BRPI0919020B1

BRPI0919020B1 - Uso de células de linhagem monocitária enriquecidas para tratar isquemia e para tratar angina pectoris

Info

Publication number: BRPI0919020B1
Application number: BRPI0919020-1A
Authority: BR
Inventors: Alison E Willing; Adriana Invitti; Paul R. Sanberg; Nelson Hossne
Original assignee: University Of South Florida; Universidade Federal De São Paulo-Unifesp; Cryopraxis Criobiologia Ltda.
Priority date: 2008-09-12
Filing date: 2009-09-14
Publication date: 2021-03-23
Also published as: EP2331679B1; JP2017214426A; US10335434B2; JP2012502114A; CN102186970A; BRPI0919020A2; JP2016128521A; US20110274674A1; US20140369983A1; JP2014088443A; RU2011113869A; BRPI0919020A8; EP2331679A1; WO2010031006A1; US8784802B2; CN107595889A; EP2331679A4; HK1248125A1; JP6105846B2; CA2737193A1

Abstract

uso de células de linhagem monocitária enriquecidas para tratar isquemia e para tratar angina pectoris. a presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de doenças e condições isquêmicas, particularmente isquemia do miocárdio, do snc/cérebro e de membros. mais particularmente, a presente invenção estabelece métodos de tratamento de doenças mediante administração de monócitos obtidos de sangue, incluindo sangue de cordão umbilical, sangue periférico ou medula óssea, a um indivíduo que precisa de tratamento, em que a formulação específica é administrada para o indivíduo, em um tempo especificamente determinado para proporcionar a eficácia terapêutica. em uma modalidade, as células são para injeção no miocárdio isquêmico para o tratamento de angina.

Description

USO DE CÉLULAS DE LINHAGEM MONOCITÁRIA ENRIQUECIDAS PARA TRATAR ISQUEMIA E PARA TRATAR ANGINA PECTORIS

DECLARAÇÃO DE INTERESSES DO GOVERNO

[0001] O Governo dos Estados Unidos da América fomentou o desenvolvimento desta invenção através do processo No. RO1NS52839, recebido pelo Instituto Nacional de Desordens Neurológicas e Acidente Vascular Cerebral; possuindo assim direitos sobre a invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se ao uso de monócitos isolados de sangue periférico, sangue de cordão umbilical humano (SCUH) e medula óssea para o tratamento de doenças e condições isquêmicas, principalmente miocárdicas, cerebrais e de membros. A invenção refere-se à terapia baseada em populações celulares terapêuticas enriquecidas com células da linhagem monocitária, bem como composições e métodos de manufatura. Esta invenção também se refere às metodologias de uso destas terapias e composições no tratamento ou prevenção das isquemias ou, senão, na promoção da perfusão tecidual e aumento da formação de vasos sanguíneos colaterais. Em uma modalidade, uma população de células mononucleares enriquecida com células da linhagem monocitária é utilizada no tratamento de isquemia cardíaca e angina pectoris. Em outra modalidade, a doença é o acidente vascular cerebral (AVC) e os monócitos são isolados de sangue periférico, sangue de cordão umbilical humano (SCUH) e medula óssea.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A angina pectoris é caracterizada por dores no peito e desconforto causados por fluxo sanguíneo insuficiente no músculo cardíaco. A prevalência de angina em adultos americanos acima dos 20 anos é estimada em 9.100.000. A angina pectoris estável é uma variante de angina onde os episódios de dor ocorrem em decorrência da atividade física ou quando o indivíduo está sob estresse emocional. A prevalência da angina estável nos adultos americanos acima de 45 anos (sem correspondente infarto agudo do miocárdio) é de 500.000. (Rosamond e outros. Circulation 117(4): e 25 (2008)).

[0004] As terapias atuais incluem uso de aspirinas, beta-bloquea-dores (por exemplo carvedilol, propanolol, atenolol), nitroglicerina (alívio imediato), vasodilatadores como bloqueadores de canal de cálcio (por exemplo nifedipina (Adalat) e amlodipina), mononitrato de isossorbida e nicorandila, inibidores de canal If (por exemplo ivabradina), inibidores da enzima conversora de angiotensina (iECA), estatinas, e ranolazina (Ranexa). Entretanto, esse tipo de terapia trata somente dos episódios de dor sem prevenir a sua recorrência. Além disso, nem todos os pacientes que sofrem de angina respondem a esses tratamentos. Estudos clínicos em angina refratária vem sendo conduzidos com o uso de células-tronco CD34; as células-tronco são administradas com o intuito de gerar uma nova vascularização, prevenindo, assim, a recorrência dos episódios de dor. Entretanto, ainda não é comprovada a segurança e a eficácia desse tratamento. A angina pectoris necessita de uma opção de tratamento que possua efeito de longa duração, especialmente a angina pectoris refratária.

[0005] A conduta para os pacientes com angina refratária é complexa e requer uma abordagem multidisciplinar. As terapias atuais incluem o uso de aspirinas, beta-bloqueadores (por exemplo carvedilol, propanolol, atenolol), nitroglicerina (alívio imediato), vasodilatadores como bloqueadores de canal de cálcio (por exemplo nifedipina (Adalat) e amlodipina), mononitrato de isossorbida e nicorandila, inibidores de canal If (por exemplo ivabradina), inibidores da enzima conversora de angiotensina (iECA), estatinas, e ranolazina (Ranexa). Essas terapias geralmente demandam exaustivas tentativas de adequação de diferentes combinações de fármacos e regimes de administração a fim de diminuir os episódios de dor. Entretanto, essas terapias, em geral, só tratam a dor, não impedindo a sua recorrência e nem todos os pacientes anginosos respondem a tais tratamentos.

[0006] Além das terapias farmacológicas, os pacientes podem ser submetidos a procedimentos intervencionistas como, a angioplastia coronária percutânea transluminal ou cirurgia de revascularização miocárdica. Porém, esses procedimentos não estão disponíveis para alguns dos pacientes com angina em decorrência de diversos fatores como: anatomia desfavorável do leito coronariano, artérias coronárias finas, lesões coronarianas difusas ou distais, etc. O Manual da Associação Americana do Coração (American Heart Association) de 2002 recomenda o uso de terapias alternativas que incluem a cirurgia de revascularização transmiocárdica a laser (Classe IIa), contrapulsação externa aumentada (EECP) e eletro-estimulação da medula espinhal (Classe IIb).

[0007] Novas modalidades de tratamento estão sendo investigadas, inclusive o uso de populações de células-tronco. Diversos pesquisadores deram os primeiros passos demonstrando a regeneração do tecido cardíaco com o uso de frações mononucleares de medula óssea, contendo células-tronco, em infarto agudo do miocárdio. Esses estudos observaram: (i) regeneração do miocárdio pós-infarto; (ii) redução da área do infarto; (iii) Expressão de novo de proteínas cardíacas pelas células de medula óssea. Seguindo esses estudos preliminares, diversos grupos demonstraram o potencial regenerativo das células mesenquimais derivadas de medula óssea em diferentes modelos experimentais de coração; com resultados preliminares baseados no potencial miogênico e angiogênico destas células.

[0008] Estudos clínicos, a maioria em pacientes que sofreram infarto agudo do miocárdio com infusão intracoronariana de células-tronco, foram desenvolvidos a fim de verificar a segurança e a eficácia do transplante autólogo de células na melhoria do reparo cardíaco. Entretanto, estes estudos geraram resultados conflituosos devido a diferença no desenho dos estudos, populações celulares ou métodos de infusão.

[0009] Nas doenças isquêmicas do coração, alguns estudos clínicos demonstraram ao menos a segurança do implante de células-tronco derivadas da fração mononuclear de medula óssea; com variados graus de eficácia. A técnica de infusão mais comum nestes estudos é a infusão intramiocárdica de células-tronco - seja ela transendocárdica ou transepicárdica.

[00010] No cenário da angina refratária, alguns grupos desenvolveram estudos clínicos. A maioria deles utilizando células mononucleares de medula óssea (CMMO) como tratamento único ou em conjunto com a revascularização miocárdica.

[00011] Como exemplo, Hamano e outros realizaram a injeção transepicárdica de CMMO, em conjunto com revascularização miocárdica, em cinco pacientes considerados sem opção de tratamento associada a cardiomiopatia isquêmica. Os resultados demonstraram um aumento objetivo da perfusão miocárdica na área de injeção em três pacientes. Entretanto, os resultados podem ser confundidos com o efeito da concomitante revascularização miocárdica. Assim, os efeitos terapêuticos das CMMO continuam incertos.

[00012] Outros investigadores relataram a sua experiência inicial com o uso de um cateter percutâneo guiado por um sistema de mapeamento eletromecânico (sistema NOGA®) para injeção endomiocárdica de CMMO. De forma geral, esses estudos, não randomizados, demonstraram que a transferência direta de CMMO ao miocárdio isquêmico acarreta a melhoria dos sintomas, da capacidade de realizar atividades físicas, aumenta a perfusão miocárdica e a função cardíaca, na maioria dos pacientes com angina refratária. Muitos desses estudos incluíram pacientes sem opção de tratamento e cardiomiopatia isquêmica.

[00013] Recentemente, foi publicado o primeiro estudo prospectivo randomizado de injeção endomiocárdica de CMMO em doença coronariana severa (PROTECT-CAD). Esse estudo demonstrou, no grupo tratado, uma melhora significativa no tempo de realização de atividade física, na fração de ejeção do ventrículo esquerdo e na isquemia miocárdica induzida por estresse.

[00014] Losordo e outros realizaram um estudo clínico fase I/IIa, duplo-cego, randomizado, controlado por placebo, com escalonamento da dose, para o tratamento de angina refratária através da injeção endomiocárdica de células-troco CD34+ autólogas. Os parâmetros de eficácia, que incluíam a frequência dos episódios de angina, uso de nitroglicerina, tempo de realização de atividade física e a classe de acordo com a CCSAC, demonstraram tendências favoráveis aos pacientes tratados com células CD34+ em comparação com o grupo controle que recebeu placebo.

