CN113583948A - Cd200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种CD200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基。该培养基为添加如下成分的DMEM/F12培养基：8v/v％～12v/v％FBS、FGF 8ng/ml～12ng/ml、BDNF 10ng/ml～30ng/ml以及NT3 10ng/ml～30ng/ml。利用该培养基对CD200⁺亚群脐带间充质干细胞进行培养能够大大加快脊髓损伤的修复。

Description

CD200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种CD200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基。

背景技术

“脊髓损伤”(Spinal Cord Injury)一词是指由创伤(如撞车)、疾病或退化(如癌症)造成的脊髓损坏。目前没有关于全球患病率的可靠估计，但大多是由创伤造成，尽管非创伤性脊髓损伤的比例呈现上升趋势。脊髓损伤的症状取决于损伤的严重程度和受损脊髓的位置。症状可能包括胳膊、腿和/或身体的感觉功能或运动控制部分或完全丧失。最严重的脊髓损伤会影响调节尿便控制、呼吸、心率和血压的身体系统。大多数脊髓损伤者会经历慢性疼痛，脊髓损伤有引发继发性疾病的危险，这些疾病——如深静脉血栓、尿道感染、肌肉痉挛、骨质疏松、褥疮、慢性疼痛和呼吸道并发症，可能导致衰弱，甚至危及生命。急救护理、康复服务和持续的健康维护对预防和管理这些疾病至关重要。其后果是终身性和毁灭性的，不仅给病人造成极大的痛苦，也给家庭和社会带来沉重的负担。

目前针对脊髓损伤的治疗手段主要包括手术、药物、物理、基因以及细胞移植等多种治疗方法。外源性干细胞移植是近几十几年来脊髓损伤治疗的研究热点，简单来说，主要分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(adult stem cells，ASCs)两类，其中ASCs包括来源于胎儿、新生儿以及成年机体组织的干细胞。近些年来，用于脊髓损伤治疗的干细胞主要有胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、神经干细胞(neuralstem cells，NSCs)以及间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等。

MSC是一种多能干细胞，在胎儿附属物如羊膜、羊水、脐带及脐血中亦发现有丰富的MSCs，它们可以称为介于成体干细胞和胚胎干细胞之间的类型，可能具有更低的免疫原性、更高的增殖能力以及来源更方便等独特的优越性。其中脐带来源的MSCs更丰富，一根脐带可制备相当于约5000毫升骨髓来源的间充质干细胞。故而，深入研究脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的作用并探讨其机制具有重要的意义。

现有技术曾有报道CD200⁺亚群脐带间充质干细胞具有抑制免疫排斥反应的作用，但其功能单一，促进脊髓损伤修复的能力并不强。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其为添加如下成分的DMEM/F12培养基：

8v/v％～12v/v％FBS、FGF 8ng/ml～12ng/ml、BDNF 10ng/ml～30ng/ml以及NT310ng/ml～30ng/ml。

可选的，如上所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其为添加如下成分的DMEM/F12培养基：

9v/v％～11v/v％FBS、FGF 9ng/ml～11ng/ml、BDNF 15ng/ml～25ng/ml以及NT315ng/ml～25ng/ml。

可选的，如上所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其为添加如下成分的DMEM/F12培养基：

10v/v％FBS、FGF 9ng/ml～11ng/ml、BDNF 15ng/ml～25ng/ml以及NT3 15ng/ml～25ng/ml。

可选的，如上所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，所述培养基还包括：

青霉素80U/ml～120U/ml和链霉素80U/ml～120U/ml。

可选的，如上所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，所述培养基还包括：

青霉素90U/ml～110U/ml和链霉素90U/ml～110U/ml。

本发明的第二方面涉及一种CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养方法，其包括：

将纯化得到的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞于如上所述的培养基中培养至少7天；优选7～15天，例如8、9、10、11、12、13、14天。

可选的，如上所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养方法，所述纯化的方法为流式细胞法分选或者通过磁珠分选。

可选的，如上所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养方法，当细胞融合度≥80％的时候更换新鲜的培养基。

本发明的第三方面涉及如上所述方法培养得到的细胞。

本发明的第四方面涉及药物组合物，其包括如上所述的细胞以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及一种治疗脊髓损伤的方法，包括将如上有效量的如上所述的药物组合物移植到受试者体内。

