CN107750170B - 转分化的方法和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种用于从非胰腺β‑细胞制造人类胰岛素产生细胞的群体的方法，其中所述所得的胰岛素产生细胞具有增加的胰岛素含量、或增加的葡萄糖调节的胰岛素分泌、或这两者的组合。

Description

转分化的方法和其使用方法
技术领域
本文所呈现的公开内容提供了一种用于大规模产生人类胰岛素产生细胞的方法，其中所述胰岛素产生细胞包括以葡萄糖调节方式产生胰岛素的转分化非胰腺β-细胞的细胞。
背景技术
胰腺中朗格罕氏岛(islet of Langerhans)的β-细胞响应于诸如氨基酸、甘油醛、游离脂肪酸、以及最显著地，葡萄糖等因素而分泌胰岛素。正常胰岛β-细胞感受血糖浓度升高并且通过分泌胰岛素对升高的葡萄糖水平作出响应的能力对于控制血糖水平来说是关键的。响应于葡萄糖负荷而增加的胰岛素分泌通过刺激葡萄糖摄取到外周组织中，特别是肌肉和脂肪组织中来防止正常个体的高血糖症。
胰岛β-细胞功能受损的个体患有糖尿病。胰岛素依赖性糖尿病或IDDM(也被称为青少年发病型或I型糖尿病)占所有人类糖尿病的约10％。IDDM与非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的不同之处在于只有IDDM涉及郎格罕氏岛的胰岛素产生β细胞的特异性破坏。在IDDM中β-细胞的破坏似乎是特异性自身免疫攻击的结果，其中患者自身的免疫系统识别并且破坏β-细胞，但不破坏构成胰岛的周围的α-细胞(产生胰高血糖素)或δ-细胞(产生生长抑素)。
用于IDDM的治疗选择方案集中在胰岛素的自行注射，这是一种不方便和不精确的解决方案。因此，新的治疗策略的开发是非常令人期望的。胰岛或胰腺碎片移植的可能性已经作为一种用于永久性胰岛素替代的手段而被研究。现行的方法使用尸体材料或猪胰岛作为移植基质。然而，待克服的主要问题是供体组织的可用性低、经由解离获得的胰岛的变异性和低收率、以及可能由于分离过程而发生的酶损伤和物理损伤。此外，使用猪胰岛进行的异种移植存在免疫排斥和目前担忧的问题。
很明显，仍然迫切需要建立通过自行注射胰岛素治疗糖尿病的替代方案。虽然干细胞研究在这方面已经显示出了希望，但是没有取得很大的成功。需要改进的用于分离、培养、以及转分化待用于治疗糖尿病的非胰腺细胞的程序。本文所公开的方法包括大规模产生分泌胰岛素的转分化非β胰腺细胞。这些转分化细胞可以用于移植治疗中，从而避免了对现在为治疗糖尿病所需的多次自行注射胰岛素的需要。
发明内容
在一个方面，本文公开了一种制造人类胰岛素产生细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤：获得成人肝组织；处理所述肝组织以回收原代成人原代肝细胞；使所述原代成人肝细胞繁殖和扩增到预定的细胞数；将所述扩增的细胞转分化；以及收获所述转分化的扩增的培养物；从而制造所述人类胰岛素产生细胞的群体，与对照非转分化肝细胞相比，所述细胞具有增加的胰岛素含量、或增加的葡萄糖调节分泌、或其任何组合。
在一个相关方面，所述人类胰岛素产生细胞的群体中的大于70％表达内源性PDX-1。在另一个相关方面，所述表达PDX-1的细胞还表达内源性NeuroD1或MafA、或其任何组合。在又另一个相关方面，所述表达PDX-1的群体中的少于5％表达白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。
在一个相关方面，所产生的细胞的胰岛素含量增加包括与所述没有经过转分化的对照细胞相比增加至少5％。
在另一个方面，所述肝组织是从患有胰腺或胰岛素依赖性糖尿病的受试者获得的。在一个相关方面，所述人类胰岛素产生细胞的群体对于需要这样的胰岛素治疗的患者是自体的。在另一个相关方面，所述人类胰岛素产生细胞的群体对于需要这样的胰岛素治疗的患者是同种异体的。
在一个相关方面，所述方法包括经由直到生产生物反应器系统的一系列传代培养步骤使所述肝细胞繁殖和扩增。在另一个相关方面，所述生物反应器系统包括单个生物反应器或多个生物反应器。在另一个相关方面，所述生物反应器包括单次使用生物反应器、多次使用生物反应器、封闭系统生物反应器、或开放系统生物反应器、或其任何组合。在另一个相关方面，所述将所述扩增的细胞转分化包括经由一系列生物反应器系统进行转分化。
在一个相关方面，所述转分化包括：用包含编码人类PDX-1多肽的核酸的腺病毒载体感染所述扩增的细胞，所述感染是在第一时间段进行的；用包含编码人类NeuroD1多肽或Pax4多肽的核酸的腺病毒载体感染(a)的所述扩增的细胞，所述感染是在第二时间段进行的；以及用包含编码人类MafA多肽的核酸的腺病毒载体感染(b)的所述扩增的细胞，所述感染是在第三时间段进行的。
在另一个相关方面，所述转分化包括：用包含编码人类PDX-1多肽并且编码第二胰腺转录因子多肽的核酸的腺病毒载体感染所述扩增的细胞，所述感染是在第一时间段进行的；以及用包含编码人类MafA多肽的核酸的腺病毒载体感染(a)的所述扩增的细胞，所述感染是在第二时间段进行的。在另一个相关方面，所述第二胰腺转录因子选自NeuroD1和Pax4。
在另一个相关方面，所述方法还包括富集所述原代成人肝细胞中倾向于转分化的细胞。在另一个相关方面，所述倾向性细胞包含中央静脉周围肝细胞。在又另一个相关方面，所述倾向性细胞包含如下细胞，所述细胞包含：活性Wnt信号转导通路；激活谷氨酰胺合成酶响应元件(GSRE)的能力；增加的HOMER1、LAMP3、ITGA6、DCBLD2、THBS1、VAMP4、或BMPR2、或其任何组合的表达；降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4、或PRNP、或其任何组合的表达；或其任何组合。
在另一个相关方面，所述方法还包括用锂处理原代成人肝细胞群体，其中所述经过处理的群体富含倾向于转分化的细胞。在另一个相关方面，在转分化之前用锂进行处理。
在一个方面，本文公开了一种人类胰岛素产生细胞的群体，所述群体是通过包括以下步骤的方法制造的：获得成人肝组织；处理所述肝组织以回收原代成人原代肝细胞；使所述原代成人肝细胞繁殖和扩增到预定的细胞数；将所述扩增的细胞转分化；以及收获所述转分化的扩增的培养物；其中与对照非转分化肝细胞相比，所述人类胰岛素产生细胞的群体具有增加的胰岛素含量、或增加的葡萄糖调节的胰岛素分泌、或其任何组合。
在另一个相关方面，所述人类胰岛素产生细胞的群体中的大于70％表达内源性PDX-1。在另一个相关方面，所述表达PDX-1的细胞还表达内源性NeuroD1或MafA、或其任何组合。在又另一个相关方面，所述表达PDX-1的群体中的少于5％表达白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。
在另一个相关方面，与所述对照细胞相比，所述人类胰岛素产生细胞的群体包含增加的胰岛素含量，所述增加的胰岛素含量包括增加至少5％。
在另一个相关方面，所述人类胰岛素产生细胞的群体用于患有胰腺炎或胰岛素依赖性糖尿病的患者的基于细胞的治疗中。在另一个相关方面，所述细胞与所述患者是自体的或同种异体的。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，所述组合物包含人类胰岛素产生细胞的群体、和药学上可接受的载体。
附图说明
在本说明书的结论部分中特别指出和明确要求保护了被认为是具有胰腺细胞的表型和功能的转分化非β胰腺细胞和其制造方法的主题。然而，就组织和操作方法这两者来说，具有胰腺细胞的表型和功能的转分化非β胰腺细胞以及其目标、特征、和优势可以通过在结合附图阅读时参考以下详细说明被最好地理解，其中：
图1A-1D示出了人类肝细胞中PDX-1的表达在体外诱导胰腺激素表达的逐渐激活。(图1A)胰岛素(INS)；(图1B)胰高血糖素(GCG)；(图1C)生长抑素(SST)；以及(图1D)其它胰腺特异性转录因子(“pTF”)(NKX6.1、ISL1、PAX4、MAFA、NeuroD1、NeuroG3)。将结果相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化并且表示为相对于同一天的对照病毒处理的细胞的相对表达的平均值±SE。在两次独立实验中，n≥4(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图2A-2D示出了与由pTF中的每一种单独诱导的胰岛素分泌相比，在人类肝细胞中胰腺转录因子(pTF)PDX-1、Pax4、以及MafA的异位共表达在体外促进胰岛素(胰岛素原)分泌。(图2A)免疫荧光(IF)染色显示pTF的表达：PDX-1(左图)、Pax4(中左图)、MafA(中右图)以及3种pTF的合并(右图)，其中箭头指示表达所有三种pTF的细胞。(图2B)荧光素酶测定：所示的pTF对胰岛素启动子的激活；使用β-gal作为对照。结果被表示为相对光单位(RLU)/毫克蛋白质。每一个数据点表示至少两次独立实验的平均值±SE，与对照病毒处理的细胞相比，*p＜0.05，**p＜0.01(n＞4)。(图2C)免疫荧光染色显示在所示的pTF异位表达之后的胰岛素阳性细胞。原始放大倍率×20。IF染色的定量示于表(右侧)中。胰岛素阳性细胞的百分比是通过由至少两次独立实验对至少500个阳性细胞进行计数来计算的。(图2D)通过放射免疫测定来检测在与所示浓度的葡萄糖一起孵育之后胰岛素的分泌。在五次独立实验中，*p＜0.05，n＞12。显著性代表了三重感染与所有其它处理之间的差异。
图3A-3E示出了pTF PDX-1、Pax4、以及MafA的共同表达和顺序表达对胰腺β-细胞成熟的影响。(图3A)示意图，该示意图显示pTF(处理B-E)或对照病毒(Ad-CMV-β-gal，处理A)的感染次序。(图3B)针对胰岛素的免疫荧光染色：处理B(左图)、处理C(中图)、处理D(右图)。原始放大倍率是×20。染色的定量(百分比)示于每一个图像的下方。胰岛素阳性细胞的百分比是通过由至少两次独立实验对至少1000个阳性细胞进行计数来计算的。通过放射免疫测定来测量在与所示浓度的葡萄糖一起孵育之后(图3C)胰岛素和(图3D)C-肽的分泌。感染处理示于X轴上并且在图3A中说明。与对照病毒处理的细胞相比，*p＜0.05，**p＜0.01；在5次独立实验中，n＞12。(图3E)通过RT-PCR测量在所示的处理(X轴)之后所示的内源性胰腺特异性转录因子的表达水平。将CT值相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化。结果被表示为在4次独立实验中相对于对照病毒处理的细胞的相对表达的平均值+SE的相对水平(*p＜0.05，n＞8)。箭头指出了在处理C下Isl-1表达水平的特异性降低。
图4A-4C示出了三个图表，这些图表显示了转分化效率，从而表明感染的分级顺序次序(处理C)是最高效的。(图4A)在所示的感染处理之后通过荧光素酶测定来测量胰岛素启动子激活。结果被表示为相对光单位(RLU)/毫克蛋白质。每一个数据点表示至少两次独立实验的平均值±SE，与对照病毒处理的细胞相比，*P＜0.05，**P＜0.01(n＞4)。(图4B)在所示的感染处理之后通过RT-PCR对葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)的表达水平进行分析。将CT值相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化。结果被表示为与对照病毒处理的细胞相比平均值+SE的相对水平。与对照病毒处理的细胞相比，*P＜0.05；在4次独立实验中，n＞8。(图4C)在所示的感染处理之后通过RT-PCR确定激素原转化酶2(PC2；PCSK2)的表达水平。将CT值相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化。结果被表示为在4次独立实验中与对照病毒处理的细胞相比平均值+SE的相对水平(**P＜0.01，n＞8)。
图5A-5B示出了两个图表，这些图表显示在分级顺序次序的感染(处理C)之后C-肽的分泌。(图5A)在3次独立实验中，通过在通过直接“分级”顺序次序(处理C)处理的细胞中在0mM、5mM、10mM、15mM、20mM葡萄糖下放射免疫测定静态孵育15分钟来测量C-肽分泌(*P＜0.05，n＞7)。(图5B)在分析C-肽分泌之前在补充有胰岛素、转铁蛋白以及硒(ITS)的无血清培养基中13天或28天内通过放射免疫测定来测量C-肽分泌。在2次独立实验中，*P＜0.05，**P＜0.01，n＞5。显著性表示与标准方案(第6天时的处理C)相比的差异。
图6A-6D示出了四个图表，这些图表显示了在使用处理C感染次序以及排除每一种pTF(C-PDX-1，排除PDX-1；C-Pax4，排除Pax4；以及C-MafA，排除MafA)的情况下pTF在转分化过程中的单独作用。(图6A)通过荧光素酶测定来测量胰岛素启动子激活。结果被表示为平均值±SE，与直接“分级”顺序感染次序(处理C)相比，*p＜0.1，**p＜0.05；在3次独立实验中，n＞6。(图6B)在与所示浓度的葡萄糖一起孵育15分钟之后并且通过放射免疫测定所测量的C-肽分泌。与直接“分级”顺序感染次序(C)相比，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01；在3次独立实验中，n＞6。(图6C)通过RT-PCR测量胰酶的表达水平：葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)；葡萄糖激酶(GCK)；以及激素原转化酶(PCSK2)。(图6D)通过RT-PCR测量所示的内源性pTF的表达水平。将CT值相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化。结果被表示为与“分级顺序感染”处理的肝细胞相比平均值+SE的相对水平。在3次独立实验中，*p＜0.05，**p＜0.01，n＞6。
图7A-7C示出了三个图表，这些图表显示Isl1表达对在通过“分级”顺序次序(处理C)感染之后转分化的肝细胞的β-细胞成熟的影响。(图7A)通过RT-PCR测量胰岛素的表达水平。将CT值相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化。结果被表示为与对照病毒处理的细胞相比平均值+SE的相对水平。在3次独立实验中，*P＜0.05，n＞6。(图7B)通过放射免疫测定来测量胰岛素分泌。**P＜0.01，n＞6并且与直接“分级”顺序感染次序(C)相比，在3次独立实验中，n＞6。(图7C)通过RT-PCR测量葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)的表达水平。
图8A-8G示出了在使用分级感染次序(处理C)以及排除每一种pTF的情况下pTF促进细胞分化以产生胰高血糖素(α-细胞)和生长抑素(δ-细胞)的单独的作用。在所示的感染处理之后通过RT-PCR确定胰腺激素胰高血糖素(GCG)(图8A和8B)和生长抑素(SST)(图8A和8D)的表达水平。(图8C)还针对所示的感染处理，通过RT-PCR测量细胞特异性转录因子ARX和BRAIN4的表达水平。(图8E)在另外用Isl1(100MOI)感染之后通过RT-PCR确定生长抑素(SST)的表达水平。将CT值(对于图8A、8B、8C、以及8D)相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化。结果被表示为与对照病毒处理的细胞相比(图8A)或与“分级顺序感染”处理的肝细胞相比(图8B-8E)平均值+SE的相对水平。在3次独立实验中，*P＜0.05，**P＜0.1，n＞6。(图8F)在处理C感染之后(左图)以及在处理C感染和另外的Isl1感染之后(右图)针对生长抑素的免疫荧光染色。原始放大倍率×20。(图8G)针对生长抑素和胰岛素的免疫荧光染色，显示以直接分级方式顺序施用转录因子使得转分化的细胞沿β样胰腺谱系的成熟增加。
图9示出了胰腺转录因子诱导的从肝脏向胰腺的转分化的所提出的机制的示意图。与三种pTF中的每一种的单独作用相比，这些因子的共同表达使得转分化的肝细胞的数目增加(处理B)。以直接分级方式顺序施用转录因子使得转分化的细胞沿β样胰腺谱系的成熟增加(处理C)。
图10A-10D示出了在小鼠体内PDX-1诱导的胰岛素产生细胞(IPC)的激活只限于与中央静脉相邻的以谷氨酰胺合成酶(GS)表达为特征的细胞。在施用Ad-CMV-PDX-1之后14天时对Pdx-1(图10A)和胰岛素(图10B)的免疫组织化学分析。箭头指示阳性细胞，主要位于中央静脉(cv)附近。(图10C和10D)对人类(图10C)和小鼠(图10D)肝脏中GS表达的分析，表明在与中央静脉相邻的1个-2个细胞层处GS的表达。原始放大倍率×400。
图11示出了谷氨酰胺合成酶响应元件(GSRE)含有Wnt信号转导响应元件-TCF-LEF结合位点。GSRE的示意图，表明TCF-LEF和STAT 5结合位点的存在。
图12A-12F示出了GSRE在体外靶向人类肝细胞的亚群。(图12A和12D)Ad-GSRE-TK-PDX-1或GFP重组腺病毒的示意图。用Ad-GSRE-TK-Pdx-1(图12C)或Ad-CMV-Pdx-1(图12B)感染肝细胞。PDX-1表达的免疫荧光分析表明13％±2％的受Ad-GSRE-TK-Pdx-1感染的人类肝细胞(图12C)表达异位核因子，而70％±12％的经过Ad-CMV-Pdx-1处理的细胞(图12B)表达异位核因子(兔抗Pdx-1，由C.Wright馈赠，粉红色；分别是图12B和图12C)。使用Ad-GSRE-TK-eGFP获得了类似的结果；约15％的细胞对eGFP呈阳性(图12E和12F)。Ad-CMV-eGFP感染在3天-4天内产生约75％-80％的eGFP阳性细胞(数据未示)。
图13A-13C示出了GSRE靶向易转分化细胞。用Ad-GSRE-TK-Pdx-1(图13B)或Ad-CMV-Pdx-1(图13A)将肝细胞感染5天。(图13A和13B)胰岛素(豚鼠抗胰岛素，丹科公司(Dako)，绿色)和Pdx-1(兔抗Pdx-1，由C.Wright馈赠，粉红色)的共染色的免疫荧光分析。(图13C)经过处理的细胞中胰岛素的激活的统计分析；Ad-GSRE-TK-Pdx-1在50％的Pdx-1阳性细胞中激活胰岛素产生，而Ad-CMV-Pdx-1仅在5％的Pdx-1阳性细胞中激活胰岛素产生。蓝色：DAPI，核染色；原始放大倍率×20。
图14A-14E示出了GSRE激活人类细胞的体外谱系追踪。(图14A)慢病毒载体的示意图。(图14B)用双重慢病毒系统感染第3代-第10代的成人肝细胞。在感染之后10天时针对DsRed2(红色)或eGFP(绿色)荧光对肝细胞进行成像。(图14C)通过荧光激活细胞分选仪(FACS；Aria细胞分选仪；加利福尼亚州圣荷西的Becton Dickinson公司(BectonDickinson，San Jose，CA))用异硫氰酸荧光素滤光器(530nm/30nm)针对eGFP以及用Pe-德克萨斯红滤光器(610nm/20nm)针对DsRed2对细胞进行分选。(图14D和14E)将分离的细胞分开培养几代(原始放大倍率×10)。
图15A-15E示出了eGFP+细胞和DsRed2+细胞在体外以类似的增殖速率和类似的感染能力高效地增殖。将单独的细胞群体分开培养约1个月。分析每一组的增殖速率(图15A)。将eGFP+细胞(图15B和15C)和DsRed2+细胞(图15D和15E)用Ad-CMV-β-gal(图15B和15D)或用Ad-CMV-Pdx-1(图15C和15E)感染3天。使用抗Pdx-1(蓝色)的免疫荧光分析表明eGFP细胞和DsRed2细胞这两者中有将近80％受腺病毒感染。
图16A-16C示出了eGFP+细胞比DsRed2+细胞更高效地对pTF诱导的转分化作出响应。类似地用可溶性因子和pTF：Ad-Pdx-1+Ad-Pax-4+ad-MafA或对照病毒(Ad-β-gal)将这两组处理6天。在分离组中比较β-细胞样特征和功能：(图16A)在分子水平上，与对照处理的细胞相比，通过定量实时PCR研究胰岛素和胰高血糖素的基因表达。使用培养的胰腺人类胰岛细胞(第3代)作为阳性对照。(图16B和16C)在功能水平上，通过在低葡萄糖浓度下，继而在高葡萄糖浓度下(分别是于克-林二氏缓冲液(Krebs-Ringer buffer，KRB)中2mM和17.5mM的葡萄糖)静态孵育来分析葡萄糖调节的胰岛素分泌。使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC公司；来自3次不同实验的n≥8)或人类C-肽放射免疫测定试剂盒(Linco公司；来自3次不同实验的n≥8)来测量胰岛素(图16B)和C-肽(图16C)分泌。使用斯图登氏t-检验(Student′s t-test)分析，与DsRed2+细胞相比，*P＜0.01。
图17示出了eGFP+群体中更高的转分化效率在培养物中的传代次数递增的情况下是稳定的。两组在分选之后分开增殖并且在几次传代(分选后5次-7次传代)或更高次数的传代(分选后10次-12次传代)之后类似地用pTF(Ad-Pdx-1+Ad-Pax-4+Ad-MafA和可溶性因子)处理。通过在低葡萄糖浓度下，继而在高葡萄糖浓度下(分别是于KRB中2mM和17.5mM的葡萄糖)静态孵育来分析受调节的胰岛素分泌。使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC公司；来自2次不同实验的n≥6)测量胰岛素分泌。在这两个细胞群体中在低传代次数与高传代次数之间没有检测到统计学显著性差异，这表明了eGFP标记的细胞进行pTF诱导的沿β-细胞谱系和功能的转分化的持续趋势。
图18示出了通过微阵列分析进行的并且根据DAVID生物信息学资源6.7分析的eGFP+细胞和DsRed2+细胞的差异基因表达谱。4％的差异基因属于Wnt信号转导通路。
图19示出了活性Wnt信号转导促进肝脏向胰腺的转分化。如先前所报告，用补充有Wnt3A(50ng/ml，R&D公司)或DKK3(3μg/ml，R&D公司)的Ad-CMV-Pdx-1和可溶性因子处理成人肝细胞。在5天之后，通过在低葡萄糖浓度下，继而在高葡萄糖浓度下(分别是于KRB中2mM和17.5mM的葡萄糖)静态孵育来分析胰岛素分泌。使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC公司；来自3次不同实验的n≥8)测量胰岛素分泌并且与未处理的细胞(Cont)相比较。使用斯图登氏t-检验分析，与单独的Ad-CMV-Pdx-1相比，*p＜0.01。
图20示出了阻断Wnt信号转导通路消除了eGFP+细胞的转分化。将eGFP细胞用补充有DKK3(Dickkopf相关蛋白3)(0.5μg/ml；R&D公司)的Ad-CMV-Pdx-1或对照病毒(Ad-CMV-β-gal)处理5天。与对照处理的细胞相比，通过定量实时RT-PCR研究胰腺激素基因表达。
图21A-21C示出了eGFP+细胞比DsRed2+细胞表达更低水平的APC和更高水平的活性β-连环蛋白。(图21A)在DsRed2+细胞中APC和DKK1的表达显著增加。这可以进一步表明这些细胞与eGFP+细胞相比表达更高水平的Wnt信号转导通路阻遏因子。来自2次不同实验的n≥6；使用斯图登氏t-检验分析，DsRed2+细胞与eGFP+细胞相比，*p＜0.01。(图21B)在eGFP和DsRed2阳性细胞提取物中使用针对激活的β-连环蛋白的特异性抗体(抗ABC克隆8E7，密理博公司(Millipore)，1∶2000)进行的蛋白质印迹分析。使用β-肌动蛋白(SC-1616，圣克鲁斯公司(Santa Cruz)，1∶1000)作为归一化蛋白。(图21C)使用ImageJ 1.29x软件对β-连环蛋白的蛋白质水平进行定量。使用激活的β-肌动蛋白(SC-1616，圣克鲁斯公司，1∶1000)作为归一化蛋白。
图22示出了显微照片，这些显微照片显示间充质干细胞(MSC)易受腺病毒感染。通过增加Ad-GFP的moi来感染MSC。在五天后，通过荧光显微镜术(放大倍率×4)将细胞可视化。受Ad-CMV-GFP感染的MSC的代表性相衬形态(左图)和绿色荧光(左图)。用1000MOI的Ad-GFP感染MSC细胞产生约20％-60％的阳性细胞(这取决于细胞系)，而肝细胞通常存在70％-80％阳性细胞。
图23示出了条形图，该条形图显示MSC以葡萄糖调节方式分泌胰岛素。研究细胞进行转分化的能力。通过用PDX1、NeuroD1以及MafA感染细胞在MSC上诱导转分化。在实验的第六天时，细胞经受分泌实验和RIA以检测胰岛素。通过与于KRB中2mM或17.5mM的葡萄糖一起孵育15分钟来测量以葡萄糖调节方式进行的胰岛素分泌。
图24A-24B示出了在比较PAX4与NeuroD1的作用的实验的第6天时未处理的和GS富集的细胞群体的组合胰岛素分泌测量结果。图24A示出了响应于低浓度(2mM)和高浓度(17.mM)的葡萄糖的胰岛素分泌(被表示为每小时每百万个细胞的胰岛素的纳克数(ng/106/hr))的条形图。图24B示出了响应于低浓度(2mM)和高浓度(17.mM)的葡萄糖的胰岛素分泌(被表示为每小时胰岛素的纳克数(ng/hr))的条形图。
图25A-24D示出了在比较PAX4与NeuroD1的作用的实验的第6天时未处理的和富集的细胞群体的单独的胰岛素分泌测量结果。图25A(针对GS表达富集)和图25C(未处理)示出了响应于低浓度(2mM)和高浓度(17.mM)的葡萄糖的胰岛素分泌(被表示为每小时每百万个细胞的胰岛素的纳克数(ng/106/hr))的条形图。图25B(针对GS表达富集)和图25D(未处理)示出了响应于低浓度(2mM)和高浓度(17.mM)的葡萄糖的胰岛素分泌(被表示为每小时胰岛素的纳克数(ng/hr))的条形图。
图26A-26C示出了在实验的第6天时在与2mM葡萄糖(低浓度)或17.5mM葡萄糖(高浓度)一起孵育之后所测量的胰岛素分泌。对于从人类供体获得的原代肝细胞，结果被表示为每小时每百万个细胞的胰岛素的纳克数(ng INS/106/hr)(图26A：Muhammad；图26B：Pedro；以及图26C：Leon)。
图27示出了人类肝源性细胞扩增和转分化过程的示意图，表明了临床前研究和开发过程(细胞培养皿过程)和临床过程(Xpansion生物反应器过程)。
图28示出了人类肝源性原代细胞从复盘Cell Stack(CS)10板到XP-200生物反应器的典型种子培养和细胞扩增曲线。绿色的虚线表示在每个患者所需的细胞数方面的目标(靶向糖尿病的基于细胞的自体治疗)，其中所示的目标数目是每个患者10亿个细胞。PDL表示群体倍增极限。CS表示Cell Stack复盘。
图29示出了在XP-50和XP-200生物反应器以及它们的对照经典复盘支持对应物(CTL XP50和CTL XP-200)中的群体倍增时间(PDT)(以天为单位)。数据是基于收获的细胞密度。每一个条柱中的数字表示PDT。
图30示出了在生物反应器(XP-50和XP-200)中pH值(绿色)、DO(蓝色)、以及温度(红色)的调节趋势。虚线表示设定点并且峰是由于为了进行不同操作(例如培养基更换)而断开生物反应器。
图31A-31D示出了在第9天收获之前，对Xpansion生物反应器(图31A和31B)和对照复盘系统(图31C和31D)内的细胞进行的显微镜观测。图31A和图31C示出了来自Xpansion50生物反应器运行的细胞，而图31B和图31D示出了来自Xpansion 200生物反应器运行的细胞。
图32示出了基于肝细胞的自体细胞治疗方案，所述方案改编自Cozar-Castellan和Stewart(2005)Proc Nat Acad Sci USA 102(22)：7781-7782。
图33示出了制造过程，该制造过程显示在转分化和最终的质量保证/质量控制(QA/QC)测试之前成人原代肝细胞经历1,000倍扩增。