[00015] Os estudos clínicos utilizando células-tronco derivadas da fração mononuclear da medula óssea em pacientes com angina refratária demonstraram alguma melhoria na perfusão miocárdica e, em menor grau, da função ventricular. A maioria desses estudos incluiu pacientes com cardiomiopatia isquêmica, com diminuição de moderada a severa na fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE). Contudo, até o presente momento nenhuma terapia baseada no uso de células terapêuticas (isto é, células mononucleares ou células-tronco mesodérmicas) foi capaz de efetivamente diminuir a dor ou melhorar a perfusão miocárdica na maioria, senão todos, os pacientes tratados.

[00016] Aproximadamente entre 5 e 15% dos pacientes com doença coronariana crônica apresentam angina pectoris severa incapacitante que não pode ser controlada com uma combinação de terapias convencionais; incluindo o tratamento farmacológico múltiplo otimizado, a angioplastia coronária percutânea transluminal ou a cirurgia de revascularização miocárdica (35,37). A angina pectoris severa frequentemente resulta em uma diminuição substancial da qualidade de vida. O alívio dos sintomas para os pacientes de angina refratária, sem opção de tratamento, é um processo complexo e desafiador. Terapias alternativas, conforme os Manuais da Associação Americana do Coração (American Heart Association) (11,14), como: cirurgia de revascularização transmiocárdica a laser, contrapulsação externa aumentada e eletro-estimulação da medula espinhal apresentam, no melhor dos casos, resultados modestos (9, 26, 31, 45). A grande maioria dos pacientes com angina pectoris (75%) possuem função do ventrículo esquerdo preservada e uma taxa de mortalidade menor do que a população geral de doenças coronarianas (36, 54). Esse grupo de pacientes está crescendo rapidamente.

[00017] A Terapia Celular, especificamente o transplantes de células de medula óssea autóloga, surgiu como uma nova opção de tratamento para a regeneração cardíaca. Algumas hipóteses explicam os mecanismos que envolvem o potencial miogênico e angiogênico das células-tronco e a ativação das células progenitoras residentes através de efeitos parácrinos (2,15-17,22,48,49,52). Apesar de a regeneração do tecido miocárdico e concomitante redução da área infartada terem sido demonstradas em modelos experimentais de animais, muitas dúvidas ainda existem em relação a transferência desses resultados para seres humanos (7,33); fazendo com que o transplante de CMMO para a regeneração do tecido cardíaco seja um procedimento experimental e não procedimento clínico padrão.

[00018] Por outro lado, os pacientes com angina refratária poderão ser beneficiados com os procedimentos baseados em terapias celulares, principalmente no que se refere à angiogênese. Na terapia celular, como opção para pacientes humanos, esse efeito angiogênico é considerado de grande importância pelos pesquisadores (8).

[00019] O efeito angiogênico foi observado em diversos estudos pré-clínicos (8, 28, 33, 48). Corações transplantados com células de medula óssea (MO) c-kit+ apresentaram aumento da angiogênese quando comparados a camundongos controle negativos (40). A mobilização de células de medula óssea para a circulação sanguínea após infarto agudo do miocárdio resulta em regeneração dos miócitos e estruturas vasculares (39). Um estudo recente em primatas não humanos, utilizando protocolo similar, demonstrou que os animais tratados com MO tiveram um aumento da perfusão sanguínea local, sugerindo assim um efeito angiogênico potencial das células de MO (30). Os benefícios funcionais do transplante de células de MO são geralmente atribuídos a um efeito parácrino, com decorrente aumento da angiogênese pela liberação de múltiplos fatores de crescimento, como: fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator derivado de células estromais 1 (SDF-1), entre outros (8, 48).

[00020] A melhoria dos sintomas, da capacidade de realizar atividade física, assim como da perfusão miocárdica foram observadas em estudos clínicos envolvendo pacientes com angina refratária que receberam células-tronco derivadas de MO ou CMMO (4,6,8,12,13,19,21,41,53,55,56,59). O estudo clínico realizado por Beeres e outros (3) mostrou efeitos benéficos sustentados dos sintomas anginosos e da perfusão miocárdica, em 25 pacientes com angina refratária que receberam injeção intramiocárdica autóloga de CMMO. Losordo e outros (34) realizaram um estudo clínico fasel/IIa, duplo-cego, randomizado, com escalonamento da dose, controlado por placebo, que demonstrou uma tendência no aumento do tempo de realização da atividade física junto a melhoria na Classificação de Angina da Sociedade Cardiovascular Canadense (CCSAC) entre os indivíduos tratados com células CD34+. van Ramshorst e outros realizaram um estudo randomizado controlado com injeção intramiocárdica de células de medula óssea para o tratamento de angina refratária, que demonstrou um aumento modesto na perfusão miocárdica em comparação com o grupo placebo, em um período de acompanhamento curto (3 a 6 meses).

[00021] A observação de poucos efeitos na melhora da função do ventrículo esquerdo e os resultados dos estudos anteriores em angina refratária sugerem que a ação primária do transplante de células-tronco de medula óssea é a promoção de angiogênese miocárdica e não propriamente a miogênese. Neste cenário, a angiogênese, em certa medida, pode de fato melhorar a função ventricular esquerda através do resgate e recrutamento do miocárdio hibernante, como foi demonstrado por esses estudos clínicos e em algumas meta-análises (1,32, 44).

[00022] O potencial de exequibilidade, segurança e eficácia das terapias com células-tronco para a regeneração do tecido miocárdico, em pacientes com uma faixa de diagnóstico que vai do infarto agudo do miocárdio às doenças isquêmicas crônicas do coração, é corroborado pelos estudos pré-clinicos e clínicos já realizados (33).

[00023] O grande desafio é a transferência dos resultados laboratoriais para a rotina hospitalar. As diferenças no desenho dos estudos, na preparação de células-tronco ou mononucleares e nas técnicas de infusão apresentaram resultados promissores, mas os dados gerais são inconsistentes entre os estudos (43).

[00024] As doenças cérebro-vasculares, consideradas uma das cinco principais doenças dentre as doenças não contagiosas, afeta no mundo aproximadamente 50 milhões de pessoas, resultando em aproximadamente 5,5 milhões de mortes por ano. Desses 50 milhões, o acidente vascular cerebral (AVC) corresponde a cerca de 40 milhões de pessoas.

[00025] A isquemia possui um importante papel no AVC, assim como na angina. O AVC é a terceira maior causa de morte nos países desenvolvidos e é o maior responsável pela incapacitação de adultos. É uma doença vascular que possui impacto sobre as funções cognitivas e motoras e altera o sistema imune; a qual atualmente só possui uma opção de tratamento. Este estudo foca na fisiopatologia do AVC e no desenvolvimento de uma nova terapia celular (células de sangue de cordão umbilical humano - SCUH) que em estudos anteriores mostrou melhorias significativas na disfunção motora e redução da área infartada. O papel da resposta imuno-inflamatória no desenvolvimento da lesão cerebral pós-AVC não está completamente elucidado. Após um evento isquêmico, existe uma resposta imune que resulta na infiltração de neutrófilos, células-T, células-B, células-NK, assim como migrogliais no hemisfério infartado e alteração do perfil plasmático dessas células imunes. Esse estudo visa verificar se o efeito benéfico da injeção de SCUH pode ser atribuído a uma população específica de células.

[00026] Os tratamentos para o AVC estão divididos em duas categorias: prevenção e tratamento agudo. Os tratamentos preventivos consistem no uso de agregadores antiplaquetários, agentes anticoagulantes, cirurgia, angioplastia, adaptações do estilo de vida e abordagem médica. O agregador antiplaquetário comumente utilizado é a aspirina. O uso de agentes anticoagulantes parece não possuir significância estatística. O tratamento cirúrgico é efetivo somente em alguns sub-grupos. A angioplastia ainda é um tratamento experimental com dados insuficientes para análise. As adaptações no estilo de vida incluem: eliminação do tabagismo, atividade física regular, controle da alimentação, redução da ingestão de sódio e moderação do consumo de álcool. A abordagem médica consiste no uso de medicamentos para reduzir a pressão arterial, diminuir o colesterol, controlar a diabetes e os problemas circulatórios.

[00027] O tratamento agudo consiste no uso de trombolíticos, agentes neuroprotetores, Terapia com Emulsão de Nutrientes e Fluorcarbonetos Oxigenados (OFNE), Neuroperfusão, Terapia de Inibição do Receptor Plaquetário de Glicoproteína (GP)IIb/IIa e Terapia de Reabilitação Física.

[00028] Um agente trombolítico induz ou modera a trombólise, o agente mais comumente utilizado é o ativador de plasminogênio tecidual (AP-t). AP-t recombinante (AP-tr) auxilia no restabelecimento da circulação cerebral através da dissolução (lise) dos coágulos que estão obstruindo o fluxo sanguíneo. É um tratamento efetivo com uma janela terapêutica bastante curta; precisa ser administrado em até 3 horas após o início do AVC. Ele também requer uma tomografia computadorizada do crânio (TC) antes do início do tratamento, reduzindo ainda mais o tempo disponível para a terapia . Atualmente, a única fonte de AP-rt disponível é produzida somente pela Genetech Pharmaceuticals com o nome comercial ACTIV ASE®.

