KR20170102308A - 전환분화 방법 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

비-췌장 β-세포로부터 인간 인슐린 생성 세포 집단을 제조하는 방법이 본 명세서에 개시되되, 얻어진 인슐린 생성 세포는 증가된 인슐린 함량, 또는 증가된 글루코스 조절 인슐린 분비 또는 둘 다의 조합을 가진다.

Description

전환분화 방법 및 이의 사용 방법
본 명세서에 제시된 개시내용은 인간 인슐린 생성 세포의 대규모 생산 방법을 제공하되, 인슐린 생성 세포는 글루코스 조절 방식으로 인슐린을 생성하는 전환분화된 비-췌장 β-세포를 포함한다.
췌장 내 랑게르한스섬의 베타-세포는 아미노산, 글리세르알데하이드, 유리 지방산, 및 가장 현저하게는, 글루코스와 같은 인자에 반응하여 인슐린을 분비한다. 인슐린을 분비함으로써 혈액 글루코스 농도의 상승을 감지하고 상승된 수준의 글루코스에 반응하는 정상적인 섬 베타-세포의 능력은 혈액 글루코스 수준의 제어에 중요하다. 글루코스 부하에 반응하는 증가된 인슐린 분비는 말초 조직, 특히 근육 및 지방조직 내로의 글루코스 흡수를 자극함으로써 정상 개체에서의 고혈당증을 예방한다.
섬 베타-세포가 기능하는 개체는 당뇨병으로 고통받는다. 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 또는 IDDM(또는 소아성 당뇨병 또는 I형 당뇨병으로 알려짐)은 모든 인간 당뇨병 중 대략 10%를 나타낸다. IDDM만이 랑게르한스섬의 인슐린 생성 베타 세포의 특정 파괴를 수반한다는 점에서 IDDM은 비-인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)이다. IDDM에서 베타-세포의 파괴는 특정 자가면역 공격의 결과인 것으로 나타나는데, 이때 환자 자신의 면역계가 베타-세포를 인식 및 파괴하지만, 섬을 포함하는 주위의 알파-세포(글루카곤 생성) 또는 델타-세포(소마토스타틴 생성)는 인식 및 파괴하지 않는다.
IDDM에 대한 치료 선택사항은 인슐린의 자가 주사에 중점을 두는 데, 이는 불편하고 모호한 해결책이다. 따라서 새로운 치료적 전략의 개발이 매우 바람직하다. 섬 또는 췌장 단편 이식 가능성은 영구적인 인슐린 대체를 위한 수단으로서 연구되었다. 현재의 방법은 이식 기재로서 시체에서 나온 물질 또는 돼지 섬 중 하나를 이용한다. 그러나, 극복을 위한 상당한 문제는 공여체 조직의 낮은 이용 가능성, 가변성 및 분리를 통해 얻은 섬의 낮은 수율, 및 단리 과정의 결과로서 생길 수 있는 효소적 및 물리적 손상이다. 추가로, 면역 주사 문제 및 돼지 섬을 이용하는 이종이식에 관한 현재의 문제가 있다.
인슐린의 자가-주사에 의한 당뇨병 치료에 대한 대안을 확립하기 위한 중요한 필요가 남아있다는 것은 분명하다. 줄기세포 연구는 이와 관련하여 조짐을 나타내었지만, 큰 성공은 없었다. 당뇨병의 치료에서 사용될 비-췌장 세포를 단리, 배양 및 전환분화하기 위한 개선된 절차에 대한 필요가 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 인슐린을 분비하는 전환분화된 비-베타 췌장 세포의 대규모 생산을 포함한다. 이들 전환분화된 세포는 이식 요법에서 사용될 수 있는데, 이는 현재 당뇨병 치료에 필요한 인슐린의 수많은 자가-주사에 대한 필요를 제거한다.
일 양상에서, 본 명세서에서 인간 인슐린 생성 세포 집단(population of human insulin producing cells)을 제조하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 성인 인간 간 조직을 얻는 단계; 상기 간 조직을 가공하여 1차 성인 인간 1차 간 세포를 회수하는 단계; 상기 1차 성인 인간 간 세포를 사전 결정된 세포 수로 증식 및 확장시키는 단계; 상기 확장된 세포를 전환분화시키는 단계; 및 상기 전환분화된 확장 배양물을 채취하는 단계를 포함함으로써; 대조군 비전환분화된 간 세포에 비해 증가된 인슐린 함량, 또는 증가된 글루코스 조절된 분비, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 상기 인간 인슐린 생성 세포 집단을 제조한다.
관련된 양상에서, 상기 인간 인슐린 생성 세포 집단의 70% 초과는 내인성 PDX-1을 발현시킨다. 추가적인 관련된 양상에서, PDX-1을 발현시키는 세포는 또한 내인성 NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합을 발현시킨다. 또 다른 관련된 양상에서, PDX-1을 발현시키는 집단의 5% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시킨다.
관련된 양상에서, 생산된 세포의 증가된 인슐린 함량은 전환분화되지 않은 상기 대조군 세포에 비해 적어도 5% 증가를 포함한다.
다른 양상에서, 간 조직은 췌장으로부터 또는 인슐린 의존성 당뇨병으로부터 고통받는 대상체로부터 얻는다. 관련된 양상에서, 인간 인슐린 생성 세포 집단은 이러한 인슐린 요법이 필요한 환자에 대해 자가(autologous)이다. 다른 관련된 양상에서, 인간 인슐린 생성 세포 집단은 이러한 인슐린 요법이 필요한 환자에 대해 동종이계(allogeneic)이다.
관련된 양상에서, 상기 방법은 생성-생물반응기 시스템까지 일련의 계대배양 단계들을 통해 상기 세포를 증식 및 확장시키는 단계를 포함한다. 다른 관련된 양상에서, 생물반응기 시스템은 단일 생물반응기 또는 다중 생물반응기를 포함한다. 다른 관련된 양상에서, 생물반응기는 일회용 생물반응기, 다회용 생물반응기, 폐쇄 시스템 생물반응기, 또는 개방 시스템 생물반응기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 추가적인 관련된 양상에서, 상기 확장된 세포의 전환분화는 일련의 생물반응기 시스템을 통한 전환분화를 포함한다.
관련된 양상에서, 전환분화는 인간 PDX-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 제1 시간 기간에 상기 확장된 세포를 감염시키는 단계; 인간 NeuroD1 폴리펩타이드 또는 Pax4 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 (a)의 상기 확장된 세포를 제2 시간 기간에 감염시키는 단계; 및 인간 MafA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 (b)의 상기 확장된 세포를 제3 시간 기간에 감염시키는 단계를 포함한다.
다른 관련된 양상에서, 전환분화시키는 것은 인간 PDX-1 폴리펩타이드를 암호화하고, 제2 췌장 전사 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 상기 확장된 세포를 감염시키는 단계로서, 상기를 제1 시간 기간에 감염시키는 단계; 및 인간 MafA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 (a)의 상기 확장된 세포를 감염시키는 단계로서, 상기를 제2 시간 기간에 감염시키는 단계를 포함한다. 추가적인 관련된 양상에서, 제2 췌장 전사 인자는 NeuroD1 및 Pax4로부터 선택된다.
다른 관련된 양상에서, 상기 방법은 전환분화하는 경향을 갖는 세포에 대해 상기 1차 성인 인간 간 세포를 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 관련된 양상에서, 상기 경향을 갖는 세포는 주심(pericentral) 간 세포를 포함한다. 또 다른 관련된 양상에서, 상기 경향을 갖는 세포는 활성 Wnt-신호전달 경로; 글루타민 합성효소 반응 요소(glutamine synthetase response element: GSRE)의 활성화 능력; HOMER1, LAMP3, ITGA6, DCBLD2, THBS1, VAMP4 또는 BMPR2, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현; ABCB1, ITGA4, ABCB4 또는 PRNP, 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 발현; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 세포를 포함한다.
다른 관련된 양상에서, 상기 방법은 리튬을 이용하여 1차 성인 인간 간 세포 집단을 처리하는 단계를 더 포함하되, 상기 처리된 집단은 전환분화의 경향이 있는 세포가 풍부하다. 다른 관련된 양상에서, 리튬을 이용하여 치료하는 단계는 전환분화 전에 일어난다.
일 양상에서, 성인 인간 간 조직을 얻는 단계; 상기 간 조직을 가공하여 1차 성인 인간 1차 간 세포를 회수하는 단계; 상기 1차 성인 인간 간 세포를 사전 결정된 세포 수로 증식 및 확장시키는 단계; 상기 확장된 세포를 전환분화시키는 단계; 및 상기 전환분화된 확장 배양물을 채취하는 단계의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 인간 인슐린 생성 세포 집단이 본 명세서에 개시되되; 상기 인간 인슐린 생성 세포 집단은 대조군 비-전환분화된 간 세포에 비해 증가된 인슐린 함량 또는 증가된 글루코스 조절 인슐린 분비, 또는 이들의 임의의 조합을 가진다.
다른 관련된 양상에서, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 70% 초과는 내인성 PDX-1을 발현시킨다. 추가적인 관련된 양상에서, PDX-1을 발현시키는 세포는 또한 내인성 NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합을 발현시킨다. 또 다른 관련된 양상에서, PDX-1을 발현시키는 집단의 5% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시킨다.
다른 관련된 양상에서, 인간 인슐린 생성 세포 집단은 상기 대조군 세포에 비해 적어도 5% 증가를 포함하는 증가된 인슐린 함량을 포함한다.
다른 관련된 양상에서, 인간 인슐린 생성 세포 집단은 췌장염으로부터 또는 인슐린 의존성 당뇨병으로부터 고통받고 있는 환자에 대한 세포 기반 요법에서 사용하기 위한 것이다. 추가적인 관련된 양상에서, 세포는 환자와 자가 또는 동종이계이다.
다른 양상에서, 본 명세서에서 인간 인슐린 생성 세포 집단, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 개시된다.
췌장 세포의 표현형 및 기능을 갖는 전환분화된 비-베타 췌장 세포로서 여겨지는 대상 및 이의 제조 방법이 언급되며, 본 명세서의 결말 부분에서 별도로 청구된다. 그러나, 유기화와 작업 방법 둘 다에 대해, 이들의 대상, 특징 및 이점과 함께 췌장 세포의 표현형 및 기능을 갖는 전환분화된 비-베타 췌장 세포는 수반하는 도면과 함께 읽을 때 다음의 상세한 설명을 참고로 하여 가장 잘 이해될 것이다:
도 1A 내지 도 1D는 시험관내 인간 간 세포에서 PDX-1 발현은 췌장 호르몬 발현의 점진적 활성화를 유도한다는 것을 도시한 도면. (도 1A) 인슐린(INS); (도 1B) 글루카곤(GCG); (도 1C) 소마토스타틴(SST); 및 (도 1D) 다른 췌장-특이적 전사 인자("pTF")(NKX6.1, ISL1, PAX4, MAFA, NeuroD1, NeuroG3). 결과를 동일한 cDNA 샘플 내의 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시키고 나서, 상대적 발현 대 동일한 날에 대조군 바이러스 처리 세포의 평균 ± SE로서 제공한다. 두 독립적 실험에서 n ≥4(*p<0.05, **p<0.01).
도 2A 내지 도 2D는 시험관내 인간 간 세포 내 췌장 전사 인자(pTF) PDX-1, Pax4 및 MafA의 이소성 공동-발현은 pTF 단독의 각각에 의해 유도되는 것에 비해 (프로)인슐린 분비를 촉진시킨다는 것을 도시한 도면. (도 2A) 면역형광법(IF) 염색은 pTF의 발현을 나타낸다: PDX-1(좌측 패널), Pax4(중간 좌측 패널), MafA(중간 우측 패널) 및 3가지 pTF의 병합(우측 패널), 화살표는 모두 3가지 pTF를 발현시키는 세포를 나타낸다. (도 2B) pTF로 나타내는 루시퍼라제 분석 인슐린 프로모터 활성화; β-gal을 대조군으로서 사용하였다. 결과를 상대적 광 단위(상대적 광 단위: RLU)/㎎ 단백질로서 표현한다. 각각의 데이터 지점은 대조군 바이러스 처리 세포, (n>4)에 비해 적어도 2개의 독립적 실험의 평균±SE를 나타낸다, *p<0.05, **p<0.01. (도 2C) 면역형광법 염색은 표시된 pTF의 이소성 발현 후 인슐린 양성 세포를 나타낸다. 본래의 배율 x20. 표에서 IF 염색의 정량화(우측). 인슐린-양성 세포의 백분율을 적어도 2회의 독립적 실험으로부터 적어도 500개의 양성 세포를 계수화함으로써 계산하였다. (도 2D) 표시된 농도의 글루코스와 함께 인큐베이션 후 인슐린 분비를 방사면역측정법에 의해 검출하였다. 5회의 독립적 실험에서 *p<0.05, n>12. 유의도는 삼중 감염과 모든 다른 처리 사이의 차이를 나타낸다.
도 3A 내지 도 3E는 췌장 β-세포 성숙에 대해 pTF PDX-1, Pax4 및 MafA의 협력되고 순차적인 발현 효과를 도시한 도면. (도 3A) pTF(처리 B 내지 E) 또는 대조군 바이러스(Ad-CMV-β-gal, 처리 A)의 감염 순서를 도시하는 계획. (도 3B) 인슐린에 대한 면역형광법 염색: 처리 B(좌측 패널), 처리 C(중간 패널), 처리 D(우측 패널). 본래의 배율은 x20이다. 염색의 정량화(백분율)는 이하의 각각의 이미지를 나타낸다. 인슐린 양성 세포의 백분율은 적어도 2회의 독립적 실험으로부터 적어도 1000개의 양성 세포를 계수화함으로써 계산하였다. (도 3C) 인슐린 및 (도 3D) 표시된 농도의 글루코스와 함께 인큐베이션 후에 C-펩타이드 분비를 방사면역측정법에 의해 측정하였다. 감염 처리를 X-축 상에 나타내고, 대조군 바이러스 처리 세포에 비교하여 도 3A에서 설명한다. *p<0.05, **p<0.01; 5회의 독립적 실험에서 n>12. (도 3E) 표시된 처리 후 표시된 내인성 췌장-특이적 전사 인자의 발현 수준(X-축)을 RT-PCR에 의해 측정하였다. CT 값을 동일한 cDNA 샘플 내의 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시켰다. 결과를 4회의 독립적 실험에서 대조군 바이러스 처리 세포에 대한 상대적 발현의 평균 + SE의 상대적 수준(*p<0.05 n>8)으로서 제시한다. 화살표는 처리 C 하에서 Isl-1 발현 수준의 특이적 감소를 지시한다.
도 4A 내지 도 4C는 감염의 층위인 순차적 순서(처리 C)가 가장 효율적이라는 것을 나타내는 전환분화 효율을 보여주는 3개 그래프를 도시한 도면. (도 4A) 표시된 감염 처리 후 인슐린 프로모터 활성화를 루시퍼라제 분석에 의해 측정하였다. 결과를 상대적 광 단위(RLU)/㎎ 단백질로서 표현한다. 각각의 데이터는 대조군 바이러스 처리 세포에 비해 적어도 2회의 독립적 실험의 평균 ± SE(*P<0.05, **P<0.01)를 나타낸다, (n>4). (도 4B) 표시된 감염 처리 후에 RT-PCR에 의한 글루코스 수송체 2(GLUT2) 발현 수준 분석을 수행하였다. CT 값을 동일한 cDNA 샘플 내의 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시킨다. 결과를 대조군 바이러스 처리 세포에 비교하여 평균 + SE의 상대적 수준으로서 제시한다. *P<0.05, 4회의 독립적 실험에서 대조군 바이러스 처리 세포 n>8과 비교하였다. (도 4C) 표시된 감염 처리 후 RT-PCR에 의해 프로호르몬 전환효소 2(PC2; PCSK2)의 발현 수준을 결정하였다. CT 값을 동일한 cDNA 샘플 내에서 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시킨다. 결과를 4회의 독립적 실험에서 대조군 바이러스 처리 세포에 비교한 평균 + SE의 상대적 수준으로서 제시한다(**P<0.01, n>8).
도 5A 내지 도 5B는 감염의 층위인 순차적 순서 후에 C-펩타이드 분비를 입증하는 두 그래프를 도시한 도면(처리 C). (도 5A) C-펩타이드 분비를 3회의 독립적 실험에서 직접적인 "층위" 순차적 순서에 의해 처리한 세포 내 0, 5, 10, 15, 20mM 글루코스에서 15분 동안 방사면역측정법 정적 인큐베이션에 의해 측정하였다(처리 C)(*P<0.05, n>7). (도 5B) C-펩타이드 분비에 대해 분석하기 전에, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄(ITS)으로 보충한 무혈청 배지에서 13일 또는 28일에 걸쳐 방사면역측정법에 의해 C-펩타이드 분비를 측정하였다. *P<0.05, **P<0.01, 2회의 독립적 실험에서 n>5. 유의도는 표준 프로토콜에 비교한 차이를 나타낸다(제6일에 처리 C).
도 6A 내지 도 6D는 처리 C 감염 순서 및 각각의 pTF의 제외(C-PDX-1, PDX-1의 제외; C-Pax4, Pax4의 제외; 및 C-MafA, MafA의 제외)를 이용하는 전환 분화 과정에서 pTF의 개개 역할을 나타내는 4개 그래프를 제공한다. (도 6A) 인슐린 프로모터 활성화를 루시퍼라제 분석에 의해 측정하였다. 결과를 3회의 독립적 실험에서 직접적인 "층위" 순차적 감염 순서(처리 C)(n>6)에 비교한 평균 ± SE(*p<0.1, **p<0.05)로서 제시한다. (도 6B) 표시된 농도의 글루코스와 함께 15분 동안 인큐베이션 후 C-펩타이드 분비를 방사면역측정법에 의해 측정하였다. *=p<0.05, **=p<0.01을 3회의 독립적 실험에서 직접적인 "층위" 순차적 감염 순서(C)(n>6)와 비교한다. (도 6C) 췌장 효소의 발현 수준을 RT-PCR: 글루코스 수송체 2(GLUT2); 글로코키나제(GCK); 및 프로호르몬 전환효소(PCSK2)에 의해 측정하였다. (도 6D) 표시된 내인성 pTF의 발현 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다. CT 값을 동일한 cDNA 샘플 내에서 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시킨다. 결과를 "층위 순차적 감염" 처리 간 세포에 비교한 평균 + SE의 상대적 수준으로서 제시한다. 3개의 독립적 실험에서 *p<0.05, **p<0.01, n>6.
도 7A 내지 도 7C는 "층위" 순차적 순서에 의한 감염 후 전환분화된 간 세포의 β-세포 성숙에 대한 Isl1 발현 효과를 나타내는 3개의 그래프를 도시한 도면(처리 C). (도 7A) 인슐린의 발현 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다. CT 값을 동일한 cDNA 샘플 내에서 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화한다. 결과를 대조군 바이러스 처리 세포에 비해 평균 + SE의 상대적 수준으로서 제시한다. 3회의 독립적 실험에서 *P<0.05, n>6. (도 7B) 인슐린 분비를 방사면역측정법에 의해 측정하였다. **P<0.01, n>6, 3회의 독립적 실험에서 직접적 "층위" 순차적 감염 순서(C)와 비교하였다, n>6. (도 7C) 글루코스 수송체 2(GLUT2)의 발현 수준을 RT-PCR에 의해 측정하였다.
도 8A 내지 도 8G는 각각의 pTF의 감염(처리 C) 및 제외 층위 순서를 이용하여 글루카곤(α-세포) 및 소마토스타틴(δ-세포)을 생성하기 위해 세포 분화를 촉진시킴에 있어서 pTF의 개개 역할을 도시한 도면. 표시된 감염 처리 후에 췌장 호르몬 글루카곤(GCG)(도 8A 및 도 8B) 및 소마토스타틴(SST)(도 8A 및 도 8D)의 발현 수준을 RT-PCR에 의해 결정하였다. (도 8C) 세포-특이적 전사 인자 ARX 및 BRAIN4의 발현 수준을 표시된 감염 처리를 위해 RT-PCR에 의해 측정하였다. (도 8E) 소마토스타틴(SST)의 발현 수준을 Isl1(100 MOI)에 의한 추가적인 감염 후에 RT-PCR에 의해 결정하였다. CT 값(도 8A, 도 8B, 도 8C 및 도 8D에 대해)을 동일한 cDNA 샘플 내에서 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시킨다. 결과를 대조군 바이러스 처리 세포(도 8A)에 비교하거나 또는 "층위 순차적 감염" 처리 간 세포에 비교하여(도 8B 내지 도 8E) 평균 + SE의 상대적 수준으로서 제시한다. 3회의 독립적 실험에서 *P<0.05, **P<0.1, n>6. (도 8F) 처리 C 감염 후(좌측 패널), 그리고 추가적인 Isl1 감염에 의한 처리 C 감염 후(우측 패널) 소마토스타틴에 대한 면역형광법 염색. 본래의 배율 x20. (도 8G) 직접적 층위 방식에서 전사 인자의 순차적 투여가 베타-유사-췌장 계통을 따라서 전환분화된 세포의 증가된 성숙을 초래한다는 것을 나타내는 소마토스타틴 및 인슐린에 대한 면역형광법 염색.
도 9는 간으로부터 췌장까지 췌장 전사 인자 유도 전환분화의 제안된 메커니즘의 개략적 표현을 도시한 도면. 3개의 pTF의 협력된 발현은 각각의 인자의 개개 효과에 비해 증가된 수의 전환분화된 간 세포를 초래한다(처리 B). 직접적 층위 방식에서 순차적 투여는 베타-유사-췌장 계통(처리 C)을 따라서 전환분화된 세포의 증가된 성숙을 초래한다.
도 10A 내지 도 10D는 생체내 마우스에서 PDX-1-유도 인슐린 생성 세포'(IPC) 활성화가 글루타민 합성효소(GS) 발현을 특징으로 하는 중심정맥에 인접한 세포로 제한된다는 것을 도시한 도면. Ad-CMV-PDX-1 투여 14일 후에 Pdx-1(도 10A) 및 인슐린(도 10B)의 면역조직화학적 분석. 화살표는 중심정맥(cv)에 근위에 주로 위치된 양성 세포를 나타낸다. (도 10C 및 도 10D) 중심정맥에 인접한 1 내지 2개 세포층에서 GS의 발현을 나타내는 인간(도 10C) 및 마우스(도 10D)의 GS 발현 분석. 본래의 배율 x400.
도 11은 글루타민 합성효소 반응 요소(GSRE)가 Wnt 신호전달 반응 요소-TCF-LEF 결합 부위를 함유한다는 것을 도시한 도면. TCF-LEF 및 STAT 5 결합 부위의 존재를 나타내는 GSRE의 개략적 제시.
도 12A 내지 도 12F는 GSRE가 시험관내 인간 간 세포의 하위집단을 표적화한다는 것을 도시한 도면. (도 12A 및 도 12D) Ad- GSRE -TK- PDX -1 또는 GFP 재조합 아데노바이러스의 개략적 제시. 간세포를 Ad- GSRE -TK- Pdx -1(도 12C)로 또는 Ad- CMV -Pdx-1(도 12B)로 감염시켰다. PDX-1 발현의 면역형광 분석은 인간 간 세포의 13±2%가 Ad- GSRE -TK- Pdx -1에 의해 감염되는 한편(도 12C) Ad-CMV-Pdx-1-처리 세포의 70±12%(도 12B)는 이소성 핵 인자(토끼 항-Pdx-1, C. Wright로부터 기증, 핑크색; 각각 도 12B 및 도 12C)를 발현시킨다는 것을 나타내었다. Ad- GSRE -TK- eGFP를 이용하여 유사한 결과를 얻었고; 세포의 대략 15%는 eGFP에 대해 양성이었다(도 12E 및 도 12F). Ad- CMV - eGFP 감염은 3 내지 4일 내에 약 75 내지 80% eGFP 양성 세포를 초래하였다(데이터 미제시).
도 13A 내지 도 13C는 GSRE가 전환분화-경향 세포를 표적화한다는 것을 도시한 도면. 간 세포를 5일 동안 Ad- GSRE -TK- Pdx -1(도 13B)로 또는 Ad- CMV - Pdx - 1(도 13A)로 감염시켰다. (도 13A 및 도 13B), 인슐린(기닉픽 항-인슐린, 다코사(Dako), 녹색) 및 (Pdx-1 토끼 항-Pdx-1, C. Wright로부터 기증, 핑크)의 공동 염색의 면역형광 분석. (도 13C) 처리 세포에서 인슐린 활성화의 통계학적 분석; Ad- GSRE -TK-Pdx-1은 인슐린 생성을 50%로 활성화시킨 반면, Ad- CMV - Pdx -1은 단지 Pdx-1-양성 세포의 5%만을 활성화시켰다. 파랑 - DAPI, 핵 염색; 본래의 배율 x20.
도 14A 내지 도 14E는 GSRE 활성화 인간 세포에 대한 시험관내 계통 추적을 도시한 도면. (도 14A) 렌티바이러스 벡터의 개략적 제시. (도 14B) 3 내지 10회 계대에서 성인 인간 간 세포를 이중 렌티바이러스 시스템에서 감염시켰다. DsRed2(적색) 또는 eGFP(녹색) 형광에 대한 감염 10일 후에 간 세포를 영상화하였다. (도 14C) 형광-활성화 세포 분류기(FACS; 아리아 세포 분류기(Aria cell sorter); eGFP에 대해 플루오레세인 아이소티오사이아네이트 필터(530/30㎚) 및 DsRed2에 대해 Pe-Texas 레드 필터(610/20㎚)를 이용하여 캘리포니아주 산 호세에 소재한 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에 의해 세포를 분류하였다. (도 14D 및 도 14E). 분리된 세포를 몇몇 계대 동안 배양시켰다(본래의 배율 x10).
도 15A 내지 도 15E는 eGFP+ 및 DsRed2+ 세포가 유사한 증식 속도 및 유사한 감염 능력으로 시험관내에서 증식한다는 것을 도시한 도면. 별개의 세포 집단을 대략 1개월 동안 별도로 배양시켰다. 각각의 그룹의 증식 속도를 분석하였고(도 15A) eGFP+(도 15B 및 도 15C) 및 DsRed2+(도 15D 및 도 15E) 세포를 Ad- CMV -β-gal(도 15B 및 도 15D)로 또는 Ad- CMV - Pdx -1(도 15C 및 도 15E)로 3일 동안 감염시켰다. 항-Pdx-1(청색)을 이용하는 면역형광 분석은 eGFP와 DsRed2 세포 둘 다의 거의 80%가 아데노바이러스에 의해 감염되었다는 것을 나타내었다.
도 16A 내지 도 16C는 eGFP+ 세포가 pTF-유도 전환분화에 대해 DsRed2+ 세포보다 더 효율적으로 반응한다는 것을 도시한 도면. 두 그룹을 가요성 인자 및 pTF:Ad-Pdx-1+Ad-Pax-4+ad-MafA 또는 대조군 바이러스(Ad-β-gal)로 6일 동안 유사하게 처리하였다. β-세포-유사 특징 및 기능을 분리된 그룹에서: (도 16A) 분자 수준으로 비교하였고, 인슐린 및 글루카곤 유전자 발현을 대조군 처리 세포에 비교한 정량적 실시간 PCR에 의해 연구하였다. 배양시킨 췌장 인간 섬 세포(3회 계대)를 양성 대조군으로서 사용하였다. (도 16B 및 도 16C) 기능적 수준에서, 글루코스-조절 인슐린 분비를 낮은 글루코스 농도, 다음에 높은 글루코스 농도(크렙스-링거 완충제(Krebs-Ringer buffer: KRB)에서 각각 2mM 및 17.5mM 글루코스)에서 정적 인큐베이션에 의해 분석하였다. 인슐린(도 16B) 및 C-펩타이드(도 16C) 분비를 인간 인슐린 방사면역측정법 키트(DPC; 3개의 상이한 실험으로부터 n≥8) 또는 인간 C-펩타이드 방사면역측정법 키트(3회의 상이한 실험으로부터 린코(Linco) n≥8를 이용하여 측정하였다. *스튜던츠 t-검정 분석을 이용하여, P<0.01으로 DsRed2+ 세포에 비교하였다.
도 17은 배양물 내 계대를 증가시킴에 따라 eGFP+ 집단 내 더 높은 전환분화 효율이 안정하다는 것을 도시한 도면. 두 그룹을 분류 후 별도로 증식시키고, 약간의 계대(분류 후 5 내지 7회 계대) 또는 더 많은 수의 계대(분류 후 10 내지 12회 계대) 후에 pTF(Ad-Pdx-1+Ad-Pax-4+Ad-MafA 및 가용성 인자)로 유사하게 처리하였다. 조절된 인슐린 분비를 저글루코스 농도 다음에 고글루코스 농도(각각 KRB 중에서 2mM 및 17.5mM 글루코스)에서 정적 인큐베이션에 의해 분석하였다. 인간 인슐린 방사면역측정법 키트(DPC; 2회의 상이한 실험으로부터 n≥6)를 이용하여 인슐린 분비를 측정한다. 세포 집단 둘 다에서 낮은 수의 계대와 높은 수의 계대 사이에 통계학적으로 유의한 차이가 검출되지 않았는데, 이는 eGFP 태그 세포의 지속적 경향이 β-세포 계통 및 기능을 따라서 전환분화를 유도하였다는 것을 시사한다.
도 18은 마이크로어레이 분석에 의해 수행하고 DAVID 생물정보학 자원(Bioinformatics Resources) 6.7에 따라 분석한 eGFP+ 및 DsRed2+ 세포의 차별적 유전자 발현 프로파일을 도시한 도면. 차별적 유전자의 4%는 Wnt 신호전달 경로에 속한다.
도 19는 활성 Wnt 신호전달이 간 내지 췌장 전환분화를 촉진시킨다는 것을 도시한 도면. 성인 인간 간 세포를 앞서 보고한 바와 같이 Ad- CMV - Pdx -1 및 가요성 인자로 처리하고 나서, Wnt3A(50ng/㎖ R&D 또는 DKK3(3㎍/㎖ R&D)로 보충하였다. 5일 후에, 인슐린 분비를 낮은 글루코스 농도 다음에 높은 글루코스 농도(각각 KRB에서 2mM 및 17.5mM 글루코스)에서 정적 인큐베이션에 의해 분석하였다. 인간 인슐린 방사면역측정법 키트(DPC; 3회의 상이한 실험으로부터 n≥8)를 이용하여 인슐린 분비를 측정하고 나서, 비처리 세포(대조군)에 비교하였다. 스튜던츠 t-검정 분석을 이용하여, *p<0.01로 Ad- CMV - Pdx - 1 단독과 비교하였다.