图34示出了自体胰岛素产生(AIP)细胞制造过程的概述。步骤包括：步骤1：获得肝组织(例如肝活检)；步骤2：处理所述组织以回收原代肝细胞；步骤3：使所述原代肝细胞繁殖到预定的细胞数；步骤4：将所述原代肝细胞转分化；步骤5：收获所述原代转分化的肝细胞；以及步骤6：测试所述转分化的细胞以进行质量保证和质量控制(即安全性、纯度以及效力)。任选的步骤包括冷冻保存早期传代原代肝细胞，其中在一个实施方案中，早期传代是第1代；将冷冻保存的细胞解冻以供日后使用以及储存转分化的细胞以供日后使用。
图35示出了在从在三次单独运行期间制造的细胞收获时细胞密度的变异性，其中起始密度是相当的。
图36A和36B示出了条形图，这些条形图显示了来自转分化的人类原代肝细胞群体的内源性基因表达的典型结果，所述结果显示与对照未处理(非转分化)细胞相比，内源性胰腺细胞标志物(PDX-1、NeuroD1、MafA、胰高血糖素、以及生长抑素)增加。
图37示出了AIP细胞产物效力(葡萄糖调节的胰岛素分泌，通过ELISA测定)的测试结果。
图38示出了显示三种不同的“2+1”转分化方案的流程图，包括使用多系统生物反应器的方案，以用于从非胰腺细胞产生人类胰岛素产生细胞，如在此从肝细胞开始所示的那样。所述流程图表明了接种和感染后平板接种时的靶细胞密度、以及包括用包含编码PDX-1和NeuroD1多肽的DNA的腺病毒载体感染的第一次感染和包括用包含编码MafA的DNA的腺病毒载体感染的第二次感染。总之，从接种到收获在约8天内发生。
图39A-39D示出了在第6天在第二次感染时细胞密度的显微照片，包括未处理的对照细胞的图像。
图40A-40B示出了在第6天在第二次感染时来自Xpansion-10多系统生物反应器的板3(图40A)和板5(图40B)的细胞密度的显微照片。
图41A-41D示出了在第8天在最终收获时细胞密度的显微照片，包括未处理的对照细胞的图像。
图42A-42B示出了在第8天在最终收获时来自Xpansion-10多系统生物反应器的板3(图42A)和板5(图42B)的细胞密度的显微照片。
图43示出了条形图，该条形图显示了使用“2+1”方案(参见图38)产生的细胞的胰岛素含量测定的结果，显示在生物反应器系统中的转分化不仅是可行的，而且还产生人类胰岛素产生细胞，其中所述细胞与对照未处理细胞相比具有增加的胰岛素含量。
图44A和44B示出了扩增和转分化的肝细胞的流式细胞术分析的结果。图44A示出了在活细胞上门控的几种间充质于细胞(MSC)标志物的代表性FACS图。所示的标志物包括CD90、CD73、CD105、以及CD44。阴性混合物包括造血标志物。图44B示出了在不同的细胞传代次数，即P12(第12代)、P13(第13代)、P14(第14代)时以及在受感染细胞(P16_AdV感染)中MSC标志物的出现率。
图45A-45C：BP001肝细胞的转导效率。图45A：荧光显微照片，图45B：FACS，以及图45C：FACS数据的汇总。
图46A-46C示出了TS001肝细胞的转导效率。图46A：荧光显微照片，图46B：FACS，以及图46C：FACS数据的汇总。
图47示出了eGFP+细胞和DsRed2+细胞中细胞表面分子的相对表达水平的条形图，这些细胞表面分子列于实施例16的表2B中。
图48A-48C示出了预先存在的WNT/β-连环蛋白信号使细胞倾向于高效的转分化。在转分化之前通过Li将WNT信号转导诱导48小时，然后在整个转分化方案中将Li去除(Li第-2天)或维持(Li第-2天以后)。通过ELISA测量响应于17.5mM葡萄糖刺激的胰岛素分泌。图48A：条形图示出了在转分化之前的48小时没有用锂预处理(左)和用锂预处理(右)的情况下转分化之后胰岛素的倍数增加。(图48B和48C)通过实时PCR测量胰腺基因Nkx6.1、Isl-1、以及人类PDX1的表达水平，并且相对于肌动蛋白归一化。结果代表了两个供体。
将了解的是，为了简单和清楚说明，图中所示的元件未必是按比例绘制的。举例来说，为了清楚起见，这些元件中的一些的尺寸可以相对于其它元件被放大。
具体实施方式
在以下详细说明中，阐述许多具体细节以提供对具有胰腺细胞表型和功能的非胰腺转分化人类胰岛素产生细胞和其制造方法的深入了解。在其它情况下，公知的方法、程序、以及组分没有被详细描述以免混淆具有胰腺细胞表型和功能的非胰腺转分化人类胰岛素产生细胞和其制备方法。本申请要求2014年12月30日提交的美国临时申请序列号62/098,050的权益，该美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
转录因子(TF)已经被证实在许多细胞谱系中诱导转分化。本领域技术人员将了解的是，术语“转分化”可以涵盖第一细胞类型丧失鉴定特征并且使它的表型变成第二细胞类型的表型而不经历其中所述细胞具有胚胎特征的阶段的过程。在一些实施方案中，所述第一细胞和所述第二细胞来自不同的组织或细胞谱系。在一个实施方案中，转分化涉及将成熟或分化的细胞转化成不同的成熟或分化的细胞。确切地说，谱系特异性转录因子(TF)已经被表明在使成体细胞转化成内分泌胰腺细胞、神经元、造血细胞以及心肌细胞谱系中显示出指导性作用，这表明了转分化过程在广泛的环境中发生。在所有转分化方案中，异位TF用作潜在的广泛的、功能性的和不可逆的发育过程的短期触发因子。许多研究表明，单个TF的异位表达在涉及另外相关的原本沉默的TF的激活的过程中激活所期望的替代谱型和功能。然而，诱导的TF的时间过程、相对水平以及分级或次序仍是未知的。
通过利用由引入单个异位TF所引起的内源性转录因子(TF)诱导的相对不足，本文公开了作为受TF的分级网络影响的顺序和时间受控过程的转分化方法。
如本文所公开的人类胰岛素产生细胞产物和其制备和产生这种产物的方法是基于以下发现，即TF诱导的肝脏向胰腺的转分化是一个逐渐和连续的过程。重要的是，仅顺序施用胰腺TF，而不是使它们共同表达，选择性地驱动了内分泌胰腺内的谱系特化程序。胰腺TF以直接分级模式的顺序表达已经被证实是为转分化的细胞沿β-细胞谱系成熟所必须的。确切地说，在转分化过程的最终阶段中胰腺β-细胞特异性转录因子MafA的作用已经被鉴定。在这个阶段，MafA在与Isl1和生长抑素阻遏相关的过程中促进转分化的肝细胞沿β-细胞谱系成熟。惊人的是，发现2+1分级法(先是PDX-1和Pax4或NeuroD1，继而是MafA)成功用于在非胰腺细胞内选择性地驱动朝向胰腺表型和功能的谱系特化。
本文所述的发现表明了转录因子介导的转分化的基本时间特征，这可以有助于提高使用TF诱导的成体细胞重编程治疗包括糖尿病在内的退行性疾病的治疗功效。
胰腺转录因子(pTF)，如Pdx-1、NeuroD1、Ngn-3以及Pax4激活肝脏向胰腺的转分化并且单独地引起糖尿病小鼠的高血糖症的改善。此外，使用成人肝细胞的体外实验系统，证实Pdx-1激活许多β-细胞特异性标志物的表达并且诱导经过加工的胰岛素的受葡萄糖调节的分泌。所诱导的过程与许多关键的内源性pTF的表达有关并且在将转分化的成人肝细胞移植到糖尿病小鼠体内时表现出高血糖症的改善。然而，许多其它研究已经表明，与由单个TF的异位表达所诱导的重编程效率相比，使用几种关键的TF的组合显著地提高了重编程效率。这表明了单个异位因子将内源性补充TF激活到高效转分化过程所需的足够水平的潜在有限的能力。在胰腺器官发生期间胰腺转录因子的靶向破坏或时间错误表达会阻碍胰腺发育以及胰岛细胞分化和功能。通过利用由单个异位TF所引起的内源性TF诱导的相对不足，本文所呈现的公开内容与作为受TF的分级网络影响的顺序和时间受控过程的转分化有关。
胰腺特化是由同源异型盒转录因子Pdx1引发的，这也是为成人的β-细胞功能所需的。然后由碱性螺旋-环-螺旋因子Ngn3介导内分泌分化。配对同源异型盒因子Pax4和Arx已经作为关键因子牵涉到不同内分泌细胞类型的分离中。沿β-细胞谱系和功能的最终成熟归因于成人胰腺中β-细胞中MafA的选择性表达。
本文公开了方法和使用这些方法产生的人类胰岛素产生细胞，它们部分地基于以下惊人发现，即人类肝细胞可以被直接转分化以产生完全不同的细胞类型，即包括β细胞在内的产生胰腺激素的细胞。按时间调节的序列施用所选择的转录因子诱导成体肝细胞转分化成功能性成熟β细胞。本文所述的方法通过提供用于将成体细胞扩增和转分化的方法解决了产生大的胰岛素产生细胞或胰腺β细胞群体的问题。包含所选择的转录因子或所产生的转分化的胰腺细胞群体的组合物可以用于使用本文所述的方法来治疗胰腺病症。
先前将非胰腺细胞转分化成胰腺细胞，如β细胞的尝试仅利用了一种转录因子或超过一种胰腺转录因子的共同或同时施用。本文公开的方法提供了特异性转录因子在限定的时间点有序的顺序施用。本文公开的替代方法提供了特异性转录因子在限定的时间点的“两种pTF+一种pTF”(2+1)组合和有序的顺序施用。此外，与由单个转录因子中的每一种单独诱导的转分化效率相比，本文所述的方法显著提高了转分化效率。
本文公开了一种具有提高的转分化能力的细胞群体。这些细胞的特征在于：(1)潜在的细胞膜标志物；(2)具有激活谷氨酰胺合成酶调节元件(GSRE)的能力；以及(3)独特地配备有活性Wnt信号转导。所述群体中至少30％的细胞能够激活GSRE。举例来说，所述细胞是内皮细胞、上皮细胞、间充质细胞、成纤维细胞、或肝细胞。在一个实施方案中，所述细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以沿胰腺谱系转分化成具有胰腺功能的成熟胰腺细胞。在其它实施方案中，所述细胞可以沿神经谱系转分化成神经细胞。
因此，本文公开的方法解决了先前往往具有有限的效率的转分化或重编程方案的问题。举例来说，尽管关键的胰腺转录因子的异位表达在每一个宿主细胞中均引起表达，但是只有最多15％的细胞被成功转分化以表现出胰腺功能。
此外，本文公开了用于分离具有富集或提高的转分化能力的细胞群体的方法。举例来说，一种用于分离这些细胞的方法是通过分选出激活与谷氨酰胺合成酶调节元件或其片段可操作地连接的GFP表达的细胞，从而分离出可以激活GSRE的那些细胞来实现的。所述细胞可以通过FACS来分选并且可以在培养物中与所述细胞的其余部分分开繁殖以使具有富集的转分化能力的细胞快速扩增。具有富集的转分化能力的细胞的群体只占体内构成组织的细胞的一小部分。举例来说，在给定的组织或细胞群体中，具有富集的转分化能力的细胞的群体只占给定组织中整个细胞群体的约少于1％、2％、3％、4％、5％、约10％、约15％。因此，本文公开了用于将所述具有提高的转分化能力的细胞与不具有提高的转分化能力的细胞分离的方法。因此，本文公开的富集的非胰腺β-细胞有具有更大比例的具有提高的转分化能力的细胞的细胞群体的优势以提高转分化的效率来提供用于治疗各种疾病或病症的转分化的细胞。
对于本领域技术人员来说将显而易见的是，可以在非胰腺β-细胞转分化人类胰岛素产生细胞产物以及制备和使用所述产物的方法的精神和范围内对本文所述的方法作出各种变化和改动。
产生胰腺β-细胞的方法
本文公开了用于产生表现出成熟胰腺β细胞表型的细胞的方法，所述方法是通过使哺乳动物非胰腺细胞与胰腺转录因子，如PDX-1、Pax-4、NeuroD1、以及MafA在特定的时间点接触而实现的。在一些实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1在第一时间段接触；使来自第一步骤的细胞与Pax-4在第二时间段接触；以及使来自第二步骤的细胞与MafA在第三时间段接触。在一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1在第一时间段接触；使来自第一步骤的细胞与NeuroD1在第二时间段接触；以及使来自第二步骤的细胞与MafA在第三时间段接触。在另一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和第二转录因子在第一时间段接触以及使来自第一步骤的细胞与MafA在第二时间段接触。在又另一个实施方案中，第二转录因子选自NeuroD1和Pax4。在另一个实施方案中，连同PDX-1一起提供的转录因子包括Pax-4、NeuroD1、Ngn3、或Sox-9。在另一个实施方案中，连同PDX-1一起提供的转录因子包括Pax-4。在另一个实施方案中，连同PDX-1一起提供的转录因子包括NeuroD1。在另一个实施方案中，连同PDX-1一起提供的转录因子包括Ngn3。在另一个实施方案中，连同PDX-1一起提供的转录因子包括Sox-9。
在其它实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1在第一时间段接触；使来自第一步骤的细胞与Ngn3在第二时间段接触；以及使来自第二步骤的细胞与MafA在第三时间段接触。在其它实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1在第一时间段接触；使来自第一步骤的细胞与Sox9在第二时间段接触；以及使来自第二步骤的细胞与MafA在第三时间段接触。在另一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和第二转录因子在第一时间段接触以及使来自第一步骤的细胞与MafA在第二时间段接触，其中第二转录因子选自NeuroD1、Ngn3、Sox9、以及Pax4。
在另一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和NeuroD1在第一时间段接触以及使来自第一步骤的细胞与MafA在第二时间段接触。在另一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和Pax4在第一时间段接触以及使来自第一步骤的细胞与MafA在第二时间段接触。在另一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和Ngn3在第一时间段接触以及使来自第一步骤的细胞与MafA在第二时间段接触。在另一个实施方案中，所述方法包括使哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和Sox9在第一时间段接触以及使来自第一步骤的细胞与MafA在第二时间段接触。
在另一个实施方案中，使所述细胞同时与所有三种因子(PDX-1；NeuroD1或Pax4或Ngn3；以及MafA)接触，但是它们的表达水平以这样的方式被控制以使得它们在所述细胞内在第一时间段表达PDX-1；在第二时间段表达NeuroD1或Pax4或Ngn3；以及在第三时间段表达MafA。可以通过在每一个基因上使用适当的启动子以使所述基因依次表达、通过改变mRNA的水平、或通过本领域已知的其它手段来实现对表达的控制。
在一个实施方案中，本文所述的方法还包括在上述步骤中的任一个时、之前、或之后使所述细胞与转录因子Sox-9接触。
在一个实施方案中，所述第一时间段和所述第二时间段是相同的，从而使得细胞群体在第一时间段与两种pTF接触，其中至少一种pTF包括pDX-1；继而使所得的细胞群体与第三pTF在第二时间段接触，其中所述第三pTF是MafA。
在一个实施方案中，所述第二时间段是第一时间段之后的至少24小时。在一个替代性实施方案中，所述第二时间段是第一时间段之后的不到24小时。在另一个实施方案中，所述第二时间段是第一时间段之后的约1小时、第一时间段之后的约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、或约12小时。在一些实施方案中，所述第二时间段可以是第一时间段之后的至少24小时、至少48小时、至少72小时、以及至少1周或更长时间。
在另一个实施方案中，所述第三时间段是第二时间段之后的至少24小时。在一个替代性实施方案中，所述第三时间段是第二时间段之后的不到24小时。在另一个实施方案中，所述第三时间段与第二时间段同时。在另一个实施方案中，所述第三时间段是第二时间段之后的约1小时、第二时间段之后的约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、或约12小时。在其它实施方案中，所述第三时间段可以是第二时间段之后的至少24小时、至少48小时、至少72小时、以及至少1周或更长时间。
在一个实施方案中，所述第一时间段、所述第二时间段以及所述第三时间段是同时的，从而使细胞群体在单个时间段与三种pTF接触，其中至少一种pTF包括pDX-1，至少一种pTF包括NeuroD1或Pax4，并且至少一种pTF包括MafA。在另一个实施方案中，所述第一时间段、所述第二时间段以及所述第三时间段是同时的，从而使细胞群体在单个时间段与三种pTF接触，其中一种pTF由pDX-1组成，一种pTF由NeuroD1或Pax4组成，并且一种pTF由MafA组成。
在一个实施方案中，转录因子包括多肽、或编码所述转录因子多肽的核糖核酸或核酸。在另一个实施方案中，所述转录因子包括多肽。在另一个实施方案中，所述转录因子包括编码所述转录因子的核酸序列。在另一个实施方案中，所述转录因子包括编码所述转录因子的脱氧核糖核酸序列(DNA)。在再另一个实施方案中，所述DNA包括cDNA。在另一个实施方案中，所述转录因子包括编码所述转录因子的核糖核酸序列(RNA)。在又另一个实施方案中，所述RNA包括mRNA。
用于本文所呈现的公开内容中的转录因子可以是多肽、核糖核酸或核酸。本领域技术人员将了解的是，术语“核酸”可以涵盖DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA、微RNA或其它RNA衍生物)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物、以及其衍生物、片段和同源物。所述核酸分子可以是单链的或双链的。在一个实施方案中，所述核酸是DNA。在其它实施方案中，所述核酸是mRNA。mRNA在本文所公开的方法中是特别有利的，这是因为PDX-1的瞬时表达足以产生胰腺β细胞。可以通过本领域已知的手段将多肽、核糖核酸或核酸递送到细胞中，包括但不限于用病毒载体感染、电穿孔以及脂质体转染。
在某些实施方案中，用于本文所述的方法中的转录因子选自由以下各项组成的组：PDX-1、Pax-4、NeuroD1、以及MafA。在其它实施方案中，用于本文所述的方法中的转录因子选自由以下各项组成的组：PDX-1、Pax-4、NeuroD1、MafA、Ngn3、以及Sox9。
同源异型结构域蛋白PDX-1(胰腺和十二指肠同源异型盒基因-1)也被称为IDX-1、IPF-1、STF-1、或IUF-1，在调节胰岛发育和功能中起重要作用。PDX-1直接或间接参与各种基因的胰岛细胞特异性表达，例如像胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰岛素原转化酶1/3(PC1/3)、GLUT-2以及葡萄糖激酶。此外，PDX-1介导响应于葡萄糖的胰岛素基因转录。编码PDX-1的核酸的合适来源包括例如分别可以基因库登录号U35632和AAA88820获得的人类PDX-1核酸(和编码的蛋白质序列)。在一个实施方案中，PDX-1多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示：
MNGEEQYYAATQLYKDPCAFQRGPAPEFSASPPACLYMGRQPPpPPPHPFPGALGALEQGSPPDISPYEVPPLADDPAVAHLHHHLPAQLALPHPPAGPFPEGAEPGVLEEPNRVQLPFPWMKSTKAHAWKGQWAGGAYAAEPEENKRTRTAYTRAQLLELEKEFLFNKYISRPRRVELAVMLNLTERHIKIWFQNRRMKWKKEEDKKRGGGTAVGGGGVAEPEQDCAVTSGEELLALPP PPPPGGAVPPAAPVAAREGRLPPGLSASPQPSSVAPRRPQEPR(SEQ ID NO：4)。
在一个实施方案中，PDX-1多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO：5所示：ATGAACGGCGAGGAGCAGTACTACGCGGCCACGCAGCTTTACAAGGACCCATGCGCGTTCCAGCGAGGCCCGGCGCCGGAGTTCAGCGCCAGCCCCCCTGCGTGCCTGTACATGGGCCGCCAGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCACCCGTTCCCTGGCGCCCTGGGCGCGCTGGAGCAGGGCAGCCCCCCGGACATCTCCCCGTACGAGGTGCCCCCCCTCGCCGACGACCCCGCGGTGGCGCACCTTCACCACCACCTCCCGGCTCAGCTCGCGCTCCCCCACCCGCCCGCCGGGCCCTTCCCGGAGGGAGCCGAGCCGGGCGTCCTGGAGGAGCCCAACCGCGTCCAGCTGCCTTTCCCATGGATGAAGTCTACCAAAGCTCACGCGTGGAAAGGCCAGTGGGCAGGCGGCGCCTACGCTGCGGAGCCGGAGGAGAACAAGCGGACGCGCACGGCCTACACGCGCGCACAGCTGCTAGAGCTGGAGAAGGAGTTCCTATTCAACAAGTACATCTCACGGCCGCGCCGGGTGGAGCTGGCTGTCATGTTGAACTTGACCGAGAGACACATCAAGATCTGGTTCCAAAACCGCCGCATGAAGTGGAAAAAGGAGGAGGACAAGAAGCGCGGCGGCGGGACAGCTGTCGGGGGTGGCGGGGTCGCGGAGCCTGAGCAGGACTGCGCCGTGACCTCCGGCGAGGAGCTTCTGGCGCTGCCGCCGCCGCCGCCCCCCGGAGGTGCTGTGCCGCCCGCTGCCCCCGTTGCCGCCCGAGAGGGCCGCCTGCCGCCTGGCCTTAGCGCGTCGCCACAGCCCTCCAGCGTCGCGCCTCGGCGGCCGCAGGAACCACGATGA(SEQ ID NO：5)。
PDX-1的序列的其它来源包括分别如基因库登录号U35632和AAA18355中所示的大鼠PDX核酸和蛋白质序列，并且以引用的方式整体并入本文。另外的来源包括分别如基因库登录号AF036325和AAC41260中所示的斑马鱼PDX-1核酸和蛋白质序列，并且以引用的方式整体并入本文。
Pax-4也被称为配对盒4、配对盒蛋白4、配对盒基因4、MODY9以及KPD，是与胰高血糖素、胰岛素以及生长抑素启动子内的元件结合的胰腺特异性转录因子，并且被认为在胰岛β细胞的分化和发育中起重要作用。在一些细胞环境中，Pax-4表现出阻遏因子活性。编码Pax-4的核酸的合适来源包括例如分别可以基因库登录号NM_006193.2和AAD02289.1获得的人类Pax-4核酸(和编码的蛋白质序列)。
MafA也被称为V-maf肌腱膜纤维肉瘤致癌基因同源物A或RIPE3B1，是胰岛素基因表达的β-细胞特异性和葡萄糖调节的转录激活因子。MafA可能参与β细胞的功能和发育以及糖尿病的发病机制中。编码MafA的核酸的合适来源包括例如分别可以基因库登录号NM_201589-3和NP_963883.2获得的人类MafA核酸(和编码的蛋白质序列)。在一个实施方案中，MafA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示：
MAAELAMGAELPSSPLAIEYVNDFDLMKFEVKKEPPEAERFCHRLPPGSLSSTPLSTPCSSVPSSPSFCAPSPGTGGGGGAGGGGGSSQAGGAPGPPSGGPGAVGGTSGKPALEDLYWMSGYQHHLNPEALNLTPEDAVEALIGSGHHGAHHGAHHPAAAAAYEAFRGPGFAGGGGADDMGAGHHHGAHHAAHHHHAAHHHHHHHHHHGGAGHGGGAGHHVRLEERFSDDQLVSMSVRELNRQLRGFSKEEVIRLKQKRRTLKNRGYAQSCRFKRVQQRHILESEKCQLQSQVEQLKLEVGRLAKERDLYKEKYEKLAGRGGPGSAGGAGFPREPSPPQAGPGGAKGTADFFL(SEQ ID NO：8)。
在另一个实施方案中，MafA多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO：9所示：ATGGCCGCGGAGCTGGCGATGGGCGCCGAGCTGCCCAGCAGCCCGCTGGCCATCGAGTACGTCAACGACTTCGACCTGATGAAGTTCGAGGTGAAGAAGGAGCCTCCCGAGGCCGAGCGCTTCTGCCACCGCCTGCCGCCAGGCTCGCTGTCCTCGACGCCGCTCAGCACGCCCTGCTCCTCCGTGCCCTCCTCGCCCAGCTTCTGCGCGCCCAGCCCGGGCACCGGCGGCGGCGGCGGCGCGGGGGGCGGCGGCGGCTCGTCTCAGGCCGGGGGCGCCCCCGGGCCGCCGAGCGGGGGCCCCGGCGCCGTCGGGGGCACCTCGGGGAAGCCGGCGCTGGAGGATCTGTACTGGATGAGCGGCTACCAGCATCACCTCAACCCCGAGGCGCTCAACCTGACGCCCGAGGACGCGGTGGAGGCGCTCATCGGCAGCGGCCACCACGGCGCGCACCACGGCGCGCACCACCCGGCGGCCGCCGCAGCCTACGAGGCTTTCCGCGGCCCGGGCTTCGCGGGCGGCGGCGGAGCGGACGACATGGGCGCCGGCCACCACCACGGCGCGCACCACGCCGCCCACCACCACCACGCCGCCCACCACCACCACCACCACCACCACCATGGCGGCGCGGGACACGGCGGTGGCGCGGGCCACCACGTGCGCCTGGAGGAGCGCTTCTCCGACGACCAGCTGGTGTCCATGTCGGTGCGCGAGCTGAACCGGCAGCTCCGCGGCTTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGGCTCAAGCAGAAGCGGCGCACGCTCAAGAACCGCGGCTACGCGCAGTCCTGCCGCTTCAAGCGGGTGCAGCAGCGGCACATTCTGGAGAGCGAGAAGTGCCAACTCCAGAGCCAGGTGGAGCAGCTGAAGCTGGAGGTGGGGCGCCTGGCCAAAGAGCGGGACCTGTACAAGGAGAAATACGAGAAGCTGGCGGGCCGGGGCGGCCCCGGGAGCGCGGGCGGGGCCGGTTTCCCGCGGGAGCCTTCGCCGCCGCAGGCCGGTCCCGGCGGGGCCAAGGGCACGGCCGACTTCTTCCTGTAG(SEQ ID NO：9)。
Neurog3也被称为神经元素3或Ngn3，是胰腺和肠中的内分泌发育所需的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。编码Neurog3的核酸的合适来源包括例如分别可以基因库登录号NM_020999.3和NP_066279.2获得的人类Neurog3核酸(和编码的蛋白质序列)。
NeuroD1也被称为神经分化因子1或NeuroD以及β2，是神经D型转录因子。它是碱性螺旋-环-螺旋转录因子，所述转录因子与其它bHLH蛋白形成异二聚体并且激活含有被称为E盒的特异性DNA序列的基因的转录。它调节胰岛素基因的表达，并且该基因中的突变导致II型糖尿病。编码NeuroD1的核酸的合适来源包括例如分别可以基因库登录号NM_002500.4和NP_002491.2获得的人类NeuroD1核酸(和编码的蛋白质序列)。