[00029] Os agentes neuroprotetores são fármacos que minimizam os efeitos da cascata isquêmica e incluem, por exemplo, Antagonistas do Glutamato, Antagonistas de Cálcio, Antagonistas Opioides, Agonistas GABAA, Inibidores de Calpaína, Inibidores de Quinase e Antioxidantes. Diversos estudos clínicos diferentes, em AVC agudo, estão sendo realizados. Os procedimentos futuros para o tratamento agudo do AVC possivelmente envolverão o uso combinado de terapias trombolítica e neuroprotetora devido a sua função complementar na anti-coagulação e proteção cerebral. Entretanto, assim como os trombolíticos, a maioria dos neuroprotetores precisam ser administrados em até 6 horas do início do AVC para serem efetivos.

[00030] A Terapia com Emulsão de Nutrientes e Fluorcarbonetos Oxigenados (OFNE) leva oxigênio e nutrientes ao cérebro através do fluído cérebro-espinhal. A neuroperfusão é um procedimento experimental no qual o sangue rico em oxigênio é redirecionado através do cérebro a fim de diminuir o dano causado pelo AVC isquêmico. A terapia de inibição do receptor plaquetário de glicoproteína (GP) IIb/IIIa impede a agregação ou acúmulo de plaquetas através da inibição do receptor plaquetário GP Mb/MIa. A Terapia de reabilitação física deve ser iniciada o mais rapidamente possível após o AVC, porém não é capaz de provocar alterações no dano cerebral. O objetivo da reabilitação é a melhora das funções do paciente sobrevivente de AVC, para que ele se torne o mais independente possível.

[00031] Um estudo desenvolvido em Cleveland mostrou que apesar dos tratamentos agudos terem se mostrado eficientes em estudos clínicos apenas 1,8% dos pacientes que apresentaram sintomas de AVC sequer receberam o tratamento com AP-t, (Katz e IL e outros, 2000 JAMA, 283:1151-1158). AP-t é atualmente o tratamento mais amplamente utilizado dentre os tratamentos agudos para AVC supracitados, porém o número de pacientes que recebem qualquer novo tratamento agudo potencialmente efetivo para AVC estima-se estar abaixo de 10%. Essas estatísticas demonstram a clara necessidade de um tratamento imediato para o AVC; antes das primeiras 24 horas a partir do início do AVC.

[00032] Em alguns desses tratamentos agudos (por exemplo: AP-t) o tempo para a administração é crucial. Estudos recentes identificaram que 42% dos pacientes que sofrem AVC levam até 24 horas para darem entrada no hospital, com um tempo médio de 6 horas pós-AVC. Cento e treze (113) pacientes que receberam terapia com AP-t demonstraram uma melhoria na recuperação, entretanto um estudo recente requisitado pelo FDA (Tratamento Padrão com Alteplase para Reversão de AVC) demonstrou que cerca de um terço dos tratamentos não foi realizado dentro da janela terapêutica de 3 horas, resultando um tratamento não efetivo. Com exceção da terapia de reabilitação, os demais tratamentos agudos ainda estão em fase de estudo clínico e não são amplamente disponíveis nos Estados Unidos, particularmente nas áreas rurais, as quais podem não possuir grandes centros médicos com o especialista em neurologia necessário e atendimento de emergência. O acesso a qualquer um dos novos métodos de diagnóstico e tratamento de AVC pode, ainda por algum tempo, ser limitado.

[00033] O custo do AVC nos Estados Unidos é superior a U$43 bilhões, incluindo os custos diretos e indiretos. Os custos diretos correspondem a aproximadamente 60% do total e correspondem a diárias hospitalares, honorários médicos e reabilitação. Esses custos normalmente atingem U$15.000 por paciente, nos primeiros três meses; além disso, em aproximadamente 10% dos casos o custo supera os U$35.000. Os custos indiretos correspondem a parcela restante e incluem a perda de produtividade da vítima do AVC, bem como a perda de produtividade dos membros da família responsáveis pelo cuidado com o paciente (dados do Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e AVC, NINDS-NIH).

[00034] Aproximadamente 750.000 AVC acontecem nos Estados Unidos todos os anos, dos quais um terço é fatal. Dos pacientes restantes, um terço é caracterizado como de gravidade leve, um terço moderada e um terço severa. O AVC isquêmico corresponde a 80% no número total de AVC.

[00035] O número total de AVC deve crescer substancialmente devido a geração de Baby-Boomers. O risco de AVC aumenta com a idade. Após os 55 anos, o risco de AVC dobra a cada década e aproximadamente 40% dos indivíduos octogenários sofrem AVC. O risco de um segundo AVC aumenta ao longo do tempo, encontrando-se na faixa entre 25-40% até 5 anos após o primeiro AVC. Considerando que espera-se um aumento na porcentagem da população acima de 65 anos devido a chegada dos baby-boomers à maturidade, esse mercado deve crescer substancialmente. Além disso, a demanda por um tratamento efetivo deve aumentar dramaticamente.

[00036] Considerando a incapacidade em efetivamente mitigar os efeitos devastadores do AVC, torna-se imperativo o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para minimizar o trauma nervoso inicial, além de reparar os danos cerebrais iniciados assim que a cascata do AVC começa seu curso.

[00037] O transplante de monócitos foi proposto como um meio de tratar o AVC. Devido a dificuldade em efetivamente tratar os pacientes pós-AVC, existe a necessidade de buscar métodos específicos que melhorem o tratamento do AVC.

[00038] A neovascularização é um processo integrado pelas reações inflamatórias e subsequente reparo das cascatas, em tecidos que sofreram injúria. Os monócitos e macrófagos possuem um papel central no processo inflamatório, inclusive na angiogênese e nos mecanismos de defesa, através da atividade antimicrobiana e atividade imunomodulatória. Estudos atuais mostraram que o recrutamento de monócitos/macrófagos auxilia na regulação da angiogênese em tecidos isquêmicos, tumores e inflamações crônicas. Considerando a neovascularização seguida de regeneração tecidual, os monócitos/macrófagos mostram-se mais atrativos para o uso em terapias celulares quando comparados a qualquer outro tipo de célula-tronco. Eles possuem algumas vantagens consideráveis como a não-oncogenicidade, não-teratogenicidade, ausência de polêmicas éticas, função multissecretória (fatores pró-angiogênicos e de crescimento) e fácil obtenção. Os monócitos/macrófagos podem ser obtidos não somente de fontes adultas, como a medula óssea ou o sangue periférico, mas também do sangue de cordão umbilical (SCU) como potencial fonte autóloga e alogênica. Os monócitos do SCU devem ser especialmente considerados como principais candidatos devido a sua rápida exequibilidade, baixa rejeição imune e múltiplas habilidades, como reações anti-inflamatórias decorrentes da sua imaturidade imuno-inflamatória assim como, a habilidade pró-angiogênica. As características e potencial dos monócitos/macrófagos na terapia celular foram demonstradas especialmente com foco na neovascularização e no uso de monócitos derivados de SCU.

[00039] Uma função interessante dos monócitos/macrófagos é a promoção de angiogênese relacionada às reações inflamatórias. A angiogênese (neovascularização) é o principal elemento do processo inflamatório, incluindo as cascatas de reparo subsequentes (Sunderkotter, 1994 #4). Durante o início do processo inflamatório, os monócitos presentes na circulação sanguínea migram para os tecidos (Bosco, 2008 #3). Inicialmente, as células inflamatórias e endoteliais vizinhas regulam a passagem dos monócitos pela parede dos vasos através da liberação de uma série de sinais quimiotáticos e de adesão (Baggiolini, 200 #9; Imhof, 2004 #2; Bosco 2008 #3). Em decorrência do gradiente quimiotático e de oxigênio entre o tecido normal e o lesado, os monócitos migram até atingir o centro hipóxico e/ou necrótico do tecido doente antes de se diferenciarem em macrófagos tissulares. Os tecidos patológicos nos quais os monócitos/macrófagos são capazes de se acumular são os tumores sólidos, miocárdio ou tecido nervoso infartado, placas de ateroma, membranas sinoviais em artrite crônica, infecções bacterianas e feridas em processo de cura (Baggiolini, 200 #9; Murdoch, 2004 #1; Bosco, 2008 #3; Mantovani, 2002 #15) (figura 8).

[00040] Depois da diferenciação dos monócitos em macrófagos tissulares, esses dividem-se em duas populações polarizadas, M1 e M2 (Mantovani, 2004 #67; Sica, 2006 #16; Mantovani, 2002 #15). Enquanto os macrófagos polarizados em M1 são células fortemente inflamatórias que produzem citocinas pró-inflamatórias e fagocitam patógenos, os macrófagos M2 modulam a resposta inflamatória e auxiliam na angiogênese e no reparo tecidual (Mantovani, 2004 #67; Sica, 2006 #16; Mantovani, 2002 #15). De maneira interessante, na expressão gênica dos macrófagos, os genes para a combinação dos grupos M1 e M2, no início do processo de cicatrização da ferida, é convertida posteriormente em genes M2 (Deonarine, 2007 #68). Durante os estágios iniciais do processo de cicatrização, os macrófagos M1 levam a uma reação inflamatória direta que limpa a ferida e remove os debris microbianos e/ou de tecido danificado enquanto, simultaneamente, os macrófagos M2 iniciam o reparo tecidual e a angiogênese. Nos estágios finais, quando a limpeza realizada pelos macrófagos M1 está praticamente terminada, os macrófagos M2 prevalecem e seguem com o seu trabalho de regeneração tecidual e angiogênese (Deonarine, 2007 #68). Um grande número de evidências sugerem o recrutamento de monócitos/macrófagos para o auxílio na modulação e regulação da neovascularização em tecidos isquêmicos, tumores e inflamações crônicas como, artrite e aterosclerose.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00041] A presente invenção trata dessa grande necessidade, estabelecendo métodos e composições para o tratamento da isquemia (preferivelmente aquela que ocorre na angina e no AVC) e para o aumento da perfusão para tratar a isquemia subjacente ou necessidade de melhora da perfusão, ao invés de tratar somente da dor causada por essas condições e aumentar a confiabilidade na eficácia do uso de terapias celulares para essas condições.