도 20은 Wnt 신호전달 경로의 차단이 eGFP+ 세포의 전환분화를 없앤다는 것을 도시한 도면. eGFP 세포는 5일 동안 DKK3(Dickkopf-관련 단백질 3)(0.5㎍/㎖ R&D)로 보충한 Ad- CMV - Pdx -1 또는 대조군 바이러스(Ad- CMV -β-gal)였다. 췌장 호르몬 유전자 발현을 대조군-처리 세포와 비교하여 정량적 실시간 RT-PCR에 의해 연구하였다.
도 21A 내지 도 21C는 eGFP + 세포가 DsRed2 + 세포보다 더 저수준의 APC 및 더 고수준의 활성 β-카테닌을 발현시킨다는 곳을 도시한 도면. (도 21A) APC 및 DKK1 발현은 DsRed2+ 세포에서 현저하게 증가된다. 이는 이들 세포가 eGFP+ 세포에 비해 더 고수준의 Wnt 신호전달 경로 리퍼레서를 발현시킨다는 것을 추가로 시사할 수 있다. 스튜던츠 t-검정 분석을 이용하여 DsRed2+에서의 2회의 상이한 실험으로부터 n≥6(*p<0.01)을 eGFP+ 세포에 비교하였다. (도 21B) eGFP 및 DsRed2 양성 세포 추출물에서 활성화된 β-카테닌(항-ABC 클론 8E7, 밀리포어(Millipore), 1:2000)에 대한 특정 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석. β-액틴(산타 크루즈에 소재한 SC-1616, 1:1000)을 정규화 단백질로서 사용하였다. (도 21C) ImageJ 1.29x 소프트웨어를 이용하여 β-카테닌 단백질 수준의 정규화를 수행하였다. 활성화된 β-액틴(SC-1616, 산타 크루즈, 1:1000)을 정규화 단백질로서 사용하였다.
도 22는 간충직 줄기 세포(MSC)를 나타내는 현미경이 아데노바이러스 감염의 여지가 있다는 것을 도시한 도면. Ad-GFP의 감염 다중도(moi)를 증가시킴으로써 MSC를 감염시켰다. 5일 후에, 형광 현미경에 의해 세포를 시각화하였다(배율 x4) Ad-CMV-GFP에 의해 감염시킨 MSC의 대표적인 위상 콘트라스트 형태(좌측 패널), 및 녹색 형광(좌측 패널). 간 세포가 보통 70 내지 80% 양성 세포를 제시할 때, Ad-GFP의 1000 MOI에 의한 MSC 세포의 감염은 약 20 내지 60% 양성 세포(세포주에 의존적)를 초래하였다.
도 23은 글루코스-조절 방식으로 인슐린을 분비하였다는 것을 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면. 세포를 전환분화를 겪는 그들의 능력에 대해 시험하였다. PDX1, NeuroD1 및 MafA로 세포를 감염시킴으로써 MSC 상에서 전환분화를 유도하였다. 실험의 제6일에, 세포는 인슐린 검출을 위한 분비 실험 및 RIA를 겪었다. 글루코스-조절 방식에서 인슐린 분비는 KRB 중에서 2mM 또는 17.5mM 글루코스와 함께 15분 동안 인큐베이션에 의해 측정하였다.
도 24A 내지 도 24B는 PAX4 대 NeuroD1의 효과를 비교하는 실험의 제6일에 나이브 및 GS 풍부 세포 집단의 조합된 인슐린 분비 측정을 제시하는 도면. 도 24A는 인슐린(나노그램)/백만개 세포/시간(ng/106/hr)로서 저농도(2mM) 및 고농도(17.mM)의 글루코스에 반응한 인슐린 분비의 막대 그래프를 제시한다. 도 24B는 인슐린(나노그램)/시간(ng/hr)으로서 저농도(2mM) 및 고농도(17.mM) 글루코스에 반응한 인슐린 분비의 막대 그래프를 제시한다.
도 25a 내지 도 24D는 PAX4 대 NeuroD1의 효과와 비교한 실험의 제6일에 나이브 및 농축 세포 집단의 개개 인슐린 분비 측정을 제시한 도면. 도 25a(GS 발현이 풍부) 및 도 25c(나이브)는 인슐린(나노그램)/백만개 세포/시간(ng/106/hr)으로서 저농도(2mM) 및 고농도(17.mM)의 글루코스에 반응한 인슐린 분비의 막대 그래프를 제시한다. 도 25b(GS 발현이 풍부) 및 도 25d(나이브)는 인슐린(나노그램)/시간(ng/hr)으로서 저농도(2mM) 및 고농도(17.mM)의 글루코스에 반응한 인슐린 분비의 막대 그래프를 제시한다.
도 26a 내지 도 26c는 2mM 글루코스(저농도) 또는 17.5mM 글루코스(고농도)와 함께 인큐베이션 후에 실험 제6일에 측정한 인슐린 분비를 도시한 도면. 결과를 인간 공여체로부터 얻은 1차 간 세포에 대해 인슐린(나노그램)/백만 개 세포/시간(ng INS/106/hr)으로서 제시한다(도 26a 무하마드, 도 26b 페드로, 및 도 26c 레온).
도 27은 인간 간-유래 세포 증폭 및 전임상 R&D 공정(세포 배양물 접시 공정) 및 임상 공정(엑스팬션(Xpansion) 생물반응기 공정)을 나타내는 전환분화 공정의 개략도를 도시한 도면.
도 28은 다중-트레이 셀 스택(Cell Stack: CS) 10개 플레이트로부터 XP-200 생물반응기까지의 인간 간-유래 1차 세포의 전형적인 종자 트레인 및 세포 확장 프로파일을 도시한 도면. 점선(녹색)은 환자 당 필요한 세포 수에 관한 표적을(당뇨병 세포-기반 자가 요법을 표적화) 나타내되, 나타낸 표적 수는 환자 당 10억개의 세포이다. PDL은 집단 배가 제한(Population Doubling Limit)을 나타낸다. CS는 세포 저장 다중트레이를 나타낸다.
도 29는 XP-50 및 XP-200 생물반응기에서 그리고 그들의 대조군 분류 다중-트레이 지지 상태(CTL XP50 및 CTL XP-200)에서 집단 배가 시간(PDT)(일)을 도시한 도면. 데이터는 채취한 세포 밀도에 기반한다. 각각의 막대의 수는 PDT를 나타낸다.
도 30은 pH(녹색), DO(청색) 및 온도(적색)에 대한 생물반응기 내 조절 경향(XP-50 및 XP-200)을 도시한 도면. 점선은 설정치를 나타내고, 피크는 상이한 작업(예를 들어, 배지 교환)을 위한 생물반응기 단절에 기인하였다.
도 31A 내지 도 31D는 제9일에 채취 전에 엑스팬션 생물반응기(도 31A 및 도 31B) 및 대조군 다중-트레이 시스템(도 31C 및 도 31D) 내에서 세포의 현미경 관찰을 도시한 도면. 도 31A 및 도 31C는 엑스팬션 50 생물반응기 실행으로부터의 세포를 나타내는 반면, 도 31B 및 도 31D는 엑스팬션 200 생물반응기 실행으로부터의 세포를 나타낸다.
도 32는 문헌[Cozar-Castellan and Stewart (2005) Proc Nat Acad Sci USA 102(22): 7781-7782]으로부터 적합화된 간 세포 기반 자가 세포 요법을 도시한 도면.
도 33은 전환분화 및 최종 품질 보증/품질 관리(QA/QC) 검사 전에 1,000배 확장을 겪은 성인 인간 1차 간 세포를 나타내는 제조 공정을 도시한 도면.
도 34는 자가 인슐린-생성(AIP) 세포 제조 공정의 검토를 도시한 도면. 단계들은 단계 1 - 간 조직을 얻는 단계(예를 들어, 간 생검); 단계 2 -1차 간 세포를 회수하기 위한 조직의 가공 단계; 단계 3 - 1차 간 세포를 사전 결정된 세포 수로 증식시키는 단계; 단계 4 - 1차 간 세포의 전환분화 단계; 단계 5 - 1차 전환분화된 간 세포의 채취 단계; 및 단계 6 - 품질 보증 및 품질 관리(즉, 안전성, 순도 및 효능)를 위해 전환분화된 세포를 시험하는 단계(즉, 안전성, 순도 및 효능)를 포함한다. 선택적 단계들은, 일 실시형태에서, 초기 계대가 계대 1인 초기 계대 1차 간 세포를 동결보존하는 단계; 이후의 날짜에 사용하기 위해 동결보존된 세포를 해동시키고, 이후의 날짜에 사용하기 위해 전환분화된 세포를 저장하는 단계를 포함한다.
도 35는 3회의 개개 실행 동안 제조한 세포로부터의 채취 시 세포 밀도의 가변성을 제시하되, 시작 밀도는 비슷하다는 것을 도시한 도면.
도 36A 및 도 36B는 전환분화된 인간 1차 간 세포의 집단으로부터 내인성 유전자 발현의 전형적인 결과를 나타내는 막대 그래프를 제시하며, 결과는 대조군 비처리(비-전환분화된) 세포에 비해 췌장 세포 마커(PDX-1, NeuroD1, MafA, 글루카곤, 및 소마토스타틴)의 내인성 증가를 나타내는 도면.
도 37은 AIP 세포 생성물 효능(ELISA에 의해 분석된 글루코스 조절된 인슐린 분비)에 대한 시험 결과를 도시한 도면.
도 38은 간세포로부터 시작해서 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 비췌장 세포로부터의 인간 인슐린 생성 세포의 생산을 위해 다중 시스템 생물반응기를 이용하는 프로토콜을 포함하는 3가지 상이한 "2+1" 전환분화 프로토콜을 나타내는 흐름도를 도시한 도면. 흐름도는 감염 후 파종 및 플레이팅 시 표적 세포 밀도뿐만 아니라 PDX-1 및 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 의한 감염을 포함하는 제1 감염, 및 MafA를 암호화하는 DNA를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 의한 감염을 포함하는 제2 감염을 나타낸다. 모두에서, 채취를 위한 파종은 약 8일에 일어난다.
도 39A 내지 도 39D는 비처리 대조군 세포의 영상화를 포함하는 제2 감염 시간에 제6일에 세포 밀도의 현미경 사진을 도시한 도면.
도 40A 내지 도 40B는 엑스팬션-10 다중-시스템 생물반응기의 플레이트 3(도 40A) 및 5(도 40B)로부터의 제2 감염 시 제6일에 세포 밀도의 현미경사진을 도시한 도면.
도 41A 내지 도 41D는 비처리 대조군 세포의 영상을 포함하는 최종 채취 시 제8일에 세포 밀도의 현미경 사진을 도시한 도면.
도 42A 내지 도 42B는 엑스팬션-10 다중-시스템 생물반응기의 플레이트 3(도 42A) 및 5(도 42B)로부터의 최종 채취 시 제8일에 세포 밀도의 현미경사진을 도시한 도면.
도 43은 "2+1" 프로토콜(도 38 참조)을 이용하여 생산된 세포에 대한 인슐린 함량 분석 결과를 나타내며, 생물반응기 시스템 내 전환분화가 실현 가능하지 않을 뿐만 아니라 인간 인슐린 생성 세포를 수득한다는 것을 나타내되, 세포는 대조군 비처리 세포에 비해 증가된 인슐린 함량을 가진다는 것을 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면.
도 44a 및 도 44b는 확장 및 전환분화된 간 세포의 유세포분석 결과를 도시한 도면. 도 44a는 살아있는 세포 상에서 개폐된 몇몇 간충직 줄기 세포(MSC) 마커의 대표적인 FACS 플롯을 나타낸다. 나타낸 마커는 CD90, CD73, CD105 및 CD44를 포함한다. 음성 칵테일은 조혈 마커를 포함한다. 도 44b는 상이한 세포 계대, P12(12번째 계대), P13(13번째 계대), P14(14번째 계대)에서, 그리고 감염 세포(P16_AdV 감염)에서 MSC 마커의 빈도를 나타낸다.
도 45a 내지 도 45C는 BP001 간 세포의 형질도입 효율을 도시한 도면. 도 45a 형광 현미경 사진, 도 45b FACS, 및 도 45C FACS 데이터의 개요.
도 46a 내지 도 46C는 TS001 간 세포의 형질도입 효율을 도시한 도면. 도 46a 형광 현미경사진, 도 46b FACS, 및 도 46C FACS 데이터의 요약.
도 47은 실시예 16의 표 2B에 열거한 eGFP+ 및 DsRed2+ 세포에서 세포-표면 분자의 상대적 발현 수준의 막대 그래프를 도시한 도면.
도 48a 내지 도 48c는 이미 존재하는 WNT/β-카테닌 신호가 세포에게 효율적인 전환분화의 경향을 갖게 한다는 것을 도시한 도면. WNT 신호전달은 전환분화 전 48시간 동안 Li에 의해 유도되었는데, 이어서, 이는 전환분화 프로토콜 내내 제거되거나(-제2일 Li) 또는 유지되었다(-제2일로부터 Li). 17.5mM 글루코스 자극에 반응하여 ELISA에 의해 인슐린 분비를 측정하였다. 도 48a 막대 그래프는 리튬의 전처리가 없는(좌) 그리고 전환분화 전 48시간에 리튬의 전처리가 있는, 전환분화 후 인슐린의 배수 증가를 나타낸다. (도 48b 및 도 48c). 췌장 유전자 Nkx6.1, Isl-1 및 인간 PDX1의 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였고, 액틴에 대해 정규화시켰다. 결과는 두 공여체를 대표한다.
예시의 단순함 및 명확함을 위해, 도면에 나타낸 구성요소가 반드시 일정한 비율로 도시되어야 하는 것이 아님이 인식될 것이다. 예를 들어, 일부 구성요소의 치수는 명확함을 위해 다른 구성요소에 비해 과장될 수 있다.
다음의 상세한 설명에서, 수많은 구체적인 상세한 설명은 췌장 세포 표현형 및 기능을 갖는 비-췌장 전환분화된 인간 인슐린 생성 세포, 및 이의 제조 방법의 철저한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 다른 예에서, 잘 공지된 방법, 절차 및 성분은 췌장 세포 표현형 및 기능을 갖는 비-췌장 전환분화된 인간 인슐린 생성 세포 및 이의 생산 방법을 모호하게 하지 않기 위하여 상세하게 기재되지 않았다. 본 출원은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 2014년 12월 30일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/098,050호의 유익을 주장한다.
전사 인자(전사 인자: TF)는 수많은 세포 계통에서 전환분화를 유도하는 것으로 나타났다. 당업자는 용어 "전환분화"가 제1 세포 유형이 특징을 동정하는 단계를 잃고, 세포가 배아 특징을 갖는 단계를 통하는 일 없이 제2 세포 유형의 표현형으로 그의 표현형을 변화시키는 과정을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 세포 및 제2 세포는 상이한 조직 또는 세포 계통으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 전환분화는 성숙 또는 분화된 세포를 상이한 성숙 또는 분화된 세포로 전환하는 단계를 수반한다. 구체적으로, 계통-특이적 전사 인자(TF)는 성체 세포를 내분비 췌장 세포, 뉴런, 조혈세포 및 심근세포 계통으로 전환하는 유익한 역할을 나타내는 것을 시사하였는데, 이는 전환분화 과정이 넓은 범위의 환경에서 생긴다는 것을 시사한다. 모든 전환분화 프로토콜에서, 이소성 TF는 잠재적인 넓고, 기능성이며, 비가역적인 발생 과정에 대한 단기간 촉발자로서 작용한다. 수많은 연구는 개개 TF의 이소성 발현이 추가적인 적절한 다른 침묵 TF의 활성화와 함께 수반된 공정에서 목적으로 하는 대안의 레퍼토리 및 기능을 활성화한다는 것을 시사하였다. 그러나, 유도된 TF의 시간 과정, 상대적 수준 및 층위 또는 순서는 알려지지 않고 남아있다.
개개 이소성 TF를 도입하는 것에 의한 내인성 전사 인자(TF) 유도의 상대적 불충분을 이용함으로써, 본 명세서에서 TF의 층위 네트워크에 의해 영향받는 순차적 및 일시적으로 제한된 공정으로서 전환분화 방법이 개시된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 인슐린 생성 세포 제품, 및 이 생성물의 제조 및 생산 방법은 TF-유도 간의 췌장으로의 전환분화가 점진적이고 연속적인 공정이라는 발견에 기반한다. 중요하게는, 췌장 TF의 순차적 투여만이(그들의 협력된 발현은 아님) 내분비 췌장 내의 계통 사양 프로그램을 선택적으로 구동한다. 직접적 층위 방식에서 췌장 TF의 순차적 발현은 β-세포 계통을 따라 전환분화된 세포 성숙에 대해 필연적이 되는 것으로 나타났다. 구체적으로, 췌장 β-세포 특이적 전사 인자 MafA에 대한 역할은 전환분화 공정의 최종 단계에서 동정되었다. 이 단계에서, MafA는 Isl1 및 소마토스타틴 억제와 관련된 공정에서 β-세포 계통을 따라 전환분화된 간 세포의 성숙을 촉진시킨다. 놀랍게도, 2+1 층위 방법(PDX-1 및 Pax4 또는 NeuroD1, 다음에 MafA)은 비췌장 세포 내에서 췌장 표현형 및 기능에 대해 계통 사양을 선택적으로 구동하는 데 성공적이었다는 것을 발견하였다.
본 명세서에 기재된 방법은 당뇨병을 포함하는 퇴행성 질환을 치료하기 위해 TF-유도 성체 세포 재프로그래밍의 치료적 장점을 증가시키는 데 기여할 수 있는 전사 인자-매개 전환분화의 근본적인 일시적 특징을 시사한다.
췌장 전사 인자(pTF), 예컨대 Pdx-1, NeuroD1, Ngn-3 및 Pax4는 간의 췌장으로의 전환분화를 활성화시키며, 당뇨병 마우스에서 고혈당증의 개선을 개개로 유도한다. 게다가, 성인 인간 간 세포의 시험관내 실험 시스템을 이용하여, Pdx-1은 수많은 β-세포 특이적 마커의 발현을 활성화시키고, 가공된 인슐린의 글루코스-조절 분비를 유도한다는 것을 입증하였다. 유도된 공정은 수많은 중요한 내인성 pTF의 발현과 관련되었고, 고혈당증의 개선은 당뇨병 마우스에서 전환분화된 성인 인간 간 세포의 이식 시 입증되었다. 그러나, 수많은 다른 연구는 몇몇 중요한 TF의 조합을 이용하는 것이 개개 TF의 이소성 발현에 의해 유도된 것에 비해 재프로그래밍 효율을 현저하게 증가시킨다는 것을 나타내었다. 이는 내인성 보완 TF를 효율적인 전환분화 공정을 위해 필요한 충분한 수준으로 활성화시키기 위한 개개 이소성 인자의 잠재적인 제한된 능력을 시사한다. 췌장 기관형성 동안 췌장 전사 인자의 표적화된 파괴 또는 일시적 오발현(mis-expression)은 췌장 발생뿐만 아니라 섬 세포 분화 및 기능을 방해한다. 개개 이소성 TF에 의한 내인성 TF 유도의 상대적 불충분을 이용함으로써, 본 명세서에 제시된 개시내용은 TF의 층위 네트워크에 의해 영향받는 순차적 및 일시적으로 제어된 공정으로서 전환분화와 관련된다.
췌장 사양은 또한 성인에서 β-세포 기능에 필요한 호메오박스 전사 인자 Pdx1에 의해 개시된다. 이어서, 내분비 분화는 기본적 나선-루프-나선 인자 Ngn3에 의해 매개된다. 쌍별 호메오박스 인자 Pax4 및 Arx는 상이한 내분비 세포 유형의 분리에서 중요한 인자와 연루되었다. β-세포 계통 및 기능에 따른 최종 성숙은 성인 췌장 내 β-세포에서 MafA의 선택적 발현에 기여한다.
본 명세서에서 인간 간 세포가 완전히 상이한 세포 유형, 즉, 베타 세포를 포함하는 췌장 호르몬 생성 세포를 생성하기 위해 직접적으로 전환분화될 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기반한 방법 및 이들 방법을 이용하여 생성된 인간 인슐린 생성 세포가 개시된다. 일시적으로 조절된 서열에서 선택 적사 인자의 적용은 성체 간 세포의 기능성 성숙 베타 세포로의 전환분화를 유도하였다. 본 명세서에 기재된 방법은 성체 세포를 확장 및 전환분화시키기 위한 방법을 제공함으로써, 인슐린-생성 세포 또는 췌장 베타 세포의 거대 집단을 생성하는 문제를 해결한다. 선택 전사 인자 또는 전환분화된 췌장 세포의 생성 집단을 포함하는 조성물은 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 췌장 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
비-췌장 세포를 췌장 세포, 예컨대 베타 세포를 전환분화하기 위한 이전의 노력은 단지 하나의 전사 인자 또는 한 가지 초과의 췌장 전사 인자의 협력 또는 동시 투여를 이용한다. 본 명세서에 개시된 방법은 정해진 시점에 구체적 전사 인자의 정돈된, 순차적 투여를 제공한다. 본 명세서에 개시된 대안의 방법은 정해진 시점에 특정 전사 인자의 "2 pTF + 1 pTF"(2+1) 조합 및 정돈, 순차적 투여를 제공한다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 방법은 각각의 개개 전사 인자 단독에 의해 유도되는 것에 비해 전환분화 효율을 실질적으로 증가시킨다.
본 명세서에서 증가된 전환분화 능력을 갖는 세포 집단이 개시된다. 이들 세포는 (1) 잠재적 세포막 마커, (2) 글루타민 합성효소 조절 요소(GSRE)를 활성화시키는 능력의 소유, 및 (3) 활성 Wnt-신호전달을 독특하게 구비하는 것을 특징으로 한다. 집단 내 세포의 적어도 30%는 GSRE를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 세포는 내피 세포, 상피 세포, 간충직 세포, 섬유아세포, 또는 간 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 췌장 계통을 따라서 췌장 기능을 지니는 성숙 췌장 세포로 전환분화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 중성 계통을 따라서 중성 세포로 전환분화될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 이전의 전환분화, 또는 종종 제한된 효율을 갖는 재프로그래밍 프로토콜 문제를 해결하는 방법이 개시된다. 예를 들어, 중요한 췌장 전사 인자의 이소성 발현은 각각의 숙주 세포에서 발현을 초래하지만, 세포 중 15%까지만이 췌장 기능을 나타내기 위해 성공적으로 전환분화된다.
추가로, 본 명세서에서 풍부한 또는 증가된 전환분화 능력을 지니는 세포 집단을 단리하기 위한 방법이 개시된다. 예를 들어, 이들 세포를 단리하기 위한 한 가지 방법은 글루타민 합성효소 조절 요소, 또는 이들의 단편에 작동 가능하게 연결된 GFP 발현을 활성화시키는 세포를 분류하는 것에 의하며, 이에 의해 GSRE를 활성화시킬 수 있는 해당 세포를 단리시킨다. 세포는 FACS에 의해 분류될 수 있고, 풍부한 전환분화 능력을 지니는 세포의 빠른 확장을 위해, 세포의 나머지와 별개로 배양물 중에서 증식될 수 있다. 전환분화를 위한 풍부한 능력을 지니는 세포 집단은 생체내 조직을 구성하는 세포의 소집단뿐이다. 예를 들어, 주어진 조직 또는 세포 집단에서, 전환분화를 위한 풍부한 능력을 지니는 세포의 집단은 주어진 조직 내 전체 세포 집단의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 약 10%, 약 15% 미만뿐이다. 따라서, 증가된 전환분화를 갖지 않는 세포로부터 증가된 전환분화 능력을 지니는 상기 세포의 단리를 위한 방법이 본 명세서에 개시된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 농축 비-췌장 β-세포는 다양한 질환 또는 장애의 처리를 위해 전환분화된 세포를 제공하도록 전환분화 효율을 증가시키는 전환분화 능력이 증가된 세포 비율이 더 큰 세포 집단의 이점을 가진다.
다양한 변화 및 변형이 세포 생성물을 생성하는 비-췌장 β-세포 전환분화 인간 인슐린 및 상기 생성물의 제조 방법의 정신과 범주 내에서 본 명세서에 기재된 방법으로 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.
췌장 베타-세포의 생산 방법
본 명세서에서 특정 시점에 포유류 비-췌장 세포를 췌장 전사 인자, 예컨대 PDX-1, Pax-4, NeuroD1 및 MafA와 접촉시킴으로써 성숙 췌장 베타 세포 표현형을 나타내는 세포를 생성하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 Pax-4와 접촉시키는 단계; 및 제3 시간 기간에 제2 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 NeuroD1과 접촉시키는 단계; 및 제3 시간 기간에 제2 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1 및 제2 전사 인자와 접촉시키는 단계 및 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한 추가 실시형태에서, 제2 전사 인자는 NeuroD1 및 Pax4로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, PDX-1과 함께 제공된 전사 인자는 Pax-4, NeuroD1, Ngn3 또는 Sox-9를 포함한다. 다른 실시형태에서, PDX-1과 함께 제공된 전사 인자는 Pax-4를 포함한다. 다른 실시형태에서, PDX-1과 함께 제공된 전사 인자는 NeuroD1을 포함한다. 다른 실시형태에서, PDX-1과 함께 제공된 전사 인자는 Ngn3을 포함한다. 다른 실시형태에서, PDX-1과 함께 제공된 전사 인자는 Sox-9를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1와 접촉시키는 단계; 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 Ngn3과 접촉시키는 단계; 및 제3 시간 기간에 제2 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1과 접촉시키는 단계; 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 Sox9와 접촉시키는 단계; 및 제3 시간 기간에 제2 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1 및 제2 전사 인자와 접촉시키는 단계 및 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함하되, 제2 전사 인자는 NeuroD1, Ngn3, Sox9, 및 Pax4로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1 및 NeuroD1과 접촉시키는 단계, 및 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1 및 Pax4와 접촉시키는 단계, 및 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1 및 Ngn3과 접촉시키는 단계, 및 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 제1 시간 기간에 포유류 비-췌장 세포를 PDX-1 및 Sox9와 접촉시키는 단계, 및 제2 시간 기간에 제1 단계로부터의 세포를 MafA와 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포는 동시에 모두 3종의 인자(PDX-1; NeuroD1 또는 Pax4 또는 Ngn3; 및 MafA)와 접촉되지만, 그들의 발현 수준은 PDX-1에 대해 제1 시간 기간에, NeuroD1 또는 Pax4 또는 Ngn3에 대해 제2 시간 기간에; 및 MafA에 대해 제3 기간에 그들을 세포 내에서 발현시키는 방법으로 제어된다. 발현의 제어는 유전자가 순차적으로, mRNA 수준을 변형함으로써, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 발현되도록 각각의 유전자에 대해 적절한 프로모터를 이용함으로써 달성될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 상기 방법은 추가로 임의의 상기 단계에서, 전에 또는 후에 세포를 전사 인자 Sox-9와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 시간 기간 및 제2 시간 기간은 제1 시간 기간에 세포 집단을 2개의 pTF와 접촉시키는 단계(적어도 하나의 pTF는 pDX-1을 포함함), 다음에 제2 시간 기간에 얻어진 세포 집단을 제3 pTF와 접촉시키는 단계(상기 제3 pTF는 MafA임)의 결과와 동일하다.
일 실시형태에서, 제2 시간 기간은 제1 시간 기간 후에 적어도 24시간이다. 대안의 실시형태에서, 제2 시간 기간은 제1 시간 기간 후 24시간 미만이다. 다른 실시형태에서, 제2 시간 기간은 제1 시간 기간 후 약 1시간, 제1 시간 기간 후에 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 또는 약 12시간이다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 기간은 제1 시간 기간 후에 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 및 적어도 1주 이상일 수 있다.
다른 실시형태에서, 제3 시간 기간은 제2 시간 기간 후에 적어도 24시간이다. 대안의 실시형태에서, 제3 시간 기간은 제2 시간 기간 후 24시간 미만이다. 다른 실시형태에서, 제3 시간 기간은 제2 시간 기간과 동시이다. 다른 실시형태에서, 제3 시간 기간은 제2 시간 기간 후 약 1시간, 제2 시간 기간 후 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 또는 약 12시간이다. 다른 실시형태에서, 제3 시간 기간은 제2 시간 기간 후 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 및 적어도 1주 이상일 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 시간 기간, 제2 시간 기간 및 제3 시간 기간은 단일 시간 기간에 세포 집단을 3개의 pTF와 접촉시키는 것과 동시에 일어나되, 적어도 하나의 pTF는 pDX-1을 포함하고, 적어도 하나의 pTF는 NeuroD1 또는 Pax4를 포함하며, 적어도 하나의 pTF는 MafA를 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1 시간 기간, 제2 시간 기간 및 제3 시간 기간은 단일 시간 기간에 세포 집단을 3개의 pTF와 접촉시키는 것과 동시에 일어나되, 하나의 pTF는 pDX-1로 이루어지고, 하나의 pTF는 NeuroD1 또는 Pax4로 이루어지며, 하나의 pTF는 MafA로 이루어진다.
일 실시형태에서, 전사 인자는 폴리펩타이드, 또는 전사 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 리보핵산 또는 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 전사 인자는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전사 인자는 전사 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 전사 인자는 전사 인자를 암호화하는 데옥시리보핵산 서열(DNA)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, DNA는 cDNA를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전사 인자는 전사 인자를 암호화하는 리보핵산 서열(RNA)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNA는 mRNA를 포함한다.
본 명세서에 제시된 개시내용에서 사용하기 위한 전사 인자는 폴리펩타이드, 리보핵산 또는 핵산일 수 있다. 당업자는 용어 "핵산"이 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA, 마이크로RNA 또는 다른 RNA 유도체), 뉴클레오타이드 유사체, 및 이의 유도체, 단편 및 상동체를 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 다른 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다. mRNA는 본 명세서에 개시된 방법에서 특히 유리한데, PDX-1의 일시적 발현이 췌장 베타 세포를 생성하는 데 충분하기 때문이다. 폴리펩타이드, 리보핵산 또는 핵산은 바이러스 벡터에 의한 감염, 전기천공법 및 리포펙션을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 수단에 의해 세포에 전달될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위한 전사 인자는 PDX-1, Pax-4, NeuroD1 및 MafA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위한 전사 인자는 PDX-1, Pax-4, NeuroD1, MafA, Ngn3 및 Sox9로 이루어진 군으로부터 선택된다.
