CN114515336B

CN114515336B - 低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体在脊髓损伤治疗中的应用

Info

Publication number: CN114515336B
Application number: CN202210142811.XA
Authority: CN
Inventors: 王秀娟
Original assignee: Tianjin Changhe Biological Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Changhe Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114515336A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体在脊髓损伤治疗中的应用。通过低氧诱导培养得到的hUCMSC细胞与OMgP抗体配合，能有效增强对脊髓组织损伤的修复效果，具有很好的应用前景。

Description

低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体在脊髓损伤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体在脊髓损伤治疗中的应用。

背景技术

脊髓损伤导致脊髓功能障碍，引起患者大小便失禁、慢性疼痛及心理精神疾患等，严重影响患者的生活质量，极大地增加了家庭及社会经济负担。原发性脊髓损伤常被认为是不可逆性损伤，因此明确继发性脊髓损伤机制及促进神经功能恢复一直以来是研究的难点与重点。

MSC是一种多能干细胞，在胎儿附属物如羊膜、羊水、脐带及脐血中发现有丰富的MSCs，它们可以称为介于成体干细胞和胚胎干细胞之间的类型，具有更低的免疫原性、更高的增殖能力以及来源更方便等独特的优越性。其中脐带来源的MSCs更丰富，一根脐带可制备相当于约5000毫升骨髓来源的间充质干细胞。故而，深入研究脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的作用并探讨其机制具有重要的意义。

此前有研究表明，3％O₂低氧环境能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，但低氧对人脐带间充质干细胞功能的研究还较少，而对于低氧培养后的充质干细胞对脊髓损伤的修复作用则更是鲜少有所记载。

目前认为影响脊髓损伤后再生的不利因素主要有髓鞘相关抑制分子和胶质瘢痕。髓鞘相关糖蛋白(Oligdendrocyte-associatedmyelin glycoprotein,OMgP)是髓鞘相关抑制分子中的一种，现有技术表明OMgP是脊髓再生的主要抑制因子，现有技术曾有报道采用siRNA等方法干扰OMgP的表达，但siRNA通常利用外泌体、病毒、脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒等技术递送，且RNA分子不稳定，易被降解。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的应用。

本发明的第二目的在于提供一种药物组合物，其包含hUCMSC细胞以及OMgP抗体；

所述hUCMSC细胞于5％～7％的低氧环境中培养得到。

优选的，如上所述的药物组合物，所述培养基为添加8v/v％FBS～12v/v％的DMEM低糖培养基；优选还包含BDNF 10ng/ml～30ng/ml。

神经营养因子可促进hUCMSC向神经干细胞分化，并且之前的研究也表面BDNF能够抑制损伤区域免疫反应，改善损伤组织周围微环境抑制神经细胞凋亡。

优选的，如上所述的药物组合物，其培养时间为8～10天。

优选的，如上所述的药物组合物，当细胞培养至75％～85％融合时，进行传代，每3～4天传代一次。

优选的，如上所述的药物组合物，所述OMgP抗体包含氨基酸序列依次如SEQ IDNO:1～3所示的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3，以及氨基酸序列依次如SEQ IDNO:4～6所示的轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3。

优选的，如上所述的药物组合物，所述OMgP抗体包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区HCVR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区LCVR。

优选的，如上所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种。

优选的，如上所述的药物组合物，所述hUCMSC细胞在所述药物组合物中的浓度为10⁵～10⁷个/mL。

优选的，如上所述的药物组合物，所述OMgP抗体在所述药物组合物中的浓度为0.7～1.0g/mL。

本发明的有益效果为：

通过低氧诱导培养得到的hUCMSC细胞与OMgP抗体配合，能有效增强对脊髓组织损伤的修复效果，具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为CCK8法检测hUCMSC活性实验结果；

图2为6％O₂+BDNF对hUCMSC培养后对细胞增殖和凋亡相关信号通路蛋白分子表达的影响；

图3为BBB评分结果；*：p<0.05,vs Vehicle；#：p<0.05,vs 6％O₂+BDNF；

图4中A为对各组脊髓组织HE染色结果；B为对损伤面积的统计图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 OMgP抗体制备与检测

