CN111122872B - 血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用，利用酶联免疫吸附测定法检测心力衰竭患者的血清样本时，当样本中血管生成素样蛋白7的含量大于等于869pg/mL时，患者大概率预后不良，即大概率会发生30天死亡和90天死亡事件。本发明利用血管生成素样蛋白7作为心力衰竭预后评估的标志物，可以通过检测血清中ANGPTL7的浓度来判断心力衰竭患者的预后情况。利用此标志物对于心力衰竭患者的预后情况进行预测，简单易行，结果准确，对临床治疗方案有的指导作用，有很好的应用前进和价值，值得大力推广和保护。

Description

血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用

技术领域

本发明涉及心脏病检测技术领域，更具体地，涉及血管生成素样蛋白7在心 力衰竭预后评估中的应用。

背景技术

心血管疾病是目前全球范围内死亡率最高的疾病，严重威胁着人类的生命 健康。有研究显示，心血管疾病的死亡人数每年都在大幅度的增长。心血管疾病 发病率高、致死率高，并且随着人口老龄化、生活环境恶化、生活方式不健康化， 其带来的危害更是日益显著。各种心血管疾病如：高血压病、心肌梗死、缺血性 心肌病、心肌炎、扩张型心肌病、肥厚型心肌病等发展的共同终点是心力衰竭。 心力衰竭为各种心脏结构或功能性疾病导致的心室充盈和/或射血功能受损、心 排出量下降不能满足机体代谢所需而引起的一组复杂的临床综合征，其主要的临 床表现是呼吸困难、乏力(活动耐量下降)，以及液体潴留(肺淤血和外周水肿)。 心力衰竭是各种心血管疾病发展的严重和终末阶段，各种基础的心脏疾病不断进 展，导致血流动力学负荷增加及心肌、冠状动脉功能不全，最终引发心力衰竭。

心力衰竭的显著特点是高患病率、高花费和高致死率。2010年来自美国的 流行病学统计资料显示，在美国有超过580万的成年人患有心力衰竭，进入老 年期后患病率有明显的升高。2003年我国开展的一项心力衰竭流行病学调查结 果也显示我国当时成年人中有约400万心力衰竭患者。心力衰竭一旦发生，患 者甚至整个家庭就面临着长期治疗、反复住院、多种药物及非药物治疗产生的高 额医疗费用，带给社会和医疗卫生体系沉重的卫生负担和经济负担。心力衰竭的 死亡率高，严重心力衰竭患者可因泵衰竭导致死亡，并且可因心律失常的发生率 升高而导致猝死。据国外报道，心力衰竭患者1年的全因死亡率达30％。国内 也有研究数据显示，重症心力衰竭患者在确诊后1年内全因死亡率超过20％。心力衰竭的高致死率，与其诊断干扰多、治疗难度高、预后差异大密切相关。

目前临床上主要以NYHA心功能分级、左室射血分数、B型利钠肽(BNP)、 氨基末端B型利钠肽(NT-proBNP)等判断急性心力衰竭患者的预后。然而， 在急性心力衰竭的治疗过程中，患者的上述指标可因心功能的改善而发生改变，BNP和NT-proBNP还会受到除心功能外多种因素的影响，上述指标并不能准 确的代表病情发展的阶段，在一定程度上无法准确指导疾病的治疗及预后判断。 因此，寻找新的的心力衰竭预后评估手段，对于制定合理有效的干预策略具有重 要意义。

血管生成素样蛋白家族(Angiopoietin-related proteins，ANGPTLs)包括了 与血管生成素(ANG)家族成员具有相似结构的一组分泌蛋白，目前共发现了A NGPTL1-8八个家族成员。它们在结构上共有N末端卷曲螺旋结构域和C末 端纤维蛋白原样结构域。ANGPTLs蛋白不结合血管生成素细胞表面受体Tie-1 和Tie-2，即不通过TIE酪氨酸激酶受体通路进行信号传导，提示其可能与AN G蛋白具有不同的生物学功能。ANGPTLs通过整合相关的信号传导参与多种生 理和病理过程，包括介导脂质、葡萄糖代谢、血管生成、癌症、炎症等过程。 ANGPTL3，ANGPTL4和ANGPTL6可直接参与调控脂质和葡萄糖等能量代 谢过程。ANGPTL2和ANGPTL6与肥胖症等代谢相关疾病和心血管疾病有关。 ANGPTL8可调节血清甘油三酯水平。ANGPTL4同时具有促血管生成和抗血 管生成作用。ANGPTL3和ANGPTL6具有刺激造血干细胞和促进血管生成的 活性。卵巢癌、肺癌等肿瘤中报道了ANGPTL2表达，表明其可能是癌症发展的 关键因素。ANGPTL4被认为是肺癌和乳腺癌中癌症转移的预测因子。最近有 研究显示，ANGPTL6参与结肠直肠癌细胞在肝脏的定居。现有技术并没有关 于ANGPTLs家族成员与心血管疾病特别是心力衰竭发生发展的相关报道。

