CN105154395A - 一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，适用于骨髓、脂肪、脐带来源的间充质干细胞培养。本发明采用无血清完全培养基进行脐带组织来源的间充质干细胞的培养，应用二次接种的方法对传统方法进行了改进，提高了原代细胞的获得率；同时本发明应用咪唑喹啉R848？1～5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b？100～200U/mL作为预处理因子，明显地诱导了MSCs高表达和分泌细胞因子VEGF，HGF和PGE-2，使其更好地发挥其免疫调节和促进组织再生的能力，可明显地提高MSCs的增殖能力和抵抗NK细胞杀伤的能力，同时预处理后的MSCs具有增强的抑制淋巴细胞增殖的能力，更好地应用于以T细胞为主的GVHD和其他自身免疫性疾病的治疗。

Description

一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞的应用领域，具体为一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法。

背景技术

间充质干细胞：间充质干细胞(mesenehymalstemcell，MSC)是来源于早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在不同的诱导条件下，可分化为造血细胞以外的多种组织细胞，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和星形胶质细胞等。近年研究表明，MSC除支持体外造血、促进体内造血重建外，还具有抑制同种异体免疫反应，降低移植物抗宿主病(GVHD)的作用。

人脐带间充质干细胞(hUCMSC)：人脐带连接于母体和胎儿之间，妊娠期间为胎儿提供营养，由三部分构成：羊膜被覆上皮、脐血管和位于两者之间被称为华通氏胶(Wharton’SJelly)的黏液结缔组织。华通氏胶对脐血管起支撑和保护作用华通氏胶中存在着一种成纤维样细胞，该细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能，被称为人脐带间充质于细胞(hUCMSC)。

Toll样受体(TLRs)：在机体的先天性免疫和获得性免疫中作为重要的调节器对病原体的识别发挥着非常重要的作用。TLRs作为一类病原模式识别受体,TLRs信号失调会引起多种疾病。TLRs存在于多数骨髓细胞(如巨噬细胞、树状突细胞、中性细胞、T细胞、B细胞)及非骨髓细胞(如上皮细胞和纤维细胞)中,迄今为止已发现有10种人TLRs(TLR1～10)。

混合淋巴细胞培养(MLC)：常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。

免疫调节：是指免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间，以及与其它系统如神经内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答以最恰当的形式维持在最适当的水平。免疫调节配合好可以识别和清除抗原，对自身成分产生免疫耐受，维持内环境的稳定。配合差会导致病原微生物感染、肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷病、超敏反应。

干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。其中间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在体外可以分化诱导为骨、脂肪、神经等多种组织细胞，具有向受损组织归巢并且修复、重建受损或病变组织器官的特点。此外，MSCs还具备免疫原性低、移植成活率高、细胞治疗效果好等特点，因此成为当前干细胞研究的热点。

根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会制定的最低标准,MSCs需满足以下条件:1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长；2)MSCs表达CD105,CD73和CD90,不表达CD45,CD34,CD14或CD11b,CD79a或CD19和HLA-DR；3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。

目前临床应用MSCs的主要来源为骨髓、脐带血，但成人骨髓中MSCs数量较少，病毒感染率高，免疫原性强，且取材较复杂，限制其应用。近年研究显示，人脐带中存在大量的MSCs，与其他来源相比，脐带间充质干细胞(hUCMSC)更加易于获得，对母子均无损伤，且冻存和复苏后细胞的生物学性状无明显变化，使其成为细胞治疗中的理想细胞而逐渐替代骨髓来源MSCs。

MSCs除具有支持体外造血、促进体内造血重建、组织损伤修复外，还具有独特的免疫调节作用，而其调节作用又以T细胞为主，在混合淋巴细胞反应中，通过周期阻滞抑制T细胞增殖，但不引起T细胞凋亡增加、活化受抑。同时MSCs还能降低反应体系中的CD8T细胞和Thl细胞，由Th1极化状态向Th2漂移，升高Th2细胞，其分泌的IL-4,IL-10等细胞因子含量明显增加，从而抑制炎症反应，在T细胞介导的自身免疫性疾病中发挥治疗作用。

实验表明，MSCs在体外可抑制T细胞分泌IFN-γ，促进IL-l0的分泌，Treg细胞比例增加；NK细胞IFN-γ分泌减少。这一切表明，MSC存在于炎症环境中，通过改变DC1、DC2、Thl、Th2或Treg等分泌细胞因子调节免疫反应，最终使炎症环境向抗炎性环境转变。

