KR20120094488A - 세포의 재프로그램화 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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로우웨이다 엘라유비
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뉴 월드 레보러토리즈 인코포레이티드.
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Abstract

세포 탈분화, 전환 및 진핵 세포 재프로그램화 방법이 본 명세서에 개시된다. 또한, 시험관 내 탈분화 및 시험관 내 재프로그램화의 단계 후에 환자에게 이식될 수 있는 세포, 세포주 및 조직이 기재된다. 특정 실시형태에서, 세포는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 포함하는 줄기-유사 세포(SLC)이다. 또한, 인간 체세포 및 다른 유형의 세포로부터의 이들 세포의 생성 방법이 기재된다. 또한, 인간 치료법 및 다른 영역에서의 이렇게 생성된 세포의 조성물 및 사용 방법이 제공된다.

Description

세포의 재프로그램화 방법 및 이의 용도{METHODS FOR REPROGRAMMING CELLS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 제61/256,967호(출원일: 2009년 10월 31일)에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 진핵 세포 재프로그램화의 분야, 특히 세포 탈분화에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 체세포(및 기타 세포)로부터 안정적인 신경 줄기-유사 세포(Neural Stem-Like Cell: NSLC)를 생성하는 방법, 및 그렇게 생성된 세포의 인간 치료법에서의 용도에 관한 것이다.
세포 재프로그램화
의학, 과학 및 진단 분야에서, 난모세포 또는 다른 줄기 세포와 융합하거나 물질을 교환하지 않고, 용이하게 수득할 수 있는 세포를 일반적으로 수득하기 더 어려운 세포로 재프로그램화하거나, 세포가 새로운 기능적 특성 또는 상이한 기능적 특성을 갖도록 재프로그램화하는 것에 대한 요구가 있다.
제1 메커니즘(mechanism)에 따라, 줄기 세포는 자연적으로 분열하거나 다른 줄기 세포, 선구세포(progenitor), 전구세포(precursor) 또는 체세포로 분화할 수 있다. 제2 메커니즘에 따라, 체세포는 때때로 특정 조건에 놓였을 때, 일시적으로 그 표현형을 변경시키거나 특정 마커를 발현한 다음, 원래 조건에 다시 놓였을 때 다시 복귀할 수 있다. 제2 메커니즘에 따르면, 많은 세포의 표현형은 특정 유전자의 강제 발현을 통하여 변경될 수 있으나(예를 들어, 섬유아세포 내로 c-myc 유전자를 안정적으로 트랜스펙션(transfect)시키면, 이들이 신경선구세포(neuroprogenitor) 특징을 갖는 무한증식(immortal) 세포로 바뀐다), 일단 이러한 강제 유전자 발현이 제거되면, 세포는 그들의 원래 상태로 다시 천천히 복귀한다. 따라서, 상기 3가지 메커니즘 중 어느 것도 진정한 재프로그램화로 여겨서는 안된다: 제1은 이미 적소에 있는 세포 프로그램의 일부인 천연 분화로 여겨지며(더 미분화된 상태로부터 더 분화된 상태로 가는 것), 제2는 일시적인 표현형 변화이며, 제3은 일시적으로 강요된 세포 유형이다. 진정한 줄기 세포는: (i) 거의 '무기한' (체세포보다 상당히 더 길게) 자가-재생하며, (ii) 암 세포가 아니며, (iii) 강제 유전자 발현 또는 유사 수단(또한, 표준 줄기 세포 배지에서 유지될 수 있어야 함)에 의해 인공적으로 유지되지 않으며, (iv) 선구세포, 전구세포, 체세포 또는 다른 더 분화된 세포 유형(동일한 계통의)으로 분화할 수 있고, (v) 특정 마커 또는 유전자 발현 또는 형태적 외양만이 아닌 줄기 세포의 모든 특징을 갖는다.
일반적으로 줄기 세포로의 성공적인 재프로그램화 또는 탈분화를 청구하는 많은 특허 및 과학 문헌에도 불구하고, 거의 모든 이들 문헌이 진정한 재프로그램화를 개시하지 않고 있는데, 이는 이들이 상술된 메커니즘 중 하나로 분류되기 때문이다. 예를 들어, 바신(국제 특허 공개 WO2010/088735호), 치파렐리 등(미국 특허 공개 US2010/0003223호), 크레머 등(미국 특허 공개 US2004/0009595호) 및 위니어 등(미국 특허 공개 US2010/0047908호)은 모두 재프로그램화, 탈분화 및/또는 수득된 줄기 세포(또는 선구세포)를 보충물이 있는 상이한 배지 중의 배양 후에 세포 표면 마커의 변화에만 기초한 표현형 세포 변화로 지칭하며, 진정한 재프로그램화 또는 실제 줄기 세포 (줄기 세포 마커가 있고, 분화 마커가 없는 비-암성 자가-재생)의 증거가 없다. 증가된 Oct4 및 Sox2의 발현을 사용한 베네티(국제 특허 공개 WO2009/079007호)도 마찬가지이다. 다른 이, 예컨대, 아카마츄 등(국제 특허 공개 WO2010/052904호) 및 유 등(국제 특허 공개 WO2007/097494호, 미국 특허 공개 US2009/0246870호)은 줄기 세포를 만든 것으로 언급하나, 이들은 레트로바이러스(cMyc와 유사)에 의해 운반되는 불변의 인공 유전자 유도를 통해 발생하였으며, 무한증식/종양성이 아니고, 일시적이 아닌 안정적인 진정한 줄기 세포의 증거가 없다. 다른 이, 예컨대, 첸 등(미국 특허 공개 US2005/0176707호) 및 유 등(미국 특허 공개 US2009/0227023호)은 줄기 세포가 아닌 "다능 세포(multipotent cell)"를 만들었다. 또한, 이들의 주장된 다능 세포는 안정적이지 않으며(유 등의 경우에, 세포는 심지어 증식할 수 없었다), 표현형을 변화시키는 조건 및 일정한 배지 보충물 둘 모두를 사용하였다. 다른 이들, 예컨대 올리버리 등(국제 특허 공개 WO2009/018832호) 및 자흐너 등(미국 특허 공개 US2002/0136709호)은 게놈 영역의 DNA 탈메틸화 및 히스톤 아세틸화를 통하여 자동적으로 만능(pluripotent), 전능(totipotent), 다능 및/또는 단일능 세포를 제조하는 것을 청구하고 있으나, 안정적이며, 비-암이고, 진정한 세포주의 증거가 없다.
진정한 재프로그램화는 야마나카의 그룹(Takahashi et al., 2007) 및 톰슨의 그룹(Yu et al., 2007) 및 아마도 이들 전에 다른 이들에 의해 독립적으로 생성된 유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포)를 사용하여 달성된 것으로 보이며, 이들 세포 중 다수가 이후에 암인 것으로 관찰되었지만, 이들 중 일부는 그렇지 않았다. 이들 세포는 진정한 재프로그램화에 의해 유도될 수 있으며, 이는 이후에 이들이 비-유전자 통합(integrating) 일시적 트랜스펙션(Soldner et al., 2009; Woltjen et al., 2009; Yu et al., 2009)뿐 아니라, 단독의 RNA(Warren et al., 2010) 또는 단백질(Kim et al., 2009; Zhou et al., 2009) 또는 소분자(Lyssiotis et al., 2009)에 의하여, 그리고 유사 방법에 의해서도 유도될 수 있는 것으로 보여졌기 때문이다. 그러나, 이들 세포는 본질적으로 배아 줄기 세포와 동일하며, 비조절된 성장, 기형종 형성 및 잠재적인 종양 형성의 동일한 문제가 있다.
더욱 바람직한 옵션은 계통 및 분화능이 이들이 용이하게 기형종 및 비조절된 성장을 형성하지 못하도록 더 제한된 다능 줄기 세포 또는 만능-유사 세포를 갖는 것이다. 따라서, 다능 줄기 세포, 다능 줄기-유사 세포 및 줄기-유사 세포를 생성하는 방법 및 용이하게 수득할 수 있는 세포를 매우 목적으로 하는 다능 줄기 세포, 다능 줄기-유사 세포 및 줄기-유사 세포로 재프로그램화하거나 전환시키는 방법이 필요하다.
신경 줄기-유사 세포( NSLC )
중추신경계(CNS)의 회복은 의과학이 아직 극복하지 못한 한계 중 하나이다. 병상, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 뇌졸중은 피해를 입은 사람들에 대해 치명적인 결과를 가질 수 있다. 이들 병상에 대한 중심이 되는 바람은 신경망을 재건할 수 있는 세포 집단을 발생하고, 신경계의 기능을 다시 제대로 제공하는 것이다. 이러한 이유로, 신경 줄기 및 선구세포에서 관심이 많이 발생하였다. 현재까지, 일반적으로 다능 신경선구세포는 분화 경로에서 초기에 신경 제한된 세포 또는 신경교세포 제한된 세포 중 어느 하나로 수임되는 것으로 생각되었다.
신경 줄기 세포는 질환 또는 손상으로부터의 조직 재생을 보장하나; 그러나 이들 치료법은 필요한 세포 유형을 생성하기 위하여 세포 기능에 걸친 정밀한 조절을 필요로 할 것이다. 세포 증식 및 분화를 조절하는 메커니즘이 아직 완전히 이해되어 있지 않으며, 이에 따라, 뇌의 임의의 주어진 영역 또는 발생 중인 태아로부터 유래된 신경 줄기 세포 집단의 유연성을 완전히 탐구하기 어렵다.
통상적으로 제한된 재생 능력을 갖는 것으로 여겨지는 CNS는 성체, 특히 해마의 치상회 및 후각 신경구를 보충하는 뇌실하영역(subventricular zone)에서 제한된 수의 신경 줄기 세포를 보유한다(Singec I et al., 2007; Zielton R, 2008). 전구 세포의 이용가능성은 성숙 신경계 내의 결함의 이식-기반의 회복에 대한 주요 전제 조건이다. 따라서, 신경 이식에 대한 공여자 세포는 대부분 태아 뇌로부터 유래된다. 이는 면역-거부에 더하여, 많은 윤리적 문제를 일으키며, 이러한 방법이 많은 환자의 치료를 위해 사용될 수 있는지 의심스러운데, 이는 신경 줄기 세포가 각 세포 분열과 함께 이들의 능력의 일부를 소실할 수 있기 때문이다.
신경 줄기 세포는 신경변성 질환에서 세포-대체 치료법에 대한 유망한 치료 능력을 제공한다(Mimeault et al., 2007). 현재까지, 많은 치료적 이식은 공여 물질의 공급원으로서 다양한 인간 태아 조직 유형을 이용하여 수행되어 왔다. 그러나, 윤리적 및 실행적 고려 사항 및 이들의 비접근성은 이식 치료법에 대한 세포 공급원으로서의 이용가능성을 제한한다(Ninomiy M et al., 2006).
환자 특이적 세포의 유래에 대한 장애물과 제한을 극복하기 위하여, 한가지 방법은 피부 세포와, 신경 줄기 세포 및/또는 뉴런으로의 분화전환(trans-differentiation)을 유도하는 것을 사용하여 왔다(Levesque et al., 2000). 분화전환은 과거 수년 동안 주의가 증가되어 왔으며, 포유동물 세포의 분화전환은 공동-배양에서 또는 세포 배양 조건의 조작에 의하여 달성되었다. 세포 운명의 변경은 세포 배양물의 미세섬유 억제제(Shea et al., 1990), 호르몬(Yeomans et al., 1976) 및 칼슘-아이오노포어(Shea, 1990; Sato et al., 1991)로의 처리에 의하여 시험관 내에서 인공적으로 유도될 수 있다. 포유동물 상피 세포는 근육-유사 형상 및 기능을 획득하도록 유도될 수 있으며(Paterson and Rudland, 1985), 췌장 외분비관 세포는 인슐린-분비 내분비 표현형을 획득할 수 있으며(Bouwens, 1998a, b), 골수 줄기 세포는 간 세포(Theise et al., 2000) 및 신경 세포(Woodbury et al., 2000)로 분화될 수 있다. 다른 이, 예컨대 페이지 등(미국 특허 공개 US 2003/0059939호)은 체세포를 세포골격, 아세틸화 및 메틸화 억제제의 존재 하에서 배양함으로써, 체세포를 신경 세포로 분화전환시켰으나, 프라이밍 효능제(priming agent)의 제거 후에, 뉴런 형태 및 확립된 시냅스가 시험관 내에서 수 주를 넘지 않는 동안만 지속되고, 완전한 기능 및 안정적인 유형의 뉴런으로의 완전한 전환이 전혀 증명되지 않았다. 따라서, 이들은 일시적인 세포 표현형이다. 완전한 기능 및 안정적인 신경선구세포 또는 신경 줄기 세포의 유형으로의 완전한 전환도 또한 전혀 증명되지 않았다. 분화전환 후에 안정적인 표현형의 획득은 해당 분야에 직면되고 있는 주요 문제 중 하나이다.
따라서, 다양한 신경 장애 및 질환의 치료에서 사용하기 위한 안정적이며, 강력하고, 바람직하게는 자가유래의 신경 줄기 세포, 신경선구세포뿐 아니라 뉴런 및 신경교세포가 생물의학 분야에서 필요하다. 상기의 것은 많은 다른 유형의 세포에 대해서도 그러하다. 최근에, 기본 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH) 부류의 유전자가 신경 계통 발생에서 몇 단계의 중요한 조절자이며, 몇몇 신경성 bHLH 인자의 과발현이 비-결정된 외배엽의 신경 조직으로의 전환을 야기한다는 증거가 수득되었다. 전신경(Proneural) bHLH 단백질은 신경계의 도처에 신경 프로그램을 통한 선구세포로의 분화 및 이들의 진행을 조절한다(Bertrand et al ., 2002). MASH1, NeuroD, NeuroD2, MATH1-3 및 뉴로게닌(Neurogenin) 1-3은 포유동물 신경 결정 및 분화 동안 발현되는 bHLH 전사 인자이다(Johnson et al., 1990; Takebyashi et al., 1997; McCormick et al., 1996; Akazawa et al., 1995). 마우스에서 MASH1, Ngn1, Ngn2 또는 NeuroD의 표적화된 붕괴는 특정 서브셋의 뉴런의 소실을 야기한다(Guillemot et al., 1993; Fode et al ., 1998; Miyata et al., 1999).
미국 특허 제6,087,168호(Levesque et al.)는 상피 기저 세포의 생존가능한 뉴런으로의 전환 또는 분화전환 방법을 개시하고 있다. 일 예에서, 이러한 방법은 상피 세포를 신경 분화의 원인이 되는 신경 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 cDNA를 함유하는 하나 이상의 발현 벡터(들)로 트랜스펙션시키는 것을 포함한다. 적절한 cDNA에는 기본-헬릭스-루프-헬릭스 활성화제, 예컨대 NeuroD1, NeuroD2, ASH1 및 아연-핑거(finger)형 활성화제, 예컨대 Zic3 및 MyT1이 포함된다. 트랜스펙션 단계는 신경 분화를 억제하는 것으로 알려져 있는 적어도 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 인간 MSX1 유전자 및/또는 인간 HES1 유전자(또는 비-인간, 상동 대응물)를 성장 배지에 첨가하는 것으로 이어진다. 마지막으로, 트랜스펙션된 세포를 레티노이드 및 적어도 하나의 뉴로트로핀 또는 사이토카인, 예컨대 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀 3(NT-3) 또는 뉴로트로핀 4(NT-4)의 존재 하에 성장시켰다. 이러한 기술은 26%의 신경 세포를 생성하나; 이들 세포의 기능적 특성 또는 안정성은 확립되지 않았다. 또한, 신경 줄기 세포 또는 신경선구세포는 이 방법에 따라 생성되지 않는다.
이후의 방법(Levesque et al., 2005; 미국 특허 제6949380호)은 상피 기저 세포를 뼈 형성 단백질(BMP)의 길항제에 노출시키고, 세포를 MSX 1 유전자 및/또는 HES1 유전자의 세그먼트(segment)를 포함하는 적어도 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 성장시키는 것에 의한 상피 기저 세포의 신경선구세포, 신경 세포 또는 신경교세포로의 전환을 언급하고 있다. 그러나, 임의의 신경선구세포 또는 신경교세포가 이러한 방법에 따라 생성되었다는 증거 또는 예가 없고, 신경 세포의 형태학적, 생리학적 또는 면역학적 특성이 달성되었다는 어떠한 상세사항 또는 증거만이 허용되었다. 또한, 생성되거나 생성되지 않을 수 있는 세포에 관한 기능적 특성, 안정성, 증식 및 수율에 대한 정보가 없기 때문에, 이들 세포가 실제로 신경 세포로 분화되는 피부-유래의 전구세포일 가능성이 있다(Fernandes et al., 2004).
따라서, 상기의 관점에서, 안정적이며, 강력하고, 바람직하게는 자가유래의 신경 줄기 세포, 신경선구세포, 뉴런 및 신경교세포뿐 아니라 다른 유형의 세포, 줄기 세포 및 선구세포가 필요하다. 또한, 진정한 세포 탈분화 및 세포 재프로그램화를 야기할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명은 이들 요구를 다루며, 다양한 유형의 줄기-유사 및 선구세포-유사 세포 및 이들 줄기-유사 또는 선구세포-유사 세포로부터 유래되거나 분화된 세포뿐 아니라, 진정한 세포 탈분화 및 세포 재프로그램화를 야기할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 특징은 본 명세서에서 본 발명의 개시내용, 도면 및 설명의 검토로부터 명백할 것이다.
본 발명은 줄기-유사 및 선구세포-유사 세포 및 이들 줄기-유사 또는 선구세포-유사 세포로부터 유래되거나 분화된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 세포 탈분화 및 세포 재프로그램화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 세포의 재프로그램화에 유용한 조성물 및 방법 및 관련 치료 조성물 및 방법을 특징으로 한다.
하나의 특정 태양은 체세포 또는 비-신경 세포를, 신경 줄기 세포의 하나 이상의 형태학적, 생리학적 및/또는 면역학적 특징을 가지며, 신경 및 신경교세포 계통을 따라 분화하는 능력을 갖는 세포로 재프로그램화하기 위한 기법의 개발에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 따라, 본 발명은 더욱 구체적으로는 인간 체세포, 인간 선구세포 및/또는 인간 줄기 세포로부터 안정적인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 생성하는 방법, 및 이러한 방법을 사용함으로써 수득되는 세포, 세포주 및 조직에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 인간 체세포의 신경 줄기 세포 특이적 마커를 발현하는 신경 줄기-유사 세포로의 탈분화를 유도하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 세포의 다양한 분화된 신경 세포 유형으로의 전환을 달성하는 것이 가능하며, 이는 개별 공여자로부터 취한 단일 세포 유형으로부터 생성된 다음, 재프로그램화되고, 동일한 개체로 이식될 수 있다. 유도 시에, 본 발명에 따른 세포는 신경 줄기-세포 특이적 마커를 발현하고, 신경 줄기-유사 세포가 된다.
하나의 특정 태양에 따라, 본 발명은 제1 유형의 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 전환하는 방법에 관한 것이다. 이는 i) 제1 유형의 세포를 수득하는 단계; ii) 제1 유형의 세포에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제(reprogramming agent)의 세포내 수준을 일시적으로 증가시키는 단계로서, 상기 일시적인 증가가 적어도 하나의 유전자 조절인자(gene regulator)의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 것인 단계; iii) 세포를 목적으로 하는 세포의 성장 및/또는 전환을 지지하는 조건에 두고, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 재프로그램화 효능제의 부재 하에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 단계; 및 iv) 세포를 목적으로 하는 세포의 성장 및/또는 전환을 지지하는 배양 조건에서 유지하는 단계를 포함한다. 이러한 조건은 많은 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지한다. 본 발명에 따라서, 하나 이상의 제2 유전자의 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적인 한편, 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적인 것이 아니다. 따라서, 상기 기간의 마지막에, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포가 수득된다.
다른 특정 태양에 따라, 본 발명은 제1 유형의 세포를 상이한 제2 유형의 세포로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 제1 유형의 세포를 상기 세포 내에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 수준을 증가시킬 수 있으며 세포의 염색질 및/또는 DNA를 집적적으로 또는 간접적으로 리모델링(remodeling)할 수 있는 하나 이상의 효능제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 재프로그램화 효능제는 상이한 유형의 목적으로 하는 세포 또는 상이한 세포 계통의 형태 및 기능 특징의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도하도록 선택된다.
다른 태양에 따라, 본 발명은 제1 유형의 세포를 상이한 제2 유형의 세포로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 상기 세포의 염색질 및/또는 DNA를 리모델링할 수 있는 효능제와 접촉시키는 단계; 및 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 재프로그램화 효능제는 상이한 세포 계통 또는 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 형태 및 기능 특징의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도하기 위해 선택된다.
본 발명의 추가의 태양은 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는 단계로서, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 목적으로 하는 제2 세포 유형의 형태 및 기능 특징의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도하기 위해 선택되는 것인 단계; 및 제1 유형의 세포를 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하기 위한 배양 조건에서 유지하는 단계로서, 제2 전자의 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이며, 적어도 하나의 제2 유전자는 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않은 것인 단계를 포함하는, 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 세포로의 전환 방법에 관한 것이다. 상기 기간의 마지막에, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포가 수득되며, 수득된 세포는 추가로 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 태양은 제1 유형의 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 재프로그램화하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 하기를 포함한다:
- 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준의 일시적인 증가(적어도 하나의 재프로그램화 효능제는 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하며, 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 내인성 발현이 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 존재에 필요하다);
- 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현;
- 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현(제2 유전자의 안정적인 발현은 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현의 결과이며, (i) 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, (ii) 적어도 하나의 상기 제2 유전자의 안정적인 발현은 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않으며, (i) 및 (ii)는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 성공적인 재프로그램화를 나타낸다).
특정 실시형태에서, 상기 방법에서의 적어도 하나의 재프로그램화 효능제는 MDB2 폴리펩티드와 함께 Msi1 폴리펩티드 또는 Ngn2 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 조절인자는 Sox2, Msi1 또는 둘 모두이다. 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 조절인자는 신경 줄기-유사 세포에 대하여 표 A에 열거된 하나 이상의 유전자일 수 있다.
추가의 태양에 따르면, 본 발명은 줄기-유사 세포(Stem-Like Cell: SLC)의 수득 방법에 관한 것이며, 이 방법은
i) 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
ii) 세포 내에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 일시적으로 증가시키는 단계로서, 일시적인 증가가 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 것인 단계;
iii) 세포를 줄기-유사 세포로의 전환을 지지하는 조건에 두고, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 재프로그램화 효능제의 부재 하에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 단계;
iv) 세포를 줄기-유사 세포로의 전환을 지지하는 조건에 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 두는 단계로서, 제2 유전자의 발현이 줄기-유사 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, 적어도 하나의 제2 유전자는 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않은 것인 단계를 포함한다. 상기 기간의 마지막에, 줄기-유사 세포가 수득된다.
다른 태양에 따라, 본 발명은 줄기-유사 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제1 유형의 세포의 줄기-유사 세포로의 직접적 또는 간접적인 전환을 추진할 수 있는 목적으로 하는 줄기 세포 유형에 특이적인 적어도 하나의 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 줄기-유사 세포의 수율 또는 유형을 증가시키기 위하여, 상기 방법은 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 히스톤 아세틸화제(acetylator), 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 탈메틸화제(demethylator) 및/또는 DNA 메틸화의 억제제와 접촉시키는 단계; 및/또는 제1 유형의 세포의 줄기-유사 세포로의 직접적 또는 간접적 전환을 추진할 수 있는 목적으로 하는 줄기 세포 유형에 특이적인 적어도 하나의 다른 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제1 유형의 세포의 NSLC로의 직접적 또는 간접적 전환을 추진할 수 있는 적어도 하나의 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. NSLC의 수율 또는 유형을 증가시키기 위하여, 상기 방법은 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 탈메틸화제 및/또는 DNA 메틸화의 억제제와 접촉시키는 단계; 및/또는 제1 유형의 세포의 NSLC로의 직접적 또는 간접적 전환을 추진할 수 있는 적어도 하나의 다른 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 피부 세포를 무사시(Musashi)1, 무사시1 및 뉴로게닌 2, 무사시1 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 또는 뉴로게닌 2 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션시켜, 피부 세포를 NSLC로 재프로그램화하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 피부 세포를 (i) 히스톤 탈아세틸화의 억제제, (ii) DNA 메틸화의 억제제, (iii) 히스톤 아세틸화제 및/또는 (iv) DNA 탈메틸화제, 예컨대 MBD2 폴리펩티드에 노출시키는 단계; 및/또는 MBD2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션시키는 단계; 및 세포를(동시에, 이전에 또는 이후에) 무사시1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 NGN2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 추가로 트랜스펙션시켜, 피부 세포를 NSLC로 재프로그램화하는 단계를 포함한다. 또한, 일부 다른 세포, 예컨대 케라틴 세포 및 CD34+ 세포를 사용하고 재프로그램화할 수 있다.
특정 일 실시형태에서, 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법은
- 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
- 하나 이상의 하기의 폴리펩티드를 일시적으로 발현할 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계: 무사시1(Msi1); 무사시1(Msi1) 및 뉴로게닌 2(Ngn2); 무사시1(Msi1) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2); 및 뉴로게닌 2(Ngn2) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2); 및
- 세포를 NSLC로의 전환을 지지하는 배양 조건에 다수의 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하는 충분한 기간 동안 두는 단계로서, 유전자의 발현이 NSLC의 표현형 및 기능적 특성에 특징적인 것인 단계를 포함한다.
상기 기간의 마지막에, NSLC가 수득되며, 수득된 NSLC는 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 추가로 특징으로 한다.
다른 실시형태에 따르면, 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법은
- NSLC가 아닌 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
- 적어도 하나의 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계로서, 폴리펩티드가 제1 유형의 세포의 NSLC로의 직접적 또는 간접적인 전환을 추진할 수 있는 것인 단계; 및
- 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화제의 억제제, DNA 탈메틸화제 및/또는 DNA 메틸화의 화학적 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 따르면, 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법은
- 비-NSLC를 수득하는 단계;
- 비-NSLC를 MBD2 폴리펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 무사시1 폴리펩티드를 암호화하고/하거나 NGN2 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 제2 폴리뉴클레오티드로 공동-트랜스펙션시키는 단계;
- 공동-트랜스펙션된 세포를 상기 NSLC가 수득될 때까지, NSLC의 전환을 지지하기 위한 배양 조건에 두는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 태양은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 수득된 세포를 포함하는 분리된 세포, 세포주, 조성물, 세포의 3D 어셈블리(assembly) 및 조직에 관한 것이다. 추가의 태양은 의학적 치료 및 포유동물 조직 또는 기관을 재생하는 방법의 이러한 분리된 세포, 세포주, 조성물, 세포의 3D 어셈블리 및 조직의 용도에 관한 것이다.
다시, 추가의 태양은 대상체에서 조직을 회복시키거나 재생하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 재프로그램화된 세포의 병상의 완화를 필요로 하는 대상체로의 투여를 포함하며, 투여는 주어진 조직 또는 기관의 생물학적 기능을 증가시키거나 지지하는데 충분한 용량의 재프로그램화된 세포를 제공하여, 이에 의해 대상체의 병상이 완화된다.
본 발명의 이점은 상당하며, 면역억제제의 필요성을 없앰으로써 세포 치료법의 비용을 더 낮추고, 배아 또는 태아 조직이 필요 없어, 이에 따라 윤리적 제약 및 시간 제약을 없애고, 생산 비용을 더 낮추고, 바이러스 또는 다른 질환의 가능한 전이로 인한 건강의 위험이 없는 것이 포함된다. 또한, 세포를 신선하게 생성하기 때문에, 이들은 다수 회 계대된 세포보다 더 강력한 경향이 있다.
본 발명의 추가의 태양, 이점 및 특징은 하기의 바람직한 실시형태의 비-제한적인 설명의 열람시에 더욱 명백해질 것이며, 이는 예시적인 것으로, 본 발명의 범주를 제한하지 않는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1은 다양한 시점에 Msi1 및 MBD2로 트랜스펙션시킨 세포 및 비트랜스펙션된 세포의 세포 형태 변화를 제시하는 광학 현미경(10×)의 패널이다.
도 2는 MBD2의 존재 하에 Msi1 또는 Ngn2로 트랜스펙션시킨 세포에서 NCAM 양성 세포를 나타내며, 셀로믹스(상표명)(10×)를 사용하여 수득한 현미경 사진의 패널이다. HFF를 사이토칼라신 B(10㎍/㎖)로 사전처리하고, pCMV6-XL5-Msi1 및 pCMV6-XL5-MBD2 또는 pCMV6-XL4-Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에, 배지를 교환하고, 세포를 EGF(epidermal growth factor)(20ng/㎖) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)(20ng/㎖)를 보충한 증식 배지(NPBM, 론자(Lonza))에서 1주 동안 배양하였다. 배지를 NGF(20ng/㎖), bFGF(20ng/㎖), ATRA(5μM) 및 포르스콜린(10μM)을 보충한 NbActive(브레인비츠(BrainBits)(상표명))로 교환함으로써 분화를 유도하였다. 세포를 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 20일 동안 인큐베이션하였다.
도 3은 MBD2의 존재 하에 Msi1 또는 Ngn2로 트랜스펙션시킨 세포에서 MAP2b 양성 세포를 나타내며, 셀로믹스(상표명)(10×)를 사용하여 수득한 현미경 사진의 패널이다. MAP2b 양성 세포는 비트랜스펙션된 세포 및 Pax6/MBD2로 트랜스펙션시킨 세포에서 검출가능하지 않다. HFF를 사이토칼라신 B(10㎍/㎖)로 사전처리하고, pCMV6-XL5-Msi1, pCMV6-XL4-Ngn2 또는 pCMV6-XL5-Pax6 및 pCMV6-XL5-MBD2로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에, 배지를 교환하고, 세포를 EGF(20ng/㎖) 및 bFGF(20ng/㎖)를 보충한 증식 배지(NPBM, 론자)에서 1주 동안 배양하였다. 배지를 NT-3(20ng/㎖), bFGF(20ng/㎖), ATRA(5μM) 및 포르스콜린(10μM)을 보충한 NbActive(브레인비츠(상표명))로 교환함으로써 분화를 유도하였다. 세포를 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 2주 동안 인큐베이션하였다.
도 4A는 실시예 V로부터의 NSLC에 의해 형성된 뉴로스피어(neurosphere)를 아큐타제(Accutase)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리시켰음을 나타내는 사진의 패널이며, 하나의 단일 세포를 뉴로스피어 형성 능력을 보여주기 위하여 시간의 경과에 따라 모니터링하였다(A, 광학 현미경 관찰), 뉴로스피어는 Sox2에 대해 양성으로 염색되었다.
도 4B는 셀로믹스(상표명)를 사용하여 수득한 면역조직화학 결과로부터의 사진의 패널이다. 면역조직화학을 20일에 수행하여, 뉴로스피어에 대한 마커를 검출하고, 정상 인간 신경선구세포(hNPC, 론자)에 의해 형성된 뉴로스피어 내의 발현 수준과 비교하였다. Sox2 외에, 세포는 신경 줄기 세포 마커 무사시, CD133, 네스틴 및 GFAP에 대하여 양성으로 염색되었다. 또한, 세포는 βIII-튜불린(뉴런에 대한 마커), O4(희소돌기아교세포에 대한 마커) 및 GFAP(성상세포에 대한 마커)에 대하여 양성으로 염색되었으며, 이는 두 세트의 세포(NSLC 및 hNPC) 둘 모두의 3-능 분화능을 나타내며, 이는 NGFrec 및 NeuN(분화된 뉴런에 대한 마커)에 대하여 음성이었으며, 이는 세포가 최종적으로 분화되지 않았음을 나타낸다.
도 5는 셀로믹스(상표명)를 사용하여 수득된 면역조직화학 결과로부터의 현미경 사진 패널이다. 면역조직화학을 HFF, NSLC 및 hNPC에서 수행하여, 부착 배양(세포를 부유 및 뉴로스피어 형성으로부터 방지)에서, 섬유아세포뿐 아니라 신경 줄기 세포(Sox2, 네스틴, GFAP)에 대한 마커의 발현을 검출하였다. 핵을 훽스트(Hoechst)로 염색하였다(상측 레벨 사진). HFF는 섬유아세포 마커를 발현하는 한편, 이들 HFF로부터 생성된 NSLC는 그렇지 않았다. 비교하여, NSLC는 신경 줄기 세포 마커를 hNPC와 유사하게 발현하였으나, HFF는 이들 마커 중 임의의 것을 발현하지 않았다.
도 6은 인간 NSLC를 나타내는 현미경 사진 패널이다. 인간 NSLC를 3주 동안 BDNF(20ng/㎖, 페프로테크(Peprotech)) 및 bFGF(40ng/㎖, 페프로테크)의 존재 하에서 NS-A 분화 배지(스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies))의 존재 하에 신경 계통으로 분화되게 유도하였다. 상이한 분화 시점에, 셀로믹스(상표명)(10×)를 사용한 면역염색은 Sox2 양성 세포의 감소 및 p75, βIII-튜불린 및 GABA 양성 세포의 염색의 세기 및 수의 증가뿐 아니라 분화된 형태로 나타낸 바와 같이 세포의 분화를 나타내는 한편, 총 세포수는 훽스트 염색으로 나타낸 바와 같이 증가하였다.
도 7은 현미경 사진의 다른 패널이다. HFF, 각질형성세포 및 CD34+를 pCMV6-Msi1-Ngn2 및 pCMV6-XL5--MBD2로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에, 배지를 EGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 bFGF(20ng/㎖, 페프로테크)를 보충한 증식 배지(스템셀 테크놀로지즈)로 2주 동안 교환한 다음 분석하였다. 셀로믹스(상표명)(10×)를 사용한 현미경 사진은 모든 3가지 유형의 세포로부터 생성된 NSLC가 네스틴, Sox2 및 GFAP(신경 줄기 세포에 대한 마커)에 대하여 양성인 한편, 원래의 HFF는 그렇지 않음을 나타낸다.
도 8은 뉴런을 향한 HFF의 분화전환에서의 CDM 배지의 효과를 나타내는 현미경 사진의 패널이다. HFF를 사이토칼라신 B(10㎍/㎖) 및 히스톤 탈아세틸화 억제제(VPA, 4 mM) 및 DNA 메틸화 억제제(5-Aza, 5μM)로 사전-처리하고, 3:1 비의 둘베코(Dulbecco)의 변형 이글 배지(DMEM, L-글루타민과 피루브산나트륨이 있는 고 글루코스(4.5g/ℓ)) 및 하기의 성분이 보충된 햄(Ham)의 F-12 배지를 함유하는 CDM 배지에서 배양하였다: EGF(4.2×10-10M), bFGF(2.8×10-10M), ITS(8.6×10-5M), 덱사메타손(1.0×10-7M), L-아스코르브산 포스페이트 마그네슘 염 n-수화물(3.2×10-4M), L-3,3',5-트라이아이오도티로닌(2.0×10-10M), 에탄올아민(10-4M), 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)(4×10-3M), 글루타티온(3.3×10-6M). 24시간 후에, 배양 배지를 75% 의 CDM 배지 및 25%의 신경 증식 배지(론자, Cat#CC-3210)로 교체하고; 다음 3일 동안에, 배지의 비를 50%:50%, 25%:75% 및 그 다음, 3일에 100% 신경 증식 배지로 교환하였다. 상이한 시점에, 세포를 βIII-튜불린(신경 마커) 및 훽스트(핵을 염색)로 면역염색한 후에, 현미경 사진을 셀로믹스(상표명)(10×)로 취하였다. 세포는 수일 내에 분화전환을 시작하였으며, 분화전환된 세포는 βIII-튜불린 양성이었으나; 1주 후에, 섬유아세포 형상으로의 자발적인 전환 및 βIII-튜불린 발현의 소실이 관찰되었다.
도 9는 Msi1 및 Ngn2로의 트랜스펙션 후에 상이한 시점에 CDM 내에서의 재프로그램화된 세포의 특성화를 나타내는 현미경 사진의 패널이다. 트랜스펙션된 세포를 사이토칼라신 B(10㎍/㎖), VPA(4mM) 및 5-AZA(5μM)로 처리하여, 미세섬유의 붕괴, 세포의 라운딩 업(rounding up) 및 염색질의 풀림을 야기하였다. 3-차원 CDM에서의 면역조직화학을 셀로믹스(상표명)(10×)를 사용하여 1주 및 2주 후에 수행하였다. 세포는 신경 성숙 마커, 예컨대 MAP2b에 대해서 양성이었으나, 비트랜스펙션된 대조군 CDM에서는 없었다.
도 10은 현미경 사진의 다른 패널이다. 4일 CDM 내에 세포를 6시간의 기간 동안 pCMV-XL5-MBD2와 병용한 2개의 벡터 pCMV6-XL5-Msi1 및 pCMV6-XL4-Ngn2를 개별적으로 또는 함께 사용하여 리포트랜스펙션(lipotransfect)시켰다. 병행하여, 트랜스펙션을 뉴클레오펙션(Nucleofection)을 사용하여 6시간 후에 새로운 HFF에서 수행하고, 이들 새로운 HFF를 6시간 후에 리포펙타민 배지를 신선한 CDM 배지로 교환하였을 때와 동일한 시간에 CDM의 상측에 두었다. 24시간 후에, 배지를 1주 동안 Noggin(50ng/㎖, 페프로테크), 재조합 hFGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 재조합 hEGF(20ng/㎖, 페프로테크)의 존재 하에 신경 증식 배지(NPBM, 론자)로 교체하였다. NS-A 분화 배지(스템 셀 테크놀로지즈)를 24일 동안 첨가함으로써, 분화를 7일에 유도하였다. 면역조직화학을 셀로믹스(상표명)(10×)를 사용하여 다양한 시점에 수행하였다. CDM을 네스틴(신경 줄기 세포에 대한 마커)에 대한 특이적인 항체로 염색하였으며, CDM 내의 세포는 트랜스펙션 후 시험한 거의 모든 시점(8일, 15일 및 21일)에 네스틴을 발현하였다. 비트랜스펙션된 대조군 CDM 내의 세포는 어떠한 네스틴도 발현하지 않았다.