[00042] Os monócitos, que são derivados dos monoblastos, são células-tronco precursoras hematopoiéticas na medula óssea (MO) e estão presentes na circulação sanguínea antes de migrarem para os tecidos do corpo. Nos tecidos, os monócitos diferenciam-se em vários tipos de macrófagos residentes teciduais de acordo com a localização anatômica, por exemplo: células de Langherans na pele, células de Kupffer no fígado, osteoclastos nos ossos, microglias no sistema nervoso central, macrófagos alveolares nos pulmões e células sinoviais tipo A nas articulações sinoviais (Bosco e col. 2008; Gordon, 2003, Imhof e Aurrand-Lions, 2004; Murdoch e col. 2004; Sunderkotter e col. 1994) (figura 8). Monócitos e macrófagos podem realizar fagocitose utilizando como mediadores anticorpos e componentes do complemento, que revestem os microorganismos, ou ligando-se diretamente aos patógenos através do reconhecimento de receptores específicos (endocitose). Além disso, os monócitos/macrófagos são capazes de matar células do próprio organismo que estejam infectadas com patógenos, através de uma resposta imune chamada citotoxicidade celular mediada por anticorpo (Nathan, 1987; Sunderkotter e col. 1994). Os monócitos/macrófagos são as únicas células imunorregulatórias capazes tanto de estimular quanto de suprimir as atividades imunes, incluindo a apresentação de antígenos para as células-T e controlar a secreção de uma ampla gama de citocinas e fatores de crescimento (Bosco e col., 2008; Murdoch e col., 2004, Paulnock e col., 2000). Em suma, os monócitos/macrófagos possuem um papel fundamental no sistema imune inato, através da destruição de patógenos por fagocitose e citotoxicidade celular e imunomodulação (Bosco e col., 2008; Paulnock, e col., 2000).

[00043] Angina e AVC são condições isquêmicas características ou condições onde o paciente necessita de melhora da perfusão. Sob esse aspecto, a presente invenção preenche parcialmente a necessidade de identificar um método novo e único para o tratamento de angina, AVC e outras formas de isquemia. Da mesma maneira, também necessitam de melhores terapias, as outras condições isquêmicas ou condições onde o paciente necessita da melhora na perfusão.

[00044] Em uma modalidade, o método compreende a administração de monócitos a um indivíduo com necessidade de tratamento, onde os monócitos são administrados para um indivíduo de forma sistêmica em uma quantidade e em um período de tempo especificamente determinados para proporcionar a eficácia terapêutica.

[00045] Um aspecto da invenção corresponde ao método de tratamento da isquemia, em um indivíduo, que compreende a injeção de uma população celular terapêutica enriquecida com a linhagem de células monocitária diretamente no tecido isquêmico do indivíduo. Em uma determinada modalidade, a isquemia é cardíaca e o tecido isquêmico é o miocárdio. Outro aspecto da invenção corresponde ao método de melhora da perfusão, em um indivíduo, que compreende a injeção de uma população celular terapêutica enriquecida com a linhagem de células monocitárias diretamente no tecido isquêmico de um indivíduo que necessite de melhora na perfusão. Em uma determinada modalidade, a isquemia é cardíaca e o tecido isquêmico é o miocárdio. Assim, outro aspecto da invenção é o método de tratamento da angina pectoris em um indivíduo, através da injeção de uma população de células-tronco enriquecida com a linhagem de células monocitárias diretamente no miocárdio do indivíduo. Nas modalidades que compreendem a qualquer um dos aspectos anteriores o método pode incluir injeções de no mínimo 107 células da linhagem monocitária dentro da população celular terapêutica enriquecida com a linhagem de células monocitárias. Os aspectos e modalidades anteriores podem ainda incluir uma modalidade onde a população de células monocitárias é injetada diretamente no miocárdio através de pelo menos duas injeções independentes, pelo menos três injeções independentes, pelo menos quatro injeções independentes, pelo menos cinco injeções independentes, pelo menos dez injeções independentes, pelo menos vinte injeções independentes, pelo menos trinta injeções independentes, pelo menos quarenta injeções independentes, pelo menos cinquenta injeções independentes, pelo menos sessenta injeções independentes, pelo menos setenta injeções independentes, pelo menos oitenta injeções independentes, pelo menos noventa injeções independentes ou pelo menos centenas de injeções independentes. Os aspectos e modalidades anteriores podem ainda incluir uma modalidade onde o volume de injeção está entre 0,05mL e 0,3mL ou é aproximadamente 0,2mL. Os aspectos e modalidades anteriores podem ainda incluir uma modalidade onde a população celular terapêutica enriquecida com a linhagem de células monocitárias é autóloga ou alogênica em relação ao indivíduo. Os aspectos e modalidades anteriores podem ainda incluir uma modalidade onde a população celular terapêutica é uma população de células mononucleares. Os aspectos e modalidades anteriores podem ainda incluir uma modalidade onde, antes da injeção, seja realizada uma das etapas listadas a seguir: isolamento de células-tronco de uma amostra utilizando um método de enriquecimento das células da linhagem monocitária, cultivo de uma população terapêutica de células sob condições de enriquecimento das células da linhagem monocitária e adicionando células da linhagem monocitária em uma população celular terapêutica.

[00046] Outro aspecto da invenção corresponde a uma formulação terapêutica compreendida por um dispositivo capaz de realizar injeções de substâncias terapêuticas com medidas controladas no tecido isquêmico, onde o dispositivo compreende um reservatório de substância terapêutica e a substância terapêutica é uma população celular terapêutica enriquecida com células da linhagem monocitária. Em uma modalidade, a população terapêutica de células é a população de células mononucleares. Os aspectos e modalidades anteriores podem ainda incluir uma modalidade onde a população celular terapêutica enriquecida com células da linhagem monocitária corresponda a pelo menos 107 células da linhagem monocitária.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00047] A figura 1 mostra a comparação entre o número de monócitos injetados de forma intramiocárdica (número de células x 106, eixo X) e a melhoria na perfusão miocárdica (%, eixo Y) seis meses após o procedimento de terapia celular. A correlação entre o número de monócitos injetados e a melhora na perfusão miocárdica está ilustrada no gráfico e é estatisticamente significante (p < 0,05, GL = 6).

[00048] A figura 2 mostra a comparação entre o número de injeções intramiocárdicas (eixo X) e a melhora na perfusão miocárdica (%, eixo Y) seis meses após o procedimento de terapia celular. O gráfico mostra que a melhora na perfusão está relacionada com as células injetadas e não com o choque físico provocado pelas agulhas ou pela infusão de fluído no tecido, já que não foi observada significância estatística na correlação entre a melhora na perfusão miocárdica e o número de injeções (p = n.s.; GL = 6).

[00049] A figura 3 mostra as variações da classe na CCSAC em 18 meses de acompanhamento. Cada linha do gráfico representa um paciente incluído no ReACT® e a melhoria correspondente da classe na CCSAC durante os 18 meses de acompanhamento. O eixo X representa a classe na CCSAC (valor igual a 4 para angina pectoris refratária e 0 para ausência de dor). O eixo Y representa o acompanhamento dos pacientes ao longo do tempo (meses). A tabela a direita mostra a análise estatística da melhoria de classe na CCSAC em 3, 6, 12 e 18 meses de acompanhamento através do teste unicaudal de Wilcoxon. A variação na classe de angina é estatisticamente significante em relação à classificação inicial (p < 0,0125 (0,05/4) - com coeficiente de correção de Bonferroni).

[00050] A figura 4 mostra a variação na área isquêmica do miocárdio avaliada por cintilografia de estresse com tecnécio em 12 meses de acompanhamento. Cada linha do gráfico representa um paciente incluído no ReACT® e a correspondente melhora na área isquêmica medida por cintilografia em 12 meses de acompanhamento. O eixo X representa a porcentagem de área miocárdica isquêmica medida por cintilografia. O eixo Y representa o tempo de acompanhamento dos pacientes em meses (as análises cintilográficas foram realizada apenas em 6 e 12 meses após o tratamento). A tabela na parte inferior direita mostra a análise estatística da melhora da área miocárdica isquêmica medida por cintilografia com 6 e 12 meses de acompanhamento através do teste unicaudal de Wilcoxon. A variação na melhora da área isquêmica do miocárdio medida por cintilografia é estatisticamente significante em relação a isquemia basal (p < 0,025 (0,05/2) com coeficiente de correção de Bonferroni).

[00051] A figura 5: Os monócitos e macrófagos são o componente fundamental do sangue de cordão umbilical para o reparo cerebral após a oclusão da artéria cerebral média (OACM) em ratos. A) Após a OACM ocorre um dano considerável no hemisfério ipsilateral, particularmente no estriado, hipocampo e córtex. O tratamento com SCUH 48 horas após a OACM reduz o tamanho da lesão, enquanto que o sangue de cordão umbilical do qual foram retirados os monócitos CD14+ não produz esse efeito. B) O volume do infarto pós-OACM retorna aos mesmos níveis observados nos ratos que sofreram OACM e não foram tratados quando os monócitos CD14+ e os macrófagos são removidos do sangue de cordão umbilical. O volume do infarto nos ratos que receberam SCUH sem CD14 é significativamente maior do que no grupo tratado com SCUH.

[00052] A figura 6: Teste de Marcha para medida da assimetria motora. A) Após a OACM ocorre uma diminuição no número de passos dados com deficiência de membro. A administração de SCUH melhora a performance deste membro, enquanto que a recuperação é perdida com a remoção das células CD14+ (monócitos e macrófagos) da fração de SCUH. B) A injeção somente da porção de células CD14+ de SCUH melhora a função motora do membro dianteiro afetado.