在一个实施方案中，NeuroD1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示：MTKSYSESGLMGEPQPQGPPSWTDECLSSQDEEHEADKKEDDLETMNAEEDSLRNGGEEEDEDEDLEEEEEEEEEDDDQKPKRRGPKKKKMTKARLERFKLRRMKANARERNRMHGLNAALDNLRKVVPCYSKTQKLSKIETLRLAKNYIWALSEILRSGKSPDLVSFVQTLCKGLSQPTTNLVAGCLQLNPRTFLPEQNQDMPPHLPTASASFPVHPYSYQSPGLPSPPYGTMDSSHVFHVKPPPHAYSAALEPFFESPLTDCTSPSFDGPLSPPLSINGNFSFKHEPSAEFEKNYAFT MHYPAATLAGAQSHGSIFSGTAAPRCEIPIDNIMSFDSHSHHERVMSAQLNAIFHD(SEQ ID NO：6)。
在另一个实施方案中，NeuroD1多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO：7所示：ATGACCAAATCGTACAGCGAGAGTGGGCTGATGGGCGAGCCTCAGCCCCAAGGTCCTCCAAGCTGGACAGACGAGTGTCTCAGTTCTCAGGACGAGGAGCACGAGGCAGACAAGAAGGAGGACGACCTCGAAGCCATGAACGCAGAGGAGGACTCACTGAGGAACGGGGGAGAGGAGGAGGACGAAGATGAGGACCTGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGAGGATGACGATCAAAAGCCCAAGAGACGCGGCCCCAAAAAGAAGAAGATGACTAAGGCTCGCCTGGAGCGTTTTAAATTGAGACGCATGAAGGCTAACGCCCGGGAGCGGAACCGCATGCACGGACTGAACGCGGCGCTAGACAACCTGCGCAAGGTGGTGCCTTGCTATTCTAAGACGCAGAAGCTGTCCAAAATCGAGACTCTGCGCTTGGCCAAGAACTACATCTGGGCTCTGTCGGAGATCTCGCGCTCAGGCAAAAGCCCAGACCTGGTCTCCTTCGTTCAGACGCTTTGCAAGGGCTTATCCCAACCCACCACCAACCTGGTTGCGGGCTGCCTGCAACTCAATCCTCGGACTTTTCTGCCTGAGCAGAACCAGGACATGCCCCCGCACCTGCCGACGGCCAGCGCTTCCTTCCCTGTACACCCCTACTCCTACCAGTCGCCTGGGCTGCCCAGTCCGCCTTACGGTACCATGGACAGCTCCCATGTCTTCCACGTTAAGCCTCCGCCGCACGCCTACAGCGCAGCGCTGGAGCCCTTCTTTGAAAGCCCTCTGACTGATTGCACCAGCCCTTCCTTTGATGGACCCCTCAGCCCGCCGCTCAGCATCAATGGCAACTTCTCTTTCAAACACGAACCGTCCGCCGAGTTTGAGAAAAATTATGCCTTTACC ATGCACTATCCTGCAGCGACACTGGCAGGGGCCCAAAGCCACGGATCAATCTTCTCAGGCACCGCTGCCCCTCGCTGCGAGATCCCCATAGACAATATTATGTCCTTCGATAGCCATTCACATCATGAGCGAGTCATGAGTGCCCAGCTCAATGCCATATTTCATGATTAG(SEQ ID NO：7)。
Sox9是参与胚胎发育的转录因子。Sox9在骨和骨骼发育中的重要性已经被特别研究。SOX-9连同HMG盒类DNA结合蛋白的其它成员一起识别序列CCTTGAG。在本文所呈现的公开内容的背景下，Sox9的使用可能参与在诱导转分化之前或之后维持胰腺祖细胞质量。编码Sox9的核酸的合适来源包括例如分别可以基因库登录号NM_000346.3和NP_000337.1获得的人类Sox9核酸(和编码的蛋白质序列)。
在一个实施方案中，同源性是通过本领域充分描述的方法，通过用于序列比对的计算机算法确定的。举例来说，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括利用许多可用的软件包，例如像BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST增强比对应用程序)、GENPEPT以及TREMBL软件包。
在另一个实施方案中，“同源性”指的是与选自SEQ ID No：4-9的序列的大于60％的同一性。在另一个实施方案中，“同源性”指的是与选自SEQ ID No：1-76的序列的大于70％的同一性。在另一个实施方案中，所述同一性大于75％、大于78％、大于80％、大于82％、大于83％、大于85％、大于87％、大于88％、大于90％、大于92％、大于93％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、或大于99％。在另一个实施方案中，所述同一性是100％。每一种可能性代表了本文所呈现的公开内容的一个单独的实施方案。
在另一个实施方案中，同源性是经由确定候选序列杂交来确定的，其方法在本领域有充分的描述(参见例如“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”，Hames，B.D.和Higgins S.J.编著，(1985)；Sambrook等，2001，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning，A Laboratory Manual)》，纽约的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press，N.Y.)；以及Ausubel等，1989，《最新分子生物学方案(Current Protocols in MolecularBiology)》，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y)。举例来说，可以在中度到严格的条件下对编码原生胱天蛋白酶肽的DNA的互补序列进行杂交方法。杂交条件是例如在包含以下各项的溶液中在42℃孵育过夜：10％-20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×登哈特溶液(Denhardt′s solution)、10％硫酸葡聚糖、以及20μg/ml变性的剪切的鲑鱼精子DNA。
在一个实施方案中，本文所列的任何氨基酸序列的蛋白质和/或肽同源性是通过本领域充分描述的方法，包括免疫印迹分析、或经由利用许多可用的软件包中的任一种对氨基酸序列进行计算机算法分析、经由公认的方法确定的。这些软件包中的一些可以包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps软件包，并且可以例如利用Smith和Waterman算法和/或全局/局部或BLOCKS比对的使用来进行分析。确定同源性的每一种方法均代表了本文所呈现的公开内容的一个单独的实施方案。
所述细胞可以是能够产生胰腺激素的任何细胞，例如骨髓、肌肉、脾脏、肾脏、血液、皮肤、胰腺、或肝脏。在一个实施方案中，所述细胞是非胰腺细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是非胰腺β-细胞。在一个实施方案中，所述细胞能够用作胰岛，即储存、加工和分泌胰腺激素。在另一个实施方案中，分泌是葡萄糖调节的。
在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.001pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.002pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.003pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.005pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.007pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.01pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.1pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少0.5pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少1pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少5pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少10pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少50pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少100pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少500pg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少1ng胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少5ng胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少10ng胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少50ng胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少100ng胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少500ng胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少1μg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少5μg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少10μg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少50μg胰岛素/106个细胞/小时。在另一个实施方案中，葡萄糖调节的胰岛素分泌包括响应于高葡萄糖浓度至少100μg胰岛素/106个细胞/小时。
在另一个实施方案中，所述胰腺激素包括胰岛素，它可以在细胞外触发时被分泌。在另一个实施方案中，所述细胞是肝细胞。在另外的实施方案中，所述细胞是全能的或多能的。在替代性实施方案中，所述细胞是造血干细胞、胚胎干细胞或优选地，肝干细胞。在其它实施方案中，所述细胞是诱导性多能干细胞。
在一个实施方案中，在本文所公开的细胞群体的来源是人类来源。在另一个实施方案中，相对于需要胰岛素治疗的受试者，在本文所公开的细胞群体的来源是自体人类来源。在另一个实施方案中，相对于需要胰岛素治疗的受试者，在本文所公开的细胞群体的来源是同种异体人类来源。
在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞，也被称为间充质基质细胞(MSC)，如源自于肝组织、脂肪组织、骨髓、皮肤、胎盘、脐带、华顿氏胶质(Wharton′s jelly)或脐血的MSC。“脐带血”或“脐血”意在指的是从新生儿或胎儿，最优选地从新生儿获得的血液，并且优选地指的是从新生儿的脐带或胎盘获得的血液。这些细胞可以根据本领域已知的任何常规方法获得。MSC是通过某些细胞表面标志物(包括但不限于CD105、CD73以及CD90)的表达以及分化成包括成骨细胞、脂肪细胞以及成软骨细胞的多个谱系的能力来限定的。MSC可以通过常规的分离技术，如塑料贴壁、使用诸如STRO-1的单克隆抗体分离或经由经历上皮-间充质转化(EMT)的上皮细胞从组织中获得。
本领域技术人员将了解的是，术语“脂肪组织来源的间充质干细胞”可以涵盖从脂肪组织分离的未分化的成体干细胞并且也可以是具有完全相同的性质和含义的术语“脂肪干细胞”。这些细胞可以根据本领域已知的任何常规方法获得。
本领域技术人员将了解的是，术语“胎盘来源的间充质干细胞”可以涵盖从胎盘分离的未分化的成体干细胞并且在本文可以被称作具有完全相同的含义和性质的“胎盘干细胞”。
暴露于化合物，即与化合物(即PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1和/或Sox-9多肽或编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1和/或Sox-9多肽的核酸)接触的细胞群体可以是任何数量的细胞，即一个或多个细胞，并且可以在体外、体内、或离体提供。与转录因子接触的细胞群体在与所述转录因子接触之前可以在体外扩增。所产生的细胞群体表现出成熟胰腺β细胞表型。可以在转分化和沿β-细胞谱系成熟之前以及在向有需要的患者或受试者施用或递送之前，通过本领域已知的方法在体外使这些细胞扩增。
在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是例如人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、或牛。
在一些实施方案中，所述转录因子是多肽，如PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9、或其组合，并且通过本领域已知的方法向细胞递送。举例来说，将转录因子多肽直接向细胞提供或经由微粒或纳米颗粒，例如脂质体载体递送。
在一些实施方案中，所述转录因子是核酸。举例来说，所述核酸编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9多肽。编码转录因子的核酸或这样的核酸的组合可以通过本领域已知的任何手段向细胞递送。在一些实施方案中，所述核酸被并入表达载体或病毒载体中。在一个实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体。在另一个实施方案中，腺病毒载体是第一代腺病毒(FGAD)载体。在另一个实施方案中，FGAD不能整合到细胞的基因组中。在另一个实施方案中，FGAD包括E1缺失型重组腺病毒载体。在另一个实施方案中，FGAD提供所编码的多肽的瞬时表达。
表达载体或病毒载体可以通过以下各项中的任一种引入到细胞中：转染、电穿孔、感染或转导。在其它实施方案中，所述核酸是mRNA并且它是例如通过电穿孔来递送。在一个实施方案中，电穿孔的方法包括流式电穿孔技术。举例来说，在另一个实施方案中，电穿孔的方法包括使用MaxCyte电穿孔系统(美国乔治亚州的MaxCyte公司(MaxCyte Inc.GeorgiaUSA))。
在某些实施方案中，所制造的人类胰岛素产生细胞的群体包含肝表型标志物的减少。在一个实施方案中，白蛋白、α-1抗胰蛋白酶、或其组合的表达减少。在另一个实施方案中，表达内源性PDX-1的细胞群体中的少于5％表达白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。在另一个实施方案中，表达内源性PDX-1的细胞群体中的少于10％、9％、8％、7％、6％、4％、3％、2％、或1％表达白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。
倾向于转分化的细胞群体
本文所呈现的公开内容提供了倾向于转分化的肝源性细胞群体。所述细胞群体可用于本文所述的产生胰腺β细胞的方法中。本文所呈现的公开内容的倾向于转分化的细胞也可以被称为具有提高或富集的转分化能力。“提高的转分化能力”意指当本文所呈现的公开内容的细胞群体经受分化方案(即引入胰腺转录因子)时，大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％或大于80％的细胞可以分化成替代细胞类型。在一个实施方案中，具有提高的转分化能力的内皮细胞、上皮细胞、间充质细胞、成纤维细胞、或肝细胞的群体可以分化成成熟胰腺细胞或成熟神经细胞(转分化)。
在另一个实施方案中，倾向于转分化的细胞群体具有激活谷氨酰胺合成酶响应元件(GSRE)的能力。举例来说，在本文所呈现的公开内容的细胞群体中，所述群体中至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的细胞能够激活GSRE。在一个实施方案中，所述群体中至少30％的细胞能够激活GSRE。谷氨酰胺合成酶是主要在脑、肾脏以及肝脏中表达的酶，并且通过催化谷氨酸和氨缩合形成谷氨酰胺而在氮代谢中起必要的作用。谷氨酰胺合成酶例如独特地表达在中央静脉周围肝细胞和脑中的星形细胞中。本文所提供的数据表明表现出GSRE激活的细胞提供了用于分离倾向于转分化的细胞的独特的选择参数。在另一个实施方案中，倾向性细胞群体包含中央静脉周围肝细胞。
GSRE的激活可以通过本领域的普通技术人员已知的方法来测量。举例来说，可以产生重组腺病毒，所述重组腺病毒含有与启动子和报告基因，如荧光蛋白可操作地连接的谷氨酰胺合成酶响应元件。可以将这种具有GSRE-报告基因的重组腺病毒引入到含有一定比例的倾向于转分化的细胞的细胞异质混合物中。有激活GSRE的能力的那些细胞将表达报告基因，这可以通过本领域已知的方法来检测，从而鉴定出倾向于转分化的细胞。
可以使其中倾向于转分化的那些细胞是未知的异质细胞群体与腺病毒载体接触，所述腺病毒载体含有与最小TK启动子和eGFP可操作地连接的GSRE。激活GSRE的细胞将表达GFP并且可以通过本领域已知的各种方法检测GFP表达来鉴定。举例来说，倾向于转分化的GSRE激活细胞与不倾向于转分化的细胞的分离可以经由FACs设备、分选仪以及本领域普通技术人员已知的技术来实现(图14)。然后可以使所分离的倾向于转分化的细胞在体外繁殖或扩增。本文所述的结果表明将倾向于转分化的细胞传代5代-12代或更多代保留了它们的转分化能力。举例来说，分离的倾向于转分化的肝细胞持续以葡萄糖依赖性方式产生和分泌胰岛素，即使是在培养物中12次传代之后(图17)。
在另一个实施方案中，倾向于转分化的细胞群体还具有活性Wnt信号转导通路。Wnt信号转导通路在干细胞多能性和发育期间细胞的命运以及体轴模式化、细胞增殖和细胞迁移中起重要作用。Wnt信号转导通路是由Wnt蛋白配体与卷曲受体(Fz)家族受体(G偶联蛋白受体)结合，任选地激活辅助受体蛋白，以及随后激活被称作蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh)的细胞质蛋白而被激活的。在经典的Wnt通路中，辅助受体LRP-5/6也被激活并且β-连环蛋白在细胞质中积聚并且最终易位到核中以用作TCF/LEF转录因子的转录共激活因子。在不存在Wnt信号转导的情况下，包括诸如结肠腺瘤样息肉(APC)、轴蛋白、蛋白质磷酸酶2A(PP2A)、糖原合酶激酶3(GSK3)以及酪蛋白激酶1α(CK1α)的蛋白质的破坏复合物靶向β-连环蛋白以使其发生泛素化和后续由蛋白酶体的降解。然而，卷曲受体由Wnt结合而激活会对破坏复合物造成破坏，从而允许β-连环蛋白积聚。
Wnt信号转导也可能经由非经典通路发生，所述通路利用不同的辅助受体蛋白并且激活不同的下游效应因子以例如调节细胞骨架、刺激钙从内质网释放、激活mTOR通路、以及调节肌发生。
本领域的普通技术人员可以容易地使用本领域已知的方法来确定Wnt信号转导通路的激活。举例来说，表达Wnt3a、降低水平的DKK1或DKK3、降低水平的APC、升高的激活的β-连环蛋白水平、或STAT3结合元件的细胞具有活性Wnt信号转导通路。DKK1、DKK3、以及APC是Wnt信号转导通路的已知抑制因子。指示活性Wnt信号转导通路的其它信号转导效应因子是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，所公开的方法还包括用锂处理所述原代成人肝细胞群体，其中所述经过处理的群体富含倾向于转分化的细胞。在另一个实施方案中，所公开的方法还包括用锂处理所述原代成人肝细胞群体，其中所述群体内所述倾向于转分化的细胞在用锂处理之后具有提高的倾向。因此，可以通过用锂处理原代成体细胞群体来建立倾向于转分化的细胞的富集群体。
在一个实施方案中，用10mM的锂处理原代成体细胞群体。在另一个实施方案中，用1mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用1mM-10mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用2mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用3mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用4mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用5mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用6mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用7mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用8mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用9mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用约10mM-20mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用15mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用20mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用10mM-50mM的锂处理原代成体细胞群体。在一个实施方案中，用10mM-100mM的锂处理原代成体细胞群体。
在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前处理细胞。在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前12小时处理细胞。在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前24小时处理细胞。在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前36小时处理细胞。在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前48小时处理细胞。在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前60小时处理细胞。在另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)之前72小时处理细胞。在又另一个实施方案中，在转分化(第一时间段)时处理细胞。
在一个实施方案中，用于本文所公开的方法中的细胞群体倾向于转分化成胰腺谱系，其中所述转分化的细胞表现出胰腺表型和功能。举例来说，转分化的细胞表现出成熟胰腺β细胞表型和功能，包括但不限于表达、产生、和/或分泌胰腺激素。胰腺激素可以包括但不限于胰岛素、生长抑素、胰高血糖素、或胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)。胰岛素可以是肝胰岛素或血清胰岛素。在一个实施方案中，胰岛素是能够促进葡萄糖利用、以及碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的完全加工形式的胰岛素。举例来说，倾向于转分化的细胞可以占异质体外原代人类肝细胞培养物中所有细胞的约15％。当细胞异位表达pTF时，培养物中大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％的细胞产生胰岛素或分泌C-肽。
在一个实施方案中，倾向于转分化的细胞群体位于肝脏的中央静脉附近，或是中央静脉周围肝细胞。如本文所示，尽管超过40％-50％的肝细胞异位表达胰腺转录因子，如PDX-1，但是只有一部分的细胞在pTF表达时产生胰岛素。这些胰岛素产生细胞(IPC)主要位于中央静脉附近，如图10B所示。这些细胞的特征还在于表达谷氨酰胺合成酶和活性Wnt信号转导。
在另一个实施方案中，用于本文所公开的方法中的细胞群体倾向于转分化成神经谱系，其中所述转分化的细胞表达神经标志物、表现出神经表型、或表现出神经功能。所述转分化的细胞可以是神经元或胶质细胞。
在另一个实施方案中，具有提高的转分化倾向的细胞可以经由特异性细胞表面标志物来鉴定。举例来说，当与没有转分化倾向的细胞相比时，具有升高的HOMER1、LAMP3或BMPR2水平的细胞指示了具有提高的转分化能力的细胞。当与没有转分化倾向的细胞相比时，具有降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4或PRNP水平的细胞指示了具有提高的转分化能力的细胞。所述的细胞表面标志物的任何组合可以用于区分倾向于转分化的细胞群体与不倾向于转分化的细胞群体。这些细胞表面标志物的抗体是可商购获得的。可以利用本领域已知的免疫测定或免疫亲和技术来区分具有提高的转分化能力的细胞与没有转分化能力的那些细胞。
相对于使非胰腺细胞的异质群体分化以产生表现出胰腺细胞表型的细胞，使用本文所呈现的公开内容的细胞群体产生表现出胰腺细胞表型的细胞提供了某些优势。先前的描述了使胰腺转录因子(pTF)，如PDX-1在非胰腺细胞(即肝细胞)的异质群体中表达的研究显示最多只有15％的表达PDX-1的细胞有产生胰岛素的能力。因此，只有15％的细胞被成功地分化成能够产生和分泌胰腺激素的成熟胰腺β细胞。相反，将pTF引入到本文所呈现的公开内容的细胞群体中使得至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的细胞分化成成熟胰腺β细胞表型，例如产生胰岛素、胰高血糖素、和/或分泌c-肽。在一个实施方案中，当本文所呈现的公开内容的细胞群体的细胞表达胰腺转录因子时，至少30％的细胞产生胰岛素或分泌C-肽。
转分化的方法
本文所呈现的公开内容还提供了用于利用具有提高的转分化能力的细胞群体产生表现出成熟分化细胞类型的细胞的方法，其中所述分化细胞与起始细胞群体具有不同的表型。举例来说，具有提高的转分化能力的细胞(即上皮细胞、成纤维细胞或肝细胞)的群体可以沿胰腺谱系或神经谱系分化成细胞以表现出成熟分化胰腺或神经细胞表型。可以利用本领域已知的用于使细胞分化成胰腺谱系或神经谱系的任何手段。