도 11은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 사진을 나타내는 패널이다. 부착 배양 또는 현탁 배양(뉴로스피어로서)으로 성장한 NSLC 둘 모두는 텔로머라제(telomerase)(이는 모든 줄기 세포에서 발현되나, 정상의 분화된 체세포에서는 그렇지 않다)를 발현한다. 조기(p5) 및 후기(p27) 계대 NSLC 둘 모두는 텔로머라제를 발현한다. (NSLC가 생성된 원래의 HFF는 텔로머라제를 발현하지 않았다.) 샘플(NSLC)을 스핀 다운(spin down)시키고, 상층액의 단백질 농도를 BCA 검정을 사용하여 결정하였다. 각 세포 추출물으로부터의 900ng의 단백질을 TRAP 반응 완충액, dNTP, 주형 물질(TS) 프라이머, TRAP 프라이머 믹스 및 Taq 중합효소를 함유하는 TRAP 반응 혼합물에 직접 첨가하였다. 반응 혼합물을 주형 합성을 위해 30℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 연장된 텔로머라제 생성물의 증폭을 위한 PCR 절차(초기 변성을 위해 95℃/15분, 32 사이클 동안 94℃/30초, 59℃/30초, 72℃/1분)로 이어졌다. 텔로머라제 활성을 검출하기 위하여, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 10% 비-변성 TBE 겔 상의 반응 생성물에 대해 수행하였다. 전기영동 후에, 겔을 SYBR(등록상표) 그린(Green) I 핵산 겔 염색으로 30분 동안 염색하고, 겔-도큐멘테이션 시스템(Gel-Documentation System)(알파 이노테크(Alpha Innotech))을 사용한 이미지 캡쳐로 이어졌다. 모든 4개의 샘플은 (TRAP 생성물 래더(ladder)에 의해 나타낸 바와 같이) 텔로머라제 양성이었다.
도 12는 일시적인 트랜스펙션 2주 후에, Msi1 및 Ngn2 유전자 통합에 대해 분석한 2개의 상이한 NSLC 샘플의 서던 블롯 분석을 표시한 사진을 나타내는 패널이다. Dig-표지된 PCR 프로브에 의해, Msi1/Ngn2 플라스미드 DNA를 게놈당 1, 10 또는 100개의 통합의 당량에 대하여 HFF 게놈 DNA 내로 스파이킹한(spiked) 양성 대조군 샘플에서 다른 신호가 나타났다. 비트랜스펙션된 HFF와 NSLC 샘플 #1 및 #2로부터의 제한 효소 분해된 게놈 DNA에서 소수의 약한 동일한 밴드가 있었으며, 이는 NSLC의 게놈 DNA 내로의 플라스미드 DNA 통합이 없었음을 시사한다. 이들 약한 밴드는 내인성 Ngn2 유전자를 나타낼 수 있는데, 1.2 kb Dig-표지된 PCR 프로브가 작은 부분의 Ngn2 유전자를 함유할 수 있기 때문이다. 적절한 제한 효소(NEB)로 완전히 분해된 많은 플라스미드에 속하는 밴드로서의 DNA kb 래더의 레인(lane)에서, 양성의 신호가 있었다. 이러한 데이터는 일시적인 트랜스펙션 후에, NSLC가 숙주 게놈 내로의 플라스미드 통합을 가지지 않거나, 소수의 NSLC 만이 숙주 게놈 내로의 플라스미드 통합을 가지고, 일시적으로 트랜스펙션된 유전자는 오직 짧은 기간 동안(2주 미만)만 세포에서 존재하였음을 나타낸다.
도 13은 NSLC로 처리된 EAE 마우스에서 유의미하게 더 나은 임상 점수와 향상을 보이는 선 그래프 및 막대 그래프를 갖는 패널이다. 암컷 8주령 C57BL/6 마우스를 등의 2 부위에 5㎎/㎖의 건조시킨(사멸 및 건성) 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Ra(디프코 인코포레이티드(Difco, inc))를 함유하는 CFA 중의 MOG35 -55(쉘돈 바이오테크놀로지 센터 맥길 유니버서티(Sheldon Biotechnology Centre McGill University))로 면역화시키고, PBS 중의 200ng의 백일해 독소를 0일 및 2일에 복강내로 주사하였다. 일단 마우스가 EAE의 징후를 보이기 시작하면(면역화 13일 후에), 이들에 200㎕의 NSLC(100만개 세포), hNPC (100만개 세포), 염수 또는 사이클로스포린이 있는 염수를 정맥내 주사하였다. 염수 대조군을 제외한 모든 마우스에 매일 사이클로스포린의 주사를 제공하였다. 마우스를 임상 질환에 대하여 매일 점수를 매겼다; 데이터는 1일 평균 점수를 나타낸다. 단일의 NSLC의 주사를 제공한 마우스는 hNPC 또는 사이클로스포린을 단독으로 제공한 마우스보다 유의미하게 더 낮은 질환 중증도를 가졌다.
도 14는 실시예 XVII 파트 2에 따른 로타로드(rotarod) 평가의 결과를 나타내는 선 그래프이다. 래트를 실험의 시작 전에 로타로드에서 훈련시켰다. 래트를 정지하고 있는 로타로드 및 회전하고 있는 로타로드(20rpm으로 회전)에 두고, 래트가 떨어지기 전에 로타로드에서 보행하면서 소비한 시간을 모니터링하였다. 좌뇌 반구 절제 및 치료 전(수술-전) 및 후(수술-후)에 측정하였다. 데이터 점은 20rpm의 고정 속도에서 수행한 각 60초의 시험 세션 동안 각 동물이 떨어지는 평균 수를 나타낸다. 각 군은 8마리의 래트로 이루어져 있다.
도 15는 실시예 XVII 파트 2에 따른 보행 평균대(walking beam) 평가의 결과를 나타내는 선 그래프이다. 래트를 좌뇌 반구 절제 및 치료 후에 100㎝ 길이의 빔을 가로지르는 그들의 능력에 대하여 평가하였다. 수술 2일 후에, 모든 그룹은 시험을 통과하지 못하였으며, 동물은 빔에서 균형을 유지할 수 없다. 수술 1주 후에, 모든 동물은 그들의 보행 능력에서 향상을 보였으나, 상이한 치료군 사이에 유의미한 차이를 알아낼 수 없었다. 4주 내지 26주에서, NSLC로 처리한 동물은 다른 군에 비해 그들의 보행 능력에서 유의미한 향상을 보였다.
도 16은 실시예 XIX에 기재된 바와 같은 뉴클레오펙터를 사용하여 다양한 만능 벡터로 일시적으로 트랜스펙션된 ADSC(Adipocyte Derived Stem Cell)의 사진을 나타내는 패널이다. 트랜스펙션 후에, 세포를 6-웰 플레이트에서 ADSC 완전 배지(스템프로(StemPro)(상표명) 43) 및 배아 줄기 세포 배지(mTeSR1(상표명) 스템셀 테크놀로지즈)의 50:50 혼합물을 사용한 현탁액 중에서 배양하였다. 배양 중에서 2일 후에, 세포를 동일한 플라스미드로 다시 트랜스펙션시키고, 티아조비빈(0.5μM), ALK-5 억제제(SB341542, 스템젠트(Stemgent), 2μM) 및 MEK의 억제제(PD0325901, 스템젠트, 0.5μM)가 보충된 mTeSR1(상표명) 완전 배지의 존재 하에 매트리겔(Matrigel)(상표명)(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences))이 코팅된 96 웰-플레이트에 플레이팅하였다. 배지를 매일 교환하고, 세포를 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 22일 동안 배양하고 AP 염색 및 면역조직화학을 후행하여, 만능성 마커의 발현을 분석하였다. 세포는 콜로니를 형성하였으며, 세포를 pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP로 트랜스펙션시킨 후에, 둘 모두의 만능성 마커 Oct4 및 AP를 발현하는 것으로 관찰되었다.
도 17은 pCMV6-XL5-Rex1/pCMV6-XL5-Klf4 및 pCMV6-XL5-Rex1/pCMV6-XL4-Oct4로 일시적으로 트랜스펙션된 ADSC의 사진을 나타내는 패널이다. 제2 트랜스펙션 후에, ADSC를 매트리겔(상표명)이 코팅된 96-웰 플레이트에서 SB341542 및 PD0325901이 보충된 mTeSR1(상표명) 배지의 존재 하에 24일 동안 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 배양하였다. 트랜스펙션 후에, 세포의 하위집단을 특성화하기 위하여, 생세포 염색, 면역조직화학 및 AP 염색을 사용하였다. Rex1/Oct4 또는 Rex1/Klf4를 트랜스펙션시킨 전체 세포의 1 내지 5%가 SSEA-4+ 및 TRA-1-81+ 표현형(초기 만능성 마커)을 보였다. 시간에 따른 관찰은 22일에 시작하여, 이들 콜로니의 표현형이 조기 SSEA-4+ 표현형에서 후기 Oct4+/Sox2/Nanog+ 표현형으로 변하는 것을 나타내었으며, 이는 최종 재프로그램화된 상태 및 만능-유사 세포에 더 가까웠다.
도 18은 다양한 만능 벡터를 일시적으로 트랜스펙션시킨 ADSC의 사진을 나타내는 패널이다. 트랜스펙션 후에, 세포를 매트리겔(상표명)(비디 바이오사이언스즈)이 코팅된 24 웰 플레이트 상에 스템프로(상표명) MSC SFM 배지에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2 , 5% 02에서 인큐베이션하였다. 1일에, 배지를 75% 스템프로(상표명) MSC 및 25% hES 세포 배지의 믹스로 교환하고; 스템프로(상표명) NSC SFM 배지의 백분율을 4일에 걸쳐 매일 감소시켜, 4일까지 100% hES 세포 배지를 갖게 하였다. 그 다음, 배지를 매 2일마다 교환하였다. hES 세포 배지는 20% 낙아웃(Knockout)(상표명) 혈청 대체물(KSR, 인비트로젠(Invitrogen)), 1mM 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명), 100μM 비필수 아미노산, 100μM β-머캅토에탄올 및 10ng/㎖ Fgf-2가 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, 인비트로젠)로 이루어져 있다. 트랜스펙션 후에, 세포의 하위집단을 특성화하기 위하여, 생세포 염색, 면역조직화학 및 AP 염색을 사용하였다. Oct4/UTF1/MBD2, Oct4/Dppa4/MBD2, FoxD3/Dppa4/MBD2, Oct4/FoxD3/Dppa4 및 Sox2/FoxD3/UTF1로 트랜스펙션시킨 트랜스펙션된 세포는 14일에 SSEA-4+, TRA1-60 및 TRA-1-81+ 표현형(조기 만능성 마커)에 대하여 양성이었다.
도 19는 일시적으로 트랜스펙션된 HFF의 사진을 나타내는 패널이다. HFF를 하기의 3가지 1㎍의 DNA 플라스미드를 각각 사용한 점을 제외하고는 실시예 II에 기재된 절차를 따라, 뉴클레오펙터(등록상표) II 디바이스(론자)를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다: pCMV-Oct4nuc-IRES2-Sox2nuc, pCMV-Klf4nuc-IRES2-Cmycnuc 및 pCMV-Nanognuc-IRES2-Lin28. 세포를 VPA 및 5-Aza와 함께 또는 이것 없이 전처리하였다. 트랜스펙션 후에, 세포를 매트리겔(상표명)(비디 바이오사이언스즈) 코팅된 6-웰 플레이트 상에서 VPA(2mM) 및 5-AZA(2.5μM)가 보충되거나 보충되지 않은 섬유아세포 배지에서 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 1일 및 2일에, 배지를 VPA 및 5-AZA가 보충되거나 보충되지 않은 100% mTeSR1(상표명) 배지(스템셀 테크놀로지즈)로 교환하였다. 3일 및 6일에, 세포를 상기와 같이 다시 트랜스펙션시키고, VPA 및 5-AZA가 보충되거나 보충되지 않은 mTeSR1(상표명) 배지에서 매트리겔(상표명) 코팅된 플레이트 상에서 플레이팅하였다. 배지를 상기와 같이 매일 교환하였다. 7일 내지 14일에 배지에 Y27632(스템젠트, 10μM)를 보충하여, 유력한 재프로그램화된 세포의 생존력 및 클론 증식을 증진시켰다. 세포를 20일에 알칼라인 포스파타제 검출 키트(밀리포어(Millipore))를 사용하여, 면역조직화학 분석에 의하여 분석하였다. 일부 세포는 만능성 마커 AP, SSEA-4 및 TRA-1-81(Mel2 인간 배아 줄기 세포주(양성 대조군)와 유사)에 대해 양성으로 염색되었다. 이들 클론은 억제제(즉, VPA 및 5-AZA)를 함유하지 않았던 조건에서만 수득되었다. 이들 억제제로 처리한 조건에 대하여 클론이 관찰되지 않았다.
도 20은 트랜스펙션된 NSLC 및 BG-01의 사진을 나타내는 패널이다. NSLC 및 BG-01 NS를 실시예 II에서 이전에 기재된 바와 같이, 2가지 에피솜(episomal) 벡터, pEF-Oct4nuc-IRES2-MBD2(NC1) 또는 pCMV-FoxD3-2A-Oct4-2A-Klf4(F72)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 수집하고, 증식 배지 및 mTeSR1(상표명) 배지(50:50)의 존재 하에서, 37℃, 5% CO2의 증식 조건에서 비-코팅된 페트리-디쉬(petri-dish)에 플레이팅하였다. 48시간 후에, 세포를 동일한 플라스미드로 다시 트랜스펙션시키고, 매트리겔(상표명)이 코팅된 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 22일 동안 소 분자 BIX01294(스템젠트, 2μM) 및 BayK8644(스템젠트, 2μM)가 보충된 mTeSR1(상표명) 배지의 존재 하에서 배양한 후에, 생세포 염색 및 면역조직화학을 수행하여, 만능성 마커에 대하여 세포의 하위집단을 특성화하였다. 세포는 만능-유사 세포를 나타내는 TRA-1-81 및 SSEA-4 둘 모두에 대하여 양성인 콜로니를 형성하였다.
도 21은 상이한 배지 조건에 둔 Msi1/Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2로 트랜스펙션시킨 섬유아세포의 17일의 브라이트 필드(bright field) 사진을 나타내며 상이한 형태 및 분화도를 나타내는 패널이다. (a) 1일 내지 12일의 신경 증식 배지에 이어서, 12일 내지 17일의 사이토카인이 있는 신경 분화 배지에서의 세포. (b) 1일 내지 12일의 신경 증식 배지에 이어서, 12일 내지 17일의 사이토카인이 있는 NbActive4 배지에서의 세포. (c) 1일 내지 12일의 사이토카인 + Fgf-2가 있는 신경 분화 배지에 이어서, 12일 내지 17일의 Fgf-2가 없는 동일한 배지에서의 세포. (d) 1일 내지 12일의 사이토카인 + Fgf-2가 있는 NbActive4 배지에 이어서, 12일 내지 17일의 Fgf-2가 없는 동일한 배지에서의 세포. (e) 1일 내지 12일의 사이토카인 + Fgf-2가 있는 CDM II 배지에 이어서, 12일 내지 17일의 Fgf-2가 없는 동일한 배지에서의 세포.
도 22는 도 21에서 Msi1/Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2로 트랜스펙션시킨 섬유아세포의 17일의 면역화학 결과의 사진을 나타내는 패널이다. 도 22A 및 22B: 세포는 1일 내지 12일에 NS-A 증식 배지에 이어서, 12일 내지 17일에는 사이토카인과 함께 NS-A 분화 배지(A) 또는 NBActive4 배지(B)에 있었다. B에는 더 많은 세포가 있었으나, 12일 내지 17일로부터의 분화는 두 경우 모두에서 βIII-튜불린의 발현을 유도하기에는 너무 짧았다. 도 22C 내지 E: 세포는 1일 내지 17일(1일 내지 12일에 FGF-2 보충물이 있음)에 NS-A 분화 배지(C) 또는 NbActive4 배지(D)에 있거나, 또는 1 내지 12일에 CDM II 배지에 이어서, 12 내지 17일에 NS-A 분화 배지에 있었다(E). C에는 다량의 세포가 있었으며, D 및 E에는 훨씬 더 적은 수의 세포가 있었다. 세포는 모든 경우에 GFAP 및 βIII-튜불린 둘 모두에 대해 면역양성이었으며, 1일부터 분화 배지 또는 비-분화 배지에 세포를 두는 것이 뉴런 및 신경교세포로의 더 직접적인 전환으로 유도하며, E에서는 GFAP 양성 세포보다 βIII-튜불린이 더욱 강한 것으로 나타났다.
도 23은 NSLC 대 HFF(세트 1) 또는 NSLC 대 hNPC(세트 2) 중 어느 하나 간의 유전자 발현 비교의 전반적인 개요를 제공하는 2개의 히트 맵(heat maps)을 나타내는 패널이다. NSLC는 HFF 또는 hNPC 중 어느 하나와 비교하는 경우, 상이한 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 세기에 기초하여(세기가 더 크면, 발현의 상대 변화가 더 큼), NSLC는 HFF와 유사하기보다는 hNPC와 훨씬 더 유사하다.
도 24는 NSLC의 사진을 보여주는 패널이다. NSLC를 이들이 피부-유래의 전구 세포(SKP)의 집단인지를 결정하기 위하여 시험하였다. EGF 및 bFGF에 대한 반응으로 증식할 수 있는 SKP는 네스틴과 피브로넥틴을 발현하며, 신경 및 지방세포를 비롯한 중배엽 자손(progeny) 둘 모두로 분화할 수 있다. 이러한 목적을 위하여 SKP를 지방세포로 바꾸기 위한 표준 프로토콜을 수행하였으며, 여기서, 지방-유래의 줄기 세포(ADSC) 및 NSLC를 스템프로(상표명) 증식 배지에서 배양하고, 이들 세포를 DMEM/F12(50:50), ITS(1:100), HEPES(1:100), 글루타맥스(상표명)(1:100), T3(0.2nM), 로지글리타손(Rosiglitasone)(0.5㎍/㎖), IBMX(100μM) 및 덱사메타손(1μM)으로 이루어진 분화 배지에서 배양함으로써, 지방세포를 향한 분화를 유도하였다. 3일 후에, IBMX 및 덱사메타손을 배지에서 뺏다. 10일에, 세포를 4% 포름알데하이드 용액으로 10분 동안 고정시키고, 오일 레드 O(Oil Red O)(인비트로젠) 염색 용액으로 염색하였다. 지방 세포는 오일 레드 O로 특이적으로 염색된 지방 소적(좌측 사진에서 밝은 흰색 점)과 함께 적색으로 나타났으나; NSLC는 음성 염색되었고, 세포에서 지질 소적의 존재가 없었으나, 형성된 신경 세포 형태가 있었다. 이들 결과로, NSLC가 피부-유래의 전구 세포(SKP)의 집단이 아님이 확인된다.
본 발명은 세포 탈분화 및 세포 재프로그램화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유의미한 태양은 이것이 시험관 내 탈분화 및 시험관 내 재프로그램화의 단계 후에 이식될 수 있는 상이한 유형의 세포를 발생시키기 위한 환자 자신의 세포의 사용을 가능하게 하는 것이다. 따라서, 이러한 기술은 비-숙주 세포의 이식과 관련된 문제, 예컨대 면역 거부 및 전이 질환의 위험을 없앤다. 또한, 세포는 "새로이 생성"되기 때문에, 이들은 이미 다수회 분열된 천연 세포의 대안적인 공급원보다 더 강력할 가능성이 있다.
정의
본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수형 "하나의(a 또는 an)" 및 "상기(the)"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 경우 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 참조는 하나 이상의 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주를 포함하며, "하나의 효능제"에 대한 참조는 하나 이상의 이러한 효능제를 포함하며, "상기 방법"에 대한 참조는 본 명세서에 기재된 방법을 변경하거나 이를 대체할 수 있는 당업자에게 공지되어 있는 동등한 단계 및 방법에 대한 참조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 임의의 DNA 또는 RNA 서열 또는 분자를 지칭한다. 상기 용어는 특정 세포, 조직 또는 유기체에서 자연적으로 발생되든지 비-자연적으로 발생되든지 간에, 모든 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다. 이는 DNA 및 이의 단편, RNA 및 이의 단편, cDNA 및 이의 단편, 발현된 서열 태그(tag), 무작위 인공 서열을 비롯한 인공 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 목적으로 하는 생물학적 작용 활성(예컨대, DNA 탈메틸화)을 갖는 임의의 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 용어는 완전 단백질, 이의 단편, 탄수화물 또는 지질 사슬 또는 조성물을 포함하는 융합 단백질 등을 포함하는 것으로 의도된다.
"분화전환"은 이미 분화된 세포의 다른 유형의 분화된 세포로의 직접 전환을 말한다.
" 탈분화 "는 유전자 또는 대사 경로를 활성화시키거나 불활성화시킴에 의한, 분화된 세포의 표현형 특징의 소실을 말한다.
" 마커 "는 특정 세포 유형 또는 세포 표현형에 특징적인 유전자, 폴리펩티드 또는 생물학적 작용을 말한다.
"유전자적으로- 엔지니어링된(Genetically - engineered ) DNA 서열"은 DNA 서열의 구성성분 서열 요소가 자연에서 발견되지 않는 방식으로 DNA 서열 내에서 구조화된 DNA 서열을 의미한다.
"신호 서열"은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 도입되는 경우, 상기 펩티드를 발현하는 세포로부터 번역된 폴리펩티드의 분비를 지시하거나, 또는 폴리펩티드가 용이하게 세포막을 가로질러 세포로 가게 하는 서열을 말한다. 신호 서열은 바람직하게는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 5' 말단에 위치하여, 신호 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열이 번역된 폴리펩티드의 N-말단에 위치되게 한다. "신호 펩티드"는 신호 서열의 번역으로부터 야기된 펩티드 서열을 의미한다.
"유비쿼터스( ubiquitous ) 프로모터"는 프로모터가 작동가능하게 연결된 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 추진하는 프로모터를 말한다. 바람직한 유비쿼터스 프로모터에는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 조기(CMV); 시미안(simian) 바이러스 40 조기 프로모터(SV40); 라우스 육종 바이러스(RSV); 또는 아데노바이러스 주요 후기(major late) 프로모터가 포함된다.
"유전자 발현 프로파일링"은 다수의 유전자의 활성을 한번에 측정하여, 세포 기능의 전반적인 그림을 만드는 검정을 의미한다. 예를 들어, 이들 프로파일에 의해, 활동적으로 분열하거나 분화하는 체세포와 인간 신경 줄기 세포를 구별할 수 있다.
"트랜스펙션"은 외래 뉴클레오티드 서열(예컨대, DNA 분자)을 바람직하게는, 비-바이러스 방법에 의하여 세포 내로 도입시키는 유전자 전달 방법을 말한다. 본 발명에 따른 바람직한 실시형태에서, 외래 DNA는 대상 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터의 일시적인 트랜스펙션에 의해 세포에 도입되며, 이에 의해, 외래 DNA는 도입되나, 세포에 의해 그리고 유사분열 동안에 시간이 지남에 따라 제거된다. "일시적 트랜스펙션"은 도입된 발현 벡터 및 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드가 숙주 세포의 게놈 또는 세포 내의 다른 곳으로 영구적으로 통합되지 않고, 이에 따라, 시간에 따라 숙주 세포 또는 그의 자손으로부터 제거될 수 있는 방법을 의미한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 화합물이 또한 트랜스펙션 방법을 사용하여 세포 내로 전달될 수 있다.
"신경선구세포"는 신경계의 비성숙 세포를 말하며, 이는 뉴런 및 신경교세포(희소돌기아교세포 및 성상세포)로 분화할 수 있다. "신경 줄기 세포"는 생리적 특징으로서, 뉴런 및 신경교세포를 형성하기 위한 분화를 지지하는 생리적 조건 하에서, 신경선구세포를 형성하는 능력을 갖는 외배엽 배엽 유래의 다능 줄기 세포이다. "신경 줄기-유사 세포" 또는 "NSLC"는 생리적 특징으로서, 뉴런-유사 세포 및 신경교세포-유사 세포를 형성하기 위한 분화를 지지하는 생리적 조건 하에서, 다른 신경 줄기-유사 세포 및 신경선구세포-유사 세포를 형성하는 능력을 갖는 임의의 세포-유래의 다능 줄기 세포를 말한다.
"뉴로스피어"는 적절한 증식 조건 하에서 신경 줄기 세포 및 신경선구세포의 결과로서 형성된 부유하는 구체를 형성하는 신경 줄기 세포 및 신경선구세포의 세포 응집체(aggregate)를 말한다. 또한, NSLC는 NSLC 및 신경선구세포-유사 세포의 응집체로 이루어진 뉴로스피어를 형성한다.
"재프로그램화된 세포"는 안정적인 분화전환, 탈분화 또는 전환을 겪는 세포를 말한다. 몇몇 재프로그램화된 세포는 이후에 재분화가 유도될 수 있다. 재프로그램화된 세포는 원래 세포의 특징이 아니었던 세포-특이적 마커, 또는 마커, 형태 및/또는 생물학적 기능의 세트를 안정적으로 발현한다. "재프로그램화된 체세포"는 체세포의 분화 상태를 변경하거나 또는 역행하는 과정을 말하며, 이는 분화된 상태의 덜 분화된 상태 또는 새로이 분화된 상태로의 완전한 또는 부분적인 전환 중 어느 하나일 수 있다.
"재생"은 피부, 조직 또는 기관의 회복 또는 신생(de novo) 구성에 기여하는 능력을 말한다.
"분화"는 세포의 계통 수임의 발생 과정을 말한다. 분화는 비분화된 세포 마커의 발현에 비한 하나 이상의 세포-분화 특이적 마커의 증가를 측정함으로써 검정될 수 있다.
"계통"은 세포 발생의 경로를 말하며, 여기서, 더 미분화된 세포는 진행적 생리적 변화를 겪어, 특징적인 기능을 갖는 더 분화된 세포 유형이 되게 한다(예를 들어, 뉴런 및 신경교세포는 신경선구세포 계통의 것이며, 이는 배반포 및 배아 줄기(ES) 세포로부터 형성된 내배엽 계통의 것이다).
"조직"은 함께 구체적인 기능 또는 기능의 세트를 수행하는 세포(동일하거나 동일하지 않은) 및 세포외 기질(ECM)의 앙상블(ensemble)을 말한다.
"CDM "은 살아있는 조직 등가물 또는 기질, 살아있는 스캐폴드(scaffold), 또는 세포-유래의 매트릭스를 의미한다.
세포 전환
본 발명의 일부 태양은 주어진 체세포를 만능, 다능 및/또는 단일능 세포로 전환시키거나 재프로그램화하는 방법 및 세포에 관한 것이다. 본 발명의 일부 태양은 만능, 다능 또는 단일능 세포로 재프로그램화하기 위하여 체세포를 컨디셔닝하는 방법에 관한 것이다.
용어 "전환" 또는 "재프로그램화"는 세포가 탈분화되거나 분화전환되어, 만능, 다능 및/또는 단일능이 되게 하는 현상을 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 탈분화된 세포는 이후에 상이한 유형의 세포로 재분화될 수 있다. 세포는 다양한 정도로 재프로그램화되거나 전환될 수 있다. 예를 들어, 오직 소량의 세포만이 전환되거나, 개별 세포가 반드시 만능이 아닌, 다능으로 재프로그램화되는 것이 가능하다. 따라서, "전환" 또는 "재프로그램화" 방법은 "새로운" 세포가 새로운 또는 상이한 특정 세포 계통의 형태 및 기능의 특징을 보여주도록(예를 들어, 섬유아세포의 신경 세포로의 전환) 세포를 재프로그램화할 수 있는 방법을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "체세포"는 줄기 세포, 선구세포 및 생식계열 세포(즉, 난조세포(ovogonie) 및 정원세포(spermatogonie)), 및 이들로부터 유래된 세포(예컨대, 난모세포, 정자)와 별개의, 유기체의 신체를 형성하는 임의의 분화된 세포를 말한다. 예를 들어, 내부 장기, 피부, 뼈, 혈액 및 연결 조직은 모두 체세포로 구성된다. 본 발명에 따른 체세포는 성체로부터 분리된 분화된 세포이거나 태아 체세포일 수 있다. 체세포는 동물, 바람직하게는 인간 대상체로부터 수득되며, 당업자에게 이용가능한 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 배양된다.
본 명세서에서 사용되는 "줄기 세포"는 세포 유사분열을 통하여 그들 자신을 재생하는 능력을 보유하며, 다양한 범위의 특수화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 이는 배반포에서 발견되는 배아 줄기 세포 및 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포 둘 모두를 포함한다. "전능 세포"는 모든 배아 삼배엽(중배엽, 내배엽 및 외배엽)으로부터 유래된 세포 및 전체 유기체(예를 들어, 인간의 경우 여성의 자궁에 위치한다면 인간)로 발생하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 전능 세포는 배아, 배체 외막 및 모든 후배 조직 및 기관을 생기게 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "만능"은 모든 배아 삼배엽의 분화된 세포가 생기게 하는 세포의 능력을 의미하는 것으로 의도된다. "다능 세포"는 밀접하게 관련된 패밀리의 세포의 세포만을 생성할 수 있는 세포를 말한다(예를 들어, 조혈 줄기 세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 분화한다). "단일능 세포"는 오직 한 유형의 조직/세포 유형(예를 들어, 피부 세포)으로 발생/분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 발명은 임의의 세포의 상이한 유형의 세포로의 재프로그램화를 가능하게 한다. 본 출원이 주로 줄기-유사 세포, 특히 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 제조에 집중하고 있지만, 본 발명은 그렇게 제한되는 것이 아닌데, 이는 많은 상이한 유형의 세포가 본 명세서에 기재된 원리에 따라 생성될 수 있기 때문이다. 유사하게, 실시예 부문에서 섬유아세포, 각질형성세포, CD34+ 세포, 지방-유래의 줄기 세포(ADSC), 신경 줄기 세포(NSLC 포함) 및 세포-유래의 기질(CDM) 내의 세포가 재프로그램화되는 실시형태가 기재되어 있지만, 본 발명은 이러한 세포를 제한하지 않는다. 본 발명은 사실상 임의의 대상 세포의 재프로그램화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일반적인 태양은 제1 유형의 세포를 상이한 제2 유형의 세포로 전환하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 제1 유형의 세포의 예에는 생식 세포, 배아 줄기 세포 및 이의 유도체, 성체 줄기 세포 및 이의 유도체, 선구세포 및 이의 유도체, 중배엽, 내배엽 또는 외배엽으로부터 유래된 세포 및 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 계통의 세포, 예컨대 지방-유래의 줄기 세포(ADSC), 간충직 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(CD34+ 세포), 피부 유래의 전구세포, 모공 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 표피 세포, 내피 세포, 상피 세포, 과립막 상피 세포, 멜라닌세포, 지방세포, 연골세포, 간세포, 림프구(B 및 T 림프구), 과립구, 대식구, 단구, 단핵 세포, 췌장도 세포(pancreatic islet cell), 세르톨리 세포, 뉴런, 신경교세포, 심근 세포 및 다른 근세포가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 제2 유형의 세포의 예에는 생식 세포, 배아 줄기 세포 및 이의 유도체, 성체 줄기 세포 및 이의 유도체, 선구세포 및 이의 유도체, 중배엽, 내배엽 또는 외배엽으로부터 유래된 세포 및 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 계통의 세포, 예컨대 지방-유래의 줄기 세포, 간충직 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 피부 유래의 전구세포, 모공 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 표피 세포, 내피 세포, 상피 세포, 과립막 상피 세포, 멜라닌세포, 지방세포, 연골세포, 간세포, 림프구(B 및 T 림프구), 과립구, 대식구, 단구, 단핵 세포, 췌장도 세포, 세르톨리 세포, 뉴런, 신경교세포, 심근 세포 및 다른 근세포가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 "-유사" 세포(세포의 공지된 천연 유형과 유사하나 완전히 동일하지 않은 특징을 갖는 세포)는 각각 제2 유형의 세포의 예에 포함된다.
특정 일 태양에 따라, 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 제2 세포로의 전환 방법은 하기의 단계를 포함한다:
i) 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
ii) 제1 유형의 세포 내에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 일시적으로 증가시키는 단계로서, 상기 일시적인 증가가 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내생적 발현을 유도하는 것인 단계;
iii) 세포를 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 조건에 두고, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 재프로그램화 효능제의 부재 하에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 단계; 및
iv) 세포를 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에서 유지하는 단계로서, 다수의 제2 유전자의 발현이 목적으로 하는 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적인 것인 단계. 안정적으로 발현되는 적어도 하나의 제2 유전자는 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않다. 상기 기간의 마지막에, 제1 유형의 세포는 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 전환된다. 바람직하게는 전환 후에 수득되는 상이한 유형의 세포는 추가로 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 특징으로 한다.
다양한 실시형태에 따르면, 단계 iii)은 단계 ii)에 연속하여, 단계 ii)와 동시에, 또는 단계 ii) 전에 수행할 수 있다.
관련 태양에 따르면, 본 발명은 제1 유형의 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 재프로그램화하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 하기를 포함한다:
- 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준의 일시적인 증가(적어도 하나의 재프로그램화 효능제는 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하며, 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 내인성 발현이 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 존재에 필요하다);
- 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현;
- 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현(제2 유전자의 안정적인 발현은 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현의 결과이며, (i) 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, (ii) 적어도 하나의 상기 제2 유전자의 안정적인 발현은 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않으며, (i) 및 (ii)는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 성공적인 재프로그램화를 나타낸다).
본 명세서에서 사용되는 "일시적으로 증가시키는 것"은 반드시 영구적이지는 않으며, 시간이 지남에 따라 감소되거나 소실될 수 있는 증가를 말한다. 예를 들어, 세포 내에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 일시적으로 증가시키는 것으로 언급되는 경우, 이는 증가가 특정 세포 사건이 발생하게 야기하는 충분한 기간 동안 존재하는 것(예를 들어, 유전자 조절인자의 안정적인 내인성 발현을 유도하는 것)을 의미한다. 전형적으로 일시적인 증가는 영구적이지 않으며, 예를 들어, 발현 벡터의 게놈 통합과 관련되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재프로그램화 효능제"는 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 형태 및/또는 기능 특징의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도할 수 있는 화합물을 말한다. 바람직한 화합물은 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 직접적인 또는 간접적인 전환을 추진할 수 있는 것을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 재프로그램화 효능제는 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인적 발현을 유도하기 위하여 선택된다. 본 발명에 따른 세포를 재프로그램화하는데 도움이 될 수 있는 많은 화합물이 있으며, 이들 화합물은 단독으로 또는 병용하여 사용할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 재프로그램화 효능제는 표 A에 따라 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
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일부 실시형태에서, 재프로그램화 효능제는 본 명세서에서 이전의 표에서 재프로그램화 효능제 중 임의의 하나의 작용성 또는 서열 동일성의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상을 공유하는 폴리펩티드이다.
재프로그램화 효능제의 부재 하에 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 "충분한 기간" 및 세포를 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에서 유지하기에 "충분한 기간"은 당업계의 기술 내에 있다. 충분한 또는 적절한 기간은 세포의 특정 유형 및 후생적 상태(예를 들어, 제1 유형의 세포 및 목적으로 하는 세포), 출발 물질의 양(예를 들어, 전환되는 세포의 수), 재프로그램화 효능제(들)의 양 및 유형, 유전자 조절인자(들), 배양 조건, 재프로그램화의 속도를 증가시키는 화합물의 존재(예를 들어, 세포 주기 턴오버(turnover)를 증가시키고/시키거나 후생적 상태를 변경시키고/시키거나 세포 생존력을 증가시키는 화합물) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 변할 것이다. 다양한 실시형태에서, 재프로그램화 효능제의 부재 하에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하는 충분한 기간은 약 1일, 약 2 내지 4일, 약 4 내지 7일, 약 1 내지 2주, 약 2 내지 3주, 또는 약 3 내지 4주이다. 다양한 실시형태에서, 세포가 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에서 유지되고, 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하는 충분한 기간은 약 1일, 약 2 내지 4일, 약 4 내지 7일, 또는 약 1 내지 2주, 약 2 내지 3주, 약 3 내지 4주, 약 4 내지 6주, 또는 약 6 내지 8주이다. 바람직한 실시형태에서, 전환 기간의 마지막에, 전환된 목적으로 하는 세포의 수는 시작 시에 제공된 제1 유형의 세포의 양과 실질적으로 동등하거나, 심지어는 이보다 더 많다.
본 발명은 제1 유형의 세포에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는데 적합한 다양한 유형의 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 화합물은 또한, 세포의 염색질 및/또는 DNA를 직접적으로 또는 간접적으로 리모델링하여, 직접적으로 또는 간접적으로 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 형태 및 기능적 특징의 발현을 야기해야 한다. 바람직한 화합물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 재프로그램화 효능제이거나, 또는 유사한 활성을 가지며, 본 명세서에서 이전에 재프로그램화 효능제의 표에 열거한 유전자의 내인적 버전의 발현을 활성화시키거나 증가시키는 능력을 가지며, 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환을 직접적으로 또는 간접적으로 추진할 수 있는 임의의 다른 화합물이다.