1.蛋白设计及表达

以Oligdendrocyte-associated myelin glycoprotein(人OMgP，Uniprot号：Q16653)作为本发明OMgp的模板，设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，在OMgP蛋白基础上融合Flag-his标签，克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#:102762)，在293细胞瞬转表达或CHO-S稳定表达纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。

2.蛋白纯化

细胞表达液高速离心，收集上清，弃掉沉淀。HisTrap FF预装柱用磷酸盐缓冲液(PBS)以5～10个柱体积进行平衡。将细胞表达上清按2ml/min的速度上样。用PBS冲洗预装柱直至mAu读数将至基线，然后依次用20mM、50mM、250mM pH7.4的咪唑洗脱目的蛋白并收集，最终将300mM咪唑洗脱的目的蛋白液移至浓缩管中，离心，换液，将目的蛋白置换到PBS的溶液中保存，以备后续实验使用。

3.抗原免疫及单克隆制备

将人OMgP与小鼠抗体Fc片段(Fragment crystallizable)的缀合物腹腔注射BALB/c小鼠，每周一次，每次100μg/200μl/只，免疫3周后每周取小鼠尾血并检测血清中OMgP抗体的表达；选择血清中OMgP抗体表达量高(dot blot检测)的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成融合子。

细胞融合方法：

用分子量为1450的50％PEG作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行，其操作步骤如下：

取1×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合，用基础培养液重悬，2000r/min，5min洗细胞三次。于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合细胞的50mL离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴。用小铝锅装2/3容积的水，于电炉上加热到37℃后放进超净工作台；从CO₂培养箱取出温育至37℃的50％PEG，用1mL的吸管吸取0.8mL，手持装有混合细胞的50mL离心管，将其放置于37℃水浴小铝锅中，将PEG缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续2min后，将离心管插到离心管架上，移走小铝锅，从CO₂培养箱取出温育至37℃的50mL基础培养液，用吸管吸取10mL缓缓加到融合细胞上边加边轻轻搅拌，使细胞团块分散，先加1mL，再加2mL，再加3mL，最后加完剩下的4mL，加完第一个10mL后，接着沿管壁加完剩下的40mL，加完后，拧紧盖，反复颠倒几次，使细胞混匀。1500r/min，离心5min，弃上清，用重悬有饲养细胞的72mL完全培养液将融合细胞重悬。注：动作要轻，将用吸管将细胞轻轻搅拌起来，不要吹打。将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置CO₂培养箱培养。融合后第4天即可观察到小集落；第7天补加完全培养液1滴/孔；第10天左右，集落长到占孔底1/4大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。

杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：

融合后第10～14天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打上小点，标明集落的位置，以便检测时取样以及原始孔的对号入座。

选择培养上清中表达OMgP抗体的融合子进行单克隆；选择表达OMgP抗体的单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，培养7～10天后收集细胞培养液纯化获得OMgP抗体。

所制备得到的抗体重链可变区序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列为SEQID NO:8所示。抗体类型为IgG。

Heavy Chain variable region:(SEQ ID NO:7)

QVQLQKSDAEFVKPGASVKISCKASGYTASAAYWVKQNPEQQLEKIGYWSPGSSDLKSSVEFFKGKATLTADKSSSTEYVQLASLVSEDSAVYFCAMSINMAYWGWGQGTQVQQVSSQQ

Light Chainvariable region:(SEQ ID NO:8)

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQVQSFCNTWYKQKSKPGESPKDLVYVYSSRDSGVPDRFIGSGTAGSFTFTLTISSLQVEDLADYFCQQHASSPYMSTMAGGKLELK

4.抗体活性的测定

1.将表面偶联Protein A蛋白的探针在250μL的buffer K(PBS+0.002％吐温20+0.02％BSA)中浸润10分钟；

2.将抗体用bufferK配置为5μg/mL的工作液；

3.将重组人OMgP蛋白用bufferK配置为四个浓度的工作液，浓度分别为10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，0μg/mL；