本发明中所述的术语“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明中所述疾病或病症的剂量。

本发明中所述的术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明中药组合物和提取物以治疗、预防、减轻和/或缓解本申请所述疾病、病症、症状的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

在一些实施方式中，所述药物组合物中的细胞分离自所述受试者。

目前，现有技术中对于CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的研究还非常少，本发明首次发现，经过常规浓度的FGF，并额外配合BDNF和NT3协同诱导培养后，CD200⁺亚群脐带间充质干细胞具有明显的抑制IFN-γ，TNF-α的作用，进而有效控制了继发性的脊髓损伤。此外，诱导培养后CD200⁺亚群脐带间充质干细胞虽然无法分化为神经细胞，但能够持续分泌近2个月的神经营养因子，从而有效促进了急性机械损伤时脊髓神经细胞的恢复，总体上大大加快了脊髓损伤的修复，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中经过诱导培养后的细胞形态光镜图；

图2为本发明一个实施例中ELISA方法检测诱导后hUCMSC分泌神经营养因子；*p＜0.05，**p＜0.01，vsGroup 1；

图3为本发明一个实施例中细胞移植后受损脊髓部位的炎症因子表达变化；*p＜0.05，**p＜0.01，vsVehicle；#p＜0.05，vsGroup 1。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

一、CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的制备

1.种子细胞的培养

本实验样品细胞采用从hUCMSC培养分离出的第4代细胞(中国广东省脐带血造血干细胞库)。除去原培养基后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞1～2次，除去剩余培养基。加入适量DMEM/F12培养基进行培养，观察细胞增殖能力及形态学特征；根据需要传代若干次后进行下一步骤。

2.制备细胞悬液

当细胞培养至接近80％融合时，去除培养基，用含双抗PBS清洗1～3次，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化10min，加入同样体积培养基终止消化，反复吹打、200目筛网过滤，离心半径12cm，1500r/min离心5min，重新用DMEM/F12补充培养基悬浮细胞，将细胞浓度调整为1×10⁸/ml。

3.CD200⁺的分离纯化

将细胞悬液与FITC标记的鼠抗人CD200单抗(Serotec公司，英国)室温孵育30min，温和离心洗去未结合的抗体，加入1ml磁珠分选缓冲液重悬细胞，洗3～6次。加入50μg羊抗鼠IgG免疫磁珠(Dynal公司，挪威)混合，摇床上颠倒旋转室温孵育30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞，将结合了靶细胞的免疫磁珠用1mL磁珠分选缓冲液清洗3～6次。37℃、5％CO₂培养48h，使得细胞与磁珠分离，流式细胞仪检测细胞纯度，CD200⁺hUCMSC阳性率＞85％，分选后胎盘蓝染色细胞活力＞90％进入后续试验步骤，为得到的CD200⁺hUCMSC。将分离得到的CD200⁺hUCMSC接种于DMEM/F12培养基中于6孔板进行培养，培养条件为37℃、5％CO₂，当细胞培养至接近80％融合时进行诱导培养。

二、CD200⁺亚群脐带间充质干细胞诱导培养

细胞一共分为以下几组：

实验组(Group 1)：

培养基为DMEM/F12培养基+10v/v％FBS+FGF10ng/ml+BDNF 20ng/ml+NT3 20ng/ml。

Group 2：

培养基为Neurobasal培养基(含2％B27)+FGF10ng/ml+BDNF 20ng/ml+NT3 20ng/ml。

Group 3：

培养基为DMEM/F12培养基+10v/v％FBS+FGF10ng/ml+NGF40ng/ml。

Group 4：

培养基为DMEM/F12培养基+10v/v％FBS+FGF10ng/ml+BDNF 20ng/ml+NGF 20ng/ml。

Control：

培养基为DMEM/F12培养基。

上述，BDNF、NGF及NT3均为人重组蛋白，BDNF购自PeproTech公司，NT-3和hrNGF-β购自Sigma-Aldrich公司，

以上各组均额外添加青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，于37℃、5％CO₂进行培养，当细胞融合度为80％的时候更换新鲜的培养基，共培养10d。

