JP2005521643A - アンジオポエチン様タンパク質3Angptl3含有組成物とその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
A.定義
「肝疾患」なる用語はここで最も広義に使用され、根底にある原因に関わらず、何らかの種類の肝傷害に関連した任意の肝臓の疾患を表す。よって、肝疾患は、例えば、感染過程又は自己免疫過程、機械的又は化学的傷害、又は癌に起因するものであってよく、それらは全て「肝疾患」なる定義に含まれる。肝臓への化学的傷害は、種々の毒素、例えばアルコール、四塩化炭素、トリクロロエチレン、鉄分の過剰摂取、薬物の過剰摂取、薬物の副作用等によるものであり得る。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、該アラインメントのA及びBで同一であるとスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2によって、該アラインメントのA及びBで同一であるとスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、該アラインメントのC及びDで同一であるとスコアされたヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2によって、該アラインメントのC及びDで同一であるとスコアされたヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、該アラインメントのA及びBで上述されたようなポジティブ値をスコアするアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%ポジティブは、BのAに対する%ポジティブとは異なることが理解されるであろう。
天然ヒトAngptl3の単離は、実施例1とPCT公報WO99/15654に記載されている。Angptl3 DNAは、1997年9月18日に、称号FLS139-DNA16451-1078でAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されており、ATCC寄託番号209283が付与されている。
天然ヒトAngptl3は当該分野で知られており、例えば1999年4月1日発行のPCT公報WO99/15654に開示されている。天然完全長配列Angptl3(配列番号2)又はここに記載したAngptl3アミノ酸配列の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号等に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として配列番号2の天然配列と比較してAngptl3のアミノ酸配列が変化するAngptl3ポリペプチドをコードする1つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、少なくとも1つのアミノ酸の、天然又は変異Angptl3配列の1つ又は複数のドメインにおける任意の他のアミノ酸との置換による。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、Angptl3の配列を、相同の知られたタンパク質分子の配列と比較し、ホモロジーの高い領域内でなされるアミノ酸配列変化数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の、類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、得られた変異体を、完全長の又は成熟した天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro;及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe
実施例で後述されるように、成体組織でのAngptl3の発現分析は、肝臓特異的発現と、疾患肝細胞での、硬変した肝臓での、又は毒性肝傷害後の強い上方制御とを示した。さらに、Angptl3のインビボ投与の結果、血管透過性の亢進と、肝損傷からの短期的保護効果とが生じたが、Angptl3の長期発現は肝損傷に関連した。さらに、Angptl3は、インビボでのラット角膜アッセイ検査では、血管新生を誘発した。疾患肝臓標本において検知された著しい発現と併合した、当該アッセイでのAngptl3による血管増殖の堅牢な誘発は、当該要因が肝再生中の血管新生過程の調整に重要な役割を果たすことを強く示す。
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は、通例、本明細書で同定された遺伝子産物の活性を阻害することができる抗癌剤、例えば抗体である。容器上の又は容器に添付されるラベルは、組成物が、選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第二の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
Angptl3は炎症性肝疾患において上方制御されるので、正常組織に対するその過剰発現は、そのような疾患の診断マーカーとしての機能を果たす。