4.根据Gator非标记分析仪(星童医疗技术，CAT#:Gator)指示添加试剂，亲和力数据KD值为7.53E-12(M)。

实施例2 hUCMSC的低氧培养

本实验样品细胞采用从脐带培养分离出的P2代hUCMSC(来自自愿捐献)。加入适量aMEM(含10％PBS)培养基进行培养，观察细胞增殖能力及形态学特征；根据需要传代2次后进行下一步骤。

2.制备细胞悬液

当细胞培养至接近80％融合时，去除培养基，用含双抗PBS清洗1～3次，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化1-2min，加入同样体积培养基终止消化，1000r/min离心5min，重新用低糖DMEM(含10％FBS)补充培养基悬浮细胞，将细胞浓度调整为1×10⁶/ml。

分出一份细胞作为对照组，其余细胞转入步骤3。

3.低氧诱导培养

6％O₂+BDNF组：将细胞接种于75T培养瓶中，添加BDNF，使其终浓度为20ng/mlBDNF，将培养瓶放置于37℃、5％CO₂，6％O₂饱和湿度的培养箱中培养，O₂浓度使用N₂调节。当细胞培养至接近80％融合时，吸弃培养液，PBS冲洗细胞，EDTA洗涤细胞1～2次后，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化1～2min，按1:2～1:3d比例传代扩增，以后养每3～4天进行传代，在低氧条件下共培养8天。

6％O₂组：条件同实验组1，区别在于培养基中不含BDNF。

BDNF组：条件同实验组1，区别在于O₂含量为21％。

4.hUCMSC活性检测

将上述各组细胞采用10ng/mL的IL-1β刺激24h以模拟体内炎症环境，随后采用Cell Counting试剂盒8(WST-8/CCK8)，依照说明书方法利用CCK8检测hUCMSC活性。

Control为以0ng/mL的IL-1β(即溶剂)处理对照组。结果如图1所示；可见低氧诱导培养配合BDNF能够有效增强hUCMSC在验证环境下的细胞活力。

5.低氧培养条件对细胞增殖和凋亡相关信号通路蛋白分子表达的影响

采用WB方法检测6％O₂+BDNF组、6％O₂组及BDNF组、BDNF组在10ng/mL的IL-1β刺激24h后细胞内蛋白的表达情况，结果如图2所示；可见细胞6％O₂+BDNF组中与细胞增殖相关蛋白(p-Pi3k、p-Akt)的磷酸化情况明显高于另外两组，而与凋亡相关蛋白(Caspase3)的表达情况明显低于另外两组。这说明低氧环境配合BDNF共培养能显著增强炎症条件下hUCMSC的细胞增殖并抑制细胞凋亡。

实施例3低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体治疗脊髓损伤

实验方法如下：

1.实验动物

实验动物为250g～280g的SD雄性大鼠，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于23℃的恒温环境中，湿度40％，12/12hr的昼夜节律。鼠粮和水充足供应。

2.大鼠脊髓打击伤模型的建立。

参照Wamil等的方法【Wamil et al.Proc NatlAcad Sci USA，1998；95(22)：13188-13193】按落体致伤原理建立模型。所用装置由撞杆、外周套管、击锤及外固定架等组成。撞杆头端直径2.3mm，高度10mm，击锤重10g，下落高度1.25cm，落体致伤的冲击力为10×1.25g·cm。室温23℃条件下，动物称重后，用5％水合氯醛(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，固定于大鼠固定架上。沿正中线切开脊髓胸背部皮肤及皮下组织长约4cm，定位T11椎体棘突，钝性分离T11、10、9椎体两旁肌肉，撑开器撑开固定，暴露上述三个椎体，行椎板切开术。将撞杆头端置于T10段脊髓，固定打击外套管，将击锤自1.25cm高度沿外周套管自由落下冲击撞杆，造成T10段脊髓挫伤，术中可见身体向前扑动、甩尾、呼吸暂停表示造模成功。明胶海绵止血，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤，术后自由进食水，分笼饲养。每日膀胱挤尿4～5次，持续1～2w，直到排尿反射恢复。