免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但是，免疫抑制剂的副作用严重，包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等。MSCs的免疫调节及免疫逃避等功能，被广泛地用来治疗由于器官移植造成的移植物抗宿主病(GVHD)和自身免疫性疾病。在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病初期，经静脉输注MSCs可诱导外周淋巴器官对T细胞耐受而改善病情。用Ⅱ型胶原免疫接种小鼠的同时，经腹腔内注入同种异体MSCs能有效避免小鼠关节内骨与软骨的破坏；在造模成功小鼠已经出现类风湿关节炎症状之后，再输注MSCs同样能阻止关节的严重破坏。此外，向多发性硬化患者体内输注hUCMSC，可控制病情。

这些研究说明，hUCMSC在体内、外对T淋巴细胞具有负调节作用，兼有免疫抑制能力及诱导免疫耐受的特性，MSCs有可能作为治疗GVHD和自身免疫性疾病的新方法。因此，寻找一种能有效增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备的方法，是更好地发挥MSCs疗效的关键。

现有技术中MSCs的制备方法为：

(1)、将采集的脐带消毒后，用PBS洗去残留的血液，分离并去除血管组织，剪碎脐带组织至1-3mm³大小，放入T75培养瓶底部，间隔0.5-1.0cm。将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，于第二天添加完全培养基，含有10％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代。此为P0代细胞；

(2)、细胞传代

应用0.25％胰蛋白酶消化5-10min，待细胞和残余组织块悬浮后，用2倍体积的完全培养基终止消化。以1500rpm/min离心10min，弃去上清。用完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养。此为P1代细胞。

(3)、待P1代细胞到达80-90％融合度时，按照上述方法进行消化传代，命名为P2代细胞，以此类推。

(4)、选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定。

(5)、选取P4或者P5代细胞进行治疗。

现有技术存在的缺点：

现有技术使用含有胎牛血清的培养基，人体可能会产生针对异种蛋白的过敏反应；应用组织块培养方法，在进行第一次消化传代时，残余的组织块被废弃，损失了大量的间充质细胞，造成产量的降低；通过现有技术中产生的MSCs，虽然具有一定免疫调节能力，但是调节能力受限，需要大量输注才能满足临床治疗的需要。而大量外源性异体细胞的输注会造成明显的生物制品输注反应，因此细胞输注数量受限，降低MSCs的免疫调节疗效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中使用含有胎牛血清的培养基，应用组织块培养的方法造成产量低、免疫调节能力有限的缺陷，提供一种增强MSC免疫调节功能的临床级别细胞制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，包括以下几个步骤：

一、脐带采集和间充质干细胞分离培养

(1)、取正常足月产健康新生儿脐带10～15cm，立即放入加有10～20％质量分数的双抗溶液的DMEM培养基中；脐带需要在在8-12h内处理完毕；

(2)、超净台内取出脐带，用75％酒精消毒脐带表面，用生理盐水充分洗涤残留的血液；将脐带剪成1～2cm小段，再次漂洗；剖开脐带，提出脐静脉和脐动脉，将剩余的华通氏胶脐带组织剪成1～2mm³大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0.5～1.0cm，将培养瓶置于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育；

(3)、第二天添加无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；优选的，无血清培养基中含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子；

(4)、细胞传代

应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化融合度为80～90％的P0代细胞5～10min，待细胞和残余组织块悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以100μm的滤器过滤细胞，收集滤液，以1500rpm/min离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P1代细胞；

优选的，收集过滤后残余的组织块，移入新的培养皿，间隔1-5mm种植，待其贴壁后加入无血清完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，换液；待细胞达到一定密度后传代；二次接种法培养；二次接种法培养，增加了P0原代细胞获得率。

(5)、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化5～10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以1500rpm/min离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P2代细胞；按照此种方法，将MSCs连续传代；

(6)选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定；

二、MSCs的预处理

选取P3代细胞，对MSCs进行预处理，在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉R8481～5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b100～200U/mL，继续培养24-72小时；处理后进行继续传代或者用作治疗。

优选的，在预处理时中先将P3代细胞的细胞的浓度调整为2×10⁵/mL～1-2×10⁴/mL。

优选的，所述的无血清完全培养基采用病原灭活的血小板裂解液PL制备得到。

本发明的增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，适用于骨髓、脂肪、脐带来源的间充质干细胞培养，与现有技术相比，具有以下的有益效果：

一、本发明采用临床级别的无血清完全培养基进行脐带组织来源的间充质干细胞的培养，添加的预处理细胞因子均为临床级别的药物，因此可安全用于临床治疗，应用脐带组织二次接种的方法对传统方法进行了改进，提高了原代细胞的获得率，节约了原材料成本，也降低了时间和人员的占有率；同时，建立了同一配型供者来源的大量原代种子细胞库，保证临床治疗的细胞数量；

