JP2018183152A - 細胞の再プログラミングのための方法とその用途 - Google Patents

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Elayoubi Rouwayda
ルウェイダ エラヨウビ
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Abstract

【課題】細胞退行分化、形質転換及び真核細胞再プログラミングのための方法、更に、インヴィトロ退行分化及びインヴィトロ再プログラミングの工程後に、患者に移植され得る細胞、細胞系、及び組織に関する。【解決手段】特定の実施形態では、細胞は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）を含む幹様細胞（ＳＬＣｓ）である。更に、これら細胞をヒト体細胞及び他の型の細胞から再生させるための方法に関する。更に、ヒト治療及び他の分野において、このように生成された細胞を使用する組成物及び方法を記載。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとみなす、２００９年１０月３１日に出願された米国仮出願第６１／２５６，９６７号に優先権を主張するものである。
技術分野
本発明は、真核細胞再プログラミングの分野に関し、特に細胞退行分化に関する。本発明はまた、ヒト体細胞（及び他の細胞）からの安定な神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）を発生させる方法と、そのように発生された細胞のヒトの治療における用途に関する。
細胞再プログラミング
従来より、医療、科学、及び診断分野において、卵母細胞又は他の幹細胞と融合又は交換されることなく、容易に取得可能な細胞を一般的に取得が困難である細胞へと再プログラムする、或いは細胞が新しい又は異なる機能性を有するように細胞を再プログラムするための要望がある。
第１の機序によると、幹細胞は、別の幹細胞、プロジェニタ-、前駆細胞、又は体細胞へ自然に分裂又は分化し得る。第２の機序によると、特定の条件下に配置される場合、体細胞は、その表現型を一過性的に変化させるか又は特定のマ-カ-を発現することがあり、次いで元の条件に配置される際に、元に戻る。第３の機序によると、多くの細胞の表現型は、特定の遺伝子の強制発現（例えば、ｃ-ｍｙｃ遺伝子を線維芽細胞に安定してトランスフェクトし、それらを、神経プロジェニタ-特性を有する不死化細胞に戻す）を通して変化され得るが、しかしながらこの強制遺伝子発現が一旦排除されると、細胞はゆっくりとその元の状態に戻る。従って、上記の3つの機序は、真の再プログラミングとは考えられるべきではなく、第１番目は、（より退行分化した状態からより分化した状態への）既に存在している細胞プログラムの一部である自然的な分化と考えられ、第２番目は、一過性の表現型変化であり、第三番目は、一定に強制された細胞型である。真の幹細胞とは、（ｉ）ほぼ「無限に」自己再生する（体細胞よりも極めて長期間）細胞、（ｉｉ）癌性細胞ではない細胞、（ｉｉｉ）強制遺伝子発現又は同様な手段（標準的幹細胞培地中で維持されなければならないような）によって人工的に維持されない細胞、（ｉｖ）プロジェニタ-、前駆体細胞、体細胞又は他のより分化した細胞型へと分化し得る細胞、及び（ｖ）幹細胞の全ての特性を有するが、ただ特定のマ-カ-又は遺伝子発現あるいは形態学的外観を有しない細胞である。
多数の科学公開論文及び特許公開が、一般的には幹細胞への有効な再プログラミング又は退行分化を主張しているにもかかわらず、それらが上記の機序のうちの１つに該当するために、これら公開のほとんど全てが本当の意味での再プログラミングを開示していない。例えば、Ｂｈａｓｉｎ著（ＷＯ第２０１０／０８８７３５号）、Ｃｉｆａｒｅｌｌｉら著（米国特許第２０１０／０００３２２３号）、Ｋｒｅｍｅｒら著（米国特許第２００４／０００９５９５号）、及びＷｉｎｎｉｅｒら著（米国特許２０１０／００４７９０８号）の全てが、補足物質を備えた異なる培地中での培養後の再プログラミング、退行分化、及び／又は細胞表面マ-カ-における変化のみに基づいた表現型細胞の変化としての取得された幹細胞に言及していて、これらは真のサイプログラミング又は実際の幹細胞（幹細胞マ-カ-を伴い、分化マ-カ-を伴わない非癌性で自己再生可能な細胞）の証拠がない。Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２の増加した発現を用いたＢｅｎｎｅｔｉ著（ＷＯ第２００９／０７９００７号）でも同じことが言える。他には、Ａｋａｍａｔｓｕら著（ＷＯ２０１０／０５２９０４号）及びＹｏｕら著（ＷＯ２００７／０９７４９４号、米国特許第２００９／０２４６８７０）などでは、幹細胞を生成したと言及しているが、これらが不死化／腫瘍発生性ではなく、並びに一過性の代わりに安定的であるという真の幹細胞の証拠がなく、これらはレトロウイルス（ｃＭｙｃと同様）から誘導された一定の人工的遺伝子導入を経て生じたものである。他には、Ｃｈｅｎら著（米国特許第２００５／０１７６７０７号）及びＹｏｕら著（米国特許第２００９／０２２７０２３号）などでは、「多能性細胞」を言及しているが、これは幹細胞ではない。更には、これら主張された多能性細胞は安定的ではなく（Ｙｏｕら著の場合、細胞は増殖すらもできなかった）、両者ともに、一定の培地補充剤及び表現型変化を強要する条件を用いた。更に他にも、Ｏｌｉｖｅｒｉら著（ＷＯ第２００９／０１８８３２号）及びＺａｈｎｅｒら著（米国特許２００２／０１３６７０９号）などは、ゲノム全域にわたるＤＮＡ脱メチル化反応及びヒストンアセチル化を通しての多分化能性、全能性、多能性、及び／又は単分化能性の細胞の自動的な生成を記載したが、安定で、非癌性の本当の意味での細胞系の証拠はない。
本当の意味での再プログラミングは、Ｙａｍａｎａｋａのグル-プ（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）とＴｈｏｍｓｏｎのグル-プ（Ｙｕら、２００７年）によって個別に、これら以前の他のグル-プによる可能性もあるが、作り出され誘導された多分化能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を使用して達成されたと考えられているが、これら細胞の多くは、その後癌性であり、そのいくつかは癌性ではないと認められた。これら細胞が、非遺伝子組み込みの一過性トランスフェクション（Ｓｏｌｄｎｅｒら，２００９年、Ｗｏｌｔｊｅｎら，２００９年、Ｙｕら，２００９年）によって、並びに同様な方法による、ＲＮＡ（Ｗａｒｒｅｎら，２０１０年）又はタンパク質（Ｋｉｍら，２００９年、Ｚｈｏｕら，２００９年）単独によって、或いは小分子（Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓら，２００９年）によって誘導され得ることが後に示されたために、これら細胞は本当の意味での再プログラミングによって誘導され得る。しかしながら、これら細胞は本質的に胚幹細胞と同一であり、無秩序な増殖、奇形腫形成、及び腫瘍形成の可能性などの同様な問題を有する。
より好ましいオプションとしては、それらが容易に奇形腫及び無秩序増殖を形成しないようにそれらの結合及び分化能力がより制限されている多能性幹細胞又は多分化能性様細胞を有することである。従って、多能性幹細胞、多能性幹様細胞、及び幹様細胞を生成する方法、並びに容易に取得可能な細胞を、極めて望ましい多能性幹細胞、多能性幹様細胞、及び幹様細胞へと再プログラミング又は形質転換する方法の要望がある。
神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）
中枢神経系（ＣＮＳ）の修復は、医療科学が克服せねばならないフロンティアの１つである。アルツハイマ-病、パ-キンソン病、及び脳卒中などのような病状は、それに冒された人々にとって、破壊的な症状である。これら病状に関する中心的願望は、神経回路網を再構成し、神経系の機能を順次戻すことができる細胞群を開発することである。このために、神経幹細胞及びプロジェニタ-細胞に関心を向けた多大な進展がある。現在まで、多能性神経プロジェニタ-細胞は、神経制限細胞又はグリア制限細胞のいずれかに、分化経路内で初期に作用すると一般的に考えられてきた。
神経幹細胞は、疾患又は損傷からの組織再生に関する有望性を有するが、このような治療では、必要な細胞型を創り出すために、細胞機能にわたる正確な制御を必要とするであろう。細胞増殖及び分化を調節する機能の完全な理解は未だなく、従って、脳又は成長中の胎児の脳の所与の領域から誘導された神経幹細胞群の可変性を徹底的に追求することは困難である。
ＣＮＳは、制限された再生能力を有し、特に嗅球ニュ-ロンを補充する海馬の歯状回顆及び脳室下帯内において、大人では神経幹細胞の制限された数を維持すると伝統的に信じられていた（Ｓｉｎｇｅｃ Ｉら，２００７年、Ｚｉｅｌｔｏｎ Ｒ，２００８年）。前駆体細胞の利用可能性は、成熟した神経系中の欠陥の移植組織に基づく修復のための重要な必須条件である。従って、神経移植のためのドナ-細胞は、胎児の脳から大量に誘導される。免疫拒絶反応に加えて、このことが、大きな倫理的問題を生じ、並びに神経幹細胞がそれぞれの細胞分裂によってその能力のいくらかを損失し得るために、このようなアプロ-チが多数の患者の治療のために用いることができるかどうかが疑問である。
神経幹細胞は、神経変性疾患の細胞交換治療のための有望な治療的可能性を提供する（Ｍｉｍｅａｕｌｔら，２００７年）。現時点まで、ドナ-物質源としてヒト胎児組織の種々の型を開発するために、多数の治療的移植が実行されてきた。しかしながら、倫理上及び実用上の考慮並びに入手不能性が、移植治療のための細胞源としての利用可能性を制限している（Ｎｉｎｏｍｉｙ Ｍら，２００６年）。
患者に特異的な細胞の誘導への障壁及び制限を克服するために、皮膚細胞を用いて、神経幹細胞及び／又はニュ-ロンへの分化形質転換を誘導する１つのアプロ-チがあった（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら，２０００年）。分化形質転換は、過去数年間、増大する注目を集めてきていて、哺乳類細胞の分化形質転換は、共培養中又は細胞培養条件の操作によって達成された。細胞運命の改変は、細胞培養を微小線維阻害物質（Ｓｈｅａら，１９９１年）、ホルモン（Ｙｅｏｍａｎら，１９７６年）、及びカルシウムイオノホア（Ｓｈｅａ，１９９０年、Ｓａｔｏら，１９９１年）でインヴィトロ処理することによって、人工的に誘導され得る。哺乳類上皮細胞は、筋肉様形状及び機能を獲得するよう誘導され得（Ｐａｔｅｒｓｏｎ及びＲｕｄｌａｎｄ，１９８５年）、膵臓外分泌管細胞は、インシュリン分泌外分泌表現型を獲得し得（Ｂｏｕｗｅｎｓ，１９９８ａ，ｂ）、並びに骨髄幹細胞は、肝臓細胞（Ｔｈｅｉｓｅら，２０００年）及び神経細胞（Ｗｏｏｄｂｕｒｙら，２０００年）へと分化され得る。他には、細胞骨格、アセチル化及びメチル化阻害物質の存在下での体細胞の培養によって、体細胞を神経細胞へと分化形質転換させたＰａｇｅら著（米国特許第２００３／００５９９３９号）などがあるが、プライミング剤の取り出し後、ニュ-ロン形態及び確立されたシナプスが、インヴィトロにおいて数週間までも続かず、神経プロジェニタ-又は神経幹細胞の完全に機能的型及び安定型への完全な変換は、全く示されていない。分化形質転換に続く安定な表現型の獲得は、技術分野が直面している主な課題の１つである。
安定で、有効な、及び好ましくは自家性の神経幹細胞、神経プロジェニタ-細胞、並びに種々の神経学的疾患及び疾病の治療で用いられるためのニュ-ロン及びグリア細胞の要望が生物医学分野である。多くの細胞の他の型に関して同様な要望があるのも真実である。近年、基本的なヘリックス-ル-プ-ヘリックス（ｂＨＬＨ）クラスの遺伝子が、神経系統の発達における複数の工程の重要な調節因子であること、並びに複数個の神経因性ｂＨＬＨ因子の過剰発現が、未決定の外胚葉の神経組織への変換をもたらすことの証拠が得られている。前神経性ｂＨＬＨタンパク質は、プロジェニタ-細胞への分化及び神経系全体にわたる神経原性プログラムを経てのそれらの進行を制御する（Ｂｅｒｔｒａｎｄら，２００２年）。ＭＡＳＨ１、ＮｅｕｒｏＤ２、ＭＡＴＨ１-３、及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ１-３は、哺乳類ニュ-ロン決定及び分化中に発現されたｂＨＬＨ転写因子である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９０年、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈら，１９９７年、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら，１９９６年、Ａｋａｚａｗａら，１９９５年）。マウス中のＭＡＳＨ１、Ｎｇｂ１、Ｎｇｎ２又はＮｅｕｒｏＤの標的破壊は、ニュ-ロンの特異的サブセットの損失へと導く（Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔら，１９９３年、Ｆｏｄｅら，１９９８年、Ｍｉｙａｔａら，１９９９年）。
米国特許第６，０８７，１６８号（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら著）は、皮膚基底細胞を生存可能なニュ-ロンへと変換または分化形質転換するための方法を記載している。１つの例では、本方法は、神経分化の役割を果たす神経原性転写因子をコ-ド化する少なくとも１つのｃＤＮＡを含有する１つ又はそれ以上の発現ベクタ-を使用しての皮膚細胞のトランスフェクションを含む。好適なｃＤＮＡとしては、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮｅｕｒｏＤ２、ＡＳＨ１などのようなヘリックス-ル-プ-ヘリクス活性化物質、並びにＺｉｃ３及びＭｙＴ１のような亜鉛-フィンガ-型活性化物質が挙げられる。トランスフェクション工程の次には、ヒトＭＳＸ１遺伝子及び／又はヒトＨＥＳ１遺伝子（又は非ヒト、相同性相当物）などのような、ニュ-ロンの分化を抑制するとして知られているアンチセンスオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ培地に添加する工程が続いた。最後に、トランスフェクトされた細胞が、レチノイド及び脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、ニュ-ロトロフィン３（ＮＴ-３）、又はニュ-ロトロフィン４（ＮＴ-４）などの少なくとも１つのニュ-ロトロフィン又はサイトカインの存在下で増殖された。この技法は、２６％のニュ-ロン細胞を産出するが、これらの細胞の機能性及び安定性のいずれも確立されなかった。更に、この方法によると、神経幹細胞又は神経プロジェニタ-細胞も産生されない。
後のプロセス（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら著，２００５年，米国特許第６９４９３８０号）では、皮膚基底細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の拮抗物質に曝すことによって、更にＭＳＸ １遺伝子及び／又はＨＥＳ１遺伝子のセグメントを含む少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド存在下で細胞を増殖させることによって、皮膚基底細胞の神経プロジェニタ-細胞、ニュ-ロン細胞、又はグリア細胞への変換を記載している。しかし、本方法で、神経プロジェニタ-細胞又はグリア細胞のいずれかが生産された証拠又は例はない。更には、生産され得た、又は生産され得ない細胞に関する機能性、安定性、増殖及び収率の情報がないために、これら細胞が実際にニュ-ロン細胞へと分化された皮膚由来の前駆体細胞（Ｆｅｒｎａｄｅｓら，２００４年）であることは可能である。
上記記載を鑑みて、安定で、効果的で、並びに好ましくは自家性である神経幹細胞、神経プロジェニタ-細胞、ニュ-ロン及びグリア細胞、並びに他の細胞型、幹細胞及びプロジェニタ-細胞への要望がある。真の細胞退行分化及び細胞再プログラミングをもたらし得る方法への要望も更にある。
本発明は、これらの要望に対処し、幹様細胞及びプロジェニタ-様細胞並びにこれらの幹様細胞及びプロジェニタ-様細胞から誘導又は分化された細胞の種々の型、並びに本当の意味での細胞退行分化及び細胞再プログラミングをもたらし得る方法を提供する。
本発明の更なる特徴は、本明細書の開示の概要、図面及び記載から明らかになるであろう。
本発明は、幹様細胞及びプロジェニタ-様細胞、並びにこれら幹様細胞及びプロジェニタ-様細胞から誘導又は分化された細胞に関する。本発明は、細胞退行分化及び細胞再プログラミングのための方法に更に関する。本発明は、再プログラミングのために有用な組成物及び方法、並びに関連する治療用組成物及び方法を更に特徴とする。
１つの特別な態様は、体細胞又は非ニュ-ロン細胞を、ニュ-ロン系統及びグリア系統に沿った分化を実行する能力を有する神経幹細胞の１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的、免疫学的特徴を有する細胞へと再プログラムするための技術の開発に関する。いくつかの実施形態によると、本発明は、特に、ヒト体細胞、ヒトプロジェニタ-細胞及び／又はヒト幹細胞、並びにこのような方法を用いることから得られた細胞、細胞系及び組織からの安定な神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）の発生の方法に関する。
更に、本発明は、神経幹細胞特異的マ-カ-を発現する神経幹様細胞へのヒト体細胞の退行分化に関する。本発明によると、個々人のドナ-から採取された単一の細胞型から作り出され得、次いで同一の個々人へ再プログラムされ移植され得るような、分化したニュ-ロン細胞の種々の型への細胞の変換をもたらすことが可能である。導入の際には、本発明による細胞は、神経幹細胞特異的マ-カ-を発現し、神経幹様細胞になる。
特別な態様では、本発明は、第１の型の細胞を所望の異なる型の細胞へと形質転換する方法に関する。本方法は、ｉ）第１の型の細胞を取得することと、ｉｉ）再プログラミング剤の一過性の増加が、少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導する中で、第１の型の細胞内で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを一過性で増加させることと、ｉｉｉ）所望の細胞の増殖及び／又は形質転換を支援し、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを維持するような条件下で、再プログラミング剤の不在下で少なくとも１つの遺伝子調節因子を安定に発現させるために十分な期間時間で細胞を配置することと、ｉｖ）所望の細胞の増殖及び／又は形質転換を支援する培養条件下で、細胞を維持すること、とを含む。このような条件は、複数個の第２の遺伝子を安定して発現させるのに十分な期間時間で維持される。本発明によると、１つ又はそれ以上の第２の遺伝子の発現は、胚幹細胞の表現型的特徴及び機能的特徴の特性ではない一方、所望の細胞の表現型的特徴及び機能特徴の特性である。従って、この期間時間の最後には、異なる型の所望の細胞が得られる。
別の特別な態様によると、本発明は、第１の型の細胞を第２の異なる型の細胞へと形質転換する方法に関する。本方法は、少なくとも１つの再プログラミング剤のレベルを上述の細胞内で増加させることが可能な２つまたはそれより多くの薬剤に第１の型の細胞を接触させて、細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを直接的又は間接的に再構築させることを含む。少なくとも１つの再プログラミング剤は、所望の異なる型の細胞又は異なる細胞系統の形態学的及び機能的特性の発現を直接的又は間接的に誘導するように選択される。
別の態様によると、本発明は、第１の型の細胞を第２の異なる型の細胞へと形質転換する方法に関する。本方法は、細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを、この細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを再構築させることが可能な薬剤と接触させることと、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを増加させること、とを含む。少なくとも１つの再プログラミング剤は、所望の異なる型の細胞又は異なる細胞系統の形態学的及び機能的特性の発現を直接的又は間接的に誘導するように選択される。
本発明の他の態様は、第１の型の細胞を所望の異なる型の細胞へと形質転換する方法に関し、本方法は、少なくとも１つの再プログラミング剤が、所望の第２の細胞型の形態学的及び機能的特性の発現を直接的又は間接的に誘導するように選択される中で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを増加させることと、第２の遺伝子の発現が所望の細胞の表現型的及び機能的特徴の特性であるように複数個の第２の遺伝子を安定して発現させるために十分な期間時間で、所望の細胞の形質転換を支援するための培養条件下で、第１の型の細胞を維持すること、とを含み、少なくとも１つの第２の遺伝子は、胚幹細胞の表現型的及び機能的特徴の特性を有しない。この期間時間の最後には、所望の異なる型の細胞が得られ、得られた細胞が、第１の細胞型中で発現された複数個の遺伝子の安定的な抑制によって、更に特性評価される。
本発明の他の態様では、第１の型の細胞が所望の異なる型の細胞へと再プログラミングされるような工程に関し、本工程は、少なくとも１つの再プログラミング剤が、少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的または間接的に誘導し、並びにこの少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現が、所望の異なる型の細胞の存在のために必要である中で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルの一過性の増加と、上述の少なくとも１つの遺伝子調節因子の安定的な発現と、複数個の第２の次遺伝子の安定的な発現と、とを含み、この中で第２の次遺伝子の安定的発現は、少なくとも1つの遺伝子調節因子の安定的な発現の結果であり、この中で（ｉ）複数個の第２の遺伝子の安定的な発現は、所望の細胞の表現型的又は機能的特徴の特性であって、（ｉｉ）少なくとも1つの第２の遺伝子の安定的な発現は、胚幹細胞の表現型的及び機能的特徴の特性ではなく、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）は、第１の型の細胞の所望の異なる型の細胞への良好な再プログラミングを示唆している。
特別な実施形態では、工程における少なくとも１つの再プログラミング剤は、ＭＤＢ２ポリペプチドを伴う、Ｍｓｉ１ポリペプチド、又はＮｇｎ２ポリオペプチドである。特別な実施形態では、少なくとも１つの遺伝子調節因子は、Ｓｏｘ２、Ｍｓｉ１、又はこれら両者である。更なる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子調節因子は、神経幹様細胞に関する表Ａで表示された１つまたはそれより多くの遺伝子であってもよい。
別の態様によると、本発明は、幹様細胞（ＳＬＣ）を得る方法に関し、本方法は、ｉ）第１の型の細胞を提供することと、ｉｉ）少なくとも１つの再プログラミング剤のレベルを細胞内にて一過性で増加させることであって、一過性の増加が少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導するものであり、ｉｉｉ）幹様細胞中への形質転換を支援するための条件に細胞を配置させて、再プログラミング剤の不在下で少なくとも１つの遺伝子調節因子を安定して発現させるために十分な期間時間で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを維持することと、ｉｖ）その発現が、幹様細胞の表現型的及び／又は機能的特徴の特性を有するような複数個の第２の次遺伝子を安定して発現させるような十分な期間時間で、幹様細胞中への形質転換を支援するための条件で細胞を維持すること、とを含み、この中で、少なくとも１つの第２の遺伝子は、胚幹細胞の表現型的及び機能的特徴の特性を有さない。この期間時間の最後にて、幹様細胞が得られる。
別の態様によると、本発明は、幹様細胞を得るための方法に関する。本方法は、幹様細胞中への第１の型の細胞の直接的又は間接的な形質転換を操作することが可能である、所望の幹細胞型に特異的な少なくとも１つのポリペプチドの細胞内レベルを増加させることを含む。収量又は幹様細胞の型を増加させるために、本方法は、第１の型の細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを、ヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又はＤＮＡメチル化の阻害剤と接触させること、及び／又は幹様細胞中への第１の型の細胞の直接的又は間接的な形質転換を操作することが可能であるような所望の幹細胞型に特異的な、少なくとも１つの他のポリペプチドの細胞内レベルを増加させることを更に含んでもよい。
別の態様によると、本発明は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法に関する。
本方法は、ＮＳＬＣ中への第１の型の細胞の形質転換を直接的又は間接的に操作可能であるような、少なくとも１つの神経幹細胞特異的ポリペプチドの細胞内レベルを増加させることを含む。収量又はＮＳＬＣの型を増加させるために、方法は、第１の型の細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを、ヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又はＤＮＡメチル化の阻害剤と接触させること、及び／又はＮＳＬＣ中への第１の型の細胞の直接的又は間接的な形質転換を操作することが可能であるような少なくとも１つの他の神経幹細胞特異的ポリペプチドの細胞内レベルを増加させることを更に含んでもよい。
本発明の他の態様は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法に関する。本方法の１つの実施形態では、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｍｕｓａｓｈｉ１及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１及びメチル-ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）、又はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２及びメチル-ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２をコ-ド化するポリヌクレオチドで皮膚細胞をトランスフェクトすることを含み、これによって、ＮＳＬＣ中への皮膚細胞の再プログラミングが行われる。別の実施形態では、方法は、（ｉ）ヒストン脱アセチル化の阻害剤、（ｉｉ）ＤＮＡメチル化の阻害剤、（ｉｉｉ）ヒストンアセチル化剤、及び／又は（ｉｖ）ＭＢＤ２ポリペプチドのようなＤＮＡ脱メチル化剤に皮膚細胞を曝すこと、及び／又はＭＢＤ２ポリペプチドをコ-ド化するポリヌクレオチドでトランスフェクトすることを含み、更にＭＵＳＡＳＨＩ１をコ-ド化するポリヌクレオチド及び／又はＮＧＮ２をコ-ド化するポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることを含み、これによって、皮膚細胞がＮＳＬＣ中に再プログラムされる。角化細胞及びＣＤ３４＋細胞のようないくつかの他の細胞もまた使用され得、再プログラムされる。
１つの特別な実施形態では、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法は、第１の型の細胞を提供することと、次のポリペプチド：Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びメチル-ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）、及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）及びメチル-ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）の１つ又はそれより多くの一過性発現が可能である１つ又はそれより多くのポリヌクレオチドを細胞中に導入することと、並びにその発現がＮＳＬＣの表現型的及び機能的特徴の特性を有する複数個の遺伝子を安定的に発現させるような十分な期間時間で、ＮＳＬＣ中への形質転換を支援する培養条件中に細胞を配置させること、とを含む。この期間時間の最後にて、ＮＳＬＣが取得され、得られたＮＳＬＣは、第１の細胞型中で発現された複数個の遺伝子の安定的な抑制によって更に特性評価される。
別の実施形態によると、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法は、ＮＳＬＣではない第１の型の細胞を提供することと、少なくとも１つの神経幹細胞特異的ポリペプチドの細胞内レベルを増加させることであって、この中でポリペプチドは第１の型の細胞のＮＳＬＣ中への直接的又は間接的形質転換を操作することが可能であり、並びに第１の型の細胞のクロマチン又はＤＮＡを、ヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又はＤＮＡメチル化の化学的阻害剤に接触させること、とを含む。
別の実施形態によると、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法は、非-ＮＳＬＣを取得することと、非-ＮＳＬＣを、ＭＢＤ２ポリペプチドをコ-ド化する第１のポリヌクレオチドとＭＵＳＡＳＨＩ１ポリペプチド及び／又はＮＧＮ２ポリペプチドをコ-ド化する少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドでコトランスフェクトすることと、前述のＮＳＬＣが得られるまで、ＮＳＬＣの形質転換を支援するための条件中に、コトランスフェクトされた細胞を配置させること、とを含む。
本発明の特定の態様は、本明細書に記載された方法を用いて得られた、単離された細胞、細胞系、組成物、細胞の３Ｄ組み立て品、及び細胞を含む組織に関する。追加の態様は、このような単離された細胞、細胞系、組成物、細胞の３Ｄ組み立て品、及び医学的治療の組織の用途、並びに哺乳類の組織又は臓器の再生の方法に関する。
更に、他の態様は、被験者の組織の修復又は再生のための方法に関する。１つの実施形態では、方法は、本明細書で定義された再プログラムされた細胞の必要とする対象者への投与を含み、投与は、所与の組織又は臓器の生物学的機能を増加または支援するために十分な再プログラムされた細胞の投与量を提供し、これによって、被験者の病状を寛解する。
本発明の利点は有意であり、免疫抑制剤の必要性を排除することによる細胞治療のコストの低減、胚又は胎児組織の必要がなく、これによって倫理的及び時間的拘束が排除されること、生産コストの低減、並びにウィルスや他の疾病の可能な感染のための健康上の危害がないことなどが挙げられる。更に、細胞は新鮮に生成されるために、複数回を経過した細胞よりも更に効能が高い傾向にある。
追加的態様として、本発明の利点及び特徴は、以下の好適な実施例の非制限的記載を読めば明らかになるであろうが、この実施形態は例示であり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
本発明による、トランスフェクトされていない細胞及びＭｓｉ１及びＭＢＤ２でトランスフェクトされた細胞の種々の時点にての細胞形態変化を示す光顕微鏡写真（１０×）のパネルである。 本発明による、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）（１０×）を用いて取得され、並びにＭＢＤ２の存在中、Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２でトランスフェクトされた細胞中でのＮＣＡＭ陽性細胞を示している光顕微鏡写真のパネルである。ＨＦＦｓは、サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）で前処理され、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２、若しくはｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２でトランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて２４時間後、培地が交換され、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）とｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充した増殖培地（ＮＰＢＭ、Ｌｏｎｚａ）中、１週間、細胞が培養された。培地をＮＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＡＴＲＡ（５μＭ）及びホルスコリン（１０μＭ）が補充されたＮｂＡｃｔｉｖｅ（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ（登録商標））に変えることによって、分化が誘導された。 本発明による、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（１０×）を用いて取得され、並びにＭＢＤ２の存在中、Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２でトランスフェクトされた細胞中でのＭＡＰ２ｂ陽性細胞を示している光顕微鏡写真のパネルである。ＭＡＰ２ｂ陽性細胞は、トランスフェクトされていない細胞中及びＰａｘ６／ＭＢＤ２でトランスフェクトされた細胞中では検出不能であった。ＨＦＦｓは、サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）で前処理され、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１、ｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２、若しくはｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｐａｘ６、及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２でトランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて２４時間後に、培地が交換されて、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を補充した増殖培地（ＮＰＢＭ、Ｌｏｎｚａ）中、１週間、細胞が培養された。培地をＮＴ-３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＡＴＲＡ（５μＭ）及びホルスコリン（１０μＭ）が補充されたＮｂＡｃｔｉｖｅ（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）に交換することによって、分化が誘導された。細胞が、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて、２週間インキュベ-トされた。 図４（Ａ）は本発明による、実施例ＶからのＮＳＬＣｓによって形成された神経球が、アキュタ-ゼを用いた単一細胞懸濁液中に完全に溶解されたことを示す写真のパネルであり、神経球形成能力を明らかにするために、１つの単一細胞が経時的に監視された。神経球は、Ｓｏｘ２に関して陽性染色された。図４（Ｂ）は本発明による、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓを用いて取得された免疫組織化学法の結果からの写真のパネルである。神経球のマ-カ-を検出するために、免疫組織化学法が２０日目に実施され、正常なヒト神経プロジェニタ-細胞（ｈＮＰＣ、Ｌｏｎｚａ）によって形成された神経球における発現レベルと比較された。Ｓｏｘ２に加えて、神経幹細胞マ-カ-のＭｕｓａｓｈｉ、ＣＤ１３３、ネスチン、及びＧＦＡＰに関して陽性染色された。細胞は、更に細胞セットの双方（ＮＳＬＣ及びｈＮＰＣ）の三分化能力を示唆するβＩＩＩ-チュ-ブリン（ニュ-ロンのマ-カ-）、Ｏ４（希突起神経膠細胞のマ-カ-）、及びＧＦＡＰ（星状細胞のマ-カ-）に関して陽性染色し、並びに細胞が最終的に分化されないことを示唆するＮＧＦｒｅｃ及びＮｅｕＮ（分化されたニュ-ロンに関するマ-カ-）について陰性染色した。 本発明による、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓを用いて取得された免疫組織化学法の結果からの光顕微鏡写真のパネルである。接着培養（細胞の浮遊及び神経球の形成を防止する培養）中で繊維芽細胞に関するマ-カ-並びに神経幹細胞に関するマ-カ-（Ｓｏｘ２、ネスチン、ＧＦＡＰ）の発現を検出するために、ＨＦＦｓ、ＮＳＬＣｓ、及びｈＮＰＣｓ上で免疫組織化学法が実施された。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（写真の最上部）で核が染色された。ＨＦＦｓは繊維芽細胞マ-カ-を発現したが、一方これらＨＦＦｓから生成されたＮＳＬＣｓは発現しなかった。それに比べ、ＮＳＬＣｓは神経幹細胞マ-カ-をｈＮＰＣｓと同様に発現したが、一方ＨＦＦｓはこれらのマ-カ-のいずれも発現しなかった。 本発明による、ヒトＮＳＬＣｓを示すパネル光顕微鏡写真である。ヒトＮＳＬＣｓは、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下、ＮＳ-Ａ分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在中で、３週間、ニュ-ロン系統に分化するよう誘導された。分化の異なる時点にて、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（１０×）を用いた免疫染色は、Ｓｏｘ２陽性細胞の減少とｐ７５、βＩＩＩ-チュ-ブリン及びＧＡＢＡ陽性細胞の数及び染色の強度の増加、並びに分化した形態によって示されたような、細胞の分化を示したが、一方Ｈｏｅｃｈｓｔ色素染色によって示されたように、細胞の総数は減少した。 本発明による、光顕微鏡写真の別のパネルである。ＨＦＦ、角化細胞、及びＣＤ３４＋が、ｐＣＭＶ６-Ｍし１-Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２でトランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて２４時間後に、培地が、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充された増殖培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に交換され、２週間培養され、次いで分析された。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（１０×）を用いた光顕微鏡写真は、３つの型の細胞から生み出されたＮＳＬＣｓは、ネスチン、Ｓｏｘ２及びＧＦＡＰ（神経幹細胞のマ-カ-）に関しては陽性であったが、一方元のＨＦＦは陽性ではなかった。 