在一个实施方案中，可以经由使神经转录因子表达来使倾向于转分化的细胞群体沿神经谱系分化。合适的神经转录因子是本领域已知的。在其它实施方案中，可以经由使细胞与各种细胞因子、生长因子、或本领域已知的其它试剂接触以使细胞分化成神经谱系来使本文所呈现的公开内容的细胞群体分化成成熟的神经细胞。分化的神经细胞可以表达神经标志物、表现出神经表型(即神经基因表达谱)、或表现出神经功能。分化的细胞可以是神经元或胶质细胞。
在另一个实施方案中，可以经由使胰腺转录因子表达来使倾向于转分化的细胞群体沿胰腺谱系分化。所述胰腺转录因子是例如PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或其组合。用于产生胰腺β细胞的方法描述于美国专利号6,774,120和美国公开号2005/0090465中，它们的内容以引用的方式整体并入本文。
在另一个实施方案中，可以经由本文所述的方法使倾向于转分化的细胞群体沿胰腺谱系分化。
胰腺β-细胞表型
本文所提供的方法产生具有成熟胰腺β细胞表型或功能的细胞。本领域技术人员将了解的是，术语“胰腺β细胞表型或功能”可以涵盖显示出胰腺β细胞典型的一个或多个特征的细胞，即胰腺激素产生、加工、储存于分泌颗粒中、激素分泌、胰腺基因启动子的激活、或特征性β细胞基因表达谱。激素分泌包括营养和/或激素调节的分泌。在一个实施方案中，所产生的细胞表现出如本文所述的至少一种胰腺β细胞表型或功能。
所述胰腺激素可以是例如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)。胰岛素可以是肝胰岛素或血清胰岛素。在另一个实施方案中，所述胰腺激素是肝胰岛素。在一个替代性实施方案中，所述胰腺激素是血清胰岛素(即能够促进例如葡萄糖利用、碳水化合物、脂肪以及蛋白质代谢的完全加工形式的胰岛素)。
在一些实施方案中，所述胰腺激素呈“激素原”形式。在其它实施方案中，所述胰腺激素呈激素的完全加工生物活性形式。在其它实施方案中，所述胰腺激素处在调节控制下，即激素的分泌处在营养和激素控制下，这类似于内源性产生的胰腺激素。举例来说，在本文所公开的一个实施方案中，所述激素处在葡萄糖的调节控制下。
胰腺β细胞表型可以例如通过测量胰腺激素产生，即胰岛素、生长抑素或胰高血糖素蛋白质mRNA或蛋白质表达来确定。激素产生可以通过本领域已知的方法，即免疫测定、蛋白质印迹、受体结合测定或在功能上通过在植入糖尿病宿主体内时改善高血糖症的能力来确定。胰岛素分泌还可以通过例如C-肽加工和分泌来测量。在另一个实施方案中，可以利用高灵敏度测定来测量胰岛素分泌。在另一个实施方案中，高灵敏度测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、mesoscale discovery测定(MSD)、或酶联免疫斑点测定(ELISpot)、或本领域已知的测定。
在一些实施方案中，可以使用本文所说明的方法引导所述细胞产生和分泌胰岛素。细胞产生胰岛素的能力可以通过本领域的普通技术人员已知的多种方法来测定。举例来说，胰岛素mRNA可以通过RT-PCR来检测或胰岛素可以通过针对胰岛素所产生的抗体来检测。此外，胰腺分化的其它指标包括基因Isl-1、Pdx-1、Pax-4、Pax-6、以及Glut-2的表达。用于鉴定胰岛细胞的其它表型标志物公开于整体并入本文的U.S.2003/0138948中。
胰腺β细胞表型可以例如通过胰腺特异性基因的启动子激活来确定。特别关注的胰腺特异性启动子包括胰岛素和胰腺转录因子，即内源性PDX-1的启动子。启动子激活可以通过本领域已知的方法，例如通过荧光素酶测定、EMSA、或检测下游基因表达来确定。
在一些实施方案中，胰腺β-细胞表型还可以通过诱导胰腺基因表达谱来确定。本领域技术人员将了解的是，术语“胰腺基因表达谱”可以涵盖包括在非内分泌组织中通常转录沉默的一种或多种基因，即胰腺转录因子、胰酶或胰腺激素的表达的谱。胰酶是例如PCSK2(PC2或激素原转化酶)、PC1/3(激素原转化酶1/3)、葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)。胰腺特异性转录因子包括例如Nkx2.2、Nkx6.1、Pax-4、Pax-6、MafA、NeuroD1、NeuroG3、Ngn3、β-2、ARX、BRAIN4以及Isl-1。
胰腺基因表达谱的诱导可以使用本领域的普通技术人员公知的技术来检测。举例来说，胰腺激素RNA序列可以在例如RNA印迹杂交分析、基于扩增的检测方法(如基于逆转录的聚合酶链反应)或通过微阵列芯片分析进行的全身检测中被检测。或者，还可以在蛋白质水平上，即通过测量所述基因编码的多肽的水平来测量表达。在一个具体实施方案中，PC1/3基因或蛋白质表达可以通过它将激素原加工成它们的活性成熟形式的活性来确定。这样的方法是本领域公知的并且包括例如基于针对由所述基因编码的蛋白质的抗体的免疫测定、或经过加工的激素原的HPLC。
在一些实施方案中，由本文所述的方法产生的表现出成熟β-细胞表型的细胞可以阻遏原始细胞的至少一种基因或基因表达谱。举例来说，被诱导而表现出成熟β-细胞表型的肝细胞可以阻遏至少一种肝特异性基因。本领域技术人员可以使用本领域已知的方法，即测量由所述基因编码的mRNA或多肽的水平容易地确定原始细胞和所产生的细胞的肝特异性基因表达。在比较时，肝特异性基因表达的减少将表明转分化已经发生。
在某些实施方案中，本文所公开的转分化的细胞包含肝表型标志物的减少。在一个实施方案中，白蛋白、α-1抗胰蛋白酶、或其组合的表达减少。在另一个实施方案中，表达内源性PDX-1的细胞群体中的少于5％表达白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。在另一个实施方案中，表达内源性PDX-1的转分化细胞中的少于10％、9％、8％、7％、6％、4％、3％、2％、或1％表达白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。
治疗胰腺病症的方法
本文所呈现的公开内容公开了用于在受试者中治疗，即预防或延迟胰腺病症发病或缓解胰腺病症的症状的方法。举例来说，所述胰腺病症是退行性胰腺病症。本文所公开的方法特别可用于由胰腺细胞，例如胰岛β细胞的丧失或胰腺细胞功能的丧失所引起或导致胰腺细胞，例如胰岛β细胞的丧失或胰腺细胞功能的丧失的那些胰腺病症。
常见的退行性胰腺病症包括但不限于：糖尿病(例如I型、II型、或妊娠糖尿病)以及胰腺癌。可以通过使用本文所公开的方法治疗的其它胰腺病症或胰腺相关病症是例如高血糖症、胰腺炎、胰腺假性囊肿或由损伤所引起的胰腺创伤。此外，已经接受胰腺切除术的个体也适于通过所公开的方法来治疗。
糖尿病是以三种形式存在的代谢紊乱：1型、2型和妊娠糖尿病。1型或IDDM是一种自身免疫性疾病；免疫系统破坏胰腺的胰岛素产生β细胞，从而降低或消除胰腺产生胰岛素的能力。1型糖尿病患者必须每日服用胰岛素补充剂来维持生命。症状通常快速产生并且包括口渴和排尿增加、长期饥饿、体重减轻、视力模糊以及疲劳。2型糖尿病是最常见的，见于90％至95％的糖尿病患者中。它与年龄较大、肥胖症、家族史、先前妊娠糖尿病、身体不活动以及种族有关。妊娠糖尿病只在妊娠期发生。患妊娠糖尿病的女性有20％至50％的在5年至10年内患2型糖尿病的可能性。
患有糖尿病或有患糖尿病的风险的受试者是通过本领域已知的方法，如确定血糖水平来鉴定的。举例来说，至少两次在过夜禁食之后血糖值高于140mg/dL则意味着个体患有糖尿病。没患糖尿病或没有患糖尿病的风险的人的特征在于具有70mg/dL-110mg/dL的空腹糖水平。
糖尿病的症状包括疲劳、恶心、频繁排尿、过度口渴、体重减轻、视力模糊、频繁感染以及伤口或疮愈合缓慢、血压始终等于或高于140/90、HDL胆固醇低于35mg/dL或甘油三酯大于250mg/dL、高血糖症、低血糖症、胰岛素缺乏或抵抗。接受化合物施用的糖尿病患者或糖尿病前期患者是使用本领域已知的诊断方法来鉴定的。
高血糖症是一种胰腺相关病症，其中过量的葡萄糖在血浆中循环。这一般是高于(200mg/dl)的葡萄糖水平。患有高血糖症的受试者可能患有糖尿病或可能没有糖尿病。
胰腺癌是美国第四大最常见的癌症，主要发生在超过60岁的人中，并且具有任何癌症的最低五年存活率。腺癌是胰腺癌的最常见类型，发生在胰管的内层中；囊腺癌和腺泡细胞癌较罕见。然而，良性肿瘤也在胰腺内生长；这些包括胰岛素瘤，即分泌胰岛素的肿瘤；胃泌素瘤，它分泌高于正常水平的胃泌素；以及胰高血糖素瘤，即分泌胰高血糖素的肿瘤。
胰腺癌没有已知的病因，但是有几种风险，包括糖尿病、吸烟以及慢性胰腺炎。症状可以包括上腹部疼痛、食欲不振、黄疸、体重减轻、消化不良、恶心或呕吐、腹泻、疲劳、瘙痒或腹部器官肿大。使用超声、计算机断层扫描、磁共振成像、ERCP、经皮肝穿刺胆管造影术、胰腺活检或血液检查来作出诊断。治疗可以包括手术、放射治疗或化学治疗、用于疼痛或瘙痒的药物、口服酶制剂或胰岛素治疗。
胰腺炎是胰腺的炎症和自身消化。在自身消化中，胰腺被它自身的酶破坏，从而引起炎症。急性胰腺炎通常仅涉及单次发病，之后胰腺将恢复正常。然而，慢性胰腺炎涉及胰腺和胰腺功能的永久性损伤并且可能导致纤维化。或者，它可以在几次发作之后消退。胰腺炎最常是由胆结石阻塞胰管或滥用酒精所引起，滥用酒精可能导致小的胰小管被阻塞。其它病因包括腹部创伤或手术、感染、肾衰竭、狼疮、囊性纤维化、肿瘤或蝎毒刺伤。
经常与胰腺炎相关的症状包括腹部疼痛，可能放射到背部或胸部、恶心或呕吐、速脉、发热、上腹部肿胀、腹水、血压降低或轻度黄疸。症状在被鉴定为与胰腺炎相关之前可能归因于其它疾病。
治疗神经病症的方法
本文所呈现的公开内容还提供了用于治疗患有神经疾病或病症，如神经退行性疾病或病症的受试者的方法。本文所述的细胞群体可用于经由补充退化的或非功能性的细胞来治疗患有特征在于神经细胞或神经功能丧失的神经疾病或病症的受试者。可以使用本文所述的方法治疗的神经退行性疾病包括但不限于帕金森氏病(Parkinson′s disease)、似帕金森氏病症(Parkinsonian disorder)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、路易体病(Lewy body disease)、年龄相关神经退行性变、神经系统癌症、以及由手术、事故、缺血或中风所导致的脑创伤。可以使本文所述的细胞群体分化成具有神经功能的神经细胞群体，并且可以向患有神经疾病或病症的受试者施用所述分化的神经细胞群体。
重组表达载体和宿主细胞
本文所公开的另一个实施方案涉及载体。在一个实施方案中，用于本文所公开的方法中的载体包括表达载体。在另一个实施方案中，表达载体包含编码PDX-1、Pax-4、NeuroD1或MafA蛋白质、或其它胰腺转录因子，如Ngn3的核酸、或其衍生物、片段、类似物、同源物或组合。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码以下转录因子中的任一种的单一核酸：PDX-1、Pax-4、NeuroD1、Ngn3、MafA、或Sox-9或其衍生物或片段。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码以下转录因子的任何组合的两种核酸：PDX-1、Pax-4、NeuroD1、Ngn3、MafA、或Sox-9或其衍生物或片段。在又另一个实施方案中，所述表达载体包含编码PDX-1和NeuroD1的核酸。在再另一个实施方案中，所述表达载体包含编码PDX-1和Pax4的核酸。在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码MafA的核酸。
本领域技术人员将了解的是，术语“载体”涵盖了能够转运已经与它连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它涵盖了当中可以连接另外的DNA片段的线性或环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，并且从而连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。一般来说，用于重组DNA技术中的表达载体常常呈质粒形式。本领域技术人员将了解的是，术语“质粒”和“载体”可以互换使用，具有完全相同的性质和含义。在一个实施方案中，术语“质粒”是最常用的载体形式。然而，本文所呈现的公开内容意图包括这样的其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒以及腺相关病毒)，它们发挥等同的功能。此外，一些病毒载体能够特异性地或非特异性地靶向特定的细胞类型。
本文所公开的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本文所公开的核酸，这意味着所述重组表达载体包括一个或多个调节序列，所述调节序列是基于待用于表达的宿主细胞来选择的，与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体内，本领域技术人员将了解的是，术语“可操作地连接”可以涵盖所关注的核苷酸序列以允许所述核苷酸序列(例如在体外转录/翻译系统中或当将所述载体引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)表达的方式与所述一个或多个调节序列连接。本领域技术人员将了解的是，术语“调节序列”可以涵盖启动子、增强子以及其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列描述于例如Goeddel；《基因表达技术(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY)》：《酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)》，185，加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(AcademicPress，San Diego，Calif.)(1990)中。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列的组成型表达的那些序列以及只在某些宿主细胞中引导核苷酸序列的表达的那些序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当了解的是，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白质的表达水平等因素。在此所公开的表达载体可以被引入宿主细胞中，从而产生蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽，所述蛋白质或肽由如本文所述的核酸编码(例如PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9蛋白质、或其突变形式或融合蛋白等)。
举例来说，表达载体包含与启动子可操作地连接的编码转录因子的一种核酸。在包含编码转录因子的两种核酸的表达载体中，每一种核酸可以与启动子可操作地连接。与每一种核酸可操作地连接的启动子可以是不同的或相同的。或者，这两种核酸可以与单个启动子可操作地连接。可用于在此公开的表达载体的启动子可以是本领域已知的任何启动子。本领域普通技术人员可以容易地确定用于其中待表达核酸的宿主细胞的合适的启动子、所期望的蛋白质的表达水平、或表达时间等。所述启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、或细胞类型特异性启动子。
在此所公开的重组表达载体可以被设计用于在原核细胞或真核细胞中表达PDX-1。举例来说，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、和/或Sox-9可以在诸如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞进一步论述于Goeddel，《基因表达技术(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY)》：《酶学方法(METHODSIN ENZYMOLOGY)》，185，加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)中。或者，重组表达载体可以在体外被转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核生物中的表达最常是在大肠杆菌中用含有引导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体进行的。融合载体将许多氨基酸添加到其中所编码的蛋白质中，通常是添加到重组蛋白的氨基末端。这样的融合载体通常用于三个目的：(1)增加重组蛋白的表达；(2)增加重组蛋白的溶解度；以及(3)通过在亲和纯化中用作配体来帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这样的酶和它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以及肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(法玛西亚生物科技公司(Pharmacia Biotech Inc)；Smith和Johnson(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Beverly，Mass.))以及pRIT5(新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia，Piscataway，N.J.))，它们分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A与靶重组蛋白融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等，(1988)Gene69：301-315)和pET 11d(Studier等，《基因表达技术(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY)》：《酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)》，185，加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)60-89)。
使重组蛋白的表达在大肠杆菌中达到最大的一种策略是使蛋白质在具有受损的蛋白水解切割重组蛋白的能力的宿主细菌中表达。参见Gottesman，《基因表达技术(GENEEXPRESSION TECHNOLOGY)》：《酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)》，185，加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)119-128。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列以使得每一个氨基酸的单个密码子是在大肠杆菌中优先利用的那些(Wada等，(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。在此所公开的核酸序列的这样的改变可以通过标准DNA合成技术来进行。
在另一个实施方案中，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EMBO J 6：229-234)、pMFa(Kujan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)、pYES2(加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.))、以及picZ(加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司)。
或者，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol Cell Biol3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。
在又另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体使在此所公开的核酸在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J 6：187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常是由病毒调节元件提供的。举例来说，常用的启动子源自于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒以及猿猴病毒40。关于用于原核细胞和真核细胞这两者的其它合适的表达系统，参见例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)》，第2版，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社的冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，1989的第16章和第17章。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定的细胞类型中表达(例如使用组织特异性调节元件表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等(1987)Genes Dev 1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv Immunol43：235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J 8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等(1983)Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33：741-748)；神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230：912-916)、以及乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev 3：537-546)。
本文的公开内容还提供了一种重组表达载体，所述载体包含以反义定向克隆到表达载体中的在此所公开的DNA分子。也就是说，所述DNA分子以允许与PDX mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子的转录)的方式与调节序列可操作地连接。可以选择与以反义定向克隆的核酸可操作地连接的引导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达的调节序列，例如病毒启动子和/或增强子，或可以选择引导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。反义表达载体可以呈重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸是在高效率调节区的控制下产生的，该高效率调节区的活性可以由当中引入载体的细胞类型决定。关于使用反义基因调节基因表达的论述，参见Weintraub等，“作为遗传分析的分子工具的反义RNA(Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis)”，Reviews--Trends in Genetics，第1(1)卷，1986。
本文公开的另一个实施方案涉及当中已经引入在此所公开的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应当了解的是，这样的术语不仅指的是特定的主题细胞，而且还指的是这样的细胞的后代或潜在后代。由于在后代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，因此这样的后代实际上可能与亲本细胞不相同，但是仍被包括在如本文所用的术语的范围内。此外，宿主细胞一旦表达PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9或其组合就可以被调节，并且可以维持或丧失原始特征。
宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。举例来说，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9蛋白质可以在诸如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。或者，宿主细胞可以是早熟的哺乳动物细胞，即多能干细胞。宿主细胞还可以源自于其它人类组织。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可以经由常规的转化、转导、感染或转染技术引入到原核细胞或真核细胞中。本领域技术人员将了解的是，术语“转化”、“转导”、“感染”以及“转染”可以涵盖多种本领域公认的用于将外来核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、或电穿孔。此外，转染可以由转染剂介导。本领域技术人员将了解的是，术语“转染剂”可以涵盖介导DNA并入到宿主细胞中的任何化合物，例如脂质体。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以见于Sambrook等(《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL)》，第2版，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社的冷泉港实验室，1989)和其它实验室手册中。
转染可以是“稳定的”(即外来DNA整合到宿主基因组中)或“瞬时的”(即DNA以游离的形式在宿主细胞中表达)或将mRNA电穿孔到细胞中)。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分的细胞可以将外来DNA整合到它们的基因组中，其余的DNA仍是游离的。为了鉴定和选择这些整合体，一般将编码选择性标记(例如抗生素抗性)的基因连同所关注的基因一起引入到宿主细胞中。各种选择性标记包括赋予对药物，如G418、潮霉素(hygromycin)以及甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性的那些。编码选择性标记的核酸可以在与编码PDX-1的载体相同的载体上引入到宿主细胞中或可以在不同的载体上引入。被所引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如已经含有选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。在另一个实施方案中，受PDX-1调节的细胞或转染的细胞是通过诱导内源性报告基因的表达来鉴定的。在一个具体的实施方案中，所述启动子是驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的胰岛素启动子。