二、本发明中应用咪唑喹啉R8481～5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b100～200U/mL作为预处理因子，明显地诱导了MSCs高表达和分泌细胞因子VEGF，HGF和PGE-2，使其更好地发挥其免疫调节和促进组织再生的能力，可明显地提高MSCs的增殖能力和抵抗NK细胞杀伤的能力，同时预处理后的MSCs具有增强的抑制淋巴细胞增殖的能力，更好地应用于以T细胞为主的GVHD和其他自身免疫性疾病的治疗。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是脐带间充质干细胞分离图例；

图2是脐带间充质原代细胞获得率；

图3是流式细胞仪检测间充质干细胞的表面标志；

图4是间充质干细胞的多向分化；

图5是预处理对MSCs细胞表型的影响；

图6是预处理对MSCs细胞增殖的影响；

图7是预处理对MSCs抵抗NK细胞杀伤作用的影响；

图8预处理对MSCs细胞因子分泌的影响；

图9是预处理对MSCs抑制淋巴细胞增殖能力的影响。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，包括以下几个步骤：

一、脐带采集和间充质干细胞分离培养

(1)、取正常足月产健康新生儿脐带10～15cm，立即放入加有10～20％质量分数的双抗溶液的DMEM培养基中；脐带需要在在8-12h内处理完毕；

(2)、超净台内取出脐带，用75％酒精消毒脐带表面，用生理盐水充分洗涤残留的血液；将脐带剪成1～2cm小段，再次漂洗；剖开脐带，提出脐静脉和脐动脉，将剩余的华通氏胶脐带组织剪成1～2mm³大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0.5～1.0cm，将培养瓶置于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育；图1为脐带间充质干细胞分离图例，由图1可知，MSC细胞密度低时成扁平单层细胞，细胞密度高时趋于融合，细胞变细长，类似成纤维细胞，呈平行或者漩涡状生长。

(3)、第二天添加无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；优选的，无血清培养基中含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子；

(4)、细胞传代

应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化融合度为80～90％的P0代细胞5～10min，待细胞和残余组织块悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以100μm的滤器过滤细胞，收集滤液，以1500rpm/min离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P1代细胞；

收集过滤后残余的组织块，移入新的培养皿，间隔1-5mm种植，待其贴壁后加入无血清完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，换液；待细胞达到一定密度后传代；二次接种法培养；二次接种法培养，增加了P0原代细胞获得率。图2是脐带间充质原代细胞获得率，由图2可见，二次组织块接种后可明显增加原代细胞获得量。

(5)、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化5～10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以1500rpm/min离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P2代细胞；按照此种方法，将MSCs连续传代；

(6)选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定；图3是流式细胞仪检测间充质干细胞的表面标志。由图3可见，分离培养的间充质干细胞高表达CD73，CD90，和CD105，不表达造血细胞的标志，具有较低的免疫原性(低表达HLA-DR)。图4是间充质干细胞的多向分化，由图4可知培养的间充质干细胞具有多向分化的潜能，符合对间充质干细胞的定义。

二、间充质干细胞的预处理及其对细胞本身的影响

(1)、预处理对MSCs细胞表型的影响

选取P3代细胞，预处理组在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉(Imiquimod)R8481-5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b100-200U/mL，继续培养72小时。应用胰蛋白酶消化MSCs，收集未处理和处理的细胞，用PBS充分洗涤二次。调整细胞浓度为1×10⁶/mL，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD73，CD90，CD105和HLA-ABC，HLA-DR各10μl，充分混匀，室温下30min，洗涤后应用流式细胞仪进行检测，分析MFI的表达强度。图5是预处理对MSCs细胞表型的影响，由图5可知：预处理方案不影响MSCs的细胞表面标志表达，仍符合MSCs的鉴定标准。

(2)、预处理对MSCs细胞增殖的影响

选取P3代细胞，调整MSCs细胞浓度至1-2×10⁴/mL加入96孔板，每孔200μl。预处理组在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉(Imiquimod)R8481-5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b100-200U/mL，继续培养24-72小时。培养结束后，每孔加入20μlMTT(5g/L)，37℃放置4h，然后每孔加入150μlDMSO,振荡10min，用酶标仪测定各孔吸光光度值(OD值，490nm)，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线。图6是预处理对MSCs细胞增殖的影响，由图6可知预处理可以明显促进MSCs的增殖，表现为随着时间的延长，其增殖能力成对数上升。