本発明による、ニュ-ロンに対してのＨＦＦの分化形質転換に及ぼすＣＤＭ培地の影響を示す光顕微鏡写真のパネルである。ＨＦＦは、サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）とヒストン脱アセチル化阻害剤（ＶＰＡ、４ｍＭ）とＤＮＡメチル化阻害剤（５-Ａｚａ、５μＭ）で前処理され、次の成分（ＥＧＦ（４．２×１０-１０Ｍ）、ｂＦＧＦ（２．８×１０-１０Ｍ）、ＩＴＳ（８．６×１０-４Ｍ）、Ｌ-３，３’，５-トリヨ-ドチロニン(２．０駈ける１０-１０Ｍ)、エタノ-ルアミン（１０-４Ｍ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（４×１０-３Ｍ）、グルタチオン（３．３×１０-６Ｍ））で補充された、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｌ-グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを伴う高グルコ-ス（４．５ｇ／Ｌ））とＨａｍのＦ-１２培地の３：１比を含有するＣＤＭ培地中で培養された。２４時間後に、培地が、ＣＤＭ培地７５％とニュ-ロン増殖培地（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃ＣＣ-３２１０）２５％に交換され、それに続く３日間で、培地の比が５０％：５０％、２５％：７５％に変えられて、次いで第３日目までにニュ-ロン増殖培地１００％に変えられた。異なる時点にて、βＩＩＩ-チュ-ブリン（ニュ-ロンマ-カ-）及びＨｏｅｃｈｓｔ色素（核を染色するため）での免疫染色後に、光顕微鏡写真がＣｅｌｌｏｍｉｃｓによって撮影された。細胞は数日間の内に分化形質転換を開始し、分化形質転換した細胞は、βＩＩＩ-チュ-ブリン陽性であったが、１週間後に、繊維芽細胞形状への自然復帰とβＩＩＩ-チュ-ブリン発現の損失が観察された。 本発明による、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２によるトランスフェクションに続いての異なる時点でのＣＤＭ培地中の再プログラムされた細胞の特性を示している光顕微鏡写真のパネルである。トランスフェクトされた細胞は、サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）、ＶＰＡ（４ｍＭ）及び５-ＡＺＡ（５μＭ）で処理され、微細線維の分裂及び細胞の丸まり並びにクロマチンの緩みが生じた。１週間後と２週間後に、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（１０×）を用いて、三次元ＣＤＭ上の免疫組織化学法が実施された。細胞は、ＭＡＰ２ｂのようなニュ-ロン成熟マ-カ-に関して陽性であったが、トランスフェクトされていないコントロ-ルＣＤＮ中の細胞では陰性であった。 本発明による、光顕微鏡写真の別のパネルである。４日目以内のＣＤＭ中の細胞が、２つのベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１及びｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２を別個に或いはｐＣＭＶ-ＸＬ５-ＭＢＤ２と組み合わせて一緒に、６時間リポトランスフェクトされた。これと並行して、Ｎｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを用いて、６時間後に、新鮮なＨＦＦｓでトランスフェクションが行われて、６時間後に、リポフェクタミン培地が新鮮なＣＤＭ倍日交換されるのと同時に、これら新鮮なＨＦＦｓがＣＤＭの最上部に配置された。２４時間後、培地が、Ｎｏｇｇｉｎ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、組み換え体ｈＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び組み換え体ｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を加えたニュ-ロン増殖培地（ＮＰＢＭ、Ｌｏｎｚａ）に１週間交換された。７日目に、ＮＳ-Ａ分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２４日間添加することによって、分化が誘導された。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（１０×）を用いて、種々の時点にて免疫組織化学試験が行われた。ネスチン（神経幹細胞に関するマ-カ-）に対する特異的抗体を使用して、ＣＤＭが染色され、ＣＤＭ内の細胞は、トランスフェクションに続く試験された全ての時点にて８日、１５日、及び２１日）ネスチンを発現した。トランスフェクトされていないコントロ-ルＣＤＭ内の細胞は、いかなるネスチンも発現しなかった。 本発明による、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真を示すパネルである。接着培養又は懸濁培養（神経球として）として増殖されたＮＳＬＣｓは、双方共にテロメラ-ゼ（幹細胞中で発現されるが、正常に分化した体細胞中では発現されない）を発現した。初期継代及び後期継代の双方のＮＳＬＣｓがテロメラ-ゼを発現する（ＮＳＬＣｓが作り出された元のＨＦＦｓはテロメラ-ゼを発現しなかった）。サンプル（ＮＳＬＣｓ）を遠心沈殿させて、ＢＣＡアッセイを用いて、上澄み液のタンパク質濃度が決定された。それぞれの細胞抽出物からの蛋白質９００ｎｇが、ＴＲＡＰ反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、鋳型基質（ＴＳ）プライマ-、ＴＲＡＰプライマ-混合物及びＴａｑポリメラ-ゼを含有するＴＲＡＰ反応混合物に直接添加された。鋳型合成のために、反応混合物を３０℃で３０分間インキュベ-トし、続いて伸張したテロメラ-ゼ生成物の増幅のために、ＰＣＲ法（初期変性に関して９５℃／１５分、３２サイクルに関して９４℃／３０秒、５９℃／３０秒、７２℃／１分）を行った。テロメラ-ゼ活性を検出するために、１０％の非変性ＴＢＥゲル上の反応生成物に関して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。電気泳動後、ゲルをＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ核酸ゲル染色剤で３０分間染色し、これに続いて、Ｇｅｌ-Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて画像取得を行った。すべての４つのサンプルがテロメラ-ゼ陽性（ＴＲＡＰ生成物ラダ-によって示されたように）であった。 本発明による、一過性トランスフェクション後２週間で、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２遺伝子組込みに関して解析された２つの異なるＮＳＬＣサンプルのサザンブロット法解析を示す写真を示しているパネルである。Ｄｉｇ標識ＰＣＲプロ-ブは、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２プラスミドＤＮＡが、ゲノム当り１、１０又は１００個の組込みの等価性のためにＨＦＦゲノムＤＮＡ中に固定されているような陽性対照サンプル中で明確な信号を示した。トランスフェクトされていないＨＦＦ及びＮＳＬＣサンプル＃１並びに＃２からのゲノムＤＮＡを分解した制限酵素中で出現した数個の弱く同一のバンドが存在して、これはＮＳＬＣｓのゲノムＤＮＡ中へのプラスミドＤＮＡ組込みがないことを示唆している。１．２ｋｂのＤｉｇ標識ＰＣＲプロ-ブが、Ｎｇｎ２遺伝子の小部分を含有するがために、これらの微弱なバンドは、内因性Ｎｇｎ２遺伝子を表している可能性がある。適切な制限酵素（NEB）で完全に分解された多数のプラスミドに属するので、ＤＮＡ ｋｂラダ-のレ-ン内で陽性信号が存在した。このデ-タは、一過性トランスフェクション後に、ホストゲノムへのプラスミド組込みを有するＮＳＬＣｓが全くない、又は極めて少ないこと、並びに一過性トランスフェクトされた遺伝子が短期間の間だけ（２週間未満）細胞中に存在することを示している。 本発明による、ＮＳＬＣｓで処理されたＥＡＥマウスにおける改善及び極めて良好な臨床スコアを示す折れ線グラフと棒グラフ内のパネルである。メスの生後８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスが、乾燥した（死滅させて乾燥した）結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｉｎｃ）５ｍｇ／ｍｌを含有するＣＦＡ中のＭＯＧ３５-５５（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅ ＭｃＧｉｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で背中二箇所で免疫化されて、０日及び２日目に、ＰＢＳ中の百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）２００ｎｇを腹腔内注入した。一旦マウスがＥＡＥの症状を示したら（免疫化後１３日目）、ＮＳＬＣ（１００万個の細胞）２００μｌ、ｈＮＰＣ（１００万個の細胞）、生理食塩水、又はシクロスポリンを加えた生理食塩水を静脈注射した。生理食塩水対照グル-プ以外の全てのマウスが、シクロスポリンを毎日注射された。マウスは、臨床疾患について毎日評価され、デ-タは平均の毎日のスコアを表している。ＮＳＬＣｓの単一の注射を受けたマウスは、ｈＮＰＣｓ又はシクロスポリン単独の注射を受けたマウスよりも著しく低い疾患重篤度を有した。 本発明による、実施例ＸＶＩＩ ２部によるロ-タロッド試験評価の結果を示す折れ線グラフである。実験を開始する前に、ラットをロ-タロッド上で訓練させた。ラットは静止する及び回転する（２０ｒｐｍの回転）ロ-タロッド上に配置され、ロ-タロッドから落ちてしまうまで、ロ-タロッド上を歩くラットが居続けた時間を監視した。外科的左脳半球切除及び治療の前（手術前）及び後（手術後）に測定が取得された。デ-タ測定点は、２０ｒｐｍの一定速度で行われた毎６０秒の試験セッション中でのそれぞれの動物による落下の平均数を表している。各グル-プは、８匹のラットで構成された。 本発明による、実施例ＸＶＩＩの２部によるウォ-キングビ-ム評価の結果を示す折れ線グラフである。左脳半球切除及び処置後に、ラットが１００ｃｍの長さのビ-ムを渡るための彼らの能力が測定された。手術後２日目に、全てのグル-プが試験で不合格になり、ラットはビ-ム上で平衡を保っていることは不可能である。手術後１週間で、全ての動物は、その歩行能力に改善を示したが、異なる処置をしたグル-プ間の顕著な有意差はなかった。４週間〜２６週間では、ＮＳＬＣｓで処置した動物が、他のグル-プに比べて著しい歩行能力の改善を示す。 本発明による、実施例ＸＩＸに記載されたようなヌクレオフェクタ-を用いた種々の多分化能ベクタ-で一過性トランスフェクトしたＡＤＳＣｓの写真を示すパネルである。トランスフェクションに続いて、細胞が、ＡＤＳＣ完全培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-４３）と胚幹細胞培地（ｍＴｅＳＲ１（登録商標）、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の５０：５０混合物を含む懸濁液中、６ウェルプレ-ト中で培養された。培養２日後に、同一のプラスミドで細胞が再トランスフェクトされ、チアゾビビン（０．５μＭ）、ＡＬＫ-５阻害剤（ＳＢ３４１５４２、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）、及びＭＥＫの阻害剤（ＰＤ０３２５９０１、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０．５μＭ）を補充されたｍＴｅＳＲ１完全培地の存在中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でコ-ティングされた９６ウェルプレ-トで平板培養された。培地を毎日交換し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２で２２日間、細胞を培養し、次いで多分化能マ-カ-の発現を分析するために、ＡＰ染色及び免疫組織化学法が行われた。細胞はコロニ-を形成し、ｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰでのトランスフェクト後に、多分化能マ-カ-Ｏｃｔ４とＡＰの双方を発現したことが確認された。 本発明による、種々の多分化能ベクタ-で一過性にトランスフェクトされたＡＤＳＣｓの写真を示すパネルである。トランスフェクションに続いて、細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌがコ-ティングされた２４ウェルプレ-ト上のＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ培地に平板培養され、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２でインキュベ-トされた。１日目に、培地が、７５％ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ及び２５％ｈＥＳ細胞培地の混合物に交換され、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ培地のパ-センテ-ジが、４日間にわたって毎日減少されて、４日目までに１００％ｈＥＳ細胞培地を有するようにされた。次いで、培地が２日毎に交換された。ｈＥＳ細胞培地は、２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）、１００μＭの非必須アミノ酸、１００μＭのβ-メルカプトエタノ-ル、及び１０ｎｇ／ｍｌのＦｇｆ-２が補充された、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成された。トランスフェクション後の細胞の部分集団を特性化するために、生細胞染色、免疫組織化学法及びＡＰ染色が用いられた。Ｏｃｔ４／ＵＴＦ１／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／Ｄｐｐａ４／ＭＢＤ２、ＦｏｘＤ３／Ｄｐｐａ４／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／ＦｏｘＤ３／Ｄｐｐａ４、及びＳｏｘ２／ＦｏｘＤ３／ＵＴＦ１でトランスフェクトされた感染細胞が、１４日目にてＳＳＥＡ-４＋、ＴＲＡ１-６０及びＴＲＡ-１-８１＊表現型（初期多分化能マ-カ-）に関して陽性であった。 本発明による、種々の多分化能ベクタ-によって一過性トランスフェクトされたＡＤＳＣｓの写真を示しているパネルである。トランスフェクションに続いて、細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）がコ-ティングされた２４ウェルプレ-ト上のＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ培地に、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて播種された。１日目に、培地が７５％ ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣと２５％ ｈＥＳ細胞培地の混合物に交換され、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ培地のパ-センテ-ジが、４日目までに１００％ ｈＥＳ細胞培地を有するように、４日間にわたって毎日減少された。次いで、培地が２日ごとに交換された。ｈＥＳ細胞培地は、２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、１００μＭの非必須アミノ酸、１００μＭのβ-メルカプトエタノ-ル及び１０ｎｇ／ｍｌのＦｇｆ-２が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる。トランスフェクション後の細胞のサブ集団を特性評価するために、生細胞染色、免疫組織化学法及びＡＰ染色が使用された。Ｏｃｔ４／ＵＴＦ１／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／Ｄｐｐａ４／ＭＢＤ２、ＦｏｘＤ３／Ｄｐｐａ４／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／ＦｏｘＤ３／Ｄｐｐａ４、及びＳｏｘ２／ＦｏｘＤ３／ＵＴＦ１でトランスフェクトされたトランスフェクション細胞が、１４日目にて、ＳＳＥＡ-４＋、ＴＲＡ１-６０、及びＴＲＡ-１-８１＋表現型（初期多分化能性マ-カ-）に関して陽性であった。 本発明による、一過性トランスフェクトされたＨＦＦｓの写真を示すパネルである。次に示す３つのＤＮＡプラスミド：ｐＣＭＶ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｓｏｘ２ｎｕｃ、ｐＣＭＶ-Ｋｌｆ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｃｍｙｃｎｕｃ及びｐＣＭＶ-Ｎａｎｏｇｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｌｉｎ２８が用いられたことを除けば、実施例ＩＩに記載された手法に従って、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＨＦＦｓが一過性にトランスフェクトされた。細胞は、ＶＰＡ及び５-Ａｚａで前処理又前処理されなかった。トランスフェクションに続いて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコ-ティングされた６ウェルプレ-ト上のＶＰＡ（２ｍＭ）及び５-ＡＺＡ（２．５μＭ）を補充された又は補充されていない繊維芽細胞培地に平板培養され、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２でインキュベ-トされた。１日目と２日目に、培地が、ＶＰＡと５-ＡＺＡが補充された又は補充されていない１００％ｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に交換された。３日目と６日目に、細胞は上記のように再トランスフェクトされ、ＶＰＡと５-ＡＺＡが補充された又は補充されていないｍＴｅＳＲ１培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌコ-ティングプレ-ト上で平板培養された。培地は、上記のように毎日交換された。７日目〜１４日目に、潜在的に再プログラムされた細胞の生存能力とクロ-ン増殖を促進するために、培地がＹ２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、１０μＭ）で補充された。２０日目に、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて並びに免疫組織化学分析法によって、細胞が分析された。いくつかの細胞は、多分化能マ-カ-ＡＰ、ＳＳＥＡ-４及びＴＲＡ-１-８１（Ｍｅｌ２ヒト胚幹細胞系（正の対照）と同様））に関して陽性染色であった。これらクロ-ンは、阻害剤（すなわち、ＶＰＡ及び５-ＡＺＡ）を含まない条件下でのみ得られた。これら阻害剤で処理された条件に関しては、クロ-ンは観察されなかった。 本発明による、トランスフェクトされたＮＳＬＣｓ及びＢＧ-０１の写真を示すパネルである。ＮＳＬＣｓ及びＢＧ-０１ Ｎｓは、２つのエピソ-ムベクタ-ｐＥＦ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-ＭＢＤ２（ＮＣ１）又はｐＣＭＶ-ＦｏｘＤ３-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４（Ｆ７２）によって、実施例ＩＩに先に記載されたようにトランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて、細胞が回収され、増殖培地とｍＴｅＳＲ１培地（５０：５０）の存在中、３７℃、５％ＣＯ２の増殖条件で、コ-ティングされていないペトリ皿上で平板培養された。４８時間後に、細胞が同一のプラスミドで再トランスフェクトされ、Ｍａｔｒｉｇｅｌがコ-ティングされた９６ウェルプレ-トに加え、小分子ＢＩＸ０１２９４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）及びＢａｙｋ８６４４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）で補充されたｍＴｅＳＲ１培地の存在中、３７℃、５％ＣＯ２で、２２日間培養されて、その後、多分化能マ-カ-に関する細胞の部分集合を特性化するために、生細胞染色及び免疫組織化学法が実施された。細胞は、多分化能様細胞を示唆する、ＴＲＡ-１-８１及びＳＳＥＡ-４の双方に関して陽性であるコロニ-を形成した。 本発明による、異なる培地条件中に配置されたＭｓｉ１／Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２でトランスフェクトされ、並びに異なる形態及び分化度を示している繊維芽細胞の１７日目にての明視野写真を示すパネルである。（ａ）１日〜１２日に細胞が神経分化培地中にあり、次いで１２日〜１７日に、サイトカインを加えた神経分化培地中にある。（ｂ）１日〜１２日に細胞が神経分化培地中にあり、次いで１２日目〜１７日目に、サイトカインを加えたＮｂＡｃｔｉｖｅ４培地中にある。（ｃ）１日〜１２日に細胞が、サイトカイン＋Ｆｇｆ-２を加えた神経分化培地中にあり、次いで１２日〜１７日に、同じ培地であるがＦｇｆ-２を含まない培地中にある。（ｄ）１日〜１２日に細胞が、サイトカイン＋Ｆｇｆ-２を加えたＮｂＡｃｔｉｖｅ４培地中にあり、次いで１２日〜１７日目に、同じ培地であるがＦｇｆ-２を含まない培地中にある。（ｅ）１日〜１２日に細胞が、サイトカイン＋Ｆｇｆ-２を加えたＣＤＭ ＩＩ培地中にあり、次いで１２日〜１７日に、同じ培地であるがＦｇｆ-２を含まない培地中にある。 本発明による、図２１でＭｓｉ１／Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２でトランスフェクトされた繊維芽細胞の１７日目にての免疫化学法の結果の写真を示すパネルである。図２２Ａ及び２２Ｂ：１日〜１２日に細胞がＮＳ-Ａ増殖培地中にあって、次いで１２日〜１７日に、サイトカインが補充されたＮＳ-Ａ増殖培地（Ａ）又はＮＢＡｃｔｉｖｅ４培地（Ｂ）にあった。Ｂではより多くの細胞があるが、両方の場合、１２日〜１７日の分化は、βＩＩＩ-チュ-ブリンの発現を誘導するためには短すぎた。図２２Ｃ〜Ｅ：１日目〜１７日目に、細胞がＮＳ-Ａ分化培地（Ｃ）又はＮｂＡｃｔｉｖｅ４培地（Ｄ）中にあり（１日〜１２日に、ＦＧＦ-２補充が行われた）、又は１日〜１２日に、ＣＤＭ ＩＩ培地中にあり、次いで１２日〜１７日に、ＮＳ-Ａ分化培地（Ｅ）にある。Ｃでは非常に多数の細胞が存在し、Ｄ及びＥでは極めて少数の細胞が存在した。すべての場合で、細胞は、ＧＦＡＰ及びβＩＩＩ-チュ-ブリンの双方に関して免疫陽性であって、１日目以降に分化培地又は非増殖培地中に細胞を配置することは、ＥでのＧＦＡＰ陽性細胞よりも強いβＩＩＩ-チュ-ブリンを伴って、ニュ-ロン及びグリア細胞中へのより直接的な形質転換を誘導したと思われる。 本発明による、ＮＳＬＣ対ＨＦＦ（セット１）、又はＮＳＬＣ対ｈＮＰＣ（セット２）のいずれかの間の遺伝子発現比較のグロ-バルな概要を提供している２つの熱マップを示すパネルである。ＮＳＬＣは、ＨＦＦ又はｈＮＰＣのいずれかと比較する場合、明確な遺伝子発現プロファイルを有する。強度に基づいて（強度がより高くなると、発現における相対的変化がより高くなる）、ＮＳＬＣは、ＨＦＦよりもｈＮＰＣに極めて類似している。 本発明によるＮＳＬＣｓの写真を示すパネルである。ＮＳＬＣが、それらが皮膚由来前駆体細胞（ＳＫＰｓ）の群であるかどうかを確認するために、テストされた。ＥＧＦ及びｂＦＧＦに応答して増殖することが可能であるＳＫＰｓは、ネスチン及びフィブロネクチンを発現し、ニュ-ロン及び脂肪細胞までを含める中胚葉後代の双方へと分化し得る。このために、ＳＫＰｓを脂肪細胞へと転じる標準プロトコルが実施され、この中で、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣｓ）及びＮＳＬＣｓがＳｔｅｍＰｒｏ培地中で培養されて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（５０：５０）、ＩＴＳ（１：１００）、ＨＥＰＥＳ（１：１００）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１：１００）、Ｔ３（０．２ｎＭ）、ロシグリタゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ＩＢＭＸ（１００μＭ）及びデキサメタゾン（１μＭ）からなる分化培地中で、これらの細胞を培養することによって、脂肪細胞へと向かう分化が誘導された。３日後、ＩＢＭＸとデキサメタゾンが培地から回収された。１０日目に、細胞が４％ホルムアルデヒド溶液で１０分間固定されて、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色溶液で染色された。脂肪細胞は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏによって特異的に染色された脂質小滴で赤く現れた（左側写真では明るい白色）が、ＮＳＬＣｓは陽性染色であり、細胞中に脂質小滴の存在はなかったが、代わりに取り込まれたニュ-ロン細胞形態を有した。これらの結果は、ＮＳＬＣｓが皮膚由来前駆体細胞（ＳＫＰｓ）ではないことに一致する。
本発明は、細胞退行分化及び細胞再プログラミングのための方法に関する。本発明の重要な態様は、インヴィトロ退行分化及びインヴィトロ再プログラミングの工程後に移植され得るような細胞の異なる型に発達させるために、患者自身の細胞を使用することが可能なことである。従って、本技術は、免疫学的拒絶及び疾病の感染のリスクなどのような非ホスト細胞の移植に関連する問題を排除する。更に、細胞が「新しく作られる」ために、複数回にわたって既に細胞分裂した天然細胞の代替源よりもより有効な能力を有する。
用語の意味
本明細書及び添付された請求項で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって別途明確に指示されない限り、複数の支持対象を含む。従って、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」という表示は、１つまたはそれよりも多くのそのような細胞又はそのような細胞から誘導された細胞系を含み、「ａｎ ａｇｅｎｔ」という表示は、１つまたはそれ以上のそのような薬剤を含み、並びに「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ」という表示は、本明細書に記載された方法を変更または置き換え得る当該技術分野の当業者に既知である等価の工程及び方法に関するものを含む。
本系最初で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指し、コ-ド化ヌクレオチド配列を含む。本用語は、それが天然であろうと非天然であろうと、特別な細胞、組織又は生物体中の全てのポリヌクレオチドを包含するよう意図されている。これは、ＤＮＡ及びそれらの断片、ＲＮＡ及びそれらの断片、ｃＤＮＡ及びそれらの断片、発現された配列タグ、ランダム人工配列を含む人工的配列が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、所望の機能的生物学的活性（例えば、ＤＮＡ脱メチル化）を有する任意のアミノ酸配列を指す。本用語は、完全蛋白質、それらの断片、融合蛋白質、炭水化物又は脂質鎖又は組成物を含むその他同類物を包含するよう意図されている。
「分化形質導入」は、既に分化された細胞を分化された細胞の別の型に直接切り替えることを指す。
「退行分化」は、遺伝子又は代謝経路の活性化又は不活性化による分化された細胞の表現型特性の損失を指す。
「マ-カ-」は、特別な細胞型又は細胞の表現型の特性である遺伝子、ポリペプチド、又は生物学的機能を指す。
「遺伝子改変ＤＮＡ配列」は、ＤＮＡ配列の構成成分配列要素が、自然界では見出せない方法でＤＮＡ配列内に組織化されたようなＤＮＡ配列を意味する。
「シグナル配列」は、それがポリペプチドをコ-ド化する核酸配列に組み込まれる場合、前記ポリペプチドを発現する細胞から翻訳したポリペプチドの分泌を指示し、或いはポリペプチドに容易に細胞膜を横切らせるような核酸配列を指す。シグナル配列によってコ-ド化されたポリペプチド配列が、翻訳したポリペプチドのＮ-末端に配置されるように、シグナル配列は、ポリペプチドをコ-ド化する核酸配列の５’末端に配置されることが好ましい。「シグナルペプチド」とは、シグナル配列の翻訳から生じたペプチド配列を意味
する。
「ユビキタスプロモ-タ-」は、プロモ-タ-が操作可能となるよう結合された核酸配列によってコ-ド化されたポリペプチド又はペプチドの発現を操作するプロモ-タ-を指す。好適なユビキタスプロモ-タ-としては、ヒトサイトメガロウイルス即時型（ＣＭＶ）プロモ-タ-、シミアンウィルス４０初期プロモ-タ-（ＳＶ４０）、Ｒｏｕｓ肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、又はアデノウィルス主要後期プロモ-タ-が挙げられる。
「遺伝子発現プロファイル」は、細胞機能の広範囲な写真を創り出す、複数の遺伝子の活性を直ちに測定するアッセイを意味する。例えば、これらプロファイルは、能動的に分裂し又は分化しているヒト神経幹細胞と体細胞との間を識別し得る。
「トランスフェクション」は、外部ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ分子）を細胞に中へと、好ましくは非ウィルス性方法によって導入する遺伝子送達の方法を指す。本発明による好適な実施形態では、対象のポリペプチドをコ-ド化する発現ベクタ-の一過性トランスフェクションによって、外部ＤＮＡが細胞へ導入され、かくして、外部ＤＮＡは導入されるが、細胞によって及び有糸分裂中に、時間をかけて除去される。「一過性トランスフェクション」とは、導入された発現ベクタ-及びベクタ-によってコ-ド化されたポリペプチドが、ホスト細胞のゲノム中、あるいは細胞中のいずれかに永久的に組み込まれることがなく、従って、これらがホスト細胞又はその後代から時間をかけて排除される可能性がある方法を意味する。トランスフェクション法を用いて、蛋白質、ポリペプチド、又は他の化合物もまた、細胞中に送達され得る。
「神経プロジェニタ-細胞」は、ニュ-ロンとグリア細胞（希突起神経膠細胞と星状細胞）へ分化し得る神経系の未成熟細胞を指す。「神経幹細胞」は、生理学的特徴として神経プロジェニタ-細胞を形成する能力を有し、並びに分化を好む生理学的条件下にてニュ-ロン及びグリア細胞を形成する、外胚葉由来の多能性幹細胞である。「神経幹様細胞」又は「ＮＳＬＣ」は、生理学的特徴として他の神経幹様細胞及び神経プロジェニタ-様細胞を形成する能力を有し、並びに分化を好む生理学的条件下にてニュ-ロン様細胞及びグリア様細胞を形成する、任意の細胞由来の多能性幹細胞を指す。
「神経球」は、適切な増殖条件下で、神経幹細胞及び神経プロジェニタ-細胞の増殖の結果として形成された浮遊する球体を形成する、神経幹細胞及び神経プロジェニタ-細胞の細胞凝集体を指す。ＮＳＬＣｓもまた、ＮＳＬＣｓと神経プロジェニタ-様細胞の凝集体からなる神経球を形成する。
「再プログラム化細胞」は、安定な分化形質転換、退行分化、又は形質転換が行われた細胞を指す。いくつかの再プログラム化細胞は、引き続いて再分化するよう誘導される。
再プログラム化細胞は、細胞特異的マ-カ-又はマ-カ-のセット、形態、及び／又は元の細胞の特性ではなかった生物学的機能を発現する。「再プログラム化体細胞」は、体細胞の分化状態を変更または逆転させる工程を指し、これは、劣った分化状態又は新しい分化状態のいずれかへの分化した状態の完全的又は部分的のいずれかの変換であり得る。
「再生」は、細胞、組織又は器官の修復またはデノボ構成に寄与する能力を指す。
「分化」は、細胞の系列委託の発達工程を指す。分化は、１つまたはそれ以上の細胞特異的マ-カ-の未分化細胞マ-カ-の発現に対する増加を測定することによって評価分析され得る。
「系統」は、より未分化の細胞が漸進的生理学的変化を行い、特徴的な機能（例えば、ニュ-ロン及びグリアが神経プロジェニタ-系統であり、神経プロジェニタ-細胞が胚盤胞及び胚幹（ＥＳ）細胞から形成された外胚葉系統である）を有するより分化した細胞になるような、細胞発達の経路を指す。
「組織」は、一緒に特異的な機能または機能のセットを行う細胞（同一又は異なる）と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の集合を指す。
「ＣＤＭ」は、生きている組織等価物又はマトリックス、生きている骨格、又は細胞由来マトリックスを意味する。
細胞形質転換
本発明のいくつかの態様は、所与の体細胞を多分化能性、多能性及び／又は単分化能性細胞へと形質転換する又は再プログラムするための方法及び細胞に関する。本発明のいくつかの態様は、体細胞を多分化能性、多能性又は単分化能性細胞へと再プログラミングするための状態調節の方法に関する。
用語「形質転換する」又は「再プログラムする」は、細胞が退行分化され又は分化形質転換されて多分化能性、多能性及び／又は単分化能性細胞になる現象を指すために互換的に使用される。退行分化した細胞は、引き続いて細胞の異なる型へと再分化されることが可能である。細胞は、種々の程度まで再プログラムまたは変換され得る。例えば、細胞の少しの部分が変換されることも、又は個々の細胞が多能性に再プログラムされるが、必ずしも多分化能性に再プログラムされないことも可能である。従って、用語「形質転換」又は「再プログラミング」法は、「新しい」細胞が、新しい又は異なる特異的細胞系統の形態的又は機能的特徴を示すように細胞を再プログラムすることが可能であるような方法を指す（例えば、ニュ-ロン細胞への繊維芽細胞の形質転換）。
本明細書で使用するとき、用語「体細胞」は、幹細胞、プロジェニタ-細胞、及び生殖系細胞（すなわち、卵原細胞及び精原細胞）及びそれらから誘導された細胞（例えば、卵子細胞、精子細胞）を除いた、生物の身体を形成する任意の分化した細胞を指す。例えば、内臓、皮膚、骨、血液、及び結合組織は、全て体細胞から作り上げられている。本発明による体細胞は、成体又は胎児体細胞から単離された分化した細胞であり得る。体細胞は動物、好ましくはヒト被験者から取得され、当業者が利用できる標準的培養プロトコルに従って培養される。
本明細書で使用するとき、用語「幹細胞」は、有糸細胞分裂を経て、それら自体を再生する能力を保持するような細胞、並びに多種多様な特殊な細胞型へと分化し得る細胞を指す。これは、未分化胚芽細胞中に見出される胚幹細胞と、成体組織中見出される成体幹細胞との双方を含む。「全能細胞」は、３つの胚芽胚葉の全て（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）から誘導された細胞、並びに全生物体（例えば、ヒトの場合は、女性の子宮内配置されるような人間）へと発達する能力を有する細胞を指す。本明細書で使用されるような用語「多分化能」は、３つの全ての胚芽胚葉の分化した細胞になる細胞の能力を意味することが意図されている。「多能性細胞」は、細胞の緊密に関連した族（例えば、赤血球、白血球、血小板などに分化する造血幹細胞）の細胞のみを産生し得る細胞を指す。「単分化能細胞」は、組織のただ１つの型／細胞型（例えば、皮膚細胞）へと発達／分化する潜在能力を有する細胞を指す。
本発明は、異なる型の細胞への任意の細胞の再プログラミングを与える。本願は、幹様細胞、特に神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）の調製に焦点を絞っているが、本明細書に記載された原理により、細胞の多くの異なる型が発生され得るために、本発明はそのように制限されるものではない。同様に、実施例セクションが、繊維芽細胞、角化細胞、ＣＤ３４＋細胞、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣｓ）、神経幹細胞（ＮＳＬＣｓを含む）、及び細胞由来マトリックス（ＣＤＭ）内の細胞が再プログラムされるような実施形態を記載してはいるが、本発明はそのような細胞に限定されるものではない。本発明は、実質的に関心のあるいかなる細胞の再プログラミングに適用されてもよい。
従って、本発明の一般的な態様は、細胞の第１の型の第２の異なる型への形質転換の方法に関する。本明細書で使用するとき、第１の型の細胞の例としては、限定されるものではないが、生殖細胞、胚幹細胞及びそれらの誘導体、成体幹細胞及びそれらの誘導体、プロジェニタ-細胞及びそれらの誘導体、中胚葉、内胚葉又は外胚葉から誘導された細胞、並びに脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、間葉幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）、皮膚由来前駆体細胞、毛胞細胞、繊維芽細胞、角化細胞、皮膚細胞、内皮細胞、上皮細胞、顆粒膜上皮細胞、メラニン形成細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肝細胞、リンパ細胞（Ｂ及びＴリンパ細胞）顆粒細胞、巨大赤血球、単球、単核細胞、膵臓島細胞、セルトリ細胞、ニュ-ロン、グリア細胞、心筋細胞、及び他の筋細胞などのような内胚葉又は外胚葉系統が挙げられる。
本明細書で使用するとき、第２の細胞の型の例としては、限定されるものではないが、生殖細胞、胚幹細胞及びそれらの誘導体、成体幹細胞及びそれらの誘導体、プロジェニタ-細胞及びそれらの誘導体、中胚葉、内胚葉又は外胚葉から誘導された細胞、並びに脂肪細胞由来幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）、皮膚由来前駆体細胞、毛胞細胞、繊維芽細胞、角化細胞、皮膚細胞、内皮細胞、上皮細胞、顆粒膜上皮細胞、メラニン形成細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肝細胞、リンパ細胞（Ｂ及びＴリンパ細胞）顆粒細胞、巨大赤血球、単球、単核細胞、膵臓島細胞、セルトリ細胞、ニュ-ロン、グリア細胞、心筋細胞、及び他の筋細胞などのような内胚葉又は外胚葉系統が挙げられる。更に、上記の「-様」細胞（細胞の既知の天然型の特徴と同様な特徴を有するが完全に同一ではない特徴を有する細胞）のそれぞれは、第２の型の細胞の例でまた誘導される。
１つの特別な態様によると、第１の型の細胞を第２の異なる型へと形質転換する方法は、ｉ）第１の型の細胞を提供することと、ｉｉ）第１の型の細胞中で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを一過性で増加させることであって、これによって、一過性の増加が少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導するものであり、ｉｉｉ）所望の細胞の形質転換を支援するための条件下に細胞を配置させて、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを、再プログラミング剤の不在下での少なくとも１つの遺伝子調節因子を安定して発現させるのに十分な期間時間で維持することと、並びにｉｖ）所望の細胞の形質転換を支援する培養条件中、その発現が所望の細胞の表現型的及び機能的特徴の特性を有するような複数個の第２の遺伝子を安定して発現をさせるのに十分な期間時間で維持すること、とのステップを含む。少なくとも１つの安定発現された第２の遺伝子は、胚幹細胞の表現型的及び機能的特徴の特性を有さない。この期間時間の最後には、第１の型の細胞が、異なる型の所望の細胞中に形質転換されている。好ましくは、形質転換後に得られた異なる型の細胞は、第１の型の細胞中で発現された複数個の遺伝子の安定した抑制によって、更に特性評価される。