三、诱导细胞的生化指标检测

1.诱导培养后的细胞仍为间充质干细胞

将实验组诱导培养后的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞进行流式细胞仪检测。检测结果如表1所示，结果表明诱导培养后的hUCMSC高表达CD200、CD73、CD105、CD90，低表达CD14、CD34、CD38、HLA-DR。CD73、CD105是间充质干细胞相关标志，CD90是间充质相关抗原。CD14、CD34、CD45和CD28为造血系细胞表面标记。结果显示，相比Control组，Group 1诱导后CD105和CD73表达量略有下降(p<0.05)，但诱导后细胞的表面标志整体上仍然呈现为间充质干细胞特性。此外，Group2在经过无血清培养基培养后，相比Group1，CD200表型会发生显著退化(p<0.01)，这说明无血清培养基并不适合CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的表达。从细胞形态上看(图1所示)，三组形态均与原代相似，呈成纤维样细胞样，梭形突起生长，排列呈旋涡样结构，表现为hUCMSC形态。

表1流式细胞术检测hUCMSC表型

阴性<5％；++30％～50％；++++80％～95％；+++++>95％。

2.诱导培养后的hUCMSC细胞能够阶段性表达神经营养因子，并且具有抗炎症的作用

现有技术中有报道神经营养因子NGF配合无血清培养基并额外添加B27能够促进hUCMSC分化为神经元，但无血清培养基并不利于CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养，且会缩短hUCMSC细胞传代次数，降低hUCMSC活力。为克服上述问题，本发明对培养基进行改进，以期使CD200⁺亚群脐带间充质干细胞获得更强的脊髓损伤修复能力。

2.1.ELISA表明诱导后的hUCMSC能够分泌神经营养因子

我们用ELISA的方法检测诱导后hUCMSC是否能够分泌神经营养因子。步骤二培养后的各组细胞均转入含有10v/v％FBS的DMEM/F12培养基继续培养。以培养0d、7d、15d、30d及45d作为检测时间点，检测hUCMSC的神经营养因子的分泌能力。检测方法为：

(1)蛋白提取：细胞加TNE蛋白裂解液(TNE:PMSF、NaF、Leupeptin 1:100)，离心后取上清。

(2)蛋白浓度测定(参考BCA试剂盒说明书进行)：

①计算所需BCA的量，按一定比例配好混合液(MA:MB:MC＝25:24:1)，每个加150ul,标准品A-I各加150ul,加样时做复孔。

②因标准品是溶解在0.9％NaCl中，故先将待测样品用0.9％NaCl稀释后上样150ul，待测样品同样需要做复孔。

③用酶标仪震荡5s，使样品混匀，然后放置于37℃培养箱中孵育2h。

④从37℃培养箱中拿出，待冷却后用酶标仪测蛋白的吸光光度值，计算蛋白浓度。

(3)加样：96孔板每孔各加标准品或待测样品100ul，37℃孵育2h。

(4)洗涤：用洗涤液洗4～6次。

(5)抗原抗体反应：每孔加入抗体工作液100ul，37℃孵育1h。

(6)充分洗涤后，加入酶标抗体100ul，37℃孵育30min。

(7)洗掉多余抗体后，每孔中加入底物工作液100ul，37℃孵育15min。

(8)终止反应，并在30min内用酶标仪测定吸光值。

检测结果如图2所示。从结果可以看出，除了Control组外，其他各组均能够分泌BDNF和NGF，并且分泌量随时间而逐渐减少，这说明虽然诱导培养并未诱导hUCMSC形成神经干细胞，但仍使其具有部分神经细胞特性。我们还发现相比Group 3和4两组，Group 1的分泌持续时间最长，说明BDNF+NT3的组合能够显著提高神经营养因子的分泌时间。

四、动物实验表明诱导培养能够增加CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的抗炎症特性并加快脊髓损伤的康复

鉴于之前有报道表明高表达CD200的人胎盘间充质干细胞亚群细胞具备较强的免疫调节能力，能够降低免疫排斥反应。而急性脊髓损伤可导致严重的运动、感觉和括约肌功能障碍。由炎症因子引起的炎症反应在继发性损伤的发生、发展过程中起关键作用。因而发明人进一步验证经过诱导培养后CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的抗炎症特性是否发生变化。