본 명세서에서 이후에 설명될 바와 같이, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준의 증가는 상이한 수단에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 재프로그램화 효능제는 폴리펩티드이며, 이러한 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 것은 폴리펩티드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA 또는 RNA)를 갖는 발현 벡터의 트랜스펙션(또는 공동-트랜스펙션) 또는 폴리펩티드(들)의 세포내 전달에 의한 것을 포함한다. 본 발명에 따르면, 일시적 발현이 일반적으로 바람직하다. 추가의 적절한 화합물은 재프로그램화 효능제의 표에 열거된 유전자 및 표 B에 열거된 재프로그램화 인자를 포함하나 이에 한정되지 않는 유전자 조절인자의 내인성 버전의 발현을 증가시킬 수 있는 화합물을 포함할 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명의 원리에 따르면, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는 것은 적어도 하나의 유전자 조절인자의 내인적 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도해야 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "유전자 조절인자"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭하며, 이의 발현은 제1 유형의 주어진 세포의 만능, 다능 및/또는 단일능 세포로의 전환을 야기하는 일련의 세포내 사건과 관련된다. 전형적으로, 유전자 조절인자의 발현은 만능, 다능 및/또는 단일능 세포의 표현형 및 기능적 특징에 필요한 유전자를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화시키는 한편, 제1 유형의 세포의 유전자를 억제한다. 유전자 조절인자는 재프로그램화 효능제와 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 유전자 조절인자의 예는 본 명세서에서 이전에 표 A에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 유전자 조절인자는 본 명세서의 이전의 표 A에 제공된 유전자 조절인자 중 임의의 것의 작용성 또는 서열 동일성의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상을 공유하는 폴리펩티드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 목적으로 하는 세포를 지칭하는 경우, "성장을 지지하는 조건" 또는 "전환을 지지하는 조건"은 목적으로 하는 세포 유형의 성장에 유리하고/하거나 이러한 목적으로 하는 세포 유형을 향한 전환에 유리한 다양한 적절한 배양 조건(온도, pH, O2 장력, 세포 배지, 인자, 화합물, 성장 물질(예컨대, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 매트리겔(상표명), 저-결합 표면, 나노구조화된 또는 하전된 표면 등), 3D 환경 등)을 지칭한다. 당업자는 특정 세포 유형의 성장 또는 전환이 특정 조건 하에서 자극되는 한편, 다른 것들에 의해서 억제되는 것을 알고 있으며, 목적으로 하는 세포 유형의 성장 또는 전환에 유리한 적절한 조건(예를 들어, 배양 조건)을 선택하는 것이 그들의 기술 내에 있다.
목적으로 하는 세포 또는 배아 줄기 세포를 지칭하는 경우, 용어 "표현형 및 기능적 특성"은 특정 유전자의 발현 및 세포 표면 마커를 비롯한 세포의 생물학적, 생화학적, 생리학적 및 가시적 특성을 의미하며, 이는 그의 식별 또는 기능(들)을 확인하기 위해 측정하거나 평가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따른 적절한 재프로그램화 효능제의 예는 무사시1이다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드는 제1 세포, 예컨대 섬유아세포를 신경 줄기-유사 세포(NSLC)로 추진시키는데 바람직하다. 다른 실시형태에서, 상기 세포내 수준이 증가되는 적어도 하나의 재프로그램화 효능제는 단독의 무사시1(Msi1); 무사시1(Msi1) 및 뉴로게닌 2(Ngn2); 무사시1 (Msi1) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2); 또는 뉴로게닌 2(Ngn2) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 중 어느 하나이다. 이들 폴리펩티드의 적절한 세포내 수준이 바람직한데, 이는 이들이 배아 줄기 세포(또는 심지어는 더 조기의)만큼 조기로부터 예비-체세포(또는 심지어는 더 후기의)까지의 전체 세포 계통을 통해 발현되는 경향이 있기 때문에다.
MBD2는 전사 억제제 및 DNA 탈메틸화효소(dMTase) 둘 모두인 것으로 보고된 메틸-CpG-결합 단백질의 패밀리의 구성원이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "MBD2"는 일반적으로 인간 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2를 지칭한다. 인간 MBD2의 진뱅크(상표명)(NCBI) 수탁 번호는 NM_003927.3/AF072242이고, 유니프로트(상표명) 수탁 번호는 NP-003918/Q9UBB5이고, 유니진(상표명) 수탁 번호는 Hs.25674이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Msi1"은 일반적으로 인간 무사시 동족체 1을 지칭한다. 인간 Msi1의 진뱅크(수탁 번호)(NCBI) 수탁 번호는 NM_002442.2/AB012851이고, 유니프로트(상표명) 수탁 번호는 NP-002433/O43347이며, 유니진(상표명) 수탁 번호는 Hs.158311이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Ngn2"는 일반적으로 인간 뉴로게닌 2를 지칭한다. 인간 Ngn2의 진뱅크(상표명)(NCBI) 수탁 번호는 NM_024019.2/BC036847이고, 유니프로트(상표명) 수탁 번호는 NP-076924/Q9H2A3이고, 유니진(상표명) 수탁 번호는 Hs.567563이다.
추가의 태양에 따르면, 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법은 다음 중 어느 하나의 단계를 포함한다:
1) 제1 유형의 세포를 세포 내에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시킬 수 있는 하나 이상의 화합물과 접촉시키고, 세포의 염색질 및/또는 DNA를 직접적으로 또는 간접적으로 리모델링하는 단계; 또는
2) 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 세포의 염색질 및/또는 DNA를 리모델링할 수 있는 효능제와 접촉시키고; 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는 단계.
다양한 실시형태에 따르면, 단계 2)는 단계 1)에 연속하여, 단계 1)과 동시에, 또는 단계 1) 전에 수행할 수 있다.
특정 태양에 따르면, 본 발명은 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법은
- NSLC가 아닌 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
- 적어도 하나의 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계로서, 폴리펩티드가 제1 유형의 세포의 NSLC로의 직접적 또는 간접적인 전환을 추진할 수 있는 것인 단계; 및
- 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화제의 억제제, DNA 탈메틸화제 및/또는 DNA 메틸화의 화학적 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
제2 단계에 관하여, 용어 "염색질 및/또는 DNA 를 리모델링하는 것"은 염색질에 대한 역동적 구조적 변화를 지칭한다. 이들 변화는 전사 조절에 필요한 국소적인 변화로부터 염색질 구조의 개방 또는 염색질 응집에 필요한 전반적인 변화까지의 범위여서, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 유전자 특징의 새로운 세트의 전사를 가능하게 하고, 염색질 구조의 폐쇄 또는 염색체 응집으로, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포에 특징적이지 않은 특정 유전자의 전사를 방지하게 한다. 일부 실시형태에서, 염색질 구조의 개방은 더욱 자세하게는 히스톤의 아세틸화 및 DNA의 탈메틸화를 지칭하는 한편, 염색질 구조의 폐쇄는 더욱 자세하게는 히스톤의 탈아세틸화 및 DNA의 메틸화를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "화합물"은 목적으로 하는 생물학적 기능을 야기할 수 있는 화합물을 지칭한다. 상기 용어에는 DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드, 및 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 또는 소분자를 비롯한 다른 화합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 염색질 및/또는 DNA를 리모델링할 수 있는 화합물에는 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 탈메틸화제, DNA 메틸화의 억제제 및 이들의 조합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
"DNA 메틸화의 억제제"는 DNA 메틸화를 억제할 수 있는 효능제를 지칭한다. DNA 메틸화 억제제는 억제된 유전자 발현을 복구하는 능력을 나타낸다. DNA 메틸화를 억제하기 위한 적절한 효능제에는 5-아자-2-데옥시시티딘, 1-β-D-아라비노우라실-5-아자시토신 및 다이하이드로-5-아자시티딘 및 제불라린(ZEB), BIX(히스톤 라이신 메틸전이효소 억제제) 및 RG108이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"히스톤 탈아세틴화의 억제제"는 히스톤의 라이신 잔기로부터의 아세틸기의 제거를 방지하는 효능제를 지칭하며, 아세틸기의 제거는 다르게는 응축된, 전사적으로 침묵화된 염색질의 형성을 야기할 것이다. 히스톤 탈아세틸화제 억제제는 하기를 포함하는 몇개의 그룹으로 분류된다: (1) 하이드록삼산, 예컨대 트라이코스태틴 (A), (2) 사이클릭 테트라펩티드, (3) 벤즈아미드, (4) 친전자성 케톤 및 (5) 화합물의 지방산 그룹, 예컨대 페닐부티레이트 및 발프로산. 히스톤 탈아세틸화를 억제하는 적절한 효능제에는 발포르산(VPA), 페닐부티레이트 트라이코스태틴 A (TSA), Na-부티레이트 및 벤즈아미드가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. VPA는 NeuroD를 비롯한 신경 전사 인자의 유도를 통하여 신경 운명을 증가시키고, 동시에 신경교세포 운명을 억제한다.
"히스톤 아세틸화제"는 아세틸기를 염색질을 개방하는 히스톤의 라이신 잔기에 삽입하고, 이것을 전사적으로 활성인 상태로 바꾸는 효능제를 지칭한다. 적절한 히스톤 아세틸화제에는 폴리아민, CREB(cAMP 요소 결합 단백질) 및 BniP3이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
"DNA 탈메틸화제"는 DNA로부터 메틸기를 제거하며, 과메틸화를 억제하고, 억제된 유전자 발현을 복구하는 능력을 갖는 효능제를 지칭한다. 탈메틸화제는 억제성 메틸 잔기를 제거함으로써 유전자를 활성화시키는 것으로 예상된다. 적절한 DNA 탈메틸화제에는 MBD2 및 Gadd45b가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 재프로그램화 효능제는 하나 이상의 하기의 작용을 갖는다: 이는 제1 유형의 세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, 표 C 참조)의 발현을 감소시키고/시키거나 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, 표 A 참조)의 발현을 증가시킨다. 그 다음, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포에 대한 선택가능한 마커를 나타내는 세포를 선택하고, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 특징에 대해 평가한다.
본 발명에 따르면, 목적으로 하는 세포로의 전환은 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 야기하며, 이의 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이다. 발현이 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적인 유전자에는 표 A에 열거된 것이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 발현이 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적인 제2 유전자의 발현은 하기의 표에 따라 정의된 마커의 발현을 야기한다:
Figure pct00011
일부 실시형태에서, 제1 유형의 세포의 목적으로 하는 세포로의 전환은 제1 유형의 세포에서 전형적으로 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 야기한다. 이러한 억제된 유전자의 예에는 표 C에 정의된 것이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure pct00013
바람직한 실시형태에서, 제1 세포 유형에서 발현되는 표 C에 열거된 임의의 하나 이상의 유전자의 안정적인 발현은 또한, 상응하는 마커의 소실을 특징으로 한다(표 C 참조).
당업자는 세포 재프로그램화를 용이하게 하기 위한 많은 대안적인 단계가 존재한다는 것을 이해할 것이다. 이에는 세포의 세포골격 구조를 불안정화시키는 것(예를 들어, 세포를 사이토칼라신(cytochalasin) B에 노출시킴으로써), 세포의 염색질 구조를 느슨하게 하는 것(예를 들어, 효능제, 예컨대 5 아자시티딘(5-Aza) 및 발프로산(VPA) 또는 DNA 탈메틸화제, 예컨대 MBD2를 사용함으로써), 세포를 신경 전사 인자(예를 들어, Msi1 또는 Ngn2)를 암호화하는 적어도 하나의 cDNA를 함유하는 하나 이상의 발현 벡터(들)로 트랜스펙션시키는 것, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포에 적절한 배지 및 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 분화 수임을 유도하는데 적절한 분화 배지를 사용하는 것, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 수임에 부정적으로 영향을 미치는 억압 경로를 억제하는 것, 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포에 적절한 물질(예를 들어, NSLC에 대해서는 라미닌 또는 부유하는 뉴로스피어를 배양하기 위한 저-결합 표면)에서 성장시키는 것 및 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포(또는 "-유사" 세포)가 적절한 온도, pH 및 낮은 산소 환경(예를 들어, 약 2-5% O2)와 같이 생체 내에 정상적으로 노출될 환경에서 성장시키는 것이 포함된다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 이들 방법 및 다른 관련 방법 및 세포 재프로그램화를 용이하게 하기 위한 기법을 포함한다.
따라서, 제1 유형의 세포의 상이한 제2 유형의 세포로의 전환 방법은 추가의 임의의 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포의 전환 방법은 제1 유형의 세포를 세포골격 파괴물질(disruptor)과 함께 예열하는 단계를 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "세포골격"은 F-액틴, 미오신 경쇄 및 중쇄, 미소관 및 중 3개의 화학적으로 별개의 서브유닛, 액틴, 튜불린 중 하나 또는 IF 단백질의 몇몇 분류 중 하나로 이루어진 중간 섬유의 섬유질 네트워크를 지칭한다. 따라서, 용어 "세포골격 파괴물질"은 세포의 세포골격을 억제하여, 세포를 불안정하게 하고, 결과적으로 세포의 형상과 세포 및 핵 기능 간의 피드백 메커니즘을 없앨 수 있는 임의의 분자를 말한다. 본 발명에 따른 적절한 세포골격 파괴물질에는 액틴 세포골격 억제제의 사이토칼라신 패밀리, 예컨대 사이토칼라신 B 또는 D 및 미오신 억제제, 예컨대 2,3-부탄다이온 모노옥심이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 사전처리는 재프로그램화를 증가시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포를 신경 전사 인자(들)를 도입하기 1일 전에, 그 동안에 또는 그 후에 적어도 하나의 세포골격 억제제의 존재 하에서 배양한다.
세포를 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 조건에 두고/두거나 세포를 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에 유지하는 것은 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 형태 및 기능 특징의 발현을 유도하는데 적절한 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 인자는 세포를 재프로그램화하는데 도움이 되는 재프로그램화 효능제이며, 이들 재프로그램화 효능제는 단독으로 사용되거나 병용하여 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 형태 및 기능 특징의 발현을 유도하는데 적절한 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계는 본 명세서에서 이전에 정의된 바와 같은 단계 iii) 또는 iv) 이후에 또는 이와 동시에, 또는 단계 1) 또는 2) 이후에 또는 이와 동시에 수행한다.
당업자는 세포를 재프로그램화하는데 도움이 될 수 있는 많은 상이한 유형의 배지 및 많은 재프로그램화 인자를 알고 있으며, 이들 재프로그램화 인자는 단독으로 사용되거나 병용하여 사용될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 재프로그램화 인자는 표 B에 따라 선택된다.
일부 실시형태에서, 재프로그램화 인자는 하나 이상의 하기의 기능을 갖는다: 제1 유형의 세포의 하나 이상의 마커의 발현을 감소시키는 것 및/또는 목적으로 하는 세포의 하나 이상의 마커의 발현을 증가시키는 것. 그 다음, 목적으로 하는 세포에 대한 선택가능한 마커를 나타내는 세포를 선택하고, 단일능, 다능, 만능 또는 유사 특징(적절한)에 대하여 평가한다.
특정 실시형태에서, 세포를 본 명세서에서 이전에 정의된 바와 같은 단계 i) 내지 iv) 중 임의의 한 단계 전에, 그 동안에 또는 그 후에, 또는 본 명세서에서 이전에 정의된 바와 같은 단계 1) 또는 2) 전에, 그 동안에 또는 그 후에 무혈청 배지에서 배양한다.
신경 줄기-유사 세포( NSLC )를 수득하는 것
신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 생성하기 위한 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 세포를 선택된 효능제, 화합물 및 인자로 처리하여, 줄기-유사 세포(SLC)를 향한 재프로그램화 및/또는 탈분화를 용이하게 하도록 수행된다. 그 다음, 이러한 재프로그램화된 체세포를 효능제로 추가로 처리하고/하거나 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 향한 재프로그램화 및 장기간 동안의 NSLC의 증식을 용이하게 하는데 적절한 조건 하에서 배양할 수 있다. 본 발명에 따른 NSLC는 신경 질환 및 손상, 예컨대 파킨슨병 및 척수 손상의 유력한 치료를 위한 신경-유사 및/또는 신경교-유사 세포뿐 아니라 신경 및/또는 신경교 세포로의 분화능을 갖는다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법은 세포 치료법을 위한 조직적합성 세포를 생성하는데 유용하다.
따라서, 본 발명의 일부 태양은 개별 환자로부터 뉴런을 생성하고, 이에 따라, 신경외상, 뇌졸중, 신경변성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머병을 비롯한 많은 신경 병상을 위한 치료 방식(treatment modality)으로서 자가 이식을 가능하게 하는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 대상 질환 또는 외상을 치료하기 위한 신경 치료법을 위해 제공된다.
따라서, 본 발명의 다른 태양은 다음 중 어느 하나의 단계를 포함하는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 수득하는 방법에 관한 것이다:
1) 제1 유형의 세포를 세포 내에서 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시킬 수 있고, 제1 유형의 세포의 NSLC로의 전환을 직접적으로 또는 간접적으로 추진할 수 있는 하나 이상의 신경 줄기 세포 조절 폴리펩티드와 접촉시키고, 상기 세포의 염색질 및/또는 DNA를 직접적으로 또는 간접적으로 리모델링하는 단계; 또는
2) 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 탈메틸화제 및/또는 DNA 메틸화의 억제제와 접촉시키고; 제1 유형의 세포의 NSLC로의 전환을 직접적으로 또는 간접적으로 추진할 수 있는 적어도 하나의 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계.
바람직한 실시형태에서, 단계 1)은 무사시1 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 본 명세서에서 이후에 설명될 바와 같이, 이는 바람직하게는 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터를 트랜스펙션시키는 것에 의한 무사시1 폴리펩티드의 일시적인 발현을 포함하나 이에 한정되지 않는 상이한 수단에 의해 달성될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 단계 2)는 MBD2 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키거나 세포를 VPA 및 5-AZA로 처리하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 이후에 설명될 바와 같이, 이는 바람직하게는 폴리펩티드(들)를 암호화하는 발현 벡터를 트랜스펙션시키는 것에 의한 MBD2 폴리펩티드의 일시적인 발현을 포함하나 이에 한정되지 않는 상이한 수단에 의해 및/또는 세포를 VPA 및 5-AZA로 사전-처리하고/하거나 처리하여 달성될 수 있다.
특정 일 실시형태에서, 제1 유형의 세포를 신경 줄기 세포에 대한 적어도 2개의 선택가능한 마커를 나타내는 상이한 유형의 세포로 재프로그램화하는 것은 제1 유형의 세포를 신경 전사 인자 및 하나의 DNA 탈메틸화제를 암호화하는 cDNA를 함유하는 하나의 벡터로 트랜스펙션시키는 것을 필요로 한다. 탈분화를 증가시키기 위하여, 세포를 DNA 메틸화를 억제시키는 효능제(들)에 노출시키거나 사전-노출시키고, 히스톤 탈아세틸화를 억제하고/하거나 세포의 세포골격을 파괴한다. 예를 들어, 탈분화는 세포를 세포의 세포골격을 파괴하는 효능제로 사전-처리하고, 이어서 세포를 DNA 탈메틸화제 및/또는 DNA 메틸화 및 히스톤 탈아세틸화의 억제제의 존재 하에서 2개의 신경 전사 인자를 함유하는 하나 이상의 벡터(들)로 트랜스펙션시킴으로써 증가될 수 있다. 히스톤 탈아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 타메틸화제 및/또는 DNA 메틸화의 억제제는 이전에 정의된 바와 같다.
이전에 정의된 바와 같이, 상기 방법은 이전에 정의된 바와 같이 제1 유형의 세포를 세포골격 파괴물질로 사전-처리하고/하거나 이전에 정의된 바와 같이 세포를 NSLC의 형태 및 기능 특징의 출현 및 유지에 적절한 하나 이상의 재프로그램화 인자(예를 들어, 레티노이드 화합물, 향신경성 인자(neurotrophic factor), bFGF, EGF, SHH, Wnt 3a, 뉴로펩티드 Y, 에스트로겐)를 포함하는 배지에서 배양하는 예비 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포내 BMP 신호전달 경로를 억제하는 단계(예를 들어, NOGGIN, 페투인(fetuin) 또는 폴리스타틴(follistatin)에 의한)를 추가로 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 제1 세포로부터의 NSLC의 생성은 하나 이상의 재프로그램화 효능제의 사용을 포함한다. 적절한 효능제에는 무사시-1(Msi1) 및 뉴로게닌 2(Ngn2)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 다른 유력한 효능제는 표 A 및 표 B에 열거되어 있다.
또한, 본 발명은 신경발생의 발현을 상향조절하는 단백질 또는 전사체를 암호화하는 DNA 발현 벡터의 용도에 관한 것이다. 규정된 재프로그램화 효능제, 예컨대 Msi1 및 Ngn2를 암호화하는 유전자적으로-엔지니어링된 DNA 서열을 일-, 이-, 또는 다-시스트론성 벡터를 사용함으로써 세포 내에 도입시킬 수 있다. 내인성 다능 유전자의 발현은 cDNA가 세포에서의 발현이 세포의 탈분화를 직접적으로 또는 간접적으로 야기하는 단백질을 암호화하는 것을 나타낸다. 새로이 탈-분화된 포유동물 세포는 신경 계통으로 재분화되어, 상기 포유동물 세포, 조직 및 기관을 재생할 수 있다.
본 발명은 추가로 유전자적으로-엔지니어링된 DNA 서열을 일시적 트랜스펙션에 의하여 인간 체세포 내로 도입함으로써, NSLC를 생성하는 방법에 관한 것이다. 트랜스펙션 과정에서 도입된 DNA가 핵 게놈 내로 삽입되지 않기 때문에, 외래 DNA는 시간이 지나면서, 그리고 세포가 유사분열을 겪으면서 감소한다. 비-복제가능 형태로 유지된 비바이러스성 벡터는 낮은 면역원성을 가지며, 제조 및 사용하기 쉽고 안전하다. 더욱이, 플라스미드는 큰 DNA 단편을 수용할 수 있다.
특정 일 실시형태에서, 상기 방법은 개체로부터 세포를 수득하고, 시험관 내에서 세포를 재프로그램화하여, NSLC를 생성하는 것과 함께 시작한다. 본 발명의 중요한 태양은 체세포 또는 비-신경 세포의 NSLC로의 안정적인 재프로그램화이며, 이는 상이한 유형의 신경 또는 신경교 세포(신경-유사 또는 신경교-유사 세포 포함)를 야기할 수 있다. 그 다음, 이들은 세포를 수득한 동일한 환자에 다시 이식되어, 신경외상, 뇌졸중 및 신경변성 질환을 비롯한 많은 신경 병상에 대한 자가 치료 방식을 가능하게 할 수 있다. 또한, 이들은 세포를 수득한 개체와 상이한 개체로 이식될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 및 방법은 신경 질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증 또는 척수 손상을 치료하거나, 예방하거나, 안정화시키는데 도움이 될 수 있다. 이러한 기법은 생체 내에서의 NSLC의 이식 또는 시험관 내에서의 분화의 유도 및 생체 내에서의 신경-선구세포 또는 특이적 뉴런 또는 신경교세포의 이식에 의해 수행될 수 있는 임상 치료를 위한 신경 줄기 세포, 신경-선구세포, 뉴런 및 신경교세포의 충분한 공급원을 제공한다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 체세포 또는 비-신경 세포를 분리하고, 세포를 세포 형태 및 염색질 구조를 변경시키는 하나 이상의 효능제에 노출시키고, 세포를 신경 전사 인자를 암호화하는 적어도 하나의 cDNA를 함유하는 하나 이상의 유전자로 트랜스펙션시키는 것을 포함한다. 유전자 트랜스펙션 단계를 세포에서 신경 전사 인자(들)의 발현을 유도하는 대안적인 효능제로 교체할 수 있다. DNA 및 히스텐에 대한 후생적 변형을 유도하는 것(특히, DNA 탈메틸화 및 개방된 염색질 구조)은 세포의 진정한 재프로그램화를 용이하게 한다. 다른 실시형태에서, 세포를 낮은 산소 환경에서, 예컨대 5% O2에서 인큐베이션하여, 세포를 재프로그램화하는 것을 도와준다.
이러한 방법은 세포의 NSLC로의 재프로그램화를 가능하게 한다. 재프로그램화된 세포의 발생 및 증식의 추가의 경로는 그것이 노출되는 동소(in situ) 환경 신호에 좌우된다. 본 발명의 실시형태는 상피 성장 인자(EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 존재 하에, 생성된 NSLC를 증식시키는데 적절한 증식 배지, 예컨대 신경선구세포 증식 배지(스템셀 테크놀로지즈)에서 재프로그램화된 세포를 성장시켜, 신경 줄기 세포가 증식하게 조장하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명에 따라 수득된 NSLC는 NSLC의 신경 및/또는 신경교세포를 향한 분화를 유도하기 위한 전-트랜스-레티노산 또는 비타민 A 및 BDNF를 포함하는 적절한 분화 배지, 예컨대 NS-A 분화 배지(스템셀 테크놀로지즈) 또는 NbActive 배지(브레인비츠(BrainBits)(상표명))에서 신경, 성상세포 및/또는 희소돌기아교세포 계통으로 분화될 수 있다. 신경 세포는 신경 세포 유형과 관련된 하나 이상의 신경-특이적 형태적, 생리학적, 기능적 및/또는 면역학적 특징을 나타내는 세포를 포함한다. 유용한 기준은 하기를 포함한다: 형태적 특징(예를 들어, 긴 융기 또는 신경돌기), 생리학적 및/또는 면역학적 특징, 예컨대 일련의 신경-특이적 마커 또는 항원의 발현, 신경전달물질(들), 예컨대 도파민 또는 감마 아미노부티르산(GABA)의 합성 및 기능적 특징, 예컨대 뉴런에 특징적인 이온 채널 또는 활동 전위.
상기 방법에 따르면, 재프로그램화된 세포를 비트랜스펙션된 세포와 비교하여, 차등적인 부착 특성에 기초하여 선택할 수 있으며; 예를 들어, 재프로그램화된 세포는 부유하는 뉴로스피어를 형성하거나 라미닌 상에서 잘 자랄 수 있는 한편, 비트랜스펙션된 섬유아세포는 정상 세포 배양 처리된 플레이트 상에 부착되어 잘 성장한다. 재프로그램화된 세포는 하나 이상의 신경 줄기 특이적 마커 및 형태, 및 원래 세포에 비한 특정 마커의 일부 또는 모두의 소실을 나타내는 세포를 포함한다. 더욱이, 신경-유사 세포(NLC)의 작용성의 일부를 예를 들어, 패치-클램핑, 시냅토파이신 및 MAP2b에 대한 면역염색에 의해, 그리고 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA)에 의한 것과 같은 면역화학적 수단에 의해 상이한 시점에서 평가할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 조직 손상 부위에서 중추신경계 재생을 개시하고 지시할 수 있으며, 공여자 또는 출발 세포로서 그들 자신의 세포를 사용하는 개별 환자에 대하여 맞춤화될 수 있는 NSLC를 제공한다. 본 발명은 개별 환자로부터 세포를 생성하고, 이에 따라, 많은 신경 병상에 대한 치료 방식으로서 자가 이식을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 기법은 비-숙주 세포의 이식과 관련된 문제, 예컨대 면역 거부 및 질환 전이의 위험을 없앤다. 본 발명의 큰 이점은 이것이 이식에 적합한 자가 이식편에 대한 본질적으로 무제한적인 공급을 제공한다는 것이다. 따라서, 이는 현재의 이식 재료의 공급원 및 방법과 관련된 일부 상당한 문제를 예방할 것이다.
폴리뉴클레오티드의 전달
특정 실시형태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, MBD2 폴리펩티드, 무사시1 폴리펩티드 및/또는 Ngn2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 수단은 당업계에 널리 공지되어 있다. 세포의 트랜스펙션 방법, 예컨대 뉴클레오펙션 및/또는 리포펙션 또는 다른 유형의 트랜스펙션 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 목적으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현을 위한 진핵 세포 내의 트랜스펙션을 위한 중간 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 핵산의 저장 또는 조작, 또는 단백질의 생성을 위한 중간 벡터는 예를 들어, 원핵 벡터(예컨대 플라스미드), 셔틀 벡터, 삽입 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 목적으로 하는 폴리펩티드는 또한 융합 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
클로닝된 핵산의 발현을 수득하기 위하여, 이를 전형적으로 전사를 지시하기 위한 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝시킨다. 적절한 박테리아 및 진핵 프로모터가 해당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 기재되어 있다. 선택하는 핵산의 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터는 특정 응용에 좌우된다. 예를 들어, 강력한 구성(constitutive) 프로모터는 전형적으로 발현 및 정제를 위해 사용된다. 반면, 탈분화 단백질 또는 화합물은 단백질의 특정 용도에 따라 생체 내에서 구성 또는 유도성 프로모터 중 어느 하나를 사용하거나, 또는 화합물이 사용된다. 또한, 약한 프로모터, 예컨대 HSV TK 또는 유사 활성을 갖는 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 프로모터는 전형적으로 트랜스활성화에 대해 반응성인 요소, 예컨대 저산소 반응 요소, Ga14 반응 요소, lac 억제자 반응 요소 및 소분자 조절 시스템, 예컨대 tet-조절 시스템 및 RU-486 시스템을 포함할 수 있다.
프로모터 외에, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포, 원핵 또는 진핵 중 어느 하나에서 핵산의 발현에 필요한 추가의 요소를 함유하는 전사 유닛 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 예를 들어, 핵산 서열 및 예를 들어, 전사체의 효과적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 및/또는 번역 종결에 필요한 신호에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 카세트의 추가의 요소는 예를 들어, 인핸서(enhancer) 및 이종 스플라이싱된 인트론 신호를 포함할 수 있다.
진핵 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 종종 진핵 발현 벡터, 예컨대 SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터 및 엡스테인-바 바이러스 유래의 벡터에서 사용된다. 다른 예시적인 진핵 벡터에는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE 및 SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 보이는 다른 프로모터의 지시 하에서 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 다른 벡터가 포함된다.
표준 트랜스펙션 방법을 사용하여, 다량의 탈분화 단백질을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모, 곤충 또는 다른 세포주를 생성할 수 있으며, 탈분화 단백질은 표준 기법을 사용하여 필요에 따라 정제될 수 있다. 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기법에 따라 수행한다.
외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 도입시키는 임의의 절차가 사용될 수 있다. 이들에는 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란-매개의 트랜스펙션, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 지질-매개의 전달(예컨대, 리포솜), 미세주입, 입자 충격(particle bombardment), 네이키드(naked) DNA의 도입, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(에피솜 및 통합 둘 모두) 및 숙주 세포 내로 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전 물질을 도입하기 위한 임의의 다른 널리 공지되어 있는 방법이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다(참조예: 상기 문헌[Sambrook et al.]). 사용되는 특정 유전자 엔지니어링 절차가 적어도 하나의 유전자를 선택되는 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 성공적으로 도입시킬 수 있는 것만이 필요하다.
통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반의 유전자 전달 방법을 사용하여, 핵산을 포유동물 세포 또는 표적 조직으로 도입시킬 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 시험관 내에서 재프로그램화 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 세포에 투여할 수 있다. 바람직하게는 생체 내 또는 시험관 내 유전자 치료법 용도를 위하여 핵산을 투여한다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산 및 리포솜과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로의 전달 후에, 에피좀 또는 통합된 게놈 중 어느 하나를 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 미세주입, 탄도(ballistic), 비로좀, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질-핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 효능제-증가된 DNA의 이용을 포함한다. 리포펙션 시약은 시판되고 있다(예컨대, 트랜스펙탐(Transfectam)(상표명) 및 리포펙틴(상표명)). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적절한 양이온 및 중성 지질이 공지되어 있다. 핵산은 세포로(생체 외 투여) 또는 표적 조직으로(생체 내 투여) 전달될 수 있다. 표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질(immunolipid) 복합체를 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스-기반의 시스템의 사용은 신체 내에서 바이러스를 특정 세포에 표적화시키고, 바이러스 페이로드(payload)를 핵에 수송하기 위한 매우 개량된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터를 환자에 직접 투여하거나(생체 내) 이들을 사용하여 시험관 내에서 세포를 처리하고, 변경된 세포를 환자에게 투여할 수 있다(생체 외). 전달에 통상적인 바이러스 기반의 시스템은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 및 간염바이러스 벡터를 포함하지만, 숙주 게놈 내의 통합은 삽입된 트랜스유전자의 장기간 발현을 야기하는 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법을 비롯하여 특정 바이러스 벡터에서 가능하다. 또한, 높은 형질도입(transduction) 효능이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용되는 레트로바이러스 벡터의 예이다. 일시적 발현이 바람직한 응용에서, 아데노바이러스-기반의 시스템이 유용하다. 아데노바이러스 기반의 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효능이 있을 수 있으며, 감염시킬 수 있고, 이에 따라 핵산을 분열 및 비-분열 세포로 전달할 수 있다. 이러한 벡터를 사용하여, 높은 역가 및 수준의 발현을 수득하였다. 아데노바이러스 벡터를 상대적으로 간단한 시스템에서 다량으로 생성할 수 있다.
유전자 치료법 벡터는 전형적으로 전신 투여(예컨대, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 응용에 의한 개별 환자로의 투여에 의해 생체 내에서 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 통상 재프로그램화되는 세포에 대한 선택 후에, 생체 외에서 세포, 개별 환자로부터 외식된 세포(예컨대, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검) 또는 보편적인 공여 조혈 줄기 세포로 전달되고, 세포의 환자 내로의 재이식으로 이어질 수 있다.
진단, 연구 또는 유전자 치료법(예를 들어, 트랜스펙션된 세포를 숙주 유기체 내로 재주입)을 위한 생체 외 세포 트랜스펙션은 당업계에 널리 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포를 대상 유기체로부터 분리하고, 핵산(유전자 또는 cDNA)으로 트랜스펙션시키고, 대상 유기체(예를 들어, 환자) 내로 다시 재주입한다. 생체 외 트랜스펙션에 적절한 다양한 세포 유형은 당업계에 널리 공지되어 있다.
또한, 치료 핵산을 함유하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 생체 내에서의 세포의 트랜스펙션을 위하여 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 분자를 혈구 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉하게 도입시키는데 통상 사용되는 임의의 경로에 의한다. 이러한 핵산의 적절한 투여 방법이 이용가능하며, 당업계에 널리 공지되어 있고, 1가지 초과의 경로를 특정 조성물을 투여하기 위하여 사용할 수 있지만, 종종 특정 경로가 다른 경로보다 더 자명하고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물의 매우 다양한 적절한 제형이 있다.
폴리펩티드의 전달
대부분, 본 명세서에 기재된 모든 방법까지는 아니라 하더라도, 대안적인 가능성은 폴리뉴클레오티드의 사용을 우회하고, 제1 유형의 세포를 세포내 수준이 증가되는 것을 목적으로 하는 화합물(예를 들어, 폴리펩티드)과 직접 접촉하는 것으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 예를 들어, 특정 시험관 내 상황에서, 세포를 하나 이상의 작용성 폴리펩티드를 함유하는 배지에서 배양한다.
폴리펩티드의 투여에서의 중요한 인자는 폴리펩티드가 세포의 원형질 막 또는 세포내 구획, 예컨대 핵의 막을 가로지르는 능력을 갖는 것을 보장하는 것이다. 세포막은 작은, 비이온성 친유성 화합물을 자유롭게 투과시킬 수 있으며, 극성 화합물, 거대분자 및 치료 또는 진단 효능제에 대해서는 본질적으로 비투과성인 지질-단백질 2층으로 이루어진다. 그러나, 세포막을 가로질러 폴리펩티드를 전위시킬 수 있는 능력을 갖는 단백질, 지질 및 다른 화합물이 기재되어 있다. 예를 들어, "막 전위 폴리펩티드"는 막-전위 캐리어(carrier)로 작용하는 능력을 갖는 양친매성 또는 소수성 아미노산 부분서열(subsequence)을 갖는다. 본 발명에 따라 증가된 세포내 수준이 요구되는 폴리펩티드는 세포 내로의 그들의 흡수를 용이하게 하기 위한 적절한 펩티드 서열에 연결될 수 있다. 또한, 증가된 세포내 흡수를 제공하는 다른 적절한 화학적 부분(moiety)은 폴리펩티드에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 또한, 세포막을 가로질러 폴리펩티드를 수송하는 능력을 갖는 다른 적절한 캐리어를 사용할 수 있다.
또한, 목적으로 하는 폴리펩티드는 리포솜 및 리포솜 유도체, 예컨대 면역리포솜을 통해 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 내로 도입시킬 수 있다. 용어 "리포솜"은 수성상을 둘러싸는 하나 이상의 동심적으로 정렬된 지질 2층으로 이루어진 소포를 지칭한다. 수성상은 전형적으로 세포로 운반되는 화합물을 함유한다. 특정 실시형태에서, 이는 표적 세포 유형, 조직 등에 특이적인 표적화 부분을 사용하여 리포솜을 표적화하는데 바람직할 수 있다. 다양한 표적화 부분(예컨대, 리간드, 수용체 및 모노클로널 항체)을 사용한 리포좀의 표적화가 이전에 기재되어 있다.
세포 및 세포주
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 방법으로부터 유래된 세포, 세포주, 줄기 세포 및 정제된 세포 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 세포, 세포주, 줄기 세포 및 정제된 세포 제제는 인간, 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 소 또는 양을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물 기원의 것이다. 바람직한 실시형태에서, 이들은 인간으로부터 유래한다.