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用指示に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定される細胞の供給源はAmerican Type Culture Collection, マナッサス, ヴァージニアである。
Angptl3の同定
Angptl3を、「Instruction Manual: SUPERSCRIPT(商品名)Lambda System for cDNA Synthesis and λ cloning」カタログ番号19643-014, Life Technologies, ゲイサーズバーグ, メリーランド, アメリカ合衆国に記載のプロトコルに従って、Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, カリフォルニア, アメリカ合衆国、カタログ番号64018-1から得たヒト胎児肝臓mRNAから調製したcDNAライブラリーで同定した。特に明記しない限り、全ての試薬もLife Technologiesから得た。全体的な手順は、次の段階:(1)第一鎖の合成;(2)第二鎖の合成;(3)アダプター添加;(4)酵素消化;(5)cDNAのゲル単離;(6)ベクターへのライゲーション;及び(7)形質転換に要約できる。
Not1プライマーアダプター(Life Tech., 2μl, 0.5g/μl)をポリA+mRNA(7μl, 5μg)を添加した無菌の1.5mlのマイクロ遠心分離チューブに加えた。反応チューブを5分間又はmRNAの二次構造を変性させるのに十分な時間、70℃まで温めた。次いで反応物を氷上で冷却し、5X第一鎖バッファー(Life Tech., 4μl)、0.1M DTT(2μl)及び10mM dNTP Mix(Life Tech., 1μl)を添加し、次いで恒温にするように37℃で2分間温めた。Superscript II(商品名)逆転写酵素(Life Tech., 5μl)を添加し、反応チューブをよく混合して37℃で1時間インキュベートし、氷上において終了した。反応物の最終濃度は次の通りであった:50mMのTris-HCl(pH8.3);75mMのKCl;3mMのMgCl2;10mMのDTT;それぞれ500μMのdATP, dCTP, dGTP及びdTTP;50μg/mlのNot Iプライマーアダプター;5μg(250μg/ml)のmRNA;50,000U/mlのSuperscript II(商品名)逆転写酵素。
氷上で、次の試薬を、第一鎖の合成の反応チューブに添加し、反応物をよく混合し、16℃を越えないように温度に注意しながら16℃で2時間反応させた:蒸留水(93μl);5X第二鎖バッファー(30μl);dNTP混合物(3μl);10U/μlの大腸菌DNAリガーゼ(1μl);10U/μl大腸菌DNAポリメラーゼI(4μl);2U/μl大腸菌RNase H(1μl)。10UのT4 DNAポリメラーゼ(2μl)を添加し、反応物をさらに5分間16℃でインキュベートし続けた。反応物の最終濃度は次の通りであった:25mMのTris-Hcl(pH7.5);100mMのKCl;5mMのMgCl2;10mMの(NH4)2SO4;0.15mMのβNAD+;それぞれ250μMのdATP, dCTP, dGTP及びdTTP;1.2mMのDTT;65U/mlのDNAリガーゼI;250 U/mlのDNAポリメラーゼ;13U/mlのRNase H。反応物を氷上に置いて、0.5MのEDTA(10μl)を添加することにより停止し、次いで、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1, 150μl)を通して抽出した。水相を取り出して回収し、5MのNaCl(15μl)及び無水エタノール(-20℃, 400μl)で希釈し、14,000 x gで2分間、遠心分離した。最終産物のDNAペレットから上清を注意深く取り出し、ペレットを70%エタノール(0.5ml)に再懸濁し、14,000 x gで2分間、再び遠心分離した。上清を再び取り出し、ペレットをSpeedvacで乾燥した。
次の試薬を、上記の第二鎖の合成のcDNAペレットに加え、反応物を穏やかにかき混ぜ、16℃で16時間インキュベートした:蒸留水(25μl);5X 4T DNAリガーゼバッファー(10μl);Sal Iアダプター(10μl);T4 DNAリガーゼ(5μl)。反応物の最終組成物は、次の通りであった:50mMのTris-HCl(pH7.6);10mMのMgCl2;1mMのATP;5%(w/v)PEG 8000;1mMのDTT;200μl /mlのSal Iアダプター;100U/mlのT4 DNAリガーゼ。反応物をフェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール(25:24:1, 50μl)を通して抽出し、水相を取り出して回収し、5MのNaCl(8μl)及び無水エタノール(-20℃, 250μl)で希釈した。これを次いで14,000 x gで20分間、遠心分離し、上清を取り出して、ペレットを0.5mlの70%エタノールに再懸濁し、14,000 x gで2分間、再び遠心分離した。続いて上清を再び取り出し、最終産物のペレットをSpeedvacで乾燥して、次の手順に進んだ。
前の段落のSal Iアダプターで調製したcDNAに次の試薬を混合し、混合物を37℃で2時間インキュベートした:DEPC処理水(41μl);Not I制限バッファー(REACT, Life Tech., 5μl)、Not I(40μl)。この反応物の最終組成物は次の通りであった:50mMのTris-HCl(pH8.0);10mMのMgCl2;100mMのMaCl;1,200U/mlのNot I。