IDX-1, IPF-1, STF-1 또는 IUF-1로서도 알려진 호모도메인 단백질 PDX-1(췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1)은 췌장섬 발생 및 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. PDX-1은 다양한 유전자, 예를 들어 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 프로인슐린 전환효소 1/3(PC1/3), GLUT-2 및 글로코키나제의 섬-세포-특이적 발현에 직접적으로 또는 간접적으로 연루된다. 추가적으로, PDX-1은 글루코스에 반응하여 인슐린 유전자 전사를 매개한다. PDX-1을 암호화하는 핵산의 적합한 공급원은, 예를 들어 각각 젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 U35632 및 AAA88820로서 입수 가능한 인간 PDX-1 핵산(및 암호화된 단백질 서열)을 포함한다. 일 실시형태에서, PDX-1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시된다:
Figure pct00001
일 실시형태에서, PDX-1 폴리펩타이드의 핵산 서열은 서열번호 5에 제시된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
PDX-1에 대한 서열의 다른 공급원은 각각 젠뱅크 수탁 번호 U35632 및 AAA18355에 나타낸 바와 같은 래트 PDX 핵산 및 단백질 서열을 포함하며, 본 명세서에 그들 전체가 참고로 포함된다. 추가적인 공급원은 제브라피시 PDX-1 핵산을 포함하고, 단백질 서열은 각각 젠뱅크 수탁 번호 AF036325 및 AAC41260에 나타내며, 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.
Pax-4(또한 짝지어진 박스 4, 짝지어진 박스 단백질 4, 짝지어진 박스 유전자 4로서 알려짐), MODY9 및 KPD는 글루카곤, 인슐린 및 소마토스타틴 프로모터 내의 요소에 결합하는 췌장-특이적 전사 인자이고, 췌장 섬 베타 세포의 분화 및 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 일부 세포 내용에서, Pax-4는 리프레서 활성을 나타낸다. Pax-4를 암호화하는 핵산의 적합한 공급원은, 예를 들어 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM_006193.2 및 AAD02289.1로서 입수 가능한 인간 Pax-4 핵산(및 암호화된 단백질 서열)을 포함한다.
V-maf 근육널힘줄섬유종증 암유전자 상동체 A 또는 RIPE3B1로서도 알려진 MafA는 인슐린 유전자 발현을 위한 베타-세포-특이적 및 글루코스-조절 전사 활성체이다. MafA는 베타 세포의 기능 및 발생에서 뿐만 아니라 당뇨병의 병리에 연루될 수 있다. MafA를 암호화하는 핵산의 적합한 공급원은, 예를 들어 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM_201589.3 및 NP_963883.2로서 입수 가능한 인간 MafA 핵산(및 암호화된 단백질 서열)을 포함한다. 일 실시형태에서, MafA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시된다:
Figure pct00004
Figure pct00005
다른 실시형태에서, MafA 폴리펩타이드의 핵산 서열은 서열번호 9에서 제시된다:
Figure pct00006
Neurog3(뉴로제닌 3 또는 Ngn3으로서도 알려짐)은 췌장 및 장에서 내분비 발생에 필요한 기본적 나선-루프-나선(bHLH) 전사 인자이다. Neurog3을 암호화하는 핵산의 적합한 공급원은, 예를 들어 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM_020999.3 및 NP_066279.2로서 입수 가능한 인간 Neurog3 핵산(및 암호화된 단백질 서열)을 포함한다.
NeuroD1(Neuro 분화 1 또는 NeuroD, 및 베타-2(β2)로서도 알려짐)은 Neuro D-형 전사 인자이다. 다른 bHLH 단백질과 이형이량체를 형성하고 E-박스로서 알려진 특정 DNA 서열을 함유하는 유전자의 전사를 활성화시키는 기본적 나선-루프-나선 전사 인자이다. 이는 인슐린 유전자의 발현을 조절하며, 이 유전자의 돌연변이는 II형 진성 당뇨병을 초래한다. NeuroD1을 암호화하는 핵산의 적합한 공급원은, 예를 들어 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM_002500.4 및 NP_002491.2로서 입수 가능한 인간 NeuroD1 핵산(및 암호화된 단백질 서열)을 포함한다.
일 실시형태에서, NeuroD1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시된다:
Figure pct00007
다른 실시형태에서, NeuroD1 폴리펩타이드의 핵산 서열은 서열번호 7에 제시된다.
Figure pct00008
Sox9는 배아 발생에 연루된 전사 인자이다. Sox9는 뼈 및 골격 발생에서의 그의 중요성에 대해 특히 연구되었다. SOX-9는 HMG-박스 부류 DNA-결합 단백질의 다른 구성원과 마찬가지로 서열 CCTTGAG를 인식한다. 본 명세서에 제시된 개시내용과 관련하여, Sox9의 용도는 전환분화 유도 전에 또는 후에 췌장 전구 세포 덩어리를 유지하는 데 연루될 수 있다. Sox9를 암호화하는 핵산의 적합한 공급원은, 예를 들어 각각 젠뱅크 수탁 번호 NM_000346.3 및 NP_000337.1로서 입수 가능한 인간 Sox9 핵산(및 암호화된 단백질 서열)을 포함한다.
상동체는, 일 실시형태에서, 당업계에 잘 기재된 방법에 의해 서열 정렬을 위한 컴퓨터 알고리즘에 의해 결정된다. 예를 들어, 핵산 서열 상동체의 컴퓨터 알고리즘 분석은, 예를 들어, BLAST, DOMAIN, BEAUTY(BLAST 향상 정렬 유틸리티(BLAST Enhanced Alignment Utility)), GENPEPT 및 TREMBL 패키지와 같이 입수 가능한 다수의 소프트웨어 패키지의 이용을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, "상동체"는 서열번호 4 내지 9로부터 선택된 서열에 대해 60% 초과의 동일성을 지칭한다. 다른 실시형태에서, "상동체"는 서열번호 1 내지 76으로부터 선택된 서열에 대해 70% 초과의 동일성을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 동일성은 75% 초과, 78% 초과, 80% 초과, 82% 초과, 83% 초과, 85% 초과, 87% 초과, 88% 초과, 90% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과이다. 다른 실시형태에서, 동일성은 100%이다. 각각의 가능성은 본 명세서에 제시된 개시내용의 별개의 실시형태를 나타낸다.
다른 실시형태에서, 상동체는 후보 서열 혼성화의 결정을 통해 결정되고, 이의 방법은 당업계에 잘 기재되어 있다(예를 들어, 문헌["Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y] 참조). 예를 들어 혼성화 방법은 천연 카스파제 펩타이드를 암호화하는 DNA의 상보체에 대해 보통 내지 엄격한 조건 하에서 수행될 수 있다. 혼성화 조건은, 예를 들어, 10 내지 20% 폼아마이드, 5 X SSC(150mM NaCl, 15mM 시트르산삼나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 X 덴하르트 용액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/㎖ 변성, 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 밤새 42℃에서 인큐베이션이다.
본 명세서에 열거된 임의의 아미노산 서열에 대한 단백질 및/또는 펩타이드 상동체는, 일 실시형태에서 면역블롯 분석을 포함하는 당업계에 잘 기재된 방법에 의해 또는 아미노산 서열의 컴퓨터 알고리즘 분석을 통해, 이용 가능한 임의의 다수의 소프트웨어 패키지를 이용하여, 확립된 방법을 통해 결정된다. 일부 이들 패키지는, 예를 들어 FASTA, BLAST, MPsrch 또는 Scanps 패키지를 포함할 수 있고, 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman) 알고리즘 및/또는 전역/국부 또는 분석을 위한 블록스(BLOCKS) 정렬의 사용을 이용할 수 있다. 상동체를 결정하는 것의 각각의 방법은 본 명세서에 제시된 개시내용의 별개의 실시형태를 나타낸다.
세포는 췌장 호르몬, 예를 들어, 골수 근육, 비장, 신장, 혈액, 피부, 췌장 또는 간을 생성할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 비-췌장 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 비-췌장 β-세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 췌장섬으로서 기능할 수 있고, 즉, 췌장 호르몬을 저장, 처리 및 분비할 수 있다. 다른 실시형태에서, 분비는 글루코스 조절된다.
다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.001pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.002pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.003pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.005pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.007pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.01pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.1pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.5pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 1pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 5pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 10pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 50pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 100pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 500pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 1ng 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 5ng 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 10ng 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 50ng 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 100ng 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 500ng 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 1㎍ 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 5㎍ 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 10㎍ 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 50㎍ 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다. 다른 실시형태에서, 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 100㎍ 인슐린/106개 세포/시간을 포함한다.
다른 실시형태에서, 췌장 호르몬은 세포외 촉발자 상에 분비될 수 있는 인슐린을 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포는 간세포이다. 추가적인 실시형태에서, 세포는 분화전능성 또는 다능성이다. 대안의 실시형태에서, 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 바람직하게는 간 줄기 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 집단의 공급원은 인간 공급원이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 집단의 공급원은 인슐린 요법이 필요한 대상체에 대한 자가 인간 공급원이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 집단의 공급원은 인슐린 요법이 필요한 대상체에 대한 동종이계 인간 공급원이다.
특정 실시형태에서, 세포는 간충직 스트로마 세포, (MSC) 예컨대, 간 조직, 지방조직, 골수, 피부, 태반, 탯줄, 바르톤 젤리 또는 제대혈로부터 유래된 MSC로서도 알려진 간충직 줄기 세포이다. "탯줄 혈액" 또는 "제대혈"은 신생아 또는 태아, 가장 바람직하게는 신생아로부터 얻은 혈액을 지칭하는 것을 의미하며, 바람직하게는 신생아의 탯줄 또는 태반으로부터 얻은 혈액을 지칭한다. 이들 세포는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있다. MSC는 CD105, CD73 및 CD90을 포함하는 특정 세포 표면 마커의 발현 및 조골세포, 지방세포 및 연골아세포를 포함하는 다중 계통으로 분화하는 능력에 의해 정해진다. MSC는 통상적인 단리 기법, 예컨대 플라스틱 접착, 단클론성 항체, 예컨대 STRO-1을 이용하거나 또는 상피-간충직 전이(EMT)를 겪은 상피를 통한 분리에 의해 조직으로부터 얻을 수 있다.
당업자는 용어 "지방조직-유래 간충직 줄기 세포"가 지방조직으로부터 단리된 비분화 성인 줄기 세포를 포함할 수 있고, 또한 동일한 양 및 의미를 갖는 용어 "지방 줄기 세포"일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 세포는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있다.
당업자는 용어 "태반-유래 간충직 줄기 세포"가 태반으로부터 단리된 비분화 성인 줄기 세포를 포함할 수 있고, 모두 동일한 의미 및 품질을 갖는 "태반 줄기 세포"로서 본 명세서에서 지칭될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
화합물에 노출되는, 즉, 접촉되는 세포 집단(즉, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드 또는 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)은 다수의 세포, 즉, 하나 이상의 세포일 수 있고, 시험관내, 생체내 또는 생체밖에서 제공될 수 있다. 전사 인자와 접촉되는 세포 집단은 전사 인자와 접촉되기 전에 시험관내에서 확장될 수 있다. 생산된 세포 집단은 성숙 췌장 베타 세포 표현형을 나타낸다. 이들 세포는 β-세포 계통을 따라서 전환분화 및 성숙 전에, 그리고 이들이 필요한 환자 또는 대상체에 대한 투여 또는 전달 전에 당업계에 공지된 방법에 의해 시험관내에서 확장될 수 있다.
대상체는, 일 실시형태에서, 포유류이다. 포유류는, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있다.
일부 실시형태에서, 전사 인자는 폴리펩타이드, 예컨대 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9, 또는 이들의 조합이고, 당업계에 공지된 방법에 의해 세포에 전달된다. 예를 들어, 전사 인자 폴리펩타이드는 세포에 직접적으로 제공되거나 또는 마이크로입자 또는 나노입자, 예를 들어 리포좀 담체를 통해 전달된다.
일부 실시형태에서, 전사 인자는 핵산이다. 예를 들어, 핵산은 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 폴리펩타이드를 암호화한다. 전사 인자를 암호화하는 핵산, 또는 이러한 핵산의 조합은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 세포에 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 발현 벡터 또는 바이러스 벡터에 혼입된다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 다른 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 제1 세대 아데노바이러스(FGAD) 벡터이다. 다른 실시형태에서, FGAD는 세포 게놈 내로 통합될 수 없다. 다른 실시형태에서, FGAD는 E1-결실 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 다른 실시형태에서, FGAD는 암호화된 폴리펩타이드의 일시적 발현을 제공한다.
발현 또는 바이러스 벡터는 다음 중 임의의 것에 의해 세포에 도입될 수 있다: 형질감염, 전기천공법, 감염 또는 형질도입. 다른 실시형태에서, 핵산은 mRNA이고, 이는, 예를 들어 전기천공법에 의해 전달된다. 일 실시형태에서, 전기천공법 방법은 유동 전기천공법 기법을 포함한다. 예를 들어, 다른 실시형태에서, 전기천공법의 방법은 MaxCyte 전기천공법 시스템(미국 조지아주 MaxCyte Inc.)의 사용을 포함한다.
특정 실시형태에서, 인간 인슐린 생성 세포의 제조된 집단은 간 표현형 마커의 감소를 포함한다. 일 실시형태에서, 알부민, 알파-1 항-트립신, 또는 이들의 조합물의 발현 감소가 있다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1을 발현시키는 세포 집단의 5% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시킨다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1을 발현시키는 세포 집단의 10%, 9%, 8 %, 7%, 6%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시킨다.
전환분화의 경향이 있는 세포 집단
본 명세서에 제공된 개시내용은 전환분화의 경향이 있는 간 유래 세포 집단을 제공한다. 세포 집단은 본 명세서에 기재된 췌장 베타 세포를 생성하는 방법에서 유용할 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시내용의 전환분화의 경향이 있는 세포는 또한 증가 또는 농축된 전환분화 능력을 갖는 것으로 지칭될 수 있다. "증가된 전환분화 능력"은 본 명세서에 제공된 개시내용의 세포 집단에 분화 프로토콜(즉, 췌장 전사 인자의 도입)이 실시될 때, 세포의 15% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과가 대안의 세포 유형으로 분화할 수 있다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 증가된 전환분화 능력을 지니는 내피 세포, 상피 세포, 간충직 세포, 섬유아세포 또는 간 세포의 집단은 성숙 췌장 세포 또는 성숙 중성 세포로 분화될 수 있다(전환 분화).
다른 실시형태에서, 전환분화의 경향이 있는 세포 집단은 글루타민 합성효소 반응 요소(GSRE)를 활성화시키는 능력을 가진다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 개시내용의 세포 집단에서, 집단 내 세포의 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 GSRE를 활성화시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 집단 내 세포의 적어도 30%는 GSRE를 활성화시킬 수 있다. 글루타민 합성효소는 뇌, 신장 및 간에서 대부분 발현되는 효소이고, 글루타민을 형성하기 위해 글루탐산염 및 암모니아의 축합을 촉매함으로써 질소의 대사에서 필수적인 역할을 한다. 글루타민 합성효소는, 예를 들어, 주심 간 세포 및 뇌의 성상교세포에서 독특하게 발현된다. 본 명세서에 제시된 데이터는 GSRE의 활성화를 입증하는 세포가 전환분화의 경향을 갖는 세포의 단리를 위한 독특한 선택적 매개변수를 제공한다는 것을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 세포의 경향이 있는 집단은 주심 간 세포를 포함한다.
GSRE의 활성화는 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 아데노바이러스는 프로모터 및 리포터 유전자, 예컨대 형광 단백질에 작동 가능하게 연결된 글루타민 합성효소 반응 요소를 함유하는 재조합 아데노바이러스가 생성될 수 있다. GSRE-리포터를 지니는 이 재조합 아데노바이러스는 전환분화의 경향이 있는 일부 비율의 세포를 함유하는 세포의 이질적 혼합물 내로 도입될 수 있다. GSRE의 활성화에 적격인 해당 세포는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있는 리포터 유전자를 발현시킴으로써, 전환분화의 경향이 있는 세포를 동정할 것이다.
전환분화의 경향이 있는 해당 세포가 알려져 있지 않은 세포의 이질적 집단은 최소 TK 프로모터 및 eGFP에 작동 가능하게 연결된 GSRE를 함유하는 아데노바이러스 벡터와 접촉될 수 있다. GSRE를 활성화시키는 세포는 GFP를 발현시키며, GFP 발현을 검출하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 전환분화의 경향이 없는 세포로부터의 전환분화의 경향이 있는 GSRE-활성화된 세포의 분리는 FAC 장치, 분류기 및 당업자에게 공지된 기법을 통해 달성될 수 있다(도 14). 이어서, 전환분화의 경향이 있는 분리된 세포는 시험관내에서 증식 또는 확장될 수 있다. 본 명세서에 기재된 결과는 5 내지 12회 계대 또는 그 이상 동안 전환분화의 경향이 있는 세포의 계대가 그들의 전환분화 능력을 보유한다는 것을 입증한다. 예를 들어, 전환분화의 경향이 있는 단리된 간 세포는 배양물에서 12회 계대 후조차 글루코스-의존적 방식으로 인슐린을 계속해서 생성 및 분비한다(도 17).
다른 실시형태에서, 전환분화의 경향이 있는 세포 집단은 또한 활성 Wnt 신호전달 경로를 가진다. Wnt 신호전달 경로는 발생 동안 줄기 세포 다능성 및 세포 운명뿐만 아니라 체축 패터닝, 세포 증식, 및 세포 이동에서 중요한 역할을 한다. Wnt 신호전달 경로는 프리즐드(Frizzled: Fz) 패밀리 수용체(G-결합된 단백질 수용체)에 대한 Wnt-단백질의 결합, 선택적으로 공동-수용체 단백질의 활성화, 및 디쉬벨드(Dishevelled: Dsh)로 불리는 세포질 단백질의 후속적 활성화에 의해 활성화된다. 정규 Wnt 경로에서, 공동-수용체 LRP-5/6은 또한 활성화되며, 베타-카테닌은 세포질 내에 축적되고, TCF/LEF 전사 인자의 전사 공활성체로서 작용하기 위해 종국적으로 핵 내로 전위된다. Wnt 신호전달 없이, 선종성 용종증(APC), 악신(Axin), 단백질 포스파타제 2A(PP2A), 글리코겐 신타제 키나제 3(GSK3) 및 카제인 키나제 1α(CK1α)과 같은 단백질을 포함하는 파괴 복합체는 유비퀴틴화를 위한 β-카테닌 및 프로테아좀에 의한 그의 후속적 분해를 표적화한다. 그러나, Wnt 결합에 의한 프리즐드 수용체의 활성화는 파괴 복합체의 파괴를 야기함으로써, β-카테닌이 축적되게 한다.
Wnt 신호전달은 상이한 공동-수용체 단백질을 이용하고, 예를 들어, 세포골격의 조절, 소포체로부터의 칼슘 방출 자극, mTOR 경로의 활성화, 및 근분화의 조절을 위해 상이한 하류의 효과기를 활성화하는 비정규 경로를 통해 일어날 수 있다.
당업자는 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 결정하기 위해 당업계에 공지된 방법을 용이하게 이용할 수 있었다. 예를 들어, Wnt3a, 감소된 수준의 DKK1 또는 DKK3, 감소된 수준의 APC, 증가된 활성화된 베타-카테닌 수준, 또는 STAT3 결합 요소를 발현시키는 세포는 활성 Wnt 신호전달 경로를 가진다. DKK1, DKK3 및 APC는 Wnt 신호전달 경로의 공지된 저해제이다. 활성 Wnt 신호전달 경로를 나타내는 다른 신호전달 효과기는 당업계에서 용이하게 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 개시된 방법은 추가로 리튬을 이용하여 1차 성인 인간 간 세포 집단을 처리하는 단계를 포함하되, 상기 처리된 집단은 전환분화 경향이 있는 세포가 풍부하다. 다른 실시형태에서, 개시된 방법은 추가로 리튬을 이용하여 1차 성인 인간 간 세포 집단을 처리하는 단계를 포함하되, 집단 내에서 전환분화의 경향이 있는 상기 세포는 리튬을 이용하는 처리 후에 증가된 경향을 가진다. 따라서, 전환분화의 경향이 있는 세포의 농축 집단은 리튬을 이용하여 세포의 1차 성인 집단을 처리함으로써 확립될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 10mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 다른 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 1mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 1 내지 10mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 2mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 3mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 4mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 5mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 6mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 7mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 8mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 9mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 약 10 내지 20mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 15mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 20mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 10 내지 50mM의 리튬을 이용하여 처리된다. 일 실시형태에서, 세포의 1차 성인 집단은 10 내지 100mM의 리튬을 이용하여 처리된다.
다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 12시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 24시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 36시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 48시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 60시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 72시간(제1 시간 기간) 전에 처리되었다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 전환분화 시간(제1 시간 기간)에 처리되었다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 세포 집단은 췌장 계통으로의 전환분화 경향이 있되, 전환분화된 세포는 췌장 표현형 및 기능을 나타낸다. 예를 들어, 전환분화된 세포는 성숙 췌장 베타 세포 표현형 및 기능을 나타내는데, 이는 췌장 호르몬의 발현, 생성 및/또는 분비를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 췌장 호르몬은 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤 또는 섬 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 인슐린은 간 인슐린 또는 혈청 인슐린일 수 있다. 일 실시형태에서, 인슐린은 글루코스 이용, 및 탄수화물, 지방 및 단백질 대사를 촉진시킬 수 있는 인슐린의 완전한 가공 형태이다. 예를 들어, 전환분화의 경향이 있는 세포는 이질적 시험관내 1차 인간 간세포 배양물에서 모든 세포의 약 15%를 포함할 수 있다. 세포가 pTF를 이소성으로 발현시킬 때, 배양물 내 세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 초과는 인슐린을 생성하거나 또는 C-펩타이드를 분비한다.
일 실시형태에서, 전환분화의 경향이 있는 세포 집단은 간의 중심정맥에 근접하여 위치되거나, 또는 주심 간 세포이다. 본 명세서에서 나타내는 바와 같이, 간 세포의 40 내지 50% 이상이 췌장 전사 인자, 예컨대 PDX-1을 이소성으로 발현시키지만, 세포의 서브세트만이 pTF 발현 시 인슐린을 생성하였다. 이들 인슐린-생성 세포(IPC)는 도 10B에 의해 나타낸 바와 같이 배쪽 정맥에 가깝게 주로 위치되었다. 이들 세포는 또한 글루타민 합성효소 및 활성 Wnt 신호전달의 발현을 특징으로 한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 세포 집단은 신경 계통으로 전환분화하는 경향이 있되, 전환분화된 세포는 신경 마커를 발현시키거나, 신경 표현형을 나타내거나, 또는 신경 기능을 나타낸다. 전환분화된 세포는 뉴런 또는 뉴런 또는 신경교 세포일 수 있다.
다른 실시형태에서, 전환분화의 경향이 증가된 세포는 특정 세포 표면 마커를 통해 동정될 수 있다. 예를 들어, HOMER1, LAMP3 또는 BMPR2의 수준이 증가된 세포는 전환분화에 대한 경향이 없는 세포에 비교할 때 전환분화 능력이 증가된 세포를 나타낸다. ABCB1, ITGA4, ABCB4 또는 PRNP의 수준이 감소된 세포는 전환분화에 대한 경향이 없는 세포에 비교할 때 전환분화 능력이 증가된 세포를 나타낸다. 기재된 세포 표면 마커의 임의의 조합은 전환분화의 경향이 있는 세포 집단을 전환분화의 경향이 없는 세포 집단과 구별하기 위해 사용될 수 있다. 이들 세포 표면 마커에 대한 항체는 상업적으로 입수 가능하다. 당업계에 공지된 면역분석 또는 면역친화도는 전환분화 능력이 증가된 세포를 전환분화 능력이 없는 해당 세포와 구별하기 위해 이용될 수 있다.
췌장 세포 표현형을 나타내는 세포를 생성하는 본 명세서에 제시된 개시내용의 세포 집단의 사용은 췌장 세포 표현형을 나타내는 세포를 생성하는 비-췌장 세포의 이질적 집단을 구별하는 것 이상으로 특정 이점을 제공한다. 비-췌장 세포(즉, 간 세포)의 이질적 집단에서 췌장 전사 인자(pTF), 예컨대 PDX-1을 발현시키는 것을 기재하는 이전의 연구는 기껏해야 PDX-1-발현 세포의 15%만이 인슐린을 생성하는 데 적격이라는 것을 나타낸다. 따라서, 세포의 15%만이 췌장 호르몬을 생성 및 분비할 수 있는 성숙 췌장 베타 세포로 성공적으로 분화되었다. 대조적으로, 본 명세서에 제공된 개시내용의 세포 집단 내로 pTF를 도입하는 것은 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%가 성숙 췌장 베타 세포 표현형으로 분화되도록, 예를 들어 인슐린, 글루카곤을 생성하고/하거나 c-펩타이드를 분비하도록 초래한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 개시내용의 세포 집단의 세포가 췌장 전사 인자를 발현시킬 때, 세포의 적어도 30%는 인슐린을 생성하거나 또는 C-펩타이드를 분비한다.
전환분화 방법
본 명세서에 제시된 개시내용은 또한 성숙 분화 세포 유형을 나타내는 세포를 생산하는 전환분화 능력이 증가된 세포 집단을 이용하는 방법을 제공하며, 여기서, 분화된 세포는 출발 세포 집단과 상이한 표현형을 가진다. 예를 들어, 전환분화 능력이 증가된 세포(즉, 상피 세포, 섬유아세포 또는 간 세포)의 집단은 성숙 분화된 췌장 또는 신경 세포 표현형을 나타내기 위해 췌장 또는 신경 계통을 따라 세포로 분화될 수 있다. 췌장 또는 신경 계통으로 분화하는 세포에 대해 당업계에 공지된 임의의 수단이 이용될 수 있다.
일 실시형태에서, 전환분화의 경향이 있는 세포 집단은 신경 전사 인자의 발현을 통해 신경 계통을 따라 분화될 수 있다. 적합한 신경 전사 인자는 당업계에 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 개시내용의 세포 집단은 세포를 다양한 사이토카인, 성장 인자, 또는 세포를 신경 계통으로 분화시키는 당업계에 공지된 다른 제제와 접촉시키는 것을 통해 성숙 신경 세포로 분화될 수 있다. 분화된 신경 세포는 신경 마커를 발현시키거나, 신경 표현형(즉, 신경 유전자 발현 프로파일)을 나타내거나, 또는 신경 기능을 나타낼 수 있다. 분화된 세포는 뉴런 또는 신경교 세포일 수 있다.
다른 실시형태에서, 전환분화 경향이 있는 세포 집단은 췌장 전사 인자의 발현을 통해 췌장 계통을 따라 분화될 수 있다. 췌장 전사 인자는, 예를 들어, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1, 또는 이들의 조합이다. 췌장 베타 세포를 생성하기 위한 방법은 미국 특허 제6,774,120호 및 미국 특허 공개 제 2005/0090465호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그들의 전문이 참고로 포함된다.
다른 실시형태에서, 전환분화 경향이 있는 세포 집단은 본 명세서에 기재된 방법을 통해 췌장 계통을 따라 분화될 수 있다.
췌장 베타-세포 표현형
본 명세서에 제공된 방법은 성숙 췌장 베타 세포 표현형 또는 기능을 지니는 세포를 생성한다. 당업자는 용어 "췌장 베타 세포 표현형 또는 기능"이 췌장 베타 세포의 전형적인 하나 이상의 특징, 즉, 췌장 호르몬 생성, 가공, 분비 과립 내 저장, 호르몬 분비, 췌장 유전자 프로모터의 활성화, 또는 특징적 베타 세포 유전자 발현 프로파일을 나타내는 세포를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 호르몬 분비는 영양적으로 및/또는 호르몬적으로 조절된 분비를 포함한다. 일 실시형태에서, 생산된 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 췌장 베타 세포 표현형 또는 기능을 나타낸다.
췌장 호르몬은, 예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 또는 섬 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP)일 수 있다. 인슐린은 간 인슐린 또는 혈청 인슐린일 수 있다. 다른 실시형태에서, 췌장 호르몬은 간 인슐린이다. 대안의 실시형태에서, 췌장 호르몬은 혈청 인슐린(즉, 예를 들어, 글루코스 이용, 탄수화물, 지방 및 단백질 대사를 촉진시킬 수 있는 인슐린의 완전히 가공된 형태)이다.
일부 실시형태에서, 췌장 호르몬은 "프로호르몬(prohormone)" 형태이다. 다른 실시형태에서, 췌장 호르몬은 호르몬의 완전히 가공된 생물학적 활성 형태이다. 다른 실시형태에서, 췌장 호르몬은 조절 제어 하에 있으며, 즉, 호르몬의 분비는 내인성으로 생성된 췌장 호르몬과 유사한 영양 및 호르몬 제어 하에 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 일 실시형태에서, 호르몬은 글루코스의 조절 제어 하에 있다.
췌장 베타 세포 표현형은, 예를 들어 췌장 호르몬 생성, 즉, 인슐린, 소마토스타틴 또는 글루카곤 단백질 mRNA 또는 단백질 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다. 호르몬 생성은 당업계에 공지된 방법, 즉, 면역분석, 웨스턴 블롯, 수용체 결합 분석에 의해 또는 당뇨병 숙주에서 이식 시 고혈당증을 개선시키는 능력에 의해 기능적으로 결정될 수 있다. 인슐린 분비는 또한, 예를 들어, C-펩타이드 가공 및 분비에 의해 측정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 인슐린 분비를 측정하기 위해 고민감도 분석이 이용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 고민감도 분석은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 중간규모 발견 분석(mesoscale discovery assay: MSD), 또는 효소결합 면역스팟 분석(Enzyme-Linked I㎜unoSpot assay: ELISpot), 또는 당업계에 공지된 분석을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에서 구체화된 방법을 이용하여 인슐린을 생성 및 분비하도록 지시될 수 있다. 인슐린을 생성하는 세포의 능력은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 mRNA는 RT-PCR에 의해 검출될 수 있거나 또는 인슐린은 인슐린에 대해 상승된 항체에 의해 검출될 수 있다. 추가로, 췌장 분화의 다른 지표는 유전자 Isl-1, Pdx-1, Pax-4, Pax-6 및 Glut-2의 발현을 포함한다. 섬 세포의 동정을 위한 다른 표현형 마커는 전문이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제2003/0138948호에 개시되어 있다.