種々の実施形態によると、ステップｉｉｉ）は、ステップＩＩ）に連続して、ステップｉｉ）と同時に、又はステップｉｉ）の前に行われてもよい。
関連する態様によると、本発明は、第１の型の細胞が異なる型の所望の細胞へと再プログラムされる工程に関し、本工程は、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを一過性で増加させることと、この中で少なくとも１つの再プログラミング剤が、少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導し、並びに少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現が、異なる型の所望の細胞の存在のために必要であって、前記少なくとも１つの遺伝子調節因子の安定な発現と、複数個の第２の遺伝子の安定な発現と、とを含み、この中で、複数個の第２の遺伝子の安定な発現が、少なくとも１つの遺伝子調節因子の安定な発現の結果であり、並びに（ｉ）複数個の第２の遺伝子の安定な発現が、所望の細胞の表現型的及び／又は機能的特徴の特性であり、（ｉｉ）少なくとも１つの第２の遺伝子の安定な発現が、胚幹細胞の表現型的及び機能的特徴の特性ではなく、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）が、第１の型の細胞の異なる型の所望の細胞への再プログラミングが成功裏に行われたことを示唆している。
本明細書で使用するとき、「一過性の増加」は、永久的である必要がなく、従ってそれが経時的に減少または消失してもよいような増加を指す。例えば、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞なレベルの一過性の増加と言及する場合、特別な細胞的事象が起こる（例えば、遺伝子調節因子の安定な内因性発現を誘導すること）ための十分な時間に増加が存在することを意味する。典型的には、一過性の増加は永久的ではなく、例えば発現ベクタ-のゲノム組込みに関連しない増加である。
本明細書で使用するとき、「再プログラミング剤」は、異なる型の所望の細胞の形態的及び／又は機能的特性の発現を直接的又は間接的に誘導が可能である化合物を指す。好適な化合物は、第１の型の細胞の異なる型の所望の細胞への直接的又は間接的な形質転換を操作可能であるような化合物である。好適な実施形態では、再プログラミング剤は、本明細書に記載されたように、少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導するために選択される。本発明による再プログラミングで有益であり得る多くの化合物があり、これら化合物は、単独又は組み合わされて使用され得る。種々の実施形態では、再プログラミング剤は、表Ａに従って選択されたポリヌクレオチド又はポリペプチドである。
Figure 2018183152
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Figure 2018183152

Figure 2018183152
いくつかの実施形態では、再プログラミング剤は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上の上記表中の再プログラミング剤のうちのいずれか１つの機能性又は配列同一性を占有するポリペプチドである。
再プログラミング剤の不在下で、少なくとも１つの遺伝子調節因子の安定な発現を可能にする「十分な期間時間」を同定すること並びに細胞が所望の細胞への形質転換を支援する培養条件中で維持されるような「十分な期間時間」を同定することは、当業者の技術の範囲内である。十分又は適当な時間期間は、限定されるものではないが、細胞の特別な型及び後成的状態（例えば、第１の型の細胞及び所望の細胞）、開始物質の量（例えば、形質転換される細胞の数）、再プログラミング剤の量と型）、遺伝子調節因子、培養条件、再プログラミングを加速する化合物の存在（例えば、細胞周期回転を増加させる、後成的状態を変更する、並びに／又は細胞生存性を増強させる化合物）などを含む種々の因子によって変動するであろう。種々の実施形態では、再プログラミング剤の不在下で、少なくとも１つの遺伝子調節因子の安定な発現を可能にする十分な期間時間は、約１日、約２〜４日、約４〜７日、約１〜２週、約２〜３週又は約３〜４週である。種々の実施形態では、細胞が所望の細胞への形質転換を支援する培養条件中で維持され、並びに複数個の第２の遺伝子の安定した発現を可能にするような十分な期間時間は、約１日、約２〜４日、約４〜７日、約１〜２週、約２〜３週又は３〜４週、約４〜６週又は約６〜８週である。好適な実施形態では、形質転換期間の最後に、形質転換された所望の細胞の数は、開始時に提供された第１の型の細胞の量と実質的に等価であるか、又はそれよりも高い。
本発明は、第１の型の細胞内において、再プログラミング剤の細胞内レベルを増加させるために好適な種々のタイプの化合物を包含する。好ましくは、化合物は、細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを直接的又は間接的に再構築することが可能であるべきで、これによって、異なる型の所望の細胞の形態的及び機能的特性の発現を直接的又は間接的にもたらす。好適な化合物は、本明細書で定義された再プログラミング剤、又は同様な活性を有し並びに以前に再プログラミング剤の表中に表示された遺伝子の内因性変種の発現を活性化又は増強させる能力を有する任意の他の化合物であり、これらは異なる型の所望の細胞への第１の型の細胞の形質転換を直接的又は間接的に操作することが可能である。
以下で説明されるように、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルの増加は、異なる手段によって達成され得る。好適な実施形態では、再プログラミング剤は、ポリペプチドであり、そのようなポリペプチドの細胞内レベルを増加させることは、ポリペプチドをコ-ド化するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を有する発現ベクタ-トランスフェクション（又はコトランスフェクション）、或いはポリペプチドの細胞内送達によるものが挙げられる。本発明のよると、一過性発現が一般的に好適である。追加の適切な化合物としては、再プログラミング剤の表中で表示された遺伝子の内因性変種の発現を増加させることが可能である化合物と、限定されるものではないが、表Ｂ中の再プログラミング因子を含む遺伝子調節因子が挙げられ得る。
Figure 2018183152
本発明の原理によると、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを増加させることが、少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導する。本明細書で使用するとき、「遺伝子調節因子」は、その発現が、第１の型の所与の細胞の多分化能性、多能性及び／又は単分化能性細胞への形質転換へと導く一連の細胞内事象に関連しているようなポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。典型的には、遺伝子調節因子の発現は、第１の型の細胞の遺伝子を抑制する一方で、多分化能性、多能性及び／又は単分化能性細胞の表現型的及び機能的特性に必要な遺伝子を、直接的又は間接的に活性化する。本発明による遺伝子調節因子の例としては、限定されものではないが、以前表Ａで表示されたポリヌクレオチド及びポリペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子調節因子は、以前表Ａで提供された遺伝子調節因子のうちのいずれか１つの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上の機能性又は配列同一性を占有するポリペプチドである。
本明細書で使用するとき、所望の細胞を指す場合の「増殖を支援する条件」又は「形質転換を支援する条件」は、所望の細胞型の増殖を導く並びに／又はそのような所望の細胞型に向かう形質転換を導くような種々の好適な培養条件（温度、ｐＨ、Ｏ２分圧、細胞培地、因子、化合物、増殖基質（例えば、ラミニン、コラ-ゲン、フィブロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、低結合表面、ナノ構造化又は荷電表面など）、３Ｄ環境など）を指す。特別な細胞型の増殖又は形質転換は、特異的な条件下で刺激されること並びに他によって阻害されることは当業者には既知であるが、所望の細胞型の増殖又は形質転換へと導く適切な条件（例えば培養条件）を選択することは当業者の技術の範囲内である。
用語「表現型的及び機能的特徴」は、所望の細胞又は胚幹細胞を指す場合、その同一性又は機能を確認するために測定又は評価され得るような、特定の遺伝子及び細胞表面マ-カ-の発現を含む生物学的、生化学的、生理学的及び視覚的特性を指す。
本発明の好適な実施形態による適切な再プログラミング剤の例は、ＭＵＳＡＳＨＩ１である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、繊維芽細胞のような第１の細胞を神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）中へと操作するために適している。他の実施形態では、上述の細胞内レベルが増加される少なくとも１つの再プログラミング剤は、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）単独、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）とＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）とメチル-ＣｐＧ結合ドメイン蛋白質２（ＭＢＤ２）、又はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）とメチル-ＣｐＧ結合ドメイン蛋白質２（ＭＢＤ２）のうちのいずれかである。これらポリペプチドが、早くも胚幹細胞（又はそれよりも初期の細胞）から前体細胞（又はそれよりも後期の細胞）に至るまで、全細胞系統の全体を通して発現される傾向にあるために、これらの適切な細胞内レベルが推奨される。
ＭＢＤ２は、転写抑制物質とＤＮＡデメチラ-ゼ（ｄＭＴア-ゼ）の双方で報告されたメチル-ＣｐＧ-結合蛋白質の族の一員である。本明細書で使用するとき、用語「ＭＢＤ２」は、ヒトメチル-ＣｐＧ結合ドメイン蛋白質２を一般的に指す。ヒトＭＢＤ２のＧｅｎｅＢａｎｋ（登録商標）（ＮＣＢＩ）受入番号はＮＭ＿００３９２７．３／ＡＦ０７２２４２であり、ＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標）受入番号はＮＰ-００３９１８／Ｑ９ＵＢＢ５であり、並びにＵｎｉＧｅｎｅ（登録商標）受入番号はＨｓ．２５６７４である。
本明細書で使用するとき、用語「Ｍｓｉ１」は、ヒトｍｕｓａｓｈｉホモログ１を一般的に指す。ヒトＭｓｉ１のＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢ）受入番号はＮＭ＿００２４４２．２／ＡＢ０１２８５１であり、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＮＰ-００２４３３／Ｏ４３３４７であり、並びにＵｎｉＧｅｎｅ受入番号はＨｓ．１５８３１１である。
本明細書で使用するとき、用語「Ｎｇｎ２」は、ヒトｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２を一般的に指す。ヒトＮｇｎ２のＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）受入番号は、ＮＭ＿０２４０１９．２／ＢＣ０３６８４７で、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＮＰ-０７６９２４／Ｑ９Ｈ２Ａ３で、並びにＵｎｉＧｅｎｅ受入番号はＨｓ．５６７５６３である。
追加的態様によると、第１の型の細胞を、異なる型の所望の細胞へ形質転換する方法は、１）細胞内で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを増加させることが可能な１つまたはそれ以上の化合物と第１の型の細胞を接触させるて、細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを直接的又は間接的に再構築すること、若しくは、２）第１の型の細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを、細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを再構築することが可能な薬剤と接触させて、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを増加させること、とのいずれかのステップを含む。
種々の実施形態によると、ステップ２）が、ステップ１）に引き続いて、ステップ１）と同時に、又はステップ１）の前に実行されてもよい。
特別な態様によると、本発明は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法に関し、方法は、ＮＳＬＣではない第１の型の細胞を提供することと、少なくとも１つの神経幹細胞に特異的なポリペプチドの細胞内レベルを増加させることと、このポリペプチドは第１の型の細胞のＮＳＬＣへの直接的又は間接的形質転換が可能であり、並びに第１の型の細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡをヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又はＤＮＡメチル化の化学的阻害剤と接触させること、とを含む。
第２のステップに関して、用語「クロマチン及び／又はＤＮＡを再構築する」は、クロマチンに対する動的な構造的変化を指す。これらの変化は、転写調節のために必要な局所的変化から、異なる型の所望の細胞の遺伝子特性の新しいセットの転写を可能にするためのクロマチン構造又は染色体分離の開放に必要な、並びに異なる型の所望の細胞の特性ではない特定の遺伝子の転写を妨害するためのクロマチン構造又は染色体分離の閉鎖に必要な広範囲の変化にまで及ぶことができる。いくつかの実施形態では、クロマチン構造の開放は、具体的には、ヒストンのアセチル化、及びＤＮＡの脱メチル化を指し、一方クロマチン構造の閉鎖は、具体的には、ヒストンの脱アセチル化、及びＤＮＡのメチル化を指す。
本明細書で使用するとき、「化合物」は、所望の生物学的機能に影響を及ぼすことが可能な化合物を指す。この用語としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチド、及び成長因子、サイトカイン、ホルモン又は小分子を含む他の化合物が挙げられる。本明細書で使用するとき、クロマチン及び／又はＤＮＡを再構築することが可能な化合物としては、限定されるものではないが、ヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、ＤＮＡメチル化の阻害剤及びそれらの組み合わせが挙げられる。
「ＤＮＡメチル化の阻害剤」は、ＤＮＡメチル化を阻害することができる薬剤を指す。
ＤＮＡメチル化阻害剤は、抑制された遺伝子発現を回復する能力が立証されている。ＤＮＡメチル化を阻害するために好適な薬剤としては、限定されるものではないが、５-アザシチジン、５-アザ-２-デオキシシチジン、１-β-Ｄ-アラビノフラノシル-５-アザシトシン、及びジヒドロ-５-アザシチジン、及びゼブラリン（ＺＥＢ）、ＢＩＸ（ヒストンリジンメチルトランスフェラ-ゼ阻害剤）、並びにＲＧ１０８が挙げられる。
「ヒストン脱アセチル化の阻害剤」は、凝縮クロマチン及び転写的に沈黙したクロマチンの形成へと導くであろうヒストンのリジン残基からのアセチル基の除去を妨害する薬剤を指す。ヒストンデアセチラ-ゼ阻害剤は数個のグル-プに分離され、これらグル-プは（１）トリコスタチン（Ａ）のようなヒドロキサム酸類、（２）環式テトラペプチド、（３）ベンズアミド、（４）求電子性ケトン、並びに（５）酪酸フェニル及びバルプロン酸などのような脂肪酸族を含む。ヒストン脱アセチル化を阻害する好適な薬剤としては、限定されるものではないが、バルプロン酸（ＶＰＡ）、フェニルブチレ-ト、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、Ｎａ-ブチレ-ト、及びベンズアミドが挙げられる。ＶＰＡは、ＮｅｕｒｏＤを含む神経原性転写因子の誘導を経て、ニュ-ロン運命を促進し、かつグリア細胞運命を同時に阻害する。
「ヒストンアセチル化剤」は、クロマチンを開放し、それを転写的に活性な状態に戻すようなヒストンのリジン残基にアセチル基を挿入する薬剤を指す。好適なヒストンアセチル化剤としては、限定されるものではないが、ポリアミン、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ要素結合蛋白質）、及びＢｎｉＰ３が挙げられる。
「ＤＮＡ脱メチル化剤」は、ＤＮＡからメチル基を除去し、高メチル化を阻害し、抑制された遺伝子発現を回復させる能力を所有する薬剤を指す。デメチラ-ゼは、抑制的メチル残基を除去することによって、遺伝子を活性化すると予想される。好適なＤＮＡ脱メチル化剤は、限定されるものではないが、ＭＢＤ２及びＧａｄｄ４５ｂが挙げられる。
いくつかの実施形態では、再プログラミング剤は、１つまたはそれ以上の次の機能を有し、それが第１の型の細胞の１つまたはそれ以上のマ-カ-の発現を減少させること（例えば、表Ｃを参照）、及び／又はそれが異なる型の所望の細胞の１つ又はそれ以上のマ-カ-の発現を増加させること（例えば、表Ａを参照）である。所望の異なる型の細胞のための選択可能なマ-カ-を示す細胞が、次いで選択され、所望の異なる型の細胞の特性に関して評価される。
本発明によると、所望の細胞への形質転換は、その発現が所望の細胞の表現型的及び／又は機能的特徴の特性であるような複数個の第２の遺伝子の安定な発現をもたらす。その発現が所望の細胞の表現型的及び／又は機能的特徴の特性である遺伝子は、限定されるものではないが、表Ａ中に表示された遺伝子である。
いくつかの実施形態では、その発現が所望の細胞の表現型的及び／又は機能的特徴の特性であるような二次遺伝子の発現は、次の表３に従って定義されたマ-カ-の発現をもたらす。
Figure 2018183152
いくつかの実施形態では、所望の細胞への第１の型の細胞の形質転換は、第１の型の細胞中で典型的に発現された複数個の遺伝子の安定な制止をもたらす。このような抑制された遺伝子の例としては、限定されるものではないが、表Ｃ（表４）中に定義されたような遺伝子が挙げられる。
Figure 2018183152
好適な実施例では、第１の細胞型中で発現される表Ｃ中に表示された1つまたはそれ以上のいずれかの遺伝子の安定な抑制もまた、相当するマ-カ-の消失によって特性化される（表Ｃを参照）。
細胞の再プログラミングを促進するための多くの代替的ステップがあることを、当業者は理解されるであろう。これらステップは、細胞の骨格構造をすること不安定化（例えば、細胞をサイトカラシンＢにさらすことによる）、細胞のクロマチン構造を緩和すること（例えば、５アザシチジン（５-Ａｚａ）及びバルプロン酸（ＶＰＡ）又はＭＢＤ２などのようなＤＮＡ脱メチル化剤を使用することによる）、神経原性転写因子（例えば、Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２）をコ-ド化する少なくとも１つのｃＤＮＡを含有する１つまたはそれ以上の発現ベクタ-で細胞をトランスフェクトすること、所望の異なる型の細胞の分化委託を誘導するための所望の異なる型の細胞に対する適切な培地及び適当な分化培地を使用すること、所望の異なる型の細胞の委託への誘導に悪影響を及ぼす抑制的経路を阻害すること、所望の異なる型の細胞に関する適切な基質（例えば、ＮＳＬＣｓのためのラミニ又は浮遊する神経球の培養のための低結合表面など）の上で細胞を増殖させること、並びに所望の異なる型の細胞（又は-様細胞）が、適当な温度、ｐＨ及び低酸素環境（例えば、約２〜５％Ｏ２）のようなインヴィヴォ中で正常に露出されるような環境内で細胞を増殖させることが挙げられる。種々の実施形態では、本発明は、これら方法及び他の関連した方法並びに細胞再プログラミングを促進するための技術を包含する。
したがって、第２の異なる型の細胞への第１の型の細胞を形質転換する方法は、追加の条件的ステップを含んでもよい。１つの実施形態では、細胞を形質転換する方法は、第１の型の細胞を細胞骨格構造攪乱物質で前処理するステップを更に含む。本明細書で使用するとき、「細胞骨格構造」は、Ｆ-アクチンの糸状網、ミオシン軽鎖及び重鎖、微小管、及び３つの化学的に異なっているサブユニットのうちの１つ、アクチン、チュ-ブリン、又はＩＦ蛋白質の数個の部類のうちの１つから構成される中間径繊維（ＩＦｓ）を指す。
したがって、用語「細胞骨格構造攪乱物質」は、細胞を不安定化するために細胞骨格構造を阻害し得、並びに引き続き細胞の形状と細胞及び核機能との間のフィ-ドバック機構を排除し得るような任意の分子を指す。本発明による適切な細胞骨格構造攪乱物質としては、限定されるものではないが、サイトカラシンＢ又はＤのようなアクチン細胞骨格構造阻害物質のサイトカラシン族、及び２，３-ブタンジオンモノオキシムなどのようなミオシン阻害物質が挙げられる。このような前処理は、再プログラミングを増進させる。好適な実施形態では、神経原性転写因子の導入前、導入中、又は導入後に、少なくとも１つの細胞骨格構造阻害物質の存在下で１日、細胞が培養される。
所望の細胞の形質転換を支援するための条件下に細胞を配置すること、並びに／又は所望の細胞の形質転換を支援する条件下で細胞を維持することは、所望の異なる型の細胞の形態的及び機能的特性の発現を誘導するための１つまたはそれ以上の因子を含む培地中で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の因子は、細胞の再プログラミングで有益であるような再プログラミング因子であって、これら再プログラミング因子は、単独で又は組み合わせて使用され得る。
他の実施形態では、所望の異なる型の細胞の形態的及び機能的特性の発現を誘導するために適切な１つまたはそれ以上の因子を含む培地中で細胞を培養するステップは、以前い定義されたように、ステップｉｉｉ）又はｉｖ）に連続して又は同時に、あるいはステップ１）又は２）に引き続いて又は同時に実行される。
多くの異なるタイプの培地、及び細胞の再プログラミング中で有益であり得る多くの再プログラミング因子並びにこれら再プログラミング因子が、単独または組み合わされて使用され得ることを当業者は認識する。種々の実施形態では、再プログラミング因子は、表Ｂに従って選択される。
いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、１つまたはそれ以上の次に機能を有し、第１の型の１つまたはそれ以上のマ-カ-の発現を減少させる及び／又は所望の細胞の１つまたはそれ以上のまか-の発現を増加させることである。次いで、所望の細胞に対する選択可能なマ-カ-細胞を示す細胞が選択され、並びに単分化能性、多能性、多分可能性、又は類似した特性（必要に応じて）に関して評価される。
特別な実施形態では、以前に定義されたようなステップｉ）〜ｉｖ）のうちのいずれか１つのステップの前、ステップ中若しくはステップ後、あるいは以前に定義されたようなステップ１）又は２）のステップ中、又はステップ後に、細胞が無血清培地中で培養される。
神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）の取得
神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）を生成するための好適な実施形態によると、本発明の方法は、幹様細胞（ＳＬＣｓ）に向かっての再プログラミング及び／又は分化を推進するための選択された薬剤、化合物及び因子で細胞が処理されるように実行される。次いで、このように再プログラムされた体細胞は、薬剤で更に処理され、並びに／又は神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）に向かっての再プログラミングを推進するために、並びにＮＳＬＣｓの増殖を長期間にわたって推進するために適切な条件下で培養される。本発明によるＮＳＬＣｓは、パ-キンソン病や脊髄損傷などのような神経疾患及び損傷の実質的な治療のために、ニュ-ロン様細胞及び／又はグリア様細胞へ分化するための能力、並びにニュ-ロン細胞及び／又はグリア細胞へと分化する潜在能力を有する。本明細書で記載された方法はまた、細胞治療のための組織適合性細胞を生み出すために有用である。
したがって、本発明のいくつかの態様は、個々の患者からニュ-ロンを発生させること、並びにこれによって、自己移植を、神経外傷、脳卒中、多発硬化症、パ-キンソン病、ハンチントン病、アルツハイマ-病などの神経変性疾患の治療法として可能にすることに関する。したがって、本発明は、関心の対象である疾患又は外傷を治療する神経学的治療法を提供する。
したがって、本発明の別の態様は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を得るための方法に関し、方法は、１）第１の型の細胞を、上述の細胞内で神経幹細胞特異的ポリペプチドの細胞内レベルを増加させることが可能な１つ又はそれ以上の神経幹細胞調節ポリペプチドと接触させて、細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを直接的又は間接的に再構築させて、並びにＮＳＬＣへの第１の型の細胞の形質転換を直接的又は間接的に操作すること、あるいは、２）第１の型の細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを、ヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又はＤＮＡメチル化の阻害剤と接触させて、少なくとも１つの神経幹細胞特異的ポリペプチドの細胞内レベルを増加させて、ＮＳＬＣへの第１の型の細胞の形質転換を直接的又は間接的に操作することのいずれかを含む。
好適な実施形態では、ステップ１）は、ＭＵＳＡＳＨＩ１ポリペプチドの細胞内レベルを増加させることを含む。以下で説明されるように、限定されるものではないが、これは、ＭＵＳＡＳＨＩ１ポリペプチドの一過性発現による、好ましくはこのポリペプチドをコ-ド化する発現ベクタ-をトランスフェクトすることによる、とを含む異なる方法によって達成され得る。
好適な実施形態では、ステップ２）は、ＭＢＤ２ポリペプチドの細胞内レベルを増加させること、又は細胞をＶＰＡ及び５-ＡＺＡで処理することを含む。以下で説明するように、限定されるものではないが、これは、ＭＢＤ２ポリペプチドの一過性発現、好ましくはこのポリペプチドをコ-ド化する発現ベクタ-をトランスフェクトすることによって、及び／又は細胞をＶＰＡ及び５-ＡＺＡで前処理及び／又は処理することを含む異なる方法によって達成され得る。
１つの特別な実施形態では、少なくとも２つの神経幹細胞のための選択可能なマ-カ-を呈する細胞の別の型への第１の型の細胞の再プログラミングは、第１の型の細胞を、神経原性転写因子をコ-ド化するｃＤＮＡを含有するベクタ-と１つのＤＮＡ脱メチル化剤でトランスフェクトすることを必要とする。退行分化を増強させるために、細胞は、ＤＮＡメチル化を阻害する、ヒストン脱アセチル化を阻害する、及び／又は細胞骨格構造を崩壊させる薬剤に露出又は前露出される。例えば、細胞骨格構造を崩壊させる薬剤で細胞を前処理し、続いてＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチル化及びヒストン脱アセチル化の阻害剤の存在中で、2つの神経原性転写因子を含有する1つまたはそれ以上のベクタ-で細胞をトランスフェクトすることによって、退行分化が増強され得る。ヒストン脱アセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又はＤＮＡメチル化の阻害剤は、先に定義されている。
先に定義されたように、方法は、先に定義されたような細胞骨格構造崩壊剤で第１の型の細胞を前処理するステップ、及び／又は先に定義されたような、ＮＳＬＣｓの形態的及び機能的特性の出現及び維持のために適切な1つまたはそれ以上の再プログラミング因子（例えば、レチノイド化合物、神経栄養因子、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＳＨＨ、Ｗｎｔ３ａ、神経ペプチドＹ、エストロゲン）を含む培地中で細胞を培養するステップの予備的ステップを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞ＢＭＰ信号伝達経路を阻害すること（例えば、ＮＯＧＧＩＮ、フェチュイン、又はホリスタチンによる）を更に含む。
好適な実施形態では、第１の細胞からのＮＳＬＣの発生は、1つまたはそれ以上の再プログラミング剤の使用を含む。好適な薬剤としては、限定されるものではないが、Ｍｕｓａｓｈｉ-１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）が挙げられる。他の可能性のある薬剤は、表Ａ及びＢに示されている。
本発明はまた、ニュ-ロン形成を上方制御する蛋白質又は転写物をコ-ド化するＤＮＡ発現ベクタ-の使用に関する。Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２などの定義された再プログラミング剤をコ-ド化する遺伝子的に処理されたＤＮＡ配列が、モノ-、ビ-、又はポリ-シストロンベクタ-を用いて、細胞中に導入され得る。内因性多能性遺伝子の発現は、その細胞中での発現が、細胞の退行分化を直接的又は間接的にもたらす蛋白質をｃＤＮＡがコ-ド化していることを示唆する。新しく退行分化された哺乳類細胞は、上述の哺乳類細胞、組織及び器官を再生するために、ニュ-ロン系統へと再分化することが可能である。
本発明は、一過性トランスフェクションを介して、遺伝子的に処理されたＤＮＡ配列をヒ体細胞中に導入することによって、ＮＳＬＣｓを発生させるための方法に更に関する。
トランスフェクション過程中で導入されたＤＮＡは、核内ゲノム中には挿入されないために、細胞が有糸分裂を行う際に、外部ＤＮＡは経時的に減少する。非複製型を維持する非ウィルスベクタ-は、低い免疫原性を有し、並びに調製かつ使用するために容易かつ安全である。更に、プラスミドはＤＮＡの大きな断片に対応可能である。
１つの特別な実施形態では、方法は、個人から細胞を取得すること、並びにインヴィトロで細胞を再プログラミングしてＮＳＬＣｓを発生させることから開始する。本発明の重要な観点は、ニュ-ロン細胞又はグリア細胞（ニュ-ロン様細胞又はグリア様細胞を含む）への体細胞又は非ニュ-ロン細胞の安定した再プログラミングである。これらは、次いで細胞が取得された同一の患者に戻されて移植され得、これによって、考えられる神経外傷、脳卒中、及び神経変性疾患を含む多くの神経的病状のための自己治療法を作り出すことが可能である。これらはまた、細胞が取得された異なる個人に移植されることもできる。
したがって、本発明の細胞及び方法は、アルツハイマ-病、パ-キンソン病、多発性硬化症、又は脊髄損傷などのような神経的疾患を治療、予防、又は安定化するために有用であり得る。本技術は、インヴィヴォでのＮＳＬＣｓの移植又はインヴィトロでの分化の誘導、並びにインヴィヴォでの神経プロジェニタ-細胞又は特異的なニュ-ロン又はグリア細胞の移植によって実行され得る、臨床治療のための神経幹細胞、神経プロジェニタ-細胞、ニュ-ロン及びグリア細胞の十分なソ-スを提供する。
別の実施形態では、方法は、体細胞又は非ニュ-ロン細胞を単離し、細胞形態とクロマチン構造を変更する１つ又はそれ以上の薬剤にさらすこと、並びに神経原性転写因子をコ-ド化する少なくとも１つのｃＤＮＡを含有する１つまたはそれ以上の遺伝子で細胞をトランスフェクトすることを含む。遺伝子トランスフェクションステップは、細胞内で神経原性転写因子の発現を誘導する別の薬剤に置き換えられてもよい。ＤＮＡ及びヒストンの後成的改変（具体的には、ＤＮＡ脱メチル化及び開放染色体構造）を誘導することは、細胞の真の再プログラミングを促進する。別の実施形態では、例えば５％Ｏ２の低酸素環境中で細胞がインキュベ-トされ、これによって、細胞の再プログラミングを補助する。
本方法論は、ＮＳＬＣ中への細胞の再プログラミングを可能にする。再プログラムされた細胞の発達の更なる過程及び拡大は、細胞が曝されるインサイチュの環境因子に依存する。本発明の実施形態は、発生したＮＳＬＣを増大させる適切な分化培地中、例えば、神経幹細胞が増殖するよう促進するための上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子が加えられた、Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、再プログラムされた細胞を増殖することを更に含む。
本発明によって得られたＮＳＬＣｓは、適切な培地中で、例えば、ニュ-ロン細胞及び／又はグリア細胞へと向かうＮＳＬＣｓの分化を誘導するためのオ-ルトランスレチノン酸又はビタミンＡのようなレチノイド化合物とびＢＤＮＦを含有するＮＳ-Ａ分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＮｂＡｃｔｉｖｅ培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ（登録商標））中で、ニュ-ロン、星状細胞、及び／又は希突起神経膠細胞系へと分化され得る。ニュ-ロン細胞は、ニュ-ロン細胞型に関連する１つまたはそれ以上の神経特異的な形態学的、生理学的、機能的及び／又は免疫学的特徴を表す細胞を含む。有用な基準特徴としては、形態学的特徴（例えば、長脚又は神経突起）、ニュ-ロン特異的マ-カ-又は抗原のセットの発現のような生理学的及び／又は免疫学的特徴、ド-パミン又はγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のような神経伝達物質の合成、並びにイオンチャンネル又はニュ-ロンの活性電位特性のような機能特性が挙げられる。
本方法によると、再プログラムされた細胞は、未トランスフェクト細胞と比較しての示差接着特性に基づいて選択され得、例えば、再プログラムされた細胞は、浮遊する神経球を形成し、かつラミニン上で良好に成長することができるのに対し、未トランスフェクト繊維芽細胞は正規の細胞培養処理されたプレ-ト上に取り付きかつ良好に成長する。再プログラムされた細胞は、１つまたはそれ以上の神経幹細胞に特異的なマ-カ-及び形態、並びに元の細胞に関連するいくつかの又は全ての特異的マ-カ-の損失を表す。更に、神経様細胞（ＮＬＣｓ）の機能性のいくつかは、例えば、パッチクランプ法、シナプトフィシン及びＭＡＰ２ｂに関する免疫染色法、及び酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫化学的方法によって異なる時点にて評価され得る。
特定の実施形態では、本発明は、組織損傷の部位にて中枢神経系再生を開始しかつ指向することが可能であり、並びに個々の患者自身の細胞をドナ-又は出発細胞として用いる個々の患者のためにカスタマイズされ得るＮＳＬＣｓを提供する。本発明は、個々の患者から細胞を発生させることに使用され得、これによって、多くの神経学的病状のための治療法として可能である自己移植を創り出すことができる。したがって、本技術は、免疫的拒絶及び疾患の感染のリスクなどの非ホスト細胞の移植に関連する問題を排除する。本発明の大きな利点は、移植に適した自己移植片のための本質的に無制限の供給を提供することである。したがって、本発明の方法は、現行の材料の供給源及び移植の方法に関連する重要な問題を排除するであろう。
ポリヌクレオチドの送達
特定の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド、例えば、ＭＢＤ２ポリペプチド、ＭＵＳＡＳＨＩ１ポリペプチド及び／又はＮｇｎ２ポリペプチドをコ-ド化するポリヌクレオチドの使用に関する。ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法は、当業者に周知である。ヌクレオフェクション及び／又はリポフェクションなどのトランスフェクション法、又はトランスフェクションの他のタイプが用いられ得る。例えば、所望のポリペプチドをコ-ド化するポリヌクレオチドが、複製及び／又は発現のために、真核細胞中のトランスフェクションのために中間のベクタ-中にクロ-ニングが行われ得る。核酸の記憶又は操作のための、あるいは蛋白質の生産のための中間のベクタ-は、例えば、原核細胞ベクタ-（例えば、プラスミド）、シャトルベクタ-、昆虫ベクタ-、又はウィルスベクタ-であり得る。所望のポリペプチドはまた、融合核酸によってコ-ド化され得る。
クロ-ン化された核酸の発現を得るために、典型的には、転写に向かうプロモ-タ-を含有する発現ベクタ-にサブクロ-ン化される。好適な細菌及び原核細胞プロモ-タ-は、周知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。選択した核酸の発現に向かわせるために使用されるプロモ-タ-は、個々の用途に依存する。例えば、強い構成型プロモ-タ-が、発現及び精製のために典型的に使用される。対照的に、退行分化蛋白質又は化合物がインヴィヴォで使用される場合、蛋白質の特別な使用に依存して、構成型あるいは誘導可能なプロモ-タ-又は化合物のいずれかが使用される。更には、ＨＳＶ ＴＫ又は同様な活性を有するプロモ-タ-のような弱いプロモ-タ-が使用され得る。プロモ-タ-はまた。転写活性化に反応性の要素、例えば、低酸素反応要素、Ｇａ１４反応性要素、ｌａｃリプレッサ-反応性要素、及びｔｅｔ-調節系及びＲＵ-４８６系などのような小分子制御系などの要素を典型的に含む。
プロモ-タ-に追加して、発現ベクタ-は、典型的に、原核細胞又は真核細胞のいずれかのホスト細胞中での核酸の発現に必要である追加の要素を含有する転写ユニット又は発現カセットを含有する。典型的な発現カセットは、したがって、例えば核酸に操作可能となるように結合されたプロモ-タ-、並びに例えば、転写物の有効なポリアデニル化、転写終結、リボソ-ム結合、及び／又は翻訳終結のために必要とされる信号を含有する。カセットの追加の要素としては、例えば、エンハンサ-、異種性スプライシングされたイントロン信号などが挙げられる。
真核細胞ウィルスからの調節要素を含有する発現ベクタ-は、例えば、ＳＶ４０ベクタ-、パピロ-マウィルスベクタ-、及びＥｐｓｔｅｉｎ-Ｂａｒｒウィルスから誘導されたベクタ-などのような真核細胞発現ベクタ-中で頻繁に使用される。他の代表的な真核細胞ベクタ-としては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ-５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、並びにＳＶ４０初期プロモ-タ-、ＳＶ４０後期プロモ-タ-、メタロチオネインプロモ-タ-、ネズミ乳房腫瘍ウィルスプロモ-タ-、ニワトリ肉腫ウィルスプロモ-タ-、ポリヒドリンプロモ-タ-、又は真核細胞中での発現に有効であると示された他のプロモ-タ-などの指示の元で、蛋白質を発現させる任意の他のベクタ-が挙げられる。