实验方法如下：

1.实验动物

实验动物为250g～280g的SD雄性大鼠，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于23℃的恒温环境中，湿度40％，12/12hr的昼夜节律。鼠粮和水充足供应。

2.大鼠脊髓打击伤模型的建立。

参照Wamil等的方法【Wamil et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998；95(22)：13188-13193】按落体致伤原理建立模型。所用装置由撞杆、外周套管、击锤及外固定架等组成。撞杆头端直径2.3mm，高度10mm，击锤重10g，下落高度1.25cm，落体致伤的冲击力为10×1.25g·cm。室温23℃条件下，动物称重后，用5％水合氯醛(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，固定于大鼠固定架上。沿正中线切开脊髓胸背部皮肤及皮下组织长约4cm，定位T11椎体棘突，钝性分离T11、10、9椎体两旁肌肉，撑开器撑开固定，暴露上述三个椎体，行椎板切开术。将撞杆头端置于T10段脊髓，固定打击外套管，将击锤自1.25cm高度沿外周套管自由落下冲击撞杆，造成T10段脊髓挫伤，术中可见身体向前扑动、甩尾、呼吸暂停表示造模成功。明胶海绵止血，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤，术后自由进食水，分笼饲养。每日膀胱挤尿4～5次，持续1～2w，直到排尿反射恢复。

3.实验分组及细胞移植

脊髓打击伤模型建立成功24h后尾静脉注射步骤二培养后的各组细胞，分为如下几组，每组动物13只。

1)空白对照组(Vehicle)，注射PBS。

2)实验组，注射Group 1、Group 2、Group 3、Group 4组培养的细胞(使用PBS悬浮后注射)；

注射方法为尾静脉注射，分3次注射，每次间隔1小时，每组总注射细胞量均为1×10⁶个细胞。

4.炎症因子检测

在上述步骤2.1中可以看出，在培养第30d时各组差异最为显著，因此为判断诱导培养基对CD200⁺将培养第30d进行疗效评定，随后立即处死动物，并取小鼠T11、10、9椎体附近样品裂解并提取mRNA并进行qRT-PCR检测。检测方法如下：

4.1组织RNA提取

1)准备：EP管、1ml枪头、黄枪头用未高压的DEPC水37°浸泡过夜后高压去除残余的DEPC。

2)样品处理：取新鲜组织，每30mg～50mg组织加入1mlTRNzol-A+用玻璃匀浆器研磨。注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％。

3)研磨液室温放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

4)4℃，14000rpm离心10min,取上清于一新EP管。

5)以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管15秒。室温放置3min。

6)4℃，14000rpm离心10-15min.样品分为黄色的有机相，中间层和上层无色的水相三层。把水相转移至新EP管。加入等体积异丙醇，混匀，-20°放20-30min。

7)4℃，14000rpm离心10min,弃去上清。离心后可在管侧壁或者管底形成胶状沉淀，但有时看不见。

8)1ml Trizol液加入至少1ml预冷的75％乙醇，颠倒混匀洗涤沉淀(乙醇用DEPC水配制)。

9)4℃下14000rpm离心10分钟，小心弃去上清液。

10)然后室温或真空干燥5～10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃～60℃水溶10分钟。

11)加入30-100ulDEPC水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA.

12)跑胶：marker：DL2000 5ul

加样：6×loading buffer 1ul

甲酰胺 4ul

RNA 2ul

混匀后一起加

胶：1.8％有EB 120V 15min

4.2 RNA浓度测定

取1ulRNA用分光光度计测定浓度计OD260/280比值。

4.3逆转录反应

1)准备：冰上混合液的制备：

总RNA 0.1ug～5ug(一般取0.5ug即可)

随机引物(random primer)(0.5ug/ul) 1ul

DEPC水加至11ul

混匀，离心3～5s。

2)65℃孵育5min.冰上冷却，短暂离心。

3)依次加入：

5×reaction buffer 4ul

RiboLock Ribonuclease Inhibitor(20u/ul)1ul

10mM dNTPmix 2ul

混匀，短暂离心。

4)37℃孵育5min

5)加M-MuLV reverse transcriptase(20u/ul)2ul,总体积20ul。

6)室温5min。

7)42℃孵育60min。

8)70℃加热10min终止反应。冰上冷却。

9)反转录出的DNA可放-20℃保存。

4.4实时定量PCR

1)反应体系：

共20ul体系，加完样品后带托离心<2000rbpm

2)