cDNAを5%アクリルアミドゲルのアクリルアミドゲル電気泳動により、サイズ分画し、分子量マーカーと比較して決定されるような、1kbよりも大きい任意の断片を、ゲルから除去した。次いでcDNAを、ゲルから0.1 x TBEバッファー(200μl)に電気溶出し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1, 200μl)で抽出した。水相を取り出して回収し、14,000 x gで20分間遠心分離した。上清を、70%エタノール(0.5ml)に懸濁したDNAペレットから取り出し、再び14,000 x gで2分間遠心分離した。上清を再び除去し、ペレットをSpeedvacで乾燥し蒸留水(15μl)に再懸濁した。
次の試薬をともに加え、16℃で16時間インキュベートした:5X T4 リガーゼバッファー(3μl);pRK5, Xho I, Not I消化ベクター, 0.5μg, 1μl);前の段落で調製されたcDNA(5μl)及び蒸留水(6μl)。続いて、さらなる蒸留水(70μl)及び10mg/mlのtRNA(0.1μl)を添加し、全ての試薬をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を通して抽出した。水相を取り出して回収し、5MのNaCl(10μl)及び無水エタノール(-20℃, 250μl)中に希釈した。次いでこれを14,000 x gで20分間、遠心分離し、ペレットを70%エタノール(0.5ml)に再懸濁し、14,000 x gで2分間、再び遠心分離した。次いでDNAペレットをSpeedvacで乾燥して、次の手順で使用するために蒸留水(3μl)に溶出した。
前記したように調製した、ライゲートされたcDNA/pRK5ベクターDNAを、電気コンピテントDH10Bバクテリア(Life Tech., 20μl)が添加された氷上で冷却した。次いでバクテリアベクター混合物を、メーカーの勧めに従って電気穿孔した。続いてSOC培地(1ml)を添加し、混合物を37℃で30分インキュベートした。次いで形質転換体をアンピシリンを含む20の標準150mm LBプレートに蒔き、コロニーが成育するまで16時間(37℃)インキュベートした。次いでポジティブコロニーをこすり取り、標準CsCl勾配プロトコルを用いてバクテリアペレットからDNAを単離した(例えば上掲のAusubel等, 2.3.1.)。
Angptl3は、Klein R.D.等, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci 93, 7108-7113及びJacobs (1996年7月16日発行の米国特許第5,563,637号)により報告された方法を含む、当該分野で周知の任意の標準的な方法によって、ヒト胎児肝臓ライブラリーで同定可能である。Klein等及びJacobsによると、新規に分泌された哺乳類の膜結合タンパク質をコードするcDNAは、レポーター系として酵母転化酵素遺伝子を用いてそれらの分泌リーダー配列を検出することによって同定される。酵素転化酵素は、スクロースのグルコース及びフルクトースへの分解と、ラフィノースのスクロース及びメリビオースへの分解を触媒する。転化酵素の分泌形態は、分泌転化酵素を産生できない酵母細胞が、単一の炭素及びエネルギー源としてスクロースを含む培地上であまり増殖しないように、酵母(Saccharomyces cerevisiae)によってスクロースの利用のために必要とされる。Klein R.D.等, 上掲、及びJacobs, 上掲は双方とも、酵母転化酵素の天然シグナル配列を機能的に置換するために、哺乳類シグナル配列の周知の能力を利用する。哺乳類cDNAライブラリーは、非分泌酵母転化酵素をコードするDNAにライゲートされ、該ライゲートされたDNAは、単離され、転化酵素遺伝子を含まない酵母細胞に形質転換される。哺乳類シグナル配列にライゲートされた非分泌酵母転化酵素遺伝子を含む組換え体は、炭素源としてスクロースだけ又はラフィノースだけを含む培地で増殖する能力に基づいて同定される。同定された哺乳類シグナル配列は、次いで、対応する分泌タンパク質をコードする全長クローンを単離するために第二の全長cDNAライブラリーをスクリーニングするために使用される。クローニングは、例えば、発現クローニングによって、又は当該分野で周知の任意の他の技術によって行われてよい。
OLI114 CCACGTTGGCTTGAAATTGA(配列番号3)
OLI115 CCTCCAGAATTGATCAAGACAATTCATGATTTGATTCTCTATCTCCAGAG(配列番号4)
OLI116 TCGTCTAACATAGCAAATC(配列番号5)
Angptl3の発現