췌장 베타 세포 표현형은, 예를 들어 췌장-특이적 유전자의 프로모터 활성화에 의해 결정될 수 있다. 특정 관심 대상의 췌장-특이적 프로모터는 인슐린 및 췌장 전사 인자, 즉, 내인성 PDX-1에 대한 프로모터를 포함한다. 프로모터 활성화는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 루시퍼라제 분석, EMSA, 또는 하류의 유전자 발현의 검출에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 베타-세포 표현형은 또한 췌장 유전자 발현 프로파일의 유도에 의해 결정될 수 있다. 당업자는 용어 "췌장 유전자 발현 프로파일"이 정상적으로는 비-내분비 조직, 즉, 췌장 전사 인자, 췌장 효소 또는 췌장 호르몬에서 전사적으로 침묵인 하나 이상의 유전자의 발현을 포함하는 프로파일을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 췌장 효소는, 예를 들어, PCSK2(PC2 또는 프로호르몬 전환효소), PC1/3(프로호르몬 전환효소 1/3), 글로코키나제, 글루코스 수송체 2(GLUT-2)이다. 췌장-특이적 전사 인자는, 예를 들어, Nkx2.2, Nkx6.1, Pax-4, Pax-6, MafA, NeuroD1, NeuroG3, Ngn3, 베타-2, ARX, BRAIN4 및 Isl-1을 포함한다.
췌장 유전자 발현 프로파일의 유도는 당업자에게 잘 공지된 기법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 췌장 호르몬 RNA 서열은, 예를 들어, 노던 블롯 혼성화 분석, 증폭-기반 검출 방법, 예컨대 역전사 기반 중합효소 연쇄 반응 또는 마이크로어레이 칩 분석에 의한 전신 검출에서 검출될 수 있다. 대안적으로, 발현은 또한 단백질 수준에서, 즉, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 구체적 실시형태에서, PC1/3 유전자 또는 단백질 발현은 프로호르몬을 그들의 활성 성숙 형태로 가공함에 있어서 그의 활성에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대한 항체에 기반한 면역분석, 또는 가공된 프로호르몬의 HPLC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 성숙 베타-세포 표현형을 나타내는 세포는 본래 세포의 적어도 하나의 유전자 또는 유전자 발현 프로파일을 억제할 수 있다. 예를 들어, 성숙 베타-세포 표현형을 나타내도록 유도된 간세포는 적어도 하나의 간-특이적 유전자를 억제할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 즉, 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 폴리펩타이드 수준을 측정함으로써 본래 세포 및 생산된 세포의 간-특이적 유전자 발현을 용이하게 결정할 수 있었다. 비교 시, 간-특이적 유전자 발현의 감소는 전환분화가 생겼다는 것은 나타낸다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 전환분화된 세포는 간 표현형 마커의 감소를 포함한다. 일 실시형태에서, 알부민, 알파-1 항-트립신, 또는 이들의 조합의 발현 감소가 있다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1을 발현시키는 세포 집단의 5% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시킨다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1을 발현시키는 전환분화된 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시킨다.
췌장 장애의 치료 방법
본 명세서에 제시된 개시내용은 대상체에서 췌장 장애 증상의 개시를 예방 또는 지연시키거나 또는 증상을 완화시키는 데 사용하기 위한 방법을 개시한다. 예를 들어, 췌장 장애는 퇴행성 췌장 장애이다. 본 명세서에 개시된 방법은 췌장 세포, 예를 들어, 섬 베타 세포의 상실, 또는 췌장 세포 기능의 상실에 의해 야기되거나 또는 초래되는 해당 췌장 장애에 특히 유용하다.
통상적인 퇴행성 췌장 장애는 당뇨병(예를 들어, I형, II형 또는 임신성) 및 췌장암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법을 이용함으로써 치료될 수 있는 다른 췌장 장애 또는 췌장 관련 장애는, 예를 들어, 고혈당증, 췌장염, 췌장 위낭포 또는 손상에 의해 야기되는 췌장 외상이다. 추가적으로, 췌장전적술을 갖는 개체는 또한 개시된 방법에 의한 처리에 적합하다.
당뇨병은 3가지 형태(1형, 2형 및 임신성)로 발견되는 대사 장애이다. 1형 또는 IDDM은 자가면역 질환이고; 면역계는 인슐린을 생성하는 췌장의 능력을 감소시키거나 또는 제거하는 췌장의 인슐린-생성 베타 세포를 파괴한다. 1형 당뇨병 환자는 삶을 지속하기 위해 매일 인슐린 보충물을 취하여야 한다. 증상은 전형적으로 빠르게 진행되며, 증가된 갈증 및 배뇨, 헛헛증, 체중감소, 흐린 시력 및 피로를 포함한다. 2형 당뇨병은 가장 통상적이며, 당뇨병 환자의 90% 내지 95%에서 발견된다. 이는 고령, 비만, 가족력, 이전의 임신성 당뇨, 신체적 비활성 및 인종과 관련된다. 임신성 당뇨병은 임신 중에만 생긴다. 임신성 당뇨병이 발생한 여성은 5년 내지 10년 내에 2형 당뇨병이 발생할 20% 내지 50%의 가능성이 있다.
당뇨병이 발생하는 것으로 고통받고 있거나 또는 당뇨병이 발생할 위험에 있는 대상체는 혈액 글루코스 수준을 결정하는 것과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 동정된다. 예를 들어, 밤새 금식 후에 적어도 두 경우에 140㎎/㎗ 초과의 혈액 글루코스 값은 사람이 당뇨병이 있다는 것을 의미한다. 당뇨병이 발생하는 것으로 고통받지 않거나 또는 당뇨병이 발생할 위험에 있지 않은 대상체는 공복 당 수준이 70 내지 110㎎/㎗인 것을 특징으로 한다.
당뇨병 증상은 피로, 구역, 빈뇨, 과도한 갈증, 체중감소, 흐린 시력, 빈번한 감염 및 상처 또는 궤양의 느린 치유, 140/90 이상의 지속적인 혈압, 35㎎/㎗ 미만의 HDL 콜레스테롤 또는 250㎎/㎗ 초과의 트라이글리세라이드, 고혈당증, 저혈당증, 인슐린 결핍증 또는 내성을 포함한다. 화합물이 투여되는 당뇨병 또는 당뇨병 전증 환자는 당업계에 공지된 진단 방법을 이용하여 동정된다.
고혈당증은 과량의 글루코스가 혈액 혈장에서 순환하는 췌장-관련 장애이다. 이는 일반적으로 (200㎎/㎗)보다 높은 글루코스 수준이다. 고혈당증을 지니는 대상체는 당뇨병이 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
췌장암은 미국에서 4번째로 흔한 암이며, 주로 60세 이상의 사람에서 발생하고, 임의의 암의 가장 낮은 5년 생존률을 가진다. 가장 통상적인 유형의 췌장암인 선암종은 췌장관의 내벽에서 생긴다; 낭선암종 및 샘꽈리세포 암종은 더 희귀하다. 그러나, 양성 종양은 또한 췌장 내에서 성장하며; 이들은 인슐린종(인슐린을 분비하는 종양), 가스트린종(정상보다 더 높은 수준의 가스트린을 분비함), 및 글루카곤종(글루카곤을 분비하는 종양)을 포함한다.
췌장암은 공지된 원인은 없지만, 당뇨병, 흡연 및 만성 췌장염을 포함하는 몇몇 위험이 있다. 증상은 상복부 통증, 식욕 없음, 황달, 체중감소, 소화불량, 구역 또는 구토, 설사, 피로, 가려움 또는 비대해진 복부 기관을 포함할 수 있다. 진단은 초음파, 컴퓨터 단층촬영 스캔, 자기 공명 영상, ERCP, 경피 간경유 담도 조영술, 췌장 생검 또는 혈액 검사를 이용하여 이루어진다. 치료는 수술, 방사선 요법 또는 화학요법, 통증 또는 가려움에 대한 의약, 경구 효소 제제 또는 인슐린 치료를 수반할 수 있다.
췌장염은 췌장의 염증 및 자가소화이다. 자가소화에서, 췌장은 그 자신의 효소에 의해 파괴되는데, 이는 염증을 야기한다. 급성 췌장염은 전형적으로 단일 발생률 만을 수반하는데, 이 후에 췌장은 정상으로 되돌아 올 것이다. 그러나, 만성 췌장염은 췌장 및 췌장 기능에 대한 영구적인 손상을 수반하고, 섬유증을 야기할 수 있다. 대안적으로, 이는 몇몇 공격 후에 해결될 수 있다. 췌장염은 췌장관을 막는 담석에 의해 또는 알코올 남용에 의해 가장 빈번하게 야기되는데, 이는 작은 췌장 소도관이 막히게 할 수 있다. 다른 원인은 복부 외상 또는 수술, 감염, 신부전, 낭창, 낭성 섬유증, 종양 또는 전갈 독침을 포함한다.
췌장염과 빈번하게 관련된 증상은 가능하게는 등 또는 흉부로 뿜어져 나오는 복부 통증, 구역 또는 구토, 빠른 맥박, 열, 상복부 종창, 복수, 저혈압 또는 경증의 황달을 포함한다. 증상은 췌장염과 관련된 것으로 동정되기 전의 다른 병에 기인할 수 있다.
신경학적 장애를 치료하는 방법
본 명세서에 제시된 개시내용은 또한 신경학적 질환 또는 장애, 예컨대 신경퇴행성 질환 장애를 지니는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 세포 집단은 퇴화된 또는 비기능성 세포를 보충하는 것을 거쳐 신경 세포 또는 신경 기능을 특징으로 하는 신경학적 질환 또는 장애를 지니는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 치료될 수 있는 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 파킨슨증후군 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증, 루이 소체 질환, 노인성 신경퇴행, 신경학적 암, 및 수술, 사고, 허혈 또는 뇌졸중으로부터 초래되는 뇌외상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 세포의 집단은 신경 기능을 지니는 신경 세포 집단으로 분화될 수 있고, 분화된 신경 세포 집단은 신경학적 질환 또는 장애를 지니는 대상체에게 투여될 수 있다.
재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
본 명세서에 개시된 다른 실시형태는 벡터에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 벡터는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 PDX-1, Pax-4, NeuroD1 또는 MafA 단백질, 또는 기타 췌장 전사 인자, 예컨대 Ngn3, 또는 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 다음의 전사 인자 중 임의의 것을 암호화하는 단일 핵산을 포함한다: PDX-1, Pax-4, NeuroD1, Ngn3, MafA, 또는 Sox-9 또는 이들의 유도체 또는 단편. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 다음의 전사 인자의 임의의 조합을 암호화하는 2개의 핵산을 포함한다: PDX-1, Pax-4, NeuroD1, Ngn3, MafA, 또는 Sox-9 또는 이들의 유도체 또는 단편. 또 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 PDX-1 및 NeuroD1을 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 PDX-1 및 Pax4를 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 MafA를 암호화하는 핵산을 포함한다.
당업자는 용어 "벡터"가 핵산 분자가 연결되어 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 벡터의 한 가지 유형은 추가적인 DNA 세그먼트에 결찰될 수 있는 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 포함하는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 유래의 복제 및 에피솜 포유류 벡터를 갖는 박테리아 벡터)에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포 게놈 내로 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈과 마찬가지로 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 당업자는 용어 "플라스미드"와 "벡터"가 모두 동일한 품질 및 의미를 갖고 상호 호환적으로 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 용어 "플라스미드"는 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이다. 그러나, 본 명세서에 제시된 개시내용은 동등한 기능을 하는, 발현 벡터의 이러한 다른 형태, 예컨대 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 일부 바이러스 벡터는 구체적으로 또는 비-구체적으로 특정 세포 유형을 표적화할 수 있다.
본 명세서에 개시된 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 명세서에 개시된 핵산을 포함하는데, 이는 발현을 위해 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택되는, 즉, 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, 당업자는 용어 "작동 가능하게 연결된"이 (예를 들어, 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주 세포에서) 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결된 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 다양한 유형의 숙주 세포 및 특정 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 당업자는 발현 벡터 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따를 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서에 개시된 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 이에 의해 본 명세서에 기재된 핵산에 의해 암호화된 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 단백질, 또는 이들의 돌연변이체 형태 또는 융합 단백질 등)를 생성할 수 있다.
예를 들어, 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전사 인자를 암호화하는 하나의 핵산을 포함한다. 전사 인자를 암호화하는 두 핵산을 포함하는 발현 벡터에서, 각각의 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 각각의 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 상이하거나 또는 동일할 수 있다. 대안적으로, 두 핵산은 단일 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 개시된 발현 벡터에 유용한 프로모터는 당업계에 공지된 임의의 프로모터일 수 있었다. 당업자는 핵산이 발현될 숙주 세포에 적합한 프로모터, 요망되는 단백질의 발현 수준 또는 발현 시간 등을 용이하게 결정할 수 있었다. 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 세포 유형 특이적 프로모터일 수 있다.
본 명세서에 개시된 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 PDX-1의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및/또는 Sox-9는 박테리아 세포, 예컨대 이콜라이(E. coli), 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 이용) 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에서 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
원핵생물에서 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 이용하여 이콜라이에서 가장 자주 수행된다. 융합 벡터는 그 안에서 암호화된 단백질에 대해, 보통 재조합 단백질의 아미노 말단에 대해 다수의 아미노산을 첨가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 3가지 목적을 위한 역할을 한다: (1) 재조합 단백질의 발현을 증가시킴; (2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시킴; 및 (3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 도움. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 분해 절단 부위는 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 단백질의 정제에 후속적으로 융합 모이어티로부터의 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소, 및 그들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 각각 표적 재조합 단백질에 융합하는 pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) 유전자 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
적합한 유도성 비-융합 이콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) 및 pET 11d(Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)을 포함한다.
이콜라이에서 재조합 단백질 발현을 최대화하기 위한 한 가지 전략은 재조합 단백질을 단백질 분해로 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현시키는 것이다. 문헌[Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128] 참조. 다른 전략은 발현 벡터 내로 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변경시키는 것이며, 따라서 각각의 아미노산에 대한 개개 코돈은 이콜라이에서 우선적으로 이용되는 것이다(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). 본 명세서에 개시된 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기법에 의해 수행될 수 있다.
다른 실시형태에서, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae)에서 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1(Baldari, et al., (1987) EMBO J 6:229-234), pMFa (Kujan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al., (1987) 유전자 54:113-123), pYES2(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation)) 및 picZ(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 인비트로젠 코포레이션)를 포함한다.
대안적으로, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9는 바큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현을 위해 이용 가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(Smith et al. (1983) Mol Cell Biol 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow and Su㎜ers (1989) Virology 170:31-39)를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산은 포유류 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포에서 발현된다. 포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8(Seed (1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195)를 포함한다. 포유류 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 벡터에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵세포와 진핵세포 둘 다에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해, 예를 들어, Chapters 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16 및 17장 참조.
다른 실시형태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 우선적으로 지시할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현시키기 위해 사용된다). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적 예는 알부민 프로모터(간-특이적; Pinkert et al. (1987) Geness Dev 1:268-277), 림프구-특이적 프로모터(Calame and Eaton (1988) Adv I㎜unol 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J 8:729-733) 및 면역글로불린(Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 신경미세섬유 프로모터; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), 췌장-특이적 프로모터(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), 및 젖샘-특이적 프로모터(예를 들어, 유청 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 특허 출원 공개 제264,166호)를 포함한다. 발생 조절된 프로모터, 예를 들어 뮤린 hox 프로모터(Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) 및 알파-태아단백 프로모터(Campes and Tilghman (1989) Genes Dev 3:537-546)가 또한 포함된다.
본 명세서의 개시내용은 추가로 안티센스 배향으로 발현 벡터 내에 클로닝된 본 명세서에 개시된 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 PDX mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 발현을 허용하는 방식으로(DNA 분자의 전사에 의해) 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 다양한 세포 유형, 예를 들어 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서에서 안티센스 RNA 분자의 연속적 발현을 지시하는 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하게 연결된 조절 서열이 선택될 수 있거나, 또는 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적 발현을 지시하는 조절 서열이 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산은 고효율 조절 영역의 제어 하에 생성되는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독 바이러스의 형태일 수 있으며, 이의 활성은 벡터가 도입되는 세포 유형에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 이용하는 유전자 발현의 조절 논의를 위해, 문헌[Weintraub et al., "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis," Reviews--Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986] 참조.
본 명세서에 개시된 다른 실시형태는 본 명세서에 개시된 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 가능한 자손을 지칭한다는 것이 이해된다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향 중 하나에 기인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 사실 모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에서 사용되는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다. 추가적으로, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 또는 이들의 조합을 한 번 발현시키는 숙주 세포는 조절될 수 있고, 본래의 특징을 유지하거나 또는 상실할 수 있다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 단백질은 박테리아 세포, 예컨대 이콜라이, 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포(예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포)에서 발현될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 미숙 포유류 세포, 즉, 다능성 줄기 세포일 수 있다. 숙주 세포는 또한 다른 인간 조직으로부터 유래될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환, 형질도입, 감염 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다. 당업자는 용어 "형질전환", "형질도입", "감염" 및 "형질감염"이, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공법을 포함하는, 숙주 세포 내로 외래 핵산(예를 들어, DNA)를 도입하기 위한 다양한 당업계에 인식된 기법을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 형질감염은 형질감염제에 의해 매개될 수 있다. 당업자는 용어 "형질감염제"는 숙주 세포, 예를 들어, 리포좀 내 DNA의 혼입을 매개하는 임의의 화합물을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기 위한 적합한 방법은 문헌[Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)] 및 다른 실험 동물에서 찾을 수 있다.
형질감염은 "안정한"(즉, 외래 DNA의 숙주 게놈 내로의 통합) 또는 "일시적"(즉, DNA는 숙주 세포 내에서 에피솜 발현됨) 또는 mRNA는 세포 내로 전기천공될 수 있다.
포유류 세포의 안정한 형질감염을 위해, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라서, 소분획의 세포만이 외래 DNA를 그들의 게놈 내로 통합할 수 있고, DNA의 나머지는 에피솜에 남아있다는 것은 알려져 있다. 이들 구성요소를 동정 및 선택하기 위해, 선택 가능한 마커를 암호화하는 유전자(예를 들어, 항생제 내성)는 일반적으로 관심 대상의 유전자를 따라 숙주 세포 내로 도입된다. 다양한 선택 가능한 마커는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선택 가능한 마커를 암호화하는 핵산은 PDX-1을 암호화하는 것과 동일한 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나 또는 별개의 벡터 상에 도입될 수 있다. 도입된 핵산에 의해 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선택에 의해 동정될 수 있다(선택 가능한 마커 유전자를 혼입한 세포는 생존할 것이지만, 다른 세포는 사멸한다). 다른 실시형태에서, PDX-1 또는 형질감염 세포에 의해 조절되는 세포는 내인성 리포터 유전자의 발현 유도에 의해 동정된다. 구체적 실시형태에서, 프로모터는 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 유도하는 인슐린 프로모터이다.
일 실시형태에서, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 핵산은 바이러스 벡터 내에 존재한다. 일 실시형태에서, PDX-1 및 NeuroD1 핵산은 동일한 바이러스 벡터 내에 존재한다. 다른 실시형태에서, PDX-1 및 Pax4 핵산은 동일한 바이러스 벡터 내에 존재한다. 다른 실시형태에서, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 핵산은 바이러스에서 캡슐화된다. 다른 실시형태에서, PDX-1 및 NeuroD1은 바이러스에서 캡슐화된다(즉, PDX-1 및 NeuroD1을 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 입자에서 캡슐화된다). 다른 실시형태에서, PDX-1 및 Pax4는 바이러스에서 캡슐화된다(즉, PDX-1 및 Pax4를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 입자에서 캡슐화된다). 일부 실시형태에서, 바이러스는 바람직하게는 다양한 조직 유형의 다능성 세포, 예를 들어, 조혈 줄기, 세포, 뉴런 줄기 세포, 간 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포를 감염시키며, 바람직하게는 바이러스는 간친화성이다. 당업자는 용어 "간친화성"이 바이러스가 특이적으로 또는 비특이적으로 바람직하게는 간 세포를 표적화하는 능력을 가진다는 것을 의미함을 인식할 것이다. 추가 실시형태에서, 바이러스는 조절된 간염바이러스, SV-40, 또는 엡스타인-바르 바이러스이다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 아데노바이러스이다.
유전자 요법
일 실시형태에서, 핵산 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 폴리펩타이드 또는 이들의 조합, 또는 이들의 기능성 유도체를 암호화하는 핵산은 유전자 요법에 의해 투여된다. 유전자 요법은 대상체에 대한 특정 핵산의 투여에 의해 수행되는 요법을 지칭한다. 일 실시형태에서, 핵산은 그의 암호화된 펩타이드(들)를 생성하고, 이는 이어서, 앞서 언급된 질환 또는 장애, 예를 들어 당뇨병의 기능을 조절함으로써 치료적 효과를 발휘하는 역할을 한다. 당업계 내에서 이용 가능한 유전자 요법에 관한 임의의 방법은 본 명세서에 제시된 개시내용의 실행에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12: 488-505].
다른 실시형태에서, 치료제는 적합한 숙주 내에서 앞서 언급한 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1, 및/또는 Sox-9 폴리펩타이드, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 유사체 중 임의의 하나 이상을 발현시키는 발현 벡터의 부분인 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, 이러한 핵산은 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 및 Sox-9 폴리펩타이드의 암호 영역(들)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가진다. 프로모터는 유도성 또는 구성적, 및 선택적으로, 조직-특이적일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 바이러스 또는 포유류 유래일 수 있다. 다른 구체적 실시형태에서, 암호 서열(및 임의의 다른 목적으로 하는 서열)이 게놈 내의 목적으로 하는 부위에서 상동성 재조합을 촉진시키는 영역에 측접하고, 따라서, 핵산의 염색체내 발현을 제공하는 핵산 분자가 사용된다. 예를 들어, 문헌[Koller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935]. 또 다른 실시형태에서, 전달된 핵산은 에피솜에 남아있고, 내인성 및 다르게는 침묵인 유전자를 유도한다.
환자 내로 치료적 핵산의 전달은 직접적(즉, 환자가 핵산 또는 핵산-함유 벡터에 직접적으로 노출됨) 또는 간접적(즉, 세포가 시험관내 핵산과 처음 접촉되고, 이어서, 환자에게 이식됨)일 수 있다. 이들 두 접근은 각각 생체내 또는 생체밖 유전자 요법으로서 알려져 있다. 다른 실시형태에서, 핵산은 생체내에서 직접적으로 투여되며, 이는 암호화된 산물을 생성하기 위해 발현된다. 이는 상기 핵산을 적절한 핵산 발현 벡터의 부분으로서 구성하는 것 및 세포내가 되는 방식으로 이를 투여하는 것(예를 들어, 결함 또는 약독된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 이용하는 감염에 의해; 미국 특허 제4,980,286호 참조); 네이키드 DNA를 직접 주사하는 것; 마이크로입자 충격을 이용하는 것(예를 들어, "Gene Gun. RTM; Biolistic, DuPont); 상기 핵산을 지질로 코팅하는 것; 관련된 세포-표면 수용체/형질감염제를 이용; 리포좀, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐 내에서 캡슐화; 핵 내로 유입되는 것으로 알려진 펩타이드에 대한 연결에서 그것을 투여하는 것; 또는 관심 대상의 수용체를 특이적으로 발현시키는 세포 유형을 "표적화"하기 위해 사용될 수 있는 수용체-매개 세포내 섭취의 경향이 있는 리간드에 대한 연결에서 그것을 투여하는 것(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, 1987. J Biol Chem 262: 4429-4432] 참조) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다수의 수많은 방법에 의해 달성될 수 있다.
유전자 요법에 대한 추가적인 접근은 전기천공법, 리포펙션, 인산칼슘-매개 형질감염, 바이러스 감염 등으로서 이러한 방법에 의해 시험관내 조직 배양물 내 세포 내로 유전자 또는 mRNA를 전달하는 것을 수반한다. 일반적으로, 전달 방법은 세포에 대한 선택 가능한 마커의 동시 전달을 포함한다. 이어서, 세포는 전달 유전자를 취하고, 발현시키는 해당 세포의 단리를 용이하게 하기 위해 선택압(예를 들어, 항생제 내성) 하에 놓인다. 이어서, 해당 세포는 환자에게 전달된다. 다른 실시형태에서, 얻어진 재조합 세포의 생체내 투여 전에, 핵산은 형질감염, 전기천공법, 미세주입법, 관심 대상의 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터에 의한 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 마이크로셀-매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합, 및 수용자 세포의 필요한 발생적 및 생리적 기능이 전달에 의해 파괴되지 않는다는 것을 보장하는 유사한 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 문헌[Loeffler and Behr, 1993. Meth Enzymol 217: 599-618] 참조. 선택된 기법은 핵산이 세포에 의해 발현 가능하도록, 세포에 대한 핵산의 안정한 전달을 제공하여야 한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 전달된 핵산은 유전성이며, 세포 자손에 의해 발현 가능하다. 대안의 실시형태에서, 전달된 핵산은 에피솜에 남아있고, 다르게 침묵인 내인성 핵산의 발현을 유도한다.
일 실시형태에서, 얻어진 재조합 세포는 상피 세포의 주사(예를 들어, 피하로), 환자에 대한 피부 이식으로서 재조합 피부 세포의 적용, 및 재조합 혈액 세포의 정맥내 주사(예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구 세포) 또는 간 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에게 전달될 수 있다. 사용을 위해 생각되는 세포의 총 수는 목적으로 하는 효과, 환자 상태 등에 따르며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 적어도 106개의 전환분화된 세포가 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료 방법에서 사용하는 데 필요하다. 다른 실시형태에서, 적어도 107개의 전환분화된 세포, 적어도 108개의 전환분화된 세포, 적어도 109개의 전환분화된 세포, 또는 적어도 1010개의 전환분화된 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료 방법에서 사용하는 데 필요하다. 또 다른 실시형태에서, 약 1.8 x 109개의 전환분화된 세포가 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료 방법에서 사용하는 데 필요하다.
유전자 요법의 목적을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 목적으로 하는, 이용 가능한 세포 유형을 포함하고, 이종성, 이형성, 동질적 또는 자발적일 수 있다. 세포 유형은 분화된 세포, 예컨대 상피 세포, 내피 세포, 케라틴세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포 및 혈액 세포, 또는 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히 배아 심장 근육 세포, 간 줄기 세포(국제 특허 공개 WO 94/08598), 신경 줄기 세포(Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985), 조혈 줄기 또는 전구 세포(예를 들어, 골수, 탯줄 혈액, 말초 혈액, 태아간 등으로부터 얻어진 것)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 유전자 요법을 위해 이용되는 세포는 환자에 대해 자가이다.
유전자 요법을 위한 DNA는 비경구로, 예를 들어 정맥내로, 피하로, 근육내로 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. DNA 또는 유도제는 약제학적으로 허용 가능한 담체, 즉, 동물에게 투여하기에 적합한 생물학적으로 적합한 비히클, 예를 들어, 생리 식염수로 투여된다. 치료적 유효량은 의학적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 양, 예를 들어 치료되는 동물에서 췌장 유전자의 증가이다. 이러한 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 잘 알려진 바와 같이, 임의의 주어진 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강상태, 및 기타 동시에 투여 중인 약물을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 투약량은 다를 수 있지만, DNA의 정맥내 투여를 위한 바람직한 투약량은 DNA 분자의 대략 106개 내지 1022개 복제물이다. 예를 들어, DNA는 ㎏ 당 대략 2x1012개 비리온으로 투여된다.
인간 인슐린 생성(IP) 세포의 제조 방법
인간 인슐린 생성 세포의 제조는, 예를 들어 I형 진성 당뇨병으로 고통받고 있는 대상체를 치료하기 위해 세포 기반 요법에 대해 이용 가능한 조직의 부족을 극복할 수 있다. 인간 인슐린 생성 세포를 충분한 수로 제조하는 방법은, 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 이들 및 다른 요법에서 사용하기 위해 세포 기반 산물을 제공한다(도 32).
이제 일 실시형태에서 자가 또는 동종이계 인슐린 생성 세포(AIP)일 수 있는 세포 생성물을 생성하는 인간 인슐린의 제조 공정의 흐름도를 제시하는 도 34에 대해 언급한다. 도 34는 인간 인슐린 생성 세포의 제조 공정의 일 실시형태를 기재하되, 출발 물질은 간 조직을 포함한다. 당업자는 비-췌장 β-세포 조직의 임의의 공급원이 이 제조 공정에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
도 34에 제시된 다수의 단계를 위한 실시형태는 본 명세서 전체적으로 상세하게 기재되며, 그들이 본 명세서에서 고려되어야 하지만, 본 명세서에서 반복되지는 않을 것이다. 또한 다수의 이들 단계를 예시하는 실시예 20 및 21이 언급되어야 한다. 요약하면, 제조 공정은 이하에 제시되는 단계들에 기반하여 이해될 수 있다.
단계 1에 나타낸 바와 같이: 간 조직을 얻는 단계. 일 실시형태에서, 간 조직은 인간 간 조직이다. 다른 실시형태에서, 간 조직은 생검의 부분으로서 얻어진다. 다른 실시형태에서, 간 조직은 당업계에 공지된 임의의 수술적 절차를 거쳐 얻어진다. 다른 실시형태에서, 간 조직을 얻는 단계는 숙련된 의사에 의해 수행된다. 다른 실시형태에서, 얻어진 간 조직은 건강한 개체로부터의 간 조직이다. 관련된 실시형태에서, 건강한 개체는 글루코스 조절 방식으로 가공된 인슐린을 제공하는 세포 기반 요법이 필요한 환자, 예를 들어 I형 진성 당뇨병 환자 또는 췌장염으로 고통받고 있는 환자에 대한 동종이계 공여체이다. 다른 실시형태에서, 공여체 선별 및 공여체 검사는 공여체로부터 얻은 조직이 감염성 또는 악성 질환의 임상적 또는 신체적 증거 또는 이에 대한 위험 인자가 AIP 세포의 제조로부터 유래되지 않았다는 것을 나타낸다는 것을 보장하기 위해 수행되었다. 또 다른 실시형태에서, 간 조직은 글루코스 조절된 방식에서 가공된 인슐린을 제공하는 세포 기반 요법이 필요한 환자, 예를 들어 I형 진성 당뇨병 환자 또는 췌장염으로 고통받고 있는 환자로부터 얻어진다. 또 다른 실시형태에서, 간 조직은 글루코스 조절된 방식으로 가공된 인슐린을 제공하는 세포 기반 요법이 필요한 환자, 예를 들어 I형 진성 당뇨병 환자 또는 췌장염으로 고통받고 있는 환자에 의한 자가이다.