在一个实施方案中，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9核酸存在于病毒载体中。在一个实施方案中，PDX-1和NeuroD1核酸存在于同一病毒载体中。在另一个实施方案中，PDX-1和Pax4核酸存在于同一病毒载体中。在另一个实施方案中，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9核酸被封装在病毒中。在另一个实施方案中，PDX-1和NeuroD1被封装在病毒中(即编码PDX-1和NeuroD1的核酸被封装在同一病毒颗粒中)。在另一个实施方案中，PDX-1和Pax4被封装在病毒中(即编码PDX-1和Pax4的核酸被封装在同一病毒颗粒中)。在一些实施方案中，所述病毒优选地感染各种组织类型的多能细胞，例如造血干细胞、神经元干细胞、肝脏干细胞或胚胎干细胞，优选地，所述病毒是嗜肝的。本领域技术人员将了解的是，术语“嗜肝”意指病毒具有优选地特异性或非特异性靶向肝脏的细胞的能力。在另外的实施方案中，所述病毒是调节型肝炎病毒、SV-40、或爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(Epstein-Barvirus)。在又另一个实施方案中，所述病毒是腺病毒。
基因治疗
在一个实施方案中，如本文所公开的编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽或其组合的一种核酸或多种核酸或其功能衍生物是经由基因治疗施用的。基因治疗指的是通过向受试者施用特定的核酸来进行的治疗。在一个实施方案中，核酸产生它编码的一种或多种肽，所述肽然后用来通过调节上述疾病或病症，例如糖尿病的功能来发挥治疗作用。本领域中可用的与基因治疗有关的方法中的任一种可以用于实施本文所呈现的公开内容。参见例如Goldspiel等，1993.Clin Pharm 12：488-505。
在另一个实施方案中，治疗剂包含作为在合适的宿主内表达上述PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、和/或Sox-9多肽、或其片段、衍生物或类似物中的任何一种或多种的表达载体的一部分的核酸。在一个实施方案中，这样的核酸具有与PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1以及Sox-9多肽的一个或多个编码区可操作地连接的启动子。所述启动子可以是诱导型的或组成型的、以及任选地，组织特异性的。所述启动子可以是例如病毒或哺乳动物来源的。在另一个具体实施方案中，使用如下的核酸分子，其中编码序列(和任何其它所期望的序列)由促进基因组内所期望的位点处的同源重组的区域侧接，从而提供核酸的染色体内表达。参见例如Koller和Smithies，1989.Proc Natl Acad Sci USA 86：8932-8935。在又另一个实施方案中，所递送的核酸保持游离并且诱导内源性和原本沉默的基因。
向患者体内递送治疗性核酸可以是直接的(即，使患者直接暴露于核酸或含有核酸的载体)或间接的(即，首先使细胞在体外与核酸接触，然后移植到患者体内)。这两种方法分别被称为体内或离体基因治疗。在另一个实施方案中，直接在体内施用核酸，其中它被表达以产生编码产物。这可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来实现，包括但不限于将所述核酸构建成适当的核酸表达载体的一部分并且将其以这样的方式施用以使得它变成细胞内的(例如通过使用有缺陷的或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体感染；参见美国专利号4,980,286)；直接注射裸DNA；使用微粒轰击(例如Gene Gun.RTM；Biolistic，杜邦公司(DuPont))；用脂质包被所述核酸；使用相关的细胞表面受体/转染剂；封装在脂质体、微粒、或微囊中；将它在与已知进入核的肽连接的状态下施用；或通过将它在与倾向于受体介导的内吞的配体连接的状态下施用(参见例如Wu和Wu，1987.J Biol Chem 262：4429-4432)，这可以用于“靶向”特异性表达所关注的受体的细胞类型；等。
基因治疗的另外的方法涉及通过诸如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染、病毒感染等方法在体外组织培养物中将基因或mRNA转移到细胞中。一般来说，转移的方法包括同时将选择性标记转移到细胞中。然后使细胞处于选择压力(例如抗生素抗性)下以促进已经摄取并且正表达转移的基因的那些细胞分离。然后向患者递送那些细胞。在另一个实施方案中，在体内施用所得的重组细胞之前，通过本领域已知的任何方法将核酸引入到细胞中，包括但不限于：转染、电穿孔、显微注射、用含有所关注的核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合、以及确保接受体细胞的必要的发育和生理功能不会因转移而被破坏的类似方法。参见例如Loeffler和Behr，1993.Meth Enzymol 217：599-618。所选择的技术应当使得核酸被稳定转移到细胞中，以使得所述核酸是可由所述细胞表达的。在又另一个实施方案中，所述转移的核酸是可遗传的并且可由细胞后代表达。在一个替代性实施方案中，转移的核酸保持游离并且诱导原本沉默的内源性核酸表达。
在一个实施方案中，可以通过本领域已知的各种方法向患者递送所得的重组细胞，包括但不限于注射上皮细胞(例如皮下)、将重组皮肤细胞作为皮肤移植物施用到患者身上、以及静脉内注射重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)或肝细胞。被设想使用的细胞的总数取决于所期望的作用、患者状态等，并且可以由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，在如本文所公开的治疗方法中需要使用至少106个转分化细胞。在另一个实施方案中，在如本文所公开的治疗方法中需要使用至少107个转分化细胞、至少108个转分化细胞、至少109个转分化细胞、或至少1010个转分化细胞。在又另一个实施方案中，在如本文所公开的治疗方法中需要使用约1.8×109个转分化细胞。
当中可以引入核酸以实现基因治疗的目的的细胞涵盖了任何所期望的可用的细胞类型，并且可以是异种的、异基因的、同基因的、或自体的。细胞类型包括但不限于分化的细胞，如上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞和血细胞、或各种干细胞或祖细胞，特别是胚胎心肌细胞、肝脏干细胞(国际专利公开WO 94/08598)、神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985)、造血干细胞或祖细胞，例如，如从骨髓、脐带血、外周血液、胎儿肝脏等所获得。在一个优选的实施方案中，被用于基因治疗的细胞是患者自体的。
用于基因治疗的DNA可以肠胃外，例如静脉内、皮下、肌内、以及腹膜内向患者施用。DNA或诱导剂是在药学上可接受的载体，即适用于向动物施用的生物相容媒介物，例如生理盐水中施用的。治疗有效量是能够产生医学上所期望的结果，例如接受治疗的动物的胰腺基因增加的量。这样的量可以由本领域的普通技术人员确定。如医学领域公知的那样，用于任何给定患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体格大小、体表面积、年龄、待施用的具体的化合物、性别、施用时间和途径、一般健康情况、以及同时施用的其它药物。剂量可以变化，但是用于静脉内施用DNA的优选剂量是约106个至1022个拷贝的DNA分子。举例来说，以每公斤约2×1012个病毒体施用DNA。
制造人类胰岛素产生(IP)细胞的方法
制造人类胰岛素产生细胞可以克服可用于基于细胞的治疗的组织的短缺，例如以用于治疗患有I型糖尿病的受试者。在一个实施方案中，制造足够数目的人类胰岛素产生细胞的方法提供了用于这些和其它治疗中的基于细胞的产物，如本文所公开的那样(图32)。
现在参考图34，图34示出了人类胰岛素产生细胞产物的制造过程的流程图，该人类胰岛素产生细胞产物在一个实施方案中可以是自体的或同种异体的胰岛素产生细胞(AIP)。图34描述了人类胰岛素产生细胞的制造过程的一个实施方案，其中起始材料包含肝组织。本领域技术人员将认识到的是，非胰腺β-细胞组织的任何来源均可以用于该制造过程中。
图34中所示的许多步骤的实施方案在整个本申请中被详细描述，并且在本文不再赘述，尽管它们在本文应当被考虑。还参考实施例20和21，它们举例说明了这些步骤中的许多步骤。简单地说，所述制造过程可以基于以下所呈现的步骤来理解。
如步骤1所示：获得肝组织。在一个实施方案中，肝组织是人类肝组织。在另一个实施方案中，所述肝组织是作为活检的一部分获得的。在另一个实施方案中，肝组织是经由本领域已知的任何手术程序获得的。在另一个实施方案中，由熟练的执业医师获得肝组织。在另一个实施方案中，所获得的肝组织是来自健康个体的肝组织。在一个相关的实施方案中，所述健康个体是需要以葡萄糖调节方式提供经过加工的胰岛素的基于细胞的治疗的患者的同种异体供体，所述患者例如I型糖尿病患者或患胰腺炎的患者。在另一个实施方案中，进行供体筛选和供体检查以确保从没有显示出感染性疾病或恶性疾病的临床证据或身体证据或风险因素的供体获得组织来制造AIP细胞。在又另一个实施方案中，肝组织是从需要以葡萄糖调节方式提供经过加工的胰岛素的基于细胞的治疗的患者获得的，所述患者例如I型糖尿病患者或患胰腺炎的患者。在再另一个实施方案中，肝组织与需要以葡萄糖调节方式提供经过加工的胰岛素的基于细胞的治疗的患者是自体的，所述患者例如I型糖尿病患者或患胰腺炎的患者。
如步骤2所示：回收和处理原代肝细胞。使用本领域用于回收待用于进一步处理的贴壁细胞的公知技术来处理肝组织。在一个实施方案中，将肝组织切成约1mm-2mm的小块并且在无菌缓冲溶液中通过移液管上下轻轻吹吸。然后可以将样品与胶原酶一起孵育以消化组织。在另一个实施方案中，在一系列洗涤步骤之后，可以将原代肝细胞平板接种到预处理的纤连蛋白包被的组织培养组织培养皿中。本领域技术人员将熟知然后如何遵循用于使肝细胞繁殖的公知技术处理(传代)细胞。简单地说，可以在繁殖培养基中培养细胞，并且经由一系列的接种和收获，细胞数增加。可以在达到80％汇合时将细胞分瓶并且重新平板接种。图33(0周-2周)示出了这一回收和处理步骤的一个实施方案的示意图，显示了原代肝细胞的2次传代。
本领域技术人员将了解的是，在开始方案的扩增阶段(步骤3)之前，在例如2周时间段内需要足够的细胞。本领域技术人员将认识到的是，2周时间段是使细胞扩增的起点的一个实例，其中细胞可以在该时间段之前或之后准备好进行扩增。在一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生至少1×105个细胞。在另一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生至少1×106个细胞。在另一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生至少2×106个细胞。在另一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生至少5×106个细胞。在另一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生至少1×107个细胞。在另一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生1×105个-1×106个细胞。在另一个实施方案中，回收和处理原代细胞在细胞的两次传代之后产生1×106个-1×107个细胞。在另一个实施方案中，使用足够的起始组织以确保回收和处理原代细胞在两次传代之后产生足够的细胞以获得步骤3细胞的大规模扩增中足够的接种密度。
在一个实施方案中，将第1代原代细胞冷冻保存以备后用。在另一个实施方案中，将早期传代的原代细胞冷冻保存以备后用。在又另一个实施方案中，将第2代原代细胞冷冻保存以备后用。
如步骤3所示：原代肝细胞的繁殖/增殖
步骤3表示制造过程的大规模扩增阶段。本领域技术人员将了解的是，在开始方案的转分化阶段(步骤4)之前，在5周时间段内需要足够的细胞，其中预定数目的细胞可以被设想为是为治疗患者所需的。在一个实施方案中，在转分化之前所需的预定数目的细胞包括约1×108个原代细胞。在另一个实施方案中，在转分化之前所需的预定数目的细胞包括约2×108个原代细胞。在一个实施方案中，在转分化之前所需的预定数目的细胞包括约3×108个原代细胞、4×108个原代细胞、5×108个原代细胞、6×108个原代细胞、7×108个原代细胞、8×108个原代细胞、9×108个原代细胞、1×109个原代细胞、2×109个原代细胞、3×109个原代细胞、4×109个原代细胞、5×109个原代细胞、6×109个原代细胞、7×109个原代细胞、8×109个原代细胞、9×109个原代细胞、或1×1010个原代细胞。
在一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括1×103个细胞/平方厘米-10×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括1×103个细胞/平方厘米-8×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括1×103个细胞/平方厘米-5×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括1×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括2×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括3×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括4×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括5×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括6×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括7×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括8×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括9×103。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种密度包括10×103。
在另一个实施方案中，扩增时细胞接种存活率的范围包括60％-100％。在另一个实施方案中，扩增时细胞接种存活率的范围包括约70％-99％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约60％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约65％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约70％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约75％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约80％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约85％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约90％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约95％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约99％的存活率。在另一个实施方案中，扩增时的细胞接种存活率包括约99.9％的存活率。
图33示意性地图示了该扩增阶段的一个实施方案。在一个实施方案中，扩增在第2周与第5周之间发生。本领域技术人员将认识到起始组织材料内的变异性(图29)。因此，在另一个实施方案中，扩增在第2周与第6周之间发生。在再另一个实施方案中，扩增在第2周与第7周之间发生。在另一个实施方案中，扩增在第2周与第4周之间发生。在又另一个实施方案中，扩增发生直到所需数目的原代细胞已经繁殖为止。举例来说，图28示出了10亿个细胞的目标到培养的第30天时达到。
本领域技术人员将了解的是，在细胞扩增同时，可以针对转分化来增强所述群体。针对转分化而增强的原代成体肝细胞和用于富集这些群体的方法的说明已经公开于本文中，并且在实施例10-17和23中举例说明。在一个实施方案中，使用针对GSRE活性进行的选择来富集用于转分化的成体细胞的群体。在另一个实施方案中，测量已知具有增加或减少的表达的基因的基因表达水平，其中这样的增加或减少表明转分化的倾向。在另一个实施方案中，可以在转分化之前将原代成体肝细胞与锂一起孵育，其中所述孵育增强了所述原代成体肝细胞群体内细胞群体的倾向。
在一个实施方案中，在转分化步骤之前使用生物反应器来使原代细胞扩增和繁殖。可以使用生物反应器来培养细胞，其中条件适用于高细胞浓度(参见实施例20)。在另一个实施方案中，生物反应器提供了用于扩增细胞的封闭系统。在另一个实施方案中，一系列使用多个生物反应器来进行细胞扩增。在另一个实施方案中，用于本文所公开的方法中的生物反应器是单次使用生物反应器。在另一个实施方案中，所使用的生物反应器是多次使用生物反应器。在又另一个实施方案中，生物反应器包括用于监测和控制过程的参数的控制单元。在另一个实施方案中，监测和控制的参数包括溶解氧(DO)、pH值、气体、以及温度。
如步骤4所示：原代肝细胞的转分化(TD)。
在一个实施方案中，转分化包括本文所公开的任何转分化方法。举例来说，转分化可以包括分级(1+1+1)方案或“2+1”方案，如本文所公开的那样。
在一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有胰腺表型和功能的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有成熟β-细胞胰腺表型和功能的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有增加的胰岛素含量的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含能够以葡萄糖调节方式分泌经过加工的胰岛素的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有增加的C-肽水平的转分化细胞。
在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有增加的至少一种胰腺基因标志物的内源性表达的转分化细胞。在另一个实施方案中，至少两种胰腺基因标志物的内源性表达增加。在另一个实施方案中，至少三种胰腺基因标志物的内源性表达增加。在另一个实施方案中，至少四种胰腺基因标志物的内源性表达增加。在一个相关实施方案中，胰腺基因标志物包括PDX-1、NeuroD1、MafA、Nkx6.1、胰高血糖素、生长抑素以及Pax4。
在一个实施方案中，内源性PDX-1的表达是非分化细胞的大于102倍。在另一个实施方案中，内源性PDX-1的表达是非分化细胞的大于103倍。在另一个实施方案中，内源性PDX-1的表达是非分化细胞的大于104倍。在另一个实施方案中，内源性PDX-1的表达是非分化细胞的大于105倍。在另一个实施方案中，内源性PDX-1的表达是非分化细胞的大于106倍。
在另一个实施方案中，内源性NeuroD1的表达是非分化细胞的大于102倍。在另一个实施方案中，内源性NeuroD1的表达是非分化细胞的大于103倍。在另一个实施方案中，内源性NeuroD1的表达是非分化细胞的大于104倍。在另一个实施方案中，内源性NeuroD1的表达是非分化细胞的大于105倍。
在另一个实施方案中，内源性MafA的表达是非分化细胞的大于102倍。在另一个实施方案中，内源性MafA的表达是非分化细胞的大于103倍。在另一个实施方案中，内源性MafA的表达是非分化细胞的大于104倍。在另一个实施方案中，内源性MafA的表达是非分化细胞的大于105倍。
在另一个实施方案中，内源性胰高血糖素的表达是非分化细胞的大于10倍。在另一个实施方案中，内源性胰高血糖素的表达是非分化细胞的大于102倍。在另一个实施方案中，内源性胰高血糖素的表达是非分化细胞的大于103倍。
在另一个实施方案中，PDX-1、NeuroD1或MafA或其任何组合的内源性表达各自比非分化细胞多大于60％。在另一个实施方案中，PDX-1、NeuroD1或MafA或其任何组合的内源性表达各自比非分化细胞多大于70％。在另一个实施方案中，PDX-1、NeuroD1或MafA或其任何组合的内源性表达各自比非分化细胞多大于80％。
在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有至少60％存活率的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有至少70％存活率的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有至少80％存活率的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含具有至少90％存活率的转分化细胞。
在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含显示减少的肝细胞标志物的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含显示减少的白蛋白或α-1抗胰蛋白酶(AAT)或任何组合的转分化细胞。在另一个实施方案中，在转分化后，所得的细胞群体包含包含少于1％(通过FACS测定)的白蛋白或α-1抗胰蛋白酶(AAT)或任何组合的转分化细胞。
在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少6个月内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少12个月内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少18个月内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少24个月内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少36个月内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少48个月内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少4年内维持胰腺表型和功能。在另一个实施方案中，转分化的细胞在至少5年内维持胰腺表型和功能。
在一个实施方案中，在转分化期间维持细胞数。在另一个实施方案中，细胞数在转分化期间减少小于5％。在另一个实施方案中，细胞数在转分化期间减少小于10％。在另一个实施方案中，细胞数在转分化期间减少小于15％。在另一个实施方案中，细胞数在转分化期间减少小于20％。在另一个实施方案中，细胞数在转分化期间减少小于25％。
如步骤5所示：收获转分化的原代肝细胞
在一个实施方案中，收获包含人类胰岛素产生细胞的转分化的原代肝细胞并且将其用于基于细胞的治疗。在一个实施方案中，在收获期间维持细胞数。在另一个实施方案中，细胞数在收获期间减少小于5％。在另一个实施方案中，细胞数在收获期间减少小于10％。在另一个实施方案中，细胞数在收获期间减少小于15％。在另一个实施方案中，细胞数在收获期间减少小于20％。在另一个实施方案中，细胞数在收获期间减少小于25％。
在一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约1×107个-1×1010个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约1×108个-1×1010个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约1×107个-1×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约1×107个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约5×107个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约7.5×107个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约1×108个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约2.5×108个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约5×108个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约7.5×108个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约1×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约2×108个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约3×108个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约4×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约5×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约6×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约7×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约8×109个细胞。在另一个实施方案中，在收获时回收的转分化的细胞的数目是总共约9×109个细胞。