[00053] A figura 7: A atividade espontânea é diminuída pela administração de células CD14+ de SCUH. Após a OACM os ratos se tornam hiperativos. A administração de macrófagos e monócitos de sangue de cordão umbilical reduz a atividade para níveis normais (basal) nos múltiplos parâmetros de movimentação, como: A) atividade horizontal, B) distância total percorrida na gaiola, C) atividade vertical (levantar-se nas patas traseiras) e D) giro no sentido anti-horário.

[00054] figura 8: Diagrama esquemático que descreve a ontogenia de monócitos/macrófagos. As células-tronco pluripotentes diferenciam-se, na medula óssea, em progenitores linfoides ou mieloides. Os progenitores de granulócitos-monócitos são derivados de uma célula progenitora mieloide comum antes dela se diferenciar em mieloblastos e monoblastos. Os monócitos diferenciam-se a partir dos monoblastos e em seguida migram da medula óssea para a corrente sanguínea. Os monócitos do sangue, depois de migrarem para os tecidos, diferenciam-se em diversos tipos de macrófagos residentes de acordo com a localização anatômica. Por outro lado, no início do processo inflamatório, o recrutamento e a migração transendotelial dos monócitos é aumentada por uma série de moléculas quimiotácticas e de adesão que são expressadas pelas células inflamatórias. Os monócitos recrutados migram através dos gradientes quimiotáctico e de oxigênio existentes entre o tecido normal e o lesionado e se acumulam nos núcleos hipóxico-inflamatórios na isquemia, ou tumores sólidos, ou doenças inflamatórias crônicas, antes de se diferenciarem em macrófagos recrutados que possuem polarização M1 ou M2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS DA INVENÇÃO

[00055] A presente invenção trata da grande necessidade de prover métodos e composições para o tratamento de isquemia e para a melhoria da perfusão geral. Um tratamento de preferência é o tratamento da isquemia do miocárdio e angina. Os métodos e composições dependem em parte da surpreendente descoberta de que populações de células-tronco enriquecidas com células da linhagem monocitária aumentam a eficácia observada a partir de dados obtidos de terapias com células-tronco.

[00056] A medula óssea e as células-tronco derivadas de medula óssea são uma fonte natural de um amplo espectro de citocinas que estão envolvidas no controle dos processos inflamatório e de angiogênese.

[00057] Durante os vários estágios de angiogênese diversas citocinas são expressas como o fator de necrose tumoral alfa (TNFa), interleucinas (IL), interferon gama (IFN-g) e o fator de estimulação de colônias macrofágicas (MCSF). Essas citocinas induzem as células de músculo liso a expressarem colagenase intersticial e estromelisina que degradam o colágeno local resultando na diminuição da espessura da parede dos vasos sanguíneos e abaulamento. As citocinas expressas na parede dos vasos são potentes quimio-atratores das células inflamatórias, induzem a expressão de moléculas de adesão no endotélio e seus contra-ligantes nos leucócitos, promovem a atividade plaquetária e trombose e inibem a trombólise.

[00058] Os monócitos ou promonócitos da medula óssea podem ser ativados em resposta a estímulos quimiotáticos e sofrerem a diferenciação final em macrófagos. Os macrófagos possuem um papel fundamental na angiogênese devido a sua capacidade em secretar protease, fatores de crescimento, monocinas e da sua influência em cada fase do processo de angiogênese como as alterações na matriz extra-celular local, indução da migração e proliferação das células endoteliais e inibição do crescimento vascular com formação de capilares diferenciados.

[00059] O processo fisiopatológico das doenças isquêmicas consiste na redução da perfusão sanguínea em certas áreas do tecido. As células da área hipoperfundida sofrem com a falta de aporte suficiente de oxigênio e portanto são incapazes de realizar as suas funções naturais. Nesse cenário, a indução da angiogênese pode melhorar a função tecidual pelo resgate e recrutamento das células hibernantes através do aumento do aporte de oxigênio.

[00060] A população padrão de pacientes com angina refratária, miocárdio viável e função ventricular esquerda preservada ou levemente deprimida é a candidata ideal para o emprego da terapia angiogênica através da injeção intramiocárdica de populações de células-tronco enriquecidas com células da linhagem monocitária, descrita na presente invenção.

[00061] Iniciou-se um estudo clínico não randomizado de pacientes com angina refratária e função ventricular esquerda preservada ou levemente deprimida, onde a injeção intramiocárdica de CMMO é a única terapia para o aumento do fluxo sanguíneo miocárdico através da angiogênese que é o único efeito já bem estabelecido da terapia com células-tronco de medula óssea e também a única necessidade específica dessa população de pacientes.

Definições

[00062] A expressão "população terapêutica de células" aqui utilizada pode ser tanto uma população de células mononucleares quanto uma população de células-tronco capazes de se diferenciar em células da linhagem mesodérmica; assim como ambas.

[00063] O termo "paciente" é utilizado aqui para descrever um animal, preferencialmente um ser humano, para o qual o tratamento é fornecido, incluindo o tratamento profilático, utilizando células de acordo com a presente invenção. Para o tratamento de infecções, condições e doenças que são específicas de um animal específico assim como para o paciente humano, o termo paciente se refere a este animal específico. O termo "doador" é utilizado para descrever um indivíduo (animal, incluindo o ser humano) o qual ou quem doa sangue de cordão umbilical ou células de sangue de cordão umbilical para o uso em pacientes.

[00064] O termo "sangue de cordão umbilical" é aqui utilizado em referência ao sangue obtido de neonatos ou fetos, de preferência um neonato, e preferencialmente refere-se ao sangue que é obtido do cordão umbilical e/ou da placenta de recém-nascidos. O uso do sangue de cordão umbilical como fonte de células mononucleares é vantajoso porque ele pode ser obtido com relativa facilidade e sem trauma para o doador. Em contrapartida, a coleta de células de medula óssea é uma experiência traumática para o doador. As células de sangue de cordão umbilical podem ser utilizadas em transplantes autólogos ou alogênicos, quando e se forem necessárias. O sangue de cordão umbilical é obtido preferivelmente pela drenagem direta do cordão e/ou aspiração (com uso de agulha) dos vasos da raiz e distais na placenta já dequitada. O termo "células de sangue de cordão umbilical" utilizado aqui refere-se às células que estão presentes no conteúdo do sangue de cordão umbilical. Em uma modalidade, as células do sangue de cordão umbilical são células mononucleares posteriormente isoladas do sangue de cordão umbilical utilizando métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Em outra modalidade, as células de sangue de cordão umbilical podem ser adicionalmente diferenciadas antes da administração para o paciente.

[00065] O termo "quantidade efetiva" é utilizado aqui para descrever as concentrações ou quantidades de componentes como agentes de diferenciação, células de sangue de cordão umbilical, células precursoras ou progenitoras, células especializadas como células neurais e/ou neuronais ou gliais, permeabilizadores da barreira hemato-encefálica e/ou outros agentes que sejam efetivos na produção de um resultado desejado como a diferenciação de células tronco ou progenitoras em células especializadas, como células neurais, neuronais e/ou gliais, ou para o tratamento de doenças neurológicas ou outras condições patológicas incluindo danos do sistema nervoso central de um paciente, como o acidente vascular cerebral, infarto agudo do miocárdio, ou vítimas de acidentes ou para o transplante efetivo dessas células para o paciente que precisa ser tratado. De acordo com a presente invenção, as composições devem ser utilizadas para a realização de um transplante de células de sangue de cordão umbilical dentro de composições capazes de proporcionar uma mudança favorável no cérebro ou medula espinhal, ou nas condições ou doenças tratadas, onde essa mudança correspondem a uma melhoria (como a parada ou reversão da degeneração em uma condição ou doença, reduzindo assim o déficit neurológico ou melhorando a resposta neurológica) ou uma completa cura da condição ou doença tratada.

[00066] O termo "células-tronco" ou "células progenitoras" são utilizadas aqui de forma intercambiável entre si para se referir a células-tronco ou progenitoras derivadas do sangue de cordão umbilical. Os termos células-tronco e células progenitoras já são bem caracterizadas (por exemplo: Células-tronco: Progresso Científico e Futuros Caminhos da Pesquisa, relatório preparado pelo National Institute of Health em junho de 2001). O termo "células neurais" corresponde às células que possuem pelo menos uma indicação fenotípica neuronal ou glial, como apresentar coloração para um ou mais marcadores neuronais ou gliais ou que se diferenciam em células que apresentam marcadores neuronais ou gliais. O marcadores que podem ser utilizados para a identificação de células neuronais, de acordo com a presente invenção, são, por exemplo, proteína nuclear neurônio específica, tirosina hidrolase, proteína associada aos microtubulos, calbindina, entre outros. O termo células neurais pode também incluir células que são precursoras neurais, isto é, células-tronco ou progenitoras que se diferenciam em ou tornam-se células neurais ou células que em última instância possuem marcadores neurais ou gliais; tal termo inclui ainda células-tronco e/ou progenitoras que em última instância diferenciam-se em células neuronais e/ou gliais. Todas as células anteriores e sua progênie podem ser interpretadas como células neurais para os propósitos da presente invenção. Células-tronco neurais são células com a habilidade de proliferar, realizar auto-manutenção ou renovação ao longo do tempo de vida do organismo e de gerar clones relacionados a progênie neural. Células-tronco neurais dão origem a neurônios, astrócitos e oligodendrócitos durante o desenvolvimento e podem substituir algumas células neurais no cérebro adulto. Células-tronco neurais são células neurais para os propósitos da presente invenção. O termo "células neurais" e "células neuronais" são genericamente utilizados e são intercambiáveis em muitos aspectos da presente invenção. As células neurais preferencialmente utilizadas em certos aspectos da presente invenção incluem aquelas células que exibem um ou mais marcadores fenotípicos neurais/neuronais como: Musashi-1, Nestina, NeuN, β-tubulina classe III, GFAP, NF-L, NF-M, proteína associada a microtubulo (MAP2), S100, CNPase, glipicanas (principalmente glipicana 4), pentraxina neuronal II, PAS neuronal 1, proteína 43 associada a crescimento neuronal, proteína de extensão do prolongamento neurítico, vimentina, Hu, internexina, O4, proteína mielínica básica e pleiotrofina; entre outros.