단계 2에 나타낸 바와 같이: 1차 간세포의 회수 및 가공 단계. 간 조직은 추가 가공에서 사용될 부착세포의 회수를 위한 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 가공된다. 일 실시형태에서, 간 조직은 약 1 내지 2㎜의 작은 조각으로 절단되고, 멸균 완충 용액 중에서 약하게 위아래로 피펫팅한다. 이어서, 샘플을 콜라게나제와 함께 인큐베이션하여 조직을 분해할 수 있다. 일련의 세척 단계 후에, 다른 실시형태에서, 1차 간 세포를 전처리 피브로넥틴-코팅된 조직 배양물 조직 접시 상에서 플레이팅할 수 있다. 당업자는 간세포의 증힉을 위한 잘 공지된 기법 후에 세포를 가공하는(계대) 방법을 잘 알 것이다. 간략하게, 세포는 증식 배지에서 그리고 일련의 파종을 통해 성장될 수 있고, 채취 세포 수는 증가된다. 세포는 80% 합류에 도달 시 분할되고, 재플레이팅될 수 있다. 도 33(0 내지 2주)은 이 회수의 일 실시형태 및 1차 간 세포의 2회 계대를 나타내는 공정 단계의 개략도를 나타낸다.
당업자는 프로토콜의 확장기가 시작되기 전에, 예를 들어 2주 시각 기간에 충분한 세포에 대한 필요를 인식할 것이다(단계 3). 당업자는 2주 시간 기간이 세포를 확장시키는 시작점의 일 예라는 것을 인식할 것이되, 세포는 이 시간 기간 전에 또는 후에 확장을 위한 준비를 할 수 있다. 일 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 적어도 1 x 105개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 적어도 1 x 106개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 2 x 106개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 5 x 106개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 1 x 107개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 1 x 105 내지 1 x 106개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 1차 세포의 회수 및 가공은 세포의 2회 계대 후 1 x 106 내지 1 x 107개 세포를 수득한다. 다른 실시형태에서, 충분한 시작 조직은 단계 3, 세포의 대규모 확장에서 적절한 파종 밀도를 위해 1차 세포의 회수 및 가공이 세포의 2회 계대 후 충분한 세포를 수득한다는 것을 보장하기 위해 사용된다.
일 실시형태에서, 제1 계대 1차 세포는 이후의 사용을 위해 동결보존된다. 다른 실시형태에서, 초기 계대 1차 세포 이후의 사용을 위해 동결보존된다. 또 다른 실시형태에서, 제2 계대 1차 세포 이후의 사용을 위해 동결보존된다.
단계 3에서 표시된 바와 같이: 1차 간세포의 번식/증식
단계 3은 제조공정의 대규모 확장기를 나타낸다. 당업자는 프로토콜의 전환분화기를 시작하기 전에 5주 시간 기간에 충분한 세포에 대한 필요를 인식할 것이되(단계 4), 사전 결정된 세포 수는 환자를 치료하는 데 필요한 것으로 생각될 수 있다. 일 실시형태에서, 전환분화 전에 필요한 사전 결정된 세포 수는 약 1 x 108개의 1차 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 전에 필요한 사전 결정된 세포 수는 약 2 x 108개의 1차 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 전환분화 전에 필요한 사전 결정된 세포 수는 약 3 x 108개의 1차 세포, 4 x 108개의 1차 세포, 5 x 108개의 1차 세포, 6 x 108개의 1차 세포, 7 x 108개의 1차 세포, 8 x 108개의 1차 세포, 9 x 108개의 1차 세포, 1 x 109개의 1차 세포, 2 x 109개의 1차 세포, 3 x 109개의 1차 세포, 4 x 109개의 1차 세포, 5 x 109개의 1차 세포, 6 x 109개의 1차 세포, 7 x 109개의 1차 세포, 8 x 109개의 1차 세포, 9 x 109개의 1차 세포 또는 1 x 1010개의 1차 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 1 x 103 내지 10x103개의 세포/㎠를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 1 x 103 내지 8x103개의 세포/㎠를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 1 x 103 내지 5 x 103개의 세포/㎠를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 1 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 2 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 3 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 4 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 5 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 6 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 7 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 8 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 9 x 103개를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 밀도는 10 x 103개를 포함한다.
다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도에 대한 범위는 60 내지 100%를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도에 대한 범위는 약 70 내지 99%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약60%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약65%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 70%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 75%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 80%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 85%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 90%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 95%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 99%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 확장 시 세포 파종 생존도는 약 99.9%의 생존도를 포함한다.
도 33은 이 확장 기간의 일 실시형태를 개략적으로 도시한다. 일 실시형태에서, 확장은 2주 내지 5주에 일어난다. 당업자는 출발 조직 물질 내에서 가변성을 인식할 것이다(도 29). 따라서, 다른 실시형태에서 확장은 2주 내지 6주에 일어난다. 또 다른 실시형태에서, 확장은 2주 내지 7주에 일어난다. 다른 실시형태에서, 확장은 2주 내지 4주에 일어난다. 또 다른 실시형태에서, 확장은 필요한 수의 1차 세포가 증식될 때까지 일어난다. 예를 들어, 도 28은 표적 목표 10억개 세포가 배양물의 제30일까지 도달된다는 것을 나타낸다.
당업자는 세포의 확장과 동시에, 집단이 전환분화를 위해 향상될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 전환분화를 위해 향상된 1차 성인 간 세포 및 이들 집단을 농축하기 위한 방법의 설명을 본 명세서에 개시되었고, 실시예 10 내지 17 및 23에서 예시된다. 일 실시형태에서, GSRE 활성을 위한 선택은 전환분화를 위한 성체 세포의 집단을 농축하기 위해 사용된다. 다른 실시형태에서, 유전자 발현 수준은 증가 또는 감소된 발현 중 하나를 갖는 것으로 알려진 유전자에 대해 측정되되, 이러한 증가 또는 감소는 전환분화에 대한 경향을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 1차 성인 간 세포는 전환분화 전에 리튬과 함께 인큐베이션될 수 있되, 인큐베이션은 1차 성인 간 세포의 상기 집단 내에서 세포 집단의 경향을 향상시킨다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 전환분화 단계 전에 1차 세포를 확장 및 증식시키기 위해 사용된다. 생물반응기는 세포의 배양을 위해 사용될 수 있으며, 이때 조건은 높은 세포 농도에 적합하다(실시예 20 참조). 다른 실시형태에서, 생물반응기는 세포의 확장을 위한 폐쇄 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 다중 생물반응기는 일련의 세포 확장을 위해 사용된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 생물반응기는 일회용 생물반응기이다. 다른 실시형태에서, 사용되는 생물반응기는 다회용 생물반응기이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 공정의 모니터링 및 제어 매개변수를 위한 제어 장치를 포함한다. 다른 실시형태에서, 모니터링 및 제어를 위한 매개변수는 용존산소(Dissolve Oxygen: DO), pH, 기체, 및 온도를 포함한다.
단계 4에 나타낸 바와 같이: 1차 간세포의 전환분화(TD).
일 실시형태에서, 전환분화는 본 명세서에 개시된 임의의 전환분화 방법을 포함한다. 예를 들어, 전환분화는 본 명세서에 개시된 바와 같은 층위(1+1+1) 프로토콜 또는 "2+1" 프로토콜을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 췌장 표현형 및 기능을 갖는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 성숙 β-세포 췌장 표현형 및 기능을 갖는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 증가된 인슐린 함량을 갖는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 글루코스-조절 방식에서 가공된 인슐린을 분비할 수 있는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 증가된 C-펩타이드 수준을 갖는 전환분화된 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 적어도 하나의 췌장 유전자 마커의 내인성 발현이 증가된 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 내인성 발현은 적어도 2개의 췌장 유전자 마커에 대해 증가된다. 다른 실시형태에서, 내인성 발현은 적어도 3개의 췌장 유전자 마커에 대해 증가된다. 다른 실시형태에서, 내인성 발현은 적어도 4개의 췌장 유전자 마커에 대해 증가된다. 관련된 실시형태에서, 췌장 유전자 마커는 PDX-1, NeuroD1, MafA, Nkx6.1, 글루카곤, 소마토스타틴 및 Pax4를 포함한다.
일 실시형태에서, 내인성 PDX-1 발현은 비분화 세포보다 102배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1 발현은 비분화 세포보다 103배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1 발현은 비분화 세포보다 104배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1 발현은 비분화 세포보다 105배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 PDX-1 발현은 비분화 세포보다 106배 초과이다.
다른 실시형태에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비분화 세포보다 102배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비분화 세포보다 103배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비분화 세포보다 104배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 NeuroD1 발현은 비분화 세포보다 105배 초과이다.
다른 실시형태에서, 내인성 MafA 발현은 비분화 세포보다 102배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 MafA 발현은 비분화 세포보다 103배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 MafA 발현은 비분화 세포보다 104배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 MafA 발현은 비분화 세포보다 105배 초과이다.
다른 실시형태에서, 내인성 글루카곤 발현은 비분화 세포보다 10배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 글루카곤 발현은 비분화 세포보다 102배 초과이다. 다른 실시형태에서, 내인성 글루카곤 발현은 비분화 세포보다 103배 초과이다.
다른 실시형태에서, PDX-1, NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합의 내인성 발현은 각각 비분화 세포보다 60% 초과이다. 다른 실시형태에서, PDX-1, NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합의 내인성 발현은 각각 비분화 세포보다 70% 초과이다. 다른 실시형태에서, PDX-1, NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합의 내인성 발현은 각각 비분화 세포보다 80% 초과이다.
다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 적어도 60%의 생존도를 갖는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 적어도 70%의 생존도를 갖는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 적어도 80%의 생존도를 갖는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 적어도 90%의 생존도를 갖는 전환분화된 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 감소된 간세포 마커를 나타내는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 감소된 알부민 또는 알파-1 안티트립신(AAT), 또는 임의의 조합을 나타내는 전환분화된 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 전환분화 후 얻어진 세포 집단은 FACS 알부민 또는 알파-1 안티트립신(AAT), 또는 임의의 조합에 의해 1% 미만을 포함하는 전환분화된 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 6개월 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 12개월 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 18개월 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 24개월 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 36개월 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 48개월 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 4년 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다. 다른 실시형태에서, 전환분화된 세포는 적어도 5년 동안 췌장 표현형 및 기능을 유지한다.
일 실시형태에서, 세포 수는 전환분화 동안 유지된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 전환분화 동안 5% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 전환분화 동안 10% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 전환분화 동안 15% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 전환분화 동안 20% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 전환분화 동안 25% 미만만큼 감소된다.
단계 5에 나타낸 바와 같이: 전환분화된 1차 간세포의 채취 단계
일 실시형태에서, 인간 인슐린 생성 세포를 포함하는 전환분화된 1차 간 세포가 채취되고, 세포 기반 요법을 위해 사용된다. 일 실시형태에서, 세포 수는 채취 동안 유지된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 채취 동안 5% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 채취 동안 10% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 채취 동안 15% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 채취 동안 20% 미만만큼 감소된다. 다른 실시형태에서, 세포 수는 채취 동안 25% 미만만큼 감소된다.
일 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 1x107 내지 1x1010개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 1x108 내지 1x1010개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 1x107 내지 1x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 1x107개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 5 x107개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 7.5x107개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 1x108개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 2.5x108개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 5x108개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 7.5x108개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 1x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 2x108개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 3x108개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 4x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 5x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 6x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 7x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 8x109개의 세포이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 회수된 전환분화된 세포 수는 총 약 9x109개의 세포이다.
일 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 1x103 내지 1x105개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 1x104 내지 5x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 1x104 내지 4 x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 1x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 2x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 3x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 4x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 5x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 6x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 7x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 8x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 9x103개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 1x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 2x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 3x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 4x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 5x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 6x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 7x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 8x104개의 세포/㎠이다. 다른 실시형태에서, 채취 시 전환분화된 세포의 밀도는 약 9x104개의 세포/㎠이다.
다른 실시형태에서, 채쉬 시 세포 생존도에 대한 범위는 50 내지 100%를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도에 대한 범위는 60 내지 100%를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도에 대한 범위는 50 내지 90%를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도에 대한 범위는 약 60 내지 99%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도에 대한 범위는 약 60 내지 90%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 60%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 65%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 70%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 75%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 80%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 85%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 90%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 95%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 99%의 생존도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 채취 시 세포 생존도는 약 99.9%의 생존도를 포함한다.
다른 실시형태에서, 인간 인슐린 생성 세포를 포함하는 전환분화된 1차 간 세포는 이후의 날짜에 세포 기반 요법에서 사용하기 위해 채취 및 저장된다. 다른 실시형태에서, 저장은 세포를 동결보존하는 단계를 포함한다.
단계 6에 나타내는 바와 같이: 품질 분석/품질관리
세포 기반 요법에서 전환분화된 세포의 임의의 사용 전에, 전환분화된 세포는 품질분석/품질제어 평가를 받아야 한다. FACS 분석 및/또는 RT-PCR은 막 마커 및 유전자 발현을 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, ELISA, MSD, ELISpot, HPLC, RP-HPLC를 포함하는 인슐린 분비를 위한 분석 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 인슐린 분비 검사는 고글루코스 농도(약 17.5mM)에 비교하여 저 글루코스 농도(약 2mM)에서이다.
치료적 조성물
본 명세서에 기재된 전환분화-유도 화합물, 또는 이소성 췌장 전사 인자(즉, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 폴리펩타이드, 리보핵산 또는 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산) 및 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성되는 췌장 베타 세포 표현형을 갖는 세포는, 치료적으로 사용될 때, 본 명세서에서 "치료제"로서 지칭된다. 치료제의 투여 방법은 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 제시된 개시내용의 치료제는, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 임의의 편리한 경로로 투여될 수 있고, 다른 생물학적으로-활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어 간에 대한 간문맥 전달을 통한 전신 또는 국소일 수 있다. 추가로, 심실내 및 척추강내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계 내로 치료제를 투여하는 것이 유리할 수 있다. 심실내 주사는 저장소(예를 들어, 옴마야(O㎜aya) 저장소)에 부착된 심실내 카테터에 의해 용이하게 될 수 있다. 폐 투여는 또한 흡입기 또는 네뷸라이저 및 에어로졸화제에 의한 제형의 사용에 의해 사용될 수 있다. 또한 치료가 필요한 면적에 치료제를 국소로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는, 예를 들어, 제한 없이, 수술 동안 국소 주입, 국소 적용, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있다. 다양한 전달 시스템은 공지되어 있고, 예를 들어: (i) 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐 내의 캡슐화; (ii) 치료제를 발현시킬 수 있는 재조합 세포; (iii) 수용체-매개 세포내 섭취(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, 1987. J Biol Chem 262:4429-4432] 참조); (iv) 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 벡터 등의 부분으로서 치료적 핵산의 구성을 포함하는, 본 명세서에 제시된 개시내용의 치료제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 제시된 개시내용의 일 실시형태에서, 치료제는 소수포, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다. 리포좀에서, 본 명세서에 제시된 개시내용의 단백질은 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체에 추가로 양친매성 제제, 예컨대 수용액 중에서 마이셀, 불용성 단일층, 액정 또는 라멜라 층으로서 응집된 형태로 존재하는 액체와 조합된다. 리포좀 제형을 위한 적합한 액체는 모노글리세라이드, 다이글리세라이드, 설파타이드, 라이소레시틴, 인지질, 사포닌, 답즙산 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 리포좀 제형의 제조는, 예를 들어, 미국 특허 제4,837,028호; 및 미국 특허 제4,737,323호에 개시된 바와 같이 당업자의 수준 내이며, 이들 모두는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 치료제는, 예를 들어: 전달 펌프(예를 들어, 문헌[Saudek, et al., 1989. New Engl J Med 321:574] 참조) 및 반투성 중합체 물질(예를 들어, 문헌[Howard, et al., 1989. J Neurosurg 71:105] 참조)를 포함하는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 추가적으로, 제어 방출 시스템은 치료적 표적(예를 들어, 뇌)에 근접하여 놓일 수 있고, 따라서 전신 용량의 분획만이 필요하다. 예를 들어, 문헌[Goodson, In: Medical Applications of Controlled Release 1984. (CRC Press, Boca Raton, Fla.)] 참조.
본 명세서에 제시된 개시내용의 일 실시형태에서, 치료제가 단백질을 암호화하는 핵산인 경우, 치료적 핵산은 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 부분으로서 구성하고, 그것이 세포내가 되도록 투여함으로써(예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해, 직접 주사에 의해, 마이크로입자 충격에 의해, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제에 의한 코팅에 의해, 또는 핵에 유입되는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩타이드에 대한 연결에서 투여함으로써(예를 들어, 문헌[Joliot, et al., 1991. Proc Natl Acad Sci USA 88:1864-1868] 참조) 등) 그의 암호화된 단백질의 발현을 촉진시키기 위해 생체내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산 치료제는 세포내로 도입될 수 있고, 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 상동성 재조합에 의해 혼입되거나, 에피솜에 남을 수 있다.
일 실시형태에서, 치료제는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 췌장 베타 세포 표현형을 갖는 세포이며, 치료제는 정맥내로 투여된다. 구체적으로, 치료제는 간문맥 주입을 통해 전달될 수 있다.
당업자는 용어 "치료적 유효량"은 의미 있는 환자 유익, 즉, 적절한 의학적 병태의 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 이러한 병태의 치료, 치유, 예방 또는 개선 속도의 증가를 나타내는데 충분한 약제학적 조성물 또는 방법의 각각의 활성 성분의 총량을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 단독으로 투여되는 개개 활성 성분에 적용될 때, 상기 용어는 해당 성분 단독을 지칭한다. 조합으로 적용될 때, 상기 용어는 치료 효과를 초래하는 활성 성분의 조합된 양, 조합으로, 연속으로 또는 동시에 투여되는지의 여부를 지칭한다.
본 명세서에 제시된 개시내용의 치료제의 정맥내 투여에 대한 적합한 투약량 범위는 일반적으로 적어도 1백 만개의 전환분화된 세포, 적어도 2백 만개의 전환분화된 세포, 적어도 5백 만개의 전환분화된 세포, 적어도 1천 만개의 전환분화된 세포, 적어도 2천 5백 만개의 전환분화된 세포, 적어도 5천 만개의 전환분화된 세포, 적어도 1억 개의 전환분화된 세포, 적어도 2억 개의 전환분화된 세포, 적어도 3억 개의 전환분화된 세포, 적어도 4억 개의 전환분화된 세포, 적어도 5억 개의 전환분화된 세포, 적어도 6억 개의 전환분화된 세포, 적어도 7억 개의 전환분화된 세포, 적어도 8억 개의 전환분화된 세포, 적어도 9억 개의 전환분화된 세포, 적어도 10억 개의 전환분화된 세포, 적어도 20억 개의 전환분화된 세포, 적어도 30억 개의 전환분화된 세포, 적어도 40억 개의 전환분화된 세포, 또는 적어도 50억 개의 전환분화된 세포이다. 일 실시형태에서, 용량은 60 내지 75㎏ 대상체에게 10억 내지 20억 개의 전환분화된 세포이다. 당업자는 유효량이 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다른 실시형태에서, 유효량은 정맥내로 간문맥에 투여될 수 있다.
세포는 이러한 세포에 대한 목적으로 하는 효과 또는 활성을 증식시키거나 또는 생성하기 위해 본 명세서에 제시된 개시내용의 치료제, 핵산 또는 단백질의 존재 하에 생체 밖에서 배양될 수 있다. 이어서, 처리된 세포는 치료적 목적을 위해 본 명세서에 기재된 투여 경로를 통해 생체내에 도입될 수 있다.
약제학적 조성물
화합물, 예를 들어, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 폴리펩타이드, PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1 또는 Sox-9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 핵산 또는 PDX-1, Pax-4, MafA, NeuroD1, 또는 Sox-9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 발현을 증가시키는 화합물(또한 본 명세서에서 "활성 화합물"로서 지칭됨) 및 이들의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체 및 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 췌장 베타 세포는 투여에 적합한 약제학적 조성물 내론 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 핵산 분자 또는 단백질, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 이 분야의 표준 참고 문헌인 가장 최신판의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예는 물, 식염수, 핑거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리포좀 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립 가능하지 않은 경우를 제외하고, 조성물 중의 이들의 사용이 상정된다. 보충적 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립 가능한 것으로 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 진피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 진피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성의 조절을 위한 제제. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨을 이용하여 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 이루어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알 중에 동봉될 수 있다.
주사용 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모퍼 EL(Cremophor EL)(상표명)(뉴욕주 파시퍼니에 소재한 바스프사(BASF)) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균이어야 하고, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 중의 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요하다면 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입한 다음, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이들의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 동봉될 수 있거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 마우스워시로서 사용하기 위한 유체 담체를 이용하여 제조될 수 있되, 유체 담체 중의 화합물은 경구로 적용되고, 가글하고 나서, 뱉거나 또는 삼킨다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조 물질은 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 유사한 특성의 임의의 다음의 성분 또는 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질셀룰로스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스; 활택제, 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향.
전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 적절한 침투제가 제형 내에서 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 세정제, 담즙산염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 연고, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
일 실시형태에서, 활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 신체로부터의 빠른 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 분명할 것이다. 상기 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 얻어질 수 있으며, 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대해 단클론성 항체에 의해 감염된 세포에 표적화된 리포좀을 포함)은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이함 및 투약량의 균일함을 위한 투약량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 투약량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 일원화된 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적으로 하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 사전 결정된 활성 화합물의 양을 함유한다. 본 명세서에 개시된 투약량 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료 효과에 의해 그리고 직접적으로 의존하여 지시된다.
본 명세서에 개시된 핵산 분자는 벡터 내로 삽입되고, 유전자 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 다수의 경로, 예를 들어, 미국 특허 제5,703,055호에 기재된 바와 같이 대상체에게 전달될 수 있다. 따라서 전달은 또한, 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여(미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 정위 주사(예를 들어, 문헌[Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057] 참조)를 포함할 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약제학적 제조는 허용 가능한 희석제 중의 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 함입된 서방출 기질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터로부터 무손상으로 생성될 수 있다면, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 명세서에 제시된 개시내용은 특정 방법, 프로토콜 및 시약, 및 본 명세서에 기재된 예이지만, 이들로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 및 예는 단지 특정 실시형태를 설명하는 목적을 위해, 당업자에 대한 가이드를 제공하는 의도 및 목적을 위한 것이며, 본 명세서에 제시된 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 일반적 방법
인간 간 세포
성인 인간 간 조직은 3 내지 23세 이상의 개체로부터 얻었다. 임상 연구 위원회(생명윤리위원회)로부터의 승인에 의해 간 조직을 사용하였다. 인간 간 세포의 단리를 기재한 바와 같이 수행하였다(Sapir et al, (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102: 7964-7969; Meivar-Levy et al, (2007) Hepatology 46: 898-905). 세포를 10% 소태아 혈청, 100 단위/㎖ 페니실린; 100ng/㎖ 스트렙토마이신; 250ng/㎖ 암포테리신 B(이스라엘 베 해먹(Beit Haemek)에 소재한 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries))로 보충한 둘베코 최소 필수 배지(글루코스 1 g/ℓ) 중에서 배양시키고, 5% CO2 및 95% 공기의 습한 분위기에서 37℃에서 유지하였다.
바이러스 감염
본 연구에서 사용되는 아데노바이러스는 다음과 같았다: Ad- CMV - Pdx -1 (Sapir et al, 2005 상기 참조; Meivar-Levy et al, 2007 상기 참조), Ad-RIP- 루시퍼라제(Seijffers et al, (1999) Endocrinology 140: 3311-3317), Ad- CMV -b-Gal, Ad- CMV - MafA(듀크 유니버시티 뉴가드 씨.비.(Newgard, C.B.)로부터의 기증), Ad-CMV-Pax4-IRES-GFP(독일 괴팅겐에 소재한 엘. 데벨로겐 아게(L. DeveloGen AG) 세인트 옹게(St Onge)로부터의 기증), 및 Ad- CMV - Isl1(캐나다 밴쿠버에 소재한 브리티시 콜롬비아 유니버시티 클리에퍼, 티(Kieffer, T.)로부터의 기증). 바이러스 입자를 표준 프로토콜에 의해 생성하였다(He et al, (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95: 2509-2514).
간 세포를 5 내지 6일 동안 재조합 아데노바이러스로 감염시키고 나서(표 1), EGF(20ng/㎖; 이스라엘 사이토랩 엘티디(Cytolab, Ltd.)) 및 니코틴아마이드(10mM; 시그마(Sigma))로 보충하였다. 최적의 감염 다중도(MOI)를 세포 생존도(<75%) 및 C-펩타이드 분비의 유도에 따라 결정하였다. 사용한 바이러스의 MOI는; Ad- CMV - Pdx -1(1000 MOI), Ad- CMV - Pax4 -IRES- GFP(100 MOI), Ad- CMV - MafA(10 MOI) 및 Ad- CMV - Isl1(100 MOI)이다.
RNA 단리, RT 및 RT- PCR 반응
총 RNA를 단리시키고 나서, cDNA를 앞서 기재한 바와 같이 제조 및 증폭시켰다(Ber et al, (2003) J Biol Chem 278: 31950-31957; Sapir et al, (2005) 상기 참조). 상기 기재한 바와 같이 정량적 실시간 RT-PCR을 ABI 단계 1 + 서열 검출 시스템(미국 캘리포니아주에 소재한 Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다(Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) J Biol Chem 284: 33509-33520).
C- 펩타이드 및 인슐린 분비 검출
C-펩타이드 및 인슐린 분비를 기재한 바와 같이 바이러스 치료에 대한 초기 노출 후 6일에 성인 간 세포의 1차 배양물의 정적 인큐베이션에 의해 측정하였다 (Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) 상기 참조). 글루코스-조절 C-펩타이드 분비는 2mM 및 17.5mM 글루코스에서 측정하였는데, 이는 처리한 세포 기능에 대해 유해한 효과를 갖는 일 없이 전환분화된 간 세포로부터 인슐린 분비를 최대로 유도하기 위해 용량-의존적 분석에 의해 결정하였다(Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) 상기 참조). 인간 C-펩타이드 방사면역측정법 키트(미주리주 세인트 찰스에 소재한 링코 리서치(Linco Research); 인간 프로인슐린에 대해 4% 미만의 교차 반응성)를 이용하여 방사면역측정법에 의해 C-펩타이드 분비를 검출하였다. 인간 인슐린 방사면역측정법 키트(DPC, 캘리포니아주 앤젤레스에 소재; 인간 프로인슐린에 대해 32% 교차 반응성)를 이용하여 인슐린 분비를 방사면역측정법에 의해 검출하였다. Bio-Rad 단백질 분석 키트에 의해 측정한 총 세포 단백질에 대해 분비를 정규화시켰다.
루시퍼라제 분석
Ad-RIP- 루시퍼라제(200moi) 및 다양한 아데노바이러스(이하에 기재한 바와 같음)와 함께 인간 간 세포를 공동 감염시켰다. 6일 후, 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가(Promega)) 및 LKB 1250 루미노미터(Luminometer)(핀란드에 소재한 LKB)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 결과를 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 분석 키트(바이오-래드)에 의해 측정된 총 세포 단백질에 대해 정규화시켰다.
면역형광법
다양한 아데노바이러스로 처리한 인간 간 세포를 12-웰 배양물 플레이트(2X105개의 세포/웰)에서 유리 커버 슬라이드 상에 두었다. 3 내지 4일 후에, 세포를 고정시키고 나서, 기재한 바와 같이 염색하였다(Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) 상기 참조). 이 연구에서 사용한 항체는 항-토끼 PDX-1, 항-염소 PDX-1(둘 다 1:1000, C.V. E. Wright로부터 기증), 항-인간 인슐린, 항-인간 소마토스타틴(둘 다 1:100, 덴마크 글로스트럽에 소재한 다코사), 항-Pax4(1:100; 미네소타주 미네아폴리스에 소재한 알앤디 시스템즈(R&D Systems)), 항-MafA(1:160; 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재한 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.))이다. 사용한 2차 항체는 항-토끼 IgG 사이아닌(cy2) 컨쥬게이팅된 항체 1:250, 항-토끼 IgG 인도카보사이아닌(cy3) 컨쥬게이팅된 항체 1:250, 항-염소 IgG 사이아닌 (cy2) 컨쥬게이팅된 항체 1:200, 항-염소 IgG 인도카보사이아닌(cy3) 컨쥬게이팅된 항체 1:250, 및 항-마우스 IgG 인도카보사이아닌(cy3) 컨쥬게이팅된 항체 1:250(모두 펜실베니아주 잭슨 이뮤노리서치사(Jackson I㎜unoResearch)로부터)이다. 최종적으로, 세포를 4',6-다이아미디노-2-페닐-인돌(DAPI, 시그마)로 염색하였다. 슬라이드를 영상화하고 나서, 형광현미경(프로비스(Provis), 올림푸스(Olympus))을 이용하여 분석하였다.
순도 분석
유세포 분석 기반 분석은 확장 및 전환분화 동안 세포의 90% 초과가 간충직 줄기 세포(MSC) 유사 표현형을 가진다는 것을 보장하기 위해 원칙적 순도 분석으로서 개발하였다. 배양시킨 MSC는 CD73, CD90, CD105 및 CD44에 대해 양성인 균주이어야 하며, CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD19 또는 CD79α, 및 HLA-DR 표면 분자에 대해 음성이어야 한다.
도 44a 및 도 44b에 나타낸 바와 같이, 확장된 간 세포 및 감염된 세포는 고수준에서 CD90, CD44, CD105 및 CD73 마커(≥90%)를 발현시켰지만, 그들은 계통 음성 마커(CD34, CD11b, CD45, CD19 및 HLA-DR의 칵테일)을 발현시키지 않는다. 지금까지, CD105 발현은 P14에서의 비감염 세포에 비해 P16에서의 감염 세포에서 약간 감소되었다. 이 감소가 유의한지 여부 그리고 그것이 계대 수에 따라 또는 전환분화에 따라 감소되는지 여부를 이해하기 위해, 추가적인 실험이 필요하다. 이들 결과는 MSC 마커가 시간에 따라 그리고 간 세포의 전환분화 동안 안정하다는 것을 입증한다. MSC 마커에 대한 유세포분석은 사실 QC 검사로서 사용될 수 있다.