3.实验分组及细胞移植

脊髓打击伤模型建立成功24h后损伤部位原位注射步骤二培养后的各组细胞，分为如下几组，每组动物10只。

a)空白对照，未脊髓打击伤，仅注射PBS。

b)对照组(Vehicle)，注射PBS。

c)注射6％O₂+BDNF组培养的细胞；

d)注射6％O₂+BDNF组培养的细胞+NogoA抗体；

e)注射6％O₂+BDNF组培养的细胞+OMgP抗体。

上述，当注射液包含细胞时，细胞浓度为10⁶个/mL；当注射液包含抗体时，NogoA抗体浓度为，0.5g/mL；OMgP抗体浓度为，0.8g/mL。每只大鼠分别在第0、7、14、21天注射，共注射四次，每次注射200μL。

4.疗效评定

4.1 BBB评分通过双盲实验进行，分别对实验大鼠后肢功能进行评定，包括关节运动、行走能力、协调性和肢体稳定性。脊髓损伤后第0、7、14、21d对各组进行BBB评分。

统计学分析数据处理采用SPSS15.0软件，结果以

表示。BBB评分和细胞计数采用配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)。p<0.05即为有统计学意义。

大鼠后肢BBB评分参照表3。

表3 BBB运动功能评分表

术前各组评分均为21分，损伤后均为0分。

4.2术后30天后，制备冰冻切片并使用HE染色对脊髓组织进行形态学分析。使用ImageJ进行损伤区域分析，结果用损伤面积与空白对照组脊髓面积之比作为损伤区域百分数。

4.3结果与分析

BBB评分结果如图3所示，可见抗体与低氧培养环境联用能够有效增强脊髓损伤动物的运动功能恢复。HE结果如图4所示，其与BBB评分类似，相比其他组，可以看到抗体与低氧培养环境联用组的脊髓组织已经基本恢复。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 天津长和生物技术有限公司

<120> 低氧培养的hUCMSC联合OMgP抗体在脊髓损伤治疗中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Gly Tyr Thr Ala Ser Ala Ala Tyr

1 5

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Tyr Trp Ser Pro Gly Ser Ser Asp Leu Lys Ser Ser Val Glu Phe

1 5 10 15

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Ala Met Ser Ile Asn Met Ala Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Gln Val Gln Ser Phe Cys Asn Thr

1 5

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 5

Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Gln Gln His Ala Ser Ser Pro Tyr Met Ser Thr Met

1 5 10

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Lys Ser Asp Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser Ala Ala

20 25 30

Tyr Trp Val Lys Gln Asn Pro Glu Gln Gln Leu Glu Lys Ile Gly Tyr

35 40 45

Trp Ser Pro Gly Ser Ser Asp Leu Lys Ser Ser Val Glu Phe Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Glu Tyr Val

65 70 75 80

Gln Leu Ala Ser Leu Val Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Met Ser Ile Asn Met Ala Tyr Trp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Gln Gln Val Ser Ser Gln Gln

115

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 8

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Gln Ser Phe Cys

20 25 30

Asn Thr Trp Tyr Lys Gln Lys Ser Lys Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asp

35 40 45

Leu Val Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ile Gly Ser Gly Thr Ala Gly Ser Phe Thr Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Val Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln His Ala

85 90 95

Ser Ser Pro Tyr Met Ser Thr Met Ala Gly Gly Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Claims

1.药物组合物，其包含hUCMSC细胞以及OMgP抗体；

所述hUCMSC细胞于5％～7％的低氧环境中培养得到；

所述培养基为添加8v/v％～12v/v％FBS的DMEM低糖培养基，所述培养基还包含BDNF10ng/ml～30ng/ml；

所述OMgP抗体包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3，以及氨基酸序列依次如SEQ IDNO:4～6所示的轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其培养时间为8～10天。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，当细胞培养至75％～85％融合时，进行传代，每3～4天传代一次。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，所述OMgP抗体包含SEQ IDNO:7所示的重链可变区HCVR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区LCVR。

5.根据权利要求1～4任一项所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种。

6.根据权利要求1～4任一项所述的药物组合物，所述hUCMSC细胞在所述药物组合物中的浓度为10⁵～10⁷个/mL。

7.根据权利要求1～4任一项所述的药物组合物，所述OMgP抗体在所述药物组合物中的浓度为0.7～1.0g/mL。