ヒトAngptl3を、真核細胞の発現ベクターpRK5tkNEO及びバキュロウイルスベクターpHIF、PharMingen, カリフォルニアから購入したpVL1393の誘導体にクローニングした。プラスミドDNAを、BaculoGoldTM DNA(PharMingen, カリフォルニア)とともにLipofectin(GIBCO-BRL, MD)を用いてSpodoptera frugiperda ("Sf9") 細胞(ATCC CRL 1711)中に同時形質移入した。4日後、細胞を回収し、500μlの上清を用いて2 x 106 Sf9細胞に感染させ、バキュロウイルスを増幅した。増幅の72時間後、細胞を回収し、40時間、10mlの上清を用いて7.5 x 105 H5細胞/mlに感染させた。回収、及び0.45μm酢酸セルロースフィルターでの濾過後、上清を精製した。マウスAngptl3を、大規模な一過性形質移入実験で、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現させた。ヒトAngptl3を、イムノアフィニティクロマトグラフィーを利用して、懸濁液中で増殖したバキュロウイルスに感染した昆虫細胞から精製した。抗gD FabをグリコファーゼCPG(コントロールされたポアガラス)に結合してカラムを生成した。浄化(1000 x g 5分、その後0.2μm濾過)培地を4℃で一晩中ローディングした。280nmの流出物で吸収度が基準に戻るまで、カラムをPBSで洗浄し、pH3.0の50mM クエン酸ナトリウムで溶出した。溶出されたタンパク質を、1mM HClに対して透析し(Spectra-pore; MWCO 10,000)、-70℃で凍結した。一過的に発現されたマウスAngptl3含有CHO培養物を、浄化し、10,000 MWCO膜(Amicon)を用いて濃縮した。この容積は、ヒトAngptl3について上述したグリコファーゼCPGに結合した抗gD Fabカラムを超えた。溶出されたプールを、<5mSの伝導性まで10mM 酢酸ナトリウム(pH5.0)で希釈し、S Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech, ニュージャージー)にローディングした。280nmの流出物の吸収度が基準に戻るまで、カラムを10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で洗浄し、pH5.0の10mM 酢酸ナトリウム中、20カラム容積勾配0-0.5M NaClで溶出した。0.45M-0.5M NaClで溶出した、マウスAngptl3を含む分画をさらに、逆相C-4クロマトグラフィ(Vydac, カリフォルニア)を用いて精製した。分画を、0.1%トリフルオロ酢酸勾配で酸性化した。67%アセトニトリルで溶出したマウスmAngptl3を凍結乾燥し、-70℃で保存した。精製タンパク質の同定を、N末端配列分析で確認した。市販のキットでLPS濃度を確認し、全てのヒト又はマウスAngptl3調製について<5 Eu/mlとなるように決定した。
Angptl3に結合する抗体の調製
この実施例は、Angptl3に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
内皮細胞結合
アンジオポエチンは、N末端フィブリノゲン(FBN)様ドメインを介して内皮細胞特異的チロシンキナーゼレセプターTie2に結合することによって血管新生を調節する分泌因子である。この分泌リガンドのファミリーに存在するC末端コイルドコイル・ドメインが、リガンドのオリゴマー化に必要であることがわかった(Procopio等, J. Biol. Chem. 274:30196-201 (1999))。
FBN-Angptl3の分子モデリング
Angptl3のFBN様ドメインは、ヒトフィブリノゲンのγ鎖のC末端と39.6%の配列同一性を共有する。Angptl3が内皮細胞に結合する生物学的機能と分子メカニズムを調査するために、FBNドメインに関するX線結晶学とホモロジーモデリング技術によってもたらされた構造情報を用いて、Angptl3 のFBN様ドメインのモデルを構築した。FBNドメインは、3つの明確なドメイン:短い螺旋に挟まれた二重鎖逆平行βシートによって形成されたN末端ドメイン;2つの短い螺旋と、その面の一方に対して配列されたヘアピンループとを有する五重鎖逆平行βシートによって形成された中央ドメイン;及び主にループからなる第三のドメイン(図5B)を備えた独特の折り畳みを有する。
細胞接着アッセイ
A.インテグリン媒介Angptl3細胞接着の同定
Angptl3に結合する潜在的なインテグリンを同定するために、96ウェル平底マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, デンマーク)を、組換えAngptl3タンパク質で終夜4℃で被膜し、PBS中100μg/ml BSAで1時間37℃で遮断した。IIbIIIa(αIIBβ3)、αvβ3、αvβ1及びαvβ5を含む、異なるインテグリンヘテロ二量体が安定して形質移入された様々な293細胞株を、Angptl3で被膜されたプレートに結合するそれらの能力について検査した。細胞を回収し、1% BSA、1mM CaCl2及び1mM MgCl2を含有する無血清CS-C培地で105細胞/mlに希釈した。細胞を、遮断抗体又はペプチドあり又はなしで、15分間37℃でプレインキュベートし、その後200nM PMAで刺激した。被膜されたウェルに細胞懸濁液(104細胞/ウェル)を加え、プレートを選択した時間37℃でインキュベートした。非接着細胞をPBS洗浄によって除去し、LandegrenのPNAG法(Landegren, U., J. Immunol. Methods, 67:379-388 (1984))を用いて細胞付着性を測定した。結果は、3つのウェルの平均OD405値で表す。
インテグリンは、それらのリガンドによって活性化されたとき、細胞接着や細胞移動といった生物学的反応を誘発することが知られている。Angptl3が原発性ヒト内皮細胞にそういった影響を及ぼすか、及びαvβ3がこれらの反応を媒介するのに十分かを検査するために実験を設計した。内皮細胞接着アッセイでの検査時、Angptl3は、インキュベーション後4時間以内に堅牢な用量依存的接着を誘発した(図7C)。観察されたレベルは、細胞がビトロネクチン、αvβ3の原型的リガンド、に蒔かれたときに得られたレベルに匹敵した(データは示さず)。