다음 단계는 다양한 외인성 전사 인자 및 이상적으로는 인슐린 또는 C-펩타이드를 발현 또는 공동 발현시키는 부분집단을 정량화하기 위해 유세포분석 또는 면역형광법 분석을 개발하는 것일 것이다.
통계학적 분석
크기가 다른 분산을 추정하는 2-샘플 스튜던트 t-검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
실시예 2: PDX -1-유도 전환분화
이전의 연구(Sapir et al, (2005) 상기 참조; Meivar-Levy et al, (2007) 상기 참조; Aviv et al, (2009) 상기 참조; Gefen-Halevi et al, (2010) Cell Reprogram 12: 655-664; Meivar-Levy et al, (2011) J Transplant 2011: 252387)는 PDX-1 단독이, 가능하게는 간에서 수많은 다르게는 침묵인 내인성 pTF를 활성화시키는 그의 능력에 기인하여 인간 간 세포에서 β-세포 유사 표현형 및 기능을 유도할 수 있다는 것을 시사하였다. 췌장 계통의 활성화는 빠르며, 5일 내에 일어났다(Sapir et al, (2005) 상기 참조, Ber et al, (2003) 상기 참조)
이 예에서, PDX-1 유도 간의 췌장 전환분화를 매개하는 사건 순서를 시험한다. Pdx-1을 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 성인 인간 간 세포에 도입하였고, 이소성 PDX-1 발현의 효과를 감염 후 4연속일 동안 모니터링하였다(2일 내지 5일; 도 1A 내지 도 1D). 췌장 호르몬 및 췌장-특이적 전사 인자 발현을 5일 동안 매일 정량적 RT-PCR 분석에 의해 결정하였다. 결과를 동일한 cDNA 샘플 내에서 β-액틴 유전자 발현에 대해 정규화시키고, 동일한 날에 상대적 발현 대 대조군 바이러스(Ad-CMV-β-gal, 1000 MOI) 처리 세포의 평균 ± SE로서 제시한다. 두 독립적 실험을 수행하였다, n ≥ 4, *p < 0.05 및 ** p < 0.01.
Ad- Pdx -1 감염 후 1일 내에, 글루카곤과 소마토스타틴 유전자를 둘 다 즉시 활성화시켰다(도 1B 및 도 1C). 그러나, 인슐린 발현을 단지 감염 후 제4일 내지 제5일에 검출하였다(도 1A). 3가지 주요 췌장 호르몬의 별개의 일시적 활성화를 위한 메커니즘 설명을 제공하기 위해, 내인성으로 활성화된 전사 인자의 발현 수준을 전환분화 공정 동안 분석하였다. 초기 췌장 내분비 전사 인자, NGN3 및 NEUROD1을 즉시 활성화시켰다(도 1D). 그러나, β-세포 특이적 TF, 예컨대 NKX6.1 및 MafA는 이소성 PDX-1 발현에 반응하여 단지 점진적으로 그리고 적당하게 활성화되어, 각각 제4일 및 제5일에 그들의 최대 발현 수준에 도달되었다. 제5일에 인슐린 유전자 발현의 활성화는 MafA 발현의 증가뿐만 아니라 Isl1 발현의 감소와 관련되었다(도 1D). 이들 데이터는 췌장 계통에 따른 인간 간 세포의 전환분화가, 빠름에도 불구하고, 점진적이고 연속적인 공정이라는 것을 시사한다. 췌장 호르몬 유전자 발현(예컨대 소마토스타틴 및 글루카곤)의 별개의 일시적 활성화는 내인성으로 활성화된 pTF 발현의 시간 과정 및 상대적 수준에 부분적으로 기인할 수 있다.
실시예 3: PDX -1, PAX4 및 MAFA의 조합된 발현은 췌장 전환분화에 대한 간의 효율을 증가시킨다
이전의 연구는 몇몇 pTF의 협력된 발현이 개개 pTF에 의해 유도된 것에 비해 β-세포 계통에 따른 전환분화 효율(Kaneto et al, (2005) Diabetes 54: 1009-1022; Tang et al, (2006) Lab Invest. 86: 829-841; Song et al, (2007) Biochem Biophys Res Co㎜un. 354: 334-339; Wang et al, (2007) Mol Ther 15: 255-263; Gefen-Halevi et al, (2010) 상기 참조)뿐만 아니라 다른 계통에 따른 전환분화 효율을 증가시킨다는 것을 시사하였다. 본 명세서에 기재된 1차 성인 인간 간 세포의 실험 시스템에서 이 개념을 분석하기 위해, 췌장 전환분화에 대해 간 상의 3가지 주요 pTF의 개개 및 공동의 기여를 연구하였다. 췌장 기관 형성에서 상이한 단계를 매개하는 PDX-1, Pax4 및 MafA를 재조합 아데노바이러스를 이용하여 성인 인간 간 세포의 1차 배양물에서 이소성으로 공동발현시켰다. 배양시킨 성인 인간 간 세포를 단독으로 또는 협력하여 또는 대조군 바이러스(Ad- CMV -β-gal, 1000 MOI)와 함께 Ad-CMV-Pdx-1(1000 MOI), Ad- CMV - Pax -4(100 MOI) 및 Ad- CMV - MafA(10 MOI)로 감염시키고, 췌장 분화 마커를 6일 후에 시험하였다. 감염된 세포 생존도에 대한 최소 유해 효과에 의해 관련된 최대 재프로그래밍 효율을 초래하도록 각각의 인자의 감염다중도(MOI)를 적정하였다. PDX-1을 배양물 내 세포의 70%에서 발현시키고 나서, 모두 3가지 pTF의 공동 발현은 PDX-1 양성 세포의 46.8%에서 분명하였다(도 2A). 매우 소수의 세포는 단지 Pax-4에 대해 또는 MafA에 대해 양성으로 염색되었다. 모두 3가지의 pTF에 대해 양성으로 염색된 세포는 화살표로 표시된다(도 2A, 우측 패널). 도 2B에서, 간 세포를 조합된 pTF와 함께 그리고 Ad-RIP-LUC(200 moi)와 함께 공동 감염시키고 나서, 인슐린 프로모터의 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
3가지 pTF의 조합된 발현은 각각의 pTF 단독에 의해 유도되는 것에 비해 인슐린 프로모터 활성화의 실질적인 증가(도 2B), (프로)인슐린 생성 세포 수의 3배 증가(도 2C) 및 글루코스 조절된 (프로)인슐린 분비의 30 내지 60% 증가(도 2D)를 초래하였다. 종합하면, 이들 결과는 3가지 pTF의 조합은 전환분화 효율을 증가시킨다는 것을 시사하며, 또한 각각의 인자가 그의 능력이 제한되거나 또는 최대 전환분화를 개개로 촉진시키기에 불충분하다는 것을 나타낸다(Kaneto et al, (2005) 상기 참조; Tang et al, (2006) 상기 참조; Zhou et al, (2008) Nature 455: 627-632).
실시예 4: 전환분화된 세포의 세포를 생성하는 상이한 호르몬으로 성숙 및 분리는 층위 방식으로 일시적으로 제어된다
이 실시예에서, 3가지 pTF의 조합된 이소성 발현에 의한 증가된 전환분화 효율이 또한 상기 제시한 바와 같이 일시적으로 제어되는지의 여부를 결정하기 위해 이소성 pTF 발현을 일시적으로 제어하는 것의 영향을 연구하였다(도 2A 내지 도 2D). 췌장 전환분화에서 어떤 역할을 하는 일시적 제어를 지지하여, 3가지 pTF, 즉, Pdx-1, Pax4 및 MafA는 췌장 기관 형성 동안 별개의 일시적 발현 및 기능을 나타낸다.
3가지 pTF, 즉, PDX-1, Pax4 및 MafA를 순차적으로 또는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 성인 인간 간세포의 1차 배양물과 협력하여 도입하였다. 아데노바이러스-매개 이소성 유전자 발현은 감염 후 17시간에 최대이다(Varda-Bloom et al, (2001) 유전자 Ther 8: 819-827). 따라서, pTF를 3연속일 동안 순차적으로 투여하여(실시예 1에서 바이러스 감염 참조), 그들의 개개 효과의 나타남을 허용하였다. 표 1에 나타낸 바와 같은 스케줄에 따라 세포를 감염시켰다.
처리 순서 제1일 제2일 제3일 제4일 제5일 제6일
A Ad-β-gal (대조군) 채취
B Ad-Pdx-1 +
Ad-Pax4 +
Ad-MafA		 채취
C Ad-Pdx-1 Ad-Pax4 Ad-MafA 채취
D Ad-MafA Ad-Pax4 Ad-Pdx-1 채취
E Ad-Pdx1 Ad-MafA Ad-Pax4 채취
세포를 3가지 상이한 순서로 3일에 걸쳐 1일당 하나의 pTF 아데노바이러스 작제물로 순차적으로 감염시켰다: 직접적 층위 순서(처리 C=Pdx-1Pax4→MafA), 반대 순서(처리 D=MafAPax4Pdx-1)로, 그리고 무작위 순서(처리 E=Pdx-1MafAPax4)로. 전환분화 효율에 대한 그리고 β-세포-유사 성숙에 대한 순차적 pTF 투여의 효과를 제1일에 모두 3가지 pTF의 협력된 또는 동시 투여 효과에(처리 B= Pdx-1+Pax4+MafA) 그리고 대조군 바이러스의 유사한 MOI에(처리 A =β-gal)에 비교하였다(표 1 및 도 3A). 구체적으로, 배양한 성인 인간 간 세포를 도 3A 및 표 1(처리 B 내지 E)에 요약한 바와 같이 함께 또는 순차적 방식으로 또는 대조군 바이러스(Ad- CMV -β-gal, 1000 moi, 처리 A)와 함께 Ad- CMV - Pdx -1(1000 MOI), Ad- CMV -Pax-4(100 MOI) 및 Ad - CMV - MafA(10 MOI)로 감염시켰고, 6일 이후에 그들의 췌장 분화에 대해 분석하였다.
인슐린 프로모터 활성(도 4A), 인슐린 생성 세포의 백분율(도 3B) 및 글루코스-조절 (프로)인슐린 분비(도 3C)를 순차적으로 투여된 pTF의 순서에 의해 영향 받지 않았다. 흥미롭게도, 무작위 순서로 순차적인 pTF 투여(처리 E= Pdx-1MafA→Pax4)는 증가된 인슐린 프로모터 활성을 초래하였지만, 인슐린 분비의 글루코스 조절 상실 및 감소된 글루코스 수송체 2(GLUT-2) 발현과 관련되었다(도 3B, 도 3C 및 도 4B). Pax4 및 MafA 투여 순서의 변화 시 글루코스 감지 능력의 상실은 β-세포-유사 성숙에 대한 발현된 pTF 서열의 잠재적 효과를 시사하였지만, 전환분화 과정의 효율에 대해서는 그렇지 않다.
실시예 5: PDX -1, PAX4 및 MAFA의 층위 투여는 전환분화된 세포의 β-유사 세포로의 성숙을 촉진시킨다
이전의 연구는 증가된 전환분화 효율이 β-세포 계통을 따라 향상된 성숙과 관련되는 정도 및 조건을 결정하기 위해 추가적인 연구를 권장하였다. 성숙 β-세포의 특징적 특징은 프로인슐린을 가공하고 그것을 글루코스 조절 방식으로 분비하는 능력이다(Eberhard et al, (2009) Curr Opin Genet Dev 19: 469-475; Borowiak, (2010) Rev Diabet Stud 7: 93-104). pTF 발현에서의 일시적 변화가 β-세포 계통을 따라 전환분화된 세포 성숙에 별도로 영향을 미치는지의 여부를 분석하기 위해, 프로인슐린 가공 및 글루코스-조절 c-펩타이드 분비에 대한 별도의 처리 A 내지 E(표 1 및 도 3A)의 효과를 분석하였다.
사실, pTF의 직접적 층위 투여(처리 C) 만이 생리적 글루코스 용량 반응 특징을 나타낸 가공된 인슐린 및 그의 글루코스 조절 분비의 확연한 생성을 초래하였다(도 3C 및 도 5A). 새로 획득된 표현형 및 기능은 시험관내에서 4주까지 동안 글루코스-조절 방식에서 c-펩타이드를 분비하는 능력에 의해 입증되는 바와 같이 안정하였다(도 5A 및 도 5B).
직접적 층위 pTF 투여 시에만 증가된 프로호르몬 가공(처리 C)은 PCSK2 및 GLUT2 유전자 발현에서 확연한 증가와 관련되는데, 이는 각각 프로호르몬 가공 및 글루코스 감지 능력에서 어떤 역할을 한다(도 3A 내지 도 3E 및 도 4A 내지 도 4C). 이들 데이터는 β-세포 계통에 따라 전환분화된 간 세포의 성숙 및 기능을 촉진시킴에 있어서 pTF의 순차적이고 직접적인 층위 발현을 위한 필연적인 역할을 시사한다. 간접적 층위 방식(처리 D 및 E)에서 협력된(처리 B) 그리고 순차적 TF 투여는 둘 다 성숙 β-세포-유사 특징을 나타내는 전환분화된 세포를 생성하지 못하였다.
성숙의 β-세포-유사 상태에서 변화에 대한 메커니즘 설명을 제공하기 위해, 별개의 일시적 처리(B 내지 E) 하에서 내인성으로 활성화된 pTF의 레퍼토리를 분석하였다. 모든 처리(B 내지 E)는 수많은 내인성 pTF(도 3E), 예컨대 NEUROG3, NEUROD1, NKX6.1 및 NKX2.2의 증가된 발현을 초래하였다. 그러나, "성숙"(처리 C)과 "미성숙" 표현형(처리 B, E 및 D) 사이의 가장 강한 차이는 내인성 Isl1 유전자 발현의 수준에서 나타났다. 따라서, 직접적 층위 pTF 투여(처리 C)에 의해 유도된 β-세포 계통을 따라 가장 향상된 성숙은 내인성 Isl1 발현의 극적인 감소와 상관 관계가 있다(도 3E, 화살표). 종합하면, 이들 데이터는 β 세포로의 전환분화된 세포의 성숙이 특정 pTF의 상대적 및 일시적 발현 수준에 의해 영향받을 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6: PDX -1, PAX4 및 MAFA의 층위 투여는 β-유사 세포와 δ-유사 세포 사이의 전환분화 세포의 분리를 촉진시킨다
처리 C로부터의 MafA의 제외(표 1)는 Isl-1(도 6D)과 소마토스타틴 유전자 발현(도 8D)을 둘 다 유도하였다. MafA 제외 시 Isl-1 증가 발현이 정말로 증가된 소마토스타틴 유전자 발현을 야기하는지의 여부를 분석하기 위해, Ad-CMV-Isl-1을 제3일에 MafA와 함께 첨가하였다(처리 C, 표 1). 정말로, Isl-1은 소마토스타틴 유전자 발현을 증가시켰다(도 6E). 이소성 Isl-1 발현(C+Isl-1)은 또한 증가된 소마토스타틴 단백질 생성(도 6F) 및 인슐린 생성 세포에서 그의 공동 생성(도 9, 하부 패널)을 야기하였는데, 이는 낮은 Isl-1 발현에 의해 관련된 높은 MafA 발현이 인슐린과 소마토스타틴 생성 세포 사이의 분리에 중요하다는 것을 시사한다.
실시예 7: 간의 췌장 전환분화에 대한 PDX -1, PAX4 및 MAFA의 개개 기여의 분석
전환분화 과정의 순차적 특징을 기능 연구의 일시적 획득에 의해 동정하였다. 층위 발생 과정에 대한 각각의 전사 인자, 즉, Pdx-1, Pax4 및 MafA의 별개의 기여의 추가적인 분석을 상대적 및 일시적 "감소된 기능" 접근에 의해 수행하였다. 성인 인간 간 세포를 직접적인 일시적 및 순차적 재프로그래밍 프로토콜에 의해 처리하였고(처리 C), 이소성 pTF 중 하나를 생략하였다. 생략한 pTF를 유사한 감염 다중도에서 β-gal 발현을 운반하는 대조군 아데노바이러스로 대체하였다. 구체적으로, 성인 인간 간 세포를 직접적인 "층위" 순차적 감염 순서에 의해 처리하였다(처리 C, 도 3A 및 표 1). 하나의 단일 전사 인자(pTF)를 한 번에 생략하고 나서, Ad-CMV-β-gal의 동일한 moi로 대체하였다. Pdx-1 생략은 (C-Pdx-1)로서 나타내고, Pax4 생략은 (C-Pax4)로서 나타내며, MafA 생략은 (C-MafA)로서 나타낸다.
각각의 pTF 발현을 별개로 생략하는 것의 기능적 결과를 분자 및 기능성 수준에서 분석하였다(도 6A 내지 도 6D). 별개의 Pdx-1 및 MafA 생략(각각 C-Pdx-1 및 C-MafA)은 감소된 인슐린 프로모터 활성화(도 6A), 가공된 인슐린 분비의 흡열 글루코스 반응(도 6B) 및 감소된 GLUT2 및 GK 발현을 초래하였다(도 6C). MafA의 제외는 프로호르몬 전환효소인 PCSK2의 감소된 발현과 관련되었다(도 6C). 반면에, Pax4의 제외(C-Pax4)는 인슐린 프로모터 활성화에 상당하게 영향을 미치지 않았고, 글루코스-조절 C-펩타이드 분비에도 영향을 미치지 않았다. Pax-4 생략은 감소된 GLUT2 및 PCSK2 발현과 관련되었는데(도 6C), 이는 가능하게는 GK의 발현이 호르몬 분비의 글루코스 제어 능력을 얻기에 충분하다는 것을 시사한다.
내인성으로 활성화된 pTF 발현의 레퍼토리에 대한 일시적 및 별개의 pTF 제외 결과의 분석을 이들 개발 중인 변경을 설명하기 위해 수행하였다. Pdx-1 및 Pax4 제외는 대부분의 다른 pTF(NeuroG3, NKX2.2, NKX6.2 및 Pax6을 포함)의 발현에서 현저한 감소를 야기하였는데, 이는 증가하는 전환분화 효율에 대한 그들의 잠재적 기여가 내인성 췌장 TF를 활성화시키는 그들의 능력과 관련된다는 것을 시사한다(도 6D). 반면에, MafA의 제외는 내인성 pTF 발현의 추가적인 활성화에 기여하지 않는데, 이는 가능하게는 췌장 β-세포에서만의 그의 늦은 그리고 제한된 발현을 반영한다. 대조적으로, 증가된 인슐린 프로모터 활성, 프로호르몬 가공 및 그의 글루코스-조절 분비에 대한 MafA 기여는 감소된 단지 Isl-1 발현과 관련되었다(도 6D). 이들 데이터는 MafA가 내인성 pTF 발현 효율 및 간의 췌장 전환분화를 추가로 촉진시킴에 있어서 연루되지 않지만, 오히려 전환분화된 세포 성숙에 연루된다는 것을 시사할 수 있다.
실시예 8: ISL-1은 전환분화된 세포의 β 세포 계통으로의 성숙을 방지한다
β-세포-유사 성숙에 대한 MafA의 효과는 Isl1 발현을 억제하는 그의 능력과 부분적으로 관련될 수 있다. 이 가설을 시험하기 위해, 이소성 Isl1을 전환분화된 세포 내 아데노바이러스 감염(Ad- Isl1)에 의해 도입하였다. 간략하게, 성인 인간 간 세포를 직접적 "층위" 순차적 감염 순서에 의해 처리하였고(처리 C), 제3일에 Ad-Isl1(1 또는 100 MOI)로 보충하였다(C+Isl1).
상기 나타낸 바와 같이, 직접적 층위 방식에서 3가지 pTF의 순차적 투여(처리 C)는 증가된 전환분화 효율과 β-세포 계통에 따라 새로 생산된 세포의 성숙을 둘 다 초래하였다. Isl1은 제3일에 MafA와 함께 공동으로 투여하였다(C+Isl1). 사실, 이종성 프로모터의 제어 하에 제3일에 Isl1 과발현은 인슐린 유전자 발현의 실질적인 감소 및 글루코스 조절된 (프로)인슐린 분비의 제거를 초래하였다(도 7A 내지 도 7C). 글루코스-감지 능력의 상실은 감소된 GLUT2 발현과 관련되었다(도 7C). 이들 결과는 전환분화 프로토콜의 최종 단계에서 탈조절된 Isl1 발현이 β 세포 계통을 따라 잠재적으로 성숙을 방해하고, 낮은 MafA 발현 하에서 제거된 성숙을 부분적 설명할 수 있다는 것을 시사한다.
종합하면, 이들 데이터는 β 세포 계통을 따라 전환분화된 간세포 성숙을 촉진시킴에 있어서 pTF의 직접적 층위 발현을 위한 중요한 의무적인 역할을 시사한다. 게다가, 순차적 연구 과정은 췌장 β 세포 계통을 따라 전환분화된 세포 성숙을 촉진 또는 방해할 수 있는 pTF의 활성화와 억제 둘 다와 관련된다.
실시예 9: PDX -1, PAX4 및 MAFA 층위 투여는 글루카곤 및 소마토스타틴 발현을 유도한다
내분비 췌장 계통에 따른 전환분화는 수많은 췌장 호르몬 발현의 활성화를 초래한다. 이들 호르몬 발현 수준이 pTF의 일시적 조작에 의해 영향 받는 정도를 또한 연구하였다. 췌장 호르몬 글루카곤(GCG)의 유전자 발현(도 8A 및 도 8B), 소마토스타틴(SST)(도 8A, 도 8D, 및 도 8E) 또는 세포 특이적 전사 인자(도 8C)를 표시된 처리 후 정량적 실시간 PCR 분석에 의해 결정하였다.
글루카곤(GCG)과 소마토스타틴(SST) 유전자 둘 다의 전사를 주로 Pdx-1 및 MafA에 의해, 그리고 Pax4에 의한 더 낮은 정도로 각각 개별적으로 발현되는 pTF에 의해 유도하였다(도 8A). 글루카곤 유전자 전사에서 추가적인 증가는 pTF의 직접적 층위 투여 시에만 발생하였다(도 4A, 처리 C 참조). Pdx-1 및 MafA는 α-세포 특이적 전사 인자 ARX 및 BRAIN4 또는 ARX 단독 각각의 활성화와 관련된 과정에서 글루카곤 발현에 대한 그들의 효과를 발휘하였다(도 8C). 일시적 프로토콜이 이소성 Pax4 발현(E=Pdx-1MafA→Pax4)에 의해 끝날 때 대부분의 처리에 의해 영향받지 않고 남아있는 소마토스타틴 유전자 발현(도 8A 및 도 8D)은 증가되었다. 이 순차적인 프로토콜은 또한 글루코스-조절 (프로)인슐린 분비에 대한 악화된 효과를 나타내었고, 증가된 Isl1 내인성 발현에 의해 관련되었다(도 3C 및 도 3E). β 세포 계통을 따라 제거된 성숙은 증가된 소마토스타틴 유전자 발현 및 증가된 수의 소마토스타틴 양성 세포와 관련되었다(도 8F). 다수의 세포는 소마토스타틴 및 인슐린 공동 국소화를 나타내었다(데이터 미제시).
실시예 6에 논의한 바와 같은 층위 투여로부터의 각각의 pTF의 제외(처리 C)를 또한 글루카곤 및 소마토스타틴 발현에서 개개 pTF의 역할을 추가로 연구하는 데 시용하였다(도 8B 및 도 8D). Pax4 제외는 소마토스타틴 유전자 발현을 실질적으로 감소시켰는데, 이는 이 유전자의 전사를 유도함에 있어서 그의 잠재적인 역할을 시사한다(도 8D). 흥미롭게도, 개발 중인 과정의 마지막에 MafA 제외는 또한 소마토스타틴 유전자 발현을 실질적으로 증가시켰는데, 이는 소마토스타틴 유전자 발현에 대한 MafA의 잠재적 저해 효과를 시사한다. 이 효과는 또한 Isl1 발현을 억제하는 MafA의 능력에 기인할 수 있었다. 이 가설을 처리하기 위해, 소마토스타틴 유전자 발현에 대한 이소성 Isl1의 효과를 분석하였다. 사실, MafA와 함께 제3일에 Ad- Isl1 투여(C+Isl1)는 소마토스타틴 유전자 발현을 증가시켰지만(도 8E), 인슐린 유전자 발현, 호르몬 생성 및 분비를 감소시켰다(도 8A, 도 8B 및 도 7A 내지 도 7C). 이들 실험 조건 하에서, 40%의 인슐린 생성 세포는 소마토스타틴 단독을 발현시키는 매우 소수의 세포와 함께 소마토스타틴에 대해 양성으로 염색되었다.
이들 결과는 β-세포에 대한 전환분화된 세포의 부분적인 성숙은 전환분화 과정의 후기 단계에서 MafA 발현에 기인한다는 것을 시사한다. 이 단계에서, MafA는 Isl1 발현을 저해하기 위한 그의 능력과 관련된 과정에서 소마토스타틴 발현을 제한한다.
도 9는 췌장 전사 인자 유도 간의 췌장 전환분화로의 제안된 메커니즘을 나타낸다. 각각의 pTF는 제한된 수의 인간 간 세포에서 보통의 β-세포-유사 표현형을 활성화시킬 수 있다. pTF의 협력된 발현은 간의 내분비 췌장으로의 전환분화를 현저하게 증가시킨다. 그러나 새로 생산된 세포는 미성숙이며, 인슐린과 소마토스타틴을 둘 다 공동발현시킨다. 직접적 층위 방식에서 동일한 인자의 순차적 투여만이 β-세포 계통을 따라 전환분화 효율과 또한 전환분화된 세포 성숙을 둘 다 증가시킨다.
실시예 10: 생체내 전환분화 능력에 의한 세포 집단의 동정
전환분화 능력을 지니는 세포 집단을 마우스에서 생체내에서 동정하였다. Pdx-1 유전자의 이소성 발현을 마우스 간에서 달성하였다. 간 세포의 약 40 내지 50%에서 이소성 Pdx-1 유전자의 균일한 발현에도 불구하고(도 10A)(Ferber et al., (2000) Nat Med 6: 568-572, 및 Ber et al., (2003) 상기 참조), 생체내에서 Pdx-1-처리 마우스의 인슐린-생성 세포(IPC)는 중심정맥에 가깝게 주로 위치되는데(도 10B), 이는 활성 Wnt 신호전달 및 글루타민 합성효소(GS)의 발현을 특징으로 한다(도 1C). Pdx-1에 의한 GS 발현 및 인슐린 활성화의 공동 국소화는 또한 GSRE를 활성화할 수 있는 해당 세포가 증가된 전환분화 능력에 대한 경향을 가진다는 것을 나타내었다. 따라서, 전환분화의 경향이 있는 세포 집단은 또한 GSRE 활성화 또는 활성 Wnt-신호전달 경로에 의해 동정될 수 있다.
실시예 11: 전환분화의 경향이 있는 인간 간세포를 동정하기 위한 아데노바이러스의 이용
본 실시예는 전환분화의 경향이 있는 인간 간 세포를 동정하기 위한 재조합 아데노바이러스의 사용을 입증하는 실시예이다. 배양물 내 인간 간 세포는 세포내 Wnt 신호전달 경로의 활성화 및 GS 발현에 대해 이종성이다. GS는 주심 간 세포에서 독특하게 발현되기 때문에, 따라서 GSRE(GS 조절 요소)를 활성화시키는 능력을 적절한 세포 단리의 선택적 매개변수로서 사용할 수 있다.
추가로 GSRE는 또한 STAT3 결합 요소를 함유하기 때문에, 전환분화에 대한 세포의 경향은 이 요소에 의해 매개될 수 있었다. STAT3 경로는 재프로그래밍 또는 전환분화 경향을 지니는 세포를 기증하는 데 수반될 수 있었다(도 10A 내지 도 10D, 도 11, 도 14A 내지 도 14E 및 도 19).
실시예 12: GSRE는 배양물 내 인간 간세포의 13 내지 15%를 반복적으로 표적화한다 .
GSRE는 TCF/LEF 및 STAT5 결합 요소를 포함한다(도 11). 최소 TK 프로모터에 작동 가능하게 연결된 GSRE의 제어 하에서 eGFP 유전자 또는 Pdx-1 유전자의 발현을 운반하는 두 재조합 아데노바이러스(도 11)를 생성하였다. 이들 아데노바이러스는 Pdx-1(도 12A) 또는 eGFP(도 12B) 중 하나의 발현을 유도하였다. 단백질은 둘 다 배양물 중의 인간 간 세포의 약 13 내지 15%에서 반복적으로 발현되었는데, 이는 간 세포의 특정 집단의 표적화를 시사한다.
실시예 13: GSRE 유도 PDX -1은 간세포에서 인슐린 생성을 활성화시킴에 있어서 CMV 유도 PDX-1보다 더 효율적이다.
GSRE의 반복적 발현은 PDX-1을 유도하였지만, 배양물 내 세포의 약 13±2%만이, 세포의 60 내지 80%에서 Pdx-1 발현을 유도한 Ad- CMV - Pdx -1에 의해 유도된 것과 유사한 또는 더 높은 전환분화 능력을 나타내었다(도 13A 내지 도 13C). GSRE-활성화 세포는 배양물 내 전체 성인 인간 간 세포의 대부분의 전환분화 능력을 설명할 수 있었다. 인슐린 생성은 Ad- CMV - Pdx -1 처리 세포의 1%에 비해 Ad- GSRE - Pdx -1 처리 시 Pdx-1 양성 세포의 25%에서 일어났다.
실시예 14: EGFP에 의해 GSRE + 세포를 영구적으로 표지하기 위한 렌티바이러 스의 이용
렌티바이러스 작제물을 이용하여 영구적인 계통 추적을 수행하였다. GSRE 활성에 대한 시험관내 계통 추적을 케라틴세포 내 KRT5 또는 간 세포 내 알부민 발현을 추적하기 위해 최근에 사용한 변형된 이중 렌티바이러스에 의해 수행하였다. 이 렌티바이러스 시스템(프랑스 파리에 소재한 피에르 마리 퀴리 유니버시티로부터의 피. 라바사드(P. Ravassard) 교수와의 협작; 도 12A)은 GSRE 및 최소 TK 프로모터(독일의 구니츠(Gaunitz) 교소에 의해 기증됨, 도 3A)의 제어 하에 Cre 재조합효소의 발현을 운반하는 CMV - loxP - DsRed2 - loxP - eGFP (R/G) 리포터 및 추가적인 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 따라서, GSRE-활성화 세포는 eGFP(eGFP+)에 의해 비가역적으로 표시하고, 이중 감염된 세포의 나머지는 DsRed2(DsRed2+)로 표시한다. 세포의 10 내지 14%는 10일 미만 내에 eGFP+가 되었다(도 14B). 세포를 세포 분류기에 의해 분리하고(도 14A 내지 도 14E), 별도로 증식시켰다(도 15A). eGFP+(GSRE 활성체) 및 DsRed2+ 세포의 배양물을 10명의 상이한 인간 공여체로부터 생성하였다(3 내지 60세).