在一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约1×103个细胞/平方厘米-1×105个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约1×104个细胞/平方厘米-5×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约1×104个细胞/平方厘米-4×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约1×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约2×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约3×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约4×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约5×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约6×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约7×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约8×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约9×103个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约1×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约2×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约3×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约4×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约5×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约6×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约7×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约8×104个细胞/平方厘米。在另一个实施方案中，在收获时转分化的细胞的密度是约9×104个细胞/平方厘米。
在另一个实施方案中，在收获时细胞存活率的范围包括50％-100％。在另一个实施方案中，在收获时细胞存活率的范围包括60％-100％。在另一个实施方案中，在收获时细胞存活率的范围包括50％-90％。在另一个实施方案中，在收获时细胞存活率的范围包括约60％-99％的存活率。在另一个实施方案中，在收获时细胞存活率的范围包括约60％-90％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约60％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约65％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约70％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约75％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约80％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约85％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约90％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约95％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约99％的存活率。在另一个实施方案中，收获时的细胞存活率包括约99.9％的存活率。
在另一个实施方案中，收获包含人类胰岛素产生细胞的转分化的原代肝细胞并且将其储存以备日后用于基于细胞的治疗。在另一个实施方案中，储存包括将细胞冷冻保存。
如步骤6所示：质量分析/质量控制
在基于细胞的治疗中转分化的细胞的任何使用之前，所述转分化的细胞必须接受质量分析/质量控制评估。可以使用FACS分析和/或RT-PCR来准确地确定膜标志物和基因表达。此外，用于胰岛素分泌的分析方法是本领域公知的，包括ELISA、MSD、ELISpot、HPLC、RP-HPLC。在一个实施方案中，胰岛素分泌测试是在低葡萄糖浓度(约2mM)下与在高葡萄糖浓度(约17.5mM)下相比来进行的。
治疗组合物
本文所述的转分化诱导化合物或异位胰腺转录因子(即PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9多肽、编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9多肽的核糖核酸或核酸)以及由在此所公开的方法产生的具有胰腺β细胞表型的细胞在治疗使用时在本文被称作“治疗剂”。施用治疗剂的方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、以及口服途径。本文所呈现的公开内容的治疗剂可以通过任何方便的途径来施用，例如通过输注或推注、通过经由上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以连同其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的，例如经由门静脉递送到肝。此外，可能有利的是，通过任何合适的途径，包括脑室内和鞘内注射将治疗剂施用到中枢神经系统中。脑室内注射可以通过与贮存器(例如Ommaya贮存器)附接的脑室内导管来促进。肺部施用还可以通过使用吸入器或雾化器以及含有气溶胶化剂的制剂来使用。还可能期望将治疗剂局部施用到需要治疗的部位；这可以通过例如而不限于手术期间局部输注、局部施用、通过注射、借助于导管、借助于栓剂、或借助于植入物来实现。各种递送系统是已知的并且可以用于施用本文所呈现的公开内容的治疗剂，包括例如：(i)封装于脂质体、微粒、微囊中；(ii)能够表达治疗剂的重组细胞；(iii)受体介导的内吞(参见例如Wu和Wu，1987.J Biol Chem 262：4429-4432)；(iv)构建治疗性核酸作为逆转录病毒、腺病毒或其它载体的一部分等。在本文所呈现的公开内容的一个实施方案中，治疗剂可以在囊泡，特别是脂质体中被递送。在脂质体中，除了其它药学上可接受的载体之外，还将本文所呈现的公开内容的蛋白质与两亲性试剂(如脂质)组合，所述两亲性试剂作为胶束、不溶性单层、液晶或层状层以聚集形式存在于水溶液中。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油一酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。这样的脂质体制剂的制备在本领域的技术水平内，如例如美国专利号4,837,028；以及美国专利号4,737,323中所公开，这些美国专利全部均以引用的方式并入本文。在又另一个实施方案中，治疗剂可以在受控释放系统中被递送，包括例如：递送泵(参见例如Saudek等，1989.New Engl J Med 321：574)和半透性聚合物材料(参见例如Howard等，1989.J Neurosurg 71：105)。此外，受控释放系统可以被放置在治疗靶标(例如脑)附近，从而仅需要全身剂量的一部分。参见例如Goodson，《受控释放的医疗应用(Medical Applications of Controlled Release)》，1984(佛罗里达州博卡拉顿的CRC出版社(CRC Press，Boca Raton，Fla.))。
在本文所呈现的公开内容的一个实施方案中，在治疗剂是编码蛋白质的核酸的情况下，所述治疗性核酸可以在体内施用以促进它编码的蛋白质的表达，这是通过将它构建成适当的核酸表达载体的一部分并且施用它以使得它变成细胞内的(例如通过使用逆转录病毒载体、通过直接注射、通过使用微粒轰击、通过用脂质或细胞表面受体或转染剂包被、或通过将它在与已知进入核的同源异型盒样肽连接的状态下施用(参见例如Joliot等，1991.Proc Natl Acad Sci USA 88：1864-1868)等)来实现的。或者，可以将核酸治疗剂引入到细胞内并且通过同源重组并入到宿主细胞DNA内以进行表达或保持游离。
在一个实施方案中，治疗剂是由在此所公开的方法所产生的具有胰腺β细胞表型的细胞，并且静脉内施用所述治疗剂。确切地说，可以经由门静脉输注来递送治疗剂。
本领域技术人员将了解的是，术语“治疗有效量”可以涵盖药物组合物或方法的每一种活性组分的总量，该总量足以显示出有意义的患者益处，即治疗、治愈、预防或改善相关的医学病况、或治疗、治愈、预防或改善这样的病况的速率增加。当应用于单独施用的单个活性成分时，所述术语指的是该单独的成分。当应用于组合时，所述术语指的是产生治疗作用的活性成分的组合量，无论这些活性成分是组合、连续还是同时施用的。
用于静脉内施用本文所呈现的公开内容的治疗剂的合适的剂量范围一般是至少100万个转分化的细胞、至少200万个转分化的细胞、至少500万个转分化的细胞、至少1000万个转分化的细胞、至少2500万个转分化的细胞、至少5000万个转分化的细胞、至少10000万个转分化的细胞、至少20000万个转分化的细胞、至少30000万个转分化的细胞、至少40000万个转分化的细胞、至少50000万个转分化的细胞、至少60000万个转分化的细胞、至少70000万个转分化的细胞、至少80000万个转分化的细胞、至少90000万个转分化的细胞、至少10亿个转分化的细胞、至少20亿个转分化的细胞、至少30亿个转分化的细胞、至少40亿个转分化的细胞、或至少50亿个转分化的细胞。在一个实施方案中，所述剂量是用于60公斤-75公斤受试者的10亿个-20亿个转分化的细胞。本领域技术人员将了解的是，有效剂量可以从源自于体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线外推。在另一个实施方案中，可以将有效剂量静脉内施用到肝门静脉中。
还可以在本文所呈现的公开内容的治疗剂、核酸或蛋白质存在下离体培养细胞以使其增殖或对这些细胞产生所期望的作用或在这些细胞中产生活性。然后可以经由本文所述的施用途径在体内引入经过处理的细胞以实现治疗目的。
药物组合物
化合物，例如PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽、编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽的核酸、或提高编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽的核酸的表达的核酸或化合物(在本文也被称为“活性化合物”)以及其衍生物、片段、类似物和同源物以及由在此所公开的方法产生的胰腺β细胞可以被并入适用于施用的药物组合物中。这样的组合物通常包含核酸分子、或蛋白质、以及药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”意图包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于作为本领域的标准参考教科书的《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》的最新版本中，其以引用的方式并入本文。这样的载体或稀释剂的优选的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、以及5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发性油。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规的介质或试剂与活性化合物不相容，否则其在组合物中的使用被考虑。补充的活性化合物也可以被并入到组合物中。
在此所公开的药物组合物被配制成与它的预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、经粘膜、以及经直肠施用。用于肠胃外、真皮内、或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH值。肠胃外制剂可以被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在具有水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(新泽西州帕西帕尼的巴斯夫公司(BASF，Parsippany，N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应当是流体以达到存在易注射性的程度。它在制造和储存的条件下必须是稳定的并且必须经过防腐处理以防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用如卵磷脂的包衣、在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在很多情况下，将优选的是，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨糖醇、或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来使可注射组合物的吸收延长。
可以通过将所需量的活性化合物，根据需要连同上文所列举的成分中的一种或组合一起并入到适当的溶剂中，继而过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将活性化合物并入到含有基本分散介质和上文所列举的那些成分中所需的其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所期望的成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以被包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用，可以将活性化合物与赋形剂结合并且以片剂、锭剂、或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用流体载体来制备以用作漱口水，其中流体载体中的化合物被口服施用并且漱口并吐出或吞咽。可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸、Primogel(羟基乙酸淀粉钠)、或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotes(氢化植物油)；助流剂，如胶态二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯、或橙味调味剂。
全身施用还可以通过经粘膜或透皮方式来进行。对于经粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂一般是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐以及夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以经由使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮施用，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂、或乳膏剂，如本领域一般已知的那样。
在一个实施方案中，用载体制备活性化合物，所述载体将保护所述化合物防止从体内快速消除，如受控释放制剂，包括植入物和微封装的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法对本领域技术人员来说将是显而易见的。所述材料还可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺瓦制药公司(Nova Pharmaceuticals，Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利号4,522,811中所述来制备，该美国专利以引用的方式整体并入本文。
特别有利的是，将口服或肠胃外组合物配制成剂量单位形式以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式指的是适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每一个单位含有被计算以产生所期望的治疗作用的预定量的活性化合物联同所需要的药物载体。在此所公开的剂量单位形式的规格是由以下各项决定的并且直接取决于以下各项：活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗作用。
在此所公开的核酸分子可以被插入载体中并且用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过许多途径中的任一种向受试者递送，例如如美国专利号5,703,055中所述。递送因此还可以包括例如静脉内注射、局部施用(参见美国专利号5,328,470)或立体定向注射(参见例如Chen等，(1994)PNAS 91：3054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可以包括于可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可以包含其中包埋基因递送运载体的缓慢释放基质。或者，在完整的基因递送载体可以由重组细胞完整产生的情况下，例如逆转录病毒载体，所述药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。
所述药物组合物可以连同施用说明书一起被包括在容器、包装或分配器中。
应当了解的是，本文所呈现的公开内容不限于本文所述的具体方法、方案和试剂、以及实施例。本文所用的术语和实施例只是用于实现描述具体实施方案的目的，意在和旨在为本领域技术人员提供指导，而不意图限制本文所呈现的公开内容的范围。
实施例
实施例1：一般方法
人类肝细胞
成人肝组织是从3岁-23岁或年龄更大的个体获得的。肝组织是在临床研究委员会(Committee on Clinical Investigations)(机构审查委员会)的批准下使用的。如所述进行人类肝细胞的分离(Sapir等，(2005)Proc Natl Acad Sci U S A 102：7964-7969；Meivar-Levy等，(2007)Hepatology 46：898-905)。将细胞培养在补充有10％胎牛血清、100单位/毫升青霉素；100ng/ml链霉素；250ng/ml两性霉素B(以色列拜特海默克的BiologicalIndustries公司(Biological Industries，Beit Haemek，Israel))的杜氏最低必需培养基(Dulbecco′s minimal essential medium)(1g/l的葡萄糖)中，并且在37℃保持在5％CO2和95％空气的加湿气氛中。
病毒感染
在该研究中所用的腺病毒如下：Ad-CMV-Pdx-1(Sapir等，2005(同上)；Meivar-Levy等，2007(同上))、Ad-RIP-荧光素酶(Seijffers等，(1999)Endocrinology 140：3311-3317)、Ad-CMV-β-Gal、Ad-CMV-MafA(由杜克大学(Duke University)的Newgard，C.B.馈赠)、Ad-CMV-Pax4-IRES-GFP(由德国哥廷根的DeveloGen股份公司(DeveloGen AG，
Figure GSB0000169677760000651
Germany)的St Onge，L.馈赠)、以及Ad-CMV-Isll(由加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学(University of British Columbia，Vancouver，Canada)的Kieffer，T.馈赠)。病毒颗粒是通过标准方案产生的(He等，(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95：2509-2514)。
将肝细胞用补充有EGF(20ng/ml；以色列的Cytolab有限公司(Cytolab，Ltd.，Israel))和烟酰胺(10mM；西格玛公司(Sigma))的重组腺病毒感染5天-6天(表1)。根据细胞存活率(＜75％)和对C-肽分泌的诱导确定最佳的感染复数(MOI)。所使用的病毒的MOI是：Ad-CMV-Pdx-1(1000MOI)、Ad-CMV-Pax4-IRES-GFP(100MOI)、Ad-CMV-MafA(10MOI)以及Ad-CMV-Isll(100MOI)。
RNA分离、RT和RT-PCR反应
分离总RNA并且制备和扩增cDNA，如先前所述(Ber等，(2003)J Biol Chem 278：31950-31957；Sapir等，(2005)(同上))。使用ABI Step one plus序列检测系统(美国加利福尼亚州的应用生物系统公司(Applied Biosystems，CA，USA))进行定量实时RT-PCR，如先前所述(Sapir等，(2005)(同上)；Meivar-Levy等，(2007)(同上)；Aviv等，(2009)J BiolChem 284：33509-33520)。
C-肽和胰岛素分泌检测
通过在最初暴露于病毒处理之后6天静态孵育成体肝细胞的原代培养物来测量C-肽和胰岛素分泌，如所述的那样(Sapir等，(2005)(同上)；Meivar-Levy等，(2007)(同上)；Aviv等，(2009)(同上))。在2mM和17.5mM葡萄糖下测量葡萄糖调节的C-肽分泌，这是由剂量依赖性分析确定以最大限度地诱导转分化肝细胞的胰岛素分泌，而对经过处理的细胞的功能没有不利影响(Sapir等，(2005)(同上)；Meivar-Levy等，(2007)(同上)；Aviv等，(2009)(同上))。通过使用人类C-肽放射免疫测定试剂盒(密苏里州圣查尔斯的Linco Research公司(Linco Research，St.Charles，MO)；与人类胰岛素原具有＜4％的交叉反应性)进行放射免疫测定来检测C-肽分泌。通过使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(加利福尼亚州洛杉矶的DPC公司(DPC，Angeles，CA)；与人类胰岛素原具有32％的交叉反应性)进行放射免疫测定来检测胰岛素分泌。将分泌相对于由Bio-Rad蛋白质测定试剂盒所测量的总细胞蛋白归一化。
荧光素酶测定
将人类肝细胞用Ad-RIP-荧光素酶(200moi)和各种腺病毒(如下文所述)共感染。在6天后，使用荧光素酶测定系统(普洛麦格公司(Promega))和LKB 1250光度计(芬兰的LKB公司(LKB，Finland))来测量荧光素酶活性。将结果相对于由Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad))所测量的总细胞蛋白归一化。
免疫荧光
将经过各种腺病毒处理的人类肝细胞平板接种到12孔培养板中的盖玻片上(2×105个细胞/孔)。3天-4天后，如所述将细胞固定和染色(Sapir等，(2005)(同上)；Meivar-Levy等，(2007)(同上)；Aviv等，(2009)(同上))。该研究中所用的抗体是：抗兔PDX-1、抗山羊PDX-1(这两者均是1∶1000；由C.V.E.Wright馈赠)、抗人类胰岛素、抗人类生长抑素(这两者均是1∶100；丹麦格洛斯卓普的丹科公司(Dako，Glostrup，Denmark))、抗Pax4(1∶100；明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems公司(R&D Systems，Minneapolis，MN))、抗MafA(1∶160；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA))。所使用的二抗是：抗兔IgG花菁(cy2)缀合的抗体1∶250、抗兔IgG吲哚碳菁(cy3)缀合的抗体1∶250、抗山羊IgG花菁(cy2)缀合的抗体1∶200、抗山羊IgG吲哚碳菁(cy3)缀合的抗体1∶250、以及抗小鼠IgG吲哚碳菁(cy3)缀合的抗体1∶250(全部均来自宾夕法尼亚州的杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch，PA))。最终，将细胞用4′，6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI，西格玛公司)染色。使用荧光显微镜(Provis，奥林帕斯公司(Olympus))对盖玻片进行成像和分析。
纯度测定
基于流式细胞术的测定已经作为主要纯度测定被开发以确保在扩增和转分化期间超过90％的细胞具有间充质干细胞(MSC)样表型。培养的MSC应当对CD73、CD90、CD105以及CD44呈染色阳性并且应当对CD45、CD34、CD14或CD11b、CD19或CD79α、以及HLA-DR表面分子呈染色阴性。
如图44A和图44B中所示，扩增的肝细胞和受感染细胞以高水平(≥90％)表达CD90、CD44、CD105以及CD73标志物，而它们不表达谱系阴性标志物(CD34、CD11b、CD45、CD19以及HLA-DR的混合物)。要注意的是，与P14的非感染细胞相比，在P16的受感染细胞中CD105的表达略微减少。需要另外的实验来了解这一减少是否是显著的以及它是否随传代次数或随转分化而减少。这些结果表明MSC标志物随时间推移以及在肝细胞的转分化期间是稳定的。针对MSC标志物的流式细胞术确实可以用作QC测试。
下一步将开发流式细胞术或免疫荧光测定来定量表达或共表达各种外源性转录因子以及理想地，胰岛素或C-肽的亚群。
统计分析
用假设不等方差的双样本斯图登t检验来进行统计分析。
实施例2：PDX-1诱导的转分化
先前研究(Sapir等，(2005)(同上)；Meivar-Levy等，(2007)(同上)；Aviv等，(2009)(同上)；Gefen-Halevi等，(2010)Cell Reprogram 12：655-664；Meivar-Levy等，(2011)J Transplant 2011：252387)已经表明PDX-1单独能够在人类肝细胞中诱导β-细胞样表型和功能，这可能是因为它能够激活肝中许多原本沉默的内源性pTF的能力。胰腺谱系的激活是快速的并且在5天内发生(Sapir等，(2005)(同上)；Ber等，(2003)(同上))。
在这个实施例中，研究介导PDX-1诱导的肝向胰腺的转分化的事件序列。将编码Pdx-1的腺病毒载体引入成人肝细胞中，并且在感染后的连续4天内(第2天-第5天；图1A-1D)监测异位PDX-1表达的影响。每天通过定量RT-PCR分析确定胰腺激素和胰腺特异性转录因子表达，持续5天。将结果相对于同一cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达归一化并且表示为相对于同一天的对照病毒(Ad-CMV-β-gal，1000MOI)处理的细胞的相对表达的平均值±SE。进行两次独立实验，其中n≥4，*p＜0.05并且**p＜0.01。