大量の退行分化蛋白質を発現し、必要に応じて、標準的技法を用いて精製され得る細菌、哺乳類、酵母、昆虫、又は他の細胞を生成するために、標準トランスフェクション法が用いられ得る。
外部ヌクレオチド配列をホスト細胞へ導入するための任意の手法が用いられ得る。これらは、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ-デキストラン介在トランスフェクション法、ポリブレン介在トランスフェクション法、プロトプラスト融合法、電気泳動法、電気窄孔法、脂質介在送達法（例えば、リポソ-ム法）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、裸ＤＮＡの導入、プラスミドベクタ-、ウィルスベクタ-（エピソ-ム及び組込みの両者）並びにクロ-ン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外部遺伝子物質をホスト細胞に導入するための周知の他のいずれかの方法が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、ｓｕｐｒａ参照）。選択した蛋白質を発現することが可能なホスト細胞に、少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入することが可能であるように用いられる特別な遺伝子操作手技が必要なだけである。
通常のウィルス及び非ウィルス系遺伝子送達法が、核酸を哺乳類細胞又は標的組織へと導入するために用いられ得る。このような方法は、インヴィトロで、再プログラミングポリペプチドをコ-ド化する核酸を細胞に投与するために用いられ得る。好ましくは、インヴィヴォ又はエクスヴィヴォの遺伝子治療用途のために、核酸が投与される。非ウィルスベクタ-送達システムとしては、ＤＮＡプラスミド、裸核酸、及びリポソ-ムのような送達ビヒクルとの核酸複合体などが挙げられる。ウィルスベクタ-送達システムとしては、細胞への送達後エピソ-ムゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウィルスが挙げられる。
核酸の非ウィルス送達の方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、弾道法、ビロソ-ム法、リポソ-ム法、免疫リポソ-ム法、ポリカチオン又は脂質-核酸複合体法、裸ＤＮＡ法、人工ビリオン法、及びＤＮＡの薬剤増強組込み法などが挙げられる。ポリヌクレオチドの効果的受容体認識リポフェクションに適したカチオン性及び中性脂質が知られている。核酸は、細胞へ（エクスヴィヴォ投与）又は標的組織へ（インヴィヴォ投与）送達され得る。免疫脂質複合体などのような標的化リポソ-ムを含む脂質：核酸複合体の調製物は、当業者に周知である。
核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウィルス系システムの使用は、体内の特異的細胞へのウィルスの標的化のための並びにウィルスペイロ-ドを核へと輸送するための高度に進化した過程の利点を生かす。ウィルスベクタ-は、患者に（インヴィヴォ）直接的に投与され得、並びにインヴィトロで細胞を処理するために使用され得、この中で、修飾細胞が患者に投与される(エクスヴィヴォ)。送達のための通常のウィルス系システムは、レトロウィルス、レンチウィルス、ポックスウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、水疱性口炎ウィルス及びヘルペスウイルスベクタ-が挙げられ、レトロウィルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウィルス遺伝子送達法を含む特定のベクタ-によるホストゲノム中への組込みが可能ではあるが、挿入された移入遺伝子の長期間の発現をしばしばもたらす。更には、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型及び標的組織中で観察されている。
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ-Ｓは、臨床試験で用いられてきたレトロウィルスベクタ-の例である。一過性発現が好ましい適用において、アデノウィルス系システムは有用である。アデノウィルス系ベクタ-は、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を可能し、並びに感染が可能であるために、分裂している細胞及び非分裂の細胞の双方に拡散を送達可能である。このようなベクタ-を使用して、発現の高い力価及びレベルが取得されてきた。アデノウィルスベクタ-は、比較的単純なシステム中で大量に生産され得る。
遺伝子治療ベクタ-は、典型的には全身投与（例えば、静脈注入、腹腔内注入、筋肉内注入、皮下注入、又は頭蓋内注入）によって、個々の患者に投与することによって、インヴォヴォにて送達され得る。あるいは、ベクタ-は、個々患者から体外移植された細胞（例えばリンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など）又は不特定ドナ-の造血幹細胞のような細胞にエクスヴィヴォにて送達され得、これに続いて、通常は再プログラムされた細胞の選択後に、患者に細胞が再移植される。
診断、研究、又は遺伝子治療（例えば、宿主生物体へのトランスフェクトされた細胞の再注入）のためのエクスヴィヴォでの細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好適な実施形態では、細胞が被験生体から単離され、核酸（遺伝子又はｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、被験生体（例えば患者）へと再注入される。エクスヴィヴォトランスフェクションに好適な種々の細胞型が、当業者には周知である。
治療的核酸を含有するベクタ-（例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、リポソ-ムなど）はまた、インヴィヴォにおける細胞のトランスフェクションのために、成体に直接的に投与され得る。あるいは、裸ＤＮＡが投与され得る。投与は、最終的に血液又は組織細胞と接触するように分子を導入するために通常用いられる任意のル-トによる。このような核酸を投与する好適な方法は、選択可能であり、かつ当業者に周知であり、並びに特別な組成物を投与するために１つ以上のル-トが使用され得るが、特定なル-トは、他のル-トよりもより即効性でかつより効果的な反応をしばしば提供することができる。
薬剤学的に許容可能な担体が、投与される特定の組成物、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、多種多様な本発明の医薬組成物の好適な構造がある。
ポリペプチドの送達
本明細書に記載された方法の全てではないにしてもほとんどで、代替的可能性は、ポリヌクレオチドの使用をバイパスすることと、増加した細胞内レベルが望まれるような化合物（例えば、ポリペプチド）と第１の型の細胞を接触させることからなる。他の実施形態では、例えば特定のインヴィトロ状態で、細胞が１つ又はそれ以上の機能的ポリペプチドを含有する培地中で培養される。
ポリペプチドを投与する上で重要な因子は、ポリペプチドが細胞の原形質膜、又は核などの細胞内区画を通過する能力を有することを確実にすることである。細胞の膜は、小さな、非イオン性親油性化合物に対しては自由透過性であり、並びに極性化合物、巨大分子、及び治療的又は診断的薬剤に対しては固有に非透過性であるような脂質-蛋白質二重層から構成される。しかし、細胞膜を通過させてポリペプチドを輸送させる能力を有するような蛋白質、脂質及び他の化合物が述べられている。例えば、「膜輸送ポリペプチド」は、膜輸送担体として作用する能力を有する両親媒性又は疎水性アミノ酸サブ配列を有する。本発明による、増加した細胞内レベルが所望されるようなポリペプチドは、それらの細胞への取り込みを促進するために、好適なペプチド配列に結合され得る。増強された細胞の取り込みを提供する他の好適な化学的部分もまた、ポリペプチドに共有的又は非共有的のいずれかで結合され得る。ポリペプチドを細胞膜を通過して輸送させる能力を有するような、他の好適な担体もまた使用される。
所望のポリペプチドはまた、リポソ-ム及び免疫リポソ-ムのようなリポソ-ム誘導体を介在して、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞へと導入され得る。用語「リポソ-ム」は、水性相を封入する、１つまたはそれ以上の同心円状に配列した脂質二重層から構成された小胞を指す。水性相は、典型的には、細胞に送達される化合物を含有する。特定の実施形態では、特別な細胞型、組織などに特異的である標的部分を用いて、リポソ-ムを標的化することが望ましい可能性がある。種々の標的部分（例えば、リガンド、受容体、及びモノクロ-ナル抗体）を用いてのリポソ-ムの標的化は、先に述べられている。
細胞及び細胞系
本発明は、細胞、細胞系、幹細胞及び本明細書で記載されたいずれかの方法から誘導された精製された細胞調製物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞、細胞系、幹細胞及び精製された細胞調製物は、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、又はヒツジなどを含む哺乳類由来である。好適な実施形態では、それらはヒトに由来する。
したがって、本発明の別の態様は、修飾した細胞、細胞系、多分可能性、多能性又は単分化能性細胞及び精製した細胞調製物に関し、これら細胞のいずれかは、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）；Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２；Ｍｓｉ１及びＭＢＤ２；Ｎｇｎ２及びＭＢＤ２；Ｍｓｉ１、Ｎｇｎ２及びＭＢＤ２；Ｍｓｉ１、Ｎｇｎ２、Ｎｅｓｔｉｎ及びＭＢＤ２；Ｍｓｉ１とＮｇｎ２とＭＢＤ２を含むことが好ましい表Ａからの他の可能な組み合わせをコ-ド化する外因性ポリヌクレオチドを含む。好適な実施形態では、本発明による細胞は、幹様細胞であり、より好ましくは神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）であって、細胞は以下の１つ又はそれ以上の特性を所有する。特性は、Ｓｏｘ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、Ｍｓｉ１、及びＮｇｎ２からなるグル-プから選択された１つ又はそれ以上の神経幹細胞マ-カ-を発現すること、ＮＳＬＣがそこから取得された細胞（表Ｃ参照）に特異的な１つまたはそれ以上の遺伝子の減少した発現をすること、神経球コロニ-形成アッセイ中での神経球を形成すること、懸濁液中又は接着培養として培養されることが可能なこと、外因性再プログラミング剤の存在なしに、一ヶ月間を超えて、好ましくは２か月間を超えて、３か月間を超えて、５か月間を超えて、及び１年間以上にわたって培養されることが可能なこと、低継代数にて３６時間毎に分裂することが可能なこと、テロメラ-ゼ活性に対して陽性であること、ニュ-ロン様細胞、星状様細胞、希突起膠様細胞及びそれらの組み合わせへと分化することが可能であること、分化後のテロメラ-ゼ及び１つまたはそれ以上の神経幹細胞マ-カ-の減少した発現をすること、ニュ-ロン様細胞への分化後に、長さで１つの細胞の直径よりも大きな、１つまたはそれ以上の形態的神経突起様過程（軸索及び／又は樹状突起）を有すること、ニュ-ロン様細胞への分化後、神経特異的チュ-ブリン、微小管関連蛋白質２、ＮＣＡＭ、及び神経伝達物質のためのマ-カ-からなるグル-プから選択される少なくとも１つ神経特異的抗原の発現をすること、ニュ-ロン様細胞への分化後、１つ又はそれ以上の機能的神経マ-カ-（例えば、シナプシン）の発現をすること、ニュ-ロン様細胞への分化後、１つまたはそれ以上の向神経因子を放出することが可能であること、腫瘍コロニ-形成アッセイが陰性であること、ＳＣＩＤマウスでの腫瘍成長が陰性であること、ＳＣＩＤマウスでの混合腫瘍成長が陰性であること、除脳術モデルの空隙へのＮＳＬＣｓの適切な数の置換後に、１つまたはそれ以上の範関数測度の著しい改善が可能であること、ＮＳＬＣｓの適切な数のＥＡＥモデルへの注入後に、１つまたはそれ以上の範関数測度の著しい改善が可能であること、並びにＣＮＳ損傷中又は神経変性モデル中のｈＮＰＣｓよりも１つまたはそれ以上の範関数測度の著しい改善が可能であることの項目である。上記項目の全ての例は、本願の実施例部分に記載されている。
好適な実施形態では、本発明によるＮＳＬＣは、以下の特性の全てを所有し、これらは、体細胞よりの著しく長い時間の自己再生の能力、癌性細胞ではないこと、安定であり、並びに強制的遺伝子発現又は同様の法によって人工的に維持されることがなく、標準神経幹細胞培地中で維持され得ること、プロジェニタ-細胞、前駆体細胞、体細胞又は同一の細胞系統の別のより分化した細胞型へと分化することができること、幹細胞の特性を有し、並びに特定のマ-カ-又は遺伝子発現あるいは形態的外観のみを有しないこと、インヴィヴォにての未秩序成長、奇形種形成、及び腫瘍形成を示さないことである。
１つの特別な実施形態では、本発明による再プログラムされた細胞（ＮＳＬＣｓ）は、それらの神経幹細胞マ-カ-と、ニュ-ロン様細胞、星状様細胞、及び希突起膠様細胞に向かって分化するそれらの能力を失うことなく、数か月間にわたって増殖することが可能である。神経系統の発生は、形態、表現型変化及び機能性に基づいて特性化される。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、以下の特性及び特徴のうちの１つまたはそれ以上を有してもよく、これらは、自己再生性、インヴィトロ及びインヴィヴォでの多系統分化、クロ-ン形成能、正常核型、明確に定義された培養条件下でのインヴィトロにおける広範な増殖、及び凍結及び溶解される能力、並びに幹細胞に典型的な一般的に知られた及び／又は望ましい特徴又は特性のいずれかである。本発明の細胞は、多能性又は多分可能性細胞の分子マ-カ-（すなわち、先に定義されたような遺伝子及び表面マ-カ-）を更に発現してもよい。
本発明の別の態様は、組織特異的自家（自己）性幹細胞及び／又はプロジェニタ-細胞の生成に関する。これら幹細胞及び／又はプロジェニタ-細胞は、細胞の変性の疾患を治療するための細胞治療用途で用いられてもよい。細胞の変性の疾患としては、例えば、脳卒中、アルツハイマ-病、パ-キンソン病、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、黄斑退化症などのような神経変性疾患、骨粗鬆症、骨関節炎、骨折、骨破断、糖尿病、肝臓損傷、変性疾患、心筋梗塞、火傷及び癌などのような骨溶解性疾患が挙げられる。本発明による細胞は、ホストへと移植又は移入され得ると想定される。本発明の利点は、免疫系拒絶のリスクがなく、移植のための多数の自己幹細胞が生成され得ることである。これらの細胞は、個人への移植に適した組織の生成へと導くことができる。組織は被移植者から誘導されるために、非血縁ドナ-からの組織で起こり得るような免疫応答を刺激することはない。そのような移植は、組織（例えば、静脈、動脈、皮膚、筋肉）、固形臓器移植片（例えば、心臓、肝臓、腎臓）、ニュ-ロン細胞移植片、又は例えば白血病又はリンパ腫などの種々の悪性疾患の治療で使用されるような骨髄移植片を構成することができる。神経幹細胞、神経プロジェニタ-細胞、又はニュ-ロン細胞（並びにＮＳＬＣｓ及びそれらの誘導体）移植片はまた、例えば、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、パ-キンソン病など、並びに心筋梗塞のような可能性のあるいくつかの神経疾患の治療でも用いられ得る。
本発明の別の態様は、後続するホストへの移植又は移入のためのエクスヴィヴォで処理された組織を生成するための方法に関し、これら処理された組織の細胞の構成成分は、本発明による細胞、又はそれらから誘導された細胞を含む。例えば、本発明の細胞の増殖した培養物は、成長因子及び／又はモルフォゲンでのインヴィトロ処理によって分化され得る。分化した細胞の群が、次いで損傷又は障害の部位の近くでレシピエント宿主に移植されるか、又は記載されたように、処理された組織を発生させるために、インヴィトロで培養される。
本明細書で記載された本発明の方法及び細胞は、例えば細胞系を発生させるように、細胞の不死化のために用いられ得る。本明細書で開示された方法を使用して、体細胞が、分化した表現型を有する細胞へと形質転換され得、これによって、種々の組織からの細胞系の発生を促進する。したがって、本発明は、このような不死化細胞を包含する。
更には、本発明による細胞を誘導させる方法は、限定されるものではないが、科学的及び治療的用途で有益である可能性があり、これらは、（ａ）細胞生育及び遺伝子研究を包含する科学的発見及び研究（例えば、細胞の分化、退行分化、又は再プログラミングを研究するためのモデル細胞系としてヒト幹細胞の代わりに使用する）、（ｂ）医薬品開発及び発見（例えば、特定の医薬品候補物質及び薬品の効能及び毒性に関するスクリ-ニング、細胞の分化、退行分化、又は再プログラミングを仲介する候補薬物及び薬品に関するスクリ-ニング）、（ｃ）遺伝子治療（例えば、遺伝子治療のための送達装置としての）、並びに（ｄ）限定されるものではないが、パ-キンソン病、アルツハイマ-病、ハンチントン病、テイ-サックス病、ゴ-シェ病、脊髄損傷、脳卒中、火傷及び他の皮膚損傷、心臓疾患、糖尿病、ル-プス病、骨関節炎、肝臓疾患、ホルモン異常、腎臓疾患、白血病、リンパ腫、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、デュシェ-ヌジストロフィ-、個体発生不全、先天性異常、不妊症、流産、及び他の癌、変性疾患並びに他の疾病及び疾患などの損傷、外傷、疾病及び疾患の治療である。
追加的態様は、治療方法、処置の方法並びに哺乳類（例えば、ヒトの被験者）の組織又は臓器を再生する方法に関する。１つの特別な方法は、哺乳類組織又は臓器を再生する方法に関し、これは本明細書で記載したようなＳＬＣ、ＮＳＬＣ、又は他の所望の細胞又は人工的組織構築物に、再生される組織又は臓器を接触させることを含む。ＳＬＣ、ＮＳＬＣ、所望の細胞又は人工的組織構築物は、適切なル-トを使用して（例えば、細胞を組織又は臓器、若しくは血流中に髄腔内注入又は直接的に注入すること）、被験者に投与することによって、再生される組織又は臓器の近くに配置されてもよい。
必要としている被験者の組織又は臓器を修復又は再生する別の方法は、組織又は臓器の細胞中での少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導する化合物、及び／又は被験者のインヴィヴォでの形質転換又は退行分化を可能にする細胞中で少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導する化合物を被験者に投与することを含む。したがって、少なくとも１つの遺伝子調節因子の発現は、細胞を異なる型の細胞（例えば、神経幹様細胞）へと再プログラムし、これら異なる型の細胞は、上述の組織又は臓器の修復又は再生に有効である。
別の方法は、患者から細胞又は組織（例えば、造血幹細胞、繊維芽細胞、又は角化細胞）を取得することと、そのような細胞又は組織の複数個を再プログラムすること、並びに再プログラムされた細胞又は組織を患者に再導入することを含む。関連する態様では、複数個の所望の細胞、ＳＬＣ及び／又は神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）又は本明細書で記載された再プログラムされた組織を含む医薬組成物に関する。
本発明の治療法は、限定されるものではないが、脳、脊髄、心臓、目、網膜、内耳、皮膚、筋肉、腸、膵臓（β細胞を含む）、腎臓、肝臓、肺、骨、骨髄、軟骨、軟骨板、毛包、歯、血管、腺（内分泌腺及び外分泌腺を含む）、卵巣、生殖器、乳房及び胸部組織などを含む種々の組織及び臓器の再生及び修復に適用され得る。
関連する態様は、複数個の所望の細胞、本明細書で記載されたようなＳＬＣ及び／又は神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）を含む医薬組成物に関する。
組織
本明細書の別の態様は、必要とする被験者に移植され得る、本明細書で記載されたような再プログラムされた細胞を含有する組織に関する。
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、細胞とこれら細胞から生成された細胞外マトリクスを含むインヴィトロで生成された３Ｄ組織構築物などの組織内での細胞の再プログラミングを提供する。更には、トランスフェクトされた細胞は、完全に自己性で作られ得、これによって宿主拒絶が防止され、完全に免疫適合性にすることが可能で、並びにインヴィヴォにて移植される再プログラムした細胞のための担体としてのこれら３Ｄ組織構築物の最上部に播種され得る。有利なことに、これら新しく創り出された細胞は、インヴィトロの診断的目的又は細胞治療／組織交換アプロ-チにおける必要とする患者へのそのような組織構築物の移植のために、これら組織内において、細胞が未分化及び／又は分化された状態で使用され得る。
本発明は、３Ｄのニュ-ロン様多層組織を更に包含する。本発明による神経幹様細胞へと再プログラムされたＣＤＭ内の細胞は、ＣＤＭ内のニュ-ロン様細胞、星状様細胞、希突起膠様細胞へと容易に分化する。したがって、ＣＤＭ内の細胞を再プログラムして、３Ｄのニュ-ロン様多層組織（３０個の細胞層まで）を形成するために、本発明のＣＤＭ及び再プログラミングの方法を用いることが可能である。このような３Ｄ組織は、ニュ-ロン（又は具体的には、ニュ-ロン様細胞）、星状細胞（又は具体的には、星状様細胞）、及び希突起神経膠細胞（又は具体的には、希突起神経膠様細胞）を含み、並びにこれは完全に自己性で作られ、手動で取り扱うことができて、かつ比較的簡単に移植され得、並びにインヴィトロＣＮＳ組織モデルとして使用可能である。
１つの特別な態様は、インヴィトロで培養された細胞と、インヴィトロで培養された細胞の３Ｄ組み立て品と、これら細胞から生成された細胞外マトリックスを含む人工的組織構築物に関する。細胞は、所望の細胞、本明細書に記載された方法のうちのいずれか１つを用いて取得されたＳＬＣ及び／又は複数個の神経幹様細胞（ＮＳＬＣ）であり得る。
スクリ-ニング法
本発明の別の態様は、第１の型の細胞を所望の異なる型の細胞へと形質転換することが可能な新しい化合物（例えば、小分子、医薬品など）を同定するための方法に関する。これら新しい化合物は、研究目的で又は被験者の組織の修復または再生で使用するための薬剤として有用であり得る。
実施例部分は、このような望ましい活性化合物をスクリ-ニングしかつ同定するために有用な原理、方法及び技術を提供する。例えば、細胞中のＭｕｓａｓｈｉ１、ＮＧＮ２又はＭＢＤ２の一過性の増加によって提供された「誘導」又は「生物学的活性」を試験される候補化合物（例えば、小分子又は化合物のライブラリ）によって置換することによって、並びにＮＳＬＣを発生させる中での候補化合物の活性又は効能を測定することによって、第１の型の細胞のＮＳＬＣへの形質転換を誘導するであろう化合物をスクリ-ニングすると考えられることを、当業者は理解されるであろう。個々の活性化合物又は混合物は、これらポリペプチドと比較して、それらが同一の活性を有する場合並びに／又は同一又は同様な効果を提供する場合（例えば、以前に定義されたような、細胞形質転換及び／又は任意の所望のマ-カ-又は望ましい特性）、選択されるであろう。例えば、繊維芽細胞をＮＳＬＣへと形質転換することが可能な化合物又は化合物の混合物は、以下の方法で同定され得る。
（ｉ）実施例１のように、繊維芽細胞のセッティングを行い、培養し、ＮＳＬＣに形質転換し、
（ｉｉ）別個のウェル中で、Ｍｓｉ１、Ｎｇｎ２及び／又はＭＢＤ２をそれぞれの候補化合物と置き換えることによって、化合物のライブラリをスクリ-ングし、
（ｉｉｉ）候補化合物が繊維芽細胞をＮＳＬＣｓに形質転換することが、置き換えられたＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及び／又はＭＢＤ２と同程度に可能である場合、化合物「ヒット」を同定し、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）部分からの化合物が全てのＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及びＭＢＤ２を置換せず、並びにそれ自体によって繊維芽細胞をＮＳＬＣｓへ形質転換することができない場合、次に（ｉｉｉ）からの化合物をそれぞれのウェルに入れることによって、（ｉｉ）部分では除去されていなかったＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及び／又はＭＢＤ２を、異なるウェル中のそれぞれの候補化合物で置き換えることによって化合物のライブラリを測定すること、
（ｖ）（ｉｉｉ）部分からの化合物と一緒に、候補化合物が、置換されたＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及び／又はＭＢＤ２とほぼ同程度に繊維芽細胞をＮＳＬＣｓへと形質転換させることが可能な場合、化合物「ヒット」を同定し、
（ｖｉ）（ｖ）部分からの化合物がＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及び／又はＭＢＤ２の全てを置換せず、並びに（ｉｉｉ）部分からの化合物と一緒に繊維芽細胞をＮＳＬＣｓへと形質転換することができない場合、次いで（ｉｉｉ）及び（ｖ）部分からの化合物をそれぞれのウェルに入れることによって、（ｉｉ）部分では除去されていなかったＭｓｉ１、Ｎｇｎ２又はＭＢＤ２を異なるウェルにて、それぞれの候補化合物で置き換えることによって、化合物のライブラリをスクリ-ニングし、
（ｖｉｉ）（ｉｉｉ）及び（ｖ）部分からの化合物と共に、置換されたＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及び／又はＭＢＤ２とほぼ同程度に、候補化合物が繊維芽細胞をＮＳＬＣｓへと形質転換できる場合、化合物「ヒット」を同定し、
（ｖｉｉｉ）（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）部分からの化合物の組み合わせが繊維芽細胞をＮＳＬＣへ形質転換させることができるような場合、これらの化合物に対する修正が行われ得、これらの化合物のより有効かつ安全な変型を更にスクリ-ニングする。
同じ原理が、多分化能様細胞、内胚葉系中胚葉様細胞、膵臓プロジェニタ-様細胞などを含む幹様細胞の他の所望の型にも適用可能である。表Ａ及びＢ、並びに実施例部分は、細胞のこれらの型のそれぞれに関して、このようなスクリ-ニング法で検討されるべき可能性のある遺伝子及び／又は化合物のリストを提供している。
したがって、本発明は、これら方法と、本明細書で記載されたような再プログラミング因子及び／又は遺伝子調節因子の効能と比較する場合に、第１の型の細胞の所望の異なる型の細胞への形質転換におけるその効能に関して、候補化合物が試験されるような任意の同等のスクリ-ニング法とを包含する。
神経栄養因子の送達
神経栄養因子の局所的送達は、神経学的病状を治療するための方法として提案されてきた。神経栄養性分子を用いる戦略は、ニュ-ロンの進行性欠損の防止、ニュ-ロン接続及び機能（神経保護）の維持、並びに増加した神経伝達物質の代謝回転及び／又は軸索の新芽形成（神経再生）に焦点を合わせている。現在まで、神経親和性因子を動物モデルに送達させるための数種の治療的戦略が検討されてきたが、今までのところ、脳及び神経系に及ぼす成長因子の効果を試験することは、副作用の重大なリスクを運ぶこれら因子の多量の投与量の直接的周囲注入は制限されてきた。したがって、本発明の関連する態様は、移植後に興味のある成長因子安定して発現し並びに分泌することができる本発明によるＮＳＬＣ細胞及び細胞系を使用することによる、これら問題の克服に関する。
概括すれば、本発明は、１）宿主細胞（例えばニュ-ロン）の損失を補うため又は２）遺伝子ベ-スの薬剤を送達する媒体として、神経幹細胞、ニュ-ロン、星状細胞又は希突起膠細胞の移植を必要する実質的な臨床治療のための神経幹様細胞、ニュ-ロン様細胞、星状様細胞又は希突起膠様細胞の豊富な供給源を提供する。更に、本発明は、基本的研究及び医薬品スクリ-ニングにおける新規な神経学的ツ-ルを提供する。
当業者は、僅かな日常的実験、本明細書に記載された特別な手順、実施形態、請求の範囲、及び実施例に対する多数の等価物を使用することを認識されるであろうし、又は確認できるであろう。このような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、並びに添付された特許請求の範囲によってカバ-されている。本発明は、以下の実施例によって更に説明されていて、これらは本発明を更に限定するものと解されるべきではない。
実施例
以下の本明細書に開示された実施例は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）を含む再プログラムされた及び退行分化された細胞を得るための代表的方法を提供する。更に提供されたものは、代表的プロトコル、分子ツ-ル、プロ-ブ、プライマ-及び技術である。
実施例Ｉ
ヒト繊維芽細胞の調製
ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）から購入し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏの変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた細胞培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖された。培地は１週間に２回交換された。トリプシン０．２５％を用いて、３７℃で４分間、細胞がトリプシン処理され、続いて、トリプシン阻害剤溶液を添加し、遠心分離によって細胞をペレット状にして、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、更に細胞の適当数に到達するまで、組織培養フラスコ上、１：２の比にて、細胞を平板培養した。
次いで、細胞をトリプシン処理し、２つの異なる組成物のＣＤＭ培地中で、ラミニン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で前コ-ティングされた細胞培養プレ-トに、細胞をプレ-トし（８×１０４細胞／ウェル）、２つの異なる組成物のＣＤＭ培地は、ＣＤＭ Ｉ培地が、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｌ-グルタミンとピリビン酸ナトリウムを加えた高グルコ-ス（４．５ｇ／Ｌ））と、ＥＧＦ（４．２×１０-１０Ｍ）、ｂＦＧＦ（２．８×１０-１０Ｍ）、ＩＴＳ（８．６×１０-５Ｍ）、デキサメタゾン（１．０×１０-７Ｍ）、Ｌ-３，３’，５-トリヨ-ドチロニン（２．０×１０-１０Ｍ）、エタノ-ルアミン（１０-４Ｍ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（４×１０-３Ｍ）、及びグルタチオン
（３．３×１０-５Ｍ）の成分で補充され、Ｌ-アスコルビン酸が存在しないＨａｍのＦ-１２培地との３：１の比からなる。
ＣＤＭ ＩＩ培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｌ-グルタミンとピリビン酸ナトリウムを加えた高グルコ-ス（４．５ｇ／Ｌ））と、ＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、エタノ-ルアミン（２．０３ｍｇ／ｍｌ）、インシュリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、亜セレン酸（２．５μｇ・ｍｌ）、デキサメタゾン（１９．７μｇ／ｍｌ）、Ｌ-３，３’，５-トリヨ-ドチロニン（６７５ｎｇ／ｍｌ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（４×１０-３Ｍ）、及びグルタチオン（３．３×１０-５Ｍ）の成分
で補充されたＨａｍのＦ-１２培地との３：１の比からなる。
構築されたベクタ-を使用するリポフェクタミンによるＨＦＦの一過性トランスフェクション
培養２日後、製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２（２μｇ）（ＤＮＡ脱メチル化剤）で、細胞がトランスフェクトされた。ＤＮＡ-脂質複合体が細胞に添加され、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベ-トされた。ＤＮＡ脱メチル化剤を使用してのトランスフェクションから２４時間後に、培地が交換され、細胞が、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｕｓａｓｈｉ１（２μｇ、Ｏｒｉｇｅｎｅ）又はｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２（２μｇ、Ｏｒｉｇｅｎｅ）で２４時間トランスフェクトされた。２４時間後、培地がノギン（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補充された神経プロジェニタ-基本培地（ＮＰＢＭ、Ｌｏｎｚａ）に交換され、この増殖培地中で培養された。３日後、細胞が再トランスフェクトされ、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２中でインキュベ-トされた。増殖条件中７日後に、増殖培地の５０％が、ホルスコリン（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、オ-ルトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、５μＭ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＮＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及びＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充された分化培地（ＮｂＡｃｔｉｖｅ、ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）に交換され、分化培地のパ-センテ-ジが増殖培地のパ-センテ-ジを超えるように増加させることによって、培地が毎日交換され、細胞が２０日間培養された。
トランスフェクションに引き続いて毎日、明視野１０×倍にての顕微鏡観察を使用して再プログラムされた細胞の目視観察が実施された。異なる時点（６、１２及び２０日）でサンプルが回収され、遺伝子アレイと免疫組織化学法によって、ニュ-ロン遺伝子発現と蛋白質レベルが解析された。トランスフェクションに続いて、再プログラミング細胞は、トランスフェクション後３日以内で、細胞の形態で迅速な変化を示した（図１）。細胞が更に処理され、６日目及び１２日目に、延長した細胞質の突起を備えた収縮した細胞体を形成するように、並びに神経細胞体外観を呈するように、細胞の細胞質が核に向かって引き戻され、これが２０日目まで維持された。しかし、この形態は、未トランスフェクト細胞では、６日目及び１２日目には観察されなかった。
遺伝子アレイ解析
トランスフェクション後に新しく処理された細胞の特性評価が、これらの遺伝子と対照をコ-ド化する４８の部分的ｃＤＮＡを含むニュ-ロン遺伝子-アレイを用いて実行された。
ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、サンプルからＲＮＡが単離された。Ｒｎａｓｅ-Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡを更に除去するためにＤＮア-ゼ Ｉ処理がＲＮｅａｓｙカラム上で行われた。ＲＮＡが、ＲＮア-ゼフリ-の水３５μｌ中に溶出された。ｃＤＮＡ合成の前に、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（登録商標）を用いて、全てのＲＮＡサンプルが定量化された。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ａｒｔｉｖｅ ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ適応）を用いて、製造業者の取扱い説明書に従って、ｃＤＮＡが調製された。それぞれの５０μｌのＲＴ反応で、４００ｎｇのＲＮＡが使用された。得られたｃＤＮＡサンプルが、ＴＬＤＡアッセイに即時に用いられた。Ｔａｑｍａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ）のカ-ドのために、１カ-ド当たり全３８４個のウェルのために、４８個の別個のウェルに供給する８つの別個のロ-ドポ-トがある。それぞれの２μｌのウェルは、単一の遺伝子を検出可能である、特異的な、ユ-ザ-定義のプライマ-及びプロ-ブを含有する。本研究では、カスタマイズされたニュ-ロンマ-カ-２ ＴＬＤＡが８つの同一の４８個の遺伝子セット、すなわち、それぞれ４８個の遺伝子セットに対して１つのロ-ドポ-トに構成された。遺伝子が文献に基づいて選択された。４８個の遺伝子のそれぞれのセットはまた、ＡＣＴＩＮ、ＧＡＰＤＨ、及びＰＰＩＡの３つのハウスキ-ピング遺伝子を含有する。
ロ-ドポ-ト当たり１００μｌの総量に関して、ｃＤＮＡ（各ロ-ドポ-トに関して１６０ｎｇ）、２Ｘ Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ適用）及びヌクレア-ゼフリ-水（ＵＳＢ）を混合することによって、サンプルに特異的なマ-カ-混合物が、それぞれのサンプルについて生成された。穏やかに混合、遠心分離後、次いで混合物をＴＬＤＡカ-ド上のロ-ドポ-トに移した。アレイを１２００ｒｐｍで１分間、２回にわたり遠心分離し、サンプルをロ-ドポ-トから各ウェルに分配した。次いで、カ-ドが密閉され、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ適応の７９００Ｈ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用いて、ＰＣＲ増幅が行われた。サ-マルサイクラ-条件は、次のような、５０℃で２分、９４．５℃で１０分、及び９７℃で３０秒、５９．７℃で１分、４０サイクルであった。１ＴＬＤＡのカ-ドは、８サンプルに対して調製された。
比較ＣＴ法を用いて、相対的発現値が計算された。簡単に言うと、この技法は、標準物質に対して基準化された標的遺伝子の発現を計算するために、式２-ΔΔＣＴを用いる。
サイクル閾値（ＣＴ）は、増幅された標的の量が設定された閾値に到達するサイクル数を示す。ＣＴ値は、０〜４０の範囲である（後者は、信号の検出の不成立を定義する初期上限ＰＣＲサイクル数を表している）。ΔＣＴ値［ΔＣＴ＝ＣＴ（標的遺伝子）-ＣＴ（３つのハウスキ-ピング遺伝子の平均）］がＨＦＦ Ｃｔｒｌについて計算され、続いて、それぞれのサンプルの標準物質として使用された。すべての遺伝子発現値は、基準物質に関する１．００の相対値に振り分けられ、これが、ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（処理された）-ΔＣＴ（ＨＦＦ Ｃｔｒｌ）であるように、比較遺伝子発現を決定するために用いられる。
相対的発現は、式２-ΔΔＣＴを用いて計算される。