실시예 15: EGFP + 세포는 지속적으로 더 우수한 전환분화 능력을 나타내었다
GSRE 활성에 따른 계통 추적에 의해 분리한 인간 간 세포를 효율적으로 증식시키고(도 15A) 재조합 아데노바이러스에 의해 유사하게 효율적으로 감염시켰다. eGFP+ 세포는 인슐린 및 글루카곤 유전자 발현에 의해 나타난 우수한 전환분화 능력(도 16A 내지 도 16C)을 지속적으로 나타내었는데, 이는 배양물 내 인간 췌장섬(도 16A), 글루코스 조절된 인슐린 분비(도 16B) 및 글루코스 조절된 C-펩타이드 분비(도 16C)와 유사하였다. 이들 능력은 지속적이었으며, 광범위한 세포 증식 시 감소되지 않았다(도 17).
실시예 16: 전환분화 경향을 갖는 세포의 특성규명
인간 간 세포의 별개의 전환분화 효율에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 인자를 동정하기 위해, 마이크로어레이 칩 분석을 이용하여 두 분리된 집단의 전반적인 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. 인간 간세포 배양물은 3명의 상이한 공여체로부터 유래되었고, eGFP+ 및 DsRed2+ 세포로 분리되었으며 4회 계대 동안 증식시켰다. 추출한 RNA를 cDNA로 전환하고 나서, 일반적인 인간 어레이(유전자칩 인간 게놈 U133A 2.0 어레이, 애피메트릭스(Affymetrix))를 이용하여 마이크로어레이 칩 분석을 실시하였다. 대부분의 유전자는 분리된 그룹에서 비슷한 수준으로 발현되었지만, 약 800개의 프로브의 발현은 상당히 상이하였다(도 18). 마이크로어레이 칩 분석에 따르면, 막 단백질에 대한 약 100개의 유전자 암호는 전환분화 경향(eGFP+)과 비반응(DsRed2+) 세포 사이에서 차별적으로 발현된다. 몇몇 이들 마커를 표 2A 및 표 2B에 제시한다.
(표 2A)
Figure pct00009
(표 2B)
Figure pct00010
도 47은 표 2B에서 제시된 세포 표면 분자의 상대적 발현을 나타낸다. 구체화된 분자의 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 검사하고 나서, 베타-액틴 발현에 대해 정규화시켰다. 마이크로어레이 데이터는 eGFP+와 DsRed2+ 세포 사이의 차별적 발현(배수= DsRed2+에 비교하여 eGFP+ 차별적 발현(log 2)인 수많은 막 단백질을 제안하였다. 모든 제시 항원은 상업적으로 입수 가능한 항체를 가진다.
실시예 17: WNT 신호전달은 전환분화의 경향이 있는 세포에서 활성이다
간 대상분포는 활성화된 β-카테닌 수준의 구배에 의해 제어될 것이 시사된 반면; 간에서 대부분의 세포는 매우 낮은 β-카테닌 활성을 함유하고, 주심 간 세포는 활성 Wnt 신호전달과 관련된 높은 β-카테닌 활성을 발현시킨다. Wnt 신호전달은 적격 β 세포 활성에 대해 필연적이기 때문에, 간에서의 pTF-유도 췌장 계통 활성화는 활성 Wnt 신호전달을 선험적으로 나타내는 세포로 제한된다.
GSRE는 GS의 5' 인핸서로부터 단리된 TCF 조절 요소를 이용하였다. Pdx-1-유도 간의 췌장으로의 전환분화가 세포내 Wnt 신호전달 경로에 의해 부분적으로 매개된다면, Wnt 신호전달 경로를 조절하는 인자는 또한 전환분화 효율에 영향을 미칠 수 있다(도 19).
성인 인간 간 세포에서 이 데이터는 증가된 농도의 Wnt3a가 Pdx-1-유도 글루코스-조절 인슐린 분비를 증가시켰지만, DKK3(Wnt 신호전달 경로의 저해제)은 공정 상에서 Pdx-1의 효과를 완전히 제거하였다는 것을 시사한다(도 19). DKK3은 또한 GSRE를 활성화시키는 그들의 능력에 따라 단리된 eGFP 세포의 전환분화 능력을 전체적으로 제거하였다(도 20).
eGFP+ 및 DsRed+ 세포 집단에서 Wnt 신호전달 경로 활성의 특성규명을 수행하였다. β-카테닌 탈안정화에 참여하고, 따라서 Wnt 신호전달을 감소시키는 APC 발현은 eGFP+ 세포에서보다 DsRed2+ 세포에서 700% 더 높았다(도 21A, 생체내에 나타낸 대상분포와 상대적으로 일치되게). eGFP+ 집단은 DsRed2+ 세포에서 분석된 수준에 비해 활성화된 β-카테닌 수준(40%)이 증가되었다(도 21B 및 도 21C). 이들 데이터는 Wnt 신호전달이 GSRE 활성화에 적격이고 전환분화 경향을 갖는 세포에서 활성이라는 것을 입증한다.
실시예 18: PAX4 및 NEUROD1에 의해 유도된 전환분화 효율의 비교
목적
본 연구의 목적은 Ad-PDX-1에 의해 유도되는 전환분화 공정을 촉진함에 있어서 PAX4와 NeuroD1 아데노바이러스(Ad-PAX4 및 Ad-NeuroD1)를 비교하는 것이다.
물질 및 방법
인간 대상체 무하마드, 페드로 및 디에고로부터 얻은 3가지 나이브 배양물(비분류 1차 간세포) 및 글루타민 합성효소 반응 요소(GSRE) 활성화(GS 풍부)에 대한 분류 후 4가지 1차 간세포 배양물: 샬로시(Shalosh), 이든(Eden), 무하마드 및 얌(Yam) 상에서 Ad-PAX4 또는 Ad-NeuroD1에 의해 유도되는 전환분화 효율의 비교를 수행하였다.
실험 설계
실험 첫 날에, 표 3에 따라 100㎜ 팔콘(Falcon) 접시 상에서 바이러스 감염 후 300,000개의 세포를 파종하였다. 실험의 제3일에, 세포를 계수화하고 나서, Ad-MafA로 처리하고, 최종 농도 100,000개의 세포/웰로 6개의 웰 중 3개의 웰 상에 파종하였다. 실험의 제6일에, 방사면역측정법을 이용하여 인슐린 분비에 대해 세포를 분석하였다. KRB 중의 2mM 글루코스(저) 또는 17.5mM 글루코스(고) 중 하나와 함께 15분 동안 세포의 인큐베이션 후에 인슐린 분비를 측정하였다.
PDX1에 의해 유도된 전환분화 공정에서 PAX4 및 NeuroD1의 역할을 비교하기 위해 사용한 상이한 조합의 아데노바이러스의 요약.
제1일 제3일
1 Ad-눌(Null) 1300moi
2 Ad-PDX1 500moi+ Ad-NeuroD1 250moi Ad-MafA 50moi
3 Ad-PDX1 500moi+ Ad-PAX4 250moi Ad-MafA 50moi
결과
결과를 표 4 및 표 5 및 도 24A 내지 도 24B 및 도 25a 내지 도 25d에 요약한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
두 췌장 전사 인자 사이의 상세한 비교를 하였다. 향상된 GS 발현(GS 풍부)에 대해 분류함으로써 농축된 나이브 1차 간세포와 간세포 집단의 혼합 집단에 대한 비교를 하였다.
도 24A 내지 도 24B 및 도 25a 내지 도 25d는 막대 그래프로서 표로 만든 데이터를 제시한다.
인슐린 분비 측정은 PAX4 또는 NeuroD1을 이용하여 유도된 전환분화에서 통계학적 차이가 없다는 것을 나타내었다. 이 결론은 나이브 세포와 풍부한 GS 세포 둘 다에 대해 참이었다. 이는 동일한 경향을 나타낸 풍부한 GS 집단 및 나이브 세포의 평균뿐만 아니라, 동일한 배양물 무하마드 나이브 및 무하마드 GS를 농축한 결과를 시험할 때, 동일한 결과를 얻었다(전환분화 공정을 위한 모델 시스템으로서 작용하는 GS 농축 집단의 능력을 입증함).
이전의 결과는 GS 농축 집단이 전환분화 효율에 대해 전체 간세포 1차 배양물 이상으로 분명한 이점을 가진다는 것을 나타낸다. 따라서, 놀랍게도 GS 풍부 집단 및 무하마드의 비분류 집단은 유사한 결과를 나타내었다(통계학적으로 유의하지 않음). 그러나, 집단 둘 다의 계대 수의 차이가 있다는 것을 언급하여야 한다. GS 풍부 집단을 계대 19에서 시험하였고, 나이브 집단을 계대 7에서 시험하였다. 이들 결과는 효과적인 전환분화를 겪는 GS 풍부 집단의 실패로서 처리하여서는 안 되며, 나이브 세포가 달성하지 못할 수도 있는 높은 계대에서 전환분화를 겪는 GS 풍부 집단 능력으로서 처리하여야 한다.
NeuroD1과 함께 인큐베이션한 세포에 비해 PAX4와 함께 인큐베이션한 세포의 세포사에서의 유의한 차이가 없었다. 처리군(Ad-PAX4/Ad-NeuroD1)에 비교하여 대조군(비처리/Ad-눌)은 분명한 차이가 있었다. 총 인슐린에 대해서 시험하든 또는ng INS/10^6개의 세포/hr에 대한 결과에 대해서 시험하든 이는 PAX4 및 NeuroD1에 도달된 동일한 결과에 의해 알 수 있다.
관찰된 한 가지 차이는 전환분화 효율(특정 아데노바이러스를 이용할 때 얻은 양성 전환분화의 백분율)을 계산할 때였다. Ad-NeuroD1에 대해, 효율은 87.5%이고(8회 실험 중 7회 양성 전환분화), Ad-PAX4에 대해, 이는 71%였다(7회 실험 중 5회 양성 전환분화).
결론
Ad-PAX4와 Ad-NeuroD1는 둘 다 간세포의 유사한 전환분화를 뒷받침한다.
실시예 19: 전환분화 공정을 위한 최적의 프로토콜 결정
목적
본 연구의 목적은 전체 층위의 전환분화 효율(1+1+1 프로토콜)을, 2+1 프로토콜, 및 모두 3가지 아데노바이러스에 의한 동시 감염과 비교하는 것이다.
시험 시스템
DMEM 1g/ℓ 글루코스에서 성장시킨 인간 간 세포, 레온, 무하마드 및 페드로의 3가지 1차 배양물 상에서 상이한 전환분화 프로토콜을 시험하였다. 바이러스 감염 세포를 MEM 1g/ℓ 글루코스 배지에서 성장시킨 후에, 5nM 엑센딘(Exendin)-4, 20ng/㎖ EGF 및 10mM 니코틴아마이드로 보충하였다.
실험 설계
상이한 전환분화(TD) 프로토콜을 이하의 표 6에 따라 시험하였다. 간략하게, 실험의 제1일에, 프로토콜 A(눌), B(2+1) 및 E(층위 1+1+1)에 대해 이하의 표 6에 따라 100㎜ 팔콘 접시 상에서 바이러스 감염 후에 300,000개의 세포를 파종하였다. 실험의 제2일에, 100,000개의 세포를 프로토콜 C(동시에 3개 인자)에 대해 6웰 접시 상에서 파종하고 나서, 70,000개 세포를 프로토콜 D(동시에 3개 인자)에 대해 6웰 접시 상에 파종하였다. 실험 제3일에, 세포를 계수화하고 나서, Ad-MafA에 의해 처리하고(프로토콜 B 및 E), 100,000개의 세포/웰의 최종 농도로 6개 웰 중 3개 웰 상에 파종하였다.
Figure pct00015
실험 제6일에, 세포는 2mM 글루코스(저) 또는 17.5mM 글루코스(고)의 존재 하에 분비 분석을 겪었다(도 26a 내지 도 26c). KRB 중의 2mM 글루코스 또는 17.5mM 글루코스와 함께 15분 동안 세포를 인큐베이션한 후에 인슐린 분비를 측정하였다.
결과 및 분석
본 연구는 전환분화 공정을 위한 최적의 프로토콜을 결정하는 것을 추구하였다. 전통적인 층위 프로토콜(1+1+1)에서, 세포를 3가지 전사 인자로 순차적으로 처리한다: 제1일에 PDX1, 제2일에 NeuroD1 및 제3일에 MafA. 효율적이고 더 용이한 프로토콜을 개발하기 위한 노력에서, 전통적인 프로토콜의 전환분화 효율을 2+1 프로토콜 및 모두 3가지 전사 인자가 존재하는 동시 처리와 비교하였다.
이 시험을 위한 판독 분석은 인슐린 분비였다. 본 분야에서의 지식에 따르면, 예를 들어 C-펩타이드 분비에 의해 측정한 바와 같이 효율의 차이가 세포의 성숙에서만 제공되어야 하기 때문에 모든 처리는 유사한 수준의 인슐린 분비를 제시하여야 한다. 그러나, 본 실험에서, 인슐린 분비 측정에 의해 분명하게 알 수 있는 바와 같이 전환분화 효율의 예상치 못한 차이가 있었다(도 26a 내지 도 26c). 2+1 프로토콜에서 최상의 결과를 얻었다. 이들 결과는 이하의 표 5에 나타낸 바와 같이 통계학적으로 유의하였다.
Figure pct00016
2+1 프로토콜 및 층위 프로토콜의 p-값은 유의하지만, 상대적으로 높다. 모두 3가지 인자에 의한 동시 처리는 두 파종 밀도가 시험되었음에도 불구하고 가장 낮은 결과를 제공하였다(층위 프로토콜에 비해 유의하지 않음).
실시예 20: 페트리 접시로부터 엑스팬션 다중플레이트 생물반응기까지 간세포 증식의 산업화
목적
2가지 주요 단계를 포함한 전임상 적용을 위한 세포 접시에서의 생체과정을 개발하였다: 간세포 증식, 다음에 인슐린 생성 세포로 간세포 전환분화. 인간 임상 시험에서 환자의 처리를 위해, 환자 당 약 10억개의 세포의 용량 요구는 1형 당뇨병에서 고혈당증을 개선시키기 위해 사용되었다는 것이 예상된다. 이러한 생성 규모는 대규모 배양 표면적이 필요한데, 세포 배양 접시 공정(도 27 상부) 제조 전략을 제공하지 않는다. 따라서 이 연구의 목적은 엑스팬션 플랫폼(생물반응기 시스템; 미국에 소재한 팔 코포레이션(Pall Corporation))을 이용하여 세포 기반 세포 배양물 접시 공정을 산업화하였다.
물질 및 방법
사용한 물질을 이하에 열거한다:
i. 생물학적 물질: 인간 성인 간-유래 세포(1차 배양물).
ii. 성장 배지: 10% 열-비활성화된 소태아 혈청(FBS; 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 10500-064), 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B(100X)(론자(Lonza) 카탈로그 17-745E) 및 5nM 엑센딘-4(시그마 알드리치 카탈로그 E7144)로 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) 카탈로그 21885-025)
iii. 다른 시약: 둘베코 인산염 완충제 시판물(DPBS; 론자 카탈로그 17-512Q) 및 TrypLE◆ 셀렉트(라이프 테크놀로지즈 카탈로그 12563-029).
iv. 세포 배양물 지지체: CellBIND◆ 셀스택스(CellStack◆) 2-, 5- 및 10- 챔버(코닝 카탈로그 COS-3310, COS-3311 및 COS-3320), 엑스팬션 50 플레이트(XP-50) 생물반응기(카탈로그 XPAN050000000) 및 엑스팬션 200 플레이트(XP-200) 생물반응기(카탈로그 810155).
v. 폴의 연속 원심분리를 위한 세포 회수 키트(항목 6100043)
vi. 원심분리 제어: 500㎖ 원심분리 그릇에서 세포 회수 시스템 제어
상기 방법은 도 27에 제시한 공정 유동 차트에 따른다. 간략하게는, 사전 배양을 전통적인 다중-트레이 배양으로서 수행하였다. 세포를 계대 14 및 15에서 엑스팬션 생물반응기(들)에서 사용하였다. 사용한 생물반응기 시스템은 오염 위험을 감소시키기 위한 폐쇄 시스템이다. 다중-트레이 배양을 컨트롤러 설정치 pH: 7.3 내지 7.6으로 세포 성장 대조군으로서 엑스팬션 배양과 병행하여 수행하였고, 용존 산소(DO)를 50% 초과로 유지하였다. 표적 파종 밀도는 각각의 계대에서 4,000 개의 세포/㎠였다.
배양 지속기간은 7 내지 9일이었고, 배지 교환을 2 내지 4일마다 적용하여(XP-50: 제4일, 제6일 및 제8일 - XP-200: 제4일 및 제7일) 배양물 전체적으로 0.5g/ℓ 초과의 글루코스 수준을 유지하였다.
결과
본 명세서에 제시한 결과는 페트리 접시로부터 엑스팬션 200 생물반응기(미국에 소재한 팔 코포레이션)까지 인간 간-유래 세포증폭기의 성공적인 정률증가를 나타낸다.
세포 성장 - 도 28에서 제시한 세포 확장 프로파일은 세포가 처음 사전 배양 단계로부터 최종 생물반응기(XP-200) 배양까지의 성장 대수기에 있다는 것을 분명하게 입증한다. 4회 계대 내에서, 세포를 2백만개 내지 대략 18억개로 증폭시켰는데, 이는 1,000배 바이오매스 증가를 나타낸다. 따라서, 인간 간-유래 1차 세포의 대규모 생성의 실현 가능성을 분명하게 입증하였고, 10억개의 세포/환자의 표적 및 심지어 거의 18억개의 세포/환자/XP-200을 달성하였다.
계대 1을 셀스택10(CS10)에서 수행하였고, 계대 2를 2 x CS10에서 수행하였으며, 계대 3을 XP50에서 수행하였고, 계대 4를 XP200에서 수행하였다.
집단 배가 시간(PDT) 비교는 인간 간-유래 1차 세포가 전통적인 다중 트레이 시스템에서보다 엑스팬션 생물반응기에서 더 빨리 증식하였다는 것을 나타내었다(도 29). 채취한 세포 밀도는 엑스팬션 50 생물반응기에서 대략 15,000개의 세포/㎠ 및 엑스팬션 200 생물반응기에서 14,000개의 세포/㎠였는데, 이는 그들의 각각의 다중트레이 제어의 대략 160%를 나타낸다. 배양 환경의 더 양호한 제어(pH, DO)는 이 결과를 설명하기 위한 주된 가설이다.
엑스팬션 생물반응기에서의 pH, 용존 산소 및 온도 제어 경향 - pH 및 DO를 그들 각각의 예상 범위에서 유지하였다(도 30). DO를 전체 공정 내내 50%까지의 공기 포화도로 유지하였고, pH는 공정 마지막에 높은 세포 수에 기인하여 각각의 배양물의 마지막 2일 동안 7.4로부터 7.2로 점진적으로 감소되었다. 양호한 재생성 및 확장성을 입증하는 배양 둘 다 동안에 유사한 경향을 관찰하였다.
오비지오(Ovizio) 홀로그램 현미경( 오비지오 영상화 시스템, 벨기에 브뤼셀에 소재 )을 이용하는 현미경 관찰
세포 합류 및 형태는 세포 요법 과정에서 모니터링하기 위한 중요한 매개변수이다. 이를 위하여, 엑스팬션 생물반응기에서 상부 10개의 플레이트의 관찰을 허용하는 현미경을 사용하였다.
도 31A 내지 도 31D에 제시한 현미경 이미지는 엑스팬션 플레이트 전체적으로 인간 간-유래 1차 세포의 균질한 분포를 확인한다. 배양 9일 후에 세포 합류는 대략 90%가 되는 것을 결정하였고, XP-50과 XP-200 생물반응기 둘 다에서 동등한 것으로 추정하였다(도 31A 및 도 31B). 50-과 200- 플레이트 규모 둘 다에서, 엑스팬션 시스템 내 합류는 대조군 다중-트레이 시스템으로부터의 합류보다 약간 더 높았다. 이들 이미지는 또한 세포 형태가 엑스팬션 시스템 내 연속 배양에 의해 또는 세포 회수를 위해 사용한 연속적 원심분리에 의해 영향받지 않는다는 것을 입증한다. 다중-트레이 공정을 이용하여 성장시킨 대조군 세포를 도 31C 및 도 31D에서 나타낸다. 데이터는 엑스팬션 생물반응기를 이용하는 인간 간-유래 1차 세포 증식은 전환분화된 세포의 전환분화 특성 또는 인슐린 분비 프로파일을 변경시키지 않았다는 것을 입증하였다(데이터 미제시).
결론
인간 성인 간-유래 세포 증식 공정을 정률 증가시키기 위해 생물반응기를 성공적으로 사용하였다. 본 명세서의 결과는 생물반응기 플랫폼을 포함하는 공정을 이용함으로써, 세포가 1백만 개로부터 18억 개까지의 세포로 빠르게 증식할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 정률증가 수준은 당뇨병을 표적화하는 세포 기반 자가 요법 동안 환자에 대한 투여를 위해 18개의 세포를 잠재적으로 이용 가능하게 만든다. 이는 세포 접시 공정, 예를 들어, 페트리 접시(데이터 미제시)를 이용하여 생성된 7백만 개의 세포만을 비교한다. 중요하게는, 생물반응기를 이용하는 공정은 전환분화에 대한 잠재적인 세포 생존도 및 세포의 인슐린 분비 프로파일을 보존하였다.
실시예 21: 당뇨병의 치료를 위한 자가 인슐린 생성(AIP) 세포를 생성하기 위한 프로토콜
목적
이 연구의 목적은 당뇨병의 치료를 위해 비-β 췌장 세포로부터 자가 인슐린 생성(AIP) 세포를 생성하기 위한 산업적 규모 프로토콜을 개발하는 것이었다. 환자 자신의 존재하는 기관으로부터 생성된 새로운 기능성 조직을 지니는 췌장 인슐린 생성 β-세포를 제조하기 위해 기능적으로 수정함으로써, 세포 기반 자가 요법은 대상체의 당뇨병을 성공적으로 표적화할 수 있었다.
본 명세서에 제시한 프로토콜은 전사 인자 유도 전환분화에 의해 인간 간 유래 세포를 기능성 인슐린-생성 세포로 전환하는 것에 관한 분자 및 세포 접근을 사용한다(도 32). 이 치료적 접근은 산업적 규모로 자가 인슐린 생성(AIP) 세포를 생성하여, 공여체로부터 조직 이용 가능성의 단점을 극복한다.
프로토콜의 검토
도 33은 각각의 단계에서 대략의 세포 수에 따라 생검으로부터 6주의 최종 산물까지 대략의 시간을 입증하는 본 명세서에 제공된 프로토콜의 검토를 제공한다. 도 34는 일 실시형태에서 자가 또는 동종이계 인슐린 생성 세포(AIP)일 수 있는 세포 생성물을 생성하는 인간 인슐린 세포 생성물 제조 공정의 흐름도를 제시한다. 상세한 설명은 이하에 제공한다.
도 34 단계1의 간 조직 단계를 얻는 단계
성인 인간 대상체로부터 간 조직을 얻었다. 얻은 모든 간 조직을 의료 시설 헬싱키 위원회(Helsinki Co㎜ittee of the Medical Facility)의 승인 하에 받았다. 따라서, 모든 간 조직 공여자는 사전 동의서에 사인하고, 공여자 선별 및 공여자 검사를 수행하여 감염성 또는 악성 질환의 위험 인자의 임상 또는 신체적 증거를 지니는 공여자로부터의 생검이 인간 인슐린 생성 세포의 제조로부터 제외되었다는 것을 보장하였다.
자격이 있고 훈련 받은 수술의에 의해 수술실에서 간 생검을 얻었다. 약 2 내지 4g 크기의 간 조직의 생검을 자격이 있는 환자로부터 취하였고, 멸균백 내 위스콘신 유니버시티(UW) 용액 중에서 2 내지 8℃에서 GMP 시설까지 수송하였다.
도 34의 시험관내 배양물/단계 2 및 3
제조 부위에서, 부착 세포에 대해 간 생검을 진행하였다. 간략하게, 간 생검을 얇은 슬라이스로 절단하고, 37℃에서 20분 동안 I형 콜라게나제에 의해 분해하였다. 후속적으로, 단리된 단일 세포를 얻기 위해 세포를 트립신을 이용하여 반복적으로 분해하고; 초기 실험은 대략 0.5x106개의 세포가 생검(g) 당 단리될 수 있다는 것을 나타낸다.
이어서, 세포를 10% FCS, 엑센딘-4 및 항생제의 혼합물(페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B)로 보충한 세포 배지에서 생체 밖에서 확장시켰다. 전처리한 피브로넥틴-코팅 조직 배양 접시를 이용하여 5% CO2/95% 공기(20회까지 계대)의 습한 분위기에서 세포를 37℃에서 계대시켰다. 비부착세포를 제거하기 위한 생검 플레이팅 후 처음 3일 동안 매일, 그 다음에 제1 세포 계대 후 1주 2회로 배지를 바꾸었다. 제1 세포 계대 시, 적어도 하나의 세포 분취액을 동결보존하였다(이하 참조; 도 34의 선택적 단계).
목적으로 하는 수의 세포가 생성될 때까지 트립신을 이용하여 1:3으로 세포를 계대시켰다(약 4 내지 7주 내에 약 10 내지 30억개의 세포). 세포의 확장은 대략 4 내지 7주에 실시예 20에 기재한 바와 같이 그리고 도 33에서 나타내는 바와 같이 다중-플레이트 시스템의 사용을 포함하였다. (도 34의 단계 3)
조직 배양 플레이트에 부착된 인간 간 세포는 상피의 간충직 이행(EMT)을 겪으며, 효율적으로 증식되었다. 이들 EMT-유사 세포의 거의 100%는 알려진 간충직 특징(CD29, CD105, CD90 및 CD73)을 나타낼 뿐만 아니라 성인 간 마커, 예컨대 알부민 및 AAT를 발현시켰다. 세포는 간모세포도 발현시키지 않고 "줄기능(stemness)" 마커도 발현시키지 않는다. 이하의 표 8은 전환분화(TD) 전에 배양된 간 세포에 대한 간충직, 조혈 및 간 마커의 존재에 대한 이들 EMT-유사 배양 간 세포의 분석 결과를 나타낸다.
전환분화 전 사양
간충직 마커
CD105, CD73, CD90, CD44
>95%
조혈줄기세포 마커 <2%
간 마커
알부민
AAT
>80%
>60%
표 8에 나타낸 백분율은 낮은 계대수이다.
계대 1 세포의 동결보존 ( 도 34 )
간략하게, 계대 1 세포를 2㎖ 냉동바이알 중의 10% FBS 및 10% DMSO로 보충한 DMEM 중에서 동결보존하였다(최소 0.5 x106개 세포). 가능한 가장 빠른 계대 시 세포를 동결보존하는 것이 권장된다. 냉동 세포를 -70℃에서 24 내지 48시간 동안 처음 저장하고, 이어서 장기간 저장 동안 액체 N2에 옮겼다.
동결보존 세포의 해동(도 34)
당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 동결보존 세포를 해동시켰다. 간략하게, 바이알을 액체 N2로부터 제거하고 나서, 슬라이드가 해동되었지만 중앙은 여전히 냉동상태일 때까지 서서히 해동시켰다. 세포를 조직 배양 플레이트에 조심해서 옮겼다. 일단 세포가 플레이트에 부착되면, 세포 배양물을 확장하기 위한 시험관내 가공(도 34의 단계 2 및 단계 3)을 수행하였다.
간세포 경향을 갖게 하는 선택(도 34)
도 34의 단계 3에서의 선택은 전환분화 경향이 있는 세포를 농축시키기 위해 1차 간세포를 분류하는 것이다. 예를 들어, 세포는 실시예 10 내지 15에서 본 명세서에 상기 기재한 바와 같이 글루타민 합성효소 반응 요소(GSRE) 활성화(GS 풍부 세포)에 대해 분류할 수 있었다. 대안적으로, 세포는 활성 Wnt 신호전달 경로를 갖는 세포를 농축할 수 있되, 그들은 본 명세서에서 상기 실시예 17에서 기재한 바와 같이 Wnt 신호전달에 반응하는 경향이 있다. 추가로, 세포는 본 명세서에서 상기 실시예 16에서 기재한 바와 같이 특정 유전자 발현의 증가 또는 감소, 예를 들어 ABCB1, 1TGA4, ABCB4 또는 PRNP, 또는 이들의 임의의 조합 발현의 감소, 또는 HOMER1, LAMP3, BMPR2, ITGA6, DCBLD2, THBS1 또는 VAMP4, 또는 이들의 임의의 조합 발현의 증가를 모니터링함으로써 농축될 수 있었다. 세포 집단은 세포의 전환분화에 대한 경향을 향상시키기 위해 실시예 23에 기재한 바와 같이 리튬으로 처리할 수 있다. 전환분화에 대한 경향에 대한 농축 후에, 세포를 도 34의 단계 4에서 사용하였다.
전환분화(도 34의 단계 4 )
전환분화를 위해 세포를 추가 5일 동안 전환분화 배지에서 성장시켰다. 전환분화 배지는 10% FCS, 엑센딘-4, 니코틴아마이드, EGF 및 항생제의 혼합물(페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B)로 보충한 둘베코 최소 필수 배지(1g/ℓ의 글루코스)이다.
두 상이한 프로토콜을 세포의 전환분화를 위해 사용하였다. 층위(1+1+1) 순차적 프로토콜을 이용하거나 또는 2+1 프로토콜을 이용하여 세포를 전환분화하였다. 각각의 방법의 예를 이하에 제공한다.