細胞移動アッセイ
内皮細胞上でのインテグリン活性の別の特徴は、リガンド刺激に対するそれらの移動反応であるため、内皮細胞の移動の誘発に及ぼすAngptl3の影響を研究するために移動アッセイを展開した。
Angptl3の組織発現
A.インサイツハイブリダイゼーション
上述したようにインサイツハイブリダイゼーションを行った(Lu, Cell Vision 1:169-176 (1994))。PCRプライマー
上流:5’ T7プロモーター:GGATTCTAATACGACTCACT ATAGGGC(配列番号6)+GGCATTCCTGCTGAATGTACC(hAngptl3特異的配列、配列番号7)3’及び
下流:5’ T3プロモーター:CTATGAAATT AACCCTCACTAAAGGGA(配列番号8)+ ACCACACTCATCATGCCACCA(hAngptl3特異的配列、配列番号9)3’
を、ヒトAngptl3の506-bp断片を増幅するために設計し、
上流:5’ T7プロモーター:GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGC(配列番号6)+5’ GATGACCTTCCTGCCGACTG(mAngptl3特異的配列、配列番号11)3’及び
下流:T3プロモーター:CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGA (配列番号8)+5’ GTCATTCCACCACCAGCCA(mAngptl3特異的配列、配列番号13)。プライマーには、それぞれ増幅産物からセンス又はアンチセンスのリボプローブのインビトロ転写を可能にするために、27ヌクレオチドT7又はT3 RNAポリメラーゼ開始部位をコードする伸展部が含まれていた。ヒト組織の5μm厚切片を脱パラフィン処理し、20μg/mlプロテイナーゼKで15分間37℃で脱タンパクし、2 x SSCでリンスし、段階的エタノール濃度で脱水し、プレハイブリダイゼーションバッファーで1-4時間インキュベートした。マウス組織を、4μg/mlプロテイナーゼKで30分間37℃で分解し、上述したように処理した。33P-UTP標識されたセンス及びアンチセンスプローブを終夜55℃で切片にハイブリッド形成した。20mg/ml RNaseAで30分間37℃でインキュベーションし、次いで0.1 x SSCで2時間55℃での高度のストリンジェンシー洗浄を行い、段階的エタノール濃度で脱水することによって、非結合プローブを除去した。スライドをNBT2核軌道乳剤(Eastman Kodak, ニューヨーク)に浸漬し、乾燥剤入りの密封したプラスチックスライドボックスで4週間4℃で露出し、展開し、ヘマトキシリン及びエロシンで対比染色した。
成体ヒト組織でのAngptl3発現を研究するために、上述したようにコード配列の5’端を覆う放射標識されたプローブを用いて多組織ノーザンブロット分析を行った。肝臓で独占的に発現されることがわかったマウスオルソログAngptl3での前の観察(Conklin等, Genomics 62:477-82 (1999))と対照的に、ヒトAngptl3の発現は、成体の肝臓及び腎臓で見出されたが、腎臓で観察されたシグナルは著しく低かった(図8A)。骨格筋組織でいくらかの弱いシグナルが見られたことを除いて、肺及び脳を含む分析した他の成体組織では発現が見られなかった。ヒト及びマウス標本由来の様々な正常及び罹患組織に対するインサイツハイブリダイゼーション実験によって、Angptl3 mRNA発現の細胞局在を調査した。組織は、全ての主要な器官、骨髄、病的な肝組織、例えば肝硬変、転移性肝腺癌及びアセトミノフェンが誘発する肝毒性のケースからの切片を含む。図8Bに示したように、何らかのバックグラウンド発現が正常な成体肝臓で見られ、ノーザンブロット分析データを裏付けた。分析した肝腫瘍サンプルでの発現に変化はなかったが、例えば肝硬変や毒性傷害後の、炎症と関連した罹患肝臓に由来する切片には強い誘発が観察された。高い倍率で拡大した図に示したように、肝細胞特異的発現が、正常な肝組織と罹患した肝組織の双方で見られた(図8C)。罹患組織内又はその周辺の間質細胞、リンパ球及び内皮細胞に、発現は検出されなかった。
癌及び非癌を含む正常及び罹患状態を示しているヒト組織のGeneLogicデータベースを用いて、遺伝子発現分析をAngptl3について行った。
Angptl3のインビボ血管新生活性についてのアッセイ