星状細胞、ニュ-ロン、及び希突起膠細胞の遺伝子発現の定量的比較は、再プログラムされた細胞中で示差的に発現される大多数の遺伝子の同定を可能にする。トランスフェクトされていない細胞に比べて再プログラムされた細胞中で富化されることが再現的に見出された遺伝子を同定するための有意性解析アルゴリズムを用いて、表１のデ-タが解析された。ＭＢＤ２の存在中でのＭｓｉ１又はＮｇｎ２でのトランスフェクション後、ＮＫｘ２．２、ｏｌｉｇ２、及びＭＡＧ並びに星状細胞のための２つのマ-カ-（ＧＦＡＰとＡＱＰ４）のような希突起膠細胞プロジェニタ-は、非常に増加した。更に、初期ニュ-ロン細胞の数種のマ-カ-もまた、ＨＦＦのトランスフェクション後に増強された。ＴＤＬＡデ-タは、ソマトスタチン及びカルビンジン１のような介在ニュ-ロンに関する特異的マ-カ-の注目すべき増加を示した。発達中の移動する未成熟細胞によって発現されるダブルコルチン（ＤＣＸ）、並びにニュ-ロン細胞の初期マ-カ-であるアセチルコリン（ＡＣＨＥ）ｍＲＮＡの誘導が、再プログラムされた細胞中で高度に発現された（表１）。トランスフェクションは、新生ニュ-ロンの初期マ-カ-であるジヒドロピリミジナ-ゼ様３（ＤＰＹＳＬ３）の発現を、Ｍｓｉ１でのトランスフェクションでは５倍まで、更にＮｇｎ２では７倍まで増加させた。初期ニュ-ロン形態及びニュ-ロン細胞接着分子の発達及び維持のための重要なマ-カ-である微小管関連蛋白質２（ＭＡＰ２）の発現は、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２によって、高度に発現された（表１）。成熟ニュ-ロンのマ-カ-であるエノラ-ゼ-２の発現は、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２によって、２０倍に増強された。ＮｅｕｒｏＤ族の一員であるＮｅｕｒｏＤ１は、Ｍｓｉ１によるトランスフェクションでは８４倍まで、並びにＮｇｎ２によるトランスフェクションでは３４倍にまで高度に発現された。
ＩＧＦ-１、ＩＧＦ２、ＮＰＹ及びＣＳＦ-３などのような成長因子の遺伝子発現もまた、再プログラムされた細胞中で増強された。ＶＥＧＦ及びＧＤＮＦ遺伝子の発現は、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２によって、それぞれほぼ５倍と７倍にアップレギュレ-トされた。しかしながら、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、及びｂＦＧＦの発現は活性化されず、トランスフェクトされていない細胞と比較してダウンレギュレ-トされた。成長関連蛋白質（ＧＡＰ-４３）、ニュ-ロンの成長及び再生関連マ-カ-の発現、並びにニュ-ロンの発達及び誘導に関与するネトリンの発現は、再プログラムされた細胞中で非常に富化された。ＩＩＩ型レセプタ-チロシンキナ-ゼ、神経親和性チロシンキナ-ゼ、及び神経親和性チロシンキナ-ゼレセプタ-などのような成長及びニュ-トロフィン因子に対するレセプタ-の発現は増加された。繊維芽細胞に対するマ-カ-であるビメンチン及びフィブロネクチンは、トランスフェクトされていない対照繊維芽細胞培養と比較して、再プログラムされた細胞中でダウンレギュレ-トされた。
Figure 2018183152
Figure 2018183152

Figure 2018183152
免疫組織化学アッセイ
４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で１０分間、室温で細胞を固定し、続いて４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００（登録商標）で５分間、透過性にした。ＰＢＳで２回簡単に洗浄後、ＰＢＳ中、５％の正常なヤギ血清中で３０分間インキュベ-トすることによって、非特異的抗体結合をブロックした。次いで、第一抗体を、以下のような５％の正常なヤギ血清／ＰＢＳに添加した。第１抗体は、神経幹細胞中に存在する中間代謝物マイクロフィラメントとしてのマウス抗-ネスチン（１：１００ＢＤ）と、ニュ-ロン接着分子としてのマウス抗-ＮＣＡＭ（１：１００、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ）である。２時間のインキュベ-ション後、細胞を０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）／ＰＢＳで５分間、４回にわたって洗浄した。適切な蛍光標識付第２抗体が、視覚化のために使用された。５％正常なヤギ血清／ＰＢＳ中で調製されたヤギ抗-マウス５４６（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が用いられた。１時間のインキュベ-ション後、細胞を０．１％のＲｗｅｅｎ／ＰＢＳで５分間、三回にわたって洗浄した。ＤＮＡ染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を核のマ-カ-として用いた（希釈はＰＢＳ中１：５０００、１０分間のインキュベ-ション）。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ顕微鏡システムを使用して、蛍光画像が取得された。ニュ-ロン又はグリア表現型を採用する細胞のパ-センテ-ジの概算値を決定するために、無作為に領域が選択され、各領域に関して、細胞の総数（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色された核を計測することで決定された）並びにニュ-ロン及びグリアマ-カ-に関して陽性の細胞の総数が決定された。
これらの細胞がニュ-ロン系統のマ-カ-を示したことを確認するために、細胞をネスチン及びＮＣＡＭに対して免疫染色した。この解析は、再プログラムされた細胞が両蛋白質を発現したことを示した。図２に示したように、ＮＣＡＭは、トランスフェクション後、６日間細胞中に存在し、分化に続く１２日目と２０日目にて増加したが、一方ネスチン染色に関しては、逆のパタ-ンが観察された。
本研究は、ＤＮＡ脱メチル化剤の存在を伴う神経原性転写因子を使用してのニュ-ロン遺伝子並びに神経幹細胞及びニュ-ロン細胞に特異的な蛋白質を発現する細胞に向かうＨＦＦを再プログラムする可能性を示した。これらの再プログラムされた細胞は、少なくとも２週間、培養中で安定であった。
実施例ＩＩ
３つの異なる神経原性遺伝子の再プログラミング効率の比較
ＨＦＦ細胞を、実施例Ｉのように培養し、ＣＤＭ Ｉ培地にプレ-トした。細胞を、ＡＭＡＸＡ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）装置（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクトした。ＨＦＦを、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）で採取し、ＣＤＭ培地に再懸濁させて、９０×ｇ（１×１０６細胞／管）で１０分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、塩基性Ｎｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（一次哺乳類繊維芽細胞のための塩基性Ｎｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット、Ｌｏｎｚａ）１００μｌ中に徐々に再懸濁させた。細胞懸濁液の各１００μｌを、プラスミドＤＮＡの異なる混合物と合わせた（例えば、サンプル１が、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｐａｘ６の２μｇとｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２の２μｇに混合された）。細胞懸濁液をＡｍａｘａ保証のキュベットに移し、適切なプログラム（Ｕ０２３）でトランスフェクトした。更に再懸濁することなく、サンプルをＬＡＳ-リジン／アラニン（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ、５０μｇ／ｍｌ）でコ-ティングされた培養プレ-トに移し、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベ-トした。これらの工程が、トランスフェクトされたそれぞれのサンプルについて繰り返された。２４時間後、培地が増殖培地に交換された。２日後、実施例Ｉに記載されたように、リポフェクタミンを用いて、細胞を再トランスフェクし、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にてインキュベ-トした。６日後、分化培地によって分化が誘導され、分化培地は数日余りで増殖培地に交換された。ＲＴ-ＰＣＲ及び免疫組織化学解析のために、１４日目に、細胞を採取した。
遺伝子発現解析
ＲＮＡ単離及び定量化が、実施例Ｉに記載されたように実施された。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ適用）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、ｃＤＮＡが調製され、最終的ｃＤＮＡ濃度が２ｎｇ／μｌにされた。次いで、以下に示したＦＡＳＴ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ適応）とＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ適応）を用いて、関心のあるそれぞれの遺伝子に関してリアルタイムＰＣＲが実施された。
Figure 2018183152
高速９６ウェル反応が、４０サイクルで、１０μｌの反応中、１ウェル当たり８ｎｇのｃＤＮＡで実施された。熱サイクラ-条件は、以下のようであり、９５℃で２０秒間、及び９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、４０サイクルであった。
Ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ３ Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅの代わりにＡｖｅｒａｇｅ ｏｆ ２ Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＧＡＰＤＨ＆ＰＰＩＡ）が標準化のために使用されたことを除外すれば、実施例Ｉに記載されたように相対的発現値が計算された。Ｍｓｉ１、Ｎｇｎ２、及びＰａｘ６を含有する３つの異なるベクタ-によるトランスフェクションに続いて、ニュ-ロン系統遺伝子の同定が検討された。
表２に示したように、トランスフェクションに続いて１４日後に、ニュ-ロン系統のｍＲＮＡの相対的発現が、トランスフェクトされていない細胞（ＨＦＦ）で検出不能であったが、一方ＭＢＤ２の存在下、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２でトランスフェクトされた細胞は、神経幹細胞マ-カ-（ネスチン及びＳｏｘ２）を発現し、しかしながら、Ｓｏｘ２の発現はＮｇｎ２又はＭｓｉ１によるトランスフェクト後のネスチンの発現よりも非常に高度に発現された。ニュ-ロン細胞及び星状細胞に特異的な遺伝子（βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＭＡＰ２ｂ、ＧＦＡＰ、及びＡＣＨＥ）も同様に増加された。三分化能関連遺伝子βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＭＡＰ２ｂ、アセチルコリン、及びＧＦＡＰのｍＲＮＡｓレベルは、Ｐａｘ６でトランスフェクトされた細胞中では検出不能であり、このことは、Ｐａｘ６単独では、ニュ-ロン系統へと向かう再プログラミング過程で関与することがないことを示唆している。
Figure 2018183152
免疫組織化学アッセイ
蛍光免疫組織化学染色が、先に実施例Ｉに記載されたように実施された。ＲＴ-ＰＣＲデ-タと一致して、これら培養の免疫組織化学解析は、再プログラムされた細胞（Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２によって）は、ＮＳＬＣｓのニュ-ロン様細胞（ＮＬＣｓ）への分化を示唆している、ＭＡＰ２ｂに関して陽性である形態学的複合体ニュ-ロンを発生させたことを示した（図３）。しかしながら、これらマ-カ-の陽性染色は、Ｐａｘ６／ＭＢＤ２によるトランスフェクション後には検出不能であった。更に、新しく形成されたニュ-ロンは、これらマ-カ-を発現し、成長円錐を備えた長い神経突起をそれらの端部にて発達させて、神経特異的遺伝子を発現し、並びにそれらが分化条件に曝される場合に、増殖を中止した。
実施例ＩＩＩ
ベクタ-の種々の組み合わせによるＨＦＦのトランスフェクション及び細胞骨格の崩壊
後成的改変のための神経原性調節因子とサイトカインの種々の組み合わせが、それらの再プログラミング効率へ及ぼす影響を確認するために試験された。トランスフェクションの１日前に開始し、細胞がサイトカラシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理され、あるいは処理されず、再プログラミンングの過程における細胞骨格を崩壊させる効果を観察するために、培地交換中に、その濃度が５日間にわたって毎日減少された（１日目に１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢから開始し、それに続く４日間で、７．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ・ｍｌ、及び０μｇ／ｍｌに減少された）。ヌクレオフェクチンによる１つの神経原性転写因子を含有する１つ又は２つのベクタ-で、実施例ＩＩに記載されたように、細胞が一過性トランスフェクトされた。２つのＤＮＡ脱メチル化剤、ＭＢＤ２又はＧＡｄｄ４５Ｂのいずれかでコトランスフェクトされた（例えば、２×１０６個の細胞が、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５ＭＳＩ１（２μｇ）とｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２（２μｇ）でトランスフェクトされた）。２４時間後に、培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、グルコ-ス（０．６％）、重炭酸ナトリウム（０．１％）、グルタミン（２０ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）、インシュリン（２３０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２００ｎＭ）、プトレシン（９０μｇ／ｍｌ）、及び亜セレン酸ナトリウム（３００ｎＭ）からなり、並びにノギン（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、組換体ｈＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び組換体ｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充された神経増殖培地（ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（登録商標）増殖キット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に交換されて、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて二週間、細胞が培養された。次いで、細胞が神経幹細胞マ-カ-について解析された。
遺伝子発現解析
幹細胞に特異的なマ-カ-（Ｓｏｘ２、ネスチン、ＧＦＡＰ）及び繊維芽細胞に特異的なマ-カ-（Ｃｏｌ５Ａ２）に関する遺伝子発現解析が、先に実施例Ｉで記載されたように、ＲＴ-ＰＣＲによって実施された。ＲＴ-ＰＣＲ解析は、Ｓｏｘ２、ネスチン及びＧＦＡＰの相対的発現が、神経原性転写因子によって細胞をトランスフェクトした後に増加されたことを示した。表３に示したように、Ｇａｄｄ４５ｂの存在中で、１つの転写因子Ｍｓｉ１によって細胞をトランスフェクトすることは、Ｓｏｘ２（２２．３±５．２６）とＧＦＡＰ（１０．１４±０．１５）の相対的発現のアップレギュレ-ションと関連性があって、Ｎｇｎ２によって細胞がトランスフェクトされた場合、それぞれ２０倍まで及び１０倍まで、これら遺伝子の発現は非常に増強された。２つの神経原性因子（Ｍｓｉ１とＮｇｎ２）をＧａｄｄ４５ｂと組み合わせることは、Ｓｏｘ２とＧＦＡＰの発現を更に増強させた。ＭＢＤ２の存在中での１つの転写因子（Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２）で細胞をトランスフェクトすることは、Ｓｏｘ２、ネスチン、及びＧＦＡＰの相対的発現のアップレギュレ-ション並びにＣｏｌ５Ａ２のダウンレギュレ-ションに関連性があったが、一方Ｇａｄｄ４５ｂとのコトランスフェクションは、ネスチンの発現を増加させず、並びにＣｏｌ５Ａ２の発現は調節されなかった。ＭＢＤ２と組み合わせて、２つの神経原性遺伝子で細胞をトランスフェクトした場合に、神経幹細胞の相対的発現の増強が観察され、発現での僅かな増加が、特定の条件下、サイトカラシンＢの存在中で認められた。神経幹細胞に特異的なマ-カ-（Ｓｏｘ２、ネスチン、ＧＦＡＰ）の相対的発現における増加並びに繊維芽細胞に特異的な遺伝子（ＣＯＬ５Ａ２）における減少は、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２／Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｍｓｉ１／ＭＢＤ２又はＮｇｎ２／Ｍｂｄ２によるトランスフェクション後に観察された（表３）。本研究は、ＭＢＤ２がＧＤＡ４５ｂよりも再プログラミング効率をよりいっそう増強させることを立証し、サイトカラシンＢは、対照培養中では、それ自体何の効果も有しないことを示した。
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免疫組織化学アッセイ
蛍光免疫組織化学染色が、先に実施例Ｉに記載されたように実施された。表４は、Ｓｏｘ２の最高のパ-センテ-ジ（３８．１８±１．７５％）及びネスチンの最高のパ-センテ-ジ（２８．１８±２．７７％）で、両神経原性転写因子による並びにＤＮＡ脱メチル化剤及びサイトカラシンＢとの存在中でのトランスフェクション後に、陽性細胞が観察された。Ｓｏｘ２陽性細胞の僅かな増加（１０．４２±１０．２７％）及びネスチン陽性細胞の僅かな増加（４．８５±１．１０％）が、１つの転写因子Ｍｓｉ１及びＭＢＤ２によるトランスフェクションに続いて検出された。Ｎｇｎ２とＭＢＤ２によるトランスフェクションに続いて、ネスチン及びＳｏｘ２陽性細胞の同一の傾向性が観察された。サイトカラシンＢによる細胞骨格の崩壊は、再プログラミングを著しく増強させたが、それ自体に及ぼす再プログラミング効果は有さなかった（表４）。
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種々のＤＮＡ脱メチル化剤が、再プログラミング効率に及ぼすその効果について、同様に試験された。種々のＤＮＡ脱メチル化剤と共に、２つの神経原性ｐＣＭＶ６-Ｍｓｉ１-Ｎｇｎ２因子を含有するベクタ-で、細胞がコトランスフェクトされた。同時に、別の神経原性因子が、ＮＳＣｓに向かう細胞退行分化に及ぼすその効果について、先に実施例ＩＩで記載されたように、ＭＢＤ２の存在中で、ｐＣＭＶ-ＸＬ-ネスチン単体で又はｐＣＭＶ-Ｍｓｉ１-Ｎｇｎ２、ｐＣＭＶ-ＸＬ５-Ｍｓｉ１、又はｐＣＭＶ-ＸＬ４-Ｎｇｎ２と組み合わされて試験された。
異なるＤＮＡ脱メチル化剤（ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＭｅＣＰ２、ＡＩＣＤＡ）と共に、ｐＣＭＶ-Ｍｓｉ１-Ｎｇｎ２で、細胞がコトランスフェクトされた。再プログラミング効率に及ぼすネスチンの効果を評価するために、別のアッセイが実施され、つまり、ＭＢＤ２の存在中で、ネスチン単体で、あるいは１つの神経原性因子（Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２）を含有する又は双方を含有するベクタ-と組み合わされて、細胞がトランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて、ＶＰＡ（１ｍＭ）処理を伴う又は伴わない、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びノギン（２０ｎｇ／ｍｌ）で補充された増殖培地の存在中で、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて１２日間培養された。
神経特異的遺伝子及び蛋白質発現（βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＧＦＡＰ、Ｓｏｘ２、ネスチン）を解析するために、遺伝子発現解析及び免疫組織化学法が、実施例ＩＩに記載されたように実施された。示された種々のＤＮＡ脱メチル化剤の存在中でのＭｓｉ１及びＮｇｎ２による細胞のトランスフェクションによって、本研究で使用された種々のＤＮＡ脱メチル化剤の中で、表５に示したように、ＭＢＤ２が神経幹遺伝子（Ｓｏｘ２、ＧＦＡＰ、ネスチン）の発現を促進することを確認した。更に、１つの神経原性因子の存在の有無を伴うネスチンによる細胞のトランスフェクションが、神経幹細胞へと向かう再プログラミング効果に及ぼす影響を有さなかった。しかしながら、ネスチンとＭｓｉ１／Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２によるコトランスフェクションは、神経幹細胞の発現を増強し、並びにこの増加は、ＶＰＡの存在中でより顕著であった。
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ＲＴ-ＰＣＲデ-タと並行して実施された免疫組織化学解析は、ＭＢＤ１、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＭｅＣＰ１、又はＡＩＣＡＤＡの存在中で、細胞をＭｓｉ１／Ｎｇｎ２でトランスフェクトする場合に、陽性Ｓｏｘ２細胞は検出不能であったこと（表６）、並びにテストされたＤＮＡ脱メチル化剤遺伝子の異なるタイプの中では、上記神経原性遺伝子を使用する場合には、ＭＢＤ２のみが、ＮＳＬＣｓに向かうＨＦＦの再プログラミング効果において有意な正の役割を果たしていることを示した。免疫組織化学解析は、ＭＢＤ２の存在中でのネスチンとＭｓｉ１／Ｎｇｎ２による細胞のコトランスフェクション後に、免疫陽性Ｓｏｘ２細胞の僅かな増加（８９．４９±３．１８）を示した（表６）。
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神経幹細胞へと向かう再プログラミング効率に及ぼす種々の神経原性遺伝子の効果を試験するための別の研究がデザインされた。実施例Ｉに記載されたように、細胞が培養され、並びにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-うぇｌｌ-Ｓｈｕｔｔｌｅ（登録商標）装置（Ｌｏｎｚａ）を用いて、未処理ＨＦＦ対照及び非トランスフェクトのＨＦＦ対照（完全培地及び化合物処理の細胞に及ぼす効果を決定するため）を除けば、実施例ＩＶに記載された手順に従ってトランスフェクトされた。ＶＰＡ及び５-Ａｚａで前処理された細胞と未処理細胞が、表７に記載されたように、ＤＮＡの混合物でトランスフェクトされた。細胞を、ラミニンでコ-ティングされたプレ-トに播種し、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベ-トした。表７に従って、培地を毎日交換した。細胞が、免疫組織化学解析によって、３、７、１２日目に解析され、９日目には、遺伝子アレイによって、多能性及び多分可能性遺伝子発現に関して解析が行われた。
遺伝子アレイ解析
表７中の０ａ及び１ａに従って処理された細胞の追加バッチが、９日目に解析され、それと共にＨＦＦｓ、ｈＮＰＣｓ、及び５継代のＮＳＬＣｓ（実施例ＩＩＩの先の実験で凍結処理されたもの）が多分化能遺伝子アレイ（ＡＢＩ）によって解析され（表８ａ及びｂ）、並びに、１継代と５継代のＮＳＬＣｓ中の選択の多分化能、外胚葉、内胚葉、中胚葉、及び神経系統遺伝子の遺伝子発現プロファイルを、ＨＦＦｓ（それらから創出された）及び正常なヒト神経プロジェニタ-細胞（ｈＮＰＣｓ）と比較して決定するための遺伝子のセット（表８ｃ）が解析された。表８の結果は、神経幹細胞に関連するすべての遺伝子（多分可能マ-カ-と内胚葉系中胚葉マ-カ-を顕著に発現したそのいくつかは、神経幹細胞中でも発現された）とすべての神経系統は、ＨＦＦｓ中とは反対に、ＮＳＬＣｓ中で著しく発現され、並びに発現パタ-ンは、ｈＮＰＣｓのパタ-ンとは少し異なっていて、このことは、ＮＳＬＣｓは、試験されたｈＮＰＣｓと同様ではあるが、同一ではないことを示唆している。５継代ＮＳＬＣｓは、１継代ＮＳＬＣｓよりも幹細胞性遺伝子のより高度な発現を有した。ｈＮＰＣｓは、ＮＳＬＣｓよりも神経性傾倒遺伝子のより高度な発現を有して、このことは、ＮＳＬＣｓのより大きな幹細胞性状態に対する、それらの神経プロジェニタ-状態を示唆している。
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実験の別の部分では、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２＋ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２でトランスフェクトされた細胞の別のバッチが、５つの異なるウェルのＣＤＭ ＩＩ培地中のポリオルニチン（室温で３０分間）及びラミニンでコ-ティングされたプレ-トに播種された。１日目に、２つのウェルの培地が、状態１ａ（表７）と同じ培地に、１２日まで切り替えられた。培地が１２日まで毎日交換され、交換の時点でＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＴ-３（２０んｇ・ｍｌ）、ＮＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（５μｇ）、ノギン（２０ｎｇ／ｍｌ）及びホルコリン（１０μＭ）で双方共に補充されたＮＳ-Ａ分化培地（ＳｒｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＮｂＡｃｔｉｖｅ４（Ｂｒａｉｎｂｉｔ）培地のいずれかに切り替えられた。これらの細胞は、７日目までに、典型的な神経幹細胞の形態を示し、２１日まで増殖した。２つの分化培地のいずれかへの露出中に、これらＮＳＬＣは、明視野写真（図２１）で示されたように、よりいっそうニュ-ロン細胞及びグリア細胞表現型へと変化したが、１７日までに、ＧＦＡＰを発現したのみであった（図２２）。
他の３つのウェルに関しては、１日目に、培地がＮＳ-Ａ分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｂＡｃｔｉｖｅ４（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）、又はＣＤＭ ＩＩ培地のいずれかに切り替えられ、これらの初めの２つの培地は、先に記載されたような同一のサイトカインで補充されていていたが、Ｆｇｆ-２（２０ｎｇ／ｍｌ）が更に添加された。１２日目に、最初の２つの培地からＦｇｆが除去され、一方ＣＤＭ ＩＩ培地中の細胞が、Ｆｇｆ-２を含まないサイトカインで補充されたＮＳ-Ａ分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替えられた。１２日〜１７日の間で、培地が２日〜３日毎で交換された。培養の最初の１２日間で、３つの全ての培地中の細胞は、トランスフェクトされていない繊維芽細胞に比べて、より紡錘状の細胞の混合物へと発達し、そのいくつかがＮＳＬＣ形態を備えた細胞へと発達して、Ｆｇｆ-２の除去の際には、細胞の形態は、明視野写真（図２１）で示されたような、細胞間に確立された網状構造を備えたグリア細胞と同様な非常に明確なニュ-ロン細胞形態へと戻り、１７日目までに、ＧＦＡＰとβＩＩＩ-チュ-ブリンを発現した（図２２）。
再プログラムされた細胞中の内因性蛋白質レベルに及ぼすＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及びＭＢＤ２の効果を評価するための追加研究がデザインされた。先に記載されたように、ＭＳＩ１／ＮＧＮ２ベクタ-及びＭＢＤ２で細胞がトランスフェクトされ、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にての増殖条件中で、細胞が培養された。サンプルが、２日〜１０日の種々の時点で回収され、ＲＴ-ＰＣＲによって、異なる時点にての内因性遺伝子の発現並びに神経幹細胞及びニュ-ロン遺伝子の発現が検討された。ＲＴ-ＰＣＲは、２日目から開始し１０日目に至るＭｓｉ１、Ｎｇｎ２及びＭＢＤ２遺伝子の総発現の漸進的損失を示し、対照に対するＭＢＤ２発現の増加は、５日目までにほぼ完全に失われた。この減少は、５日目にての内因性Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２の著しい活性化に関連し、９日目には内因性遺伝子発現の別の急変を伴った（表９）。Ｓｏｘ２発現の顕著な増加が４日目に検出され、並びにこの外胚葉／神経幹細胞／ニュ-ロン遺伝子の発現は、それぞれの以後の時点で増加し続けた（表１０）。ＧＦＡＰ（神経幹細胞及び星状細胞のマ-カ-）は、２日目以降既に僅かに上昇されていたが、５日目に顕著に増加し、７日目の解析時点にて遺伝子発現の非常な急変を伴い、更にこの発現が残りの研究期間中維持された。神経幹細胞マ-カ-のネスチンの発現もまた、５日目以降ゆっくりと増加を開始した。ニュ-ロン遺伝子βＩＩＩ-チュ-ブリン（ＴＵＢＢ３）及びＭａｐ２ｂの発現は、２日目以降に既にわずかに上昇されたが、５日目以降に著しく増加した。アセチルコリン受容体（ニュ-ロン中に見られる）に対するマ-カ-、アセチルコリンエステラ-ゼ（ＡＣＨＥ）の発現もまた、２日目以降に僅かに上昇されたが、７日目以降にはそれほど顕著に増加しなかった。解析された神経幹細胞マ-カ-の中で、Ｓｏｘ２の相対的発現が高度にかつ早期に発現され、次いでその発現が、ネスチン、ＧＦＡＰ、並びに内因性Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２、更には再プログラミング及び細胞運命変化を促進する他の遺伝子の活性化、並びにニュ-ロン遺伝子様βＩＩＩ-チュ-ブリン（ＴＵＢＢ３）、Ｍａｐ２ｂ、及びＡＣＨＥの活性化において、内因性Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２及び／又は他の遺伝子と直接的に又は間接的に相互作用することが可能であった。
Figure 2018183152
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 実施例ＩＶ
接着及び浮遊条件中のＮＳＬＣへのＨＦＦの再プログラミングにおけるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ ＤｅｖｉｃｅとＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅの比較
ＨＦＦ細胞を、実施例Ｉに記載されたように培養し、実施例ＩＩに記載されたようなＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、或いはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）を用いてトランスフェクトされた。ＴｒｙｏＬＥを使用して、ＨＦＦｓが採取され、９０×ｇにて10分間、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅによる１×１０６細胞／トランスフェクション及び８０×ｇにて５分間、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅによる６×１０５細胞／トランスフェクションが行われた。遠心分離後、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩについては塩基性Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液１００μｌ中に、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ ＳｈｕｔｔｌｅについてはＳＥ溶液（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｋｉｔ ＳＥ、Ｌｏｎｚａ）２０μｌ中のいずれかに、細胞ペレットが穏やかに再懸濁された。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅに関しては、細胞懸濁液の各１００μｌを、プラスミドＤＮＡの２つの異なる混合物と混合された（サンプル１は、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１の２μｇとｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２の２μｇとに混合され、並びにサンプル２は、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２の２μｇとｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２の２μｇと混合された）。それぞれの細胞懸濁液をＡｍａｘａ保証キュベット中に移して、適切なプログラム（Ｕ-０２３）でトランスフェクトした。トランスフェクション直後、温ＣＤＭ１培地９００μｌを各キュベットに加え、１×１０５〜１．５×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で、ラミニン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、１０μｇ／ｍｌ）でコ-ティングされた培養プレ-トに、又は神経球形成のための非細胞培養処理のペトリ皿のいずれかに細胞を移した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一夜インキュベ-トした。しかしながら、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅに関しては、以下の例外項目以外は工程が上記と同様であり、細胞懸濁液が同一の２つのＤＮＡ混合物のそれぞれのＤＮＡの０．６μｇと混合され、細胞懸濁液が９６ウェルのＮｕｃｌｅｏｐｌａｔｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ）のウェルに移されて、プログラムＦＦ-１３０（登録商標）でトランスフェクトされた。トランスフェクション後、温ＣＤＭ１培地の８０μｌがそれぞれのウェルに添加され、ラミニンコ-ティングされたプレ-ト又は非細胞培養処理ペトリ皿に上述の密度で移されるのに先立って、インキュベ-タ-中で１０分間放置された。両装置に関して、これらの工程が、トランスフェクトされたそれぞれのサンプルについて繰り返された。トランスフェクションに先立って、細胞が、実施例Ｉに記載されたように、ＣＤＭ１培地中で培養された。２４時間後に、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ-２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（２０ｎｇ／ｍｌ）及びサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）で補充された、７５％ＣＤＭ培地と２５％増殖培地の混合物に切り替えられ、並びに細胞が３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２でインキュベ-トされた。
神経増殖培地の比率が４日目までに１００％に増加され、並びにサイトカラシンＢの比率が５日目までに完全に削除されて、培地が毎日交換された。ホルスコリン（１０μＭ）が、４日目以降に培地に添加された。浮遊状態にある細胞が、遠心分離によってペレット化され、それらの培地が、接着状態に関して記載されたように、毎日交換された。細胞が、３、７、１２日に回収され、免疫組織化学アッセイが行われた。
神経幹細胞マ-カ-であるＳｏｘ２に対して陽性の細胞のパ-センテ-ジを決定するために、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）顕微鏡システムを使用して、蛍光画像が取得された。本解析は、トランスフェクトされていない対照とトランスフェクト後３日目のサンプルで、核Ｓｏｘ２染色が検出できなかった。しかしながら、７日及び１２日目に、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｕｓａｓｈｉ及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ条件を除いた全てのトランスフェクション条件下で、Ｓｏｘ２陽性細胞のパ-センテ-ジが漸進的に増加した。１２日目には、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅを使用してトランスフェクトされたＭｓｉ１／Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２で、最高のパ-センテ-ジが得られた（〜８０％）。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩを使用してトランスフェクトされた同一の組み合わせでは、僅か〜３５％の陽性細胞を産出した。ＳｈｕｔｔｌｅをしようしてのｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭｕｓａｓｈｉとｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２の組み合わせでは、〜２０％の陽性細胞を産出し、一方、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩを使用した場合は、一般的に産出なしであった。陽性細胞パ-センテ-ジは、ウェル間で非常に変動した。染色は、高密度に配列されたＳｏｘ２陽性細胞の場と陰性細胞のみを備える完備場が全ての場合に見出されたために、細胞群が均一ではないことを示唆した。一般的にＳｈｕｔｔｌｅは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩよりも初期には細胞に対してより有害であるが、７日〜１２日目に、少なくともＭｓｉ１／Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２シャトルの場合では、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩと比較して、２倍の数のＳｏｘ２陽性細胞を有するまでに急激に増殖した。浮遊条件中の細胞は、いずれの条件下でも、１２日間の実験中に神経球を形成せず、このことは、神経球の形成には、接着条件中での１回またはそれ以上の神経幹様細胞の発生が必要であることを示唆している。