目前缺乏一种能够准确代表心力衰竭病情发展的阶段，并在一定程度上准确 指导疾病的治疗及预后判断的标志物。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术缺乏一种能够准确代表心力衰竭病情发 展的阶段，并在一定程度上准确指导疾病的治疗及预后判断的标志物的不足，提 供血管生成素样蛋白7在急性心力衰竭预后评估中的应用。

本发明的第一个目的是提供血管生成素样蛋白7在作为心力衰竭预后评估的 标志物中的应用、

本发明的第二个目的是提供一种心力衰竭预后评估试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

血管生成素样蛋白7(Angiopoietin-related protein 7，ANGPTL7)是目前 探索最少的ANGPTL家族成员，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。发明人 经过探索性的研究发现，当用利用酶联免疫吸附测定法检测心力衰竭患者的血清 样本时，当样本中血管生成素样蛋白7的含量大于等于869pg/mL时，患者大概 率预后不良，即大概率会发生30天死亡和90天死亡事件。

因此，本发明要求保护血管生成素样蛋白7在作为心力衰竭预后评估的标志 物中的应用。

优选地，所述心力衰竭为慢性心力衰竭急性加重期和/或急性心力衰竭。

优选地，酶联免疫吸附测定法检测血清中血管生成素样蛋白7含量≥ 869pg/mL，患者预后不良。

更优选地，所述患者预后不良为发生30天死亡和/或90天死亡事件。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用血管生成素样蛋白7作为心力衰竭预后评估的标志物，可以通 过检测血清中ANGPTL7的浓度来判断心力衰竭患者的预后情况。利用此标志 物对于心力衰竭患者的预后情况进行预测，简单易行，结果准确，对临床治疗方 案有的指导作用，有很好的应用前进和价值，值得大力推广和保护。

具体实施方式

下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方 法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可 从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一、实验方法

(1)病人入组

本研究选取2015年8月至2017年2月期间于中山大学附属第一医院心 血管医学部住院治疗的心力衰竭患者。每名患者均在入院当天由2名主治医师 或以上级别的心血管专科医师确诊慢性心力衰竭急性加重期或急性心力衰竭(诊 断符合《2014年中国心力衰竭诊断和治疗指南》)，并进一步评估其是否满足入 选标准及排除标准，依据排除标准剔除不符合要求或临床资料不全的病人。所有 试验对象均已详细地告知其研究目的、研究内容、研究方法、随访方式，患 者及其家属自愿签署知情同意书后视为正式入组。

心力衰竭的诊断：

主要根据病史、症状、体征、心电图、心脏彩超、胸部X线片、实验室检 查、生物学标志物等证据。了解既往的心脏疾病史，了解有无夜间阵发性呼吸困 难、端坐呼吸、下肢水肿等临床表现，监测生命体征、评估容量状态，收集心脏 彩超提供的心脏扩大及收缩功能降低、胸部X线片提供的心脏扩大、肺淤血、 肺水肿、肺部疾病等信息，检测NT-proBNP、心肌损伤标志物等标记物的水平， 都可为心力衰竭的诊断提供有效的证据。

(2)标本采集

所有入组患者均在入院后24小时内心力衰竭急性期抽取清晨空腹静脉血 5ml置于一次性非抗凝无菌采血管中，标本采集后摇匀置入4℃冰箱内静置2 小时自然凝固。研究者将血标本送至中山大学附属第一医院辅助循环实验室进行 离心处理(低速冷冻离心机，参数设置为温度4℃，转速2000转/分钟，离心 时间10分钟)，离心后取上层血清，使用微量移液器按200μl每管分装至EP 管中并标记，最后将血清标本放入-80℃超低温冰箱保存，3至6个月内进行检 测。

(3)血清ANGPTL7浓度检测

使用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 检测心力衰竭组患者和对照组患者血清中ANGPTL7的浓度，由研究者严格按 照试剂盒使用说明书在中山大学附属第一医院辅助循环实验室进行操作。具体步 骤如下：