在Ad-Pdx-1感染之后1天内，胰高血糖素基因和生长抑素基因这两者被立即激活(图1B和1C)。然而，仅在感染后的第4天至第5天检测到胰岛素表达(图1A)。为了提供对这三种主要的胰腺激素的不同时间激活的机制解释，在转分化过程期间分析内源性激活的转录因子的表达水平。早期胰腺内分泌转录因子NGN3和NEUROD1被立即激活(图1D)。然而，响应于异位PDX-1表达，β-细胞特异性TF，如NKX6.1和MafA仅被逐渐和适度激活，分别在第4天和第5天达到它们的峰值表达水平。在第5天胰岛素基因表达的激活不仅与MafA表达的增加相关，而且还与Isll表达的减少相关(图1D)。这些数据表明人类肝细胞沿胰腺谱系的转分化尽管是快速的，但是一个逐渐和连续的过程。胰腺激素基因表达的不同时间激活(如生长抑素和胰高血糖素)可能部分地归因于内源性激活的pTF表达的时间过程和相对水平。
实施例3：PDX-1、PAX4以及MAFA的组合表达提高了肝向胰腺转分化的效率
先前的研究已经表明与由单个pTF诱导的转分化效率相比，几种pTF的共同表达提高了沿β-细胞谱系的转分化效率(Kaneto等，(2005)Diabetes54：1009-1022；Tang等，(2006)Lab Invest.86：829-841；Song等，(2007)Biochem Biophys Res Commun.354：334-339；Wang等，(2007)Mol Ther15：255-263；Gefen-Halevi等，(2010)(同上))、以及沿其它谱系的转分化效率。为了在本文所述的原代成人肝细胞的实验系统中分析这一观点，研究三种主要的pTF对肝向胰腺的转分化的单独影响和共同影响。使用重组腺病毒使介导胰腺器官发生中的不同阶段的PDX-1、Pax4以及MafA在成人肝细胞的原代培养物中异位共表达。用Ad-CMV-Pdx-1(1000MOI)、Ad-CMV-Pax-4(100MOI)以及Ad-CMV-MafA(10MOI)单独或共同或用对照病毒(Ad-CMV-β-gal，1000MOI)感染培养的成人肝细胞，并且在6天后研究胰腺分化标志物。滴定每一种因子的感染复数(MOI)以产生与对受感染细胞存活率的不利影响最小有关的最大重编程效率。PDX-1在培养物中70％的细胞中表达，并且所有3种pTF的联合共表达在46.8％的PDX-1阳性细胞中是明显的(图2A)。非常少的细胞仅对Pax-4或MafA呈染色阳性。对所有三种pTF呈染色阳性的细胞由箭头指示(图2A，右图)。在图2B中，将肝细胞用组合的pTF和Ad-RIP-LUC(200moi)共感染，并且测量胰岛素启动子的荧光素酶活性。
与由pTF中的每一种单独诱导的作用相比，三种pTF的组合表达使得胰岛素启动子的激活显著增加(图2B)、胰岛素(胰岛素原)产生细胞的数目增加到三倍(图2C)以及葡萄糖调节的胰岛素(胰岛素原)分泌增加30％-60％(图2D)。综上所述，这些结果表明3种pTF的组合提高了转分化效率并且还表明这些因子中的每一种在它单独地促进最大转分化的能力方面是有限的或不足以单独地促进最大的转分化(Kaneto等，(2005)(同上)；Tang等，(2006)(同上)；Zhou等(2008)Nature 455：627-632)。
实施例4：转分化的细胞向不同激素产生细胞的成熟和分离以分级方式在时间上受控
在这个实施例中，研究在时间上控制异位pTF表达的影响以确定由这三种pTF的组合异位表达提高的转分化效率是否也如上文所表明在时间上受控(图2A-2D)。这三种pTF，即Pdx-1、Pax4以及MafA在胰腺器官发生期间显示出不同的时间表达和功能，这支持了时间控制在胰腺转分化中起作用。
使用重组腺病毒将这三种pTF，即PDX-1、Pax4、以及MafA依次或共同引入到成人肝细胞的原代培养物中。腺病毒介导的异位基因表达在感染后17小时达到峰值(Varda-Bloom等，(2001)Gene Ther 8：819-827)。因此，在连续3天期间依次施用这些pTF(参见实施例1中的病毒感染)，从而允许表现出它们单独的作用。根据如表1中所示的时间表对细胞进行感染。
表1
Figure GSB0000169677760000701
在三天内按以下三种不同的序列依次每天用一种pTF腺病毒构建体对细胞进行感染：直接分级次序(处理C＝Pdx-1→Pax4→MafA)；按相反次序(处理D＝MafA→Pax4→Pdx-1)；以及按随机次序(处理E＝Pdx-1→MafA→Pax4)。将顺序pTF施用对转分化效率以及对β-细胞样成熟的影响与在第一天共同或同时施用所有三种pTF(处理B＝Pdx-1+Pax4+MafA)和类似MOI的对照病毒(处理A＝β-gal)的影响相比较(表1和图3A)。确切地说，将培养的成人肝细胞用Ad-CMV-Pdx-1(1000MOI)、Ad-CMV-Pax-4(100MOI)以及Ad-CMV-MafA(10MOI)共同或以顺序方式感染(如图3A和表1中所汇总，处理B-E)或用对照病毒感染(Ad-CMV-β-gal，1000moi，处理A)，并且在6天后分析它们的胰腺分化。
胰岛素启动子活性(图4A)、胰岛素产生细胞的百分比(图3B)以及葡萄糖调节的胰岛素(胰岛素原)分泌(图3C)不受依次施用的pTF的次序的影响。有趣的是，按随机次序进行的顺序pTF施用(处理E＝Pdx-1→MafA→Pax4)使得胰岛素启动子活性增加，但是与胰岛素分泌的葡萄糖调节的丧失以及葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)表达减少有关(图3B、3C以及4B)。在改变Pax4和MafA施用的次序时葡萄糖感受能力的丧失表明了表达的pTF的序列对β-细胞样成熟的潜在影响，但是对转分化过程的效率没有影响。
实施例5：PDX-1、PAX4以及MAFA的分级施用促进转分化的细胞向β样细胞的成熟
先前的结果促使进行进一步研究以确定在何种程度以及在哪些条件下增加的转分化效率与增强的沿β-细胞谱系的成熟有关。成熟β-细胞的标志性特征是能够加工胰岛素原并且将它以葡萄糖调节方式分泌的能力(Eberhard等，(2009)Curr Opin Genet Dev 19：469-475；Borowiak，(2010)Rev Diabet Stud 7：93-104)。为了分析pTF表达的瞬时变化是否明显影响转分化细胞沿β-细胞谱系的成熟，分析不同的处理A-E(表1和图3A)对胰岛素原加工和葡萄糖调节的c-肽分泌的影响。
实际上，只有直接分级施用(处理C)pTF引起显著的经过加工的胰岛素的产生和它的葡萄糖调节的分泌，所述分泌显示出生理葡萄糖剂量响应特征(图3C和5A)。新获取的表型和功能是稳定的，如由能够在体外长达4周内以葡萄糖调节方式分泌c-肽的能力所证实(图5A和5B)。
只在直接分级pTF施用(处理C)时增加的激素原加工与PCSK2和GLUT2基因表达的显著增加有关，这两者分别在激素原加工和葡萄糖感受能力方面起作用(图3A-3E和4A-4C)。这些数据表明了pTF的顺序和直接分级表达在促进转分化的肝细胞沿β-细胞谱系的成熟和功能中的必要作用。共同TF施用(处理B)和以间接分级模式进行的顺序TF施用(处理D和E)这两者不能产生显示出成熟β-细胞样特征的转分化细胞。
为了提供对成熟的β-细胞样状态的变化的机制解释，分析了在不同的时间处理(B-E)下内源性激活的pTF的谱型。所有处理(B-E)均引起许多内源性pTF的表达增加(图3E)，如NEUROG3、NEUROD1、NKX6.1以及NKX2.2。然而，“成熟”表型(处理C)与“未成熟”表型(处理B、E以及D)之间最稳固的差异表现在内源性Isl1基因表达的水平上。因此，由直接分级pTF施用(处理C)诱导的最大程度增强的沿β-细胞谱系的成熟与内源性Isl1表达的显著减少相关(图3E，箭头)。综上所述，这些数据表明了转分化细胞向β细胞的成熟可能受特异性pTF的相对和时间表达水平的影响。
实施例6：PDX-1、PAX4以及MAFA的分级施用促进转分化细胞在β样细胞与δ样细胞之间的分离
从处理C(表1)中排除MafA诱导了Isl-1(图6D)和生长抑素的基因表达(图8D)。为了分析在排除MafA时Isl-1增加的表达是否确实引起生长抑素基因表达增加，在第3天将Ad-CMV-Isl-1连同MafA一起添加(处理C，表1中)。实际上，Isl-1增加了生长抑素基因表达(图6E)。异位Isl-1表达(C+Isl-1)还引起生长抑素蛋白质产生增加(图6F)和它在胰岛素产生细胞中的共同产生(图9，下图)，这表明与低Isl-1表达相关的高MafA表达对于在胰岛素产生细胞与生长抑素产生细胞之间分离来说是至关重要的。
实施例7：分析PDX-1、PAX4以及MAFA对肝向胰腺转分化的单独影响
通过功能研究的时间增益来鉴定转分化过程的顺序特征。通过相对和时间“减少功能”方法来对转录因子Pdx-1、Pax4以及MafA中的每一种对分级发育过程的单独影响进行进一步分析。通过直接时间和顺序重编程方案(处理C)处理成人肝细胞，从所述方案中省去所述异位pTF中的一种。被省去的pTF由类似感染复数的携带β-gal表达的对照腺病毒代替。确切地说，通过直接“分级”顺序感染次序(处理C，图3A和表1)处理成人肝细胞。每次省去一种单个转录因子(pTF)并且用相同moi的Ad-CMV-β-gal代替。省去Pdx-1被表示为(C-Pdx-1)，省去Pax4被表示为(C-Pax4)，并且省去MafA被表示为(C-MafA)。
在分子水平和功能水平上分析单独省去pTF中的每一种的表达的功能后果(图6A-6D)。单独省去Pdx-1和MafA(分别是C-Pdx-1和C-MafA)引起胰岛素启动子激活减少(图6A)、经过加工的胰岛素分泌的葡萄糖响应消除(图6B)以及GLUT2和GK表达减少(图6C)。排除MafA还与激素原转化酶PCSK2的表达减少相关(图6C)。另一方面，排除Pax4(C-Pax4)没有显著影响胰岛素启动子激活，它也没有影响葡萄糖调节的C-肽分泌。省去Pax-4与GLUT2和PCSK2表达减少有关(图6C)，这可能表明了GK的表达足以获得激素分泌的葡萄糖控制能力。
对时间和单独pTF排除对内源性激活的pTF表达的谱型的影响进行分析以解释这些发育改变。排除Pdx-1和Pax4使得大部分其它pTF(包括NeuroG3、NKX2.2、NKX6.2、以及Pax6)的表达显著下降，这表明它们对提高转分化效率的潜在贡献与它们能够激活内源性胰腺TF的能力有关(图6D)。另一方面，排除MafA没有促进内源性pTF表达的进一步激活，这可能反映了它仅在胰腺β-细胞中的后期和限制性表达。相反，MafA对增加的胰岛素启动子活性、激素原加工以及它的葡萄糖调节的分泌的贡献仅与Isl-1表达减少相关(图6D)。这些数据可以表明MafA不参与进一步促进内源性pTF表达和肝向胰腺转分化的效率，而是促进转分化的细胞成熟。
实施例8：ISL-1阻止转分化细胞向β细胞谱系的成熟
MafA对β-细胞样成熟的影响可能部分地与它能够阻遏Isl1表达的能力有关。为了测试这一假设，通过腺病毒感染(Ad-Isl1)将异位Isl1引入转分化细胞中。简单地说，将成人肝细胞通过直接“分级”顺序感染次序(处理C)处理并且在第3天补充以Ad-Isl1(1MOI或100MOI)(C+Isl1)。
如上文所示，以直接分级方式顺序施用这三种pTF(处理C)引起转分化效率和新产生的细胞沿β-细胞谱系的成熟这两者增加。在第3天将Isl1与MafA一起共同施用(C+Isl1)。实际上，在第3天在异源性启动子控制下的Isl1过表达引起胰岛素基因表达的显著减少以及葡萄糖调节的胰岛素(胰岛素原)分泌的消除(图7A-7C)。葡萄糖感受能力的丧失与GLUT2表达减少有关(图7C)。这些结果表明在转分化方案的最后阶段失调的Isl1表达潜在地阻碍了沿β细胞谱系的成熟，并且可能部分地解释了在低MafA表达下消除的成熟。
综上所述，这些数据表明了pTF的直接分级表达在促进转分化的肝细胞沿β细胞谱系成熟中至关重要的必要作用。此外，顺序发育过程与对可能促进或阻碍转分化细胞沿胰腺β细胞谱系成熟的pTF的激活和阻遏这两者有关。
实施例9：PDX-1、PAX4以及MAFA的分级施用诱导胰高血糖素和生长抑素表达
沿内分泌胰腺谱系的转分化引起许多胰腺激素的表达的激活。还研究了这些激素表达水平受pTF的时间操纵影响的程度。在所示的处理之后通过定量实时PCR分析确定胰腺激素胰高血糖素(GCG)(图8A和8B)、生长抑素(SST)(图8A、8D、以及8E)或细胞特异性转录因子(图8C)的基因表达。
胰高血糖素(GCG)基因和生长抑素(SST)基因这两者的转录由单独表达的pTF中的每一种诱导，主要由Pdx-1和MafA诱导并且由Pax4在较低程度上诱导(图8A)。胰高血糖素基因转录的进一步增加仅在直接分级施用pTF时发生(图4A，参见处理C)。Pdx-1和MafA分别在与α-细胞特异性转录因子ARX和BRAIN4或单独的ARX的激活相关的过程中发挥它们对胰高血糖素表达的作用(图8C)。在时间方案以异位Pax4表达结束(E＝Pdx-1→MafA→Pax4)时，保持不受大部分处理影响的生长抑素基因表达(图8A和8D)增加。这种顺序方案还对葡萄糖调节的胰岛素(胰岛素原)分泌表现出不利影响并且与Isl1内源性表达增加相关(图3C和3E)。消除的沿β细胞谱系的成熟与生长抑素基因表达增加和生长抑素阳性细胞数目增加有关(图8F)。许多细胞表现出生长抑素和胰岛素共定位(数据未示)。
还利用如实施例6中所述从分级施用(处理C)中排除每一种pTF来进一步研究单个pTF在胰高血糖素和生长抑素表达中的作用(图8B和8D)。排除Pax4显著减少了生长抑素基因表达，这表明了它在诱导该基因的转录中的潜在作用(图8D)。有趣的是，在发育过程结束时排除MafA还显著增加了生长抑素基因表达，这表明了MafA对生长抑素基因表达的潜在抑制作用。这一作用可能也归因于MafA阻遏Isl1表达的能力。为了阐明该假设，分析异位Isl1对生长抑素基因表达的影响。实际上，在第3天Ad-Isl1连同MafA一起的施用(C+Isl1)增加了生长抑素基因表达(图8E)，而减少了胰岛素基因表达、激素产生和分泌(图8A、8B和图7A-7C)。在这些实验条件下，40％的胰岛素产生细胞对生长抑素呈染色阳性，非常少的细胞单独表达生长抑素。
这些结果表明转分化细胞向β-细胞成熟的一部分归因于在转分化过程的后期阶段MafA的表达。在这个阶段，MafA在与它抑制Isl1表达的能力相关的过程中限制生长抑素表达。
图9示出了胰腺转录因子诱导的肝向胰腺转分化的所提出的机制。所述pTF中的每一种能够在有限数目的人类肝细胞中激活适度的β-细胞样表型。pTF的共同表达显著增加肝向内分泌胰腺的转分化。然而，新产生的细胞是未成熟的并且共表达胰岛素和生长抑素这两者。只有以直接分级方式顺序施用同一些因子既提高了转分化效率，又增加了转分化细胞沿β-细胞谱系的成熟。
实施例10：在体内鉴定具有转分化能力的细胞群体
在小鼠体内鉴定具有转分化能力的细胞群体。在小鼠肝脏中实现Pdx-1基因的异位表达。尽管异位Pdx-1基因在约40％-50％的肝细胞中均匀表达(图10A)(Ferber等，(2000)Nat Med 6：568-572；以及Ber等，(2003)(同上))，但是在接受Pdx-1处理的小鼠体内胰岛素产生细胞(IPC)主要位于中央静脉附近(图10B)，特征在于活性Wnt信号转导和谷氨酰胺合成酶(GS)的表达(图1C)。GS表达和由Pdx-1所引起的胰岛素激活的共定位还表明了可以激活GSRE的那些细胞具有提高的转分化能力的倾向。因此，也可以通过GSRE激活或活性Wnt信号转导通路来鉴定倾向于转分化的细胞群体。
实施例11：使用腺病毒来鉴定倾向于转分化的人类肝细胞
这个实施例表明了使用重组腺病毒来鉴定倾向于转分化的人类肝细胞。培养物中的人类肝细胞在细胞内Wnt信号转导通路的激活和GS的表达方面是异质的。由于GS仅在中央静脉周围肝细胞中表达，因此激活GSRE(GS Regulatory Element(GS调节元件))的能力可以用作分离相关细胞的选择参数。
此外，由于GSRE还含有STAT3结合元件，因此细胞转分化的倾向可以由这一元件介导。STAT3通路也可能参与赋予细胞以重编程或转分化倾向(图10A-10D、11、14A-14E以及19)。
实施例12：GSRE重复靶向培养物中13％-15％的人类肝细胞。
GSRE包括TCF/LEF和STAT5结合元件(图11)。已经产生了携带在与最小TK启动子可操作地连接的GSRE(图11)控制下eGFP基因或Pdx-1基因的表达的两种重组腺病毒。这些腺病毒驱动Pdx-1(图12A)或eGFP(图12B)的表达。这两种蛋白质重复地在培养物中约13％-15％的人类肝细胞中表达，这表明了靶向肝细胞的特定群体。
实施例13：GSRE驱动的PDX-1比CMV驱动的PDX-1更高效地在肝细胞中激活胰岛素产生。
尽管存在GSRE驱动的PDX-1的重复表达，但是培养物中只有约13％±2％的细胞显示出与由Ad-CMV-Pdx-1所诱导的转分化能力相比相似或更高的转分化能力，所述Ad-CMV-Pdx-1在培养物中60％-80％的细胞中驱动Pdx-1表达(图13A-13C)。GSRE激活细胞可能占培养物中整体成人肝细胞的大部分的转分化能力。在Ad-GSRE-Pdx-1处理时，在25％的Pdx-1阳性细胞中存在胰岛素产生，相比之下，在1％的经过Ad-CMV-Pdx-1处理的细胞中存在胰岛素产生。
实施例14：使用慢病毒将GSRE+细胞由EGFP永久标记
使用慢病毒构建体进行永久谱系追踪。通过最近用于追踪角质细胞中的KRT5或肝细胞中的白蛋白表达的改良型双重慢病毒系统对GSRE活性进行体外谱系追踪。这种慢病毒系统(与来自法国巴黎的皮埃尔和玛丽·居里大学(Université Pierre et Marie CurieParis，France)的P.Ravassard教授合作；图12A)包括CMV-loxP-DsRed2-loxP-eGFP(R/G)报告基因和另外的慢病毒载体，该慢病毒载体携带在GSRE和最小TK启动子控制下Cre重组酶的表达(由德国的Gaunitz教授馈赠，图3A)。因此，GSRE激活细胞由eGFP不可逆地标记(eGFP+)，而其余的双重感染的细胞由DsRed2标记(DsRed2+)。在不到10天内10％至14％的细胞变成eGFP+(图14B)。将所述细胞通过细胞分选仪分离(图14A-14E)并且分开繁殖(图15A)。由10个不同的人类供体(3岁-60岁)产生eGFP+细胞(GSRE激活细胞)和DsRed2+细胞的培养物。
实施例15：EGFP+细胞始终表现出优越的转分化能力
根据GSRE活性通过谱系追踪所分离的人类肝细胞高效地繁殖(图15A)并且被重组腺病毒类似高效地感染。eGFP+细胞始终表现出优越的转分化能力(图16A-16C)，表现为与培养物中的人类胰岛相当的胰岛素和胰高血糖素基因表达(图16A)、葡萄糖调节的胰岛素分泌(图16B)以及葡萄糖调节的C-肽分泌(图16C)。这些能力在广泛的细胞增殖时是始终如一的并且没有减弱(图17)。
实施例16：具有转分化倾向的细胞的表征
为了鉴定可能潜在地影响人类肝细胞的不同转分化效率的因子，使用微阵列芯片分析比较这两个分离群体的全局基因表达谱。使源自于3个不同供体并且被分离成eGFP+细胞和DsRed2+细胞的人类肝细胞培养物繁殖4代。使提取的RNA转化成cDNA并且使用通用人类阵列(GeneChip人类基因组U133A 2.0阵列，昂飞公司(Affymetrix))进行微阵列芯片分析。虽然在分离的组中大部分的基因是以相当的水平表达的，但是约800个探针的表达是显著不同的(图18)。根据微阵列芯片分析，编码膜蛋白的约100种基因在易转分化(eGFP+)细胞与无响应(DsRed2+)细胞之间差异表达。这些标志物中的一些示于表2A和2B中。
表2A：在eGFP+细胞和DsRed2+细胞中差异表达的膜抗原。
Figure GSB0000169677760000781
表2B：与DsRed2+细胞相比，在eGFP+细胞中差异表达的细胞表面编码转录物
Figure GSB0000169677760000782
图47示出了表2B中所示的细胞表面分子的相对表达。通过实时PCR测试指定分子的表达水平并且相对于β-肌动蛋白表达归一化。微阵列数据表明了在eGFP+细胞与DsRed2+细胞之间差异表达的许多膜蛋白(倍数＝与DsRed2+相比eGFP+差异表达(log 2))。所有所呈现的抗原均具有可商购获得的抗体。
实施例17：WNT信号转导在倾向于转分化的细胞中具有活性
已经提出了通过激活的β-连环蛋白水平的梯度来控制肝脏分区；虽然肝中大部分的细胞含有非常低的β-连环蛋白活性，但是中央静脉周围肝细胞表达与活性Wnt信号转导相关的高β-连环蛋白活性。由于Wnt信号转导对于有能力的β细胞活性来说是必要的，因此肝中pTF诱导的胰腺谱系激活只限于先验显示出活性Wnt信号转导的细胞。
GSRE利用从GS的5′增强子分离的TCF调节元件。如果Pdx-1诱导的肝向胰腺的转分化部分地由细胞内Wnt信号转导通路所介导，那么调节Wnt信号转导通路的因子也可能影响转分化效率(图19)。
成人肝细胞中的这一数据表明了增加Wnt3a的浓度增加了Pdx-1诱导的葡萄糖调节的胰岛素分泌，而DKK3(Wnt信号转导通路的抑制因子)完全消除了Pdx-1对该过程的作用(图19)。DKK3还完全消除了根据激活GSRE的能力所分离的eGFP细胞的转分化能力(图20)。
对eGFP+细胞群体和DsRed+细胞群体中的Wnt信号转导通路活性进行表征。参与β-连环蛋白去稳定，从而减少Wnt信号转导的APC表达在DsRed2+细胞中比在eGFP+细胞中高700％(图21A，与在体内所显示的分区相对一致)。与在DsRed2+细胞中所分析的水平相比，eGFP+群体具有升高的激活β-连环蛋白水平(40％)(图21B和21C)。这些数据表明Wnt信号转导在有GSRE激活能力并且具有转分化倾向的细胞中具有活性。
实施例18：比较PAX4和NEUROD1所诱导的转分化的效率
目的
该研究的目的在于在促进由Ad-PDX-1诱导的转分化过程方面比较PAX4腺病毒和NeuroD1腺病毒(Ad-PAX4和Ad-NeuroD1)。
材料和方法
在从人类受试者Muhammad、Pedro、以及Diego获得的三种未处理的培养物(未分选的原代肝细胞)以及在针对谷氨酰胺合成酶响应元件(GSRE)激活进行分选后(GS富集)的四种原代肝细胞培养物(Shalosh、Eden、Muhammad以及Yam)上对由Ad-PAX4或Ad-NeuroD1诱导的转分化效率进行比较。
实验设计
在实验的第一天，根据表3，在病毒感染之后在100mm Falcon培养皿上接种300,000个细胞。在实验的第3天，对细胞进行计数并且用Ad-MafA处理并且接种到6孔培养皿的3个孔上达到100,000个细胞/孔的最终浓度。在实验的第6天，使用放射免疫测定来分析细胞的胰岛素分泌。在将细胞与于KRB中2mM的葡萄糖(低)或17.5mM的葡萄糖(高)一起孵育15分钟之后测量胰岛素分泌。
表3：用于比较PAX4和NeuroD1在由PDX1诱导的转分化过程中的作用的腺病毒的不同组合的汇总
第1天 第3天
1 Ad-空载体1300moi
2 Ad-PDX1 500moi+Ad-NeuroD1 250moi Ad-MafA 50moi
3 Ad-PDX1 500moi+Ad-PAX4 250moi Ad-MafA 50moi
结果
结果汇总于表4和表5以及图24A-24B和25A-25D中。
表4：比较PAX4和NeuroD1在由PDX1诱导的转分化过程中的作用的每小时总胰岛素(INS)分泌(ng INS/hr)的最终计算结果的汇总。
Figure GSB0000169677760000801
Figure GSB0000169677760000811
表5：比较PAX4和NeuroD1在由PDX1诱导的转分化过程中的作用的每小时每百万个细胞的总胰岛素(INS)分泌(ng INS/106个细胞/hr)的最终计算结果的汇总。
Figure GSB0000169677760000812
Figure GSB0000169677760000821
在这两种胰腺转录因子之间进行详细比较。在未处理的原代肝细胞和通过针对增强的GS表达进行分选所富集的肝细胞群体(GS富集)的混合群体上进行比较。
图24A-24B和25A-25D以条形图示出了列表数据。
胰岛素分泌测量揭示了使用PAX4或NeuroD1诱导的转分化没有统计学差异。这一结论对于未处理的细胞和富集的GS细胞这两者来说都是正确的。不仅是富集的GS群体和未处理的细胞的平均值显示出相同的趋势，而且当研究相同的Muhammad未处理培养物和Muhammad GS富集培养物的结果时，也获得了相同的结果(这表明了GS富集群体用作转分化过程的模型系统的能力)。
先前的结果显示相对于完全肝细胞原代培养物，GS富集群体在转分化效率方面具有明显的优势。因此，惊人的是，Muhammad的GS富集群体和未分选的群体显示出类似的结果(没有统计显著性)。然而，应当提及的是，这两个群体的传代次数存在差异。GS富集群体是在第19代被研究的，并且未处理群体是在第7代被研究的。这些结果不应当被认为是GS富集群体不能进行有效的转分化，而是GS富集群体能够在高传代次数下进行转分化的能力，这是未处理细胞可能无法实现的。
与和NeuroD1一起孵育的细胞相比，与PAX4一起孵育的细胞的细胞死亡没有显著性差异。唯一明显的差异是对照组(未处理/Ad-空载体)与处理组(Ad-PAX4/Ad-NeuroD1)相比的差异。这一点可以通过对于PAX4和NeuroD1所得出的相同结论来看出，无论是研究总胰岛素还是ng INS/10^6个细胞/hr的结果。
所观测到的一个差异是在计算转分化效率(在使用特定腺病毒时所获得的阳性转分化的百分比)时。对于Ad-NeuroD1，所述效率是87.5％(在8次实验中有7次阳性转分化)并且对于Ad-PAX4，它是71％(在7次实验中有5次阳性转分化)。
结论
Ad-PAX4和Ad-NeuroD1这两者支持了肝细胞的相似转分化。
实施例19：确定用于转分化过程的最佳方案
目的
该研究的目的在于比较完全分级(1+1+1方案)与2+1方案、以及与用所有三种腺病毒同时感染的转分化效率。
测试系统
在于DMEM(1g/L葡萄糖)中培养的人类肝细胞的三种原代培养物(Leon、Muhammad、以及Pedro)上研究不同的转分化方案。在病毒感染之后，将细胞培养在补充有5nM艾塞那肽-4、20ng/ml EGF以及10mM烟酰胺的DMEM 1g/L葡萄糖培养基中。
实验设计
根据下表6研究不同的转分化(TD)方案。简单地说，在实验的第一天，根据下表6，对于方案A(空载体)、方案B(2+1)以及方案E(分级1+1+1)，在病毒感染之后在100mm Falcon培养皿上接种300,000个细胞。在实验的第2天，对于方案C(3种因子同时)，在6孔培养皿上接种100,000个细胞，并且对于方案D(3种因子同时)，在6孔培养皿上接种70,000个细胞。在实验的第3天，对细胞进行计数并且用Ad-MafA处理(方案B和方案E)并且接种到6孔培养皿的3个孔上达到100,000个细胞/孔的最终浓度。
表6：
Figure GSB0000169677760000841
＊GSIS：葡萄糖刺激的胰岛素分泌
在实验的第6天，在2mM葡萄糖(低)或17.5mM葡萄糖(高)存在下对细胞进行分泌分析(图26A-26C)。在将细胞与于KRB中2mM的葡萄糖或17.5mM的葡萄糖一起孵育15分钟之后测量胰岛素分泌。
结果和分析
本研究试图确定用于转分化过程的最佳方案。在传统的分级方案(1+1+1)中，依次用三种转录因子处理细胞：在第1天用PDX1，在第2天用NeuroD1以及在第3天用MafA。为了开发高效的和更容易的方案，将传统方案的转分化效率与2+1方案和用所存在的所有三种转录因子同时处理相比较。
该研究的读出测定是胰岛素分泌。根据本领域的知识，所有的处理应当呈现类似的胰岛素分泌水平，这是因为效率的差异应当仅表现在细胞的成熟方面，例如如通过C-肽分泌所测量。然而，在本实验中，转分化效率存在意想不到的差异，如通过胰岛素分泌测量所清楚地看到的那样(图26A-26C)。在2+1方案中获得了最好的结果。这些结果具有统计显著性，如下表5中所示。
表7：上表4中所示的不同转分化方案的比较的p值(t检验)
Figure GSB0000169677760000851