(3)、预处理对MSCs细胞周期的影响

选取P3代细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/mL，接种于T25培养瓶中，37℃,5％体积浓度的CO2条件下孵育24h。预处理组在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉(Imiquimod)R848(1-5μg/mL)和重组人干扰素IFN-α-2b(100-200U/mL)，继续培养72小时后收集细胞，离心去上清，70％乙醇固定后，加入500μl含50μg/mL碘化丙啶(PI)，100μg/mLRNaseA，避光孵育，流式细胞仪检测细胞周期。表1是预处理对MSCs细胞周期的影响。

由表1可见，预处理后的MSCs在S期和G2/M期细胞比例增加，说明预处理促进更多的MSCs进入S和G2/M期，即DNA合成、分裂期，从而产生大量的增殖细胞。

表1预处理对MSCs细胞周期的影响

(4)、预处理对MSCs抵抗NK细胞杀伤作用的影响

选取P3代细胞，预处理组在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉(Imiquimod)R848(1-5μg/mL)和重组人干扰素IFN-α-2b(100-200U/mL)，继续培养72小时。纯化的外周血来源的NK细胞在体外培养48h，应用IL-2使其达到活化状态。收集未处理和处理的MSCs，用PBS充分洗涤二次。按照效靶比30:1(NK/MSCs)混合两种细胞，采用CCK8试剂盒进行细胞杀伤的检测。图7显示了预处理对MSCs抵抗NK细胞杀伤作用的影响。由图7可知，预处理后的MSCs增强了抵抗NK细胞杀伤作用的能力，表现为较低的死亡率，从而保证在机体内较长的存留时间。

三、间充质干细胞的预处理对细胞免疫调节功能的影响

(5)、预处理对MSCs细胞因子分泌的影响

选取P3代细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/mL，接种于6孔板上，37℃,5％体积浓度的CO2条件下孵育24h，预处理组在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉(Imiquimod)R848(1-5μg/mL)和重组人干扰素IFN-α-2b(100-200U/mL)，继续培养72小时。收集培养上清液，离心后应用酶联免疫分析的方法(ELISA试剂盒)检测细胞因子VEGF，HGF和PGE-2的表达。图8是预处理对MSCs细胞因子分泌的影响，由图8的ELISA检测结果显示，和未处理的MSCs相比，预处理能够有效地促进MSCs分泌促进血管新生和组织再生的细胞因子，以及降低炎症反应的抑制性细胞因子。

(6)、预处理对MSCs抑制淋巴细胞增殖能力的影响

选取P3代细胞，预处理组在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉(Imiquimod)R848(1-5μg/mL)和重组人干扰素IFN-α-2b(100-200U/mL)，收集细胞后洗涤计数，以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔板，孵育30min后加入分离的T细胞(MSCs:T细胞比为1:100)，建立混合淋巴细胞培养体系(MLC)，加入20μg/mL的PHA。将细胞置于37℃,5％CO2条件下孵育6天。应用BrdU方法测定淋巴细胞增殖情况。图9是预处理对MSCs抑制淋巴细胞增殖能力的影响。图9中可明显观察到，预处理后的MSCs具有更强的抑制淋巴细胞增殖的能力，表现为在MLC中，淋巴细胞增殖明显受到抑制。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

一、脐带采集和间充质干细胞分离培养

(1)、取正常足月产健康新生儿脐带10～15cm，立即放入加有10～20％质量分数的双抗溶液的DMEM培养基中；

(2)、超净台内取出脐带，用75％酒精消毒脐带表面，用生理盐水充分洗涤残留的血液；将脐带剪成1～2cm小段，再次漂洗；剖开脐带，提出脐静脉和脐动脉，将剩余的华通氏胶脐带组织剪成1～2mm³大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0.5～1.0cm，将培养瓶置于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育；

(3)、第二天添加无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；

(4)、细胞传代

应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化融合度为80～90％的P0代细胞5～10min，待细胞和残余组织块悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以100μm的滤器过滤细胞，收集滤液，以1500rpm/min离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P1代细胞；

(5)、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化5～10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以1500rpm/min离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P2代细胞；按照此种方法，将MSCs连续传代；

(6)选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定；

二、MSCs的预处理

选取P3代细胞，在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉R8481～5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b100～200U/mL，继续培养24-72小时；处理后进行继续传代或者用作治疗。

2.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一的(1)中的脐带需要在在8-12h内处理完毕。

3.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一的步骤(2)中的无血清培养基中含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。

4.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一的步骤(2)中收集过滤后残余的组织块，移入新的培养皿，间隔1-5mm种植，待其贴壁后加入无血清完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，换液；待细胞达到一定密度后传代；二次接种法培养。

5.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤二中先将P3代细胞的细胞的浓度调整为2×10⁵/mL～1-2×10⁴/mL。

6.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述的无血清完全培养基含有病原灭活的血小板裂解液PL。