表１は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ ＤｅｖｉｃｅとＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅの双方を使用した、典型的な真剣肝細胞の形態を備えたＳｏｘ陽性細胞のパ-センテ-ジを示している。後者は、より少量の出発物質（より少量の細胞及びより少量のＤＮＡ）でよいという利点を有し、更により多数のＳｏｘ２陽性細胞を生じる。更には、ＤＮＡ脱メチル化剤ＭＢＤ２の存在中でのただ１つの神経原性転写因子（Ｍｓｉ）によるトランスフェクションの際でも、Ｓｏｘ２陽性細胞の非常に小さい群がＳｈｕｔｔｌｅ Ｄｅｖｉｃｅによって観測される。
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 実施例V
神経球形成アッセイ及び細胞分化アッセイ
より大きく比例する再プログラミングが、２つの神経原性遺伝子をトランスフェクトすることによって達成されることを示す先の研究に基づいて、２つの神経原性転写因子（Msi1及びNgn2）を含有するベクタ-Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２を用いての再プログラミング細胞の数、並びに再プログラミング過程におけるＤＮＡ脱メチル化剤又はＤＮＡメチル化阻害剤（５-アザシチジン）及びヒストン脱アセチル化素材外の役割を評価するために、本研究がデザインされた。
実施例ＩＩＩに記載されたように、ＨＦＦｓが培養され、サイトカラシンＢで処理され、同時にＶＰＡ（１ｍＭ）と５-アザシチジン（０．５μＭ）で処理された。処理の２日後に、構築されたベクタ-Ｍｓｄｉ１／Ｎｇｎ２を使用して、実施例ＩＩに記載されたようにＮｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによって、細胞がトランスフェクトされた。細胞の調製後、細胞が全ＤＮＡ（Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２）の２μｇと混合されて、並びに化学的阻害剤（ＶＰＡ及び５-Ａｚａ）で処理されなかった細胞が、適切なプログラム（Ｕ０２３）を使用して、ＭＢＤ２（２μｇ）でコトランスフェクトされた。サンプルが、ラミニン（１０μｇ／ｍｌ、）Ｓｉｇｍａ）でコ-ティングされた培養プレ-ト中に移されて、加湿された３７℃／５％Ｏ２／５％ＣＯ２中でインキュベ-トされた。培地が、ノギン（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、組換体ｈＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び組換体ｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充された、増殖基本培地である神経増殖培地（ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（登録商標）増殖Ｋｉｔ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に交換された。トランスフェクション後６日で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、細胞を採取し、遠心分離（３００×ｇ、５分間、室温）し、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳＣ ｚｏｕｓｈｏｋｕｂａｉｃｈｉ 中、コ-ティングされていないペトリ皿に播種し、神経球又は接着培養のためのラミニンコ-ティングされたプレ-ト上と同じような懸濁液中での細胞を成長させる能力を検討した。培地交換中での浮遊する神経球体の損失を防止するために、室温（ＲＴ）にての１５０×ｇで３分間の遠心分離によって、細胞を沈降させた。次いで、ペレットを、新鮮な培地中に再懸濁させて、新しい非コ-ティングの低結合細胞培養皿に播種した。
培養を、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にてインキュベ-トして、少なくとも２か月間、供給した。
ヒト神経前駆体細胞（ｈＮＰＣｓ）及びヒトＮＳＬＣｓからの単一細胞が神経球を発生させることができたかどうかを検討するために（細胞が神経幹細胞であることを証明するための標準試験）、神経球を単一細胞中に溶解させて、これら単一細胞を単離し、懸濁液で増殖培地中で培養して、光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、１０×）を用いて明視野を取得することによって並びにＣｅｌｌｏｍｉｃｓを用いて、神経球形成を監視した。これらの細胞は、６日から開始し１０日まで、増殖を開始し、神経球と同じように成長した（図４Ａ）。
これら球体の２０日目の免疫組織化学解析（表１２及び図４）は、神経幹細胞マ-カ-Ｓｏｘ２、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＣＤ１３３、ネスチン、及びＧＦＡＰに関する免疫陽性染色を示した。細胞はまた、両細胞のセット（ＮＳＬＣ及びｈＮＰＣ）の三分化能潜在能力を示唆している、βＩＩＩ-チュ-ブリン（ニュ-ロンに対するマ-カ-）、Ｏ４（希突起膠細胞に対するマ-カ-）、及びＧＦＡＰ（星状細胞に対するマ-カ-）に関して陽性に染色され、並びに、細胞が最終的には分化されなかったことを示している、ＮＧＦｒｅｃ及びＮｅｕＮ（分化されたニュ-ロンに対するマ-カ-）に関して陰性であった。
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ＨＦＦ細胞が、実施例Ｉに記載されたように培養され、実施例ＩＩに記載されたように、Ｎｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクトされた。細胞が、ＭＢＤ２を加えたｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ／ｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ、ｐＣＭＶ-Ｍｓｉ１-Ｎｇｎ２でコトランスフェクトされるか、あるいはＶＰＡ／５ａｚａで前処理された。細胞が、懸濁液又は接着培養として増殖培地中で培養された。８サンプルにての遺伝子発現解析が、４つの主要な分類、１）繊維芽細胞特異的遺伝子、２）ニュ-ロン系統特異的遺伝子、３）神経幹細胞マ-カ-特異的遺伝子、及び４）成長因子及びそれらの受容体に関する遺伝子中の４８の遺伝子（３つのハウスキ-ピング遺伝子であるＡＣＴＩＮ、ＧＡＰＤＨ及びＰＰＩＡを含む）の発現をプロファイルしたカスタマイズされたＮｅｕｒｏｎａｌ Ｍａｒｋｅｒ ２ ＴＬＤＡ（表１３）を使用して、実施例Ｉに先に記載されたように実施された。
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表１４に示したように、繊維芽細胞特異的遺伝子（Ｃｏｌ３Ａ１、Ｌｏｘ、Ｓ１００Ａ４）は、再プログラムされた細胞中でダウンレギュレ-トされ、このことは、トランスフェクションに続く、繊維芽細胞特異的遺伝子の損失を示唆している（培養中での繊維芽細胞特異的遺伝子の発現が、そのほとんどが培養中に残されたプログラムされていない繊維芽細胞からのものであるように、全ての細胞がトランスフェクトされかつ再プログラムされるわけではないことに注目するべきである）。ＤＮＡ脱メチル化剤又はＤＮＡメチル化素材剤の不在下でＨＦＦｓがトランスフェクトされた場合に、これらの遺伝子の発現が増加することが観察されていて、このことは、繊維芽細胞の分化したマ-カ-のダウンレギュレ-ションには、ＤＮＡ脱メチル化が必要であることを示唆している。Ｍｓｉ１、Ｓｏｘ２、及びネスチンなどの外胚葉遺伝子の発現は、ＤＮＡ脱メチル化と関連して、トランスフェクション後に大幅に増加された。シナプトガミン１（シナプス小胞蛋白質）及びＮｅｕｒｏＤ１などのようなニュ-ロンマ-カ-の発現は、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２によってトランスフェクトされた細胞中でアップレギュレ-トされ、並びにMsi1/Ngn2/VPAと５-AZAでトランスフェクトされた細胞中では、僅かに増加された。希突起神経膠細胞の選択された3つのマ-カ-が、Ｏｌｉｇ２の著しい増加を伴って、トランスフェクトされた細胞中で検出された。星状細胞に関する２つのマ-カ-であるＧＦＡＰ及びＡＬＤＨ１Ｌ１は、トランスフェクションに続いて増強された。この結果は、神経球が異種性プロジェニタ-サブタイプから構成されるという考えを裏付ける。
神経親和性因子の中では、再プログラムされた細胞中で、ＣＮＴＦの発現が僅かに増加された。ＧＡＰ-４３及び神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）の発現が、最も注釈が施された遺伝子であった。ＧＡＰ-４３は、軸索の可塑性で中心的役割を果たすと長い間認められてきて、胚発達並びに損傷した脳及び脊髄におけるニュ-ロン再生の双方において、神経突起の成長及びシナプス形成を再生するためのマ-カ-として使用されている。神経栄養受容体チロシンキナ-ゼ発現のような、成長因子及び神経栄養因子のための受容体の発現が増加された。
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ＮＳＬＣｓの接着群の更なる解析及び定量化は、Ｓｏｘ２（９３．４３±１．９％）、ネスチン（６０．７６±５．７％）、及びＧＡＢＡ（３７．４８±４．９％）に関して陽性に染色されたことを示したが、これらマ-カ-は、トランスフェクトされた細胞中では検出不能であった（図５、表１５）。更には、これら細胞は、ｐ７５ＮＴＲ（３１．１５±１．６％）、βＩＩＩ-チュ-ブリン（３７．５５±０．６％）及びＧＦＡＰ（１６．４７±０．９％）に関して陽性に染色された。しかしながら、トランスフェクトされていないＨＦＦｓは、フィブロネクチン及び繊維芽細胞蛋白質マ-カ-などのようなＨＦＦマ-カ-のみに陽性に染色され（図５）、一方ではこれらマ-カ-は再プログラムされた細胞中では検出不能であり、このことは、再プログラムされた細胞が、元の細胞のマ-カ-を損失し、並びに神経幹細胞及びニュ-ロン系統の形態及びマ-カ-を採用したことを立証している。
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本研究は、同様に、ＮＳＬＣｓが培養中で分化するための能力を有し、並びに全研究期間にわたって維持された、それが培養中５か月間を超えて維持された安定な形態、遺伝子及び蛋白質発現を表すことを示した（表１６）。
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 遺伝子発現マイクロアレイ
マイクロアレイ発現解析が、７継代のＮＳＬＣｓの遺伝子発現プロファイルを、ＨＦＦ（ＮＳＬＣがそこから創出された細胞）とｈＮＰＣｓの双方と比較するための大域的な概観を得るために実施された。ｎＳＬＣ（ｎ＝３）、ＨＦＦ（ｎ＝２）、及びｈＮＰＣ（ｎ＝３）が、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）中に再懸濁されて、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃｓ（Ｉｎｄｉａ）に積み込まれて、そこでサンプルが加工され、並びに遺伝子発現マイクロアレイが実施された。
簡単に述べると、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃｓは、サンプルからＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）を用いてＱｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌを行った。ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｃｋ Ａｍｐ（登録商標）キット（ｃＤＮＡ合成及びインヴィトロ転写）を用いて、標識付が行われ、次にＱＣの標識付が行われた。次いで、８×６０Ｋアレイを用いてハイブリダイゼ-ションが行われ、ＳｕｒｅＳｃａｎ（登録商標）技術を備えた高処理Ａｇｉｌｅｎｔスキャナ-を使用して、スキャンニングが実行された。自動特徴抽出のために、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアが使用され、続いてＲａｗデ-タＱＣ及びイメ-ジＱＣが行われた。次いで、ＡｇｌｅｎｔのＧｅｎｅＡｐｒｉｎｇ ＧＸ（登録商標）ｖ１０．０及びＧｅｎｏｔｙｐｅのＢｉｏｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｒソフトウェアを用いて、経路及び遺伝子存在論解析を含む高度デ-タ分析が実施された。ＮＳＬＣサンプルが、ＨＦＦサンプル（セット１）とｈＮＰＣサンプル（セット２）とに比較された。ＮＳＬＣｓサンプルは、ＮＳＬＣｓがそこから創出されたＨＦＦｓよりもｈＮＰＣｓに極めて近い大域遺伝子発現を有した（図２３）。Ｐｅａｒｓｏｎ相関解析は、ニュ-ロン系統マ-カ-、再生遺伝子及び移入遺伝子という観点を含めて考えると、ＮＳＬＣｓがｈＮＰＣｓに緊密に関連していることを示した。
これらのデ-タは、ＮＳＬＣｓがｈＮＰＣｓと同様ではあるが、同一ではないことを裏付けている。
マイクロアレイ解析は、ＨＦＦサンプル中に比べてのＮＳＬＣサンプル中での神経前駆体細胞のアップレギュレ-ションを示した。ＡＣＴＬ６Ａ及びＰＨＦ１０は、両者が神経プロジェニタ-に特異的なクロマチン再構築複合体（ｎｐｂａｆ複合体）に属し、並びに神経プロジェニタ-の増殖のために必要であるが、これらが、それぞれ２．９倍まで及び２．３倍までアップレギュレ-トされた。中枢神経系における幹細胞の増殖及び維持で役割を果たすＭＳＩ２は、６倍までアップレギュレ-トされた（表Ｘ１）。グリア遺伝子は、ＨＦＦサンプル中と比較して、ＮＳＬＣサンプル中でアップレギュレ-トされた。神経幹細胞及び星状細胞に特異的なマ-カ-であるＧＦＡＰは、中枢神経系の発達段階において、星状細胞を他のグリア細胞から識別するものであるが、ＨＦＦと比較してＮＳＬＣサンプル中で高度にアップレギュレ-トされた（６９０倍）。ＯＬＩＧ１は、特に脳内で、希突起膠細胞の形成及び変異を促進するが、これもまた、ＨＦＦに比べてＮＳＬＣサンプル中で高度にアップレギュレ-トされた（３７０倍）（表Ｘ２）。
表Ｘ３は、ＨＦＦサンプル中に比べてＮＳＬＣサンプル中でアップレギュレ-トされる再生遺伝子のサブセットを表示している。初期胚発生及び胚幹細胞多分可能性並びに神経幹細胞にとって重要な遺伝子であるＳＯＸ２は、ＨＦＦサンプルに比べてＮＳＬＣサンプル中で高度にアップレギュレ-トされる（５０００倍）。Ｇ１／Ｓ（開始）転写にての細胞周期の制御にとって必須であるＣＣＮＤ２もまた、ＮＳＬＣサンプル中でアップレギュレ-トされる（ＨＦＦサンプルに比べて７０倍）。表Ｘ４に示されたように、多数の繊維芽細胞遺伝子が、ＨＦＦサンプルに比べてＮＳＬＣサンプル中にてダウンレギュレ-トされた。このことは、ＨＦＦからＮＳＬＣへ再プログラムされるのに伴って、ＮＳＬＣが多数の繊維芽細胞遺伝子の発現を損失することを示している。
表Ｘ５は、神経前駆体遺伝子もまた、ｈＮＰＣサンプルに比べてＮＳＬＣサンプル中でアップレギュレ-トされたことを示している。末梢神経系及び中枢神経系の選択されたニュ-ロン群の生存及び分化を促進するＢＤＮＦもまた、ｈＮＰＣサンプル中よりもＮＳＬＣサンプル中でより高度に発現される（３４倍のアップレギュレ-ション）。表Ｘ６は、グリア遺伝子のサブセットもまた、ｈＮＰＣサンプルに比べてＮＳＬＣサンプル中でアップレギュレ-トされることを示している。神経幹細胞及び星状細胞に特異的なま-か-であり、並びに、中枢神経系の発達段階において、他のグリア細胞から星状細胞を識別するＧＦＡＰは、ｈＮＰＣサンプルに比べてＮＳＬＣサンプル中で非常に高度に発現される（１３倍）。ミエリンの多重膜構造の形成又は維持で重要な役割を発中枢神経系の主要なミエリン蛋白質であるＰＬＰ１もまた、ｈＮＰＣサンプル中と比較してＮＳＬＣサンプル中でより高度に発現される（２０倍）。
再生遺伝子もまた、ｈＮＰＣサンプルと比較してＮＳＬＣサンプル中でアップレギュレ-トされた（表Ｘ７）。神経提マ-カ-であるが、成長、特に軟骨及び骨の形成を誘導するＢＭＰ２と、同様に軟骨及び骨の形成を誘導し、中胚葉誘導、歯の発達、肢形成及び骨折修復で作用するが、神経幹細胞中でも作用するＢＭＰ４とは、双方共にｈＮＰＣサンプル中と比較してＮＳＬＣサンプル中でより高度に発現された（それぞれ１８倍及び２０倍）。伸張する軸索の先端部を形成する運動性成長円錐の主要成分であるＧＡＰ４３は、ｈＮＰＣサンプルよりもＮＳＬＣサンプル中でより高度に発現された（４倍）。このことは、ＮＳＬＣの再生潜在能力を示唆している。インヴィヴォ及びインヴィトロでの治療目的の幹細胞の増殖のために、それを可能な候補としている神経幹細胞並びに造血幹細胞及びプロジェニタ-細胞の発達中及び増殖中において必要とされるＨＯＸＢ４もまた、ｈＮＰＣｓ中よりもＮＳＬＣｓ中においてより高度に発現された。このデ-タは、ＮＳＬＣｓがより「幹様」であり、あるいはｈＮＰＣｓよりもいっそう「幹細胞性」を有することを示唆している。
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ニュ-ロン系統（ニュ-ロン、星状細胞、及び希突起神経膠細胞）へのＮＳＬＣｓの分化能力を検討するために、分化培地中、ラミニン／ポリ-Ｄ-リジン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）に２週間、神経球体を溶解並びに播種した。脳由来ニュ-トロフィン因子（ＢＤＢＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、オ-ルトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、５μＭ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、及びｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充されたＮｂＡｃｔｉｖｅ培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）、又はＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ分化培地（ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ分化キット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２つの異なる分化培地を使用して、ニュ-ロン系統へ向かう分化が実施された。培養２週間後に、ニュ-ロンマ-カ-βＩＩＩ-チュ-ブリン、星状細胞マ-カ-ＧＦＡＰ及びＳ１００β、並びに希突起神経膠細胞マ-カ-ＣＮＰア-ゼで細胞が染色された。４％のホルムアルデヒドで細胞が固定され、第１抗体が５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中で次のように添加された。マウス抗体βＩＩＩ-チュ-ブリン（１：２００、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗体Ｓ１００β（１：１００、Ａｂｃａｍ）、及びニワトリ抗体ＣＮＰア-ゼ（１：５０、Ａｂｃａｍ）。第２抗体が、５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中で次のように添加された。ヤギ抗-マウスＡｌｅｘａ５４６（登録商標）（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗-ウサギＡｌｅｘａ４８８（登録商標）（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びヤギ抗-ニワトリｃｙ５（１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）。
免疫組織化学解析は、ＮｂＡｃｔｉｖｅ培地が、ニュ-ロン細胞（４８．６６±１４．０７％、βＩＩＩ-チュ-ブリン）及び潜在的初期希突起神経膠細胞系統（５０．０１±４．０４％、ＣＮＰア-ゼ）に、並びに星状細胞の低いパ-センテ-ジ（２．６８±１．１３％、Ｓ１００β）への同等な分化を促進し、一方ＮＳ-Ａ分化培地が、主にニュ-ロン（６４．８９±４．１１％、βｉｉｉ-チュ-ブリン）及び星状細胞（３５．９４±４．０４％、Ｓ１００β）、並びに潜在的初期希突起神経膠細胞の低いパ-センテ-ジ（８．６８±２．７１％、ＣＮＰア-ゼ）への分化を誘導することを示した。更なる分化研究のために、ＮＳＣ-Ａ培地がＮｂＡｃｔｉｖｅに加えて選択された。ＮＳ-Ａ分化培地中の細胞の分化は、ｓｏｘ２、ｍｕｓａｓｈｉ１及びネスチン陽性細胞のパ-センテ-ジの減少によって、表１７に示されたように、ｈＮＰＣとＮＳＬＣの分化を同様に促進する。ＮＳＬＣｓは、ニュ-ロン細胞（７４．３±０．１、ＧＡＢＡ）、星状細胞系統（６５．６±０．０、Ｓ１００β）及び希突起神経膠細胞（５．２±０．６、ＣＮＰア-ゼ）の低パ-センテ-ジへと分化された。三分化能性系統分化の同一のパタ-ンが、ｈＮＰＣｓにおいて観察された（表１７）。
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ニュ-ロン抗原に対する数個の追加の抗体が、特性評価、具体的には分化した細胞の性質の評価に用いられた。微小管関連蛋白質（ＭＡＰ２ｂ）、ＭＣＡＭ、及びシナプトフィシンに対する抗体が、抗体製造業者からの推薦物質として用いられた。分化培地中で３週間後、前駆体細胞のマ-カ-での分化由来の減少及び成熟ニュ-ロン細胞マ-カ-での分化由来の増加があった。Ｓｏｘ２のような神経前駆体マ-カ-のパ-センテ-ジは、分化中に減少されたが、一方ｐ７５ＮＴＲ、βＩＩＩ-チュ-ブリン及びＧＡＢＡは分化時間が長くなるにつれて増加され（図６）、しかしながら、Ｏ４陽性細胞は、ｈＮＰＣｓ（６．４±２．９）及びＮＳＬＣｓ（８．２±０．６）の分化の３週間後には、非常に低かった。機能的ニュ-ロン細胞を同定するために使用される抗体であるシナプトフィシンは、分化に続いて２週間又は３週間で増加され、このことは、ニュ-ロン細胞の成熟を示している。ＧＡＢＡ及びアセチルコリンマ-カ-は、分化に続いて２週間で増加され、３週間にて減少された。
いくつかの抗原及び遺伝子の形態的変化及び発現は、上記方法が正常で目視可能なニュ-ロン細胞をもたらすことを示している。更には、新しく形成されたニュ-ロン細胞が、ニュ-ロンの形態学的基準を有する。上記マ-カ-に追加して、神経突起分化の形態学的マ-カ-を特性評価することによって、分化した細胞が評価された。ニュ-ロン型細胞（βＩＩＩ-チュ-ブリンを強く発現する細胞）は、ニュ-ロン当たりの神経突起の平均数での増加（例えば１．３８±０．１からの）を含む分化後の神経突起形成を示した。同じパタ-ンが、βＩＩＩ-チュ-ブリン陽性細胞中で観察された。したがって、平均神経突起長さ（１１８．３±３．５μｍ）及びニュ-ロン当たりの分岐点の数（３．２８±０．３）もまた増加した。成長円錐をその末端に備えた、長さが３細胞直径よりも大きい、長い神経突起を発達させた分化したニュ-ロン様細胞は、ニュ-ロンに特異的な遺伝子を発現し、並びに分化の誘導後に増殖を停止した。
希突起膠細胞系統に向かう分化が促進される最適化毎値を使用して、更なる分化が実施された。ＮＳＬＣｓ及びｈＮＰＣｓが、ＦＧＦ-２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充された先に記載されたようなＮＳ-Ａ分化培地中で、４日間培養された。４日後に、培地が、Ｔ３（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＧＦ１（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＮＴ-３（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及びＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）によって補充されたＮＳ-Ａ分化培地に交換された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２にて、２０日間培養された。
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ｈＮＰＣｓ及びＮＳＬＣｓの分化のパ-センテ-ジの定量化は、Ｏ４に対して陽性に染色された細胞の群を示した。表１８に示されたように、Ｏ４陽性細胞のパ-センテ-ジは、上記分化プロトコルを用いた場合、分化したＮＳＬＣｓ（８．５±０．６％）と比較して、分化したｈＮＰＣ（４０．１±６．４％）中ではより顕著であった。
本研究は、ＤＮＡ脱メチル化剤又は後成的改変のための小分子の存在中での１つまたは２つの神経原性転写因子によって細胞をトランスフェクトすることが、安定な再プログラムされた細胞（ＮＳＬＣｓ）を達成することを示した。ＤＮＡ脱メチル化剤、後成的改変（アセチル化及びメチル化の阻害）のような物質は、再プログラミング過程の増強において有用な場合がある。これら細胞は、（１）神経幹遺伝子及び蛋白質の発現、（２）単一細胞から出発する神経球として発生かつ成長する能力、及び（３）異なる条件中でニュ-ロン系統へと分化すること、とによって決定された神経幹細胞特徴を所有かつ維持する。
有用な基準としては、形態学的特徴（長い突起又は神経突起）、ニュ-ロン特異的マ-カ-又は抗原のセットの発現などのような生理学的及び／又は免疫学的特徴が挙げられる。更に、ＮＳＬＣｓは、ニュ-ロン細胞、星状細胞の高パ-センテ-ジ並びに希突起神経膠細胞群のより低いパ-センテ-ジへの分化潜在能力を備えた三分化能性様前駆体細胞へと容易に戻る。
実施例ＶＩ
ＨＦＦｓの再プログラミングにおけるＢＭＰ信号伝達経路の意味
本研究は、ＨＦＦｓのＮＳＬＣｓへと向かう退行分化の過程におけるノギンの役割を評価するためにデザインされた。ＨＦＦｓは、実施例ＩＩＩに記載されたように、培養され、サイトカラシンＢで処理された。２日後に、実施例ＩＩに記載されたように、細胞が、構築されたベクタ-Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２を使用して、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによってトランスフェクトされた。つまり、細胞の調製後、細胞は全ＤＮＡ（Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２）の２μｇと混合され、ＡｍａｘａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによって、製造者の取扱説明書に従って、ＭＢＤ２（２μｇ）でコトランスフェクトされた。次いで、サンプルをラミニン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でコ-ティングされた培養プレ-ト中に移し、組換体ｈＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、組換体ｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充され、及びノギン（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む又は含まない神経増殖培地（ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ増殖キット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在中で培養した。サンプルが異なる時点で回収され（１、３、４、６、及び８日）、ＲＴ-ＰＣＲによってニュ-ロン遺伝子発現が解析され、並びに免疫組織化学法によって蛋白質発現レベルが解析された。
蛍光免疫組織化学染色が、実施例Ｉに先に記載されたように、トランスフェクションから４日目のサンプルについて実施された。トランスフェクトされた細胞が、Ｓｏｘ２の発現について染色並びに解析が行われ、Ｓｏｘ２のパ-センテ-ジは、４日目にてのノギンの存在がないものが２７．５±０．５０％であったことと比較して、３３．３±１．００％であった。ノギンの（２０ｎｇ／ｍｌ）存在の有無にて、ｐＣＭＶ-Ｍｓｉ１-２Ａ-Ｎｇｎ２によるＨＦＦｓのトランスフェクション後のネスチン及びＳｏｘ２などのニュ-ロン前駆体細胞マ-カ-の相対的発現のＲＴ-ＰＣＲ解析は、３日目に開始するネスチンとＳｏｘ２での増加並びに８日目までのそれらの維持に関連した。ノギンの不在下では、発現での分化は認められなかった。ノギンによるＢＭＰ信号伝達経路の阻害は、このようにして再プログラミングを増強させたが、それ自体に及ぼす再プログラミング効果は有さなかった。
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 実施例ＶＩＩ
ＨＦＦ細胞から産生されたＮＳＬＣｓは皮膚由来前駆体（ＳＫＰｓ）ではない
皮膚由来前駆体（ＳＫＰｓ）と称される細胞は、成人の皮膚に常駐する可能性があること（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００４年）が知られている。これらの細胞は、ＥＧＦ及びＥＧＦに反応して分化し、ネスチン、ベルシカン及びフィブロネクチンを発現することが可能であり、並びにニュ-ロン及び中胚葉子孫の両方へと分化することができる。ＮＳＬＣｓがＳＫＰｓと明確に区別されることを確認するために、脂肪細胞へと向かう分化が実施された。幹細胞由来脂肪細胞（ＡＤＳＣ）が、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコ-ティングされたフラスコ上、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ血清フリ-培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中ｓｗ維持された。ＣｅｌｌＳｔａｒｔは、ｄＰＢＳ／Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋中で１：１００に希釈され、フラスコが３７℃にて２時間インキュベ-トされた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を用いて、３〜４日毎に細胞を継代させて、培地が２日毎に交換された。分化開始の３〜４日前に、ＡＤＳＣｓ及びＮＳＬＣｓを、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（ｄＰＢＳ／Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋中１：１００希釈／３７℃で２時間）でコ-ティングされた組織培養プレ-ト中の６ウェルプレ-ト中に播種した。細胞が密集状態に到達した際に（３〜４日後）、増殖培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（５０：５０）、ＩＴＳ（１：１００）、ＨＥＰＥＳ（１：１００）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（１：１００）、Ｔ３（０．２ｎＭ）、ロシグリタゾン（０．５μｇ・ｍｌ）、ＩＢＭＸ（１００μＭ）及びデキサメタゾン（１μＭ）で構成される分化培地に交換された。３日後に、ＩＢＭＸとデキサメタゾンが分化培地から除去された。１０日目に、細胞が４％ホリムアルデヒド溶液で１０分間固定されて、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色溶液で１５分間、染色された。染色液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏに特異的に染色された脂質液滴を伴って、脂肪細胞が赤色で出現したが、ＮＳＬＣｓは陰性に染色され、細胞中には脂質液滴の存在は見られず、並びに細胞はニュ-ロン細胞形態を採用した。
免疫組織化学解析では、ＮＳＬＣｓがＳＫＰｓとは明確に区別されることを確認した（図２４）。ＮＳＬＣｓは、ｐ７５ＮＴＲに対して陽性染色であり、並びにフィブロネクチン及びベルシカンに対して陰性に染色され、一方、ＳＫＰｓはフィブロネクチン及びベルシカンを発現し、ｐ７５ＮＴＲを発現しない（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００４年）。本研究は、ＮＳＬＣｓが三分化能様前駆体細胞を表し、ＳＫＰｓの亜群ではないことを示唆している。
実施例ＶＩＩＩ
神経様細胞（ＮＬＣｓ）からのＢＤＮＦ放出
ニュ-ロン細胞及びグリアへと分化された神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）が、５５日間培養物中で維持され、調整培地中のＢＤＮＦ放出が、異なる時点にての抗原捕獲ＥＬＩＳＡによって測定されて、並びに未分化のＮＳＬＣｓ及びトランスフェクトされていない細胞（Ｈｆｆ）はもとより、成熟ニュ-ロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）、未分化の神経ヒト正常前駆体細胞（ＮＨＮＰ、Ｌｏｎｚａ）中での放出と比較された。各グル-プからの調整培地が回収され、遠心分離され、次いでアッセイまで-８０℃で冷凍保存された。ＢＤＮＦ濃度が、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤＮＦ Ｅｍａｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＳＡ）によって、製造者の取扱説明書に従って測定された。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡ免疫プレ-トが、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．７）中で１／１０００で希釈された抗-ＢＤＮＦ（ＣあｔＮｂ＃Ｇ７００Ｂ）でコ-ティングされ、４℃にて一夜インキュベ-トされた。翌日、全てのウェルが、ＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（登録商標）０．５％で洗浄され、その後Ｂｌｏｃｋ／Ｓａｍｐｌｅ緩衝液１×を使用して、振蕩することなく室温で１時間インキュベ-トした。ブロッキング後、標準とサンプルをプレ-トに添加し、室温にて２時間、振蕩（４５０±１００ｒｐｍ）しながらインキュベ-トした。続いて、ＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ洗浄用緩衝液で洗浄後、４℃にて、抗-ヒトＢＤＮＦ ｐＡｂ（Ｂｌｏｃｋ＆Ｓａｍｐｌｅ １× Ｂｕｆｆｅｒ中で１：５００希釈）を使用して、プレ-トを２時間インキュベ-トした。インキュベ-ション後、プレ-トをＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ０．５％洗浄用緩衝液で５回洗浄し、希釈された抗-ＩｇＹＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ１００μｌを、それぞれのウェルに添加し（Ｂｌｏｃｋ＆Ｓａｍｐｌｅ １× Ｂｕｆｆｅｒ中１：２００希釈）、振蕩（４５０±１００ｒｐｍ）しながら室温にて１時間インキュベ-トした。次に、プレ-トをＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ０．５％洗浄用緩衝液で５回洗浄し、ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎの１００μｌを各ウェルに添加した。ＢＤＮＦプレ-トに関して、振蕩（４５０±１００ｒｐｍ）しながらの室温にての１０分のインキュベ-ション後に、青色がウェル中に現れた。１Ｎの塩酸１００μｌを添加することによって、反応を停止させた後に、反応停止後３０分以内で、マイクロプレ-トリ-ダ-（Ｓｙｎｅｒｇｙ ４（登録商標））上で４５０ｎｍにて吸収が読み取られた。上澄み液中に放出されたＢＤＮＦの濃度が、標準曲線に従って決定された。
ＥＬＩＳＡの結果は、１１日目から開始し、５５日目まで維持された、分化された神経様細胞（ＮＳＬＣｓから分化されたＮＬＣｓ）及び正常ヒトニュ-ロン細胞から放出された濃度と同一の濃度で、ＢＤＮＦが放出されたこと（表２０）、これに対して、他のグル-プ中ではＢＤＮＦは放出されなかった（トランスフェクトされていないＨＦＦグル-プにてほんのわずかの量が放出されたことを除いて）。
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ニュ-ロン形態基準を採用することに加えて、ＮＬＣｓは機能的であり、かつ神経親和性因子（ＢＤＮＦ）を放出する能力を有した。これら神経親和性因子を局所的に送達し得るような再プログラムされたニュ-ロン様細胞系を発生させることは、いくつかの神経的病状を治療する方法として用いることができるであろうし、脳又は他の損傷からの再生及び機能的回復において重大な利益を提供し得る。
実施例ＩＸ
ＮＳＬＣｓに向かう異なる細胞型の再プログラミング
本研究は、角化細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヒト脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が神経幹様細胞へと向かう能力について検討するために実施された。
ヒトＣＤ３４＋細胞、ヒトＡＤＳＣ及びヒト角化細胞の調製
ヒト動員末梢血液ＣＤ３４＋細胞が、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手され、幹細胞因子（ＳＣＦ、１５０ｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、顆粒細胞コロニ-形成刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ、３７．４ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＩＬ-３（７５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充された完全ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）-３４血清フリ-培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ペトリ皿で浮遊培養として増殖された。細胞懸濁液の３００×ｇにて１０分間の遠心分離後に、サイトカインで補充された培地は、２〜３日毎に交換された。培地交換以外の日毎に、培地を交換することなく、サイトカインが培養物に直接添加された。細胞が、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベ-トされた。細胞を継代させるために、細胞を遠心分離し、サイトカインを添加された上記培地中に再懸濁し、並びに適切な数のペトリ皿に配置された。
ヒト脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎから入手され、１×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度にて、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコ-ティングされたフラスコ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含有するＰＢＳ中１：１００の希釈）上で、完全ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ血清フリ-培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。培地を、新鮮な予め加温した完全ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭで２日毎に交換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベ-トした。８０％の集密状態で、予め加温したＴｒｙｏＬＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での３〜５分間のインキュベ-ションによって、細胞を部分継代させて、次いでＳｅｍＰｒｏ ＭＳＣ培地中に回収した。