따라서, 본 발명의 다른 태양은 변형된 세포, 세포주, 만능, 다능 또는 단일능 세포 및 정제된 세포 제제에 관한 것이며, 임의의 이들 세포는 무사시1(Msi1); Msi1 및 Ngn2; Msi1 및 MBD2; 및 Ngn2 및 MBD2; Msi1, Ngn2 및 MBD2; Msi1, Ngn2, 네스틴 및 MBD2; 및 바람직하게는 Msi1 및 Ngn2 및 MBD2를 포함하는 표 A로부터의 다른 유력한 조합물을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포는 줄기-유사 세포, 더욱 바람직하게는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)이며, 세포는 하나 이상의 하나의 특징을 갖는다:
- Sox2, 네스틴, GFAP, Msi1 및 Ngn2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 신경 줄기 세포 마커의 발현;
- NSLC가 수득된 세포에 특이적인 하나 이상의 유전자(예를 들어, 표 C 참조)의 발현 감소;
- 뉴로스피어 콜로니 형성 검정에서 뉴로스피어를 형성;
- 현탁액에서 또는 부착 배양으로서 배양될 수 있음;
- 외인성 재프로그램화 효능제의 존재 없이 1개월 초과, 바람직하게는 2개월 초과, 3개월 초과, 5개월 초과 및 심지어는 1년 초과 동안 증식할 수 있음;
- 낮은 계대에서 매 36시간마다 분열할 수 있음;
- 텔로머라제 활성에 대하여 양성;
- 신경-유사 세포, 성상세포-유사 세포, 희소돌기아교세포-유사 세포 및 이들의 조합으로 분화할 수 있음;
- 분화 후에 텔로머라제 및 하나 이상의 신경 줄기 세포 마커의 발현 감소;
- 신경-유사 세포로의 분화 후에, 길이가 하나의 세포 직경을 초과하는 하나 이상의 형태적 신경돌기-유사 융기(축삭 및/또는 수지상 돌기)를 가짐;
- 신경-유사 세포로의 분화 후에 신경-특이적 튜불린, 미세소관 관련 단백질 2, NCAM 및 신경전달물질에 대한 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신경-특이적 항원의 발현;
- 신경-유사 세포로의 분화 후에 하나 이상의 작용성 신경 마커(예컨대, 시냅신)의 발현;
- 신경-유사 세포로의 분화 후에, 하나 이상의 향신경성 인자(예를 들어, BDNF)를 분비할 수 있음;
- 종양 콜로니 형성 검정에서 음성;
- SCID 마우스에서 종양 성장에 대하여 음성;
- SCID 마우스에서 기형종 성장에 대하여 음성;
- 뇌 절제 모델에서 적절한 수의 NSLC의 공극으로의 배치 후에 하나 이상의 기능적 측정치를 유의미하게 향상시킬 수 있음;
- 적절한 수의 NSLC의 EAE 모델로의 주사 후에 하나 이상의 기능적 측정치를 유의미하게 향상시키거나 유지할 수 있음; 및
- CNS 손상 또는 신경변성 모델에서 hNPC보다 더 유의미하게 하나 이상의 기능적 측정치를 향상시킬 수 있음.
상기 항목 모두의 예는 본 출원의 실시예 부문에서 찾을 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 NSLC는 하기의 특징 모두를 갖는다:
- 체세포보다 유의미하게 더 긴 자가-재생능;
- 암 세포가 아님;
- 안정적이며, 강제 유전자 발현에 의해 또는 유사한 수단에 의해 인공적으로 유지되지 않고, 표준 신경 줄기 세포 배지에서 유지될 수 있음;
- 선구세포, 전구세포, 체세포 또는 동일한 계통의 다른 더 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있음;
- 줄기 세포의 특징을 가지며, 특정 마커 또는 유전자 발현 또는 형태적 외양을 아직은 가지지 않음; 및
- 생체 내에서 비제어된 성장, 기형종 형성 및 종양 형성을 나타내지 않음.
특정 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 재프로그램화된 세포(NSLC)는 그들의 신경 줄기 세포 마커 및 그들의 뉴런-유사, 성상세포-유사 및 희소돌기아교세포-유사 세포를 향한 분화능을 소실하지 않고, 수개월 동안 증식할 수 있다. 신경 계통의 생성은 형태학, 표현형 변화 및 기능적 특성에 기초하여 특성화한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포는 하나 이상의 하기의 특징 및 특성을 가질 수 있다: 자가-재생, 시험관 내 및 생체 내에서 다계통 분화, 클론원성(clonogenicity), 정상 핵형, 잘 규정되어 있는 배양 조건 하의 시험관 내에서의 광범위한 증식 및 동결 및 해동능뿐만 아니라, 통상적으로 공지되고/되거나 목적으로 하는 줄기 세포의 전형적인 특성 또는 특징 중 임의의 것. 본 발명의 세포는 다능 또는 만능 세포의 분자 마커(즉, 이전에 정의된 바와 같은 유전자 및 표면 마커)를 추가로 발현할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 조직 특이적 자가유래(자가) 줄기 및/또는 선구세포의 생성에 관한 것이다. 이들 줄기 및/또는 선구세포는 세포 변성의 질환을 치료하기 위한 세포 치료법 응용에서 유용할 수 있다. 세포 변성의 질환에는 예컨대 신경변성 질환, 예컨대, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증, 황반 변성, 골용해성 질환, 예컨대 골다공증, 골관절염, 골절, 뼈 골절(bone break), 당뇨병, 간 손상, 변성 질환, 심근경색증, 화상 및 암이 포함된다. 본 발명에 따른 세포를 숙주에 주입하거나 이식할 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명의 이점은 면역계 매개의 거부의 위험 없이, 다수의 자가유래 줄기 세포를 이식을 위해 생성할 수 있다. 이들 세포는 개체 내로의 이식에 적절한 조직의 생성을 야기할 수 있다. 조직이 이식 수여자로부터 유래되기 때문에, 이는 비관련 공여자로부터의 조직에서와 같이, 면역 반응을 자극하지 않을 것이다. 이러한 이식물은 예를 들어, 백혈병 및 림프종과 같은 다양한 악성종양의 치료에 사용되는 조직(예컨대, 정맥, 동맥, 피부, 근육), 고형 기관 이식물(예컨대, 심장, 간, 신장), 신경 세포 이식물 또는 골수 이식물을 구성할 수 있다. 또한, 신경 줄기 세포, 신경선구세포, 신경 세포(뿐 아니라, NSLC 및 이의 유도체) 이식물은 예를 들어 신경 장애, 뇌졸중, 척수 손상, 파킨슨병 등뿐 아니라, 잠재적 일부 비-신경 장애, 예컨대 심근경색의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 이후의 숙주 세포 내로의 주입 또는 이식을 위하여, 생체 외에서 엔지니어링된 조직을 생성하는 방법에 관한 것이며, 이들 엔지니어링된 조직의 세포 구성성분은 본 발명에 따른 세포 또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 세포의 증식된 배양물은 성장 인자 및/또는 모르포겐으로의 시험관 내 처리에 의해 분화될 수 있다. 그 다음, 분화된 세포의 집단은 수여 숙주 내로 손상 또는 훼손 부위 근처에 주입하거나, 기재된 바와 같이 시험관 내에서 배양하여, 엔지니어링된 조직을 생성한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법 및 세포를 사용하여 세포를 무한증식하게 할 수 있으며, 예를 들어, 세포주를 생성할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여, 체세포를 탈분화된 표현형을 갖는 세포로 전환시켜, 다양한 조직으로부터 세포주의 생성을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 무한증식 세포를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 세포의 유도 방법은 (a) 세포 발생 및 유전적 연구를 수반하는 과학적 발견 및 연구(예컨대, 인간 세포의 분화, 탈분화 또는 재프로그램화를 연구하기 위한 모델 세포주로서의 인간 줄기 세포 대신의 용도), (b) 약물 개발 및 발견(예를 들어, 특정 약물 후보물질 및 화학물질의 효능 및 독성에 대한 스크리닝, 세포의 분화, 탈분화 또는 재프로그램화를 매개하는 유망한 약물 또는 효능제에 대한 스크리닝), (c) 유전자 치료법(예컨대, 유전자 치료법을 위한 전달 장치로서), 및 (d) 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 타이-삭스병, 고쉐병, 척수 손상, 뇌졸중, 화상 및 다른 피부 손상, 심장 질환, 당뇨병, 루푸스, 골관절염, 간 질환, 호르몬 장애, 신장 질환, 백혈병, 림프구, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 뒤시엔느 근윅축증, 불완전한 개체발생, 선천성 결함, 불임, 습관성 유산 및 기타 암, 변성 및 기타 질환 및 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는 손상, 외상, 질환 및 장애의 치료를 포함하나 이에 한정되지 않는 과학 및 치료 응용에서 도움이 될 수 있다.
추가의 태양은 치료법, 치료 방법 및 포유동물(예를 들어, 인간 대상체)에서 조직 또는 기관을 재생하는 방법에 관한 것이다. 특정 일 방법은 포유동물 조직 또는 기관의 재생 방법에 관한 것이며, 이는 재생되는 조직 또는 기관을 SLC, NSLC 또는 다른 목적으로 하는 세포 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 인공 조직 구조물(construct)과 접촉시키는 것을 포함한다. SLC, NSLC, 목적으로 하는 세포 또는 인공 조직 구조물은 임의의 적절한 경로(예를 들어, 세포를 경막내로 주사하거나, 조직 또는 기관에 직접 주사하거나, 혈류 내로 주사하는 것)를 사용하여 대상체에게 투여함으로써 재생될 조직 또는 기관 근처에 배치할 수 있다.
조직 또는 기관의 회복 또는 재생을 필요로 하는 대상체에서 조직 또는 기관을 회복 또는 재생하는 다른 방법은 대상체에게 조직 또는 기관의 세포에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 화합물 및/또는 대상체의 생체 내에서 전환 또는 탈분화할 수 있는 세포에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 적어도 하나의 유전자 조절인자의 발현은 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포(예를 들어, 신경 줄기-유사 세포)로 재프로그램화하며, 상이한 유형의 이들 세포는 상기 조직 또는 기관을 회복시키거나 재생하는데 효과적이다.
다른 방법은 환자로부터 세포 또는 조직을 수득하고(예를 들어, 조혈 줄기 세포, 섬유아세포 또는 각질형성세포), 다수의 이러한 세포 또는 조직을 재프로그램화하고, 재프로그램화된 세포 또는 조직을 환자 내로 재도입시키는 것을 포함한다. 관련 태양은 본 명세서에 정의된 다수의 목적으로 하는 세포, SLC 및/또는 신경 줄기-유사 세포(NSLC) 또는 재프로그램화된 조직을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 치료 방법은 뇌, 척수, 심장, 안구, 망막, 와우, 피부, 근육, 장, 췌장(베타 세포 포함), 신장, 간, 폐, 뼈, 골수, 연골, 연골 원반(cartilage disc), 모공, 치아, 혈관, 샘(내분비 및 외분비샘 포함), 난소, 생식 기관, 유방 및 가슴 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 조직 및 기관의 재생 또는 회복에 적용할 수 있다.
관련 태양은 본 명세서에 정의된 다수의 목적으로 하는 세포, SLC 및/또는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조직
본 발명의 다른 태양은 본 명세서에 정의된 바와 같은 재프로그램화된 세포를 함유하는 조직에 관한 것이며, 이는 이를 필요로 하는 대상체 내로 주입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 조직, 예를 들어, 세포 및 이들 세포에 의해 생성된 세포외 기질을 포함하는 시험관 내에서 생성된 3D 조직 구조물 내의 세포의 재프로그램화를 제공한다. 또한, 트랜스펙션된 세포는 완전히 자가유래로 만들어, 숙주 거부를 방지시키고, 이를 완전히 면역혼화성이게 만들고, 생체 내에서 이식될 재프로그램화 세포에 대한 캐리어로서의 이들 3D 조직 구조물의 상측에 씨딩한다. 유리하게는, 이들 새로이 생성된 세포는 시험관 내 진단 목적을 위하여 이들 조직 내에서 이들의 미분화 및/또는 분화 상태로 사용될 수 있거나, 세포 치료법/조직 대체 방법에서 이러한 구조물을 필요로 하는 환자 내로 이식될 수 있다.
본 발명은 추가로 3D 신경-유사 다층 조직을 포함한다. 본 발명에 따라 신경 줄기-유사 세포로 재프로그램화된 CDM 내의 세포는 CDM 내의 뉴런-유사 세포, 성상세포-유사 세포 및 희소돌기아교세포-유사 세포로 용이하게 분화한다. 따라서, 본 발명의 CDM 및 재프로그램화 방법을 사용하여, CDM 내의 세포를 재프로그램화하여, 3D 뉴런-유사 다층 조직(30개 초과까지의 세포층)을 형성하는 것이 가능하다. 이러한 3D 조직은 뉴런(또는 구체적으로, 뉴런-유사 세포), 성상세포(또는 구체적으로, 성상세포-유사 세포) 및 희소돌기아교세포(또는 구체적으로, 희소돌기아교세포-유사 세포)를 포함하며, 이는 완전히 자가유래로 만들 수 있으며, 상대적으로 용이하게 수동으로 조작하고 주입할 수 있거나, 시험관 내 CNS 조직 모델로서 사용할 수 있다.
특정 일 태양은 시험관 내 배양된 세포 및 이들 세포에 의해 생성된 세포외 기질의 3D 어셈블리를 포함하는 인공 조직 구조물에 관한 것이다. 세포는 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 수득되는 목적으로 하는 세포, SLC 및/또는 다수의 신경 줄기-유사 세포(NSLC)일 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명의 다른 태양은 제1 유형의 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 전환시킬 수 있는 새로운 화합물(예를 들어, 소분자, 약물 등)을 확인하는 방법에 관한 것이다. 이들 새로운 화합물은 연구 목적을 위해, 또는 대상체에서 조직을 회복시키거나 재생하는데 사용하기 위한 약제로서 유용할 수 있다.
실시예 부문은 이러한 바람직한 활성 화합물의 스크리닝 및 확인에 유용한 원리, 방법 및 기법을 제공한다. 예를 들어, 당업자는 세포 내의 무사시1, NGN2 또는 MBD2의 일시적인 증가에 의해 제공되는 "유도" 또는 "생물학적 활성"을 시험할 후보 화합물(예를 들어, 소분자 또는 화합물의 라이브러리)로 교체하고, NSLC를 생성하는데에서 후보 화합물의 활성 또는 효능을 측정함으로써, 제1 유형의 세포의 NSLC로의 전환을 유도할 화합물을 스크리닝할 수 있음을 이해할 것이다. 개별 활성 화합물 또는 활성 화합물의 혼합물은 이들이 동일한 활성을 갖고/갖거나 이들이 이들 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 효과를 제공할 수 있다면, 선택될 것이다(예를 들어, 본 명세서에서 이전에 정의된 임의의 바람직한 마커 또는 바람직한 특징의 세포 전환 및/또는 외양). 예를 들어, 섬유아세포를 NSLC로 전환시킬 수 있는 화합물 또는 화합물의 혼합물은 다음에 의해 확인할 수 있다:
(i) 실시예 1에서와 같이, 섬유아세포의 준비, 배양 및 NSLC로의 전환;
(ii) Msi1, Ngn2 및/또는 MBD2를 상이한 웰에서 각 후보 화합물로 교체하는 것에 의한 화합물의 라이브러리의 스크리닝;
(iii) 후보 화합물뿐 아니라 대체된 Msi1, Ngn2 및/또는 MBD2가 섬유아세포를 NSLC에 가까이 전환시킬 수 있는 경우, 화합물 '히트(hit)'의 확인;
(iv) 파트 (iii)로부터의 화합물이 Msi1, Ngn2 및 MBD2의 모두를 대체하지 않고, 섬유아세포를 스스로 NSLC로 전환시킬 수 없다면, 각 웰 내에 (iii)으로부터의 화합물을 포함시키고, 파트 (ii)에서 제거되지 않았던 Msi1, Ngn2 및/또는 MBD2를 상이한 웰에서 각 후보 화합물로 대체함에 의한 화합물의 라이브러리의 스크리닝;
(v) 파트 (iii)으로부터의 화합물과 함께, 후보 화합물뿐 아니라 대체된 Msi1, Ngn2 및/또는 MBD2가 섬유아세포를 NSLC에 가까이 전환시킬 수 있는 경우, 화합물 '히트'의 확인;
(vi) 파트 (V)로부터의 화합물이 Msi1, Ngn2 및/또는 MBD2의 모두를 대체하지 않고, 섬유아세포를 파트 (iii)으로부터의 화합물과 함께 NSLC로 전환시킬 수 없다면, 각 웰 내에 (iii) 및 (v)로부터의 화합물을 포함시키고, 파트 (ii) 및 (iv)에서 제거되지 않았던 Msi1, Ngn2 또는 MBD2를 상이한 웰에서 각 후보 화합물로 대체함에 의한 화합물의 라이브러리의 스크리닝;
(vii) 파트 (iii) 및 (v)로부터의 화합물과 함께, 후보 화합물뿐 아니라 대체된 Msi1, Ngn2 또는 MBD2가 섬유아세포를 NSLC에 가까이 전환시킬 수 있는 경우, 화합물 '히트'의 확인;
(viii) 파트 (iii), (v) 및 (vii)로부터의 화합물의 조합물이 섬유아세포를 NSLC로 전환시킬 수 있을 것이며; 이들 화합물에 대한 변형을 만들고 추가로 스크리닝하여, 더욱 효과적이거나 안전한 버전의 이들 화합물을 확인할 수 있음.
동일한 원리를 만능-유사 세포, 중내배엽-유사 세포, 췌장 선구세포-유사 세포 등을 비롯한 다른 목적으로 하는 줄기-유사 세포의 유형에 적용할 수 있다. 표 A 및 표 B, 및 실시예 부문은 이들 유형의 각각의 세포, 이러한 스크리닝 방법에서 고려되는 유력한 유전자 및/또는 화합물의 목록을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 재프로그램화 인자 및/또는 유전자 조절인자의 효능과 비교하여, 후보 화합물이 제1 유형의 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 전환시키는데에서의 그들의 효능에 대해 시험하는 이들 방법 및 임의의 등가의 스크리닝 방법을 포함한다.
향신경성 인자의 전달
향신경성 인자의 국소 전달은 몇몇 신경 조건을 치료하기 위한 방법으로서 제안되었다. 향신경성 분자를 사용한 전략은 뉴런의 진행성 소실을 예방하는 것, 신경 연결 및 기능(신경보호)을 유지하는 것 및 뉴런에서 증가된 신경전달물질 턴오버 및/또는 축색 발생과 같은 추가의 재생 반응을 유도하는 것에 초점을 둔다. 최근까지, 동물 모델에서 향신경성 인자를 전달하기 위한 일부 치료 전략을 연구하였으나, 지금까지, 뇌 및 신경계에서의 성장 인자의 효과의 시험은 상당한 부작용의 위험을 지니는 큰 용량의 이들 인자의 말초 주사를 지시하는 것에 제한된다. 따라서, 본 발명의 관련 태양은 이식 후에 유력한 대상의 성장 인자를 안정적으로 발현하며 분비할 수 있는 본 발명에 따른 NSLC 세포 및 세포주를 사용는 것에 의하여, 이들 문제를 극복하는 것에 관한 것이다.
요약하여, 본 발명은 신경 줄기 세포, 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포의 이식을 필요로 하는 강력한 임상 치료를 위한 신경 줄기-유사 세포, 신경-유사 세포, 성상세포-유사 세포 또는 희소돌기아교세포-유사 세포의 풍부한 공급원을 제공하여, 1) 숙주 세포(예컨대, 뉴런)의 소실을 보상하거나, 2) 비히클로서 유전자 기반의 약물을 전달한다. 또한, 본 발명은 기본 연구 및 약물 스크리닝에서 사용하기 위한 신규한 신경학적 도구를 제공한다.
당업자는 본 명세서에 기재된 특정 절차, 실시형태, 특허청구범위 및 실시예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 1가지 초과의 통상적인 실험을 사용하여 알아낼 수 있다. 이러한 등가물은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되며, 본 명세서에 첨부된 특허청구범위에 의해 포함된다. 본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
하기의 본 명세서에 기재된 실시예는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 비롯한 재프로그램화 및 탈분화된 세포를 수득하기 위한 예시적인 방법을 제공한다. 또한, 예시적인 프로토콜, 분자 도구, 프로브, 프라이머 및 기법이 제공된다.
실시예 I
인간 섬유아세포의 제조
인간 포피 섬유아세포(HFF)를 어메리컨 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 구입하고, 10% 열-불활성화 우태아 혈청(FCS, 하이클론 래보러터리즈(Hyclone Laboratories)), 0.1mM 비필수 아미노산 및 1.0mM 피루브산나트륨(인비트로젠)이 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, 인비트로젠)가 있는 세포 배양 플라스크에서 37℃, 5% CO2에서 증식시켰다. 배지를 1주에 2회 교환하였다. 세포를 37℃에서 4분 동안 트립신 0.25%를 사용하여 트립신처리하고, 이어서, 트립신 억제제 용액을 첨가하고, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 세포를 PBS로 1회 세정하고, 적절한 수의 세포에 도달할 때까지 세포를 1:2의 비로 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다.
그 다음, 세포를 2가지 상이한 조성의 CDM 배지에서 라미닌(10㎍/㎖, 시그마)으로 사전 코팅된 세포 배양 플레이트에서 트립신처리하고 플레이팅하였다(8×104 개 세포/웰): CDM I 배지는 L-아스코르브산의 존재 없이, 3:1 비의 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, L-글루타민 및 피루브산나트륨이 있는 고 글루코스(4.5g/ℓ)) 및 햄의 F-12 배지(EGF(4.2×10-10M), bFGF(2.8×10-10M), ITS(8.6×10-5M), 덱사메타손(1.0×10-7M), L-3,3',5-트라이아이오도티로닌(2.0×10-10M), 에탄올아민(10-4M), 글루타맥스(상표명)(4×10-3M) 및 글루타티온(3.3×10-6M)의 성분이 보충됨)로 이루어짐.
CDM II 배지는 3:1 비의 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, L-글루타민 및 피루브산나트륨이 있는 고 글루코스(4.5g/ℓ)) 및 햄의 F-12 배지(EGF(2.5ng/㎖), bFGF(10ng/㎖), 에탄올아민(2.03㎎/㎖), 인슐린(10㎎/㎖), 아셀렌산(2.5g/㎖), 덱사메타손(19.7㎍/㎖), L-3,3',5-트라이아이오도티로닌(675ng/㎖), 글루타맥스(상표명)(4×10-3M) 및 글루타티온(3.3×10-6M)이 보충됨)로 이루어진다.
작제된 벡터를 사용한 리포펙타민에 의한 HFF 의 일시적 트랜스펙션
배양에서 2일 후에, 세포를 제조처의 프로토콜에 따라, 리포펙타민 시약(인비트로젠)을 사용하여 pCMV6-XL5-MBD2(2㎍)(DNA 탈메틸화제)로 트랜스펙션시켰다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. DNA 탈메틸화제로의 트랜스펙션 24시간 후에, 배지를 교환하고, 세포를 pCMV6-XL5-무사시1(2㎍, 오리진) 또는 pCMV6-XL4-Ngn2(2㎍, 오리진)로 24시간 동안 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 배지를 Noggin(20ng/㎖, 페프로테크), EGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 bFGF(20ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 신경선구세포 기본 배지(NPBM, 론자(Lonza))로 교환하고, 이러한 증식 배지에서 배양하였다. 세포를 3일 후에 다시 트랜스펙션시키고, 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 증식 조건에서의 7일 후에, 증식 배지의 50%를 포르스콜린(10μM, 토크리스(Tocris)), 전-트랜스-레티노산(ATRA, 5μM, 스펙트럼(Spectrum)), bFGF(20ng/㎖, 페프로테크), NGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 BDNF(20ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 분화 배지(NbActive, 브레인비츠(상표명))로 교환하고; 증식 배지에 대한 분화 배지의 백분율을 증가시킴으로써 배지를 매일 교환하고 세포를 20일 동안 배양하였다.
트랜스펙션 후에, 재프로그램화된 세포의 시각적 관찰을 브라이트 필드에서 10× 배율로 광학 현미경 관찰에 의해 매일 수행하였다. 샘플을 상이한 시점(6, 12 및 20일)에 수집하여, 유전자 어레이 및 면역조직화학에 의해 신경 유전자 발현 및 단백질 수준을 분석하였다. 트랜스펙션 후에 재프로그램화 세포는 트랜스펙션 3일 후에 세포 형태에서의 빠른 변화를 나타내었다(도 1). 세포는 더 둥글었고, 세포의 세포질이 핵을 향해 들어가, 확대된 세포질 연장과 함께 수축된 세포체를 형성하고, 6일 및 12일에 신경 핵주위부(perikaryal) 외양을 나타내었으며, 이는 20일까지 유지되었다. 그러나, 이러한 형태는 6일 및 12일에 비트랜스펙션된 세포에서는 관찰되지 않았다.
유전자 어레이 분석
트랜스펙션 후에 새로이 엔지니어링된 세포의 특성화를 이들 유전자 및 대조군을 암호화하는 48개의 부분 cDNA를 함유하는 신경 유전자-어레이를 사용하여 수행하였다.
RNA를 QIAshredder(상표명)(퀴아젠(Qiagen)) 및 RNeasy(상표명) 플러스 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 제조처의 지시에 따라 샘플로부터 분리하였다. DNase I 처리를 RNeasy(상표명) 컬럼에서 수행하여, Rnase-프리(Free) DNase 세트(퀴아젠)를 사용하여 트랜스펙션된 플라스미드 DNA를 추가로 제거하였다. RNA를 35㎕의 무-RNase 물에 용출시켰다. cDNA 합성 전에, 모든 RNA 샘플을 나노드롭(NanoDrop) 1000(상표명)(써모사이언티픽(ThermoScientific))을 사용하여 정량화하였다. cDNA를 제조처의 지시에 따라 하이 캐퍼서티(High Capacity) cDNA 아치브 키트(archive kit)(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 제조하였다. 400ng의 RNA를 각 50㎕ RT 반응에서 사용하였다. 생성된 cDNA 샘플을 TLDA 분석을 위해 즉시 사용하였다. Taqman(상표명) 저밀도 어레이(TLDA)의 각 카드에 대하여, 카드당 총 384개의 웰에 대하여 48개의 개별 웰로 공급되는 8개의 분리된 로딩 포트(loading port)가 있다. 각 2㎕ 웰은 단일의 유전자를 검출할 수 있는 특이적인 사용자-정의된 프라이머 및 프로브를 함유한다. 이러한 연구에서, 맞춤형 신경 마커 2 TLDA를 8개의 동일한 48개 유전자 세트, 즉, 각 48개 유전자 세트에 대한 1개의 로딩 포트로 구성하였다. 유전자를 문헌에 기초하여 선택하였다. 또한, 48개 유전자의 각 세트는 3개의 하우스 키핑 유전자, 즉 액틴, GAPDH 및 PPIA를 함유한다.
로딩 포트당 총 100㎕를 위하여 cDNA(각 로딩 포트에 대하여 160ng), 2× Taqman(상표명) 유전자 발현 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈) 및 뉴클레아제가 없는 물(USB)을 혼합함으로써, 샘플-특이적 마스터 믹스(master mix)를 각 샘플에 대하여 만들었다. 온건한 혼합 및 원심분리 후에, 이어서 혼합물을 TLDA 카드 상의 로딩 포트에 전달하였다. 어레이를 각각 1200rpm에서 1분 동안 2회 원심분리하여, 샘플을 로딩 포트로부터 각 웰로 분배하였다. 그 다음, 카드를 밀봉하고, 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT(상표명) 패스트 리얼-타임(Fast Real-time) PCR 시스템을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 열 순환기 조건은 다음과 같았다: 50℃에서 2분, 94.5℃에서 10분 및 40사이클 동안 97℃에서 30초, 59.7℃에서 1분. 1 TLDA의 것을 8개의 샘플에 대하여 준비하였다.
비교 CT 방법을 사용하여 상대 발현 값을 계산하였다. 간단하게, 이러한 기법은 식 2-ΔΔ CT를 사용하여, 조정(calibrator)으로 정규화된 표적 유전자의 발현을 계산한다. 임계치 사이클(threshold cycle, CT)은 증폭된 표적의 양이 고정된 임계치에 도달하는 사이클 수를 나타낸다. CT 값은 0 내지 40 범위이다(후자는 신호를 검출할 수 없음을 규정하는 디폴트(default) 상한 PCR 사이클 수를 나타낸다). ΔCT 값[ΔCT = CT(표적 유전자) - CT(3개의 하우스키핑 유전자의 평균)]을 HFF 대조군에 대하여 계산하고, 이후에 각 샘플에 대한 조정으로 사용하였다. 모든 유전자 발현 값을 조정에 대하여 1.00의 상대 값을 할당하였으며, 이를 ΔΔCT = ΔCT(처리군) - ΔCT(HFF 대조군)이도록, 비교 유전자 발현을 결정하기 위하여 사용한다. 상대 발현은 식 2-ΔΔ CT를 사용하여 계산한다.
성상세포, 뉴런 및 희소돌기아교세포 유전자 발현의 정량적 비교에 의해, 재프로그램화된 세포에서 차등적으로 발현되는 대부분의 유전자의 확인이 가능하게 된다. 표 1의 데이터를 상이한 분석 알고리듬(algorithm)에 의해 분석하여, 비트랜스펙션된 세포에 비해 재프로그램화된 세포에서 재생가능하게 풍부하게 관찰되는 유전자를 확인하였다. MBD2의 존재 하에서의 Msi1 또는 Ngn2로의 트랜스펙션 후에, 희소돌기아교세포 선구세포, 예컨대 Kx2.2, olig2 및 MAG의 발현 및 성상세포에 대한 2개의 마커(GFAP 및 AQP4)가 크게 증가하였다. 또한, 조기 신경 세포의 일부 마커는 HFF의 트랜스펙션 후에 증가하였다. TDLA 데이터에 의해, 인터뉴런에 대한 특이적인 마커, 예컨대 소마토스타틴 및 칼빈딘(calbindin)1의 현저한 증가가 드러났다. 발생 동안 비성숙 세포 및 아세틸콜린(ACHE) mRNA의 이동에 의해 발현되며, 신경 세포의 조기 마커인 더블코르틴(Doublecortin, DCX)의 유도는 재프로그램화된 세포에서 고도로 발현하였다(표 1). 트랜스펙션에 의해, 신생 뉴런의 조기 마커인 다이하이드로피리미디나제-유사 3(DPYSL3)의 발현이 Msi1과 함께 5배 증가하고, Ngn2와 함께 7배 증가하였다. 조기 신경 형태 및 신경 세포 부착 분자의 발생 및 유지에 필수적인 마커인 미세소관-관련 단백질 2(MAP2)의 발현은 Msi1 및 Ngn2와 함께 고도로 발현하였다(표 1). 성숙 뉴런의 마커인 에놀라제-2의 발현은 Msi1 및 Ngn2에 의해 20배 증가하였다. NeuroD 패밀리 NeuroD1의 구성원은 Msi1으로의 트랜스펙션 후에 84배, Ngn2에 의해서는 34배 더 발현하였다.
또한, 성장 인자, 예컨대 IGF-1, IGF2, NPY 및 CSF-3의 유전자 발현이 재프로그램화된 세포에서 증가하였다. VEGF 및 GDNF 유전자의 발현은 각각 Msi1 및 Ngn2에 의해 거의 5배 및 7배 상향 조절되었다. 그러나, BDNF, EGF 및 bFGF의 발현은 활성화되지 않았으며, 심지어는 비트랜스펙션된 세포에 비해 하향-조절되었다. 신경 발생 및 안내에 연루되는 네트린의 발현 및 뉴런의 성장- 및 재생-관련 마커인 성장 관련 단백질(GAP-43)의 발현은 재프로그램화된 세포에서 매우 풍부하였다. 성장 및 향신경성 인자에 대한 수용체, 예컨대 III형 수용체 티로신 키나제, 향신경성 티로신 키나제 및 향신경성 티로신 키나제 수용체의 발현이 증가하였다. 섬유아세포에 대한 마커인 비멘티 및 피브로넥틴은 비트랜스펙션된 대조군 섬유아세포 배양물에 비해 재프로그램화된 세포에서 하향-조절되었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
면역조직화학 분석
세포를 4% 포름알데하이드/PBS 용액으로, 실온에서 10분 동안 고정시키고, 이어서, 4% 포름알데하이드/PBS 중의 0.1% 트리톤(Triton) X-100(상표명)으로 5분 동안 투과화시켰다. PBS로의 2회의 간단한 세정 후에, 비특이적인 항체 결합을 PBS 중의 5% 정상 염소 혈청과의 30분 인큐베이션에 의하여 블로킹하였다. 그 다음, 일차 항체를 다음과 같이, 5% 정상 염소 혈청/PBS에 첨가하였다: 신경 줄기 세포에 존재하는 중간 미세섬유로서의 마우스 항-네스틴(1:100, BD) 및 신경 부착 세포로서의 마우스 항-NCAM(1:100, 뉴로믹스(Neuromics)). 2시간의 인큐베이션 후에, 세포를 5분 동안 각각 0.1% Tween(상표명)/PBS로 4회 세정하였다. 적절한 형광-태깅된(tagged) 2차 항체를 시각화에 사용하였으며; 5% 정상 염소 혈청/PBS로 제조한 염소 항-마우스 546(1:200, 인비트로젠)을 사용하였다. 1시간 동안의 인큐베이션 후에, 세포를 0.1% Tween(상표명)/PBS로 각각 5분 동안 3회 세정하였다. DNA 스테인(stain) 훽스트 3342(인비트로젠)를 핵의 마커로 사용하였다(PBS 중에 1:5000 희석, 10분 인큐베이션). 형광 이미지를 셀로믹스(상표명) 어레이스캔 HCS 리더(Reader) 현미경 시스템을 사용하여 취하였다. 신경 및 신경교세포 표현형을 채용한 세포의 백분율의 추정치를 결정하기 위하여, 랜덤 필드(random field)를 선택하고, 각 필드에 대하여, 총 세포의 수(훽스트 염색된 핵을 계수함으로써 결정) 및 신경 또는 신경교세포에 대하여 양성인 총 세포의 수를 결정하였다.
이들 세포가 신경 계통의 마커를 나타내는지를 확인하기 위하여, 세포를 네스틴 및 NCAM에 대하여 면역염색시켰다. 이러한 분석에 의해, 재프로그램화된 세포가 두 단백질 모두를 발현하는 것으로 드러났다. 도 2에 나타낸 바와 같이, NCAM은 트랜스펙션 후 6일 동안에 세포에 존재하였고, 분화 후 12일 및 20일에 증가하였으나, 반대의 패턴이 네스틴 염색에 대하여 관찰되었다.
이러한 연구는 DNA 탈메틸화제의 존재 하에서 신경 전사 인자를 사용하여, HFF 세포를 신경 줄기 세포 및 신경 세포에 특이적인 신경 유전자 및 단백질을 발현하는 세포를 향해 재프로그램화하는 능력을 보여주었다. 이들 재프로그램화된 세포는 적어도 2주 동안 배양에서 안정적이었다.
실시예 II
3개의 상이한 신경 유전자의 재프로그램화 효율의 비교
HFF 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하고, CDM I 배지에 플레이팅하였다. 세포를 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)(상표명) 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. HFF를 TrypLE(상표명)(지브코(Gibco))로 수집하고, CDM 배지에 재현탁화시키고, 90xg에서 10분 동안 원심분리하였다(1×106개 세포/튜브). 상층액을 폐기하고, 100㎕의 염기성 뉴클레오펙터(상표명) 용액(일차 포유동물 섬유아세포를 위한 염기성 뉴클레오펙터(상표명) 키트, 론자)에 온건하게 재현탁화시켰다. 각 100㎕의 세포 현탁액을 상이한 믹스(mix)의 플라스미드 DNA와 배합하였다(예를 들어, 샘플 1을 2㎍의 pCMV6-XL5-Pax6 및 2㎍의 pCMV6-XL5-MBD2와 혼합하였다). 세포 현탁액을 아막사 보증된 큐벳(cuvette)으로 옮기고, 적절한 프로그램(U023)으로 트랜스펙션시켰다. 샘플을 임의의 추가의 재현탁화 없이 LAS-라이신/알라닌(브레인비츠(상표명) 50㎍/㎖)과 함께 배양 플레이트 내로 옮기고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이들 단계를 트랜스펙션시킨 각 샘플에 대하여 반복하였다. 24시간 후에, 배지를 증식 배지로 교환하였다. 2일 후에, 세포를 실시예 I에 기재된 바와 같은 리포펙타민을 사용하여 다시 트랜스펙션시키고, 37℃ 5% CO2 및 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 수일에 걸쳐 점차 증식 배지를 대체한 분화 배지로 분화를 유도하였다. 세포를 RT-PCR 및 면역조직화학 분석을 위해 14일에 수집하였다.
유전자 발현 분석
RNA 분리 및 정량화를 이전에 실시예 I에 기재된 바와 같이 수행하였다. cDNA를 2ng/㎕의 최종 cNDA 농도를 사용하여, 제조처의 지시에 따라 고성능 cDNA RT 키트(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 수행하였다. 그 다음, 리얼-타임 PCR을 FAST PCR 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈) 및 하기에 기재된 Taqman(상표명)(등록 상표) 유전자 발현 검정법(어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 각 대상 유전자에 대하여 수행하였다:
Figure pct00017
패스트(FAST) 96-웰 반응을 10㎕ 반응물 중에 웰당 8ng의 cDNA와 함께 40 사이클로 수행하였다. 열 순환기 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 20초 및 40 사이클 동안의 95℃에서 1초, 60℃에서 20초.