准备全部实验用试剂(-20℃保存)及待测样本(-80℃保存)，提前60min 将其从冰箱中取出，缓慢复温至室温；

配制标准液：取1支冻干标准品重组人ANGPTL7，加入1.0ml标准品稀 释液配成5000pg/ml标准液，轻轻混匀并在室温下静置10min溶解；

配制构成标准曲线8个浓度梯度的标准液：依次将5000pg/ml标准液成倍 稀释至7个浓度梯度，再加空白管构成标准曲线的8个浓度梯度；1号EP管 加入500μl5000pg/ml的标准液，2-8号EP管中分别提前加入250μl标准 品稀释液；使用移液器从1号EP管吸出250μl液体，移至2号EP管充 分混匀后使用移液器从2号EP管吸出250μl液体，移至3号EP管，如此 反复进行成倍稀释至7号EP管，8号EP管中仅有250μl标准品稀释液， 为空白对照；

加样：在ELISA试剂盒的96孔酶标板中加入100μl不同浓度的标准液、 标准品稀释液(空白)、待测样本液，每个标本设置2个复孔；全部加样操作结 束后，用封板胶纸覆盖酶标板；

第一次孵育：酶标板置入震荡摇床上，以50次/分钟的震荡速度在37℃中 孵育2小时；

配制实验用检测试剂A：依据当次试验所需用量，将检测试剂A与试剂A 稀释液按1:100的比例稀释，配成实验用检测试剂A，备用；

加实验用检测试剂A：停止孵育，并弃去96孔酶标板中的液体，酶标板 各孔中加入100μl实验用检测试剂A；全部加样操作结束后，用封板胶纸覆盖 酶标板；

第二次孵育：酶标板置入震荡摇床上，以50次/分钟的震荡速度在37℃中 孵育1小时；

配制1×洗涤液：使用双蒸去离子水将25×洗涤液稀释至1×洗涤液，备 用；

洗涤：停止孵育，并弃去96孔酶标板中的液体，在酶标板各孔中加入400ul 配置好的1×洗涤液，轻轻晃动酶标板使得充分接触，浸泡1-2分钟后，弃去 酶标板内的洗涤液并拍净洗涤液；重复此洗涤过程；共洗涤3次，最后一次洗 涤后，充分拍干酶标板内的液体；

配制实验用检测试剂B：依据当次试验所需用量，将检测试剂B与试剂B 稀释液按1:100的比例稀释，配成实验用检测试剂B，备用；

加实验用检测试剂B：在洗涤并充分拍干的96孔酶标板各孔中加入100 μl实验用检测试剂B；全部加样操作结束后，用封板胶纸覆盖酶标板；

第三次孵育：酶标板置入震荡摇床上，以50次/分钟的震荡速度在37℃中 孵育1小时；

再次洗涤：停止孵育，并弃去96孔酶标板中的液体，在酶标板各孔中加入 400ul配置好的1×洗涤液，轻轻晃动酶标板使得充分接触，浸泡1-2分钟后， 弃去酶标板内的洗涤液并拍净洗涤液；重复此洗涤过程；共洗涤5次，最后一 次洗涤后，充分拍干酶标板内的液体；

显色：在避光条件下，迅速向洗涤并充分拍干的96孔酶标板各孔中加入90 μl四甲基联苯胺基质；全部加样操作结束后，用封板胶纸覆盖酶标板；并置入 37℃恒温箱中避光反应15～30分钟；

终止：向显色后的96孔酶标板各孔中加入反应终止液50ul，轻轻地晃动 酶标板使得充分接触，终止显色反应；可看到96孔酶标板中呈蓝色的小孔迅速 变成黄色；

检测样本吸光度值：打开Tecan Sunrise光吸收酶标分析仪并连接电脑，用 镜头纸拭去酶标板底部的水渍后置入Sunrise光吸收酶标分析仪样本盒内，设置 检测波长为450nm，开始检测各孔的吸光度值(OD值)；

计算样本浓度：通过标准液浓度(pg/ml)与相应的OD值画出标准曲线， 并得到回归方程，据此计算各血清样本的ANGPTL7浓度；

将实验数据刻录至光盘中；整理实验用品；结束实验。

(4)统计学分析

将所有心衰患者按照ANGPTL7三分位数分成三组(<545pg/mL, 545-869pg/mL，≥869pg/mL)。通过卡方检验评估ANGPTL7与30天、90天死 亡的关系。通过构建多因素Logistic回归模型校正潜在的混杂因素。这些因素包 括年龄、性别、冠心病、糖尿病、心率、收缩压、左室射血分数、肾小球滤过率、 NT-proBNP、肌钙蛋白T。