2+1方案和分级方案的p值具有显著性，但是相对高的。用所有三种因子同时处理呈现了最低的结果，即使是研究了两种接种密度(与分级方案相比没有显著性)。
实施例20：肝细胞增殖过程从皮氏培养皿到XPANSION多板生物反应器的工业化
目的
开发了用于临床前应用的细胞培养皿中的生物过程，所述生物过程包括2个主要的步骤：肝细胞增殖，继而肝细胞转分化成胰岛素产生细胞。为了在人类临床试验中治疗患者，预期的是，将使用每个患者约10亿个细胞的剂量要求来改善1型糖尿病的高血糖症。这样的生产规模将需要大的培养表面积，细胞培养皿过程(图27顶部)制造策略没有提供这样的大培养表面积。因此，该研究的目标在于使用XPANSION平台(生物反应器系统；美国的颇尔公司(Pall Corporation，USA))将基于细胞的细胞培养皿过程工业化。
材料和方法
所用的材料列于下文：
i.生物材料：人类成体肝源性细胞(原代培养物)。
ii.生长培养基：杜氏改良伊格氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(DMEM；生命科技公司(Life Technologies)，目录号21885-025)，补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；生命科技公司，目录号10500-064)、1％青霉素-链霉素-两性霉素B(100×)(龙沙公司(Lonza)，目录号17-745E)以及5nM艾塞那肽-4(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号E7144)。
iii.其它试剂：杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS；龙沙公司，目录号17-512Q)和TrypLE◆Select(生命科技公司，目录号12563-029)。
iv.细胞培养支持：CellBIND◆CellStack◆2室、5室和10室(康宁公司(Corning)，目录号COS-3310、COS-3311和COS-3320)、Xpansion 50板(XP-50)生物反应器(目录号XPAN050000000)以及Xpansion 200板(XP-200)生物反应器(目录号810155)。
v.用于颇尔公司的连续离心机的细胞回收试剂盒(项目号6100043)。
vi.离心机控制：在500mL离心机转鼓中的细胞回收系统控制。
所述方法遵循图27中所示的工艺流程图。简单地说，如传统复盘培养那样进行预培养。在第14代和第15代时将细胞用于一个或多个Xpansion生物反应器中。所使用的生物反应器系统是封闭系统以降低污染风险。在Xpansion培养同时进行复盘培养作为细胞生长对照，其中控制器设定点：pH值：7.3-7.6以及溶解氧(DO)：维持在高于50％。在每一次传代时，目标接种密度是4,000个细胞/平方厘米。
培养持续时间是7天-9天，每2天-4天进行培养基更换(XP-50：第4天、第6天以及第8天；XP-200：第4天和第7天)以在整个培养期间维持葡萄糖水平高于0.5g/L。
结果
在此所示的结果显示成功将人类肝源性细胞扩增阶段从皮氏培养皿按比例放大到Xpansion 200生物反应器(美国的颇尔公司)。
细胞生长：图28中所示的细胞扩增曲线清楚地表明了细胞从第一预培养步骤到最终生物反应器(XP-200)培养处于指数生长期。在4次传代内，细胞从200万个扩增到约18亿个，这代表了生物质增加到1,000倍。因此，已经清楚地证实了大规模产生人类肝源性原代细胞的可行性，并且实现了每个XP-200 10亿个细胞/患者，甚至接近18亿个细胞/患者的目标。
在CellStack10(CS10)中进行第1次传代，在2×CS10中进行第2次传代，在XP50中进行第3次传代，并且在XP200中进行第4次传代。
群体倍增时间(PDT)比较揭示了人类肝源性原代细胞在Xpansion生物反应器中比在传统的复盘系统中更快地增殖(图29)。收获的细胞密度在Xpansion 50生物反应器中是约15,000个细胞/平方厘米，并且在Xpansion 200生物反应器中是14,000个细胞/平方厘米，这代表了它们对应的复盘对照的约160％。对培养环境(pH值、DO)的更好的控制是解释这一结果的主要假设。
Xpansion生物反应器中的pH值、溶解氧、以及温度控制趋势：pH值和DO被维持在它们对应的预期范围内(图30)。在整个过程中，DO被维持在高达50％的空气饱和度，并且pH值由于该过程结束时的高细胞数而在每一次培养的最后2天期间从7.4逐渐降低到7.2。在这两种培养期间均观测到类似的趋势，这表明了良好的再现性和可按比例缩放性。
使用Ovizio全息显微镜(比利时布鲁塞尔的Ovizio Imaging Systems公司(Ovizio Imaging Systems，Brussels/Belgium))进行的显微镜观测
细胞汇合度和形态是细胞治疗过程中监测的关键参数。为此，使用允许观测Xpansion生物反应器中前十个板的显微镜。
图31A-31D中所示的显微照片图像确认了人类肝源性原代细胞在整个Xpansion板中的均匀分布。在培养9天之后确定细胞汇合度是约90％，并且估计在XP-50生物反应器和XP-200生物反应器这两者中是相当的(图31A和31B)。在50板和200板这两种规模上，Xpansion系统中的汇合度略高于对照复盘系统中的汇合度。这些图像还表明了细胞形态没有受到Xpansion系统中的连续培养或用于细胞回收的连续离心的影响。使用复盘过程培养的对照细胞示于图31C和31D中。数据表明使用Xpansion生物反应器进行的人类肝源性原代细胞增殖没有改变转分化细胞的转分化特性或胰岛素分泌特征(数据未示)。
结论
成功地使用生物反应器将人类成体肝源性细胞增殖过程按比例放大。本文的结果显示通过使用包括生物反应器平台的过程，细胞可以可靠地从100万个细胞扩增到18亿个细胞。这种按比例放大的水平潜在地使得可以提供18亿个细胞以用于在靶向糖尿病的基于细胞的自体治疗期间向患者施用。这与使用细胞培养皿过程，例如皮氏培养皿仅产生700万个细胞形成对比(数据未示)。重要的是，使用生物反应器的过程维持了细胞存活率、转分化的潜能、以及细胞的胰岛素分泌特征。
实施例21：用于产生自体胰岛素产生(AIP)细胞以治疗糖尿病的方案
目的
该研究的目的是开发用于从非β胰腺细胞产生自体胰岛素产生(AIP)细胞以治疗糖尿病的工业规模方案。通过用由患者自身现有的器官产生的新的功能性组织在功能上纠正功能失调的胰腺胰岛素产生β-细胞，基于细胞的自体治疗可以成功地靶向受试者的糖尿病。
本文所提出的方案使用旨在通过转录因子诱导的转分化将人类肝源性细胞转化成功能性胰岛素产生细胞的分子和细胞方法(图32)。这种治疗方法在工业规模上产生自体胰岛素产生(AIP)细胞，从而克服了可从供体获得的组织的短缺。
方案的概述
图33提供了在此所提供的方案的概述，这表明了6周的从活检到成品的大致时间以及在每一个步骤时的近似细胞数。图34示出了人类胰岛素产生细胞产物细胞产物制造过程的流程图，该人类胰岛素产生细胞产物在一个实施方案中可以是自体的或同种异体的胰岛素产生细胞(AIP)。细节提供于下文中。
获得肝组织/图34的步骤1
从成人受试者获得肝组织。所获得的所有肝组织均是在赫尔辛基医疗机构委员会(Helsinki Committee of the Medical Facility)的批准下接收的。因此，所有的肝组织供体均签署知情同意书并且进行供体筛选和供体检查以确保来自有感染性疾病或恶性疾病的临床证据或身体证据或风险因素的供体的活检被排除而不用于制造人类胰岛素产生细胞。
在手术室中由合格和训练有素的外科医生获得肝活检。从符合条件的患者获取约2g-4g量的肝组织的活检并且在2℃-8℃在无菌袋中在威斯康星大学(University ofWisconsin，UW)溶液中运送到GMP设施。
体外培养/图34的步骤2和步骤3
在制造点，处理肝活检以获得贴壁细胞。简单地说，将活检组织切成薄片并且在37℃由I型胶原酶消化20分钟。随后，用胰蛋白酶反复消化细胞以获得分离的单细胞；初步实验已经显示每克活检可以分离出约0.5×106个细胞。
然后在补充有10％FCS、艾塞那肽-4以及抗生素混合物(青霉素、链霉素以及两性霉素B)的细胞培养基中离体扩增细胞。在37℃在5％CO2/95％空气的加湿气氛中使用预处理的纤连蛋白包被的组织培养皿将细胞传代(最多20次传代)。在活检平板接种后的前三天期间每天更换培养基一次以去除非贴壁细胞，继而在第一次细胞传代之后每周两次更换培养基。在第一次细胞传代时，冷冻保存至少一个等分部分的细胞(参见下文；图34的任选步骤)。
将细胞使用胰蛋白酶传代(1∶3)直到产生所期望的数目的细胞为止(约10亿个-30亿个细胞，在约4周至7周内)。细胞的扩增包括在约第4周至第7周使用如实施例20中所述和图33中所示的多板系统(图34的步骤3)。
贴附到组织培养板的人类肝细胞经历上皮-间充质转化(EMT)并且高效地增殖。这些EMT样细胞中的接近100％显示出已知的间充质特征(CD29、CD105、CD90以及CD73)，而且还表达成体肝脏标志物，如白蛋白和AAT。所述细胞既不表达成肝细胞标志物，也不表达“干性”标志物。下表8示出了分析这些EMT样培养的肝细胞在转分化(TD)之前在培养的肝细胞上间充质标志物、造血标志物、以及肝脏标志物的存在的结果。
表8
Figure GSB0000169677760000891
Figure GSB0000169677760000901
表8中所示的百分比是在低传代次数时。
冷冻保存第1代细胞(图34)
简单地说，将第1代细胞在2ml冷冻小瓶中在补充有10％FBS和10％DMSO的DMEM中冷冻保存(最少0.5×106个细胞)。建议尽可能在最早传代时将细胞冷冻保存。首先将冷冻的细胞在-70℃储存24小时-48小时，然后转移到液氮中以用于长期储存。
将冷冻保存的细胞解冻(图34)
使用本领域公知的方法将冷冻保存的细胞解冻。简单地说，将小瓶从液氮中取出并且使其缓慢解冻直到侧面解冻，但是中央仍冷冻为止。将细胞轻轻地转移到组织培养板上。一旦细胞已经贴附到板上，就进行体外处理(图34的步骤2和步骤3)以扩增细胞培养物。
选择倾向性肝细胞(图34)
图34的步骤3的选择方案是分选原代肝细胞以富集倾向于转分化的细胞。举例来说，可以针对谷氨酰胺合成酶响应元件(GSRE)激活来分选细胞(GS富集的细胞)，如上文在实施例10-15中所述的那样。或者，可以针对具有活性Wnt信号转导通路来富集细胞，其中它们倾向于对Wnt信号转导作出响应，如上文在实施例17中所述的那样。此外，可以通过监测某些基因的表达的增加或减少来富集细胞，例如ABCB1、1TGA4、ABCB4、或PRNP、或其任何组合的表达减少、或HOMER1、LAMP3、BMPR2、ITGA6、DCBLD2、THBS1、或VAMP4、或其任何组合的表达增加，如上文在实施例16中所述的那样。可以如实施例23中所述用锂处理细胞群体，以增强细胞转分化的倾向。在针对转分化的倾向进行富集之后，在图34的步骤4使用细胞。
转分化(图34的步骤4)
为了转分化，将细胞在转分化培养基中再培养5天。转分化培养基是杜氏最低必需培养基(1g/l的葡萄糖)，其补充有10％FCS、艾塞那肽-4、烟酰胺、EGF以及抗生素混合物(青霉素、链霉素以及两性霉素B)。
使用两种不同的方案将细胞转分化。使用分级(1+1+1)顺序方案或使用2+1方案将细胞转分化。每一种方法的实施例提供于下文中。
分级(1+1+1)顺序方案
然后依次用3种血清5型重组复制缺陷型腺病毒载体感染离体扩增的肝细胞，所述载体各自携带处在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的胰腺转录因子(pTF)PDX-1、Neuro-D或MafA中的一种的人类基因。这3种人类pTF基因已经插入FGAD载体的相同骨架中而处在CMV启动子的控制下。CMV启动子是通常在感染之后3周-4周内关闭的异源性启动子。然而，异位pTF基因的短期表达足以诱导内源性人类同源物。
FGAD载体被选为最佳的基因递送工具以用于诱导发育重定向。上述实施例表明了将这些异位基因引入到原代成人肝细胞中用作成体细胞的重编程的不可逆过程的短期触发因素。另一方面，重组腺病毒是相对安全的，这是因为它们不整合到宿主基因组中并且因此不会破坏遗传信息的宿主序列。PDX-1诱导染色质结构的表观遗传改变，从而允许激活原本沉默的遗传信息，同时关闭表达基因的宿主谱型(比较表8和表9的结果)。
使用封闭的自动Xpansion生物反应器系统(颇尔生命科学公司(Pall LifeSciences))，遵循图33中所示的步骤流程进行转分化过程。使用所述生物反应器系统在适用于高细胞浓度的条件下培养细胞培养物。所述生物反应器系统由两个主要系统构建，即控制系统和生物反应器本身(容器和附件)。
通过控制台监测和控制过程的参数，所述控制台包括探针、电机以及泵的连接器、用于溶解氧(DO)、pH值的控制回路、气体控制系统以及孵育箱中用于温度控制的位置。受控过程参数(如温度、pH值、DO等)可以显示在操作界面上并且由指定的控制器监测。
生物反应器中的细胞培养物生长程序
将250±50×106个细胞接种到无菌XP-200生物反应器中。将生物反应器中的生长培养基保持在以下条件下：37℃、70％溶解氧(DO)以及pH 7.3。如由控制系统所确定供应经过过滤的气体(空气、CO2、N2以及O2)以将DO值保持在70％并且将pH值保持在7.3。当培养基葡萄糖浓度降低到低于500毫克/升时，更换生长培养基。使用无菌有机硅管将培养基从进料容器泵送到生物反应器中。所有的管连接均是使用管焊机进行的，从而提供无菌连接器。每1天-2天获取生长培养基的样品以进行葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐以及铵浓度测定。细胞培养物的葡萄糖消耗速率和乳酸盐形成速率使得能够测量细胞生长速率。使用这些参数来基于累积的实验数据确定收获时间。
从生物反应器收获细胞
细胞收获过程在生长阶段(8天-16天)结束时开始。如下在100级层流区中收获培养物：
使用重力经由管道将生物反应器容器排空到废物容器中。然后将生物反应器容器重新填充以22L预升温的PBS(37℃)。经由管道通过压力或重力将PBS排出到废物瓶中。将洗涤程序重复两次。
为了从表面释放细胞，将22L预升温到37℃的胰蛋白酶-EDTA(胰蛋白酶0.25％、EDTA 1mM)添加到生物反应器容器中。将500ml FBS添加到生物反应器容器中并且将细胞悬浮液收集到无菌容器中。将细胞悬浮液离心(600RPM，10分钟，4℃)并且重悬在培养基中。
分级(1+1+1)病毒感染步骤
在连续三天通过重组腺病毒依次施用异位转基因。异位基因的顺序施用已经被证实提高了转分化效率并且增加了细胞的成熟，特别是沿β细胞谱系和功能的成熟。
转分化程序耗时约7天，在结束时洗涤细胞以去除未并入的重组腺病毒。简单地说：
在第1天，用PDX-1腺病毒载体，使用1,000的MOI感染重悬细胞。然后将细胞接种到培养皿上，在被供给5％CO2的加湿37℃孵育箱中孵育过夜。
在第2天，使用胰蛋白酶使细胞脱离培养皿并且重悬。用NeuroD1腺病毒载体，使用250的MOI感染重悬的细胞。然后将细胞接种到培养皿上，在被供给5％CO2的加湿37℃孵育箱中孵育过夜。
在第3天，使用胰蛋白酶使细胞脱离培养皿并且重悬。用MafA腺病毒载体，使用50的MOI感染重悬的细胞。然后将细胞接种到培养皿上，在被供给5％CO2的加湿37℃孵育箱中孵育三天。
然后回收细胞并且分析标志物和葡萄糖调节的经过加工的胰岛素的分泌。对照细胞包括遵循相同的方案，但是在没有添加腺病毒的情况下繁殖和孵育的那些。
材料和实验方法
膜标志物的FACS分析：如下将细胞用单克隆抗体染色：在5ml试管中将400,000个-600,000个细胞悬浮在0.1ml的流式细胞仪缓冲液中并且在室温(RT)，在暗处与以下单克隆抗体(MAb)中的每一种一起孵育15分钟：
Figure GSB0000169677760000931
收获AIP细胞(图34的步骤5)：然后将细胞用流式细胞缓冲液洗涤两次，重悬并且通过使用FC-500流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))进行流式细胞术来分析。用相关的同种型荧光分子制备阴性对照。
包装和分发
在制造结束时，将AIP细胞包装以用于装运并且在制造点进行分发。计划将AIP细胞在2℃-8℃运送到医院。
分级(1+1+1)方案的结果
细胞的腺病毒感染引起转基因的瞬时表达，这触发了对内源性基因的永久诱导，从而引起AIP细胞的稳定转分化(数据未示)。因此，最终产物中没有病毒DNA的修饰或插入。
分析所收获的AIP细胞(图34的步骤6)
针对间充质标志物、造血标志物、以及肝脏标志物的存在对转分化的肝细胞(AIP细胞)的分析示于表7中。阴性标志物包括造血标志物。
表9
Figure GSB0000169677760000941
虽然在Xpansion生物反应器中在不同的患者样品之间注意到变异性，但是在所有情况下，所收获的细胞的细胞密度与起始培养物相比均大幅增加(图35)。
分析所收获的AIP细胞产物以鉴定许多标志物的表达。通过RT-PCR和FACS进行鉴定。下表10和表11中所示的结果显示了包括PDX-1、NeuroD、MafA、Pax4、Nkx6.1以及胰岛素的β-细胞胰腺标志基因的内源性表达的倍数增加。
表10
Figure GSB0000169677760000942
Figure GSB0000169677760000951
表11
Figure GSB0000169677760000952
图36A和36B中所示的条形图示出了在使用分级方案之后所获得的典型结果。呈现了转分化的肝细胞(AIP细胞)与胰腺细胞和非转分化肝细胞的对照群体的比较，其中可以看到，AIP细胞与对照相比显示出胰腺细胞标志物的显著增加。
针对AIP细胞的功能的肝脏表型与胰腺表型对细胞进行进一步表征的结果示于下表12中。PDX-1细胞中肝脏标志物的显著减少与胰腺细胞标志物的增加的组合表明肝细胞成功转化成具有胰腺β-细胞的表型和功能的细胞。
表12：AIP细胞产物规格，如通过FACS所鉴定
Figure GSB0000169677760000953
对所收获的AIP细胞的群体内死细胞的分析显示少于20％的细胞是死的(数据未示)。
还分析了所收获的AIP细胞产物的胰岛素的功能分泌。图37示出了AIP细胞产物效力(葡萄糖调节的胰岛素分泌，如使用ELISA所测量)。所测试的AIP细胞产物代表了已经在XP-200生物反应器中扩增的转分化的细胞群体。通过GSIS(用KRB+0.1％RIA级BSA或重组BSA，在低葡萄糖浓度(2mM)和高葡萄糖浓度(17.5mM)下葡萄糖刺激的胰岛素分泌)测量胰岛素分泌。结果被表示为每小时每百万个细胞的胰岛素的纳克数并且显示AIP细胞的响应的显著增加。
2+1转分化(TD)方案
图38示出了使用Xpansion生物反应器系统以及过程对照的“2+1”TD方案。将“2+1”TD方案与多系统生物反应器组合使用的结果表明了该方案的可行性，该方案高效地产生AIP产物细胞。在第3天使用包含编码PDX-1和NeuroD1多肽的核酸的腺病毒载体或两种腺病毒载体(一种包含编码PDX-1的核酸而另一种包含编码NeuroD1的核酸)进行第一次感染。PDX-1的MOI是1∶1,000并且NeuroD1的MOI是1∶250。然后将细胞孵育3天并且在第6天使用包含编码MafA的核酸的腺病毒载体(1∶50 MOI)进行第二次感染。在两天后在第8天收获细胞并且针对质量控制标志物筛选，这类似于上文在使用分级(1+1+1)方案时所述的那样。
在第二次感染时(第6天)细胞培养物的观测结果显示出类似的汇合度，而与所使用的条件无关(图39A-39D和40A-40B)。在最终收获时，在CTL(对照)条件下处理的细胞比其它条件表现出略微更高的细胞汇合度(图41A-41D)。细胞密度的差异主要归因于不同的接种密度、以及在感染后几天内的细胞回收率和死亡率。
测定所收获的细胞的胰岛素含量并且图42中所示的结果显示与未处理的对照(没有用包含编码PDX-1、NeuroD1以及MafA的核酸的病毒载体感染)相比，在所测试的所有三种2+1方案下转分化的细胞的胰岛素含量(微国际单位/百万个细胞)增加。过程CTL条件呈现出比未处理的细胞产生显著更高的胰岛素含量的预期趋势(约2.5倍)。Xpansion CTL条件也呈现出其中经过处理的细胞比未处理的细胞表现出显著更高的胰岛素含量(约1.7倍)的预期趋势。在Xpansion 10系统中转分化的细胞与Xpansion CTL条件的经过处理的细胞表现出类似的胰岛素含量(是未处理对照的约1.7倍)。
“2+1”转分化方案的使用在产生AIP细胞产物方面是高效的(步骤数和细胞损失的机会减少)，所述细胞产物比未处理的肝细胞具有显著更高的胰岛素含量。
纯度测定
开发纯度测定以确保在扩增和转分化步骤期间超过90％的细胞具有间充质干细胞(MSC)样表型(参见上述方法中)。独立于用于转分化的方案使用这些纯度测定。培养的MSC应当对CD73、CD90、CD105以及CD44呈染色阳性。此外，MSC应当对CD45、CD34、CD14或CD11b、CD19或CD79#以及HLA-DR表面分子呈阴性。先前的结果(图44A和44B)表明MSC标志物随时间推移以及在肝细胞的转分化期间是稳定的。显示AIP细胞的MSC样表型的结果示于表6和表7中。使用流式细胞术测定和免疫荧光测定这两者来研究这些参数。
实施例22：消化方法的分析
目的
该研究的目的是验证不同的消化方法不会影响肝细胞由腺病毒转导的能力。
方法
简单地说，用Ad.CMV.GFP感染肝细胞并且在96小时之后测量GFP的表达。将肝细胞用10moi、100moi、以及500moi的Ad5.CMV.GFP病毒转导或保持未处理。在96小时之后，通过荧光显微镜术(图45A、图46A)和FACS(图45B-45C、图46B-46C)测量GFP表达。
结果
图45A-45C示出了通过用Serva胶原酶和Worthington胶原酶消化肝脏所获得的BP001细胞的转导的效率。尽管转导细胞的百分比是相似的，但是用Serva胶原酶消化的肝脏比用Worthington胶原酶消化的肝脏产生更多的GFP，如由GFP荧光强度所示(图45B和45C)。类似地，TS001细胞的转导效率没有受到Serva胶原酶的使用的影响(图46A-46C)。
实施例23：在转分化之前WNT处理提高转分化能力
目的
该研究的目的是提高细胞群体内的转分化能力。
如上文在实施例17处所述，活性WNT信号转导是eGFP+倾向性群体的特征。虽然上文所述的实验表明在连同转分化转录因子一起施用时，诱导WNT信号转导提高了转分化效率，但是并没有证实eGFP+中预先存在的WNT信号转导是否与它们提高的重定向它们的分化命运的能力有关。
方法
为了测试WNT信号转导是否赋予细胞以转分化的能力，用10mM锂(Li)将eGFP+细胞处理48小时，之后添加转分化因子。然后在添加胰腺转录因子时从培养基中去除锂。
结果
在转分化后，用Li预处理的细胞表现出胰岛素分泌的增加(图48A)以及胰腺基因的表达(图48B)，这表明了WNT信号转导是使得细胞能够进行高效的转分化的“固有”信号通路。有趣的是，内源性PDX-1表达水平在Li预处理的情况下没有上调(图48C)，这表明了后期WNT信号是为稳定的胰腺谱型所必需的。
虽然在本文中已经说明和描述了在此公开的某些特征，但许多改动方案、替代方案、变化方案以及等同方案现在将被本领域的普通技术人员想到。因此，应当了解的是，所附权利要求书意图涵盖落入在此所公开的真实精神范围内的所有这些改动方案和变化方案。
Figure IPA0000246395150000011
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Claims (11)

1.一种制造人类胰岛素产生细胞的群体的体外方法，所述方法包括以下步骤：
（a）处理成人肝组织以回收原代成人肝细胞；
（b）使所述原代成人肝细胞繁殖和扩增到预定的细胞数；
（c）将所述扩增的细胞转分化，其中所述转分化包含：
（1）用至少一种表达载体感染所述扩增的细胞，所述感染发生在第一时间段，
（i）其中所述至少一种表达载体包括含有编码PDX-1多肽的核酸的腺病毒载体，以及含有编码人类第二胰腺转录因子多肽的核酸的腺病毒载体，其中使用所述腺病毒载体的所述感染发生在同一时间；
或
（ii）其中所述至少一种表达载体包括含有编码人类PDX-1多肽和第二胰腺转录因子多肽的核酸的腺病毒载体；
以及
（2）用包含编码MafA多肽的核酸的腺病毒载体感染（1）的所述扩增的受感染的细胞，所述感染发生在第二时间段；以及其中所述第二时间段在所述第一时间段之后；以及
（d）收获所述转分化的扩增的细胞；
从而制造所述人类胰岛素产生细胞的群体，其中所述成人肝细胞表达间充质干细胞标志物并且不经历其中所述细胞包含胚胎特征的阶段，
其中所述人类胰岛素产生细胞的群体具有
与对照非转分化原代成人肝细胞相比，增加的胰岛素含量，或增加的葡萄糖调节的胰岛素分泌，或增加的葡萄糖调节的C肽分泌，或增加的内源Nkx6.1转录因子的表达，或其任何组合，
其中所述胰岛素产生细胞表达间充质干细胞标志物且不包含胚胎特征，并且
其中所述第二胰腺转录因子选自NeuroD1和Pax4。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述繁殖和扩增包含使用生物反应器。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述人肝组织包含
从患有胰腺病症或胰岛素依赖性糖尿病的受试者获取的肝组织。
4. 如权利要求2所述的方法，
a. 其中所述生物反应器包含单个生物反应器或多个生物反应器；或
b. 其中所述生物反应器包含单次使用生物反应器、多次使用生物反应器、封闭系统生物反应器、或开放系统生物反应器、或其任意组合；
或其任意组合。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在步骤（c）中，所述扩增的细胞的所述转分化包括经由一系列生物反应器系统进行转分化。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括富集所述原代成人肝细胞中倾向于转分化的细胞的步骤，其中所述富集步骤在所述转分化步骤之前或与所述转分化步骤同时进行，或两者都有。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述原代成人肝细胞中倾向于转分化的细胞包含以下细胞：
（a）含有活性Wnt信号转导通路；
（b）具有激活谷氨酰胺合成酶响应元件的能力；
（c）当所述细胞包含肝细胞时，具有增加的HOMER1、LAMP3、BMPR2、ITGA6、DCBLD2、THBS1、或VAMP4、或其任意组合的表达；
（d）当所述细胞包含肝细胞时，具有降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4、或PRNP、或其任意组合的表达；或
其任何组合。
8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括在所述原代细胞中增加Wnt信号激活的步骤。
9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述原代成人肝细胞与锂一起孵育。
10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述预定的细胞数为10-20亿个细胞。
11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中间充质干细胞标志物包括CD73、或CD90、或CD105、或CD44，或其任意组合。
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