2개의 하우스키핑 유전자(GAPDH 및 PPIA)의 평균을 3개의 파우스키핑 유전자의 평균 대신에 정규화를 위해 사용한 점을 제외하고는, 상대 발현 값을 실시예 I에서 이전에 계산된 바와 같이 계산하였다. 신경 계통 유전자의 확인을 Msi1, Ngn2 및 Pax6을 함유하는 3개의 독립적인 벡터로의 트랜스펙션 후에 연구하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 트랜스펙션 14일 후에, 신경 계통의 mRNA의 상대 발현은 비트랜스펙션된 세포(HFF)에서 검출가능하지 않았으나, MBD2의 존재 하에 Msi1 또는 Ngn2로 트랜스펙션된 세포는 신경 줄기 세포 마커(네스틴 및 Sox2)를 발현하였으나, Sox2의 발현은 Ngn2 또는 Msi1으로의 트랜스펙션 후에 네스틴 보다 훨씬 더 많이 발현하였다. 신경 및 성상세포 특이적 유전자(βIII-튜불린, MAP2b, GFAP 및 ACHE)도 또한 증가하였다. 3능-관련 유전자 βIII-튜불린, MAP2b, 아세틸콜린 및 GFAP의 mRNA 수준은 Pax6 트랜스펙션된 세포에서 검출가능하지 않았으며, 이는 단독의 Pax6이 신경 계통을 향한 재프로그램화 과정에서 연루되지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00018
면역조직화학 분석
형광 면역조직화학 염색을 이전에 실시예 I에 기재된 바와 같이 수행하였다. RT-PCR 데이터와 일치하게, 이들 배양물의 면역조직화학 분석에 의해, 재프로그램화된 세포(Msi1 또는 Ngn2 사용)는 MAP2b에 대해 양성이었던 형태학적으로 복잡한 뉴런을 생성하였음이 드러났으며, 이는 NSLC의 신경-유사 세포(NLC)로의 분화를 나타낸다(도 3). 그러나, 이들 마커에 대한 양성의 염색은 Pax6/MBD2로의 트랜스펙션 후에 검출불가능하였다. 더욱이, 새로 형성된 뉴런은 그에 대한 마커를 발현하였으며, 그들의 말단에 성장 원뿔이 있는 긴 신경돌기를 발생하였으며, 신경 특이적 유전자를 발현하였으며, 이들을 분화 조건에 노출시켰을 때 증식이 중단되었다.
실시예 III
다양한 벡터의 조합에 의한 HFF 의 트랜스펙션 및 세포의 세포골격의 파괴
후생적 변형을 위한 신경 조절제 및 사이토카인의 다양한 조합을 시험하여, 재프로그램화 효능에서의 그들의 효과를 알아냈다. 트랜스펙션 1일 전에 시작하여, 배지 교환 동안 5일에 걸쳐 매일 농도를 감소시키면서(1일에 10㎍/㎖의 사이토칼라신 B로 시작하여, 이후 4일에 걸쳐 7.5㎍/㎖, 5㎍/㎖, 2.5㎍/㎖ 및 0㎍/㎖), 세포를 사이토칼라신 B(칼바이오켐)와 함께 또는 이것 없이 처리하여, 재프로그램화 과정에서 세포의 세포골격 파괴의 효과를 조사하였다. 세포를 실시예 II에 기재된 바와 같이 뉴클레오펙션에 의해 하나의 신경 전사 인자를 함유하는 1개 또는 2개의 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 2개의 DNA 탈메틸화제, MBD2 또는 GAdd45B 중 어느 하나로 공동-트랜스펙션시켰다(예를 들어, 2×106개의 세포를 pCMV6-XL5Msi1(2㎍) 및 pCMV6-XL5-MBD2(2㎍)로 트랜스펙션시켰다). 24시간 후에, 배지를 DMEM/F12(1:1), 글루코스(0.6%), 중탄산나트륨(0.1%), 글루타민(20mM), HEPES(5mM), 인슐린(230㎍/㎖), 트랜스페린(100㎍/㎖), 프로게스테론(200nM), 푸트레신(90㎍/㎖) 및 아셀렌산나트륨(300nM)으로 이루어지고, Noggin(20ng/㎖, 페프로테크), 재조합 hFGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 재조합 hEGF(20ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 신경 증식 배지(뉴로컬트(NeuroCult)(상표명) 증식 키트, 스템셀 테크놀로지즈)로 교환하고, 세포를 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 2주 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 신경 줄기 세포 마커에 대하여 분석하였다.
유전자 발현 분석
유전자 발현 분석을 실시예 I에 이전에 기재된 바와 같이, RT-PCR에 의해 신경 줄기-특이적 마커(Sox2, 네스틴, GFAP) 및 섬유아세포-특이적 마커(Col5A2)에 대하여 수행하였다. RT-PCR 분석에 의해, Sox2, 네스틴 및 GFAP의 상대 발현이 세포를 신경 전사 인자로 트랜스펙션시킨 후에 증가되었음이 나타났다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 세포를 Gadd45b의 존재 하에서 하나의 전사 인자 Msi1로 트랜스펙션시키는 것은 Sox2(22.3±5.26) 및 GFAP(10.14±0.15)의 상대 발현의 상향-조절과 관련이 있었으며, 이들 유전자의 발현은 세포를 Ngn2로 트랜스펙션시킨 경우 각각 20배 및 10배로 매우 증가하였다. 2개의 신경 인자(Msi1 및 Ngn2)와 Gadd45b의 조합에 의하여, Sox2 및 GFAP의 발현이 추가로 증가되었다. 세포를 MBD2의 존재 하에서 하나의 전사 인자(Msi1 또는 Ngn2)로 트랜스펙션시키는 것은 Sox2, 네스틴 및 GFAP의 상대 발현의 상향-조절 및 Col5A2의 하향-조절과 관련이 있었으나, Gadd45b로의 공동-트랜스펙션에 의해, 네스틴의 발현이 증가되지 않았고, Col5A2의 발현이 조절되지 않았다. 세포를 MBD2와 병용하여 2개의 신경 유전자로 트랜스펙션시키는 경우, 신경 줄기 세포 상대 발현의 증가가 관찰되었으며; 특정 조건 하에 사이토칼라신 B의 존재 하의 발현의 적은 증가가 나타났다. 신경 줄기-특이적 마커(Sox2, 네스틴, GFAP)의 상대 발현의 증가 및 섬유아세포-특이적 유전자(COL5A2)의 감소는 Msi1/Ngn2/MBD2, Msi1/Ngn2/Gadd45b, Msi1/MBD2 또는 Ngn2/MBD2로의 트랜스펙션 후에 관찰되었다(표 3). 이러한 연구는 MBD2가 GDA45b보다 더 재프로그램화 효능을 증가시켰음을 보여주었으며, 사이토칼라신 B가 대조군 배양에서 그들 자체의 효과를 갖지 않았음을 보여주었다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
면역조직화학 분석
형광 면역조직화학 염색을 이전에 실시예 I에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표 4는 각 조건에서의 네스틴 및 Sox2의 백분율을 보여주며, 세포를 DNA 탈메틸화제 및 사이토칼라신 B의 존재 하에서, 두 신경 전사 인자 모두와 동시에 트랜스펙션시킨 후에, 가장 높은 Sox2(38.18±1.75%) 및 네스틴(28.18±2.77%) 양성 세포의 백분율이 관찰되었다. Sox2 양성 세포(10.42±10.27%) 및 네스틴 양성 세포(4.85±1.10%)의 약간의 증가가 하나의 전사 인자 Msi1 및 MBD2로의 트랜스펙션 후에 검출되었다. 네스틴 및 Sox2 양성 세포의 동일한 경향이 Ngn2 및 MBD2로의 트랜스펙션 후에 관찰되었다. 세포의 세포골격의 사이토칼라신 B로의 파괴는 재프로그램화를 상당히 증가시켰으나, 그들 자체는 재프로그램화 효과를 갖지 않았다(표 4).
Figure pct00023
또한, 다양한 DNA 탈메틸화제를 재프로그램화 효능에서의 그들의 효과에 대하여 시험하였다. 세포를 다양한 DNA 탈메틸화제와 함께 2개의 신경 pCMV6-Msi1-Ngn2 인자를 함유하는 하나의 벡터(MSI1/NGN2)로 공동-트랜스펙션시켰다. 동시에, 다른 신경 인자를 실시예 II에서 이전에 기재된 바와 같이 MBD2의 존재 하에서 pCMV-Msi1-Ngn2, pCMV-XL5-Msi1 또는 pCMV-XL4-Ngn2와 병용하여 또는 따로 pCMV-XL-네스틴을 사용하여 NSC를 향한 세포 탈분화에서의 그의 효과에 대하여 시험하였다.
세포를 상이한 탈메틸화제(MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2, AICDA)와 함께 pCMV-Msi1-Ngn2로 공동-트랜스펙션시켰다. 다른 검정법을 수행하여, 재프로그램화 효능에서의 네스틴의 효과를 평가하고; 이에 따라, 세포를 MBD2의 존재 하에서 하나의 신경 인자(Msi1 또는 Ngn2) 또는 둘 모두의 신경 인자를 함유하는 하나의 벡터와 병용하여, 또는 따로 네스틴으로 트랜스펙신시켰다. 세포를 트랜스펙션 후에 VPA(1mM)와 함께, 또는 이것 없이, EGF(20ng/㎖), FGF(20ng/㎖) 및 Noggin(20ng/㎖)이 보충된 증식 배지의 존재 하에서 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 12일 동안 배양하였다.
실시예 II에 기재된 바와 같이, 유전자 발현 분석 및 면역조직화학을 수행하여, 신경 특이적 유전자 및 단백질 발현(βIII-튜불린, GFAP, Sox2, 네스틴)을 분석하였다. 세포를 다양한 DNA 탈메틸화제의 존재 하에서 Msi1 및 Ngn2로 트랜스펙션시킴에 의해, 표 5에 나타낸 바와 같이, 이 연구에서 사용되는 다양한 DNA 탈메틸화제 중에 특히 MBD2가 신경 줄기 유전자(Sox2, GFAP, 네스틴)의 발현을 증가시킴을 보여주는 이전의 데이터를 나타내고, 확인하였다. 더욱이, 세포를 하나의 신경 인자의 존재와 함께 또는 이것 없이 네스틴으로 트랜스펙션시키는 것은 신경 줄기-유사 세포로의 재프로그램화 효능에서 효과를 갖지 않았다. 그러나, 네스틴 및 Msi1/Ngn2/MBD2로의 공동-트랜스펙션에 의해 신경 줄기 세포의 발현이 증가되었으며, 이러한 증가는 VPA의 존재 하에서 더 나타났다.
Figure pct00024
Figure pct00025
RT-PCR 데이터와 더불어 수행한 면역조직화학 분석에 의해, 세포를 MBD1, MBD3, MBD4, MeCP1 또는 AICADA의 존재 하에서 Msi1/Ngn2로 트랜스펙션시키는 경우, 양성 Sox2 세포가 검출가능하지 않았으며(표 6), 상기 신경 유전자를 사용하는 경우, 시험된 상이한 유형의 DNA 탈메틸화제 중에, 오직 MBD2 만이 HFF의 NSLC를 향한 재프로그램화 효능에 상당한 긍정적인 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 면역조직화학 분석에 의해, 세포를 MBD2의 존재 하에서 네스틴 및 Msi1/Ngn2로 공동-트랜스펙션시킨 후에, 면역양성 Sox2 세포(89.49±3.18)의 적은 증가가 나타났다(표 6).
Figure pct00026
다른 연구를 설계하여, 신경 줄기-유사 세포를 향한 재프로그램화 효능에서의 다양한 신경 유전자의 효과를 시험하였다. HFF 세포를 실시예 I에 기재된 바와같이 배양하고, 미처리 HFF 대조군 및 비트랜스펙션된 HFF 대조군(세포 상의 완전 배지 및 화합물 처리의 효과를 결정하기 위한)을 제외하고, 실시예 IV에 기재된 절차에 따라, 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. VPA 및 5-Aza로 사전 처리한 세포 및 미처리 세포를 표 7에 기재된 바와 같은 DNA의 믹스로 트랜스펙션시켰다. 세포를 라미닌-코팅된 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배지를 표 7에 따라 매일 교환하였다. 세포를 면역조직화학 분석에 의해 3일, 7일, 12일에 분석하고, 9일에는 유전자 어레이에 의해 다능 및 만능 유전자 발현에 대해 분석하였다.
유전자 어레이 분석
표 7에서 0a 및 1a에 따라 처리한 추가의 배치(batch)의 세포를 다능 유전자 어레이(ABI)(표 8a 및 b) 및 일련의 유전자(표 8c)에 의해 HFF, hNPC 및 계대 5 NSLC(실시예 III으로부터의 이전의 실험으로부터 동결)와 함께 9일에 분석하여, HFF(이들이 생성된 HFF) 및 정상 인간 신경선구세포(hNPC)에 비한 계대 1 및 계대 5 NSLC에서 선택된 다능성, 외배엽, 내배엽, 중배엽 및 신경 계통 유전자의 유전자 발현 프로파일을 결정하였다. 표 8의 결과는 신경 줄기 세포(유의미하게 발현되는 만능성 마커 및 중내배엽 마커의 일부가 또한 신경 줄기 세포에서 발현됨) 및 신경 계통이 HFF에 비해 NSLC에서 유의미하게 발현한 것을 나타내며, 발현 패턴은 hNPC와 다소 상이하였으며, 이는 NSLC가 시험한 hNPC와 유사하나 동일하지 않음을 나타낸다. 계대 5 NSLC는 계대 1 NSLC보다 더 높은 줄기세포성 유전자의 발현을 가졌다. hNPC는 NSLC보다 더 높은 신경 수임된 유전자의 발현을 가졌으며, 이는 NSLC의 더 큰 줄기세포성 상태에 대한 이들의 신경선구세포 상태를 나타내었다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
실험의 다른 파트에서, Msi1/Ngn2 + pCMV6-XL5-MBD2로 트랜스펙션시킨 다른 배치의 세포를 5개의 상이한 웰에 CDM II 배지에서 폴리-오르니틴(실온에서 30분) 및 라미닌(실온에서 1시간) 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 1일에, 웰 중 2개 내의 배지를 12일까지 조건 1a(표 7)와 동일한 배지로 바꿨다. 배지를 12일까지 매일 교환하고, 12일에 이를 양자 모두 BDNF(20ng/㎖), NT-3(20ng/㎖), NGF(20ng/㎖), 레티노산(5μM), Noggin(20ng/㎖) 및 포르스콜린(10μM)이 보충된 NS-A 분화 배지(스템셀 테크놀로지즈) 또는 NbActive4(브레인비츠(상표명)) 배지 중 어느 하나로 바꾸었다. 이들 세포는 7일까지 전형적인 신경 줄기-유사 세포 형태를 보여주었으며, 12일까지 증식하였다. 2가지 분화 배지 중 어느 하나에 대한 노출 동안에, 이들 NSLC는 브라이트 필드 사진(도 21)으로 나타낸 바와 같이 더 신경 및 신경교세포인 표현형으로 변화하였으나, 17일까지는 오직 GFAP 만을 발현하였다(도 22).
다른 3개의 웰에 대하여, 1일에 배지를 NS-A 분화 배지(스템셀 테크놀로지즈), NbActive4(브레인비츠) 또는 CDM II 배지 중 어느 하나로 바꾸고; 이들 처음 2개에는 이전에 기재된 바와 동일한 사이토카인이 보충되고, Fgf-2(20ng/㎖)의 첨가가 있었다. 12일에, Fgf-2를 처음 2개의 분화 배지로부터 제거하는 한편, CDM II 배지 중의 세포를 Fgf-2 없이 사이토카인이 보충된 NS-A 분화 배지(스템셀 테크놀로지즈)로 교체하였다. 12일 내지 17일에, 배지를 2일 내지 3일 마다 교환하였다. 처음 배양 12일 동안에, 모든 3가지 배지 중의 세포를 비트랜스펙션된 섬유아세포에 비해 더욱 스핀들(spindle) 형상인 세포의 혼합물로 발생시키고, 일부를 NSLC 형태를 갖는 세포로 발생시키고; Fgf-2 세포 형태의 제거 시에, 더욱 뛰어난 신경 형상뿐 아니라 17일까지 GFAP 및 βIII-튜불린을 발현하는(도 22) 브라이트 필드 사진(도 21)에 나타낸 바와 같은 세포 사이에 확립된 네트워크를 갖는 신경교 세포로 변화하였다.
추가의 연구를 설계하여, 재프로그램화된 세포에서 이들의 내인성 단백질 수준에서의 Msi1, Ngn2 및 MBD2의 효과를 평가하였다. 세포를 이전에 기재된 바와 같이, MSI1/NGN2 벡터 및 MBD2로 트랜스펙션시키고, 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 증식 배지에서 배양하였다. 샘플을 2일 내지 10일의 다양한 시점에 수집하고, RT-PCR로 분석하여, 상이한 시점에 신경 줄기 세포 및 신경 유전자의 발현 및 내인성 유전자의 발현을 조사하였다. RT-PCR에 의해, 2일 내지 10일에 총 Msi1, Ngn2 및 MBD2 유전자 발현의 점진적인 소실이 드러났으며, 대조군에 비한 MBD2 발현의 증가는 5일에는 거의 완전히 소실되었다. 이러한 감소는 5일에 내인성 Msi1 및 Ngn2의 유의미한 활성화와 관련이 있었으며, 9일에 내인성 유전자 발현에는 다른 급상승이 있었다(표 9). Sox2 발현에서의 유의미한 증가가 4일에 검출되었으며, 이러한 외배엽/신경 줄기 세포/신경 유전자의 발현은 이후의 각 시점에 계속 증가하였다(표 10). GFAP(신경 줄기 세포 및 성상세포 마커)는 이미 2일부터 상당히 증가되었으나, 5일에 상당히 증가되었고, 7일 분석 시점에는 유전자 발현의 큰 급상승이 있었으며, 연구 기간의 나머지 동안 이러한 발현 수준으로 유지되었다. 또한, 신경 줄기 세포 마커 네스틴의 발현은 5일부터 천천히 증가하기 시작하였다. 신경 유전자 βIII-튜불린(TUBB3) 및 Map2b의 발현이 이미 2일부터 천천히 상승하였으나, 5일부터 유의미하게 증가하였다. 또한, 아세틸콜린 수용체에 대한 마커(뉴런에서 관찰됨), 아세틸콜린 에스테라제(ACHE)의 발현이 2일부터 약간 증가하였으나, 7일까지는 유의미하게 증가하지 않았다. 분석하였던 신경 줄기 세포 마커 중에 특히, Sox2의 상대 발현이 고도로 그리고 조기에 발현되었으며, 이는 이어서 네스틴, GFAP 및 내인성 Msi1 및 Ngn2, 및 재프로그램화 및 세포 운명 변화를 촉진시키는 다른 유전자의 활성화뿐 아니라 βIII-튜불린(TUBB3), Map2b 및 ACHE와 같은 신경 유전자의 활성화에서, 직접적으로 또는 간접적으로 외인성 Msi/Ngn2 및/또는 다른 유전자와 상호작용할 수 있음을 알아야 한다.
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
실시예 IV
부착 및 부유 조건에서 HFF 의 NSLC 로의 재프로그램화에서의 뉴클레오펙터 (상표명)(등록 상표) II 디바이스와 뉴클레오펙터 (상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스의 비교
HFF 세포를 실시예 I에 기재된 바와 같이 배양하고, 실시예 II에 이전에 기재된 바와 같이 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 디바이스(론자) 또는 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. HFF를 TrypLE(상표명)(지브코)로 수집하고, 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 디바이스를 사용한 트랜스펙션당 1×106개 세포를 90g에서 10분 동안 수집하고, 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스를 사용한 트랜스펙션당 6×105개 세포를 80xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 세포 펠렛을 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II에 대한 100㎕의 염기성 뉴클레오펙터 용액 또는 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표)에 대한 20㎕의 SE 용액(세포주 키트 SE, 론자) 중 어느 하나에 온건하게 재현탁화시켰다. 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 디바이스에 대하여, 각각 100㎕의 세포 현탁액을 2가지 상이한 플라스미드 DNA 믹스와 배합하였다(샘플 1을 2㎍의 pCMV6-XL5-Msi1 및 2㎍의 pCMV6-XL5-MBD2와 혼합하고, 샘플 2를 2㎍의 Msi1/Ngn2 및 2㎍의 pCMV6-XL5-MBD2와 혼합하였다). 각 세포 현탁액을 아막사 보증된 큐벳으로 옮기고, 적절한 프로그램(U-023)으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 직후에, 900㎕의 따뜻한 CDM1 배지를 각 큐벳에 첨가하고, 샘플을 ㎠당 1×105 내지 1.5×105개 세포의 세포 밀도로, 라미닌(스템젠트, 10㎍/㎖)이 코팅된 배양 플레이트로, 또는 뉴로스피어 형성을 위하여 비-세포 배양 처리된 페트리 디쉬로 전달하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그러나, 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스에 대해서는, 전술한 단계가 유사하였으나, 하기의 제외 사항이 있었다: 세포 현탁액을 동일한 2개의 DNA 믹스의 각각의 0.6㎍의 DNA와 혼합하고, 세포 현탁액을 96-웰 뉴클레오플레이트(상표명)(론자)의 웰로 전달하고, 프로그램 FF-130(상표명)으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 80㎕의 따뜻한 CDM1 배지를 각 웰에 첨가하고, 이전에 언급된 바와 같은 동일한 세포 밀도로 라미닌 코팅된 플레이트 또는 비-세포 배양 처리된 페트리 디쉬에 옮기기 전에, 샘플을 인큐베이터에 10분 동안 놔두었다. 두 디바이스에 대하여, 이들 단계를 트랜스펙션시킨 각 샘플에 대하여 반복하였다. 트랜스펙션 전에, 세포를 실시예 I에 기재된 바와 같이 CDM1에서 배양하였다. 24시간 후에, 배지를 EGF(20ng/㎖), FGF-2(20ng/㎖), Noggin(20ng/㎖) 및 사이토칼라신 B(10㎍/㎖)가 보충된 75% CDM 배지 및 25% 증식 배지의 믹스로 교체하고, 세포를 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 배지를 매일 교환하면서, 4일까지 신경 증식 배지의 비율을 100%까지 증가시키고, 사이토칼라신 B의 비율을 감소시켜, 5일까지 완전히 빠지게 하였다. 포르스콜린(10μM)을 4일부터 배지에 첨가하였다. 부유 조건에서 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 이들의 배지를 부착 조건에 대해 기재된 바와 같이 매일 교환하였다. 세포를 면역조직화학 분석을 위해 3일, 7일 및 12일에 수집하였다.
형광 이미지를 셀로믹스(상표명) 어레이스캔 HCS 리더 현미경 시스템을 사용하여 취하여, 신경 줄기 세포 마커인 Sox2에 대하여 양성인 세포의 백분율의 추정치를 결정하였다. 이러한 분석에 의해, 비트랜스펙션된 대조군 및 트랜스펙션 3일 후에, 핵 Sox2 염색이 검출가능하지 않았다. 그러나, 7일 및 12일에는 Sox2 양성 세포의 백분율이 pCMV6-XL5-무사시 및 pCMV6-XL5-MBD2 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 조건을 제외한 모든 트랜스펙션 조건 하에서 점차 증가하였다. 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스로 트랜스펙션시킨 Msi1/Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2와 함께, 12일에 가장 높은 백분율이 수득되었다(약 80%). 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II로 트랜스펙션시킨 동일한 조합으로는 오직 약 35%의 양성 세포를 얻었다. 셔틀(등록 상표)을 사용한 pCMV6-XL5-무사시 및 pCMV6-XL5-MBD2는 약 20%의 양성 세포를 생성하는 한편, 일반적으로 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II로는 아무것도 관찰되지 않았다. 양성 세포의 백분율은 세포 간에 매우 달랐다. 염색에 의해, 세포 집단이 균질하지 않은 것으로 나타났는데, 이는 고밀도로 배열된 Sox2 양성 세포의 필드 및 오직 음성 세포만을 갖는 완전한 필드가 모든 경우에 관찰될 수 있었기 때문이다. 일반적으로, 초기에는 셔틀(등록 상표)이 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 보다 세포에 더 독성이었으나, 적어도 Msi1/Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2 셔틀의 경우에는, 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II에 비해 Sox2 양성 집단이 7일 내지 12일에 2배 만큼 많은 Sox2 양성 세포로 빠르게 증식하였다. 부유 조건에서의 세포는 임의의 조건에서 12일 실험 기간 동안 구형을 형성하지 않았으며, 이는 뉴로스피어의 형성이 먼저, 또는 더 많은 시간에 부착 조건에서 신경 줄기-유사 세포의 형성을 필요로 함을 시사한다.
표 11은 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 디바이스와 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스 둘 모두를 사용하여 전형적인 신경 줄기 세포 형태가 있는 Sox2 양성 세포의 백분율을 보여준다. 후자는 더 적은 출발 물질이 필요한 이점이 있으며(더 적은 세포와 더 적은 DNA가 필요함), 또한, 더 많은 수의 Sox2 양성 세포로 이어진다. 더욱이 매우 적은 Sox2 양성 세포의 집단은 DNA 탈메틸화제 MBD2의 존재 하에서 오직 하나의 신경 전사 인자(Msi)로의 트랜스펙션 시에만 셔틀(등록 상표) 디바이스로 관찰되었다.
Figure pct00042
실시예 V
뉴로스피어 형성 검정법 및 세포 분화 분석
더 큰 비율의 재프로그램화가 2개의 신경 유전자를 트랜스펙션시킴으로써 달성되는 것을 보여주는 이전의 연구에 기초하여, 본 연구를 설계하여, 2개의 신경 전사 인자(Msi1 및 Ngn2)를 함유하는 벡터 Msi1/Ngn2를 사용함으로써, 재프로그램화 세포의 수를 평가하고, 재프로그램화 방법에서 DNA 탈메틸화제 또는 DNA 메틸화 억제제(5-아자시티딘) 및 히스톤 탈아세틸화 억제제(VPA)의 역할을 평가하였다.
HFF를 배양하고, 실시예 III에 기재된 바와 같이 사이토칼라신 B로 처리하고, 동시에 VPA(1mM) 및 5-아자시티딘(0.5μM)으로 처리하였다. 처리 2일 후에, 세포를 실시예 II에 기재된 바와 같이 작제된 벡터 Msi1/Ngn2로 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션시켰다. 세포를 준비한 후에, 적절한 프로그램(U023)을 사용하여 이들을 2㎍의 총 DNA(Msi1/Ngn2)와 혼합하고, 화학적 억제제(VPA 및 5-Aza)로 처리하지 않은 세포를 MBD2(2㎍)로 공동-트랜스펙션시켰다. 샘플을 라미닌(10㎍/㎖, 시그마)으로 코팅된 배양 플레이트로 옮기고, 가습 37℃/5% O2/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 배지를 Noggin(20ng/㎖, 페프로테크), 재조합 hFGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 재조합 hEGF(20ng/㎖, 페프로테크)의 존재 하에서, 증식 기본 배지, 신경 증식 배지(뉴로컬트(상표명) 증식 키트, 스템셀 테크놀로지즈)로 교환하였다. 트랜스펙션 6일 후에, 세포를 아큐타제(상표명)(밀리포어)를 사용하여 수집하고, 원심분리하고(300xg, 5분, 실온), 뉴로컬트(상표명) 증식 배지에서 비코팅된 세포 배양 디쉬에 플레이팅하여, 뉴로스피어로서 현탁액에서 세포를 성장시키는 능력을 조사하고, 부착 배양에 대해서는 라미닌 코팅된 플레이트 상에서 행하였다. 배지 교환 동안 부유하는 구체의 소실을 방지하기 위하여, 세포를 실온(RT)에서 150 xg에서의 원심분리에 의해 3분 동안 침강시켰다. 그 다음, 펠렛을 새로운 배지에 재현탁화시키고, 새로운 비코팅된 저-결합 세포 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 배양물을 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 인큐베이션시키고, 적어도 2개월 동안 매일 공급하였다.
인간 신경 전구세포(hNPC) 및 인간 NSLC로부터의 단일의 세포가 뉴로스피어를 생성할 수 있었는지를 조사하기 위하여(세포가 신경 줄기 세포임을 입증하는 표준 시험), 뉴로스피어를 단일의 세포로 해리시키고, 이들 단일의 세포를 분리하고, 증식 배지에서 현탁액에 배양하고, 뉴로스피어 형성을 광학 현미경(니콘(Nikon), 10×)을 사용하고 셀로믹스(상표명)에 의해 브라이트 필드 이미지를 취함으로써, 모니터링하였다. 이들 세포는 6일 내지 10일에 시작하여 구체로서 증식하고 성장하기 시작하였다(도 4A). 20일의 이들 구체의 면역조직화학 분석에 의해(표 12 및 도 4), 신경 줄기 세포 마커 Sox2, 무사시, CD133, 네스틴 및 GFAP에 대한 면역양성 염색이 나타났다. 또한, 세포는 βIII-튜불린(뉴런에 대한 마커), O4(희소돌기아교세포에 대한 마커) 및 GFAP(성상세포에 대한 마커)에 대하여 양성으로 염색되었으며, 이는 두 세트의 세포(NSLC 및 hNPC)의 3-능 분화능을 나타내며, NGFrec 및 NeuN(분화된 뉴런에 대한 마커)에 대한 음성은 세포가 분화 종결되지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00043
HFF 세포를 실시예 I에 기재된 바와 같이 배양하고, 실시예 II에 기재된 바와 같이 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. 세포를 MBD2와 함께 pCMV6-XL5-Msi/pCMV6-XL4-Ngn2, pCMV-Msi1-Ngn2로 공동-트랜스펙션시키거나, VPA/5aza로 사전 처리하였다. 세포를 현탁액 또는 부착 배양으로서 증식 배지에서 배양하였다. 8개의 샘플에서의 유전자 발현 분석을 4개의 주요 카테고리 내의 48개 유전자(3가지 하우스키핑 유전자 포함: 액틴, GAPDH 및 PPIA)의 발현을 프로파일링하는 맞춤화된 신경 마커 2 TLDA(표 13)를 사용하여, 실시예 I에서 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다; 1) 섬유아세포 특이적 유전자; 2) 신경 계통 특이적 유전자; 3) 신경 줄기 세포 마커 특이적 유전자; 및 4) 성장 인자 및 그들의 수용체에 대한 유전자.
Figure pct00044
Figure pct00045
표 14에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포-특이적 유전자(Col3A1, Lox, S100A4)는 재프로그램화된 세포에서 하향 조절되었으며, 이는 트랜스펙션 후의 섬유아세포-특이적 유전자의 소실을 나타낸다(모든 세포가 트랜스펙션 및 재프로그램화되지 않아, 배양물 내의 섬유아세포-특이적 유전자 발현의 존재는 대부분 배양물 중에 남겨져 있는 비프로그램화된 섬유아세포로부터 기인하는 것을 주의한다). 이들 유전자의 발현은 HFF를 DNA 탈메틸화제 또는 DNA 메틸화 억제제의 부재 하에서 트랜스펙션시킨 경우, 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 섬유아세포의 분화된 마커의 하향-조절이 DNA 탈메틸화를 필요로 함을 나타낸다. 외배엽 유전자, 예컨대 Msi1, Sox2 및 네스틴의 발현은 DNA 탈메틸화와 함께 트랜스펙션한 후에 현저히 증가하였다. 신경 마커, 예컨대 시냅토가민(synaptogamin)1(시냅스 소포 단백질) 및 NeuroD1의 발현은 Msi1/Ngn2/MBD2로 트랜스펙션된 세포에서 상향-조절되었으며, Msi1/Ngn2/VPA 및 5-AZA로 트랜스펙션된 세포에서 약간 증가하였다. 희소돌기아교세포의 선택된 3개의 마커를 Olig2의 강력한 증가와 함께 트랜스펙션된 세포에서 검출하였다. 성상세포에 대한 2가지 마커, GFAP 및 ALDH1L1은 트랜스펙션 후에 증가하였다. 상기 결과는 뉴로스피어가 비균질한 전구세포 하위유형으로 이루어져 있다는 생각을 지지한다.
향신경성 인자 중에 특히, CNTF의 발현은 재프로그램화된 세포에서 약간 증가하였다. GAP-43 및 신경펩티드 Y(NPY)의 발현은 대부분 주석달린(annotated) 유전자였다. GAP-43은 오랫동안 축색 가소성에서 중추적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 왔으며, 배아 발생 및 손상된 뇌 및 척수에서의 신경 재생 둘 모두에서, 신경돌기 성장 및 시냅스 형성의 재생의 마커로 사용된다. 성장 및 향신경성 인자에 대한 수용체의 발현, 예컨대 향신경성 수용체 티로신 키나제 발현을 증가시켰다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
NSLC의 부착 집단의 추가의 분석 및 정량화에 의해, 세포가 Sox2(93.43±1.9%), 네스틴(60.76±5.7%) 및 GABA(37.48±4.9)에 대하여 양성으로 염색되었으나, 이들 마커는 비트랜스펙션된 세포에서 검출가능하지 않았다(도 5, 표 15). 추가로, 이들 세포는 p75NTR(31.15±1.6), βIII-튜불린(37.55±0.6%) 및 GFAP(16.47±0.9)에 대하여 양성으로 염색되었다. 추가로, 이들 세포는 p75NTR(31.15±1.6), βIII-튜불린(37.55±0.6%) 및 GFAP(16.47±0.9)에 대하여 양성으로 염색되었다. 그러나, 비트랜스펙션된 HFF는 HFF 마커(도 5), 예컨대 피브로넥틴 및 섬유아세포 단백질 마커에 대해서만 양성으로 염색되는 한편, 이들 마커는 재프로그램화된 세포에서 검출가능하지 않았으며, 이는 재프로그램화된 세포가 원래의 세포의 마커를 소실하고, 신경 줄기 세포 및 신경 계통의 형태 및 마커를 채용함을 나타낸다.
Figure pct00049
본 연구는 또한, NSLC가 배양에서 증식하는 능력을 가지며, 안정적인 형태, 유전자 및 단백질 발현을 나타내며, 이것이 배양에 5개월에 걸쳐 있었던 전체 연구 기간 동안 유지되었음을 보여준다(표 16).
Figure pct00050
유전자 발현 마이크로어레이
마이크로어레이 발현 분석을 수행하여, 전반적인 개관을 얻어, 계대 7 NSLC의 유전자 발현 프로파일을 HFF(NSLC가 생성되었던 세포) 및 hNPC와 비교하였다. NSLC(n=3), HFF(n=2) 및 hNPC(n=3)를 RNAlater(상표명)(퀴아젠)에 재현탁화시키고, 게노타이픽스(Genotypics)(인도)로 발송하였으며, 여기서, 샘플을 처리하고, 유전자 발현 마이크로어레이를 수행하였다.
간단하게, 게노타이픽스는 샘플로부터 RNA를 추출하고, 아질런트 바이오어널라이저(상표명)를 사용하여 품질 관리를 수행하였다. 라벨링을 아질런츠 퀵 앰프(Agilent's Quick Amp)(상표명) 키트(cDNA 합성 및 시험관 내 전사)를 사용하여 행한 다음에 라벨링 QC로 이어졌다. 그 다음, 8 × 60K 어레이를 사용하여, 혼성화를 수행하고, 슈어스캔(SureScan)(상표명) 기법으로 초고속 아질런트 스캐너를 사용하여 스캐닝을 행하였다. 자동화 특징 추출을 위하여 아질런트 특징 추출 소프트웨어를 사용하고, 미가공(Raw) 데이터 QC 및 이미지 QC로 이어졌다. 그 다음, 아질런츠 진스프링(GeneSpring) GX(상표명) 및 게노타이픽스 바이오인터프레터 소프트웨어를 사용한 경로 및 유전자 분류체계 분석을 비롯한 개선된 데이터 분석을 수행하였다. NSLC 샘플을 HFF 샘플(세트 1) 및 hNPC 샘플(세트 2)과 비교하였다. NSLC 샘플은 NSLC가 생성된 HFF보다 hNPC에 훨씬 더 가까웠던 전반적 유전자 발현 패턴을 가졌다(도 23). 피어슨(Pearson) 상관 계수에 의해, NSLC가 신경 계통 마커, 재생 유전자 및 이동 유전자에 관하여, hNPC와 밀접하게 관련이 있는 것으로 드러났다. 이들 데이터에 의해, NSLC가 hNPC와 유사하나 동일하지 않음이 확인되었다. 마이크로어레이 분석에 의해, HFF 샘플에 비하여 NSLC 샘플에서 신경 전구세포 유전자의 상향-조절이 드러났다. 둘 모두 신경선구세포-특이적 염색질 리모델링 복합체(npbaf 복합체)에 속하며, 신경선구세포의 증식에 필요한 ACTL6A 및 PHF10은 각각 2.9배 및 2.3배 상향 조절되었다. 중추신경계에서 줄기 세포의 증식 및 유지에서 역할을 수행하는 MSI2는 6배 상향-조절되었다(표 X1). 신경교세포 유전자는 HFF 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 상향-조절되었다. 중추신경계의 발생 동안에 성상세포를 다른 신경교 세포와 구분짓는 신경 줄기 세포- 및 성상세포-특이적 마커인 GFAP는 HFF 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 크게 상향-조절된다(690배). 특히, 뇌에서의 희소돌기아교세포의 형성 및 성숙을 촉진시키는 OLIG1은 또한, HFF에 비해 NSLC 샘플에서, 크게 상향-조절된다(370배)(표 X2).