１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離が行われたのちに、上記のように、細胞がＣｅｌｌＳｔａｒｔコ-ティングされたフラスコに播種された。
初代ヒト角化細胞が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手され、Ｃｏａｔｉｎｇマトリックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がコ-ティングされたフラスコ上で、限定角化細胞血清フリ-培地中で、５×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度にて増殖された。細胞が、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベ-トされた。継代培養まで、培地が、新鮮な完全成長培地に２〜３日毎に交換された。細胞が７０〜８０％の集密状態に到達したら、培地が取り除かれ、細胞がＶｅｒｓｅｎｅ（登録商標）中で３〜５分間、室温にてインキュベ-トされた。Ｖｅｒｓｅｎｅが除去され、予め加温された０．０５％のトリプシン-ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がフラスコに添加された。５〜１０分間のインキュベ-ション後、大豆トリプシン阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する成長培地をフラスコに添加し、細胞を緩やかに粉砕した。１００×ｇで１０分間の遠心分離後、上記のように、細胞を、コ-ティング付きフラスコ上の予め加温した完全成長培地の所望の容量中に再懸濁させた。
トランスフェクションに先立って、細胞がトリプシンで処理されて、Ｓｈｕｔｔｌｅを用いる実施例ＩＶ中で先に記載されたように、ｐＣＭＶ-Ｍｓｉ１-Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２で一過性コトランスフェクトされて、ラミニン（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ／ｍｌ）でコ-ティングされた培養プレ-トに播種した。トランスフェクション後１日目から出発して、細胞がＶＰＡ（１ｍＭ）で４日間処理され、培地が、ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補充された増殖培地へと徐々に交換され、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて、１８日間培養された。次いで、ＲＴ-ＰＣＲ及び免疫組織化学法によって、細胞が神経幹細胞マ-カ-について解析された。
再プログラムされた細胞の更なる解析及び定量化は、ＮＳＬＣｓの群が角化細胞とＣＤ３４＋細胞から引き起こされたことを示した。ＲＴ-ＰＣＲ解析は、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２による角化細胞とＣＤ３４＋細胞のトランスフェクション後に、Ｓｏｘ２、ネスチン、ＧＦＡＰ、及びβＩＩＩ-チュ-ブリンなどのような神経幹細胞マ-カ-の相対的発現の増加を確認した。ネスチンとＧＦＡＰの相対的発現は、ＨＦＦｓから産生されたＮＳＬＣｓと比較すると、角化細胞とＣＤ３４＋細胞から産生されたＮＳＬＣｓ中で増強されたが、しかしながら、Ｓｏｘ２及びＡＣＨＥ発現に関しては、逆もまた真であった。βＩＩＩ-チュ-ブリン（ＴＵＢＢ３）及びＭａｐ２ｂ発現は、ＣＤ３４＋細胞から産生されたＮＳＬＣｓ中で最高であって、次がＨＦＦから産生されたＮＳＬＣｓであった（表２１）。このデ-タは、異なる遺伝子発現プロファイル（及び特性）を備えた異なる型のＮＳＬＣｓは、異なる型の出発細胞／源細胞から産生され得ることを示している（同様なことが、本願で説明された幹様細胞のいくつかの他の型の産生について観察された）。角化細胞（内因性神経幹細胞と同じように外胚葉から誘導された）が、ネスチンを除いて解析されたすべての遺伝子に関して、ＨＦＦｓよりも低い発現を有するであろうことを予期しなかった（角化細胞が外胚葉由来であるために、それらがＮＳＬＣｓへと容易に再プログラムされるであろうと予期された）ために、このデ-タはまた、興味深い。
Figure 2018183152
免疫組織化学法は、図７で示されたように、ＧＦＡＰ、Ｓｏｘ２、及びネスチンについての陽性染色を示した。ＨＦＦから発達したＮＳＬＣｓは、Ｓｏｘ２とＧＦＡＰに関する陽性染色のパ-センテ-ジ（それぞれ５５．８±３．８と７．８±２．４）が、ＣＤ３４＋細胞（４２．８±２．７と２４．２±４．４）、及び核化細胞（４７．１±２．１と４３．４±８．９）比較してより高いパ-センテ-ジを生じた。ネスチン陽性細胞のパ-センテ-ジは、角化細胞中（７７．６±１０．７）及びＨＦＦ中（６８．４５±１２．９）で高く、並びにＣＤ３４＋細胞（１５．５±２．７）中でより低かった（表２２）。Ｓｏｘ２及びネスチン陽性染色は、ＡＤＳＣｓ中では検出不能であった。
Figure 2018183152
角化細胞及びＣＤ３４＋細胞から産生されたＮＳＬＣｓが、三分化能性について試験された。これらＮＳＬＣｓのニュ-ロン系統へと向かう分化を誘導するために、更なる分化研究が、実施例Ｖに記載されたように、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充されたＮｅｕｒｏＣｕｌｔ分化培地（ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ分化Ｋｉｔ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施された。ＨＦＦｓ及びｈＮＰＣｓから産生されたＮＳＬＣｓが、対照として使用されて、３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて３週間、培養物がインキュベ-トされた。更なる解析のために、分化に続いて１４日目と２８日目に、サンプルが回収され、固定された。ＲＴ-ＰＣＲ解析は、表２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ及び２３Ｄに示されたように、未分化遺伝子（ネスチン及びＳｏｘ２）の減少と分化遺伝子（Ｍａｐ２、βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＣＮＰア-ゼ、及びＧＦＡＰ）の増加を確認した。
Figure 2018183152
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Figure 2018183152
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分化の１４日及び２８日後のサンプルで、蛍光免疫組織化学染色が実施された。Ｓｏｘ２及びネスチンの発現は、分化した細胞（ＨＦＦ、角化細胞、及びＣＤ３４＋）中で時間依存的に減少された。この減少は、２８日にてのＧＦＡＰのような分化したマ-カ-の増加（ＨＦＦ-ＮＣについては６８．５１±１１．８７、角化細胞ＮＣについては５９．５５±９．１２、及びＣＤ３４＋-ＮＣについては６１．７０±１．４８）に関連した。βＩＩＩ-チュ-ブリン陽性細胞についての高いパ-センテ-ジが、角化細胞及びＣＤ３４＋細胞から産生したβＩＩＩ-チュ-ブリン陽性細胞（それぞれ２３．２７±２．９１及び３９．１５±７．９９）と比較して、ＨＦＦから産生した分化したＮＳＬＣｓから発生された（５７．８３±４．４９）（表２４）。
Figure 2018183152
分化中において、ＮＳＬＣｓ中よりもｈＮＰＣｓ中で、Ｓｏｘ２陽性細胞の％は、より急速に減少し、ネスチン陽性細胞の％は、一般的によりゆっくりと減少し、並びに分化マ-カ-（Ｓ１００β、βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＧＦＡＰ）のうちの１つを発現する細胞の％は、一般的によりゆっくりと増加した。産生されたＮＳＬＣ系の３つの型以外では、分化マ-カ-（Ｓ１００β、βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＧＦＡＰ）のうちの１つを発現する細胞の％は、角化細胞から創出されたＮＳＬＣｓ中で最もゆっくり増加し、並びにＨＦＦｓから創出されたＮＳＬＣｓ中で最も急速に増加した。
本研究は、ＮＳＬＣｓは角化細胞及びＣＤ３４＋血液細胞から作り出され得、これら細胞はＨＦＦから作り出されたＮＳＬＣｓと同様な形態及びマ-カ-を共有することを示した。Ｓ１００β染色によって確認された、分化中におけるＧＦＡＰ陽性細胞の高いパ-センテ-ジによって示されたように、ｈＮＰＣｓと同様に、角化細胞及びＣＤ３４＋細胞から作り出されたＮＳＬＣｓ並びにＨＦＦｓは、ニュ-ロン系統へと向かうよりはいっそう星状細胞系統へと向かうという傾向を有した（ＨＦＦｓから作られたＮＳＬＣｓが、βＩＩＩ-チュ-ブリン陽性細胞及びＧＦＡＰ陽性細胞のほぼ同数を有したことを除けば）。しかし、ｈＮＰＣｓから派生した星状細胞とニュ-ロン細胞の比率は、同一の培養条件中で低く、このことは、ＨＦＦ、角化細胞、及びＣＤ３４＋細胞から発生したＮＳＬＣｓが、ｈＮＰＣｓと比較して、より多数のニュ-ロン細胞及び星状細胞を発生させ得ることを示唆している。ＮＳＬＣｓは、それがＨＦＦｓ、角化細胞あるいはＣＤ３４＋細胞（又はいくつかの他の細胞の可能性があろうと）のいずれから作られていようと、三分化能性であり、ｈＮＰＣｓと同様に、ニュ-ロン、星状細胞、及び希突起細胞膠細胞へと分化するための能力を有する。しかしながら、トランスフェクトされたＡＤＳＣｓのＲＴ-ＰＣＲ及び免疫組織化学解析は、神経幹細胞遺伝子のいかなる顕著な発現を示さず、このことは、ＡＤＳＣｓをＮＳＬＣｓへと変換させるために条件を最適化する必要性、若しくはＡＤＳＣｓをＮＳＬＣｓへと変換させ得る他の神経原性因子の効果を検討することの必要性を示唆している。
実施例Ｘ
３Ｄ細胞外マトリックス（ＣＤＭ）の組立て
実施例Ｉに記載されたように、１０％ＦＣＳの存在中、ＤＭＥＭ培地中で、繊維芽細胞が培養され、続いてラミニンで前コ-ティングされた（１０μｇ／ｍｌ）１２ウェルプレ-トへ、限定ＣＤＭ培地中、２×１０６細胞／ｍｌの濃度にて播種し、限定ＣＤＭ培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｌ-グルタミンとピルビン酸ナトリウムを加えた高グルコ-ス（４．５ｇ／Ｌ））と次の成分が補充されたＨａｍのＦ-１２培地（ＥＧＦ（４．２×１０-１０Ｍ）、ｂＦＧＦ（２．８×１０-１０Ｍ）、ＩＴＳ（８．６×１０-５Ｍ）、デキサメタゾン（１．０×１０-７Ｍ）、Ｌ-アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩ｎ-水和物（３．２×１０-４Ｍ）、Ｌ-３，３’，５-トリヨ-ドチロニン（２．０×１０-１０Ｍ）、エタノ-ルアミン（１０-４Ｍ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（４×１０-
３Ｍ）、グルタチオン（３．３×１０-６Ｍ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンフォテリシンＢ）の３：１比を備える。この完全に化学的に限定された培地中で繊維芽細胞を超集密的密度にて培養することによって、増殖速度が低減された高合成期へとそれら細胞が移行することを引き起こし繊維芽細胞それ自体によって完全に合成される新生３Ｄ細胞外マトリックス（ＣＤＭ）内の繊維芽細胞の多重層からなる生きた組織等価物（ＬＴＥ）の生産へと誘導する。
ＣＤＭ内における細胞の分化形質転換及び再プログラミング
１４日目のＣＤＭサンプルを、サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理し、５日間にわたりサイトカラシンＢの濃度が１０μｇ／ｍｌから０μｇ／ｍｌに減少されるのと同時に、培地がＣＤＭ培地からＮｂＡｃｔｉｖｅ培地へと切り替えられた。サンプルを、更に１２日間、３７℃、５％ＣＯ２にて培養し、並びに培地が毎日交換された。
ニュ-ロンマ-カ-を検出するために、先に記載されたように、サンプルが固定され、免疫組織化学法が実施された。次の抗体、マウス抗-ネスチン６４７（１：１００、ＢＤ）及び抗-βＩＩＩ-チュ-ブリン（１：２００、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ）が使用された。細胞の形態的変化は、ＣＤＭ内では観察されず、免疫組織化学解析は、βＩＩＩ-チュ-ブリン陽性細胞を検出できなかった。したがって、サイトカラシンＢと化学的に限定された神経培地のみを使用しての分化形質転換の誘導は、細胞を再プログラムするために十分ではなかった。
次に、３７℃及び５％ＣＯ２にてＬＡＳ前コ-ティングされたプレ-ト中で成長された６日目のＣＤＭサンプルが、サイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）に５日間以上、ヒストン脱アセチル化阻害剤（ＶＰＡ、４ｍＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びＤＮＡメチル化の阻害剤（５-アザシチジン、５μＭ、Ｓｉｇｍａ）に同時に曝された。４日後に、培地が、ＥＧＦを含まないＣＤＭ培地とＮＴ-３（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充されたＮｂＡｃｔｉｖｅ培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）の３：１の比で構成された分化培地へと交換された。分化培地の比が、１００％の完全な分化培地になるまで、毎日徐々に増加された。処理から２週間後に、細胞が固定され、細胞の同一性を検討するための免疫組織化学解析が行われた。図１８は、７日目にて、βＩＩＩ-チュ-ブリンで免疫染色された細胞を示していて、これはニュ-ロンへの繊維芽細胞の退行分化を示唆している。しかしながら、１週間後には、これら分化形質転換された細胞が繊維芽細胞へと戻り、並びにβＩＩＩ-チュ-ブリンの発現が失われた（図８）。プライミング剤の離脱後の形態及びβＩＩＩ-チュ-ブリンの損失は、機能的及び安定な再プログラムされた細胞への完全な変換が起こっていなかったことを示している。
次いで、上記のように、ＶＰＡ（４ｍＭ）、５-Ａｚａ（５μＭ）及びサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）で、ＣＤＭが処理された。化学的処理から２日後に、ＣＤＭ内の繊維芽細胞が、リポフェクタミン剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、ＤＮＡでトランスフェクトされた。細胞をトランスフェクトするために、真核細胞ＤＮＡ発現ベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｐａｘ６、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１及びｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２（Ｏｒｉｇｅｎｅ）が使用された。２４時間後、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補充された神経プロジェニタ-基本培地（Ｌｏｎｚａ）に培地が交換され、細胞が３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて培養されて、培地が毎日交換された。６日目に、ＮＴ-３（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、オ-ルトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、５μＭ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及びｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補充されたＮＢＡｃｔｉｖｅ培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）を徐々に添加することによって、分化が開始された。再プログラムされた細胞を特性評価するために、ネスチン、βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＧＦＡＰ、ＭＡＰ２ｂ、及びＡＣＨＥのためのプライマ-を使用して、実施例ＩＩで記載された方法に従って、種々の時点にて、免疫組織化学解析及びＲＴ-ＰＣＲが実施された。先の研究と一致して、トランスフェクトされていない細胞及びＰａｘ６でトランスフェクトされた細胞は、ニュ-ロン系統に特異的な遺伝子を発現しなかった（表２５）。これに反して、Ｍｓｉ１によるトランスフェクション後には、ネスチン及びＡＣＨＥのレベルは、それぞれ４倍及び８倍まで増加され、並びにこの発現は１２日間を超えて維持された。更にＧＦＡＰ ｍＲＮＡのレベルも、約１４倍まで時間依存的に増強された。同様に、Ｎｇｎ２でトランスフェクトされた細胞においても、同じパタ-ンが観察された。
βＩＩＩ-チュ-ブリン及びＭＡＰ２ｂの発現が、１つの神経原性転写因子によるトランスフェクションに続いて、中程度に増加された一方で、Ｐａｘ６を伴う２つの神経原性因子Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２によるトランスフェクト後の遺伝子発現の調節は、ニュ-ロン遺伝子の発現をそれほど増加させなかった。図１９は、細胞がＭｓｉ１及びＮｇｎ２でトランスフェクトされた場合、βＩＩＩ-チュ-ブリンが１２日目にて６倍まで増強されたことによって、これら遺伝子の発現が増強されたことを示している。
Figure 2018183152
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３つの転写因子（Ｍｓｉ１、Ｎｇｎ２及びＰａｘ６）によって細胞をトランスフェクトした場合に、遺伝子発現の同じパタ-ンが観測されたが、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２のみでトランスフェクトされた細胞よりも、発現はそれほど顕著ではなかった。トランスフェクションから１２日後の免疫組織化学解析に関しては、ネスチン及びＭＡＰ２ｂの発現によって示唆されたように（図９）、Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２によるトランスフェクション後に、細胞はニュ-ロンマ-カ-を発現した。ｐＣＭＶ-ＸＬ-ＰＡｘ６でトランスフェクトされた細胞は、ネスチン及びＭＡＰ２ｂに対して染色されなかった。
本研究は、ＣＤＭ内の細胞をただ１つの神経原性因子（Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２）でトランスフェクトすることが、形態的変化並びに神経幹細胞及びニュ-ロン細胞の１つまたはそれ以上のマ-カ-の発現を誘導することを示している。再プログラムされた細胞が、重要な神経原性因子、ニュ-ロン前駆体マ-カ-、及び成熟ニュ-ロンマ-カ-を低いパ-センテ-ジ（１０％）で発現するために、このことが、ＣＤＭ内の細胞がＮＳＬＣｓへと変換されて、次いで神経幹細胞中で誘導されたニュ-ロン決定及び文化プログラムの種々の段階を経て、分化を開始したことが考えられる。
実施例ＸＩ
ＣＤＭ内の再プログラムされた細胞遺伝子発現解析
本研究は、再プログラミング過程で、ＭＢＤ２の存在中で、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２によって細胞をトランスフェクトすることの効果を試験するようにデザインされた。実施例Ｘに記載されたように、サイトカラシンＢによる前処理の２日後に、リポフェクタミン剤を用いて、細胞がＤＮＡ発現ベクタ-によってトランスフェクトされた。真核細胞ＤＮＡ発現ベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｕｓａｓｈｉ１又はｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２、及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２（Ｏｒｉｇｅｎｅ）が、細胞をコトランスフェクトするために用いられた。２４時間後に、培地がＣＤＭ：ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０んｇ／ｍｌ）、及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補充された神経プロジェニタ-維持培地（ＮＰＢＭ）（１：１）に交換された。ＮＰＢＭのパ-センテ-ジを増加させて、並びにＣＤＭ培地のパ-センテ-ジを減少させることによって、培地が毎日交換された。３７℃、５％ＣＯ２及び５％Ｏ２にて６日間、細胞が培養された。１週間後に、ＮＴ-３（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、オ-ルトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、５μＭ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及びｇＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が加えられたＮＰＢＭ培地を抒情に補充することによって、分化が開始された。研究期間の最後（１４日目）にサンプルが回収されて、ニュ-ロン系統に対して特異的であると再現的に確認される遺伝子を同定するための遺伝子アレイによって、デ-タが解析された。
遺伝子発現アレイ
神経幹細胞、ニュ-ロン細胞及びグリア細胞、並びにトランスフェクション後の細胞によって発現された成長因子に関連した遺伝子の発現を同定するために、８サンプルについての遺伝子発現アレイが、実施例Ｉに先に記載されたように、カスタマイズされたＮｅｕｒｏｎａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ ２ ＴＬＤＡを使用して実施された。ＮＫｘ２．２、ｏｌｉｇ２、及びＭＡＧのような希突起神経膠細胞の発現は、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２によって増加されたが、この増加は、Ｎｇｎ２と比較してＭｓｉ１によってより顕著であった（表２６）。星状細胞に対する２つのマ-カ-（ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４）は、ＤＮＡ脱メチル化剤ＭＢＤ２の存在中で、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２によるトランスフェクション後に、高度に発現された。興味深いことに、初期ニュ-ロン細胞の数個のマ-カ-が増強され、つまりトランスフェクションから１２日後に、ＴＤＬＡデ-タは、ソモアトスタチン及びカルビンジン１のようなインタ-ニュ-ロンのための特異的マ-カ-の増加を示した。発達中の未成熟細胞の移入によって発現されるダブルコルチン（ＤＣＸ）と、ニュ-ロン細胞の初期マ-カ-であるアセチルコリンは、再プログラムされた細胞中で高度に発現された（表２６）。Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２によるトランスフェクションは、新生ニュ-ロンのための初期マ-カ-であるジヒドロピリミジナ-ゼ様３（ＤＰＹＳＬ３）を、Ｍｓｉ１では５倍まで、Ｎｇｎ２では７倍まで増加させた。初期ニュ-ロン形態の発達及び維持のための必須マ-カ-である微小管関連蛋白質２（ＭＡＰ２）並びにニュ-ロン細胞接着分子（ＮＣＡＭ）の発現は、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２によって高度に発現された。成熟ニュ-ロンのマ-カ-であるエノラ-ゼ-２の発現は、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２によって２０倍まで増強された。ＮｅｕｒｏＤ族の一員であるＮｅｕｒｏＤ１は、Ｍｓｉ１によるトランスフェクション後で８４．２２倍に、並びにＮｇｎ２によるトランスフェクション後で３４．２７倍にまで高度に発現された。
ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＮＰＹ及びＣＳＦ-３などの成長因子の遺伝子発現は、Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２によるトランスフェクションに続いて増強された。ＶＥＧＦとＧＤＮＦの発現は、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２によって、それぞれほぼ５倍と７倍に増加された。しかし、トランスフェクトされた細胞の中で、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、及びｂＦＧＦの発現は活性化されず、トランスフェクトされていない細胞と比べてダウンレギュレ-トもされた。神経突起伸張の成長関連マ-カ-及び再生関連マ-カ-である成長関連蛋白質（ＧＡＰ-４３）の発現、並びにニュ-ロンの発達及び誘導に関与するネトリンの発現は、トランスフェクトされた細胞中で高度に発現された（表２６）。ＩＩＩ型受容体チロシンキナ-ゼ、神経親和性チロシンキナ-ゼ受容体、及び神経親和性チロシンキナ-ゼのような、成長因子及び神経原性因子のための受容体の発現は増加された。繊維芽細胞特異的マ-カ-のビメンチン及びフィブロネクチンは、再プログラムされた細胞中でダウンレギュレ-トされえた。
ＭＢＤ２の存在中におけるＭｓｉ１及びＮＧＮ２のみによるＨＦＦのトランスフェクションは、グリア細胞マ-カ-とニュ-ロン細胞マ-カ-の発現を増加させた。
Figure 2018183152
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実施例ＸＩＩ
リポフェクタミン及びヌクレオフェクチンによるＣＤＭ内の細胞の再プログラミング
本研究は、リポフェクタミンとヌクレオフェクチンを組み合わせることによる、並びに2つのベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１とｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２を個別に又は組み合わせて使用するＣＤＭのトランスフェクションを改善するためにデザインされた。サイトカラシンＢでの前処理後２日後又は前処理されず、４日目のＣＤＭ内の細胞を、ＭＳｉ１／ＭＢＤ２、Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２又はＭｓｉ／Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２によって、６時間、脂質トランスフェクトした。これと並行して、実施例ＩＩに記載されたように、ヌクレオフェクチンを用いて、６時間後に新鮮なＨＦＦでトランスフェクションが実施され、リポフェクタミン培地が新鮮なＣＤＭ培地に交換された際に、ＣＤＭの最上部に移動された。２４時間後、培地が、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、組換体ｈＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び組換体ｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充された神経プロジェニタ-基本培地（ＮＰＢＭ、Ｌｏｎｚａ）に交換された。ＮＳＡ-Ａ分化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによって、７日目に分化が誘導された。
遺伝子発現解析
実施例Ｉに先に記載された方法によるＲＴ-ＰＣＲを使用して、数個のニュ-ロンマ-カ-遺伝子の発現を解析することによって、新たに形成された細胞の性質を評価するために、サンプルが８、１５、及び２１日目にて回収された。表２７に示されたように、１つの神経原性転写因子（Ｍｓｉ１又はＮｇｎ２）でトランスフェクトされた細胞は、８日目にて高レベルのネスチン及びβＩＩＩ-チュ-ブリンを発現する。発現の同じパタ-ンが１５日と２１日目に観察されたが、Ｎｇｎ２でトランスフェクトされた細胞中では、サイトカラシンＢの不在下で、発現が僅かに減少された。成熟ニュ-ロンマ-カ-ＭＡＰ２ｂを除くすべての遺伝子の発現は、両神経原性転写因子でトランスフェクトされた細胞中で大幅に増加された。これら遺伝子のアップレギュレ-ションは、サイトカラシンBの不在下で僅かに減少され、このことは、サイトカラシンBの再プログラミング強化における役割を示唆している。
Figure 2018183152
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免疫組織化学解析
サンプルが４、８、１４、及び２１日目に回収されて、実施例Iに先に記載された方法による免疫組織化学解析を用いて、数個のニュ-ロンマ-カ-の発現を解析することによって、任意の再プログラムされた細胞の性質を評価した。種々の時点にての免疫組織化学解析は、ネスチンの発現は8日以内で細胞の大部分で誘導されて、分化の誘導後に、時間依存的に減少された（図１０）。
本研究は、サイトカラシンＢ及びＭＢＤ２の存在中で１つ又は２つの神経原性遺伝子によって細胞をトランスフェクトする場合には、再プログラムされた細胞は培養中で安定であって、環境的な変化（増殖対分化）に反応し、並びに少なくとも２４日間の培養でニュ-ロンマ-カ-を発現することを示した。
実施例ＸＩＩＩ
ＮＳＬＣｓのテロメラ-ゼ活性
テロメラ-ゼは神経前駆体細胞中で活性であり、その調節は、哺乳類の脳において細胞の増殖を引き起こすための重要なパラメ-タであると考えられる（Ｃａｐｒａｓｏ ＧＬら、２００３年）。初期（Ｐ７）及び後期継代（Ｐ２７）にての接着ＮＳＬＣｓ（ラミニンでコ-ティングされたプレ-ト上で培養されたＮＳＬＣｓ）並びに浮遊する神経球中のＮＳＬＣｓ（低結合表面を備えたプレ-ト中で培養されたＮＳＬＣｓ）の細胞抽出物中のテロメラ-ゼ活性を評価するように、本研究が実施された。４つのサンプルのテロメラ-ゼ活性が、ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用してのＰＣＲに基づいたテロメア反復増幅プロトコ-ル（ＴＲＡＰ）によって測定された。簡単に説明すると、細胞を２４ウェルプレ-ト中で成長させて、ＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのベンズアミジン、５ｍＭのβ-メルカプトエタノ-ル、０．５％のＣＨＰＳ及び１０％のグリセロ-ル（１×ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液、キット中に提供）並びにＲＮア-ゼ阻害剤を含む緩衝液中、氷上で３０分間ホモゲナイズした。サンプルを遠心分離し、上澄み液の蛋白質濃度が、ＢＣＡアッセイを用いて決定された。それぞれの細胞抽出物からの蛋白質９００ｎｇを、ＴＲＡＰ反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、鋳型基質（ＴＳ）プライマ-、ＴＲＡＰプライマ-混合物及びＴａｑポリメラ-ゼを含有するＴＲＡＰ反応混合物に直接添加した。反応混合物が３０℃にて３０分間インキュベ-トされて鋳型合成され、続いて伸張したテロメラ-ゼ生成物の増幅のためのＰＣＲ手法（初期変性では９５℃／１５分、３２サイクルでは９４℃／３０秒、５９℃／３０秒、７２℃／１分）が行われた。テロメラ-ゼ活性を検出するために、１０％非変性ＴＢＥゲル上の反応生成物に関して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）が実施された。電気泳動後に、ゲルがＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎで３０分間染色されて、続いてＧｅｌ-Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して画像獲得された。
図１１に示されたように、全ての４サンプルがテロメラ-ゼ陽性（ＴＲＡＰ生成物ラダ-によって示されたように）であった。予測されたように、熱処理対照（ΔＨ）は、テロメラ-ゼ活性を示さなかった（陰性対照）。３６ｂｐの内部対照バンド（Ｓ-ＩＣ）を用いて、ＰＣＲ増幅を監視した（偽陰性結果を区別するため）。このＳ-ＩＣバンドは、テストサンプル以外の全てのサンプルで観察された。このことは、テストサンプルの過剰に高いテロメラ-ゼ活性によるものである可能があり、ＴＲＡＰ生成物及びＳ-ＩＣ対照バンドの増幅は半拮抗的であった。すべての対照は予期した結果をもたらした（ＣＨＡＰＳ ｃｔｒｌに関してはＴＲＡＰ生成物なし、並びに陽性対照細胞及びＴＳＲ８対照に関しては生成物のＴＲＡＰラダ-）。
実施例ＸＩＶ
腫瘍形成アッセイ
悪性形質転換された細胞は、細胞外成長促進因子に関して必要性の低下を示し、細胞-細胞接触によって拘束されず、並びに頻繁に不死化である。足場非依存性成長及び増殖は、悪性形質転換の顕著な特徴であり、細胞の悪性形質転換を検出するためのインヴィトロのアッセイにおいて、最も正確かつ厳密であると考えられている。
初期及び後期継代（Ｐ７及びＰ２５）にての接着及び神経球ＮＳＬＣｓ、並びに正常ヒト神経プロジェニタ-細胞（ｈＮＰＣｓ）が、足場非依存性成長について検討された。ＨＦＦｓが陰性対照として用いられ、並びに子宮頸癌ＨｅＬａ細胞が陽性対照として用いられた。細胞を、室温（ＲＴ）、１５０×ｇで３分間の遠心分離によって沈降させた。ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（登録商標）９６ウェル細胞形質転換アッセイ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）を用いて、アッセイが実施された。寒天基層（１．２％）を２×ＤＭＥＭ／２０％ＰＢＳ溶液中に溶解し、寒天溶液の５０μｌをプレ-トに添加して、４℃にて３０分間インキュベ-トして固化させた。細胞寒天層の添加に先立って、プレ-トを３７℃にて１５分間温めた。細胞を異なる密度（２０，０００及び５，０００細胞／ウェル）にて再懸濁させたが、但しｈＮＰＣｓに関しては、十分な細胞の欠乏のために、５，０００細胞／ウェルにみで再懸濁させた。細胞を、１．２％寒天溶液、２×ＤＭＥＭ／２０％ＰＢＳ、及び細胞懸濁液（１：１：１）で混合し、混合物の７５μｌを、固化された寒天基層を既に含有するウェルに移し、次いで４℃にて１５分間放置し、細胞寒天層を固化させた。増殖培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００μｌを添加し、プレ-トを３７℃、５％ＣＯ２にて８日間インキュベ-トし、可溶化し溶解させて、蛍光平板読み取り機、ＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）ＧＲ染色剤によって検出された。４８５／５３８ｎｍフィルタ-を備えたＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、蛍光測定が実施された。
Figure 2018183152
表２８に示されたように、蛍光測定は、同一の条件下では、子宮頸癌ＨｅＬａ細胞のみが、非足場依存性コロニ-として成長かつ増殖したが、一方ｈＮＰＣｓとＮＳＬＣｓ（接着及び浮遊神経球）の双方共に、１０×確認蛍光測定にての明視野を用いた光顕微鏡観測による細胞の目視観察での標準寒天プレ-ト腫瘍形成アッセイにおいて、腫瘍成長については陰性であった（５，０００及び１０，０００細胞に関してＨＦＦｓ（陰性対照）と同一値）ことを示唆した。したがって、使用された一過性トランスフェクション法及び遺伝子は、正常に細胞の成長を制限する外部及び内部信号から独立して増殖することが可能な細胞群を産出するような、一連の遺伝子的又は後成的改変を経て、安定なトランスフェクション又は特定の遺伝子を一般的に生じるような悪性形質転換をすることなく、細胞の再プログラミングを可能にする。
実施例ＸＶＩ
一過性トランスフェクションからのＮＳＬＣｓ中におけるプラスミドＤＮＡの非ゲノム組込み
ＭＢＤ２（サンプル１に関して）又は５-Ａｚａ及びＶＰＡ（サンプル２に関して）を伴うＮＳＬＣｓの発生のための一過性トランスフェクションで、ＤＮＡプラスミドＭｓｉ１／Ｎｇｎ２（社内でデザインされ構築された）が使用された。トランスフェクション後２週間で、プラスミドＤＮＡの可能なゲノム組込みをテストするために、サウザンブロット法が行われた。ＮＳＬＣサンプルから抽出されたゲノムＤＮＡの３μｇ、並びに陰性対照として使用されたＨＦＦ（ヒト繊維芽細胞系）からのサンプルが、ＢｇｌＩＩ，ＰｓｔI及びＳｔｕＩなどを含む数個の制限酵素によって分解され、１％アガロ-スゲル上の電気泳動を受けて、正荷電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上に移された。プライマ-の１セットを用いてプラスミドＤＮＡから増幅された１．２ｋｂのＤｉｇ標識付ＰＣＲプロ-ブによって、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（登録商標）緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中、４２℃にて一夜、膜がハイブリダイズされた。膜が、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温にて２回、各洗浄毎に５分間洗浄されて、次いで０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃にて２回、各洗浄毎に１５分間洗浄された。ＣＤＰ-Ｓｔａｒ（登録商標）基質（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、膜ハイブリダイゼ-ション信号が検出された。膜は解析のためにＸ線フィルムに曝された。ストリッピングバッファ-（０．２Ｍ ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳ）を使用して、信号が膜から剥離された。膜が、プライマ-の１セットを用いてプラスミドＤＮＡから増幅された０．９ｋｂのＤｉｇ標識付ＰＣＲプロ-ブで、膜が再ハイブリダイズされた。
２ｋｂのＤｉｇ標識付ＰＣＲプロ-ブによるサウザンブロット解析（図１２）は、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２プラスミドＤＮＡがゲノム当たり１、１０又は１００の組込みの等価のゲノムＤＮＡをＨＦＦ中にスパイクされた陽性対照サンプルにおける信号と明確に区別される信号を示した。ＨＦＦ、ＮＳＬＣサンプル＃１及び＃２からの制限酵素で分解されたゲノムＤＮＡ中で出現した数個の弱くかつ同一なバンドが存在した。これらバンドは、１．２ｋｂのＤｉｇ標識付ＰＣＲプロ-ブがＮｇｎ２遺伝子の小部分を含有するために、内因性Ｎｇｎ２遺伝子を発現し得る。このデ-タは、一過性トランスフェクション後に、宿主ゲノム中へのプラスミド見込みを有するＮＳＬＣｓが全くないか、あるいは本の僅かであること、並びにトランスフェクトされた遺伝子が、細胞中に短期間（２週間未満）だけ存在することを示している。