층위(1+1+1) 순차적 프로토콜
이어서, 생체밖 확장 간 세포를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 l제어 하에서 췌장 전사 인자(pTF), PDX-1, Neuro-D 또는 MafA 중 하나에 대해 인간 유전자를 각각 운반하는 3가지 혈청형-5 재조합 복제-결함 아데노바이러스 벡터로 순차적으로 감염시켰다. 3가지 인간 pTF 유전자는 CMV 프로모터의 제어 하에서 FGAD 벡터의 동일한 벡본 내로 삽입하였다. CMV 프로모터는 감염 후 3 내지 4주 이내에 보통 턴 오프되는 이종성 프로모터이다. 그럼에도 불구하고, 이소성 pTF 유전자의 단기간 발현은 내인성 인간 상동체를 유도하기에 충분하였다.
FGAD 벡터는 개발 중인 방향 변경을 유도하기 위한 최적의 유전자 전달 도구로서 선택하였다. 상기 예는 1차 성인 인간 간 세포 내로 이들 이소성 유전자의 도입이 성인 세포의 재프로그래밍의 비가역적 과정에 대한 단기간 촉발자로서 작용한다는 것을 입증하였다. 반면에, 재조합 아데노바이러스는 그들이 숙주 게놈 내로 통합하지 않기 때문에 상대적으로 안전하였고, 따라서 유전자 정보의 숙주 서열을 붕괴시키지 않는다. PDX-1은 염색질 구조의 후성적 변경을 유도하고, 따라서 다른 침묵 유전자 정보를 활성화시키는 한편, 발현된 유전자의 숙주 레퍼토리를 턴 오프한다(표 8 및 표 9의 결과를 비교).
도 33에서 제시한 단계의 흐름 후에 밀폐식 자동 엑스팬션 생물반응기 시스템(폴 라이프 사이언시즈)을 이용하여 전환분화 공정을 수행하였다. 높은 세포 농도에 적합한 조건 하에서 생물반응기 시스템을 세포 배양물의 배양을 위해 사용하였다. 생물반응기 시스템은 2가지 주요 시스템, 즉, 제어 시스템과 생물반응기 그 자체(용기 및 부속품)로 구성되었다.
프로브에 대한 커넥터, 모터와 펌프, 용존 산소(DO)용 제어 루프, pH, 기체 제어 시스템을 포함하고 온도 제어를 위한 인큐베이터 내에 넣은 제어 콘솔에 의해 공정 매개변수를 모니터링하고, 제어하였다. 제어 공정 매개변수(예컨대, 온도, pH, DO 등)는 조작원 인터페이스 상에 디스플레이하고, 지정된 컨트롤러에 의해 모니터링할 수 있었다.
생물반응기 내 세포 배양 성장 절차
250±50×106개 세포를 멸균 XP-200 생물반응기에서 파종하였다. 생물반응기 내 성장 배지를 다음의 조건에서 유지하였다: 37℃, 70% 용존 산소(DO) 및 pH 7.3. DO 값 70% 및 pH 값 7.3에서 유지하기 위해 여과 기체(공기, CO2, N2 및 O2)를 제어 시스템에 의해 결정한 바와 같이 공급하였다. 배지 글로코스 농도가 500㎎/리터 이하로 감소되었을 때 성장 배지를 바꾸었다. 멸균 실리콘 튜빙을 이용하여 배지를 공급 용기로부터 생물반응기까지 펌핑하였다. 모든 튜빙 연결을 관 용접기를 이용하여 수행하여 멸균 커넥터를 제공하였다. 글루코스, 락트산염, 글루타민, 글루탐산염 및 암모늄 농도 결정을 위해 1 내지 2일마다 성장 배지 샘플을 취하였다. 세포 배양물의 글루코스 소모 속도 및 락트산염 형성 속도는 세포 성장 속도의 측정을 가능하게 하였다. 이들 매개변수를 사용하여 축적 실험 데이터에 기반한 채취 시간을 결정하였다.
생물반응기로부터 세포의 채취
세포 채취 공정을 성장기의 마지막(8 내지 16일)에 시작하였다. 배양물을 다음과 같이 클래스-100 층상 영역에서 채취하였다:
생물반응기 용기를 폐기물 용기에 대한 튜빙을 통해 중력을 이용하여 비웠다. 이어서, 생물반응기 용기를 22ℓ 사전 가온 PBS(37℃)로 다시 채웠다. PBS를 폐기물 보틀에 대해 압력 또는 중력에 의해 튜빙을 통해 배수하였다. 세척 절차를 2회 반복하였다.
표면으로부터 세포를 방출하기 위해, 트립신-EDTA(트립신 0.25%, EDTA 1mM)의 37℃로 사전 가온한 22ℓ를 생물반응기 용기에 첨가하였다. 500㎖ FBS를 생물반응기 용기에 첨가하고 나서, 세포 현탁액을 멸균 용기에 수집하였다. 세포 현탁액을 원심분리시키고(600 RPM, 10분, 4℃), 배양 배지에서 재현탁시켰다.
층위(1+1+1) 바이러스 감염 단계
3연속일에 재조합 아데노바이러스에 의해 이소성 이식유전자를 순차적으로 투여하였다. 이소성 이식유전자의 순차적 투여는 구체적으로 β 세포 계통 및 기능을 따라서 전환분화 효율을 증가시키고 세포 성숙을 증가시키는 것으로 보고되었다.
전환-분화 절차는 대략 7일 걸리는데, 이의 마지막에 세포를 세척하여 비혼입 재조합 아데노바이러스를 제거하였다. 간략하게:
제1일에, 재현탁 세포를 MOI 1,000을 이용하여 PDX-1 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 이어서, 세포를 배양 접시 상에 파종하고 나서, 5% CO2를 공급한 습윤화한 37℃ 인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이션시켰다.
제2일에, 세포를 트립신을 이용하여 배양 접시로부터 탈착시키고 나서, 재현탁시켰다. 재현탁 세포를 MOI 250을 이용하여 NeuroD1 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 이어서, 세포를 배양 접시 상에 파종하고 나서, 5% CO2를 공급한 습윤화한 37℃ 인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이션시켰다.
제3일에, 세포를 트립신을 이용하여 배양 접시로부터 탈착시키고 나서, 재현탁시켰다. 재현탁 세포를 MOI 50을 이용하여 MafA 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 이어서, 세포를 배양 접시 상에 파종하고 나서, 5% CO2를 공급한 습윤화한 37℃ 인큐베이터 내에서 밤새 3일동안 인큐베이션시켰다.
이어서, 세포를 회수하고 나서, 마커 및 글루코스 조절 처리된 인슐린 분비에 대해 분석하였다. 대조군 세포는 동일한 프로토콜 후에 증식 및 인큐베이션한 것을 포함하였지만, 아데노바이러스의 첨가는 없었다.
물질 및 실험 방법
막 마커-세포의 FACS 분석을 다음과 같이 단클론성 항체로 염색하였다: 400,000 내지 600,000개 세포를 5㎖ 시험관 내 0.1㎖ 유세포분류기 완충제 중에서 현탁시키고 나서, 각각의 다음의 단클론성 항체(MAb)와 함께 실온(RT)에서 15분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다:
Figure pct00017
AIP 세포의 채취(도 34의 단계 5) 이어서, 세포를 유세포 분석기 완충제로 2회 세척하고 나서, 재현탁시키고, FC-500 유세포분석기(베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 이용하여 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 음성 대조군을 적절한 아이소타입 형광 분자를 이용하여 준비하였다.
패키징 및 방출
제조 마지막에, AIP 세포를 운송을 위해 포장하고, 제조 장소에서 방출할 것이다. 병원까지 2 내지 8℃에서 AIP 세포를 운송하도록 계획한다.
층위(1+1+1) 프로토콜의 결과
세포의 아데노바이러스 감염은 이식유전자의 일시적 발현을 야기하였는데, 이는 내인성 유전자의 영구적인 유도를 촉발하여 AIP 세포에 대한 안정한 전환분화를 야기한다(데이터 미제시). 그 결과, 최종 산물에서 바이러스 DNA의 변형 또는 삽입은 없었다.
채취한 AIP 세포의 분석(도 34의 단계 6)
간충직, 조혈 및 간 마커의 존재에 대한 전환분화된 간 세포(AIP 세포)의 분석을 표 7에 제시한다. 음성 마커는 조혈 마커를 포함한다.
Figure pct00018
엑스팬션 생물반응기에서 상이한 환자 샘플에 걸쳐 가변성을 주목하였지만, 모든 경우에, 채취한 세포의 세포 밀도는 출발 배양물에 비해 크게 증가되었다(도 35).
채취한 AIP 세포 생성물을 분석하여 수많은 마커의 발현을 동정하였다. 동일성은 RT-PCR 및 FACS에 의하였다. 이하의 표 10 및 표 11에 제시하는 결과는 PDX-1, NeuroD, MafA, Pax4, Nkx6.1 및 인슐린을 포함하는 β-세포 췌장 마커 유전자의 내인성 발현의 배수적 증가를 나타낸다.
RT- PCR 배수 증가
(대조군에 대해)
Pdx1
 >105
NeuroD
 >104
MafA
 >103
인슐린
 >101
RT- PCR 배수 증가
(대조군에 대해)
글루카곤
 >102
소마토스타틴
 >101
Nkx6.1
 >101
Pax4
 >101
도 36A 및 도 36B에 제시하는 막대 그래프는 층위 프로토콜의 사용 후에 얻은 전형적인 결과를 나타낸다. 전환분화된 간 세포(AIP 세포)와 췌장 세포 및 비-전환분화된 간 세포의 대조군 집단의 비교를 제시하되, AIP 세포가 대조군에 비해 췌장 세포 마커의 상당한 증가를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
AIP 세포 기능의 췌장 표현형에 대한 간에 대한 세포의 추가 특성규명 결과를 이하의 표 12에 제시한다. 췌장 세포 마커의 증가와 조합된 PDX-1 세포에서 간 마커의 상당한 감소는 췌장 β-세포의 표현형 및 기능을 갖는 세포로의 간 세포의 성공적인 형질전환을 나타낸다.
Figure pct00019
채취한 AIP 세포 집단 내에서 사멸 세포에 대한 분석은 세포의 20% 미만이 사멸되었음을 나타내었다(데이터 미제시).
채취한 AIP 세포 생성물을 또한 인슐린의 기능 분비에 대해 분석하였다. 도 37은 AIP 세포 생성물 효능(ELISA를 이용하여 측정한 바와 같은 인슐린의 글루코스 조절된 분비)을 나타낸다. 시험한 AIP 세포 생성물은 XP-200 생물반응기에서 확장된 세포의 전환분화된 집단을 나타낸다. 인슐린 분비를 GSIS(KRB + 0.1%BSA RIA-등급 또는 재조합 BSA와 함께 저(2mM) 및 고(17.5mM) 글루코스 농도에서 글루코스 자극 인슐린 분비)에 의해 측정하였다. 결과를 ng 인슐린/백만 개 세포/시간으로서 제시하고, AIP 세포 반응의 상당한 증가를 나타낸다.
2+1 전환분화(TD) 프로토콜
도 38은 엑스팬션 생물반응기 시스템뿐만 아니라 공정 대조군을 이용하여 "2+1" TD 프로토콜을 제시한다. 다중-시스템 생물반응기와 조합한 "2+1" TD 프로토콜을 이용하는 것의 결과는 AIP 생성물 세포를 효율적으로 생성한 이 프로토콜의 실현 가능성을 입증하였다. 두 아데노바이러스 벡터(하나는 PDX-1을 암호화하는 핵산을 포함하고, 다른 하나는 NeuroD1을 암호화하는 핵산을 포함함) 상에서 PDX-1 및 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화한 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터 중 하나를 이용하여 제3일에 제1 감염을 수행하였다. PDX-1에 대한 MOI는 1:1,000이고, NeuroD1에 대한 MOI는 1:250였다. 이어서, 세포를 3일 동안 인큐베이션시키고 나서, MafA를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 제2 감염을 제6일에 수행하였다(1:50 MOI). 세포를 2일 후 제8일에 채취하고 나서, 층위(1+1+1) 프로토콜을 사용하였을 때 상기 기재한 것과 유사하게, 품질 제어 마커에 대해 선별하였다.
제2 감염 시(제6일) 세포 배양물의 관찰은 사용한 조건과 독립적으로 유사한 합류를 나타내었다(도 39A 내지 도 39D 및 도 40A 내지 도 40B). 최종 채취 시, 다른 조건보다 약간 더 높은 세포 합류를 제공하는 CTL(대조군) 조건 하에서 세포를 처리하였다(도 41A 내지 도 41D). 세포 밀도의 차이는 상이한 파종 밀도, 및 세포 회수 수율 및 다음 감염일의 사망률에 주로 기인하였다.
채취한 세포의 인슐린 함량을 분석하였고, 도 42에 제시한 결과는 비처리 대조군(PDX-1, NeuroD1 및 MafA를 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 감염시키지 않음)에 비해 시험한 모두 3가지 2+1 프로토콜 하에서 전환분화된 세포에 대해 증가된 인슐린 함량(마이크로 국제 단위/백만 개 세포)을 입증한다. 공정 CTL 조건은 비처리 세포보다 상당히 더 높은 인슐린 함량(대략 2.5 x 더 높음)을 수득하는 예상되는 경향을 제시하였다. 엑스팬션 CTL 조건은 또한 예상된 경향을 제시하되, 처리 세포는 비처리 세포보다 상당히 더 높은 인슐린 함량을 제시하였다(대략 1.7 x 더 높음). 엑스팬션 10 시스템에서 전환분화된 세포는 엑스팬션 CTL 조건의 처리 세포와 유사한 인슐린 함량을 제시하였다(비처리 대조군보다 대략 1.7 x 더 높음)
"2+1" 전환분화 프로토콜의 사용은 비처리 간 세포보다 상당히 더 높은 인슐린 함량으로 AIP 세포 생성물을 생성함에 있어서 효율적이었다(감소된 단계 수 및 세포 상실에 대한 기회).
순도 분석
확장 및 전환분화 단계 동안 세포의 90% 초과가 간충직 줄기 세포(MSC)-유사 표현형을 가진다는 것을 보장하기 위해 순도 분석을 개발하였다(방법에서 상기 참조). 전환분화를 위해 사용한 프로토콜과 독립적으로 이들 순도 분석을 사용하였다. 배양시킨 MSC는 CD73, CD90, CD105 및 CD44에 대해 양성으로 염색하여야 한다. 추가로, MSC는 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD19 또는 CD79#, 및 HLA-DR 표면 분자에 대해 음성이어야 한다. 이전의 결과(도 44a 및 도 44b)는 MSC 마커가 시간에 따라 그리고 간 세포의 전환분화 동안 안정하였다는 것을 입증하였다. AIP 세포의 MSC-유사 표현형을 나타내는 결과를 표 6 및 표 7에 제시한다. 이들 매개변수를 시험하기 위해 유세포 분석과 면역형광 분석을 둘 다 사용하였다.
실시예 22: 분해 방법의 분석
목적
본 연구의 목적은 상이한 분해 방법이 아데노바이러스에 의해 형질도입될 간 세포의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 것이다.
방법
간략하게, 간 세포를 Ad.CMV.GFP로 감염시키고 나서, GFP의 발현을 96시간 후에 측정하였다. 간 세포를 Ad5.CMV.GFP 바이러스의 10, 100 및 500 moi로 형질도입하거나, 또는 비처리로 남겨두었다. 96시간 후에, GFP 발현을 형광 현미경에 의해(도 45a, 도 46a) 그리고 FACS(도 45b 내지 도 45C, 도 46b 내지 도 46C)에 의해 측정하였다.
결과
도 45a 내지 도 45C는 서바(Serva) 및 워싱턴(Worthington) 콜라게나제를 이용하는 간의 분해로부터 유래된 BP001 세포의 형질도입 효율을 나타낸다. 형질도입된 세포의 백분율은 유사하였지만, 서바 콜라게나제에 의해 분해된 간은 GFP 형광 강동에 의해 나타낸 바와 같이 워싱턴 콜라게나제로 분해한 간보다 더 많은 GFP를 생성하였다(도 45b 및 도 45C). 유사하게, TS001 세포의 형질도입 효율은 서바 콜라게나제의 사용에 의해 영향받지 않았다(도 46a-46C).
실시예 23: 전환분화 전 WNT 처리는 전환분화 적격을 개선시킨다
목적
본 연구의 목적은 세포 집단 내에서 전환분화 적격을 개선시켰다.
상기 실시예 17에 기재한 바와 같이, 활성 WNT 신호전달은 eGFP+ 사전 배치 집단을 특성규명하였다. 상기 기재한 실험은 WNT 신호전달의 유도가 전환분화 전사 인자와 함께 적용될 때 전환분화 효율을 개선시켰다는 것을 입증하였지만, eGFP+에서 이미 존재하는 WNT 신호전달이 그들의 분화 운명을 재지시하기 위한 그들의 증가된 적격과 관련되는지의 여부는 나타내지 않았다.
방법
WNT 신호전달이 세포에 전환분화에 대한 적격을 부여하는지의 여부를 시험하기 위해, eGFP+ 세포를 전환분화 인자의 첨가 48시간 전에 10mM 리튬(Li)으로 처리하였다. 이어서, 췌장 전사 인자를 첨가하였을 때, 리튬을 배지로부터 제거하였다.
결과
전환분화 시, Li으로 전처리한 세포는 인슐린 분비의 증가(도 48a)뿐만 아니라 췌장 유전자의 발현(도 48b)을 입증하였는데, 이는 WNT 신호전달이 세포가 효율적인 전환분화를 겪게 할 수 있는 "빌트인" 신호 경로라는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 내인성 PDX-1 발현 수준은 Li 전처리에 의해 상향조절되지 않았는데(도 48c), 이는 후기 WNT 신호가 안정한 췌장 레퍼토리에 필수적이라는 것을 시사한다.
본 명세서에 개시된 특정 특징을 예시하고 본 명세서에 기재하였지만, 다수의 변형, 치환, 변화 및 동등물이 이제 당업자에게 일어날 것이다. 따라서, 첨부하는 청구범위는 본 명세서에 개시된 진정한 정신 내에 속하는 모들 이러한 변형 및 변화를 아우르는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> FERBER, Sarah <120> METHODS OF TRANSDIFFERENTION AND METHOD OF USE THEREOF <130> P-79488-PC <150> 62/098,050 <151> 2014-12-30 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Rattus rattus - Artificial <400> 1 tcacatggaa ggatcaaagc aagcctgctt ctattcttgg aaacagagca a 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus - Artificial <400> 2 tcacatgaaa ggatcaaagc aaatccgctt ctattcttgg aaacagagca a 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens - Artificial <400> 3 tcacatgaat ggatcaaagc aaatccattt ccattcttgg aaaagcagct c 51 <210> 4 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asn Gly Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Ser Ala Ser Pro 20 25 30 Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro His 35 40 45 Pro Phe Pro Gly Ala Leu Gly Ala Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp 50 55 60 Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Val Ala 65 70 75 80 His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Ala Leu Pro His Pro Pro 85 90 95 Ala Gly Pro Phe Pro Glu Gly Ala Glu Pro Gly Val Leu Glu Glu Pro 100 105 110 Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His 115 120 125 Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu 130 135 140 Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg 165 170 175 Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile 180 185 190 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys 195 200 205 Arg Gly Gly Gly Thr Ala Val Gly Gly Gly Gly Val Ala Glu Pro Glu 210 215 220 Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala 245 250 255 Arg Glu Gly Arg Leu Pro Pro Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser 260 265 270 Ser Val Ala Pro Arg Arg Pro Gln Glu Pro Arg 275 280 <210> 5 <211> 852 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgaacggcg aggagcagta ctacgcggcc acgcagcttt acaaggaccc atgcgcgttc 60 cagcgaggcc cggcgccgga gttcagcgcc agcccccctg cgtgcctgta catgggccgc 120 cagcccccgc cgccgccgcc gcacccgttc cctggcgccc tgggcgcgct ggagcagggc 180 agccccccgg acatctcccc gtacgaggtg ccccccctcg ccgacgaccc cgcggtggcg 240 caccttcacc accacctccc ggctcagctc gcgctccccc acccgcccgc cgggcccttc 300 ccggagggag ccgagccggg cgtcctggag gagcccaacc gcgtccagct gcctttccca 360 tggatgaagt ctaccaaagc tcacgcgtgg aaaggccagt gggcaggcgg cgcctacgct 420 gcggagccgg aggagaacaa gcggacgcgc acggcctaca cgcgcgcaca gctgctagag 480 ctggagaagg agttcctatt caacaagtac atctcacggc cgcgccgggt ggagctggct 540 gtcatgttga acttgaccga gagacacatc aagatctggt tccaaaaccg ccgcatgaag 600 tggaaaaagg aggaggacaa gaagcgcggc ggcgggacag ctgtcggggg tggcggggtc 660 gcggagcctg agcaggactg cgccgtgacc tccggcgagg agcttctggc gctgccgccg 720 ccgccgcccc ccggaggtgc tgtgccgccc gctgcccccg ttgccgcccg agagggccgc 780 ctgccgcctg gccttagcgc gtcgccacag ccctccagcg tcgcgcctcg gcggccgcag 840 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Gln Asn Gln Asp Met Pro Pro His Leu Pro 195 200 205 Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro 210 215 220 Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe 225 230 235 240 His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe 245 250 255 Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro 260 265 270 Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu 275 280 285 Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro 290 295 300 Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Gly 305 310 315 320 Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe 325 330 335 Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala 340 345 350 Ile Phe His Asp 355 <210> 7 <211> 1071 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgaccaaat cgtacagcga gagtgggctg atgggcgagc ctcagcccca aggtcctcca 60 agctggacag acgagtgtct cagttctcag gacgaggagc acgaggcaga caagaaggag 120 gacgacctcg aagccatgaa cgcagaggag gactcactga ggaacggggg agaggaggag 180 gacgaagatg aggacctgga agaggaggaa gaagaggaag aggaggatga cgatcaaaag 240 cccaagagac gcggccccaa aaagaagaag atgactaagg ctcgcctgga gcgttttaaa 300 ttgagacgca tgaaggctaa cgcccgggag cggaaccgca tgcacggact gaacgcggcg 360 ctagacaacc tgcgcaaggt ggtgccttgc tattctaaga cgcagaagct gtccaaaatc 420 gagactctgc gcttggccaa gaactacatc tgggctctgt cggagatctc gcgctcaggc 480 aaaagcccag acctggtctc cttcgttcag acgctttgca agggcttatc ccaacccacc 540 accaacctgg ttgcgggctg cctgcaactc aatcctcgga cttttctgcc tgagcagaac 600 caggacatgc ccccgcacct gccgacggcc agcgcttcct tccctgtaca cccctactcc 660 taccagtcgc ctgggctgcc cagtccgcct tacggtacca tggacagctc ccatgtcttc 720 cacgttaagc ctccgccgca cgcctacagc gcagcgctgg agcccttctt tgaaagccct 780 ctgactgatt gcaccagccc ttcctttgat ggacccctca gcccgccgct cagcatcaat 840 ggcaacttct ctttcaaaca cgaaccgtcc gccgagtttg agaaaaatta tgcctttacc 900 atgcactatc ctgcagcgac actggcaggg gcccaaagcc acggatcaat cttctcaggc 960 accgctgccc ctcgctgcga gatccccata gacaatatta 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His His His Gly Ala His His Ala Ala 180 185 190 His His His His Ala Ala His His His His His His His His His His 195 200 205 Gly Gly Ala Gly His Gly Gly Gly Ala Gly His His Val Arg Leu Glu 210 215 220 Glu Arg Phe Ser Asp Asp Gln Leu Val Ser Met Ser Val Arg Glu Leu 225 230 235 240 Asn Arg Gln Leu Arg Gly Phe Ser Lys Glu Glu Val Ile Arg Leu Lys 245 250 255 Gln Lys Arg Arg Thr Leu Lys Asn Arg Gly Tyr Ala Gln Ser Cys Arg 260 265 270 Phe Lys Arg Val Gln Gln Arg His Ile Leu Glu Ser Glu Lys Cys Gln 275 280 285 Leu Gln Ser Gln Val Glu Gln Leu Lys Leu Glu Val Gly Arg Leu Ala 290 295 300 Lys Glu Arg Asp Leu Tyr Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Ala Gly Arg 305 310 315 320 Gly Gly Pro Gly Ser Ala Gly Gly Ala Gly Phe Pro Arg Glu Pro Ser 325 330 335 Pro Pro Gln Ala Gly Pro Gly Gly Ala Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe 340 345 350 Leu <210> 9 <211> 1059 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atggccgcgg agctggcgat gggcgccgag ctgcccagca gcccgctggc catcgagtac 60 gtcaacgact tcgacctgat gaagttcgag gtgaagaagg agcctcccga 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ggccccggga gcgcgggcgg ggccggtttc ccgcgggagc cttcgccgcc gcaggccggt 1020 cccggcgggg ccaagggcac ggccgacttc ttcctgtag 1059

Claims (30)

  1. 인간 인슐린 생성 세포 집단(population of human insulin producing cells)의 제조 방법으로서,
    (a) 성인 인간 간 조직을 얻는 단계;
    (b) 상기 간 조직을 가공하여 1차 성인 인간 간 세포를 회수하는 단계;
    (c) 상기 1차 성인 인간 간 세포를 사전 결정된 세포 수로 증식 및 확장시키는 단계;
    (d) 상기 확장된 세포 배양물을 전환분화시키는 단계; 및
    (e) 상기 전환분화된 확장 세포를 채취하는 단계를 포함함으로써,
    대조군 비-전환분화된 간 세포에 비해 증가된 인슐린 함량, 또는 증가된 글루코스 조절 인슐린 분비, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 상기 인간 인슐린 생성 세포 집단을 제조하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  2. 제2항에 있어서, 상기 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.01pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간 인슐린 생성 세포 집단의 70% 초과는 내인성 PDX-1을 발현시키는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 PDX-1을 발현시키는 세포는 또한 내인성 NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합을 발현시키는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  5. 제3항에 있어서, PDX-1을 발현시키는 상기 집단의 5% 미만은 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시키는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 증가된 인슐린 함량은 상기 대조군 세포에 비해 적어도 5% 증가를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 간 조직은 췌장으로 또는 인슐린 의존성 당뇨병으로 고통받는 대상체로부터 얻은, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 간 세포를 증식시키고 확장시키는 단계는 생산 생물반응기 시스템까지의 일련의 계대배양 단계들을 통한 확장을 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생물반응기 시스템은 단일 생물반응기 또는 다중 생물반응기를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 생물반응기는 일회용 생물반응기, 다중 용도 생물반응기, 폐쇄 시스템 생물반응기 또는 개방 시스템 생물반응기, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 상기 확장된 세포의 상기 전환분화는 일련의 생물반응기 시스템을 통한 전환분화를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 상기 전환분화는 하기 단계들을 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법:
    (a) 상기 확장된 세포를 인간 PDX-1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 제1 시간 기간에 감염시키는 단계;
    (b) (a)의 상기 확장된 세포를 인간 NeuroD1 폴리펩타이드 또는 Pax4 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 제2 시간 기간에 감염시키는 단계; 및
    (c) (b)의 상기 확장된 세포를 인간 MafA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 제3 시간 기간에 감염시키는 단계.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 상기 전환분화는 하기 단계들을 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법:
    (a) 상기 확장된 세포를 인간 PDX-1 폴리펩타이드를 암호화하고, 제2 췌장 전사 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 제1 시간 기간에 감염시키는 단계; 및
    (b) (a)의 상기 확장된 세포를 인간 MafA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 제2 시간 기간에 감염시키는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제2 췌장 전사 인자는 NeuroD1 및 Pax4로부터 선택되는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제1 시간 기간 및 상기 제2 시간 기간은 동시인, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  16. 제1항에 있어서, 전환분화의 경향이 있는 세포에 대해 상기 1차 성인 인간 간 세포를 농축시키는 단계를 더 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 경향이 있는 세포는 주심(pericentral) 간 세포를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 1차 성인 인간 간 세포를 리튬과 함께 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 인큐베이션하는 단계는 전환분화 전인, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 경향이 있는 세포는 하기를 포함하는 세포를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법:
    (a) 활성 Wnt-신호전달 경로;
    (b) 상기 글루타민 합성효소 반응 요소(GSRE)를 활성화시키는 능력;
    (c) HOMER1, LAMP3, BMPR2, ITGA6, DCBLD2, THBS1, 또는 VAMP4, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현;
    (d) ABCB1, ITGA4, ABCB4 또는 PRNP, 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 발현; 또는
    이들의 임의의 조합.
  21. 제1항에 있어서, 상기 사전 결정된 세포 수는 적어도 10억개의 세포를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단의 제조 방법.
  22. 인간 인슐린 생성 세포 집단으로서,
    (a) 성인 인간 간 조직을 얻는 단계;
    (b) 상기 간 조직을 가공하여 1차 성인 인간 1차 간 세포를 회수하는 단계;
    (c) 상기 1차 성인 인간 간 세포를 사전 결정된 세포 수로 증식 및 확장시키는 단계;
    (d) 상기 확장된 세포를 전환분화시키는 단계; 및
    (e) 상기 전환분화된 확장 배양물을 채취하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되되;
    상기 인간 인슐린 생성 세포 집단은 대조군 비전환분화된 간 세포에 비해, 증가된 인슐린 함량 또는 증가된 글루코스 자극 인슐린 분비, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  23. 제22항에 있어서, 상기 글루코스 조절된 인슐린 분비는 고글루코스 농도에 반응하여 적어도 0.01pg 인슐린/106개 세포/시간을 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  24. 제22항에 있어서, 상기 인간 인슐린 생성 세포 집단의 70% 초과는 내인성 PDX-1을 발현시키는, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  25. 제24항에 있어서, 상기 PDX-1을 발현시키는 세포는 또한 내인성 NeuroD1 또는 MafA, 또는 이들의 임의의 조합을 발현시키는, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  26. 제24항에 있어서, PDX-1을 발현시키는 상기 집단의 5% 미만은 또한 알부민 및 알파-1 항-트립신을 발현시키는, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  27. 제22항에 있어서, 상기 증가된 인슐린 함량은 상기 대조군 세포에 비해 적어도 5% 증가를 포함하는, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  28. 제22항에 있어서, 췌장염으로 또는 인슐린 의존성 당뇨병으로 고통받는 환자에 대한 세포 기반 요법에서 사용하기 위한, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  29. 제28항에 있어서, 상기 세포는 상기 환자와 자가(autologous) 또는 동종이계(allogeneic)인, 인간 인슐린 생성 세포 집단.
  30. 제22항의 인간 인슐린 생성 세포 집단 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
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