Angptl3がラット角膜でインビボ血管新生反応を誘発できたか検査するために、マウス及びヒトAngptl3(500ng)及びヒトVEGF(100ng)を含有するヒアルロン・ペレットを別個に又は組合わせて上述したように注入した(Xin等, J. Biol. Chem., 274:99116-9121 (1999))。賦形剤(コントロール、マウス又はヒトAngptl3(500ng)、VEGF(100ng)、又はマウス又はヒトAngptl3(500ng)及びVEGF(100ng)の組合わせ)を含有するハイドロン・ペレットを、250ないし300gの雄Sprague-Dawleyラットの角膜に注入した。全てのハイドロン・ペレットが100ngのスクラルフェートを含んだ。6日目に、動物を安楽死させ、脈管構造を可視化するためにフルオレセインイソチオシアネート-デキストランを注入した。角膜のホールマウントを除核した眼球から作り、コンピュータ支援画像分析(Image Pro-Plus 2.0, Silver Spring, メリーランド)を用いて新生血管領域について分析した。角膜血管新生アッセイでの検査においてアンジオポエチン1及び2の効果に焦点を合わせた先の報告(Asahara等, Circ. Res. 83:233-40 (1998))と対照的に、ペレット注入の5日後、組換えAngptl3のみが強い血管新生反応を誘発した。図9A及びBに示したように、Angptl3は、組換えヒトタンパク質と比較してわずかに強く血管新生を誘発したが、どちらの反応もVEGFについて得られたレベルに匹敵した。VEGFとの組合わせ処置では、相乗効果ではなく追加効果が観察された(図9B)。これらの発見は、双方のリガンドが関与する相互依存的シグナル伝達経路を反映するものであり得る(Byzova等, Mol. Cell. 6:852-60 (2000))。
Angptl3のインビボ生物学的活性
A.Angptl3の静脈内及び皮内投与の一過的保護効果と長期的効果
手段
アデノウイルス生成:AdEasyアデノウイルスベクター系(Stratagene)を用いて原則的に製造者の指示に従い、アデノウイルスCMV-gD-mAngptl3、CMV-lacZ及びmVEGF164を生成した。マウスAngptl3又はVEGFをコードする組換えアデノウイルスベクターを、Angptl3又はVEGFのコード領域をStratageneからのAd-easyベクター構築キットのポリリンカー部位へクローニングすることによって、構築した。mAngptl3又はVEGFのコード領域は、pShuttleCMVベクターのNot IとHind III部位の間でクローニングした。供給されたpShuttleCMV-lacZとともに、これらのベクターを、BJ5183エレクトロコンピテント・バクテリア(Stratagene)で、E1及びE3領域が除かれたAd5ゲノムを含むAdEasyベクターと組換えした。組換えAdEasyプラスミドをホストHEK293細胞に一過性形質移入することによって、第一のウイルスストックを準備した。アデノウイルスストックをHEK293細胞でさらに増幅させ、Virakit Adeno精製キット(Virapur)を用いて精製した。アガロース・オーバーレイ・プラーク・アッセイでアデノウイルス力価を得た。
毒性傷害からの肝臓保護の短期的分析のために、尾静脈注射によって12の成体BalbCマウスにアデノウイルス構築物を投与し、用量1 x 109 PfuのmAngptl3及びLacZコード化コントロールウイルス、及び1 x 107 PfusのVEGFコード化ウイルスで処置した後2日から3週間にわたって肝臓でタンパク質を連続的且つ堅牢に発現させた。アデノウイルスベクターでの処置の5日後、マウスを2つのサブグループ(n=6)に細分し、賦形剤(オリーブオイル)か又はCCl4(四塩化炭素)、肝損傷を誘発する強い肝細胞毒素、での処置をさらに施した。賦形剤及びCCl4は双方とも、強制経口投与により4ml/kgで与えた。48時間後、動物を屠殺し、血液を集め、組織を回収し分析のために固定した。マウスでの構築物の発現レベルを、アデノウイルス感染の7日後にウェスタンブロット分析によって分析した(図10A)。
Angptl3をコードするアデノウイルスで処置されたマウスからの血清において、肝不全のインジケーターであるアスパラギン酸トランスフェラーゼ(AST)の血中濃度が有意に2.1倍低下したが、コントロール構築物(P<0.0001)での処置ではいずれの場合も低減しなかったことにより、CCl4が誘発する肝細胞壊死に及ぼすAngptl3の保護効果が実証された(図10B)。しかして、組換えAngptl3の一時投与は肝臓損傷の治療に有益であり得る。
Angptl3レベルの上昇の長期的効果を評価するために、上述したようにAngptl3をコードするアデノウイルスベクターで処置したマウスを、ウイルス伝播後2週間にわたって、特徴付けた。
肝機能を示す血液化学レベルを、アデノウイルス伝播後2週間にわたって、野生型C57B16マウスから採取した血清サンプルで測定した。血液学Cell-Cyn 13700と血液化学レベルをCobas Integra 400で決定した。
RAG2ノックアウトマウス及びSCIDマウスにおける、Angptl3を発現するアデノウイルスベクターでの処置の効果をさらに特徴付けるために、Angptl3を発現するアデノウイルスベクター又はコントロールアデノウイルスベクターのいずれかで処置されたRAG2ノックアウトマウス及びSCIDマウスの、ホルマリンで固定されBrdUが加えられた様々な器官、例えば腎臓、心臓、肝臓、肺及び小腸での細胞増生を定量化した。アデノウイルス投与(IV)14日後のコントロール又はAngptl3処置されたマウスのパラフィン包理された切片上の、細胞周期のSフェーズにある細胞を検出するBrdU染色を行い、細胞増生を測定した。BrdUは、用量100mg/kgで動物に腹腔内投与し、1時間後に屠殺した。37℃で0.05%のトリプシンで20分間処置し、変性のために70℃で0.15Mクエン酸三ナトリウム中95%のホルムアミドで45分間処置した後、1:1000の希釈でIdU/BrdU(Caltag)に対するマウス抗体で終夜4℃で組織を染色した。マウスIgG(Vector)に対するビオチン化ウマ抗体を二次試薬として用いて、Vectastin ABC Standard Eliteキット(Vector Laboratories)を使用して検出した。マウスアイソタイプ(Zymed)をネガティブコントロールとして使用した。次いで切片をヘマトキシリンで対比染色した。40x対象を用いて無作為に選択した、10の独立した分野の標識された核の総数を数えた。各分野は0.063mm2の領域をカバーした。