[00067] Como utilizado aqui, uma "célula-tronco" é uma célula do embrião, feto ou adulto que possui, sob condições adequadas, a habilidade de sofrer diversas divisões celulares em cultivo sem diferenciar-se ou morrer. Além disso, uma célula-tronco é capaz de diferenciar-se em pelo menos dois tipos celulares distintos quando em condições apropriadas.

[00068] Como utilizado aqui, uma "célula-tronco pluripotente" possui a habilidade de diferenciar-se em pelo menos dois tipos celulares que pertencem a diferentes folhetos embrionários (mesoderme, endoderme e ectoderme) dos quais derivam todas as células do organismo. Células pluripotentes podem ser obtidas de embriões.

[00069] Uma "célula-tronco embrionária" é uma célula-tronco derivada de um embrião, tipicamente de um grupo de células chamado de massa interna, que faz parte do estado inicial do embrião (4 a 5 dias) também chamado de blastocisto. Depois de removidas do blastocisto, as células da massa interna podem ser cultivadas assim como qualquer outra célula-tronco.

[00070] Uma "célula-tronco adulta" é a célula-tronco isolada de um adulto (isto é, tecidos não-embrionários). As células-tronco adultas, assim como todas as células-tronco, são capazes de produzir cópias idênticas de si mesmas através de diversas passagens no cultivo. Essa propriedade é conhecida como "autorrenovação". As células-tronco adultas geralmente produzem células progenitoras e precursoras sob condições apropriadas, as quais podem também diferenciar-se ou desenvolver-se em tipos celulares maduros que possuem formas características e funções especializadas, por exemplo: células da parede dos vasos sanguíneos. Células-tronco adultas podem ser isoladas de diversos tecidos incluindo, como exemplo, cérebro, medula óssea, periósteo, sangue periférico, vasos sanguíneos, músculo esquelético, epitélio e aparelho digestivo, córnea, polpa dental, retina, fígado, pâncreas e tecido adiposo.

[00071] O termo "administração" é utilizado por todo o relatório descritivo para descrever o processo no qual as células, objeto dessa invenção, como células de sangue de cordão umbilical obtidas do sangue de cordão umbilical, ou células mais diferenciadas também obtidas dele, são ministradas a um paciente com propósito terapêutico. As células objeto dessa invenção podem ser administradas de diversas maneiras, incluindo, mas não limitado às vias parenteral (esse termo refere-se à administração intravenosa, intra-arterial assim como outra via parenteral adequada), intratecal, intraventricular, intraparenquimal (incluindo a medula espinhal, tronco cerebral e córtex motor), intracisternal, intracranial, intra-estriatal, intranigral, entre outras as quais permitam que as células objeto dessa invenção migrem para o sítio alvo onde são necessárias. As células objeto dessa invenção podem ser administradas na forma de sangue de cordão umbilical integral (não processado) ou suas frações; que incluem a sua fração mononuclear ou a fração de células mononucleares, incluindo uma alta concentração de células-tronco ou progenitoras. A composição de acordo com a presente invenção pode ser utilizada sem nenhum tratamento ou com agentes de mobilização ou agentes de diferenciação (não-tratada, isto é a amostra de sangue de cordão umbilical não sofreu nenhum tratamento anterior para a promoção da diferenciação das células) ou depois de sofrer tratamentos (tratada) com agentes de diferenciação ou outros agentes que provoquem a diferenciação de certas células tronco e/ou progenitoras, na amostra de sangue de cordão umbilical, em células que apresentem um fenótipo diferenciado, como o fenótipo neuronal e/ou glial.

[00072] Os monócitos podem ser administrados pela via sistêmica ou diretamente a um alvo anatômico, permitindo que as células diferenciem-se em resposta aos sinais fisiológicos que elas possam encontrar (por exemplo: diferenciação sítio-específica). Alternativamente, as células podem sofrer diferenciação ex vivo antes de administradas ao paciente.

[00073] A administração vai geralmente depender da doença ou condição a ser tratada e pode preferencialmente ocorrer pela via parenteral, por exemplo, intravenosa; pela administração no fluído cérebro-espinhal ou pela administração direta no tecido afetado do cérebro. Por exemplo, no caso da doença de Alzheimer, doença de Huntington e doença de Parkinson, a via de administração preferencial é o transplante direto no estriado (caudado e putâmen) ou diretamente na substância negra (doença de Parkinson). No caso da esclerose lateral amiotrófica (Doença de Lou Gehrig) e da esclerose múltipla a principal via de administração é através do fluído cérebro-espinhal. No caso da doença por armazenamento de lisossomos do sistema nervoso, a via preferencial de administração é a intravenosa ou através do fluído cérebro-espinhal. No caso do acidente vascular cerebral, a via preferencial de administração vai depender da localização do AVC, mas pode ser diretamente no tecido afetado (que pode ser prontamente determinada por ressonância magnética ou outra técnica de imagem) ou por via sistêmica. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a via de administração dos indivíduos pós-AVC é sistêmica, sendo administração intravenosa ou intra-arterial.

[00074] O termo "pega" e "transplante" e "enxerto" são usados ao longo das especificações para descrever o processo nos quais as células objeto dessa invenção são distribuídas nos locais onde devem exercer seu efeito favorável, como reparar o dano no sistema nervoso central do paciente (que pode diminuir o déficit cognitivo e comportamental causado pelo dano), tratando uma doença neurodegenerativa ou os efeitos dos danos nervosos causados pelo AVC, doenças cardiovasculares, infarto agudo do miocárdio ou injúrias físicas ou trauma ou doenças genéticas ou danos ambientais ao cérebro e/ou medula espinhal, causado, por exemplo, por um acidente ou outra atividade. As células objeto dessa invenção podem ser distribuídas em áreas remotas do corpo através de qualquer uma das formas de administração descritas anteriormente, baseando-se na migração celular para a área apropriada para efetivar o transplante. Preferencialmente, as células são administradas com um permeabilizador da barreira hemato-encefálica.

[00075] O termo "não-oncogênico" refere-se ao fato de que as células não originam neoplasias ou tumores. As Células-tronco e/ou progenitoras utilizadas na presente invenção são preferencialmente livres de neoplasias e câncer.

[00076] O termo "doenças neurodegenerativas" é utilizado aqui para descrever as doenças causadas por danos no sistema nervoso central e nas quais o dano pode ser reduzido ou amenizado através do transplante de células neurais para as áreas afetadas do cérebro e/ou medula espinhal do paciente, de acordo com a presente invenção. Exemplos de doenças neurodegenerativas que podem ser tratadas utilizando células neurais e métodos de acordo com a presente invenção são doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (doença de Lou Gehrig), doença de Alzheimer, Síndrome de Rett, doença por armazenamento de lisossomos do sistema nervoso ("doença da substância branca" ou doença da demielinização glial, como descrito, por exemplo por Folkerth, J. Neuropath. Exp. Neuro., Setembro 1999, 58:9), incluindo as doenças de Sanfilippo, Gaucher, Tay-Sachs (deficiência da beta-hexosaminidase) e outras doenças genéticas, esclerose múltiplas, traumas e injúrias cerebrais causadas por isquemia, acidentes, fatores ambientais, etc., danos na medula espinhal, ataxia e alcoolismo. Além disso, a presente invenção pode ser utilizada para reduzir e/ou eliminar os efeitos negativos no sistema nervoso central do paciente provocados pelo acidente vascular cerebral ou infarto agudo do miocárdio, que são causados pela falta de aporte sanguíneo ou isquemia em um local do cérebro desse paciente, ou que ocorreu por lesão física no cérebro ou na medula espinhal. As doenças neurodegenerativas também incluem distúrbios no desenvolvimento neuronal, como, por exemplo, autismo e doenças neurológica co-relatas como a esquizofrenia; entre outras.

[00077] O termo "terapia gênica" é utilizado ao longo desse relatório descritivo para descrever a transferência e inserção estável de novas informações genéticas em células para tratamentos terapêuticos de doenças ou distúrbios. O gene estranho é transportado para uma célula que se prolifera para espalhar esse novo gene através de toda a população de células. Então, as células de sangue de cordão umbilical ou células progenitoras podem ser alvo da transferência de genes tanto antes da diferenciação quanto depois da diferenciação em fenótipo neural. As células-tronco ou progenitoras de sangue de cordão umbilical objeto da presente invenção podem ser geneticamente modificadas com sequências heterólogas de nucleotídeos com um promotor funcional ligado que guia a expressão da sequências heteróloga de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode codificar para diversas proteínas ou peptídeos de interesse. Os produtos gênicos produzidos pelas células geneticamente modificadas podem ser coletados in vitro ou as células utilizadas como veículos para a transferência de produtos gênicos (isto é, terapia gênica).

Células da linhagem monocitária

[00078] Como exemplo, a metodologia e orientações para o desenvolvimento de diversos aspectos da presente invenção são descritas a seguir, não se limitando a estas descritas aqui.