実施例ＸＶＩＩ
移植されたｈＮＳＬＣｓの神経保護的効果
１）多発性硬化症の動物モデルにおける効果
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の難治性の炎症性ミエリン破壊疾患である（Ｆｒｏｈｍａｎ ＥＭら、２００６年）。ＭＳのための治療は、免疫系の操作に依存するが、臨床的エピソ-ド又は永久的な神経性障害に及ぼす適切な効果は、時折重大な副作用を伴う（Ｌａｎｇｅｒ-Ｇｏｕｌｄ Ａら、２００４年）頻繁な注射をしばしば必要とする。実験アレルギ-性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、疾患のメカニズムを研究するために並びに可能性のある治療を試験するために一般的に使用されるＭＳの動物モデルである。
種々のＣＮＳ抗原（ミエリン希突起神経膠細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）及びミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ））を使用して、ＥＡＥは動物の種々の種及び系統（マウス、ラット、キヌザル、アカゲザル）で誘導され得る。
実験のための適切動物許可の全てを取得した後に、生後７〜８週のメスＣ５７ＢＬ／６マウスがＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓから入手され、新しい環境への適合のために、ＭＩＳＰＲＯ動物施設で１週間飼育された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、５ｍｇ／ｍｌのヒト型結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ、Ｉｎｃ．）を含有するＣＦＡ中の１００μｇのＭＯＧ ３５-５５（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭｃＧｉｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で、背中２箇所に皮下注射された。すべてのマウスが、０日と２日目に２００ｎｇの咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）腹腔内で与えられ、一方で臨床スコアが、０〜５スケ-ルに従って、４３日の期間中、毎日盲検下で計算され、スケ-ルは、１，尾部の引きずり又は尾部緊張を伴うよたつき歩行、２，尾部を引きずったよたつき歩行（運動失調）、２．５，部分的肢麻痺を伴う運動失調、３，第１の肢の完全麻痺、３．５，第２の肢の部分的麻痺を伴う第１の肢の完全麻痺、４，第１及び第２肢の完全麻痺、４．５，瀕死状態、及び５，死亡である。
細胞の有無でのＥＡＥ動物モデルの処置
動物がＥＡＥの症状を示し始めた時に、ｈＮＳＬＣとｈＮＰＣｓ（２００μｌＰＢＳ／各マウス中１．５×１０６細胞）が、尾を通して単回静脈注射した（１３日目、静脈注射）。両動物グル-プは、ヒト細胞のいかなる拒絶も回避するために、細胞の注射の１日前に、並びに移植後毎日、シクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）が与えられた。ＰＢＳ単独が腹腔内注入された偽処理の年齢、性及び系統が適合したマウスが、対照として使用された。動物の全てのグル-プが４３日間観察された。移植後４３日目に動物が致死し、脳と脊髄が、ＰＢＳ中３０％蔗糖に採取された。臨床スコアの統計的解析は、ＥＡＥの臨床的徴候は、対照及びｈＮＰＣｓ注入動物と比較して、ＮＳＬＣが注入された動物では著しく衰弱されたことを示した。累積スコアは、ＮＳＬＣが移植された動物では顕著に低減され、並びに処置は体重には何の影響も及ぼさなかった。
２）片麻痺性動物モデル（成人ラットの左感覚運動皮質の片側性アブレ-ション）における効果
実験のための適切動物許可の全てを取得した後に、１グル-プ当たり８匹のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ、２５０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ケタミン（Ｂｉｍｅｄａ-ＭＴＣ）／キシラジン（５０／１０ｍｇ／ｋｇ、Ｎｏｖｏｐｈａｒｍ）を用いて麻酔し、定位フレ-ム上に配置させた。無菌外科用メスを使用して、正中頭蓋切開が実施され、頭蓋冠が露出されて、ブレグマが同定された。感覚運動皮質上の頭蓋が開けられ、感覚運動皮質領域（ブレグマの尾部０．５〜４．０ｍｍ及び正中線の外側１．８〜３．８ｍｍ）（ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ、１９８６年）が注意深く吸引された。アブレ-ション後、処置（アルギン酸塩、アルギン酸塩＋ｈＮＰＣ、アルギン酸塩＋ＮＳＬＣｓ、ＲＭｘ＋ＮＳＬＣｓ、ＲＭｘ単独、フィブリンゲル、又は生理食塩水）が、アブレ-ション後の脳に直接適用された。次いで、頭蓋の開口が、骨ワックスで満たされた。出血がある場合は、出血を止めるために、無菌恒常的組織を病変に挿入された。Ｅｔｈｉｃｏｎ（登録商標）モノフィラメント縫合糸１／２穴針形状を用いて縫合が実施された。手術は無菌室にて行われ、局所的感染を制限するために、局所的抗生剤（Ｃｉｃａｔｒｉｎ（登録商標）、ＧｌａｘｏＡｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が、露出した頭蓋及び頭皮に適用された。ラットは、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）が、手術前から研究機関の最後まで、毎日腹腔内注入されることによって、免疫抑制された。シクロスポリンＡ注入の目的は、治療に対するラットの免疫反応を低減させるためであった。再生のいかなる潜在的不具合（起こると仮定するならば）も処置に対する免疫反応のためではないと確証するために、免疫抑制が研究の最終まで持続された。すべてのグル-プで毎週、機能的スコアが実施され、以下に記載された行動学的試験に基づいて、感覚運動障害が評価された。
ロ-タロッド試験：ロ-タロッド速度が、全ての手技の前に、１０及び２０ＲＰＭ速度に関して手計算された。動物はそれらを環境に順化させるために、３０秒間静止したロッド上にとどまることが要求された。この時に、もし動物が落ちてしまえば、３０秒間静止した状態が可能になるまで、ロッド上に戻した。動物は３回まで試すことが許可された。３０秒間静止ロッド上に快適に留まれた動物が、１０〜２０ＲＰＭの一定の速度で６０秒間走らされ、落下した数が電子的に記録された。
ビ-ムウォ-キング法：ビ-ムウォ-キング法は、１００ｃｍのビ-ム（直径２．３ｃｍ、床から４８ｃｍ）を横切って移動した距離によって下肢共調運動を測定する。タスクを完了させる目的で、開始から終了まで上昇したビ-ムに沿って歩行するようにラットが体系的に訓練された。ラットがタスクを完了するよう意欲付させるために、安全な場所、すなわちフラットボックスがビ-ムの末端に配置された。
Figure 2018183152
手術前に、全ての動物は歩行又は共調問題を抱えていないが、速度が速いために、彼らはロ-タロッドから少なくとも１回落下した。手術後（２日後）には、全ての動物が重大な歩行及び共調問題の徴候を示し、ロ-タロッドから落下する回数の増加に至った。手術後３週間で、ＮＳＬＣｓを与えられた動物に関しては、対照と比較して落下の回数が明らかに減少した（図１４）。
手術前には、動物は難なくビ-ムウォ-キング試験に合格した。ラットは１００ｃｍのビ-ムを渡り、ビ-ムから落下することなく安全スポットに到達することができた。手術後２日目には、全てのグル-プが試験に不合格となり、ビ-ム上で平衡を保つことができなかった。手術後１週間で、全ての動物が歩行能力での改善を示したが、異なる処置を与えられたグル-プ間での有意差は認められなかった。４週〜２６週で、ＮＳＬＣｓ並びにＲＭｘで処置された動物が、対照動物と比較して歩行能力で著しい改善を示した。
実施例ＸＶＩＩＩ
Ｓｈｕｔｔｌｅ装置及び内胚葉系中胚葉への再プログラミングのための異なる小分子を使用した遺伝子の種々の組み合わせによるＨＦＦのトランスフェクション
ＨＦＦ細胞が、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の修正が加えられた以外は実施例Ｉに記載されたように、ＣＤＭ ＩＩ培地中で、先に記載されたように培養され、Ｎｅｃｌｅｆｅｃｔｏｒ ９６-ウェル Ｓｈｕｔｔｌｅ装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、実施例ＩＶに記載された手順に従ってトランスフェクトされた。細胞は、表２９中に記載されたｃＤＮＡクロ-ンの種々の組み合わせでトランスフェクトされた。
トランスフェクション後、細胞が０．１％ゼラチンでコ-ティングされたプレ-ト上に播種され、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にてインキュベ-トされた。表３０に従って、培地が一日おきに交換された。４日目に、定量的リアルタイムＰＣＲによって、細胞が解析された。
Figure 2018183152
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ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）を使用して脱着させることによって、４日目に細胞が回収され、続いて８０×ｇで５分間遠心分離された。上澄み液を吸引し、ＲＮＡ単離に使用されるまで、細胞ペレットを-８６℃にて凍結させた。先に実施例Ｉに記載されたように、ＲＮＡ単離及び定量化が実施された。ｃＤＮＡが調製され、並びに定量的リアルタイムＰＣＲが、以下に示したＴａｑｍａｎ遺伝子発現アレイ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ適用）が使用された以外は、先に実施例ＩＩに記載されたように実施された。
Figure 2018183152
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内胚葉系中胚葉様細胞の形成を誘導し得る遺伝子組み合わせの同定が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＤ３、Ｔ、Ｍｉｘｌ１、ＦｏｘＡ２、及びＭＢＤ２の組み合わせによるトランスフェクションによって検討された。表２５及び２６に示されたように、両者ともに内胚葉系中胚葉／外胚葉／中胚葉マ-カ-であるＣＸＣＲ４とＧＡＴＡ４の相対的発現が、種々の組み合わせ、最も顕著にはＦｏｘＤ３／Ｍｉｘｌ１／ＭＢＤ２及びＦｏｘＤ３／Ｓｏｘ１７／ＭＢＤ２中でアップレギュレ-トされると思われる。同様に、外胚葉及び中胚葉に関するマ-カ-であるＦＯＸＡ２は、ＦｏｘＤ３／Ｓｏｘ１７でトランスフェクトされたサンプルでアップレギュレ-トされたが、発現は非常に低いままである。トランスフェクション後４日目に、ＳＯＸ１７がＳＯＸ１７トランスフェクトサンプル中で未だ高度に発現される（未処理ＨＦＦサンプルと比較して５０，０００〜４００，０００倍）。ＳＯＸ１７遺伝子発現は、トランスフェクション後４日目でも残留している残存プラスミドＤＮＡ（外因性ＳＯＸ１７）と、誘導された任意の内因性ＳＯＸ１７発現を表す。外胚葉マ-カ-ＣＤＨ１、ｐ６３及びＳｏｘ２もまた、いくつかのサンプル中（例えば、Ｏｃｔ４／ＦｏｘＤ３／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ１７／ＭＢＤ２）でアップレギュレ-トされた。
膵臓プロジェニタ-様細胞へのＨＦＦｓの再プログラミング
ＨＦＦ細胞が、実施例Ｉに記載されたように培養されて、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ウェル Ｓｈｕｔｔｌｅ装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、実施例ＩＶに記載された手順に従ってトランスフェクトされた。細胞は、表２７に記載されたような種々の組み合わせによってトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞がフィブロネクチンがコ-ティングされたコラ-ゲンゲル上に播種され、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にてインキュベ-トされた。フィブロネクチンコ-ティングプレ-トは、トランスフェクションに先立って調製された。ラットの尾のコラ-ゲンＩ（Ｇｉｂｃｏ）を、１０×ＰＢＳ及び蒸留水を使用して１．１２５ｍｇ／ｍｌに希釈されて、その１２５μｌが、２４-ウェルプレ-トの各ウェルに添加され、３７℃にて４０分間インキュベ-トされた。１×ＰＢＳによるすすぎ洗い後に、フィブロネクチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）がゲルの最上部に、１．９μｇ／ウェルの濃度にて添加された。表３３に従って、培地が一日おきに交換された。７日目に、定量的リアルタイムＰＣＲによって細胞が解析された。
Figure 2018183152
細胞が７日目に回収されて、ＲＮＡ単離及び定量化が、実施例Ｉに先に記載されたように実施された。ｃＤＮＡが調製されて、定量的リアルタイムＰＣＲが、以下に示したＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ適用）が使用された以外は、実施例ＩＩに先に記載されたように実施された。
Figure 2018183152
膵臓プロジェニタ-様細胞の形成を誘導し得る遺伝子の組み合わせの同定が、ＦｏｘＤ３、Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｍｉｘｌ１、及びＭＢＤ２の組み合わせでトランスフェクションすることによって検討された。外胚葉及び中胚葉に関するマ-カ-であるＦｏｘＡ２は、ＧＦＰ疑似トランスフェクトされた対照サンプルと比較して、ＦｏｘＤ３／Ｓｏｘ１７／Ｎｇｎ３／ＭＢＤ２でトランスフェクトされたサンプルに関して僅かにアップレギュレ-トされた。同様に、外胚葉及び中胚葉双方のためのマ-カ-であるＣＸＣＲ４は、ＦｏｘＤ３／Ｍｉｘｌ１／Ｎｇｎ３／ＭＢＤ２でトランスフェクトされたサンプルについて、僅かにアップレギュレ-トされた（ＧＦＰ-対照と比較して３倍）。トランスフェクション後７日目で、ＳＯＸ１７は、種々のレベルにてＳＯＸ１７でトランスフェクトされたサンプル中で未だ検出され得た（ＧＦＰ-対照と比較して４〜５７０倍のアップレギュレ-ション）。最高のＳＯＸ１７の発現のアップレギュレ-ションは、Ｓｏｘ１７／Ｍｉｘｌ１／Ｐｄｘ１／Ｎｇｎ３でトランスフェクトされたサンプルについて検出され（ＧＦＰ-対照と比較して５７０倍）、このことから、この遺伝子組み合わせが細胞中のＳＯＸ１７ ＲＮＡの量を増加させ得ることを示唆することができる。
実施例ＸＩＸ
多分可能様幹細胞（ＰＬＳＣ）へのヒト脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の再プログラミング
ＡＤＳＣｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、完全ＳｔｅｍＰｒｏ-４３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた細胞培養フラスコ中で、３７℃、５％ＣＯ２にて培養されて、培地が１週間当たり３回交換された。培養３日後に、細胞（５継代）がトリプシン処理され、計測されトランスフェクトされた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して、実施例ＩＩに記載されたように、次に示した１つのプラスミドｐＣＭＶ６-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-Ｎａｎｏｇ、ｐＣＭＶ-Ｓａｌｌ４-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-Ｎａｎｏｇ、ｐＣＭＶ-Ｄａｘ１-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４、ｐＣＭＶ-ＦｏｘＤ３-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４、ｐＣＭＶ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-Ｓａｌｌ４、ｐＣＭＶ-ＭＢＤ２-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ、ｐＣＭＶ-ＡＧＲ２-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ、又はＲｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４（２μｇ）、若しくはｐＣＭＶ-Ｓｏｘ２ｎｕｃ-ＩＲＥＣ-Ｌｉｎ２８又はｐＣＭＶ-Ｋｌｆ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｔｐｔ１ｎｕｃ又はｐＥＦ-Ｓｔｅｌｌａ-ＩＲＥＳ２-ＮＰＭ２を伴ったｐＥＦ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-ＭＢＤ２の２つのプラスミドによって一過性トランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて、細胞が、脂肪細胞完全培地（ＳｔｅｍＰｒｏ-４３）と胚幹細胞培地（ｍＴｅＳＲ１）の５０：５０を加えた懸濁液中、６-ウェルプレ-トで培養された。培養２日後に、細胞が上記の同じプラスミドで再トランスフェクトされて、チアゾビビン（０．５μＭ）、ＡＬＫ-５阻害剤（ＳＢ ３４１５４２、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）、及びＭＥＫの阻害剤（ＰＤ０３２５９０１、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０．５μＭ）で補充されたＴｅｓＲ完全培地の存在中で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコ-ティングされた９６-ウェルに播種された。培地が毎日交換されて、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて２２日間、細胞が培養された。アルカリフォスファタ-ゼ検出キット（ＡＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び免疫組織化学法が実施され、多分化能マ-カ-の発現が解析された。ＡＰ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、ＡＬＰ染色が実施された。
トランスフェクション後６日目から開始し、その後５日後毎に、ＳＳＥＡ-４６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＴＲＡ-８１５５５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に関する生細胞染色を使用して、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓによって、再プログラムされた細胞の目視観察が行われた。ＳＳＥＡ-４及びＴＲＡ１-８１によって陽性染色されたＰＬＳＣｓの再プログラムされたコロニ-が、プラスミドｐＣＭＶ-Ｓａｌｌ４-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-Ｎａｎｏｇ、ｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰ、ｐＣＭＶ-Ｓｏｘ２ｎｕｃ-ＩＲＥＣ-Ｌｉｎ２８を伴うｐＥＦ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-ＭＢＤ２、及びｐＣＭＶ-Ｋｌｆ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｔｐｔ１ｎｕｃを伴うｐＥＦ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-ＭＢＤ２でのみ観察された。これらコロニ-は、６日目周辺で出現し、研究期間（２２日）の最終日に至るまで、安定な形態を備えて培地中で維持された。上記で挙げられたプラスミドの中で、ｐＣＭＶ-Ｓａｌｌ４-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-ＮａｎｏｇとｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰがコロニ-の最高数を生じた。生細胞染色は、これらコロニ-が、ＳＳＥＡ-４及びＴＲＡ１-８１を含む典型的な多分化能マ-カ-を発現することを示し、これらコロニ-の更なる解析では、アルカリフォスファタ-ゼ及びＯｃｔ４のような他のＥＳＣマ-カ-もまた発現することを示した（図１６）。培養物がＰＤ０３２５９０１及びＳＢ４３１５２で２２日まで処理された場合、ｐＣＭＶ-Ｓａｌｌ４-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-Ｎａｎｏｇ及びｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰによるＡＤＳＣｓのトランスフェクション後に、従来法を超える効率で４倍の改善が観測された。
先の研究に基づいて、ｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰ及びｐＣＭＶ-Ｓａｌｌ４-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４-２Ａ-Ｎａｎｏｇを使用して、最高の再プログラミング効率が得られた。ｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰの再プログラミング効率に及ぼす効果を確認するため並びに異なる組み合わせ中の個々の多分化能遺伝子Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ４及びＫｌｆ４の効果を検討するために、別の研究がデザインされた。ＡＤＳＣｓが、上記のように、ｐＥＦ-Ｒｅｘ１-ＥＦ-Ｏｃｔ４-２Ａ-ｋｌｆ４-２Ａ-ＲＦＰ、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｒｅｘ１、ｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｏｃｔ４／ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｋｌｆ４、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｒｅｘ１／ｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｏｃｔ４、又はｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｒｅｘ１／ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｋｌｆ４でトランスフェクトされた。第２のトランスフェクション後、ＳＢ３４１５４２及びＰＤ０．３２５９０１で補充されたｍＴｅＳＲ１培地の存在中、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて、２４日間、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコ-ティングされた９６-ウェルプレ-ト中で、ＡＤＳＣが培養された。トランスフェクション後の細胞の亜集団を特性評価するために、生細胞染色、免疫組織化学、及びＡＰ染色を用いて、多分可能マ-カ-での変化を追跡した。Ｒｅｘ１／Ｏｃｔ４又はＲｅｘ１／Ｋｌｆ４でトランスフェクトされた全細胞の１５％が、ＳＳＥＡ４＋及びＴＲＡ-１-８１＋表現型を示し、このパタ-ンは研究期間の最終（２２日）まで安定であった。経時的な観測では、これらコロニ-の表現型が、２２日まで、初期ＳＳＥＡ-４＋表現型から後期Ｏｃｔ４＋／Ｓｏｘ２／Ｎａｎｏｇ＋表現型まで移動し、これは多分化能様幹細胞の最終的な再プログラムされた状態により近いことが示された（図１７）。
多分化能様細胞へと向かう再プログラミング効率へ及ぼす影響が、種々の遺伝子で試験された。ＳｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ培地中で、２日目のＶＰＡ及び５-ＡＺＡ前処理（それぞれ１ｍＭと０．５μＭ）が加えられて、実施例ＩＸに記載されたように、ＡＤＳＣ細胞が培養された。実施例ＩＶに記載された手順に従って、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６-ウェル Ｓｈｕｔｔｌｅ装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、並びに表３４中に記載されたＤＮＡ混合物を伴うトランスフェクションプログラムＥＷ-１０４を使用して、細胞がトランスフェクトされた。トランスフェクション後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコ-ティングされた２４ウェルプレ-ト上、実施例ＩＸに記載されたＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ培地中に細胞が播種され、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて１日間インキュベ-トされ、７５％ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣと２５％ｈＥＳ細胞培地の混合物に培地が交換され、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣのパ-センテ-ジが毎日４日間にわたって減少されて、４日目までに１００％ｈＥＳ細胞培地となるよう調節された。この時以降、培地が２日毎に交換された。ｈＥＳ細胞培地は、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭｎｏＧｌｕｔａＭａｘ、１００μＭの非必須アミノ酸類、１００μＭのβ-メルカプトエタノ-ル、及び１０ｎｇ／ｍｌＦｇｆ-２が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成された。異なる阻害剤及び成長因子が実験のコ-スを経て添加され、これらは表３４に表示されている。７日目と１４日目に細胞が免疫組織化学解析され、並びに７日目にはＲＴ-ＰＣＲによって細胞が解析された。
表３４：プラスミド及び１日〜１４日の培地構成成分
Figure 2018183152
Figure 2018183152
トランスフェクション後の細胞の亜集団を特性評価するために、生細胞染色、免疫組織化学法、及びAP染色が実施され、多分可能マ-カ-での変化が追跡された。Ｏｃｔ４／ＵＴＦ１／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／Ｄｐｐａ４／ＭＢＤ２、ＦｏｘＤ３／Ｄｐｐａ４／ＭＢＤ２、Ｏｃｔ４／ＦｏｘＤ３／Ｄｐｐａ４、又はＳｏｘ２／ＦｏｘＤ３／ＵＴＦ１のいずれかでトランスフェクトされた細胞は、ＴＲＡ１-６０、ＴＲＡ１-８１、及びＳＳＥＡ４に対して陽性のコロニ-を示した。この観測は、Ｏｃｔ４／ＦｏｘＤ３／ＭＢＤ２トランスフェクションを除いては、ＭＢＤ２が多分化能様細胞へと向かう再プログラミングへ及ぼすそれ自体による効果を一般的に有さないことを示唆した。コロニ-は７日目から形成を開始し、１４日目まで（図１８）（研究の最終日）形成を続けた。これらコロニ-は、同様にＡＰに関しても陽性であった。
これらの結果は、表３５中に示されたＯｃｔ４発現のアップレギュレ-ションを示しているＲＴ-ＰＣＲによっても確認された。ＳＯＸ２の相対的発現はまた、Ｏｃｔ４／Ｆｏｘｄ３／ＭＢＤ２によって細胞をトランスフェクトした後、７日で僅かにアップレギュレ-トされた。更にＯＣＴ４／Ｓｏｘ２／Ｆｏｘｄ３及びＯｃｔ４／Ｆｏｘｄ３／Ｕｔｆ１によるトランスフェクション後に、Ｓｏｘ２アップレギュレ-ションの傾向が存在する。
Figure 2018183152
 三重トランスフェクション（３日毎に１つのトランスフェクション）後のＨＦＦに及ぼす定義された多分化能因子の再プログラミング効率
ＶＰＡ及び５-ＡＺＡの濃度がそれぞれ２ｍＭ及び２．５μＭである以外は実施例Ｉに記載されたように、ＨＦＦ細胞が培養された。ＤＮＡ分量がそれぞれの３プラスミドＤＮＡの１μｇが使用されたことを除いては、実施例ＩＩに記載されたような手順に従って、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、細胞がトランスフェクトされた。細胞は、ＶＰＡ及び５-Ａｚａで前処理されていて、処理細胞と未処理細胞の双方が、ｐＣＭＶ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｓｏｘ２ｎｕｃ、ｐＣＭＶ-Ｋｌｆ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｃｍｙｃｎｕｃ又はｐＣＭＶ-Ｎａｎｏｇｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-Ｌｉｎ２８の混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクションに続いて、ＶＰＡ及び５-ＡＺＡで補充された又は補充されていない実施例Ｉに記載された繊維芽細胞培地中、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコ-ティングされた６-ウェルプレ-トに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベ-トされた。１日目及び２日目に、ＶＰＡ及び５-ＡＺＡを補充された又は補充されていない１００％ｍＴｗＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に交換された。３日目及び６日目に、それぞれの条件からの細胞が、ＴｒｙｐＬＥ中で５分間インキュベ-トすることによって脱着され、計測並びに遠心分離が行われた。細胞が上記のように再トランスフェクトされて、ＶＰＡ及び５-ＡＺＡ有無のｍＴｅＳＲ１培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌコ-ティングプレ-トに播種された。１日〜２日に記載されたように、培地が交換された。潜在能力を持つ再プログラムされた細胞の生存及びクロ-ン増殖を推進するために、Ｙ２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、１０μＭ）が７日〜１４日に補充された。２０日目に、アルカリフォスファタ-ゼ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して並びに免疫組織化学解析によって、細胞が解析された。
この解析では、３つのトランスフェクション後、３つのクロ-ンがアルカリフォスファタ-ゼ活性に対して陽性であることが確認され、丸くなった細胞／コロニ-形態を示すことが認められた。胚幹（ＥＳ）細胞マ-カ-ＳＳＥＡ-４及びＴＲＡ-１-８１に対する抗体による染色では、これらのクロ-ンが多分化能様であることが確認された（図１９）。ＨＦＦ細胞の周囲は、これらのマ-カ-に対して陰性であった。これらクロ-ンは、阻害剤（すなわち、ＶＰＡ及び５-ＡＺＡ）を含有しないような条件でのみ取得された。予想外に、これら阻害剤で処理された条件に関しては、クロ-ンが全く得られなかった。
多分可能性へのＮＳＬＣｓの再プログラミング
ＮＳＬＣと、ＳＳＥＡ-３、ＳＳＥＡ-４、ＴＲＡ-１-６０、ＴＲＡ-１-８１、及びＯＣＴ-３／４を含むＥＳ細胞の特性を有するマ-カ-を発現するヒトＥＳ細胞系であるＢＧ-０１から誘導されたニュ-ロン幹細胞とが、多分可能性へ再プログラムされた。ＮＳＬＣｓとＢＧ-０１-ＮＳＣが、ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で補充された増殖培地中で培養された。ＮＳＬＣｓ及びＢＧ-０１-ＮＳＣｓが、２つのエピソ-ムベクタ-ｐＥＦ-Ｏｃｔ４ｎｕｃ-ＩＲＥＳ２-ＭＢＤ２（ＮＣ１）又はｐＣＭＶ-ＦｏｘＤ３-２Ａ-Ｏｃｔ４-２Ａ-Ｋｌｆ４（Ｆ７２）によって、実施例ＩＩに先に記載されたようにトランスフェクトされた。トランスフェクション後に、細胞が回収され、３７℃、５％ＣＯ２にての増殖条件中、増殖培地とｍＴｅＳＲ１培地（５０：５０）の存在中で、コ-ティングされていないペトリ皿上にプレ-トされた。４８時間後、細胞が同一のプラスミドで再トランスフェクトされ、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコ-ティングされた９６-ウェルプレ-トへとプレ-トされ、小分子ＢＩＸ０１２９４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）とＢａｙＫ８６４４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）で補充されたｍＴｅＳＲ１の存在中で、３７℃、５％ＣＯ２にて２２日間培養された。生細胞染色及び免疫組織化学法が実施されて、多分可能マ-カ-に対する細胞亜集団の特性評価が行われた。
ＮＳＬＣｓ及びＢＧ-０１-ＮＳＣｓは、７日目から始まり培養２２日目（研究の最終日）まで、ＳＳＥＡ-４で陽性染色された（図２０）。１０日以内に、ＥＳＣｓと形態的に同様な細胞が観測され、それらは、ＳＳＥＡ-４、ＴＲＡ１-８１、Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ４を含む多分可能マ-カ-の広域のパネルを発現した（図２０）。本研究は、神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）を介して、体細胞から多分化能様細胞を得るための別の方法を確認した。
ＮＳＬＣｓの有用性は、多分可能様細胞へと向かう再プログラミングのための多くの利点を提供することができた。例えば、ｃ-Ｍｙｃのような腫瘍発生性遺伝子の必要条件を排除することで、癌性細胞を誘導する危険性を低減する。神経再生的及び神経変性的用途に関しては、これら細胞は、更なるヒト多分化能細胞誘導を検討するための貴重な細胞源を確立し、並びに人の疾患をモデル化するために患者に特異的な多能性及び多分可能性幹細胞を誘導するための潜在的能力を有する細胞源も確立する。
実施例ＸＸ
ＳＣＩＤマウスにおける奇形腫アッセイ
ヒト多分化能幹細胞（ＳＣ）の「重度複合免疫不全」（ＳＣＩＤ）マウスへの移植は、多分可能幹細胞のための全ての三胚葉細胞層を含む分化した腫瘍、類似する自発的ヒト奇形腫、並びに多分化能幹細胞のための特異化した腫瘍の形成へと導く。これらのアッセイは、多分可能幹細胞の分化潜在能力を立証するための文献の標準と考えられ、治療への応用として意図されたＳＣ由来細胞群の中で安全性を評価するための標準として必要である。
実験のための全ての適切な動物許可を取得した後に、２４匹のマウスがＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓから入手され、新しい環境に適合させるために、いかなる実験もなく、ＭＩＳＰＲＯ動物施設にて１週間飼育された。１００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウム及びマグネシウムフリ-）（ＣＭＦ-ＰＢＳ）中で、百万個のヒトＮＳＬＣｓ、正常なヒト神経プロジェニタ-細胞（ｈＮＰＣｓ）、又はヒト胚幹（ＥＳ）細胞が、２１-Ｇ針を使用して、ケタミン／キシラジンによる麻酔下で、生後４週間のオスＳＣＩＤ-ベ-ジュ色のマウスの右後肢に筋肉内注射された（各グル-プ８匹のマウス）。注射に続いて、培地を含む培養皿中で注射器を２、３度上下に吸引して、細胞が注入され、注射器の内側に詰まっていないことを確認した。
マウスが１２週間維持され、臨床的徴候及びいずれかの腫瘍成長を定期的に監視された。いかなる特異化された組織又は奇形腫の成長、並びに左後肢の同じ筋肉に対する筋肉の寸法も外部検査によって監視された。特異化組織又は奇形腫が同定された場合は、成長の位置及び寸法が測定され（測定用ノギスを用いて）記録された。特異化組織又は奇形腫は、左の対照筋肉と比較して筋肉サイズの僅かな成長として、通常最初に同定される。いずれかの腫瘍成長の発症まで、動物が毎週監視され、腫瘍の出現後は、毎日監視された。１２週後、ＣＯ２による安楽死によってマウスが致死された。全動物が、体内のいずれかに腫瘍の成長があるかが観察されて、注射された筋肉と比較用の左筋肉対照が測定されて（測定用ノギスを使用して）（以下の表を参照）、次いで切除し、組織学的解析のために、４％パラホルムアルデヒド溶液中で保存した。筋肉の寸法は以下のとおりである。
Figure 2018183152
筋肉の寸法の測定は、全てのヒト胚幹細胞が注入投与された筋肉の寸法が、比較用左筋肉対照よりも大きく、これはＥＳ細胞が注入投与された筋肉内にての奇形腫の成長を示唆している。全てのヒト神経プロジェニタ-細胞投与筋肉の約半分が、左筋肉対照よりも大きかったが、一方ＮＳＬＣを注入投与されたマウスでは、両筋肉（細胞で処置又は未処置）の間で差異を示さなかった。ＮＳＬＣが注入投与されたマウスでは、腫瘍又は奇形腫成長のいかなる証拠も示さなかった。
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本明細書に含まれる見出しは参照のためのものであり、特定のセクションの位置決めを提供するためのものである。これらの見出しは、本明細書に記載されたコンセプトの範囲を制限するよう意図されておらず、並びにこれらコンセプトは、本明細書全体にわたって、他のセクションでの適用性を有し得る。したがって、本発明は、本明細書に記載された実施形態に制限されるよう意図されたものではなく、本明細書で開示された原理及び新規特徴と矛盾しないより広範囲なものと捉えるべきである。
本発明に記載された実施例及び実施形態は、単に例示的目的であって、種々の変更または見解の変化が当業者に提案されるものであり、それらは本発明の範囲内および添付された特許請求の範囲内に包含されるものであると理解されるであろう。

Claims (1)

  1. 第１の型の細胞を異なる型の所望の細胞へと形質転換する方法であって、
    ｉ）第１の型の細胞を提供することと、
    ｉｉ）前記第１の型の細胞中で、少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを一過性的に増加させて、これによって前記一過性増加が少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導させることと、
    ｉｉｉ）前記細胞を、前記所望の細胞の形質転換を支援するための条件中に配置させて、並びに前記再プログラミング剤の不在下において前記少なくとも１つの遺伝子調節因子を安定して発現させるために十分な期間時間で、前記少なくとも１つの再プログラミング剤の細胞内レベルを維持することと、
    ｉｖ）その発現が前記所望の細胞の表現型的及び／又は機能的特徴の特性を有するような複数個の第２の遺伝子を安定して発現させるのに十分な期間時間で、前記所望の細胞の形質転換を支援する培養条件中で前記細胞を維持することであって、前記第２の遺伝子の少なくとも１つが、胚幹細胞の表現型的及び機能的特徴の特性を有さず、これによって前記期間時間の最終にて、前記第１の型の細胞が前記異なる型の所望の細胞へ形質転換される、維持することと、
    を含む方法。
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