表3:コントロールで処置したものと比較して、Angptl3で処置したRAG2ノックアウトマウス及びSCIDベージュマウスの処置後14日目の肝臓切片で増加したBrdU染色
アデノウイルスベクターで感染させた後14日目にC57/B16から回収した肝臓切片に、組織学的分析を行った。LacZをコードするアデノウイルスベクターで処置したコントロールマウスから単離した肝臓との比較において、肝細胞内での細胞増生と炎症性浸潤を示す有糸分裂像の増加が、Angptl3をコードするアデノウイルスベクターで処置したマウスから単離した肝臓切片に観察された。Angptl3で処置した動物の肝臓はまた、コントロールで処置した動物の肝臓よりも有意に大きかった。
免疫細胞上に発現したLFA1及びMac-1は、インビボELISAアッセイでの検査時、組換えAngptl3に結合しなかった(Camenisch等, 2002)が、免疫細胞上に発現するインテグリンファミリーの他のメンバーはAngptl3と関与し得る。
肝損傷の媒介に関与する細胞メカニズムをさらに調査するために、Angptl3で被膜された組織培養皿上の肝細胞及び内皮細胞を用いた細胞接着実験を、実施例6に示した細胞接着アッセイと同様に行った。
成体マウスで一過性Angptl3発現によって誘発される血管変化を研究するために、成体FVBマウスの耳の表皮層に、麻酔をかけて総量10μlのアデノウイルス発現ベクター(1 x 10-9 PFU)を投与し、エバンスブルーアッセイを用いて血管透過性の変化についてさらに分析した。簡単に言うと、最初からエバンスブルーアッセイの間中、マウスに麻酔をかけた。麻酔効果の発現後、100μlのエバンスブルー(PBS中1%溶液)をマウスに尾静脈注射によって静脈内投与した。エバンスブルー投与の60分後、120mmHgの圧力で、pH3.5のクエン酸バッファー中1%パラホルムアルデヒドを、左心室からマウスに潅流させた。耳を切り離し重さを量った。エバンスブルーを1mLのホルムアミドで耳から抽出した。滲出したエバンスブルーの量を、分光光度計を用いて610nmで測定し、組織の湿重量1mgあたりの含有色素として示した。
LacZを発現するコントロールアデノウイルスベクターを投与したマウスでの血管透過性レベルと比較して、Angptl3又はVEGFを発現するアデノウイルスベクターを皮内投与したマウスの耳での血管透過性は、エバンスブルーアッセイで測定したところ、投与の6日後に増加が観察された(図12D)。
別の方法で、発育中及び成体で恒常的に発現される角化細胞特異的プロモーターの制御下で、マウスAngptl3を発現するトランスジェニックマウスを作製することによって、皮膚での上昇したAngptl3発現レベルの発生効果を研究した。
マウスK5プロモーターの制御下でAngptl3の発現を可能にする構築物であるK5-gD-mAng5を用いて、標準的な手順(Filvaroff等, 2002)で初代トランスジェニックマウスを作製した。K5-gD-mAng5構築物を生成するために、Angptl3からNotI-NotIを取り除き、pNASSK5β NotI-NotI-SAPに挿入し、K5-gD-mAng5を生じさせた。
gD-mAng5.311.F:ATATGCCTTGGCGGATGC(配列番号:32);及び
gD-mAng5.578.R:ATGGACAAAATCTTTAAGTCCATGAC(配列番号:33)
を用いてマウス尾部DNA(QIAGEN, サンタクラリタ, カリフォルニア)のPCRによって生後9日目にマウス胎仔の遺伝子型を特定した。
MMAng5.1165.FP:FAM-CTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTTAMRA(配列番号:34)
MMAng5.1144.F:GCTGGCAATATCCCTGGG(配列番号:35)
MMAng5.1223.R:AGCTGTCCCTTTGCTCTGTGA(配列番号:36)
を用いた。
全ての初代トランスジェニックマウスの皮膚生検からの遺伝子発現分析に基づいて、5つの最も高度にAngptl3を発現している初代を同定し、さらにC57/B16マウスに交配した。遺伝子型頻度分析によって、導入遺伝子の正常なメンデル遺伝子頻度分布が明らかになり、導入遺伝子発現と関連する有意な生後致死性は観察されなかった。
提示した様々な組織からのRNAを単離し、特に肝臓における、内因性発現に対する導入遺伝子発現の相対的レベルをリアルタイムRT-PCRで評価した。
導入遺伝子発現データに基づき、12週齢のトランスジェニック及びリットルが同等の野生型コントロールを選択し、血管新生分子のアンジオポエチンファミリーの構造上関連した2つのメンバーであるAng1及びAng2について行われた(Maisonpierre等, 1997;Thurston等, 2000;Thurston等, 1999)ような、及び上述したようなエバンスブルーアッセイを用いて血管透過性についてアッセイを施した。血管透過性を上述したようにエバンスブルーアッセイで測定した。エバンスブルー分析を行った11週齢のトランスジェニック株は双方とも、リットルが同等の野生型株と比較して、基礎レベルの血管透過性が約2ないし3倍と有意に亢進した(図12C)。しかし、エバンスブルーアッセイ分析を行う前にマウスにからし油を投与した場合、トランスジェニックマウスとリットルが同等の野生型マウスとの血管透過性の相違はそれほど顕著ではなかった。従って、リットルが同等の野生型マウスに対するトランスジェニックマウスでの血管透過性の亢進は、血管透過性の調節におけるAngptl3の役割を示し得る。