[00079] As várias células e populações celulares discutidas ao longo dessa invenção podem ser caracterizadas por diversos métodos, incluindo, como exemplo, por características de crescimento (por exemplo: capacidade de duplicação populacional, tempo de duplicação, número de passagens até a senescência), análise de cariótipo (por exemplo: cariótipo normal, linhagem materna ou neonatal), citometria de fluxo (por exemplo: detecção de epitopos), perfil de expressão gênica (por exemplo: micro e macro-arranjos gênicos, reação em cadeia da polimerase (PCR) - como PCR com transcriptase reversa, PCR em tempo real e PCR convencional), arranjos de proteínas, secreção de proteínas (por exemplo: ensaio de coagulação ou análise em meio condicionado para células dendríticas plasmocitoides, Imunoensaio enzimático - ELISA), reação linfocitária mista (por exemplo: medida da estimulação de células mononucleares de sangue periférico - PBMCs) e/ou outros métodos já bem caracterizados.

[00080] As populações de células ou células isoladas podem ser utilizadas para iniciar ou semear culturas celulares para uso na presente invenção. Essas populações de células ou células isoladas podem ser transferidas para recipientes estéreis de cultura tecidual, cobertos ou não com matriz extra-celular ou ligantes como, laminina, colágeno (nativo, desnaturado ou reticulado), gelatina, fibronectina e outras proteínas de matriz extracelular. As células podem ser cultivadas em qualquer meio de cultura capaz de manter o crescimento das células. Exemplos desse tipo de meio (qualquer um que seja bem caracterizado e apropriado para o tipo celular ou a população de células ou qualquer outro meio já conhecido disponível), DMEM (baixa e alta glicose), DMEM avançado, DMEM/MCDB 201, meio padrão de Eagle, meio F10 de Ham (F10), meio F12 de Ham (F12), meio Dubelcco 17 modificado por Iscove, meio de crescimento para células-tronco mesenquimais (MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640 e CELL-GRO-FREE. Os meios de cultura podem ser suplementados com um ou mais componentes apropriados para a células ou população de células, incluindo, por exemplo, soro fetal bovino (FBS), soro equino (ES), soro humano (HS), beta-mercaptoetanol (BME ou 2-ME), um ou mais fatores de crescimento (por exemplo: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de inibição de leucócitos (LIF) e eritropoietina (EPO)); aminoácidos, incluindo L-glutamina e L-valina e um ou mais antibióticos e/ou agentes antimicóticos para controlar a contaminação microbiana (como, por exemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina e nistatina; sozinhos ou em combinação). As células devem ser semeadas nos recipientes de cultivo em uma densidade que permita a expansão celular.

[00081] Os métodos para a seleção dos meios de cultura mais apropriados, preparação dos meios de cultura e as técnicas de cultivo celular são baseados no tipo de célula ou população celular já são bastante conhecidos e estão descritos em diversas fontes, como: Doyle et al., (eds.), 1995, CELL &TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester; and Ho and Wang (eds.), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Boston.

[00082] As células e populações celulares adequadas para uso na presente invenção podem ser expandidas em cultura em um meio de cultura definido contendo pelo menos um fator que estimule a proliferação das células (apropriado para a aplicação desejada das células ou populações celulares). Esse fator requerido pode ser, por exemplo: TGF-β 1, 2 e 3, proteínas morfogenéticas ósseas (BMP-2, -4, -6, -7, -11, -12 e -13), soro-albumina, membros da família dos fatores de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento derivado de plaquetas - AA e -BB, plasma rico em plaquetas, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I e -II), fator de diferenciação de crescimento (GDF-5, -6, -8, -10, -11), peptídeo semelhante ao glucagon I e II (GLP-I e II), GLP-I e GLP-II miméticos, exendina-4, ácido retinóico, hormônio paratireoideano, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta-mercaptoetanol, fator de crescimento epidérmico (EGF), gastrina I e II, quelantes de cobre como: trietileno pentamina (TEPA), forskolina, butirato de sódio (BS), ativina, betacelulina, noggin; fator de crescimento neural, nodal, insulina:transferrina:selênio (ITS), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), extrato de pituitária bovina, proteína neurogênica associada a ilhas (INGAP), inibidores de proteassoma, inibidores da via de sinalização notch, inibidores da via de Hedgehog; ou combinações desses. Alternativamente, as células adequadas ao uso na presente invenção podem ser expandidas pelo cultivo em meios condicionados (isto é, meios de cultura específicos, nos quais uma população de células é cultivada para a produção de fatores solúveis no meio que sejam necessários para a população ou células de interesse). Em algumas modalidades, as células são removidas do meio e os fatores produzidos continuam em solução. Esse meio pode então ser utilizado para suprir diferentes células ou populações celulares.

[00083] Durante a hematopoiese para a linhagem monocitária, a célula-tronco hematopoiética primeiro se diferencia em um progenitor mieloide comum e depois em um mieloblasto. O mieloblasto diferencia-se então em monoblasto. O monoblasto é a primeira célula que propriamente faz parte da linhagem de células monocitárias já que ele está comprometido com a diferenciação em monócito. O monoblasto diferencia-se em promonócito. e, o promonócito então se diferencia em monócito. Os monócitos podem então sofrer monocitopoiese tanto em macrófagos quanto em células dendríticas mieloides. A linhagem monocitária de células inclui portanto todos os tipos celulares começando pelos monoblastos até toda as células pertencentes a via da monocitopoieses.

[00084] Os monoblastos são facilmente identificados por aqueles versados na técnica. Os monoblastos possuem entre doze e vinte micra de diâmetro. O volume relativo do núcleo em relação ao citoplasma é de 4:1 à 3:1 e, como a maioria dos blastos mieloides, possuem um núcleo de redondo a oval com estrutura fina da cromatina. São visíveis de um a quatro nucléolos. O núcleo pode ser central ou excêntrico e podem ser evidenciados indentação e dobramentos. O citoplasma é agranular, de leve a moderadamente basófilo e geralmente apresenta destacadas a periferia e uma zona perinuclear proeminente.

[00085] De forma similar, os monócitos são facilmente identificados por aqueles versados na técnica. Os monócitos possuem geralmente entre treze e vinte e cinco micra de diâmetro. Os monócitos são a maior célula sanguínea branca fagocítica circulante e possuem um núcleo único, regular e bem definido com forma ovoide ou de rim. A maior área do citoplasma possui muitas vesículas para o processamento de material estranho que incluem pequenos grânulos citoplasmáticos azurofílicos. Os monócitos geralmente ficam na circulação sanguínea de um a três dias até então migrarem para outros tecidos do corpo como os pulmões e o fígado. Após a migração para os tecidos, os monócitos sofrem monocitopoiese em diferentes tipos de macrófagos dependendo do tipo de tecido para o qual migraram. Os promonócitos são similares aos monócitos, mas o núcleo destes é um pouco mais regular do que dos monócitos maduros e a proporção entre núcleo e citoplasma é maior.

[00086] As células da linhagem monocitária podem ser isoladas de diversas fontes através dos métodos disponíveis que são amplamente caracterizados. Medula óssea, sangue periférico e sangue de cordão umbilical são exemplos de fontes. Além dessa forma de obtenção diretamente dos sujeitos, as células da linhagem monocitária podem ser obtidas através da diferenciação de células-tronco, incluindo, mas não se limitando às células-tronco hematopoiéticas.

Populações de células mononucleares

[00087] As populações de células mononucleares podem ser isoladas de diversas fontes e maneiras. Um exemplo é o uso de gradiente de densidade (variando de 1,0g/L a 1,1g/L; preferencialmente 1,077g/L) como demonstrado nos Exemplos a seguir. As fontes incluem, mas não se limitam a, medula óssea, sangue periférico e sangue de cordão umbilical. Além dessas fontes de obtenção diretamente dos sujeitos, as células mononucleares podem ser obtidas através da diferenciação de células-tronco, incluindo, mas não se limitando às células-tronco hematopoiéticas.

Populações de células-tronco

[00088] As células-tronco adequadas para o uso nos métodos descritos na presente invenção podem ser obtidas de qualquer tecido que possa possuir células-tronco capazes de diferenciarem-se em pelo menos um tipo celular da linhagem mesodérmica.

[00089] As células-tronco derivadas de medula óssea são o tipo mais estudado de células-tronco adultas. Atualmente, essas células-tronco derivadas de medula óssea são utilizadas clinicamente para repor diversos componentes do sangue e do sistema imune na medula óssea através de transplante. Nos dias de hoje, já foram identificados dois tipos principais de células-tronco na medula óssea: as células-tronco hematopoiéticas (CTH - HSC, ou células CD34+), que são capazes de se diferenciar em todos os tipos de células do sangue e do sistema imune; e as células-tronco estromais (mesenquimais - CTM -MSC) que geralmente considera-se que formam ossos, cartilagens, músculo e gordura. Entretanto, os dois tipos de células-tronco derivados de medula óssea demonstraram possuir uma plasticidade muito mais ampla do que se pensava anteriormente.

[00090] Existem diversas maneiras, já muito bem caracterizadas, para o isolamento e cultivo de células-tronco passíveis de utilização. Como exemplo: as células-tronco hematopoiéticas podem ser obtidas do sangue de cordão umbilical, o qual é uma fonte muito rica nesse tipo de células. As células-tronco hematopoiéticas isoladas do sangue de cordão umbilical e aquelas isoladas da medula óssea ou do sangue periférico comportam-se essencialmente de maneira idêntica quando utilizadas em transplantes. Além disso, a placenta e a medula óssea são excelentes fontes de células-tronco mesenquimais. De forma similar, as células-tronco que podem se diferenciar em células da linhagem mesodérmica podem ser também obtidas do tecido adiposo (aparentemente não são tão plásticas quanto as células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea) e possivelmente existem células-tronco semelhantes em outros tecidos.

[00091] As células-tronco também podem ser isoladas de diversos tecidos através do uso de anticorpos que se ligam a marcadores específicos das células-tronco (por exemplo: SH2, SH3 e SH4, ver em U.S. Pat. N° 5.486.359 e 5.837.539) ou pelo uso de anticorpos que se ligam a marcadores específicos de células que não são desejadas, como CD4+ e CD8+ (células-T), CD45+ ( células panB), GR-1 (granulócitos) e lad (células diferenciadas apresentadoras de antígeno). Um exemplo deste tipo de protocolo pode ser encontrado em Izaba e outros, I. Exp. Med., v. 176, p. 1693-1702 (1992).