표 X3에는 HFF 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 상향 조절되는 재생 유전자의 서브셋이 열거된다. 조기 배아발생 및 배아 줄기 세포 만능성뿐 아니라 신경 줄기 세포에 대한 중요한 유전자인 SOX2는 HFF 샘플에 비해 NSLC 샘플에서, 크게 상향-조절된다(5000배). G1/S(시작) 전이에서 세포 주기의 조절에 필수적인 CND2도 또한, NSLC 샘플에서 상향-조절된다(HFF 샘플에 비해 70-배). 표 X4에 나타낸 바와 같이, 다양한 섬유아세포 유전자가 HFF 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 하향-조절되었다. 이는 NSLC가 다양한 섬유아세포 유전자의 발현을 소실하였음을 보여주며, 이는 이것이 HFF로부터 NSLC로 재프로그램화되기 때문이다.
표 X5는 신경 전구세포 유전자가 또한 hNPC 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 상향-조절되었음을 보여준다. 발생 동안 말초 및 중추신경계의 선택된 신경 집단의 생존 및 분화를 조장하는 BDNF는 심지어는 hNPC 샘플에서보다 NSLC 샘플에서 더 고도로 발현되었다(34배 상향-조절). 표 X6은 신경교세포 유전자의 하위세트도 또한 hNPC 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 상향-조절됨을 보여준다. 중추신경계의 발생 동안 성상세포를 다른 신경교세포로부터 구분짓는 신경 줄기 세포- 및 성상세포-특이적 마커인 GFAP는 hNPC 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 더욱 크기 발현된다(13배). 수초의 다층 구조의 형성 또는 유지에서 중요한 역할을 수행하는 중추신경계의 주요 수초 단백질인 PLP1은 또한 hNPC 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 더욱 고도로 발현된다(20배).
또한, 재생 유전자는 hNPC 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 상향 조절되었다(표 X7). 신경능성 마커이나 연골 및 뼈 형성의 성장을 특별히 유도하는 BMP2, 및 차례로 연골 및 뼈 형성을 유도하고, 중배엽 유도, 치아 발생, 사지 형성 및 골절 회복뿐 아니라 신경 줄기 세포에서 작용하는 BMP4는 둘 모두 hNPC 샘플에서보다 NSLC 샘플에서 더 고도로 발현되었다. 연장 축색의 끝을 형성하는 운동 성장 원뿔의 주요 구성성분인 GAP43은 hNPC 샘플에 비해 NSLC 샘플에서 더욱 고도로 발현되었다(4배). 이는 NSLC의 재생능을 시사한다. 생체 내 및 시험관 내에서 신경 줄기 세포뿐 아니라, 조혈 줄기 및 선구세포의 발생 및 또한 증식에 수반되어, 이를 치료 줄기 세포 증식에 대한 유력한 후보물질이게 하는 전사 인자인 HOXB4는 또한, hNPC에서보다 NSLC에서 더욱 고도로 발현하였다. 이러한 데이터는 NSLC가 hNPC보다 더욱 "줄기세포-유사"이거나 더욱 "줄기세포성"임을 나타낸다.
Figure pct00051
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Figure pct00062
신경 계통(뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포)으로의 NSLC의 분화능을 조사하기 위하여, 뉴로스피어를 해리시키고, 분화 배지에서 라미닌/폴리-D-라이신(10㎍/㎖; 시그마)에 2주 동안 플레이팅하였다. 신경 계통으로의 분화를 2가지 상이한 배지를 사용하여 수행하였다: 뇌 유래의 향신경성 인자(BDNF, 20ng/㎖, 페프로테크), 전-트랜스-레티노산(ATRA, 5μM, 스펙트럼) 및 bFGF(40ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 NbActive 배지(브레인비츠(상표명)) 또는 BDNF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 bFGF(40ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 뉴로컬트(상표명) 분화 배지(뉴로컬트(상표명) 분화 키트, 스템셀 테크놀로지즈). 배양에서 2주 후에, 세포를 신경 마커 βIII-튜불린, 성상세포 마커 GFAP 및 S100β 및 희소돌기아교세포 마커 CNPase로 염색하였다. 세포를 4% 포름알데하이드로 고정하고, 일차 항체를 다음과 같이 5% 정상 염소 혈청/PBS에 첨가하였다: 마우스 항체 βIII-튜불린(1:200, 아브캄), 토끼 항체 S100β(1:100, 아브캄) 및 닭 항체 CNPase(1:50, 아브캄). 이차 항체를 다음과 같이 5% 정상 염소 혈청/PBS에 첨가하였다: 염소 항 마우스 알렉사(Alexa)546(상표명)(1:200, 인비트로젠), 염소 항 토끼 알렉사488(상표명)(1:200, 인비트로젠) 및 염소 항-닭 cy5(1:100, 잭슨 이뮤노리서치 랩스(Jackson ImmunoResearch Labs)).
면역조직화학 분석에 의해, NbActive 배지가 신경(48.66±14.07%, βIII-튜불린) 및 가능한 조기 희소돌기아교세포 계통(50.01±4.04%, CNPase)으로 동일한 분화를 조장하며, 낮은 백분율의 성상세포(2.68±1.13%, S100β)를 조장하였으나, NS-A 분화 배지는 주로 신경(64.89±4.11%, βIII-튜불린) 및 성상세포(35.94±4.04%, S100beta)로의 분화를 유도하며, 낮은 백분율의 가능한 조기 희소돌기아교세포(8.68±2.71%, CNPase)를 유도하였음이 나타났다. NSC-A 배지를 추가의 분화 연구를 위해 NbActive에 대하여 선택하였다. NS-A 분화 배지에서의 세포의 분화는 sox2, 무사시 및 네스틴 양성 세포의 백분올의 감소에 의하여, 표 17에 나타낸 바와 같이 유사하게 hNPC 및 NSLC의 분화를 조장한다. NSLC는 신경(74.3±0.1, GABA), 성상세포 계통(65.6±0.0, S100beta)로 분화하였으며, 더 낮은 백분율의 희소돌기아교세포(5.2±0.6, CNPase)로 분화하였다. 3능 계통 분화의 통일한 패턴이 hNPC에서 관찰되었다(표 17).
Figure pct00063
신경 항원에 대한 몇몇 추가의 항체를 사용하여, 분화된 세포의 성질을 더욱 상세히 특성화하였다. 미세소관-회합 단백질(MAP2b), NCAM 및 시냅토피신에 대한 항체를 항체 제조처에 의해 권고된 대로 사용하였다. 분화 배지에서의 3주 후에, 전구세포의 마커에서의 분화-유도 감소 및 성숙 신경 마커의 증가가 있었다. 신경 전구세포 마커, 예컨대 Sox2의 백분율은 분화 동안 감소되었으나, p75NTR, βIII-튜불린 및 GABA는 분화 시간의 연장과 함께 증가하였으나(도 6); O4 양성 세포는 hNPC(6.4±2.9) 및 NSLC(8.2±0.6)의 분화 3주 후에 매우 낮았다. 기능적 신경 세포를 확인하기 위해 사용되는 항체인 시냅토피신은 분화 2 및 3주 후에 증가하였으며, 이는 신경 세포의 성숙을 나타낸다. GABA 및 아세틸콜린 마커는 분화 2주 후에 증가하였으며, 3주에는 감소하였다.
형태적 변화 및 다양한 신경 항원 및 유전자의 발현은 상기 방법이 정상 및 가시적인 신경 세포를 야기하는 것을 보여준다. 또한, 새로 형성된 신경 세포는 뉴런의 형태 기준을 갖는다. 상기 마커에 더하여, 신경돌기 분화의 형태적 마커를 특성화함으로써, 분화된 세포를 평가하였다. 뉴런 유형 세포(βIII-튜불린을 강력하게 발현하는 세포)는 분화 후에, 뉴런 당 신경돌기의 평균 수의 증가(예를 들어, 1.38±0.1)를 포함하여, 신경돌기 형성을 나타냈다. 동일한 패턴이 βIII-튜불린 양성 세포에서 관찰되었다. 따라서, 평균 신경돌기 길이(118.3±3.5 ㎛) 및 뉴런 당 분지점의 수(3.28±0.3)도 또한 증가하였다. 분화된 신경-유사 세포에서는 길이가 3개의 세포 직경보다 더 크고, 말단에 성장 원뿔이 있는 긴 신경돌기가 발생하였으며, 뉴런-특이적 유전자가 발현되었고, 분화의 유도 후에 증식이 중단되었다.
추가의 분화를 희소돌기아교세포 계통을 향한 분화를 조장하는 최적화된 배지를 사용하여 수행하였다. NSLC 및 hNPC를 이전에 기재된 바와 같이 FGF-2(10ng/㎖, 페프로테크) 및 소닉 헤지호그(sonic hedgehog)(SHH, 100ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 NS-A 분화 배지에서 4일 동안 배양하였다. 4일 후에, 배지를 T3(60ng/㎖, 페프로테크), IGF1(10ng/㎖, 페프로테크), NT-3(10ng/㎖, 페프로테크) 및 PDGF(10ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 NS-A 분화 배지로 교환하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 20일 동안 배양하였다.
Figure pct00064
hNPC 및 NSLC의 분화의 정량화에 의해, O4에 대하여 양성으로 염색된 세포의 집단이 드러났다. 표 18에 나타낸 바와 같이, O4 양성 세포의 백분율은 상기 분화 프로토콜을 사용하는 경우, 분화된 NSLC(8.5±0.6%)에 비해 분화된 hNPC(40.1±6.4%)에서 더 표명되었다.
이러한 연구에 의해, 세포를 후생적 변형을 위한 DNA 탈메틸화제 또는 소분자의 존재 하에서 1개 또는 2개의 신경 전사 인자로 트랜스펙션시키는 것에 의해 안정적인 재프로그램화된 세포(NSLC)가 달성되었음을 보여준다. DNA 탈메틸화제와 같이, 후생적 변형(아세틸화 및 메틸화의 억제)은 때때로 재프로그램화 방법을 부스팅시키는데 때때로 유용하다. 이들 세포는 하기에 의해 결정된 바와 같은 신경 줄기 세포 특성을 지니며 보유한다: (1) 신경 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, (2) 단일 세포로부터 시작하여 뉴로스피어를 생성하고 성장시키는 능력, 및 (3) 분화 조건에서 신경 계통으로 분화하는 능력. 뉴런으로 분화되는 경우, 세포는 신경 세포 유형과 관련된 하나 이상의 신경-특이적 형태학적, 생리학적 및/또는 면역학적 특싱을 나타낸다. 유용한 기준은 형태학적 특징(긴 신경융기 또는 신경돌기), 생리학적 및/또는 면역학적 특징, 예컨대 일련의 신경-특이적 마커 또는 항원의 발현을 포함한다. 더욱이, NSLC는 높은 백분율의 신경, 성상세포 및 낮은 백분율의 희소돌기아교세포 집단으로의 분화능으로 3능-유사 전구세포로 용이하게 전환한다.
실시예 VI
HFF 의 재프로그램화에서의 BMP 신호전달 경로의 연루
본 연구를 설계하여, HFF의 NSLC에 대한 탈분화의 과정에서의 Noggin의 역할을 평가하였다. HFF를 실시예 III에 기재된 바와 같이 배양하고, 사이토칼라신 B로 처리하였다. 2일의 처리 후에, 세포를 실시예 II에 기재된 바와 같이 뉴클레오펙션에 의해 작제된 벡터 Msi1/Ngn2로 트랜스펙션시켰다. 간단하게, 세포를 준비한 후에, 이들을 2㎍의 전체 DNA(Msi1/Ngn2)와 혼합하고, 제조처의 프로토콜에 따라 아막사의 뉴클레오펙터(상표명)에 의해 MBD2(2㎍)를 공동-트랜스펙션시켰다. 그 다음, 샘플을 라미닌(10㎍/㎖, 시그마) 코팅된 배양 플레이트로 옮기고, 재조합 hFGF(20ng/㎖, 페프로테크), 재조합 hEGF(20ng/㎖, 페프로테크)와 함께, 그리고 Noggin(20ng/㎖, 페프로테크)의 존재 하에, 또는 부재 하에, 신경 증식 배지(뉴로컬트(상표명) 증식 키트, 스템셀 테크놀로지즈)의 존재 하에서 배양하였다. 샘플을 상이한 시점(1, 3, 4, 6 및 8일)에 수집하여, RT-PCR에 의하여 신경 유전자 발현과, 면역조직화학에 의하여 단백질 발현 수준을 분석하였다.
형광 면역조직화학 염색을 이전에 실시예 I에서 기재된 바와 같이 트랜스펙션 4일 후에, 샘플에서 수행하였다. 트랜스펙션된 세포를 염색하고, Sox2의 발현에 대하여 분석하였으며, Sox2의 백분율은 4일에, Noggin의 존재 없이 27.5±0.50%에 비해, Noggin의 존재 하에서 33.3±1.00%였다. Noggin(20ng/㎖)의 존재 하에서, 또는 부재 하에서의 HFF의 pCMV-Msi1-2A-Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2로의 트랜스펙션 후에, 신경 전구세포 마커, 예컨대 네스틴 및 Sox2의 상대 발현의 RT-PCR 분석은 3일에 시작한 네스틴 및 Sox2의 증가와 관련이 있었으며, 8일까지 유지되었다(표 19). Noggin의 부재 하에서의 발현의 차이가 눈에 띄지 않았다. 따라서, Noggin에 의한 BMP 신호전달 경로의 억제는 재프로그램화를 증가시켰으나, 그들 자체에서는 재프로그램화 효과를 갖지 않았다.
Figure pct00065
실시예 VII
HFF 세포에 의해 생성된 NSLC 는 피부-유래의 전구세포( SKP )가 아니다
피부-유래의 전구세포(SKP)로 명명된 세포가 성인 인간 세포에서 잔류할 수 있는 것이 알려져 있다(Fernandes et al., 2004). 이들 세포는 EGF 및 bFGF에 반응하여 증식할 수 있으며, 네스틴, 베르시칸(versican) 및 피브로넥틴을 발현하며, 신경 및 중배엽 자손 둘 모두로 분화할 수 있다. NSLC가 SKP와 별개임을 입증하기 위하여, 지방세포를 향한 분화를 수행하였다. 지방세포 유래의 줄기 세포(ADSC)를 셀스타트(CellStart)(상표명)(인비트로젠)로 코팅된 플라스크에서 스템프로(상표명) MSC 무혈청 배지(인비트로젠)에서 유지시켰다. 셀스타트(상표명)를 dPBS/Ca2+/Mg2+에서 1:100으로 희석하고, 플라스크를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 아큐타제(Accutase)(상표명)를 사용하여 매 3 내지 4일마다 계대하고, 배지를 매 2일 마다 교환하였다. 분화 시작 3 내지 4일 전에, ADSC 및 NSLC를 셀스타트(상표명)(dPBS/Ca2 +/Mg2 + 중에 1:100/37℃에서 2시간) 코팅된 조직 배양 플레이트에서 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. 세포가 컨플루언시에 도달한 경우(3 내지 4일 후), 증식 배지를 DMEM/F12(50:50), ITS(1:100), HEPES(1:100), 글루타맥스(상표명)(1:100), T3(0.2 nM), 로지글리타손(0.5㎍/㎖), IBMX(100μM) 및 덱사메타손(1μM)으로 이루어진 분화 배지로 교체하였다. 3일 후에, IBMX 및 덱사메타손을 분화 배지로부터 빼내었다. 10일에, 세포를 4% 포름알데하이드 용액으로 10분 동안 고정시키고, 오일 레드 오(Oil Red O)(인비트로젠) 염색 용액으로 15분 동안 염색하였다. 염색을 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세정하였다. 지방세포는 오일 레드 오로 특이적으로 염색된 지질 소적과 함께 적색으로 나타났으나, NSLC는 음성으로 염색되었으며, 세포 내의 지질 소적의 존재가 없었으며, 세포는 신경 세포 형태를 채용하였다.
면역조직화학 분석으로, NSLC가 SKP와 별개임을 확인하였다(도 24): NSLC는 p75NTR에 대하여 양성으로 염색되었고, 피브로넥틴 및 베르시칸에 대하여 음성으로 염색된 한편, SKP는 피브로넥틴 및 베르시칸을 발현하고, p75NTR을 발현하지 않았다(Fernandes et al., 2004). 이러한 연구는 NSLC가 3능-유사 전구세포를 나타내며, 이들이 SKP의 하위집단이 아님을 나타낸다.
실시예 VIII
신경-유사 세포( NLC )로부터 분비된 BDNF
신경 및 신경교세포로 분화된 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 배양에 55일 동안 유지시키고, 조정 배지에서 분비된 BDNF를 상이한 시점에 항원-포획 ELISA에 의해 측정하고, 성숙 뉴런(사이언셀(ScienCell)), 미분화 신경 인간 정상 전구세포(NHNP, 론자)뿐 아니라, 미분화 NSLC 및 비트랜스펙션된 세포(HFF)에서의 분비과 비교하였다. 각 그룹으로부터의 조정배지를 수집하고, 원심분리한 다음, 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. BDNF 농도를 제조처의 지시에 따라 ELISA 키트(BDNF Emax 이뮤노어세이 시스템(Immunoassay System), 미국 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corporation))로 측정하였다. 간단하게, 96-웰 ELISA 면역플레이트를 탄산염 완충액(pH 9.7)에 1/1000으로 희석한 항-BDNF(카달로그 번호 #G700B)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음 날에, 블록/샘플 완충액 1×로 쉐이킹 없이 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키기 전에, 모든 웰을 TBS-Tween(상표명) 0.5%로 세정하였다. 블로킹 후에, 표준물질 및 샘플을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션시키고, 실온에서 2시간 동안 쉐이킹하였다(450±100rpm). 이후에, TBS-Tween(상표명) 0.5% 세정 완충액으로의 세정 후에, 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 항-인간 BDNF pAb(블록 및 샘플 1× 완충액 중에 1:500 희석)와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 TBS-Tween(상표명) 0.5% 세정 완충액으로 5회 세정하고, 100㎕의 희석된 항-IgYHRP 컨쥬게이트를 각 웰에 첨가하고(블록 및 샘플 1× 완충액 중에 1:200 희석), 쉐이킹(450±100rpm)하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 플레이트를 TBS-Tween(상표명) 0.5% 세정 완충액으로 5회 세정하고, 100㎕의 TMB 원(One) 용액을 각 웰에 첨가하였다. BDNF 플레이트에 대하여 쉐이킹하면서(450±100rpm) 실온에서 10분 인큐베이션 후에, 청색 색상이 웰에서 형성되었다. 100㎕의 1N 염산의 첨가에 의해 반응을 중지시킨 후에, 반응 중지 30분 내에 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)(시너지(Synergy) 4(상표명)) 상에서 흡광도를 450nm에서 판독하였다. 상층액 중의 분비된 BDNF의 농도를 표준 곡선에 따라 결정하였다.
ELISA 결과에 의해, BDNF가 11일에 시작하여 분화된 신경-유사 세포(NSLC로부터 분화된 NLC) 및 정상 인간 신경 세포로부터 동일한 농도로 분비되었으며, 55일까지 유지된 한편(표 20), 다른 그룹에서는 BDNF가 분비되지 않았음(비트랜스펙션된 HFF 그룹에서의 소량 제외)이 드러났다.
Figure pct00066
신경 형태 기준을 취하는 것 외에, NLC는 기능적 특성이었으며, 이는 향신경성 인자(BDNF)를 분비하는 능력을 가졌다. 이들 향신경성 인자를 국소로 전달할 수 있는 재프로그램화된 신경-유사 세포주를 생성하는 것은 몇몇 신경 병상을 치료하기 위한 방법으로 사용될 수 있었으며, 뇌 및 다른 손상으로부터의 재생 및 기능적 회복에서 결정적인 혜택을 제공할 수 있다.
실시예 IX
상이한 세포 유형의 NSLC 에 대한 재프로그램화: 본 연구를 수행하여, 신경 줄기-유사 세포로의 각질형성세포(인비트로젠), 인간 지방세포 유래 줄기 세포(ADSCs, 인비트로젠) 및 인간 조혈 줄기 세포(CD34+, 인비트로젠)의 능력을 조사하였다.
인간 CD34 + 세포, 인간 ADSC 및 인간 각질형성세포의 제조: 인간 가동화 말초 혈액 CD34+ 세포를 스템셀 테크놀로지즈로부터 구입하였으며, 줄기 세포 인자(SCF, 150g/㎖, 페프로테크), 과립구 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 37.5ng/㎖, 페프로테크) 및 IL-3(75ng/㎖, 페프로테크)이 보충된 완전 스템프로(상표명)(등록 상표)-34 무혈청 배지(인비트로젠) 중에 페트리 디쉬에서 부유하는 배양물로서 증식시켰다. 사이토카인이 보충된 배지를 300xg에서 10분 동안의 세포 현탁액의 원심분리 후에 2 내지 3일마다 교환하였다. 격일로, 사이토카인을 배지의 교환 없이 배양물에 직접 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이들의 계대를 위하여, 세포를 원심분리하고, 상기 배지에 더하여 사이토카인에 재현탁화시키고, 적절한 수의 페트리 디쉬에 두었다.
인간 지방-유래의 줄기 세포(ADSC)를 인비트로젠으로부터 구입하고, 1×104개 세포/㎠의 세포 밀도로 셀스타트(상표명)(인비트로젠) 코팅된 플라스크(Ca2 +/Mg2 +를 함유하는 PBS에 1:100 희석)에서 완전 스템프로(상표명) MSC 무혈청 배지(인비트로젠)에서 증식시켰다. 배지를 2일 마다 새로운 재-가온된 완전 스템프로(상표명) MSC SFM으로 교환하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포를 사전-가온된 TrypLE(상표명)(인비트로젠)에서의 3 내지 5분 동안의 인큐베이션에 의하여 80% 컨플루언시일 때, 하위-계대한 다음, 스템프로(상표명) MSC 배지에서 수집하였다. 1500rpm에서의 5분 동안의 원심분리 후에, 세포를 상술된 바와 같이 셀스타(상표명) 코팅된 플라스크에 씨딩하였다.
일차 인간 각질형성세포를 인비트로젠으로부터 구입하고, 5×103개 세포/㎠의 세포 밀도로 코팅 매트릭스(인비트로젠) 코팅된 플라스크(인비트로겐) 상에서 규명된 각질형성세포 무혈청 배지에서 증식시켰다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 배지를 계대배양시까지 새로운 완전 성장 배지로 매 2 내지 3일 마다 교체하였다. 일단 세포가 70 내지 80% 컨플루언시에 도달하면, 배지를 제거하고, 세포를 베르센(상표명)(인비트로젠)에서 실온에서 3 내지 5분 동안 인큐베이션시켰다. 베르센(상표명)을 제거하고, 사전-가온된 0.05% 트립신-EDTA(인비트로젠)를 플라스크에 첨가하였다. 5 내지 10분의 인큐베이션 후에, 대두 트립신 억제제(인비트로젠)를 함유하는 성장 배지를 플라스크에 첨가하고, 세포를 부드럽게 분쇄하였다. 100xg에서 10분 동안의 원심분리 후에, 세포를 상술된 바와 같은 코팅된 플라스크 상에서 목적으로 하는 부피의 사전-가온된 완전 성장 배지에서 재현탁화시켰다.
트랜스펙션 전에, 세포를 트립신처리하고, 이전에 실시예 IV에 기재된 바와 같이 셔틀을 사용하여, 일시적으로 pCMV-Msi1-Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2로 공동-트랜스펙션시키고, 라미닌(시그마, 10㎍/㎖)으로 코팅된 배양 플레이트로 플레이팅하였다. 트랜스펙션 후 1일부터 시작하여, 세포를 4일 동안 VPA(1mM)로 처리하고, 배지를 점차 FGF(20ng/㎖) 및 EGF(20ng/㎖)로 보충된 증식 배지로 교환하고, 18일 동안 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 배양하였다. 그 다음, 세포를 RT-PCR 및 면역조직화학에 의해 신경 줄기 세포 마커에 대하여 분석하였다.
재프로그램화된 세포의 추가의 분석 및 정량화에 의해, 각질형성세포 및 CD34+ 세포로부터 엔지니어링된 NSLC의 집단이 드러났다. RT-PCR 분석에 의해, Msi1 및 Ngn2에 의하여 각질형성세포 및 CD34+를 트랜스펙션시킨 후에, 신경 줄기 세포 마커, 예컨대 Sox2, 네스틴, GFAP 및 βIII-튜불린의 상대적 발현의 증가가 드러났다. 네스틴 및 GFAP의 상대 발현이 HFF로부터의 NSLC에 비해, 각질형성세포 및 CD34+ 세포로부터 생성된 NSLC에서 증가되었으나; Sox2 및 ACHE 발현에 대해서는 그 반대였다. βIII-튜불린(TUBB3) 및 Map2b 발현은 CD34+ 세포로부터 생성된 NSLC에서 가장 높았으며, HFF로부터 생성된 NSLC가 다음이었다(표 21). 이러한 데이터는 상이한 유전자 발현 프로파일(및 특징)을 갖는 상이한 유형의 NSLC가 상이한 유형의 출발/공급원 세포로부터 생성될 수 있음을 보여준다(그리고, 동일한 것이 이러한 응용에서 검토된 몇몇 다른 유형의 줄기-유사 세포를 생성하는 데에서 관찰되었다). 또한, 이러한 데이터는 아주 흥미로운데, 이는 각질형성세포(내인성 신경 줄기 세포와 같이 외배엽으로부터 유래)가 네스틴을 제외한 분석한 모든 유전자에 대하여 HFF보다 더 낮은 발현을 가질 것이라고 예상되지 않았기 때문이다(각질형성세포가 NSLC로 재프로그램화하는데 가장 용이할 것으로 예상되는데, 이는 이들이 외배엽으로부터 유래되기 때문이다).
Figure pct00067
면역조직화학에 의해, 표 7에 나타낸 바와 같이, GFAP, Sox2 및 네스틴에 대한 양성의 염색이 드러났다. HFF로부터 발생한 NSLC는 CD34+ 세포(42.8±2.7 및 24.2±4.4) 및 각질형성세포(47.1±2.1 및 43.4±8.9)에 비해, Sox2 및 GFAP(55.8±3.8 및 78.1±2.4)에 대하여 더 높은 백분율의 양성 염색을 생성하였다. 네스틴 양성 세포의 백분율은 각질형성세포(77.6±10.7) 및 HFF(68.45±12.9)에서 높았으며, CD34+ 세포에서 더 낮았다(15.5±2.7)(표 22). Sox2 및 네스틴 양성 염색은 ADSC에서 검출불가능하였다.
Figure pct00068
각질형성세포 및 CD34+ 세포로부터 생성된 NSLC를 3능에 대하여 시험하였다. 추가의 분화 연구를 수행하여, 실시예 V에 기재된 바와 같이 BDNF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 bFGF(40ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 뉴로컬트(상표명) 분화 배지(뉴로컬트(상표명) 분화 키트, 스템셀 테크놀로지즈)를 사용하여, 이들 NSLC의 신경 계통을 향한 분화를 유도하였다. HFF 및 hNPC로부터 생성된 NSLC를 대조군으로 사용하고, 배양물을 3주 동안 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 추가의 분화를 위한 분화 14일 및 28일 후에 수집하거나 고정하였다. RT-PCR 분석으로, 표 23A, 23B, 23C 및 23D에 나타낸 바와 같이, 미분화된 유전자(네스틴 및 Sox2)의 감소 및 분화된 유전자의 증가가 드러났다.
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
형광 면역조직화학 염색을 분화 14일 및 28일 후에 샘플에서 수행하였다. Sox2 및 네스틴의 발현은 분화된 세포(HFF, 각질형성세포 및 CD34+)에서 시간에 의존적으로 감소하였다. 이러한 감소는 28일에 분화된 마커의 증가, 예컨대 GFAP (HFF-NC에 대하여 68.51±1.87, 각질형성세포 NC에 대하여 59.55±9.12 및 CD34+-NC에 대하여 61.70±1.48)와 관련이 있었다. 각질형성세포(23.27±2.91) 및 CD34+ 세포(39.15±7.99)로부터 생성된 βIII-튜불린 양성 세포에 비하여, βIII-튜불린 양성 세포에 대한 높은 백분율이 HFF(57.83±4.49)로부터 생성된 분화된 NSLC로부터 생성되었다(표 24).
Figure pct00074
Sox2 양성 세포의 %는 더 빠르게 감소하였으며, 네스틴 양성 세포의 %는 더 느리게 감소하였으며, 분화 마커(S100β, βIII-튜불린, GFAP) 중 하나를 발현하는 세포의 %는 일반적으로 분화 동안 NSLC에서보다 hNPC에서 더 느리게 증가하였다. 생성된 NSLC 라인의 3가지 유형 중에, 분화 마커(S100β, βIII-튜불린, GFAP) 중 하나를 발현하는 세포의 %는 일반적으로 각질형성세포로부터 생성된 NSLC에서 가장 느리게 증가하였으며, HFF로부터 생성된 NSLC에서 가장 빨랐다.
이러한 연구에 의해, NSLC가 각질형성세포 및 CD34+ 혈액 세포로부터 생성될 수 있으며, 이들 세포가 HFF로부터 생성된 NSLC와 유사하게 형태 및 마커를 공유하는 것으로 나타났다. hNPC와 유사하게, 각질형성세포, CD34+ 세포 및 HFF로부터 생성된 NSLC는 S100beta 염색으로 확인하였던 분화 동안 GAP 양성 세포의 높은 백분율로 나타낸 바와 같이 신경 계통보다 성상세포 계통에 대해 더 분화하는 경향을 가졌다(HFF로부터 생성된 NSLC를 제외하고, 거의 유사한 βIII-튜불린 양성 및 GFAP 양성 세포의 수를 가짐). 그러나, hNPC로부터 생성된 성상세포 및 신경 세포의 비율은 동일한 배양 조건에서 더 낮았으며, 이는 HFF, 각질형성세포 및 CD34+ 세포로부터 생성된 NSLC가 hNPC에 비해 더 많은 수의 신경 및 성상세포를 야기할 수 있음을 나타낸다. HFF로부터 생성되든, 각질형성세포로부터 생성되든, 또는 CD34+ 세포로부터 생성되든(또는 어쩌면, 심지어 몇몇 다른 세포), NSLC는 3능 세포이며, hNPC와 유사하게 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포로의 분화능을 갖는다. 그러나, 트랜스펙션된 ADSC의 RT-PCR 및 면역조직화학 분석에 의해, 신경 줄기 세포 유전자의 임의의 유의미한 발현이 드러나지 않았으며, 이는 ADSC를 NSLC로 바꾸기 위한 조건을 최적화하거나, 이들을 NSLC로 바꿀 수 있었던 다른 신경 인자의 효과를 조사할 필요성을 나타낸다.
실시예 X
제작 3D 세포외 기질( CDM )
섬유아세포를 실시예 I에 기재된 바와 같이 10% FCS의 존재 하에서 DMEM 배지에서 배양하고, 이어서, 3:1 비의 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, L-글루타민 및 피루브산나트륨이 있는 고 글루코스(4.5g/ℓ)) 및 하기의 성분이 보충된 햄의 F-12 배지로 이루어진 규명된 CDM 배지에서 2×106개 세포/㎖의 농도로 라미닌(10㎍/㎖)으로 사전-코팅된 12-웰 플레이트에 씨딩하였다: EGF(4.2×10-10M), bFGF(2.8×10-10M), ITS(8.6×10-5M), 덱사메타손(1.0×10-7M), L-아스코르브산 포스페이트 마그네슘 염 n-수화물(3.2×10-4M), L-3,3',5-트라이아이오도티로닌(2.0×10-10M), 에탄올아민(10-4M) 글루타맥스(상표명)(4×10-3M), 글루타티온(3.3×10-6M) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B. 섬유아세포를 이러한 화학적으로 완전히 규명된 배지에서 하이퍼컨플루언트(hyperconfluent) 농도로 배양함으로써, 이들이 증식을 늦추면서, 높은 합성 상태에 들어가게 하여, 섬유아세포 그들 자체에 의해 완전히 합성되는 신생 3D 세포외 기질(CDM) 내에 다층의 섬유아세포로 이루어진 생조직 등가물(living tissue equivalent : LTE)의 생성을 야기하였다.
CDM 내의 세포의 분화전환 및 재프로그램화
14일에, CDM 샘플을 사이토칼라신 B의 농도를 5일에 걸쳐 10㎍/㎖에서 0㎍/㎖(무)로 감소시키고, 동시에 배지를 CDM 배지에서 NbActive 배지로 바꾸면서, 사이토칼라신 B(10㎍/㎖, Calbiochem)로 처리하였다. 샘플을 37℃, 5% CO2에서 추가 12일 동안 배양하고, 배지를 매일 교환하였다. 샘플을 고정시켜, 이전에 기재된 바와 같이 면역조직화학을 수행하여, 신경 마커를 검출하였다. 하기의 항체를 사용하였다: 마우스 항-네스틴 647(1:100, BD) 및 항-βIII-튜불린(1:200, 뉴로믹스(Neuromics)). 세포의 명백한 형태 변화가 CDM 내에서 관찰되지 않았으며, 변역조직화학 분석으로 βIII-튜불린 양성 세포를 검출하지 못하였다. 따라서, 오직 사이토칼라신 B 및 화학적으로 규명된 신경 배지만을 사용한 세포의 분화전환의 유도는 세포를 재프로그램화하는데 충분하지 않았다.
다음으로, 6일에, 37℃ 및 5% CO2에서 LAS 사전-코팅된 플레이트에서 성장시킨 CDM 샘플을 동시에 5일에 걸쳐 사이토칼라신 B(10㎍/㎖), 히스톤 탈아세틸화 억제제(VPA, 4mM, 칼바이오켐) 및 DNA 메틸화의 억제제(5-아자시티딘, 5μM, 시그마)에 노출시켰다. 4일 후에, 배지를 3:1 비의 EGF가 없는 CDM 배지 및 NT-3(20ng/㎖, 페프로테크) 및 BDNF(20ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 NbActive 배지(브레인비츠(상표명)로 이루어진 분화 배지로 교환하였다. 분화 배지의 비는 100%의 완전 분화 배지에 도달할 때까지 날마다 점차 증가하였다. 2주의 처리 후에, 세포를 면역조직화학 분석을 위해 고정시켜, 세포의 아이덴티티(identity)를 조사하였다. 도 18은 7일에 βIII-튜불린이 있는 면역염색된 세포를 보여주며, 이는 섬유아세포의 뉴런으로의 탈분화를 나타낸다. 그러나, 1주 후에, 이들 분화전환된 세포는 다시 섬유아세포로 복귀하였으며, βIII-튜불린 발현이 소실되었다(도 8). 프라이밍 효능제의 제거 후에 형태 및 βIII-튜불린 발현의 소실은 기능적 특성 및 안정적인 재프로그램화된 세포로의 완전한 전환이 발생하지 않았음을 나타낸다.
다음으로, CDM을 상기와 같이, VPA(4mM), 5-Aza(5μM) 및 사이토칼라신 B(10㎍/㎖)로 처리하였다. 화학적 처리 2일 후에, CDM 내의 섬유아세포를 리포펙타민 시약(인비트로젠)을 사용하여 제조처의 프로토콜에 따라 트랜스펙션시켰다. 15 g의 진핵 DNA 발현 벡터 pCMV6-XL5-Pax6, pCMV6-XL5-Msi1 및 pCMV6-XL4-Ngn2(오리진)를 사용하여 세포를 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 배지를 Noggin(50ng/㎖), EGF(20ng/㎖) 및 bFGF(20ng/㎖)가 보충된 신경선구세포 기본 배지(론자)로 교환하고, 세포를 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 배양하고, 배지를 매일 교환하였다. 6일에, NT-3(20ng/㎖, 페프로테크), 전-트랜스-레티노산(ATRA, 5μM, 스펙트럼), BDNF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 bFGF(40ng/㎖, 페프로테크)가 보충된 NBActive 배지(브레인비츠(상표명))에 서서히 첨가함으로써 분화를 개시하였다. 재프로그램화된 세포를 특성화하기 위하여, 면역조직화학 분석 및 RT-PCR을 네스틴, βIII-튜불린, GFAP, MAP2b 및 ACHE에 대한 프라이머를 사용하여 실시예 II에 기재된 방법에 따라 다양한 시점에 수행하였다. 이전의 연구와 일치하여, 비-트랜스펙션된 세포 및 Pax6으로 트랜스펙션된 세포는 신경 계통에 특이적인 유전자를 발현하지 않았다(도 25). 반면, Msi1으로의 트랜스펙션 후에, 네스틴 및 ACHE의 수준이 각각 4배 및 8배로 증가하였으며, 이러한 발현은 12일 기간에 걸쳐 유지되었다. 또한, GFAP mRNA의 수준이 시간 의존적으로 대략 14배 증가하였다. 이와 같이, 동일한 패턴이 Ngn2 트랜스펙션된 세포에서 관찰되었다. βIII-튜불린 및 MAP2b의 발현이 하나의 신경 전사 인자로의 트랜스펙션 후에 완만하게 증가하였으나, 2개의 신경 인자, Pax6과 함께 Msi1 또는 Ngn2로 세포를 트랜스펙션시킨 후에, 유전자 발현의 조절은 신경 유전자의 발현을 추가로 증가시키지 않았다. 도 19는 세포를 Msi1 및 Ngn2로 트랜스펙션시킨 경우, 이들 유전자의 발현이 증가됨과 함께, βIII-튜불린이 12일에 거의 6배 증가하였음을 보여준다.