上述したように、以下の材料はAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC)に寄託されている:
材料 ATCC寄託番号 寄託日
Angptl3-DNA16451-1078 209281 1997年9月18日
Claims (29)
- Angptl3のアンタゴニストを用いて組織を治療することを含んでなる、Angptl3の過剰発現を特徴とする組織損傷の治療方法。
- 組織が肝組織である請求項1に記載の方法。
- 組織損傷が炎症に関連している請求項2に記載の方法。
- 組織損傷が慢性肝疾患に関連している請求項3に記載の方法。
- 組織損傷が肝腫瘍に関連している請求項2に記載の方法。
- 組織が心臓組織である請求項1に記載の方法。
- 組織損傷が炎症に関連している請求項6に記載の方法。
- 組織損傷がAngptl3の上昇発現を特徴とする心疾患に関連している請求項6に記載の方法。
- アンタゴニストが抗Angptl3抗体、又は抗αvβ3抗体である請求項1に記載の方法。
- アンタゴニストがイムノアドヘシンである請求項1に記載の方法。
- 必要とする哺乳類対象体に有効量のAngptl3のアンタゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における慢性肝疾患の治療方法。
- 慢性肝疾患がAngptl3の上昇発現を特徴とする請求項11に記載の方法。
- アンタゴニストが抗Angptl3又は抗αvβ3抗体である請求項11に記載の方法。
- 対象体に有効量のAngptl3のアンタゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における、Angptl3の上昇発現を特徴とする心臓病の治療方法。
- アンタゴニストが抗Angptl3抗体、又は抗αvβ3抗体である請求項14に記載の方法。
- 必要とする哺乳類対象体に、配列番号2のヒトAngptl3配列と少なくとも80%の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝疾患の治療方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2のヒトAngptl3配列のアミノ酸領域281-293(P1, 配列番号14)、442-460(P2, 配列番号15)、及び415-430(P3, 配列番号17)を有する請求項16に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2のヒトAngptl3配列のフィブリノゲンドメインを有する請求項16に記載の方法。
- 付加的な治療薬の投与をさらに含んでなる請求項16に記載の方法。
- 前記アゴニストが、Angptl3又はαvβ3に特異的に結合するアゴニスト抗体である請求項16に記載の方法。
- 必要とする哺乳類対象体に、配列番号2のヒトAngptl3配列と少なくとも80%の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝傷害後の肝再生誘発方法。
- 配列番号2のヒトAngptl3配列と少なくとも80%の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する有効量のポリペプチド又はそのアゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管新生誘発方法。
- 組織が肝組織である請求項22に記載の方法。
- 組織が心臓組織である請求項22に記載の方法。
- 有効量のAngptl3のアンタゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管透過性の望ましくない亢進の抑制方法。
- 組織が肝組織である請求項25に記載の方法。
- 組織が心臓組織である請求項25に記載の方法。
- ヒト対象体の心臓組織におけるAngptl3 mRNA又はその発現産物のレベルを、正常な心臓組織におけるAngptl3又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の心臓組織におけるAngptl3 mRNA又はその発現産物のレベルが正常な心臓細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる、心臓血管疾患の危険性があるヒト対象体の同定方法。
- 対象体の肝組織におけるAngptl3 mRNA又はその発現産物のレベルを、正常な肝組織におけるAngptl3又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の肝組織におけるAngptl3 mRNA又はその発現産物のレベルが正常な肝細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる、肝損傷の危険性があるヒト対象体の同定方法。
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