二、实验结果

结果如表1所示，共有20为患者在出院30天内死亡，共有37位患者在出 院90天死亡。ANGPTL7低、中、高三分位组30天粗死亡率分别为4.6％、14.6％、 22.9％(p＝0.035)，90天粗死亡率分别为15.2％、25.0％、37.5％(p＝0.047)。在 校正多种混杂变量后，高ANGPTL7三分位组与更高的30天死亡率(OR 8.52, 95％CI 1.45-50.17,p＝0.018)、90天死亡率(OR 8.52,95％CI 1.45-50.17,p＝0.018) 相关。以上结果说明ANGPTL7有独立的预测急性心衰预后的价值。

表1：

*多因素Logistic回归模型校正了年龄、性别、左室射血分数、收缩压、心 率、糖尿病、冠心病、高血压、肌钙蛋白T、NT-proBNP、肾小球滤过率。

OR＝比值比；CI＝置信区间。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> 血管生成素样蛋白7在心力衰竭预后评估中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Leu Lys Lys Pro Leu Ser Ala Val Thr Trp Leu Cys Ile Phe Ile

1 5 10 15

Val Ala Phe Val Ser His Pro Ala Trp Leu Gln Lys Leu Ser Lys His

20 25 30

Lys Thr Pro Ala Gln Pro Gln Leu Lys Ala Ala Asn Cys Cys Glu Glu

35 40 45

Val Lys Glu Leu Lys Ala Gln Val Ala Asn Leu Ser Ser Leu Leu Ser

50 55 60

Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Arg Asp Trp Val Ser Val Val Met Gln

65 70 75 80

Val Met Glu Leu Glu Ser Asn Ser Lys Arg Met Glu Ser Arg Leu Thr

85 90 95

Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Ser Glu Met Asn Asn Gln Ile Asp Ile Met

100 105 110

Gln Leu Gln Ala Ala Gln Thr Val Thr Gln Thr Ser Ala Asp Ala Ile

115 120 125

Tyr Asp Cys Ser Ser Leu Tyr Gln Lys Asn Tyr Arg Ile Ser Gly Val

130 135 140

Tyr Lys Leu Pro Pro Asp Asp Phe Leu Gly Ser Pro Glu Leu Glu Val

145 150 155 160

Phe Cys Asp Met Glu Thr Ser Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg

165 170 175

Arg Lys Ser Gly Leu Val Ser Phe Tyr Arg Asp Trp Lys Gln Tyr Lys

180 185 190

Gln Gly Phe Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Trp Leu Gly Asn Glu His

195 200 205

Ile His Arg Leu Ser Arg Gln Pro Thr Arg Leu Arg Val Glu Met Glu

210 215 220

Asp Trp Glu Gly Asn Leu Arg Tyr Ala Glu Tyr Ser His Phe Val Leu

225 230 235 240

Gly Asn Glu Leu Asn Ser Tyr Arg Leu Phe Leu Gly Asn Tyr Thr Gly

245 250 255

Asn Val Gly Asn Asp Ala Leu Gln Tyr His Asn Asn Thr Ala Phe Ser

260 265 270

Thr Lys Asp Lys Asp Asn Asp Asn Cys Leu Asp Lys Cys Ala Gln Leu

275 280 285

Arg Lys Gly Gly Tyr Trp Tyr Asn Cys Cys Thr Asp Ser Asn Leu Asn

290 295 300

Gly Val Tyr Tyr Arg Leu Gly Glu His Asn Lys His Leu Asp Gly Ile

305 310 315 320

Thr Trp Tyr Gly Trp His Gly Ser Thr Tyr Ser Leu Lys Arg Val Glu

325 330 335

Met Lys Ile Arg Pro Glu Asp Phe Lys Pro

340 345

Claims (1)

1.血管生成素样蛋白7的检测试剂在制备慢性心力衰竭急性加重期和/或急性心力衰竭的预后评估试剂中的应用，其特征在于，所述检测试剂为检测血清中血管生成素样蛋白7的含量的试剂；所述血清中血管生成素样蛋白7的含量≥869 pg/mL，则患者预后不良，发生30天死亡和/或90天死亡事件。