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
세포를 3개의 전사 인자(Msi1, Ngn2 및 Pax6)로 트랜스펙션시키는 경우, 동일한 유전자 발현 패턴이 관찰되었으나, Msi1 및 Ngn2로 트랜스펙션시킨 세포에서보다 덜 뚜렷하였다. 트랜스펙션 12일 후의 면역조직화학 분석의 면에서, 세포는 네스틴 및 MAP2b의 발현으로 나타낸 바와 같이, Msi1 또는 Ngn2로의 트랜스펙션 후에 신경 마커를 나타내었다(도 9). pCMV-XL-PAx6으로 트랜스펙션시킨 세포는 네스틴 및 MAP2b에 대해 염색되지 않았다.
이러한 연구는 CDM 내의 세포를 오직 하나의 신경 인자(Msi1 또는 Ngn2)로 트랜스펙션시키는 것이 형태학적 변화 및 신경 줄기 세포 및 신경 세포의 하나 이상의 마커의 발현을 유도하는 것을 보여준다. 재프로그램화된 세포가 주요 신경 인자, 신경 전구세포 마커 및 낮은 백분율(10%)로 성숙 신경 마커를 발현하기 때문에, 이는 CDM 내의 세포가 NSLC로 전환된 다음 신경 줄기 세포에서 유도되는 다양한 상태의 신경 결정 및 분화 프로그램을 통해 분화되기 시작하였음을 시사한다.
실시예 XI
CDM 내의 재프로그램화된 세포의 유전자 발현 분석
이러한 연구를 설계하여, 재프로그램화 과정에서 세포를 MBD2의 존재 하에 Msi1 및 Ngn2로 트랜스펙션시키는 효과를 시험하였다. 세포를 사이토칼라신 B로의 사전-처리 2일 후에 실시예 X에 기재된 바와 같은 리포펙타민 시약을 사용하여 DNA 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 15㎍의 진핵 DNA 발현 벡터 pCMV6-XL5-무사시 또는 pCMV6-XL4-Ngn2 및 pCMV6-XL5-MBD2(오리진)를 사용하여, 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 배지를 CDM:Noggin(50ng/㎖), EGF(20ng/㎖) 및 bFGF(20ng/㎖)가 보추된 신경 전구세포 유지 배지(1:1)로 교환하였다. NPBM의 백분율을 증가시키고, CDM 배지를 감소시킴으로써 배지를 매일 교환하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 및 5% O2에서 6일 동안 배양하였다. 1주 후에, NPBM 배지에 NT-3(20ng/㎖, 페프로테크), 전-트랜스-레티노산(ATRA, 5μM, 스펙트럼), BDNF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 bFGF(40ng/㎖, 페프로테크)를 점차 보충함으로써, 분화를 개시하였다. 샘플을 연구의 마지막(14일)에 수집하고, 데이터를 유전자 어레이에 의해 분석하여, 신경 계통에 특이적인 것으로 재현성있게 관찰되는 유전자를 확인하였다.
유전자 발현 분석
8개의 샘플 상에서 맞춤화된 신경 마커 2 TLDA를 사용하여 이전에 실시예 I에 기재된 바와 같이 유전자 발현 분석을 수행하여, 신경 줄기 세포, 신경 세포 및 신경교세포와 관련된 유전자의 발현 및 트랜스펙션 후에 세포에 의해 발현되는 성장 인자를 확인하였다. 희소돌기아교세포 유전자, 예컨대 NKx2.2, olig2 및 MAG의 발현이 Msi1 및 Ngn2에 의해 증가되었으나; 증가는 Ngn2에 비해 Msi1에 의해서 더욱 뚜렷하였다(표 26). 성상세포에 대한 2개의 마커(GFAP 및 AQP4)는 DNA 탈메틸화제 MBD2의 존재 하에서 Msi1 및 Ngn2로의 트랜스펙션 후에 고도로 발현되었다. 흥미롭게도, 조기 신경 세포의 몇몇 마커가 증가하였며; 트랜스펙션 12일 후에, TDLA 데이터에 의해, 인터뉴런에 대한 특정 마커, 예컨대 소마토스타틴 및 칼빈딘1에서의 증가가 드러났다. 발생 동안 비성숙 세포를 이동시킴으로써 발현되는 더블코르틴(DCX), 및 신경 세포의 조기 마커인 아세틸콜린(ACHE)은 재프로그램화된 세포에서 고도로 발현되었다(표 26). Msi1 또는 Ngn2로의 트랜스펙션에 의해 신생 뉴런의 조기 마커인 다이하이드로피리미디나제-유사 3(DPYSL3)의 발현이 Msi1과는 5배 및 Ngn2와는 7배로 증가하였다. 발생 및 조기 신경 형태의 유지에 필수적인 마커인 미세소관-회합 단백질 2(MAP2) 및 신경 세포 부착 분자(NCAM)의 발현은 Msi1 및 Ngn2와 함께 고도로 발현되었다. 성숙 뉴런의 마커인 에놀라제-2의 발현은 Msi1 및 Ngn2에 의해 20배 증가하였다. NeuroD 패밀리의 구성원, NeuroD1은 Msi1으로의 트랜스펙션 후에 84.22배 및 Ngn2에 의해 34.27배로 고도로 증가하였다. 성장 인자, 예컨대 IGF-1, IGF-2, NPY 및 CSF-3의 유전자 발현은 Msi1 또는 Ngn2로의 트랜스펙션 후에 증가하였다. VEGF 및 GDNF 유전자의 발현은 Msi1 및 Ngn2에 의해 각각 거의 5배 및 7배 증가하였다. 그러나, 트랜스펙션된 세포에서, BDNF, EGF 및 bFGF의 발현은 활성화되지 않았으며, 심지어는 비트랜스펙션된 세포에 비해 하향-조절되었다. 신경돌기 연장의 성장- 및 재생-관련 마커인 성장 관련 단백질(GAP-43)의 발현 및 신경 발생 및 안내에 연루되는 네트린의 발현은 트랜스펙션된 세포에서 고도로 발현되었다(표 26). 성장 및 향신경성 인자에 대한 수용체, 예컨대 III형 수용체 티로신 키나제, 향신경성 티로신 키나제 수용체 및 향신경성 티로신 키나제의 발현이 증가하였다. 섬유아세포-특이적 마커인 비멘틴 및 피브로넥틴은 재프로그램화된 세포에서 하향-조절되었다.
MBD2의 존재 하에서의 오직 Msi1 및 Ngn2 만으로의 HFF의 트랜스펙션에 의해, 신경교세포 및 신경 세포 마커의 발현이 증가하였다.
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
실시예 XII
리포펙타민 및 뉴클레오펙션에 의한 CDM 내의 세포의 재프로그램화
이러한 연구를 설계하여, 리포펙타민 및 뉴클레오펙션을 병용하고, 2가지 벡터 pCMV6-XL5-Msi1 및 pCMV6-XL4-Ngn2를 따로, 또는 pCMV-XL5-MBD2와 병용함으로써, CDM의 트랜스펙션을 향상시켰다. CDM 4일 내의 세포를 사이토칼라신 B와 함께 또는 이것 없이 사전-처리 2일 후에, Msi1/MBD2, Ngn2/MBD2 또는 Msi/Ngn2/MBD2로 6일 동안 리포트랜스펙션시켰다. 병행하여, 트랜스펙션을 실시예 II에 기재된 바와 같이 뉴클레오펙션을 사용하여 6시간 후에 새로운 HFF에서 수행하고, 리포펙타민 배지를 새로운 CDM 배지로 교환하는 경우, CDM의 상측으로 옮겼다. 24시간 후에, 배지를 Noggin(50ng/㎖, 페프로테크), 재조합 hFGF(20ng/㎖, 페프로테크) 및 재조합 hEGF(20ng/㎖, 페프로테크)의 존재 하의 신경 전구세포 기본 배지(NPBM, Lonza)로 교환하였다. NSA-A 분화 배지(스템셀 테크놀로지즈)를 21일 동안 첨가함으로써, 분화를 7일에 유도하였다.
유전자 발현 분석
샘플을 8, 15 및 21일에 수집하여, 이전에 실시예 I에서 기재된 방법에 따라, RT-PCR을 사용하여 몇몇 신경 마커 유전자의 발현을 분석함으로써, 새로 형성된 세포의 성질을 평가하였다. 표 27에 나타낸 바와 같이, 하나의 신경 전사 인자(Msi1 또는 Ngn2)로 트랜스펙션된 세포는 8일에 높은 수준의 네스틴 및 βIII-튜불린을 발현한다. 동일한 발현 패턴이 15일 및 21일에 관찰되었으나, 발현은 Ngn2로 트랜스펙션된 세포에서 사이토칼라신 B의 부재 하에서 약간 감소하였다. 성숙 신경 마커인 MAP2b를 제외하고, 모든 유전자의 발현은 두 신경 전사 인자로 트랜스펙션된 세포에서 현저하게 증가하였다. 이들 유전자의 상향조절은 사이토칼라신 B의 부재 하에서 약간 감소하였으며, 이는 재프로그램화 증가에서의 이의 역할을 나타낸다.
Figure pct00082
Figure pct00083
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Figure pct00085
면역조직화학 분석
샘플을 4, 8, 14 및 21일에 수집하여, 이전에 실시예 I에서 기재된 방법에 따라 면역조직화학 분석을 사용하여 몇몇 신경 마커의 발현을 분석함으로써, 임의의 재프로그램화된 세포의 성질을 평가하였다. 다양한 시점에서의 면역조직화학 분석에 의해, 처음 8일 내에 네스틴의 발현이 대부분의 세포에서 유도되었으며, 분화의 유도 후에 시간 의존적으로 감소되었음이 드러났다(도 10).
이러한 연구는 사이토칼라신 B 및 MBD2의 존재 하에서의 세포의 1개 또는 2개의 신경 유전자로의 트랜스펙션 시에 재프롤그램화된 세포는 배양에서 안정적이었으며, 환경 변화(증식 대 분화)에 반응성이고, 배양에서 적어도 24시간 동안 신경 마커를 발현하는 것으로 나타났다.
실시예 XIII
NSLC 의 텔로머라제 활성
텔로머라제는 신경 전구세포에서 활성이 있으며, 이의 조절이 포유류 뇌에서 발생하는 세포 증식에 대한 중요한 파라미터임이 제안되었다(Caporaso GL et, 2003). 이러한 연구를 수행하여, 조기(P7) 및 후기 계대(P27)에서 부착 NSLC(라미닌-코팅된 플레이트에서 배양된 NSLC)뿐 아니라 부유하는 나노스피어 내의 NSLC(저-결합 표면을 갖는 플레이트에서 배양된 NSLC)의 세포 추출물 내의 텔로머라제 활성을 평가하였다. 4개의 샘플의 텔로머라제 활성을 TRAPeze(등록 상표) 텔로머라제 검출 키트(케미콘(chemicon))를 사용하여, PCR-기반의 텔로미어(telomere) 반복 증폭 프로토콜(TRAP)에 의해 측정하였다. 간단하게, 세포를 24-웰 플레이트에서 성장시키고, PBS에서 세정하고, 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, 0.1mM 벤즈아미딘, 5mM β-머캅토에탄올, 0.5% CHAPS 및 10% 글리세롤(1× CHAPS 용해 완충액, 키트에 제공) 및 RNase 억제제를 함유하는 완충액에서 얼음 상에서 30분 동안 균질화시켰다. 샘플을 스핀 다운시키고, 상층액의 단백질 농도를 BCA 검정을 사용하여 결정하였다. 각 세포 추출물으로부터의 900ng의 단백질을 TRAP 반응 완충액, dNTP, 주형 물질(TS) 프라이머, TRAP 프라이머 믹스 및 Taq 중합효소를 함유하는 TRAP 반응 혼합물에 직접 첨가하였다. 반응 혼합물을 주형 합성을 위해 30℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 연장된 텔로머라제 생성물의 증폭을 위한 PCR 절차(초기 변성을 위해 95℃/15분, 32 사이클 동안 94℃/30초, 59℃/30초, 72℃/1분)로 이어졌다. 텔로머라제 활성을 검출하기 위하여, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 10% 비-변성 TBE 겔 상의 반응 생성물을 위해 수행하였다. 전기영동 후에, 겔을 SYBR(등록상표) 그린 I 핵산 겔 염색으로 30분 동안 염색하고, 겔-도큐멘테이션 시스템(알파 이노테크)을 사용한 이미지 캡쳐로 이어졌다.
모든 4개의 샘플은 도 11에 나타낸 바와 같이, 텔로머라제 양성이었다(TRAP 생성물 래더에 의해 나타낸 바와 같이). 예상한 대로, 열-처리된 대조군(ΔH)은 텔로머라제 활성이 없는 것으로 나타났다(음성 대조군). 36bp 내부 대조군 밴드(S-IC)를 사용하여 PCR 증폭을 모니터링하였다(위-음성(false-negative) 결과를 구별하기 위하여). 이러한 S-IC 밴드를 시험 샘플을 제외한 모든 샘플에 대하여 관찰하였다. 이것은 시험 샘플 내의 과도하게 높은 텔로머라제 활성 때문일 수 있으며; TRAP 생성물 및 S-IC 대조군 밴드의 증폭은 준-경쟁적(semi-competitive)이다. 모든 대조군은 예상된 결과를 제공하였다(CHAPS 대조군에 대해서는 TRAP 생성물이 없고, 양성 대조군 세포 및 TSR8에 대한 생성물의 TRAP 래더가 있음).
실시예 XIV
종양 형성 검정법
악성종양 전환된 세포는 세포외 성장 증가 인자에 대한 감소된 요구를 나타내었으며, 세포-세포 접촉에 의해 제한되지 않고, 종종 무한증식이다. 앵커리지(Anchorage)-독립적 성장 및 증식은 악성종양 전환의 특징 중 하나이며, 이는 세포의 악성종양 전환을 검출하기 위한 시험관 내 검정에서 가장 정확하고 엄격한 것으로 여겨진다.
조기 및 후기 계대(P7 및 P25)에서의 부착 및 뉴로스피어 NSLC뿐 아니라 정상 인간 신경선구세포(hNPC)를 앵커리지-독립적 성장에 대하여 조사하였다. HFF를 음성 대조군으로 사용하였으며, 자궁경부 암종 헬라(HeLa) 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포를 실온에서 3분 동안의 150xg에서의 원심분리에 의해 침강시켰다. 사이토셀렉트(상표명) 96-웰 세포 전환 검정법(셀바이오랩스(CellBiolabs))을 사용하여 검정법을 수행하였다. 베이스 아가(agar) 층(1.2%)을 2×DMEM/20% PBS 용액에 용해시키고, 50㎕의 아가 용액을 플레이트에 첨가하고, 고형화시키기 위하여 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 아가층에 첨가하기 전에, 플레이트를 37℃에서 15분 동안 가온되게 하였다. 세포를 상이한 밀도(20.000 및 5000개 세포/웰)에서 재현탁화시켰으나, hNPC는 충분한 세포가 없었기 때문에, 오직 5000개 세포/웰에서만 재현탁화시켰다. 세포를 1.2% 아가 용액, 2×DMEM/20% PBS 및 세포 현탁액(1:1:1)과 혼합하고, 75㎕의 혼합물을 이미 고형화된 베이스 아가 층을 함유하고 있는 웰에 옮긴 다음, 4℃에서 15분간 두어, 세포 아가 층이 고형화되게 하였다. 100㎕의 증식 배지(스템셀 테크놀로지즈)를 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 8일 동안 인큐베이션시킨 다은, 가용화시키고, 용해시키고, 사이큐언트(CyQuant)(상표명) GR 염료에 의해 형광 플레이트 판독기에서 검출하였다. 형광 측정을 485/538nm 필터가 있는 플렉스스테이션(Flexstation)(상표명)(몰레큘러 디바이스즈)을 사용하여 수행하였다.
Figure pct00086
표 28에 나타낸 바와 같이, 형광 측정에 의해, 동일한 조건 하에서 오직 암종 헬라 세포만이 앵커리지-독립적 콜로니로서 유의미하게 성장하고 증식하는 것으로 나타났으며, hNPC 및 NSLC(부착 및 부유 뉴로스피어)는 둘 모두 10× 확인 형광 측정에서 브라이트 필드를 사용하는 광학 현미경 관찰에 의하여 세포의 가시적 관찰에 의하여 표준 아가 플레이트 종양 형성 검정법에서 종양 성장에 대하여 음성이었다(5,000 및 10,000개 세포에 대하여 HFF(음성 대조군)와 동일한 값). 따라서, 일시적 트랜스펙션 방법 및 사용된 유전자는 일반적으로 보통 성장을 저지하는 외부 및 외부 신호 둘 모두에 독립적으로 증식할 수 있는 세포 집단을 야기하는 일련의 유전적 및 후생적 변경을 통한 특정 유전자 또는 안정적인 트랜스펙션으로 발생하는 종양성 전환 없이 세포의 재프로그램화를 가능하게 한다.
실시예 XVI
일시적 트랜스펙션으로부터의 NSLC 에서는 플라스미드의 게놈 통합 이 없음
DNA 플라스미드 Msi1/Ngn2(내부 실험실에서 설계되고 작제)를 MBD2(샘플 1에 대하여) 또는 5-Aza 및 VPA(샘플 2에 대하여)와 함께, NSLC의 생성을 위하여 일시적 트랜스펙션에 사용하였다. 트랜스펙션 2주 후에, 서던 블롯을 수행하여, 플라스미드 DNA의 가능한 게놈 통합을 시험하였다. NSLC 샘플뿐 아니라, 음성 대조군으로 사용한 HFF(인간 섬유아세포 세포주)로부터 추출한 3㎍의 게놈 DNA를 BglII, PstI 및 StuI을 비롯한 몇몇 제한 효소로 분해하고, 1% 아가로즈 겔에서 전기영동시키고, 양으로 하전된 나일론 멤브레인(로슈)으로 옮겼다. 멤브레인을 한 세트의 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA로부터 증폭된 1.2kb Dig-표지된 PCR 프로브와 함께 42℃에서 하룻밤 DIG 이지(Easy) Hyb(상표명) 완충액(로슈)에서 혼성화시켰다. 멤브레인을 2×SSC, 0.1 % SDS로 실온에서 각각 5분씩 2회 세정하고, 각각 15분씩 0.5×SSC, 0.1 % SDS로 65℃에서 2회 세정하였다. 멤브레인의 혼성화 신호를 CDP-스타(Star)(상표명) 기질(로슈)을 사용하여 검출하였다. 멤브레인을 분석을 위해 X-선 필름에 노출시켰다. 상기 신호를 스트립핑(stripping) 완충액(0.2M NaOH, 0.1% SDS)을 사용하여 멤브레인으로부터 스트립핑시켰다. 멤브레인을 한 세트의 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA로부터 증폭된 0.9kb Dig-표지된 PCR 프로브로 재혼성화시켰다.
1.2kb Dig-표지된 PCR 프로브를 사용한 서던 블롯 분석(도 12)에 의해, Msi1/Ngn2 플라스미드 DNA를 게놈당 1, 10 또는 100개의 통합의 당량에 대하여 HFF 게놈 DNA 내로 스파이킹한 양성 대조군 샘플에서 다른 신호가 나타났다. HFF, NSLC 샘플 #1 및 #2로부터의 제한 효소 분해된 게놈 DNA에서 소수의 약한 동일한 밴드가 있었으며, 이는 NSLC의 게놈 DNA 내로의 플라스미드 DNA 통합이 없었음을 시사한다. 이들 밴드는 내인성 Ngn2 유전자를 나타낼 수 있는데, 1.2kb Dig-표지된 PCR 프로브가 작은 부분의 Ngn2 유전자를 함유할 수 있기 때문이다. 이러한 데이터는 일시적인 트랜스펙션 후에, NSLC가 숙주 게놈 내로의 플라스미드 통합을 가지지 않거나, 소수의 NSLC 만이 숙주 게놈 내로의 플라스미드 통합을 가지고, 트랜스펙션된 유전자는 오직 짧은 기간 동안(2주 미만)만 세포에서 존재하였음을 보여준다.
실시예 XVII
하기에서의 이식된 hNSLC 의 신경 보호 효과:
1) 다발성 경화증의 동물 모델
다발성 경화증(MS)은 중추신경계의 난치의 염증성 탈수초성 질환이다(Frohman EM et al 2006). MS에 대한 치료법은 면역계의 조작에 의존하나, 종종 임상적 에피소드 또는 영구적인 신경 장애를 감소시키는데 크지 않은 효과를 가지며, 빈번한 주사를 필요로 하고 때때로 상당한 부작용을 갖는다(Langer-Gould A et al 2004). 실험적 알러지성 뇌수막염(EAE)은 질환 메커니즘을 연구하고 강력한 치료법을 시험하기 위하여 통상적으로 사용되는 MS의 동물 모델이다. EAE는 다양한 CNS 항원[미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 단백지질 단백질(PLP) 및 미엘린 염기성 단백질(MBP)]을 사용하여, 다양한 종 및 스트레인의 동물에서 유도될 수 있다[마우스, 래트, 마모셋 원숭이(marmoset monkey), 레서스 원숭이(rhesus macaques)].
실험을 위한 모든 적절한 동물 승인을 수득한 후에, 암컷 7 내지 8주령 C57BL/6 마우스를 칼스 리버즈(Charles Rivers)로부터 구입하고, 새로운 환경에 대한 적응을 위하여 실험 전에 MISPRO 동물 시설에 1주 동안 가두었다. C57BL/6 마우스에 5㎎/㎖ 마이코박테리움 튜베르큘로시스 H37Ra(디프코 인코포레이티드)를 함유하는 CFA(쉘돈 바이오테크놀로지 센터 맥길 유니버서티) 중의 100㎍ MOG 35-55를 등의 2 부위에 피하 주사하였다. 모든 마우스에 200ng의 백일해 독소(리스트 바이올로지컬 래보러터리즈, 인코포레이티드(List Biological Laboratories, Inc))를 0일 및 2일에 복강내로 주사하는 한편, 임상 점수를 하기와 같은 0 내지 5점에 따라, 43일 기간 동안 매일 맹검으로 계산하였다: 1, 처진 꼬리 또는 꼬리 긴장과 함께 오리 걸음; 2, 처진 꼬리와 함께 오리 걸음(운동실조); 2.5, 부분 사지마비가 있는 운동실조; 3, 한쪽의 사지의 완전 마비; 3.5, 제2 사지의 부분 마비와 함께 한쪽의 사지의 완전 마비; 4, 2쪽의 사지의 완전 마비; 4.5, 죽어감; 및 5, 사망.
세포와 함께 또는 이것 없이 EAE 동물 모델의 치료:
동물이 EAE의 징후를 보이기 시작할 때(13일 정맥내), hNSLC 및 hNPC(각 마우스당 200㎕ PBS 중의 1.5 ×106개 세포)를 고리를 통한 정맥내 단일 주사에 의해 제공하였다. 각 동물 그룹에 인간 세포의 임의의 거부를 피하기 위하여 세포의 주사 1일 전 및 이식일로부터 매일 사이클로스포린(10㎎/kg/일)을 제공하였다. 단독의 PBS 만을 복강 내로 주사한 모의-처리된 연령-, 성별- 및 스트레인-매치된 마우스를 대조군으로 사용하였다. 동물의 모든 그룹을 43일 동안 관찰하였다. 동물을 처리 후 43일에 희생시키고, 뇌 및 척수를 PBS 중의 30% 수크로스에 수집하였다. 임상 점수의 통계적 분석으로, EAE의 임상적 증후가 대조군 및 hNPC-주사 모델에 비해 SLC-주사 동물에서 유의미하게 약화된 것으로 드러났다. 누적 점수는 NSLC 이식된 동물(도 13)에서 유의미하게 감소되었으며, 치료는 체중에는 영향을 갖지 않았다.
2) 반신마비 동물 모델(성체 래트에서 좌측 감각운동 피질의 한쪽의 절제).
실험을 위한 모든 적절한 동물 승인을 수득한 후에, 그룹당 8마리의 래트(스프래그-다우리(Sprague-Dawley, 250-300g, 찰스 리버)를 케타민(Bimeda-MTC)/자일라진(50/10㎎/kg, 노보팜(Novopharm))을 사용하여 마취시키고, 스테레오탁식 프레임(stereotaxic frame)에 두었다. 멸균 외과용 스칼펠 블레이드(scalpel blade)를 사용하여 정중선 두개 절개를 수행하고, 두개골을 노출시키고, 브레그마를 확인하였다. 감각운동 피질 위의 두개골을 개방하고, 감각운동 피질 영역[0.5-4.0㎜ 미측 내지 브레그마, 및 1.8-3.8 ㎜ 측면 내지 정준선(Paxinos and Watson 1986)]을 조심히 흡입하였다. 절제 후에, 처리(알긴산염, 알긴산염 + hNPC, 알긴산염 + NSLC, RMx + NSLC, RMxOnly, 피브린 겔 또는 식염수)를 절제 후에 뇌에 직접 적용하였다. 그 다음, 두개골 내의 개구를 골 왁스(Bone Wax)로 리드하였다. 채혈의 경우에, 작은 조각의 멸균 항상성 조직을 병변 내로 삽입하여, 채혈을 중단하였다. 에티콘(Ethicon)(상표명) 단섬유 봉합 1/2 원 침상형을 사용하여 봉합을 수행하였다. 수술을 멸균 클린 룸(clean room)에서 수행하고, 국소 항생제(시카트린(Cicatrin)(상표명), 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))를 노출된 두개골 및 두피에 적용하여, 국소 감염을 제한하였다. 래트를 수술 전날에 시작하여 연구 기간의 마지막까지 사이클로스포린 A(10㎎/kg/일)를 매일 복강내 주사에 의해 면역억제시켰다. 사이클로스포린 A 주사의 목적은 치료에 대한 래트의 면역 반응을 감소시키는 것이었다. 연구의 마지막까지 면역-억제를 유지하여, 임의의 가능한 재생 실패(발생한다면)가 치료에 대한 면역 반응 때문이 아니었음을 보장하였다. 기능 점수를 모든 그룹에서 주마다 수행하고, 후술되는 바와 같은 행동 시험에 기초하여 기능장애를 평가하였다.
로타로드 시험: 모든 절차 전에 로타로드 속도를 10 및 20RPM에 대하여 수동으로 조정하였다. 동물은 동물 자체를 환경에 적응시키기 위하여 30초 동안 정지 로드(rod) 상에 자리잡게 하는 것이 필요하다. 이 시간 동안, 임의의 동물이 떨어진다면, 이것이 30초의 기간 동안 정지 능력을 달성할 때까지, 이를 다시 로드 상에 배치하였다. 동물에 3가지 시험을 허용하였다. 정지 로드 상에서 편안하게 머물렀던 동물을 60초 동안 10 및 20RPM의 고정 속도로 달리게 하고, 낙하 수를 전자적으로 기록하였다.
평균대 걷기( Beam walking ): 평균대 걷기에 의해, 100㎝ 평균대(직경 2.3 ㎝, 바닥으로부터 48㎝ 떨어져 있음)를 가로질러 이동하는 거리의 수단에 의하여 뒷다리 조화를 측정하였다. 래트를 과업을 완료하기 위한 목적으로 시작부터 끝까지 상승된 평균대를 따라 걷도록 조직적으로 훈련시켰다. 안전한 위치, 즉, 평평한 상자를 평균대의 끝에 두어, 래트가 과업을 완료하도록 동기화시켰다.
Figure pct00087
수술 전에, 모든 마우스는 로타로드로부터 적어도 1회 낙하하였으며, 이는 이들이 보행 또는 조화 문제를 가져서가 아니라, 속도가 높았었기 때문이다. 수술 후에(2일), 모든 동물은 로타로드로부터의 낙하 수의 증가를 야기하는 유의미한 보행 및 조화 문제의 증후를 보였다. 수술 3주 후에, 대조군에 비하여 치료로서 NSLC를 받은 동물에 대하여 낙하 수가 명백하게 감소하였다(도 14).
동물은 수술 전에는 어떠한 어려움 없이, 평균대 걷기 시험을 통과하였다. 래트는 100㎝ 평균대를 가로질렀으며, 평균대로부터의 낙하 없이, 안전한 지점에 도달했다. 수술 2일 후에, 모든 그룹은 완전히 시험을 통과하지 못하였으며, 동물은 평균대에서 균형을 유지할 수 없었다. 수술 1주 후에, 모든 동물은 그들의 보행 능력에서 일부 개선을 보였으나, 상이한 처리군 간에 유의미한 차이를 알아차릴 수 없었다. 4주 내지 26주까지, NSLC뿐 아니라 RMx로 처리한 동물은 대조군에 비해 그들의 보행 능력의 유의미한 개선을 보였다(도 15).
실시예 XVIII
중내배엽 -유사 세포로의 재프로그램화를 위한 셔틀(등록 상표) 디바이스를 사용한 다양한 유전자 조합에 의한 HFF 의 트랜스펙션 및 상이한 소분자로의 처리
HFF 세포를 EGF(5ng/㎖) 및 FGF(10ng/㎖) 만을 변형하여, 실시예 I에 기재된 바와 같이 CDM II 배지에서 기재된 바와 같이 배양하고, 실시예 IV에 기재된 절차를 사용하여 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. 세포를 표 29에 기재된 바와 같은 다양한 cDNA 클론의 조합으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 0.1% 겔라틴-코팅된 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 배지를 표 30에 따라 격일로 교환하였다. 세포를 4일에 정량적 리얼-타임 PCR에 의해 분석하였다.
Figure pct00088
Figure pct00089
세포를 4일에 TrypLE(상표명)로 분리시킨 다음, 80xg에서 5분 동안의 원심분리에 의해 수집하였다. 상층액을 흡입하고, RNA 분리에 대한 준비가 될 때까지 세포 펠렛을 -86℃에서 동결시켰다. RNA 분리 및 정량화를 이전에 실시예 I에 기재된 바와 같이 수행하였다. cDNA를 준비하고, 하기의 Taqman(상표명)(등록 상표) 유전자 발현 검정법(어플라이드 바이오시스템즈)을 사용한 것을 제외하고는 이전에 실시예 II에 기재된 바와 같이, 정량적 리얼-타임 PCR을 수행하였다:
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
중내배엽-유사 세포의 형성을 유도할 수 있는 유전자 조합의 확인을 Oct4, Sox17, FoxD3, T, Mixl1, FoxA2 및 MBD2의 조합으로의 트랜스펙션에 의해 조사하였다. 표 25 및 26에 나타낸 바와 같이, 둘 모두 중내배엽/내배엽/중배엽 마커인 CXCR4 및 GATA4의 상대 발현은 다양한 조합에서, 가장 눈에 띄게는 FoxD3/Mixl1/MBD2 및 FoxD3/Sox17/MBD2에서 상향-조절되는 것으로 나타났다. 유사하게, 내배엽 및 중배엽에 대한 마커인 FOXA2는 상향-조절된 FoxD3/Sox17-트랜스펙션된 샘플이었으나, 발현은 여전히 매우 낮다. 트랜스펙션 4일 후에, SOX17은 SOX17-트랜스펙션된 샘플에서 여전히 크게 발현된다(미처리 HFF 샘플에 비해 50,000 내지 400,000배). SOX17 유전자 발현은 트랜스펙션 4일 후에 여전히 남아있는 잔재 플라스미드 DNA(외인성 SOX17) 및 유도되었을 수 있는 임의의 내인성 SOX17 발현을 나타낸다. 외배엽 마커인 CDH1, p63 및 Sox2도 또한 일부 샘플(예컨대, Oct4/FoxD3/MBD2, Oct4/Sox17/MBD2)에서 상향-조절되었다.
HFF의 췌장 선구세포-유사 세포로의 재프로그램화: HFF 세포를 실시예 I에 기재된 바와 같이 배양하고, 실시예 IV에 기재된 절차에 따라 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다. 세포를 표 27에 기재된 바와 같은 다양한 cDNA 클론의 조합으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 피브로넥틴-코팅된 콜라겐 겔 상에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 피브로넥틴-코팅된 콜라겐 겔 플레이트를 트랜스펙션 전에 제조하였다. 래트 테일 콜라겐(Rat Tail Collagen) I(지브코)을 10×PBS 및 증류수를 사용하여 1.125㎎/㎖로 희석하였으며, 여기서, 125㎕를 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 1×PBS로 헹군 후에, 피브로넥틴(BD 사이언스즈)을 1.9㎍/웰의 농도로 겔의 상측에 첨가하였다. 배지를 표 33에 따라 격일로 교환하였다. 세포를 7일에 정량적 리얼-타임 PCR에 의해 분석하였다.
Figure pct00094
세포를 7일에 수집하고, RNA 분리 및 정량화를 이전에 실시예 I에 기재된 바와 같이 수행하였다. cDNA를 준비하고, 하기의 Taqman(상표명)(등록 상표) 유전자 발현 검정법(어플라이드 바이오시스템즈)을 사용한 것을 제외하고는 이전에 실시예 II에 기재된 바와 같이, 정량적 리얼-타임 PCR을 수행하였다:
Figure pct00095
췌장 선구세포-유사 세포의 형성을 유도할 수 있는 유전자 조합의 확인을 FoxD3, Sox17, Pdx1, Ngn3, Mixl1 및 MBD2의 조합으로의 트랜스펙션에 의해 조사하였다. 내배엽 및 중배엽에 대한 마커인 FoxA2는 GFP 모의-트랜스펙션된 대조군 샘플에 비해 FoxD3/Sox17/Ngn3/MBD2-트랜스펙션된 샘플에 대하여 약간 상향-조절되었다. 유사하게, 또한 내배엽 및 중배엽에 대한 마커인 CXCR4는 FoxD3/Mixl1/Ngn3/MBD2-트랜스펙션된 샘플에 대하여 약간 상향-조절되었다(GFP-대조군에 비해 3배). 트랜스펙션 7일 후에, SOX17은 여전히 SOX17로 트랜스펙션된 샘플에 대해 다양한 수준(GFP-대조군에 비해 4 내지 570배 상향-조절)으로 검출될 수 있다. 가장 높은 SOX17 발현 상향-조절은 Sox17/Mixl1/Pdx1/Ngn3으로 트랜스펙션된 샘플(GFP-대조군에 비해 570배)에 대해 검출되며, 이는 이러한 유전자 조합이 세포에서 SOX17 RNA의 양을 증가시킬 수 있는 것을 시사할 수 있다.
실시예 XIX
인간 지방세포 유래의 줄기 세포( ADSC )의 만능-유사 줄기 세포( PLSC )로의 재 프로그램화: ADSC(인비트로젠 코포레이션)를 완전 스템프로(상표명) -43 배지(인비트로젠)가 있는 세포 배양 플라스크에서 37℃, 5% CO2에서 배양하고, 배지를 주 3회 교환하였다. 배양에서 3일 후에, 세포(계대 5)를 트립신처리하고, 트랜스펙션시키기 위하여 계수하였다. 세포를 실시예 II에 기재된 바와 같이 뉴클레오펙터(상표명)를 사용하여, 하나의 플라스미드: pCMV6-Oct4-2A-Klf4-2A-Nanog, pCMV-Sall4-2A-Oct4-2A-Klf4-2A-Nanog, pCMV-Dax1-2A-Oct4-2A-klf4, pCMV-FoxD3-2A-Oct4-2A-klf4, pCMV-Oct4-2A-Klf4-2A-Sall4, pCMV-MBD2-2A-Oct4-2A-Klf4-2A, pCMV-AGR2-2A-Oct4-2A-Klf4-2A 또는 Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4 (2g); 또는 2개의 플라스미드: pEF-Oct4nuc-IRES2-MBD2와 함께 pCMV-Sox2nuc-IREC-Lin28 또는 pCMV-Klf4nuc-IRES2-Tpt1nuc 또는 pEF-Stella-IRES2-NPM2로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 50:50 비의 지방세포 완전 배지(스템프로(상표명) -43) 및 배아 줄기 세포 배지(mTeSR1)가 있는 현탁액 중에 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 배양에서 2일 후에, 세포를 상기에 열거된 동일한 플라스미드로 다시 트랜스펙션시키고, 세포를 티아조비빈(0.5μM), ALK-5 억제제(SB 341542, 스템젠트, 2μM) 및 MEK의 억제제(PD0325901, 스템젠트, 0.5μM)가 보충된 mTesR 완전 배지의 존재 하에서 매트리겔(상표명)(BD 바이오사이언스즈)로 코팅된 96-웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 배지를 격일로 교환하고, 세포를 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 22일 동안 배양하였다. 알칼리성 포스파타제 검출 키트(AP, 밀리포어) 및 면역조직화학을 수행하여, 만능성 마커의 발현을 분석하였다. ALP 염색을 제조처의 지시에 따라 AP 검출 키트(밀리포어)를 사용하여 수행하였다.
재프로그램화된 세포의 가시적 관찰을 트랜스펙션 후 6일에 시작하여, 그 이후 매 5일 마다 SSEA-4647(BD 바이오사이언스즈) 및 TRA-1-81555(BD 바이오사이언스즈)에 대한 생세포 염색을 사용하여 셀로믹스(상표명)에 의해 수행하였다. SSEA-4 및 TRA1-81로 양성으로 염색된 PLSC의 재프로그램화된 콜로니가 오직 플라스미드 pCMV-Sall4-2A-Oct4-2A-Klf4-2A-Nanog, pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP, pEF-Oct4nuc-IRES1-MBD2와 함께 pCMV-Sox2nuc-IRES1-Lin28 및 pEF-Oct4nuc-IRES1-MBD2와 함께 pCMV-Klf4nuc-IRES2-Tpt1nuc에서만 관찰되었다. 이들 콜로니는 대략 6일에 출현하였으며, 안정적인 형태와 함께 연구 기간의 마지막(22일)까지 배양에서 유지되었다. 상술된 플라스미드 중에 특히, pCMV-Sall4-2A-Oct4-2A-Klf4-Nanog 및 pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP는 가장 많은 콜로니 수를 제공하였다. 생세포 염색은 이들 콜로니가 SSEA-4 및 TRA1-81을 비롯한 전형적인 만능성 마커를 발현하는 것을 보여주며, 이들 콜로니의 추가의 분석은 콜로니가 또한 다른 ESC 마커, 예컨대 알칼리성 포스파타제 및 Oct4를 발현하는 것을 보여준다(도 16). 배양물을 최대 22일 동안 PD0325901 및 SB431542로 처리하는 경우, 통상적인 방법에 대한 효능의 4배 개선이 ADSC의 pCMV-Sall4-2A-Oct4-2A-Klf4-Nanog 및 pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP로의 트랜스펙션 후에 수득되었다.