表2引物序列

反应条件：

BDNF反应条件：

95℃30s

95℃0s

退火温度5s

72℃10s

40循环

95℃0s

65℃30s

95℃0.1/持续降温

40℃30s

检测结果如图3所示，ANOVA方差分析表明，相对于对照组，Group1、Group3和Group4组IFN-γ和TNF-α均发生显著性降低，而Group2则没有变化，这可能是由于Group2组CD200⁺标志物降低，细胞整体的生化性能发生变化所致。同时，上述实验结果也说明本申请BDNF+NT3的协同诱导还能增加CD200⁺细胞的抑制炎症的作用。

5.CD200⁺亚群脐带间充质干细胞对脊髓损伤的治疗效果

5.1疗效评定

5.1.1 BBB评分通过双盲实验进行，分别对实验大鼠后肢功能进行评定，包括关节运动、行走能力、协调性和肢体稳定性。脊髓损伤后第1周及第7周各组进行BBB评分。

统计学分析数据处理采用SPSS15.0软件，结果以

表示。BBB评分和细胞计数采用配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)。p<0.05即为有统计学意义。

大鼠后肢BBB评分参照表3。

表3 BBB运动功能评分表

术前各组评分均为21分，损伤后均为0分。经过30d休养后，Vehicle组获得初步恢复，其余各组相对于Vehicle组得分均获得了显著性的提升。且与上述研究类似，Group 2～4与Group 1也同样具有显著性差异。

表4

注：*p＜0.05，**p＜0.01，vsVehicle；#p＜0.05，vsGroup 1。

脊髓损伤包括两个阶段：原发急性机械损伤和后期继发性损伤。原发性损伤直接机械性破坏脊髓局部组织、神经元和内皮细胞，并破坏血液-脊髓屏障；淋巴细胞经血液-脊髓屏障受损处进入损伤位点，诱发炎症反应，改变局部微环境；验证反应诱使一氧化氮、活性氧等的释放，进一步增强血液-脊髓屏障的通透性，促进更多的淋巴细胞浸润，从而引起损伤位点的继发伤害。此前有研究表明，用抗体阻断IFN-γ，TNF-α，均可以有效改善脊髓损伤。而本发明发现，经过诱导培养后，CD200⁺亚群脐带间充质干细胞具有明显的抑制IFN-γ，TNF-α的作用，进而有效控制了继发性的脊髓损伤。此外，诱导培养后CD200⁺亚群脐带间充质干细胞虽然无法分化为神经细胞，但能够持续分泌近2个月的神经营养因子，从而有效促进了急性机械损伤时脊髓神经细胞的恢复，总体上大大加快了脊髓损伤的修复，具有良好的应用前景。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，其为添加如下成分的DMEM/F12培养基：

8v/v％～12v/v％FBS、FGF 8ng/ml～12ng/ml、BDNF10 ng/ml～30ng/ml以及NT3 10ng/ml～30ng/ml。

2.根据权利要求1所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，其为添加如下成分的DMEM/F12培养基：

9v/v％～11v/v％FBS、FGF 9ng/ml～11ng/ml、BDNF 15ng/ml～25ng/ml以及NT3 15ng/ml～25ng/ml。

3.根据权利要求2所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，其为添加如下成分的DMEM/F12培养基：

10v/v％FBS、FGF 9ng/ml～11ng/ml、BDNF 15ng/ml～25ng/ml以及NT3 15ng/ml～25ng/ml。

4.根据权利要求1～3任一项述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基还包括：

青霉素80U/ml～120U/ml和链霉素80U/ml～120U/ml。

5.CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括：

将纯化得到的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞于权利要求1～4任一项所述的培养基中培养至少7天。

6.权利要求5所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述纯化的方法为流式细胞法分选或者通过磁珠分选。

7.根据权利要求5所述的CD200⁺亚群脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，当细胞融合度≥80％的时候更换新鲜的培养基。

8.权利要求5～7任一项所述方法培养得到的细胞。

9.药物组合物，其包括权利要求8所述的细胞以及药学上可接受的载体。

10.权利要求8所述的细胞在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的应用。

Images