이전의 연구에 기초하여, 가장 높은 재프로그램화 효능이 pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP 및 pCMV-Sall4-2A-Oct4-2A-Klf4-2A-Nanog를 사용하여 관찰되었다. 다른 여구를 설계하여, 재프로그램화 효능에서의 pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP의 효과를 확인하고, 상이한 조합에서 개별 만능 유전자 Rex1, Oct4 및 Klf4의 효과를 조사하였다. ADSC를 상기와 같이 pEF-Rex1-EF-Oct4-2A-Klf4-2A-RFP, pCMV6-XL5-Rex1, pCMV6-XL4-Oct4/pCMV6-XL5-Klf4, pCMV6-XL5-Rex1/pCMV6-XL4-Oct4 또는 pCMV6-XL5-Rex1/pCMV6-XL5-Klf4로 트랜스펙션시켰다. 2차 트랜스펙션 후에, ADSC를 SB341542 및 PD 0.325901이 보충된 mTeSR1 배지의 존재 하에서 매트리겔(상표명)이 코팅된 96-웰 플레이트에서 24일 동안 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 배양하였다. 트랜스펙션 후에 세포의 하위집단을 특성화하기 위하여, 생세포 염색, 면역조직화학 및 AP 염색을 사용하여, 만능 유전자에서의 변화를 추적하였다. Rex1/Oct4 또는 Rex1/Klf4로 트랜스펙션된 전체 세포의 1-5%가 SSEA4+ 및 TRA-1-81+ 표현형을 보여주었으며, 이러한 패턴은 연구 기간의 마지막(22일)까지 안정적이었다. 시간에 걸친 관찰은 이들 콜로니의 표현형이 22일까지 조기 SSEA-4+ 표현형으로부터 후기 Oct4+/Sox2/Nanog+ 표현형으로 이동한 것으로 보여주었으며, 이는 만능-유사 줄기 세포의 최종 재프로그램화된 상태에 더 가까운 것이다(도 17).
다양한 유전자를 만능-유사 세포에 대한 재프로그램화 효능에서의 그들의 효과에 대하여 시험하였다. ADSC 세포를 스템프로(상표명) MSC SFM 배지에서 2일의 VPA 및 5-AZA 전처리(각각 1mM 및 0.5μM)와 함께 실시예 IX에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포를 실시예 IV에 기재된 절차에 따르고, 트랜스펙션 프로그램 EW-104를 사용하여 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) 96-웰 셔틀(등록 상표) 디바이스(론자)를 사용하여 표 34에 기재된 DNA 믹스로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 매트리겔(상표명)(BD 바이오사이언스즈) 코팅된 24 웰 플레이트 상의 실시예 A에 기재된 스템프로(상표명) MSC SFM 배지에서 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2, 5% O2에서 인큐베이션시켰다. 1일에, 배지를 75% 스템프로(상표명) MSC 및 25% hES 세포 배지의 믹스로 교환하였고; 스템프로(상표명) MSC의 백분율을 4일까지 100% hES 세포 배지가 되도록 4일에 걸쳐 매일 감소시켰다. 그때부터, 배지를 2일 마다 교환하였다. hES 세포 배지는 20% 낙아웃(Knockout)(상표명) 혈청 대체물(KSR, 인비트로젠), 1mM GlutaMAX(상표명), 100μM 비필수 아미노산, 100μM β-머캅토에탄올 및 10ng/㎖ Fgf-2가 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM, 인비트로젠)로 이루어져 있다. 상이한 억제제 및 성장 인자를 실험의 과정을 통해 첨가하고; 이들은 표 34에 열거되어 있다. 세포를 면역조직화학 분석에 의해 7일 및 14일에, 그리고 RT-PCR에 의해 7일에 분석하였다.
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
트랜스펙션 후에, 세포의 하위집단을 특성화시키기 위하여, 생세포 염색, 면역조직화학 및 AP 염색을 수행하여, 만능성 마커의 변화를 추적하였다. Oct4/UTF1/MBD2, Oct4/Dppa4/MBD2, FoxD3/Dppa4/MBD2, Oct4/FoxD3/Dppa4 또는 Sox2/FoxD3/UTF1 중 어느 하나로 트랜스펙션시킨 세포는 TRA1-60, TRA1-81 및 SSEA4에 대하여 양성의 콜로니를 보여주었다. 이러한 관찰에 의해, MBD2가 Oct4/FoxD3/MBD2 트랜스펙션의 경우를 제외하고는, 일반적으로 만능-유사 세포를 향한 재프로그램화에서 그 자체가 효과를 갖지 못하는 것으로 나타났다. 콜로니는 7일에 형성되기 시작하였으며, 14일(연구 기간의 마지막)까지 형성되었다(도 18). 이들 콜로니는 또한 AP에 대해서 양성이었다.
이들 결과를 RT-PCR 분석에 의해 확인하였으며, 표 35에 나타낸 바와 같이 Oct4 발현의 상향-조절을 보여준다. 또한, SOX2에 대한 상대 발현은 세포의 Oct4/Foxd3/MBD2로의 트랜스펙션 후 7일에 약간 상향-조절되었다. 또한, Oct4/Sox2/Foxd3 및 Oct4/Foxd3/Utf1으로의 트랜스펙션 후에 Sox2 상향-조절의 경향이 있다.
Figure pct00099
3중의 트랜스펙션 (매 3일 마다 1회의 트랜스펙션) 후에 HFF 에서 규정된 만능성 인자의 재프로그램화 효능
HFF 세포를 각각 2mM 및 2.5μM인 VPA 및 5-AZA의 농도를 제외하고, 실시예 I에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포를 DN의 양을 제외하고, 실시예 II에 기재된 절차에 따라 뉴클레오펙터(상표명)(등록 상표) II 디바이스(론자)를 사용하여 트랜스펙션시켰다: 1㎍의 각각의 3개의 플라스미드 DNA를 사용함. VPA 및 5-Aza로 전처리한 세포 및 미처리 세포를 둘 모두 pCMV-Oct4nuc-IRES2-Sox2nuc, pCMV-Klf4nuc-IRES2-Cmycnuc 또는 pCMV-Nanognuc-IRES2-Lin28의 믹스로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 매트리겔(상표명)(BD 바이오사이언스즈) 코팅된 6 웰 플레이트 상의 VPA 및 5-AZA와 함께 또는 이것 없이 보충된 실시예 I에 기재된 섬유아세포 배지에서 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 1일 및 2일에, 배지를 VPA 및 5-AZA와 함께 또는 이것 없이 보충된 100% mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지즈)로 교환하였다. 3일 및 6일에, 각 조건으로부터의 세포를 5분 동안의 TrypLE(상표명)에서의 인큐베이션에 의해 분리하고, 계수하고, 원심분리하였다. 세포를 상기와 같이 다시 트랜스펙션시키고, VPA 및 5-AZA와 함께 또는 이것 없이 보충된 mTeSR1 배지에서 매트리겔(상표명) 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 배지를 1일 및 2일 동안 기재된 바와 같이 매일 교환하였다. 배지에는 7일 내지 14일에 Y27632(스템젠트, 10μM)를 보충하여, 유력한 재프로그램화된 세포의 생존력 및 클론 증식을 촉진시켰다. 세포를 20일에 알칼리성 포스파타제 검출 키트(밀리포어)를 사용하여, 면역조직화학 분석에 의해 분석하였다.
이러한 분석에 의해, 3회의 트랜스펙션 후에, 3개의 클론이 알칼리성 포스파타제 활성에 대하여 양성인 것으로 관찰되었으며, 둥근 세포/콜로니 형태를 보임이 드러났다. 배아 줄기(ES) 세포 마커인 SSEA-4 및 TRA-1-81에 대한 항체로의 염색에 의해, 이들 클론이 만능-유사였음이 확인되었다(도 19). 주위 HFF 세포는 이들 마커에 대하여 음성이었다. 이들 클론은 억제제(즉: VPA 및 5-AZA)를 함유하지 않았던 조건에서만 수득되었다. 예상치 않게, 이들 억제제로 처리한 조건에서는 클론이 관찰되지 않았다.
NSLC 의 만능성으로의 재프로그램화
SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 및 OCT-3/4를 비롯한 ES 세포에 특징적인 마커를 발현하는 인간 ES 세포주, BG-01로부터 유래된 NSLC 및 신경 줄기 세포를 만능성으로 재프로그램화시켰다. BG-01 세포는 이전에 문헌[Chambers SM et al., 2009]에 기재된 바와 같이 신경 줄기 세포를 향한 분화를 유도하기 위한 조건에서 배양되었다. NSLC 및 BG-01-NSC를 FGF(20ng/㎖) 및 EGF(20ng/㎖)가 보충된 증식 배지에서 배양하였다. NSLC 및 BG-01-NSC를 2개의 에피솜 벡터, pEF-Oct4nuc-IRES2-MBD2(NC1) 또는 pCMV-FoxD3-2A-Oct4-2A-Klf4(F72)에 의해 이전에 실시예 II에 기재된 바와 같이 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 수집하고, 증식 조건에서 증식 배지 및 mTeSR1 배지(50:50)의 존재 하에 비코팅된 페트리-디쉬에 37℃, 5% CO2에서 플레이팅하였다. 48시간 후에, 세포를 동일한 플라스미드로 다시 트랜스펙션시키고, 매트리겔(상표명)이 코티된 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 22일 동안 소분자 BIX01294(스템젠트, 2M) 및 BayK8644(스템젠트, 2M)가 보충된 mTeSR1 배지의 존재 하에서 배양하였다. 생세포 염색 및 면역조직화학을 수행하여, 만능성 마커에 대한 세포의 하위집단을 특성화하였다.
NSLC 및 BG-01-NSC는 7일에 시작하여 SSEA-4로 양성으로 염색되었으며, 배양에서 22일(연구의 마지막)까지 유지되었다(도 20). 10일 내에, ESC와 형태적으로 유사한 세포가 관찰되었고, 이들은 SSEA-4, TRA1-81, Nanog 및 Oct4를 포함하는 만능성 마커의 광범위한 패널을 발현하였다(도 20). 이러한 연구에 의해, 신경 줄기-유사 세포(NSLC)를 통하여 체세포로부터 만능-유사 세포를 얻기 위한 다른 방법을 확인하였다. NSLC의 유용성은 만능-유사 세포를 향한 재프로그램화에 대하여 다수의 이점을 제공할 수 있다는 것이다. 예를 들어, c-Myc와 같은 종양원성 유전자에 대한 요건을 배제하는 것은 암 세포를 유도하는 위험을 감소시킨다. 신경재생 및 신경변성 응용에 대하여, 이들 세포는 인간 만능 세포 유도를 추가로 조사하기 위한 세포의 매우 귀중한 공급원을 나타낼 수 있으며, 또한, 인간 질환을 모델링하기 위한 환자-특이적 다능 및 만능 줄기 세포를 유도하기 위한 세포의 유력한 공급원을 나타낼 수 있다.
실시예 XX
SCID 마우스에서의 기형종 형성 검정법
인간 만능 줄기 세포(SC)의 "중증의 약화된 면역-결핍"(SCID) 마우스로의 이식은 만능 줄기 세포에 대한 모든 3개의 배층을 포함하는 분화된 종양의 형성을 야기하며, 이는 자발적 인간 기형종 및 다능 줄기 세포에 대한 특수화된 조직과 유사하다. 이들 검정법은 문헌에서 만능 줄기 세포의 분화능을 나타내기 위한 표준으로 여겨지며, 치료적 응용에 적합한 SC-유래의 세포 집단 중에 안정성을 평가하기 위한 표준으로 보증된다.
실험을 위한 모든 적절한 동물 승인을 수득한 후에, 24마리의 마우스를 찰스 리버즈로부터 구입하고, 새로운 환경에 대한 적응을 위한 임의의 실험 없이, MISPRO 동물 시설에 1주 동안 가두었다. 100㎕의 인산염 완충된 염수, 무-칼슘 및 -마그네슘(CMF-PBS) 중의 100만 개의 인간 NSLC, 정상 인간 신경선구세포(hNPC) 또는 인간 배아 줄기(ES) 세포를 케타민/자일라진(그룹당 8마리 마우스)의 마취 하에서 21-G 주사를 사용하여 4주령 수컷 SCID-베이지(beige) 마우스의 우측 뒷다리에 근육내 주사하였다. 주사 후에, 배지를 함유하는 배양 디쉬에 주사기를 수회 흡입 및 배출시켜, 세포를 주사하였고, 주사기 내부에서 막힘 없음을 확실히 하였다.
마우스를 12주 동안 유지시키고, 임상 증후 및 임의의 종양 성장에 대하여 주기적으로 모니터링하였다. 임의의 특수화된 조직 또는 기형종 성장을 외부 시험 및 좌측 뒷다리에서의 동일한 근육에 비한 근육의 크기의 증가에 의해 모니터링하였다. 특수화된 조직 또는 기형종이 확인된 경우, 성장의 위치 및 크기를 측정하고(측정용 캘리퍼(caliper) 사용) 기록하였다. 특수화된 조직 또는 기형종은 통상 좌측 대조군 근육에 비한 근육 크기의 적은 성장으로서 처음 확인되었다. 동물을 임의의 종양 성장의 발생까지 주마다, 종양이 발생한 후에는 매일 모니터링하였다. 12주 후에, 마우스를 CO2 안락사에 의해 희생시켰다. 각각의 전체 동물을 동물의 어느 곳에서의 임의의 종양 성장에 대하여 관찰하고, 주사한 근육 및 비교가능한 좌측 근육 대조군을 측정한 다음(측정용 캘리퍼로)(하기 표의 결과 참조), 제거하고, 조직 분석을 위하여 4% 파라포름알데하이드에 보관하였다. 근육의 크기는 다음과 같았다:
Figure pct00100
근육의 크기의 측정에 의해, 모든 인간 배아 줄기 세포를 주사한 근육이 비교용 좌측 근육 대조군보다 더 큰 것으로 나타났으며, 이는 ES 세포 주사된 근육에서의 기형종 성장을 나타낸다. 모든 인간 신경선구세포를 주사한 근육의 대략 절반이 비교용 좌측 근육 대조군보다 더 컸으며, NSLC를 주사한 마우스는 근육들(세포로 처리하거나 그렇지 않은) 간에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. NSLC를 주사한 마우스는 어떠한 종양 또는 기형종 성장의 증거도 나타내지 않았다.
Figure pct00101
* * *
헤딩(heading)들은 특정 섹션을 위치확인(locating)하는 것을 돕기 위하여 그리고 참조로서 본 명세서에 포함된다. 이러한 헤딩들은 본 명세서에 개시되는 개념의 범주를 제한하도록 의도되지 않으며, 이러한 개념은 전체 명세서를 통해 다른 섹션들에서 응용성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 나타낸 실시형태로 한정되는 것이 아니라 본 명세서에 개시된 원리 및 새로운 특징에 부합하는 가장 넓은 범위에 따르는 것이다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태가 예시의 목적을 위한 것일 뿐이며,그의 관점에서의 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제시될 것이며, 본 발명 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함될 것임이 이해된다.

Claims (55)

  1. i) 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
    ii) 상기 제1 유형의 세포에서 적어도 하나의 재프로그램화 효능제(reprogramming agent)의 세포내 수준을 일시적으로 증가시키는 증가단계로서, 상기 일시적인 증가가 적어도 하나의 유전자 조절인자(gene regulator)의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 것인 증가 단계;
    iii) 상기 세포를 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 조건에 두고, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 상기 재프로그램화 효능제의 부재 하에서 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 단계; 및
    iv) 상기 세포를 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에서 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 유지단계로서, 상기 다수의 제2 유전자의 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, 상기 제2 유전자의 적어도 하나가 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않고, 상기 기간의 마지막에 제1 유형의 세포가 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 전환되는 것인 유지단계를 포함하는, 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수득되는 상이한 유형의 목적으로 하는 세포가 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 특징으로 하는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 화합물 또는 소분자인 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 수탁 번호가 표 A에 열거되어 있는 진뱅크(GenBank)(상표명), 유니프로트(UniProt)(상표명)/스위스-프로트(Swiss-Prot)(상표명) 또는 유니진(UniGene)(상표명) 서열의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법: 무사시1(Msi1); Msi1 및 뉴로게닌 2(Ngn2); Msi1 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2); Ngn2 및 MBD2, 및 Msi1, Ngn2 및 MBD2.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 폴리펩티드이며, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는 단계가 상기 폴리펩티드를 세포내로 전달하는 것을 포함하는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 전달되는 폴리펩티드가 트랜스펙션(transfection)에 의해 세포내로 전달되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 수탁 번호가 표 A에 열거되어 있는 진뱅크(상표명), 유니프로트(상표명)/스위스-프로트(상표명) 또는 유니진(상표명) 서열의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 제2 유전자가 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 군으로부터 선택되며, 해당 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 수탁 번호가 표 A에 제공된 진뱅크(상표명), 유니프로트(상표명)/스위스-프로트(상표명) 또는 유니진(상표명) 수탁 번호에서 열거되어 있는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적인 제2 유전자의 발현이 하기의 표에 따라 정의된 하나 이상의 마커의 발현을 특징으로 하는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법:
    Figure pct00103
  11. 제2항에 있어서, 발현이 안정적으로 억제되는 상기 다수의 유전자가 표 C에 열거된 유전자에 따라 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제가 표 C에 정의된 바와 같은 상응하는 세포 마커의 소실을 특징으로 하는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)가 단계 iii) 이후에 또는 단계 iii)과 동시에 수행되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 상기 세포의 염색질 및/또는 DNA를 리모델링할 수 있는 효능제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 염색질 및/또는 DNA를 리모델링할 수 있는 효능제가 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 탈메틸화제, DNA 메틸화의 억제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 DNA 메틸화의 억제제가 5-아자시티딘, 5-아자-2-데옥시시티딘, 1-β-D-아라비노푸라노실-5-아자시토신, 다이하이드로-5-아자시티딘, 제부라린(zebularine) 및 RG108로 이루어진 군으로부터 선택되며; 히스톤 탈아세틸화의 억제제가 발프로산, 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, Na-부티레이트, 벤즈아미드 및 사이클릭 테트라펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, DNA 탈메틸화제가 MBD2인 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유형의 세포를 세포골격 파괴물질(disruptor)로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유형의 세포가 생식 세포, 배아 줄기 세포 및 이의 유도체, 성체 줄기 세포 및 이의 유도체, 선구세포(progenitor cell) 및 이의 유도체, 중배엽, 내배엽 또는 외배엽으로부터 유래된 세포 및 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 계통의 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유형의 세포가 지방-유래의 줄기 세포, 간충직 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 피부 유래의 전구세포(precursor cell), 모공 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 표피 세포, 내피 세포, 상피 세포, 과립막 상피 세포, 멜라닌세포, 지방세포, 연골세포, 간세포, B 림프구, T 림프구, 과립구, 대식구, 단구, 단핵 세포, 췌장도 세포(pancreatic islet cell), 세르톨리 세포, 뉴런, 신경교세포, 심근 세포 및 다른 근세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 유형의 제2 세포가 생식 세포, 배아 줄기 세포 및 이의 유도체, 성체 줄기 세포 및 이의 유도체, 선구세포 및 이의 유도체, 중배엽, 내배엽 또는 외배엽으로부터 유래된 세포 및 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 계통의 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 유형의 제2 세포가 지방-유래의 줄기 세포, 간충직 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 피부 유래의 전구세포, 모공 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 표피 세포, 내피 세포, 상피 세포, 과립막 상피 세포, 멜라닌세포, 지방세포, 연골세포, 간세포, B 림프구, T 림프구, 과립구, 대식구, 단구, 단핵 세포, 췌장도 세포, 세르톨리 세포, 뉴런, 신경교세포, 심근 세포 및 다른 근세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적으로 하는 세포가 신경 줄기-유사 세포(Neural Stem-Like Cell: NSLC)이며, 세포를 NSLC의 전환을 지지하는 배양 조건에 두는 단계가 세포를 레티노이드 화합물, 향신경성 인자, bFGF, EGF, SHH, Wnt3a, 전환 성장 인자 알파, 뉴로펩티드 Y, 에스트로겐, 리튬 및 L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 유형의 세포가 지방-유래의 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 섬유아세포 및 각질형성세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  24. - 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 증가시키는 증가단계로서, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 목적으로 하는 제2 유형의 세포에 특징적인 형태 및/또는 기능적 특성의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도하기 위해 선택되는 것인 증가단계; 및
    - 상기 제1 유형의 세포를 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 목적으로 하는 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에서 유지하는 유지단계로서, 해당 제2 유전자의 발현이 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, 상기 제2 유전자 중 적어도 하나가 배아 줄기 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이지 않은 것인 유지단계를 포함하되,
    상기 기간의 마지막에, 상이한 유형의 목적으로 하는 세포가 수득되며, 상기 수득된 세포가 추가로 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 특징으로 하는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 전환 방법.
  25. i) 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
    ii) 상기 세포 내에서, 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 일시적으로 증가시키는 단계로서, 상기 일시적인 증가가 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 것인 단계;
    iii) 상기 세포를 줄기-유사 세포의 전환을 지지하는 조건에 두고, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준을 재프로그램화 효능제의 부재 하에서 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 단계;
    iv) 상기 세포를 상기 줄기-유사 세포의 전환을 지지하는 배양 조건에 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 유지하는 단계로서, 해당 제2 유전자의 발현이 상기 줄기-유사 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, 상기 제2 유전자 중 적어도 하나가 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않으며, 상기 기간의 마지막에, 줄기-유사 세포가 수득되는 것인 단계를 포함하는 줄기-유사 세포(Stem-Like Cell: SLC)의 수득 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 줄기-유사 세포가 신경 줄기-유사 세포(NSLC)이며, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 무사시1(Msi1); Msi1 및 뉴로게닌 2(Ngn2); Msi1 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2); Ngn2 및 MBD2; 및 Msi1, Ngn2 및 MBD2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자가 Sox2, 네스틴 및 Msi1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 줄기-유사 세포(SLC)의 수득 방법.
  27. - 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
    - 하나 이상의 하기의 폴리펩티드를 일시적으로 발현할 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계: 무사시1(Msi1) 폴리펩티드; 무사시1(Msi1) 및 뉴로게닌 2(Ngn2) 폴리펩티드; 무사시1(Msi1) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 폴리펩티드; 뉴로게닌 2(Ngn2) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2); 무사시1(Msi1), 뉴로게닌 2(Ngn2) 폴리펩티드 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 폴리펩티드; 및
    - 세포를 NSLC로의 전환을 지지하는 배양 조건에 다수의 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 하는 충분한 기간 동안 두는 배치단계로서, 해당 유전자의 발현이 NSLC의 표현형 및 기능적 특성에 특징적인 것인 배치단계를 포함하되;
    상기 기간의 마지막에, NSLC가 수득되며, 상기 수득된 NSLC가 추가로 상기 제1 세포 유형에서 발현되는 다수의 유전자의 안정적인 억제를 특징으로 하는 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포를 NSLC의 전환을 지지하는 배양 조건에 두는 단계가 세포를 레티노이드 화합물, 향신경성 인자, bFGF, EGF, SHH, Wnt3a, 전환 성장 인자 알파, 뉴로펩티드 Y, 에스트로겐, 리튬 및 L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  29. - NSLC가 아닌 제1 유형의 세포를 제공하는 단계;
    - 적어도 하나의 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 증가단계로서, 상기 폴리펩티드가 상기 제1 유형의 세포의 NSLC로의 직접적인 또는 간접적인 전환을 추진할 수 있는 것인 증가단계; 및
    - 제1 유형의 세포의 염색질 및/또는 DNA를 히스톤 아세틸화제, 히스톤 탈아세틸화의 억제제, DNA 탈메틸화제 및/또는 DNA 메틸화의 화학적 억제제와 접촉시키는 접촉단계로서, 신경 줄기-유사 세포(NSLC)가 수득되는 것인 접촉단계를 포함하는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 유형의 세포를 세포골격 차단물질로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 신경 줄기 세포 특이적 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시키는 단계가 제1 유형의 세포를 무사시1(Msi1) 폴리펩티드; 무사시1(Msi1) 및 뉴로게닌 2(Ngn2) 폴리펩티드; 무사시1(Msi1) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 폴리펩티드; 뉴로게닌 2(Ngn2) 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 폴리펩티드; 또는 무사시1(Msi1), 뉴로게닌 2(Ngn2) 폴리펩티드 및 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2) 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시키는 것을 포함하는 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 메틸화의 억제제가 5-아자시티딘, 5-아자-2-데옥시시티딘, 1-β-D-아라비노푸라노실-5-아자시토신, 다이하이드로-5-아자시티딘, 제부라린 및 RG108로 이루어진 군으로부터 선택되며; 히스톤 탈아세틸화의 억제제가 발프로산, 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, Na-부티레이트, 벤즈아미드 및 사이클릭 테트라펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, DNA 탈메틸화제가 MBD2인 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 NSLC의 형태 및 기능적 특징의 유지, 지지 및/또는 유도에 적절한 하나 이상의 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 인자가 레티노이드 화합물, 향신경성 인자, bFGF, EGF, SHH, Wnt3a, 전환 성장 인자 알파, 뉴로펩티드 Y, 에스트로겐, 리튬 및 L-아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 NSLC가 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법:
    - Sox2, 네스틴, GFAP, Msi1 및 Ngn2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 신경 줄기 세포 마커의 발현;
    - 제1 유형의 세포에 특이적인 하나 이상의 유전자의 발현 감소;
    - 뉴로스피어 콜로니 형성 검정에서 뉴로스피어를 형성;
    - 현탁액에서 또는 부착 배양으로서 배양될 수 있음;
    - 외인성 재프로그램화 효능제의 존재 없이 1개월 초과 동안 증식할 수 있음;
    - 낮은 계대에서 매 36시간마다 분열할 수 있음;
    - 텔로머라제 활성에 대하여 양성;
    - 신경-유사 세포, 성상세포-유사 세포, 희소돌기아교세포-유사 세포 및 이들의 조합으로 분화할 수 있음;
    - 텔로머라제의 발현 및 하나 이상의 신경 줄기 세포 마커의 감소;
    - 길이가 하나의 세포 직경을 초과하는 하나 이상의 형태적 신경돌기-유사 융기(축삭 및/또는 수지상 돌기)를 가짐;
    - 신경-특이적 튜불린, 미세소관 관련 단백질 2, NCAM 및 신경전달물질에 대한 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신경-특이적 항원의 발현;
    - 하나 이상의 작용성 신경 마커의 발현;
    - 하나 이상의 향신경성 인자를 분비할 수 있음;
    - 종양 콜로니 형성 검정에서 음성;
    - SCID 마우스에서 종양 성장에 대하여 음성;
    - SCID 마우스에서 기형종 성장에 대하여 음성;
    - 뇌 절제 모델에서 적절한 수의 NSLC의 공극으로의 배치 후에 하나 이상의 기능적 측정치를 유의미하게 향상시킬 수 있음;
    - 적절한 수의 NSLC의 EAE 모델로의 주사 후에 하나 이상의 기능적 측정치를 유의미하게 향상시키거나 유지할 수 있음; 및
    - CNS 손상 또는 신경변성 모델에서 hNPC보다 더 유의미하게 하나 이상의 기능적 측정치를 향상시킬 수 있음.
  36. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득된 NSLC가 하기의 특징 모두를 갖는 것인 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법:
    - 체세포보다 유의미하게 더 긴 자가-재생능;
    - 암 세포가 아님;
    - 안정적이며, 강제 유전자 발현에 의해 또는 유사한 수단에 의해 인공적으로 유지되지 않고, 표준 신경 줄기 세포 배지에서 유지될 수 있음;
    - 선구세포, 전구세포, 체세포 또는 동일한 계통의 다른 더 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있음;
    - 줄기 세포의 특징을 가지며, 특정 마커 또는 유전자 발현 또는 형태적 외양을 아직은 가지지 않음; 및
    - 생체 내에서 비제어된 성장, 기형종 형성 및 종양 형성을 나타내지 않음.
  37. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 NSLC가 수득되며, 상기 다수의 NSLC가 3차원 구조 내에서 조직화되는 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  38. - 비-NSLC를 수득하는 단계;
    - 상기 비-NSLC를 MBD2 폴리펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 무사시1 폴리펩티드를 암호화하고/하거나 NGN2 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 제2 폴리뉴클레오티드와 공동-트랜스펙션시키는 단계;
    - 상기 공동-트랜스펙션된 세포를 NSLC가 수득될 때까지, NSLC로의 전환을 지지하는 배양 조건에 두는 단계를 포함하는 비-NSLC로부터의 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 비-NSLC가 각질형성세포, 지방세포 유래의 줄기 세포(Adipocyte Derived Stem Cell: ADSC) 및 인간 조혈 줄기 세포로부터 선택되는 것인 비-NSLC로부터의 신경 줄기-유사 세포(NSLC)의 수득 방법.
  40. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 세포주.
  41. 하기의 특징 모두를 갖는 줄기-유사 세포:
    - 체세포보다 유의미하게 더 긴 자가-재생능;
    - 암 세포가 아님;
    - 안정적이며, 강제 유전자 발현에 의해 또는 유사한 수단에 의해 인공적으로 유지되지 않고, 표준 신경 줄기 세포 배지에서 유지될 수 있음;
    - 선구세포, 전구세포, 체세포 또는 동일한 계통의 다른 더 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있음;
    - 줄기 세포의 특징을 가지며, 특정 마커 또는 유전자 발현 또는 형태적 외양을 아직은 가지지 않음; 및
    - 생체 내에서 비제어된 성장, 기형종 형성 및 종양 형성을 나타내지 않음.
  42. 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 신경 줄기-유사 세포(NSLC):
    - Sox2, 네스틴, GFAP, Msi1 및 Ngn2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 신경 줄기 세포 마커의 발현;
    - 제1 유형의 세포에 특이적인 하나 이상의 유전자의 발현 감소;
    - 뉴로스피어 콜로니 형성 검정에서 뉴로스피어를 형성;
    - 현탁액에서 또는 부착 배양으로서 배양될 수 있음;
    - 외인성 재프로그램화 효능제의 존재 없이 1개월 초과 동안 증식할 수 있음;
    - 낮은 계대에서 매 36시간마다 분열할 수 있음;
    - 텔로머라제 활성에 대하여 양성;
    - 신경-유사 세포, 성상세포-유사 세포, 희소돌기아교세포-유사 세포 및 이들의 조합으로 분화할 수 있음;
    - 텔로머라제의 발현 및 하나 이상의 신경 줄기 세포 마커의 감소;
    - 길이가 하나의 세포 직경을 초과하는 하나 이상의 형태적 신경돌기-유사 융기(축삭 및/또는 수지상 돌기)를 가짐;
    - 신경-특이적 튜불린, 미세소관 관련 단백질 2, NCAM 및 신경전달물질에 대한 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신경-특이적 항원의 발현;
    - 하나 이상의 작용성 신경 마커의 발현;
    - 하나 이상의 향신경성 인자를 분비할 수 있음;
    - 종양 콜로니 형성 검정에서 음성;
    - SCID 마우스에서 종양 성장에 대하여 음성;
    - SCID 마우스에서 기형종 성장에 대하여 음성;
    - 뇌 절제 모델에서 적절한 수의 NSLC의 공극으로의 배치 후에 하나 이상의 기능적 측정치를 유의미하게 향상시킬 수 있음;
    - 적절한 수의 NSLC의 EAE 모델로의 주사 후에 하나 이상의 기능적 측정치를 유의미하게 향상시키거나 유지할 수 있음; 및
    - CNS 손상 또는 신경변성 모델에서 hNPC보다 더 유의미하게 하나 이상의 기능적 측정치를 향상시킬 수 있음.
  43. 제42항에 있어서, 수득된 NSLC가 하기의 특징 모두를 갖는 것인 신경 줄기-유사 세포:
    - 체세포보다 유의미하게 더 긴 자가-재생능;
    - 암 세포가 아님;
    - 안정적이며, 강제 유전자 발현에 의해 또는 유사한 수단에 의해 인공적으로 유지되지 않고, 표준 신경 줄기 세포 배지에서 유지될 수 있음;
    - 선구세포, 전구세포, 체세포 또는 동일한 계통의 다른 더 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있음;
    - 줄기 세포의 특징을 가지며, 특정 마커 또는 유전자 발현 또는 형태적 외양을 아직은 가지지 않음; 및
    - 생체 내에서 비제어된 성장, 기형종 형성 및 종양 형성을 나타내지 않음.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 NSLC가 체세포, 선구세포 또는 줄기 세포의 탈분화, 전환 또는 재프로그램화로부터 유래되는 것인 NSLC.
  45. 시험관 내 배양된 세포의 3D 어셈블리(assembly)를 포함하는 인공 조직 구조물(construct)로서, 상기 3D 어셈블리가 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 목적으로 하는 세포, 제25항 또는 제26항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 SLC, 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 신경 줄기-유사 세포(NSLC), 제41항에 정의된 바와 같은 다수의 SLC 및/또는 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다수의 NSLC; 및 이들 세포에 의해 생성되는 세포외 기질을 포함하는 인공 조직 구조물.
  46. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 목적으로 하는 세포, 제25항 또는 제26항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 SLC, 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 신경 줄기-유사 세포(NSLC), 제41항에 정의된 바와 같은 다수의 SLC 및/또는 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다수의 NSLC를 제공하는 단계; 및 재생될 조직 또는 기관을 상기 다수의 목적으로 하는 세포, SLC 및/또는 NSLC와 접촉시키는 단계를 포함하는 포유동물 조직 또는 기관의 재생 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 목적으로 하는 세포, SLC 및/또는 NSLC가 재생될 조직 또는 기관에 인접하여 배치되는 포유동물 조직 또는 기관의 재생 방법.
  48. 조직 또는 기관의 회복 또는 재생을 필요로 하는 대상체에서의 조직 또는 기관의 회복 또는 재생 방법으로서, 상기 조직 또는 기관을 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 목적으로 하는 세포, 제25항 또는 제26항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 SLC, 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 수득되는 다수의 신경 줄기-유사 세포(NSLC), 제41항에 정의된 바와 같은 다수의 SLC, 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다수의 NSLC; 및/또는 제45항에 정의된 바와 같은 인공 조직 구조물과 접촉시키는 단계를 포함하는 조직 또는 기관의 회복 또는 재생을 필요로 하는 대상체에서의 조직 또는 기관의 회복 또는 재생 방법.
  49. 조직 또는 기관의 회복 또는 재생을 필요로 하는 대상체에서의 조직 또는 기관의 회복 또는 재생 방법으로서, 상기 조직 또는 기관의 세포에서 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 화합물 및/또는 상기 대상체에서 생체 내에서 전환, 탈분화할 수 있거나 재프로그램화될 수 있는 세포에서의 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 발현이 상기 세포를 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로 재프로그램화하며, 상기 상이한 유형의 세포는 상기 조직 또는 기관을 회복 또는 재생하는데 효과적인 것인, 조직 또는 기관의 회복 또는 재생을 필요로 하는 대상체에서의 조직 또는 기관의 회복 또는 재생 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 상이한 유형의 목적으로 하는 세포가 줄기-유사 세포인 조직 또는 기관의 회복 또는 재생 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 조직 또는 기관이 뇌, 척수, 심장, 안구, 망막, 와우, 피부, 근육, 장, 췌장, 신장, 간, 폐, 뼈, 골수, 연골, 연골 원반(cartilage disc), 모공, 치아, 혈관, 내분비 샘, 외분비샘, 난소, 생식 기관, 유방 조직 및 가슴 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직 또는 기관의 회복 또는 재생 방법.
  52. - 적어도 하나의 유전자 조절인자의 직접적인 또는 간접적인 내인성 발현을 유도하는 적어도 하나의 재프로그램화 효능제의 세포내 수준의 일시적인 증가;
    - 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현;
    - 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현을 포함하되,
    상기 적어도 하나의 유전자 조절인자의 내인성 발현이 상이한 유형의 목적으로 하는 세포의 존재에 필요하고,
    상기 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현은 적어도 하나의 유전자 조절인자의 안정적인 발현의 결과이며, (i) 다수의 제2 유전자의 안정적인 발현은 목적으로 하는 세포의 표현형 및/또는 기능적 특성에 특징적이며, (ii) 상기 제2 유전자 중 적어도 하나의 안정적인 발현은 배아 줄기 세포의 표현형 및 기능적 특성에 특징적이지 않으며, (i) 및 (ii)는 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 성공적인 재프로그램화를 나타내는 것인, 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 재프로그램화 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재프로그램화 효능제가 Msi1 폴리펩티드 또는 Ngn2 폴리펩티드 및 MDB2 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 재프로그램화 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자 조절인자가 Sox2, Msi1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 재프로그램화 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적으로 하는 세포가 신경 줄기-유사 세포(NSLC)이며, 제1 유형의 세포가 각질형성세포, 지방세포 유래의 줄기 세포(ADSC) 및 인간 조혈 줄기 세포로부터 선택되는 세포인 제1 유형의 세포의 상이한 유형의 목적으로 하는 세포로의 재프로그램화 방법.
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