[00092] As células-tronco hematopoiéticas podem ser obtidas de maneira semelhante das diversas fontes como o sangue de cordão umbilical, medula óssea e sangue periférico mobilizado. A purificação das células-tronco hematopoiéticas pode ser realizada com o uso de procedimentos por afinidade a anticorpos (por exemplo: uso de anticorpos que ligam CD34 que é específico de células hematopoiéticas). Um procedimento de isolamento por coluna de afinidade que utiliza tais anticorpos para a separação das células pode ser encontrado em Ho e outros, Stem Cells, v.13, supl. 31, p. 100-105 (1995). Os métodos de expansão em cultivo e purificação por afinidade também são bastante conhecidos para as células-tronco mesenquimais (vide por exemplo, U.S. PAT. n° 5.486.359 e 5.837.539). Outros exemplos desses métodos de isolamento são tratados em U.S. Pat. N° 6.087.113, U.S. Pat. N° 6.261.549, U.S. Pat. N° 5.914.262, U.S. Pat. N° 5.908.782, and US20040058412.

Populações terapêuticas de células enriquecidas com células da linhagem monocitária

[00093] As populações terapêuticas de células podem ser enriquecidas por qualquer método amplamente caracterizado que esteja disponível. Uma alternativa inclui o isolamento da população de células-tronco e então seleção, dentro dessa população, daquela que é enriquecida com monócitos como resultado final do isolamento. Esse método está essencialmente descrito no Exemplo a seguir, exceto pelo enriquecimento ter sido determinado após o uso da população mononuclear. Os Exemplos podem ser prontamente modificados para que o enriquecimento de monócitos seja mensurado antes do uso e então selecionadas aquelas populações nas quais existe um enriquecimento suficiente e/ou submetendo essas populações a um enriquecimento adicional. Considerando que as populações de células-tronco e as populações de células mononucleares contém células que podem ser induzidas à diferenciação em células da linhagem monocitária, um método de enriquecimento corresponde a adição de um ou mais fatores apropriados à indução de tal diferenciação (que é amplamente consolidado) na população de células. Outro exemplo de enriquecimento consiste na adição, na população celular, de uma ou mais citocinas ou outros fatores de crescimento que promovam a indução da divisão celular nas células da linhagem monocitária ou do seu crescimento mais acelerado do que nas células que não pertencem à linhagem monocitária e/ou adição de um ou mais fatores que inibem seletivamente a divisão celular ou o crescimento das células que não pertencem à linhagem monocitária. Finalmente, células da linhagem monocitária obtidas ou cultivadas separadamente podem ser adicionadas à população terapêutica de células.

EXEMPLOS

[00094] Os exemplos a seguir demonstram usos representativos dos métodos e composições expostos nesse relatório descritivo.

Exemplo 1 - Isolamento da População de Células Mononucleares Enriquecida com Células da Linhagem Monocitária

[00095] A preparação de células mononucleares de medula óssea foi realizada através de um gradiente de densidade padrão (variando de 1,0g/L a 1,1 g/L, preferencialmente 1,077g/L). As preparações celulares, como discutido no Exemplo 2 que segue, possuem diferentes quantidades de células da linhagem monocitária.

[00096] A preparação de CMMO foi realizada através da separação por gradiente de densidade, variando de 1,0g/L a 1,1 g/L, preferencialmente 1,077g/L, utilizando Ficoll Paque PREMIUM® (GE Healthcare). O sangue de medula óssea, 35mL, foi cuidadosamente adicionado em 10mL de Ficoll, por tubo, sem misturar, mantendo intacta a tensão superficial do Ficoll. Esse procedimento foi repetido em 9 tubos, num total de 10 tubos por paciente. Os tubos foram então centrifugados a 350g - sem o uso de freios, por 40 minutos à 20°C. Após a separação por densidade, o anel de células mononucleares (interface plasma-Ficoll) foi cuidadosamente coletado dos 10 tubos e suspendido em 4 tubos com solução salina 0,9% até completar um volume total de 45 mL por tubo. Os 4 tubos foram então centrifugados a 400g, por 10 minutos à 20°C, para separar as células do Ficoll residual. Após o descarte do sobrenadante, as células mononucleares de todos os tubos foram coletadas e combinadas em um único tubo contendo um volume total de 40mL de solução salina 0,9%. As células mononucleares foram centrifugadas novamente a 400g, por 10 minutos à 20°C. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado de células suspendido em 10 mL de solução salina 0,9%. Assim que as células foram aprovadas no critérios de qualidade que incluem: esterilidade, viabilidade e ausência de endotoxinas, seguindo as boas práticas de manipulação (GMPs) e a contagem celular automática apropriada foi realizada; as células foram suspendidas em solução salina 0,9% com 20% de soro autólogo para manter a viabilidade celular (o soro autólogo foi previamente filtrado com um filtro de 0,22μm para eliminar possíveis células contaminantes) - na concentração final de 1x107 células/mL. A solução final de células mononucleares foi filtrada em filtro de 100μm para eliminação de possíveis grumos celulares.

Exemplo 2 - Correlação entre o Número de Monócitos Injetados e o Resultado Terapêutico

[00097] O exemplo a seguir apresenta os dados dos pacientes tratados com o uso dos métodos e composições estabelecidos aqui e adiante.

[00098] O objetivo deste estudo foi avaliar a segurança e a eficácia de um protocolo de desenho proprietário, o Protocolo de Terapia Celular para Angina Refratária (ReACT), no qual uma série de múltiplas injeções intramiocárdicas de uma formulação específica de CMMO foi realizada como terapia cirúrgica única para estes pacientes.

[00099] O ReACT foi desenhado conforme as Boas Práticas de Manipulação (GMP) e critérios padrão do FDA.

[000100] Os pacientes incluídos nesse protocolo devem sofrer de angina pectoris refratária, com miocárdio viável (diagnosticado por cintilografia de estresse com tecnécio), sem disfunção ventricular esquerda (fração de ejeção de pelo menos 45%) e não candidatos à revascularização miocárdica (seja por PTCA ou CABG).

[000101] Oito pacientes com angina refratária foram incluídos no estudo, no período de setembro de 2005 a julho de 2007. Todos os pacientes já haviam realizado cirurgias de revascularização uma (4 pacientes), duas (3 pacientes) ou quatro (1 paciente) vezes, sem haver melhora da angina.

[000102] Adicionalmente, quatro pacientes com angina refratária foram incluídos e realizaram o ReACT, mas eles precisaram receber simultaneamente a revascularização miocárdica e por esse motivo foram excluídos da análise. Esses pacientes estão sendo acompanhados em um grupo separado.

[000103] Os pacientes incluídos nesse estudo foram rotineiramente atendidos no Hospital São Paulo, em São Paulo, São Paulo, Brasil; um Hospital Universitário Federal que é referência para as doenças coronarianas. O protocolo de estudo (ReACT) foi aprovado pelos comitês de ética local e nacional (CEP - EPM - 0314/05) e todos os pacientes firmaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Os pacientes com Angina Refratária são definidos como aqueles pertencentes a classe funcional IV (angina no repouso) de acordo com a Classificação de Angina da Sociedade Cardiovascular Canadense (CCSAC) apesar de uma terapia medicamentosa máxima, não candidatos a revascularização miocárdica convencional e com miocárdio viável identificado. A inelegibilidade para a revascularização - seja percutânea ou cirúrgica - foi determinada por pelo menos 2 cardiologistas e 2 cirurgiões cardiovasculares com base nas angiografias coronárias mais recentes (últimos 6 meses) do paciente. Os critérios de exclusão foram: (1) fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) < 45% no ecocardiograma transtorácico; (2) ausência de miocárdio viável nos exames nucleares de imagem cardíaca; (3) sorologia positiva para a síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV), Hepatite tipo A, B e C, vírus T-linfotrópico humano (HTLV) ou Doença de Chagas; (4) Doenças significativas nas valvas cardíacas; (5) Doença renal crônica em diálise; (6) uso abusivo de álcool e fármacos; (7) qualquer outra condição médica com sobrevivência estimada menor do que 5 anos; (8) participação anterior em estudos de terapia celular e (9) gravidez.

[000104] Um Estudo Clínico prospectivo Fase I/IIa foi conduzido com a realização de um procedimento único de infusão intramiocárdica de células mononucleares de medula óssea (preparadas de acordo com o Exemplo 1) através de múltiplos pontos de punção em pacientes que sofrem de angina refratária, com função ventricular esquerda normal ou levemente deprimida. Os pacientes com angina refratária foram definidos rigorosamente como aqueles pertencentes a classe funcional IV da Classificação de Angina da Sociedade Cardiovascular Canadense (CCSAC), com tratamento farmacológico completamente otimizado e sem nenhum procedimento médico ou intervencionista possível (seja CABG e/ou PTCA) - pacientes sem opção.

[000105] Para cada paciente, cada 100cc de medula óssea foi aspirado das cristas ilíacas e armazenado em solução salina com concentração de 80U.I de heparina por mL. As células mononucleares foram isoladas por gradiente de densidade e diluídas para uma concentração final de 107 células/mL; de acordo com o ReACT e as Boas Práticas de Manipulação (GMP). Foram realizados testes de viabilidade celular, contagem total de células mononucleares, contagem diferencial de leucócitos e conteúdo de células CD34+, assim como testes microbiológicos aeróbios e anaeróbios. Amostras foram armazenadas para referência futura.

[000106] Foi realizada uma série de múltiplas injeções da formulação celular diretamente no miocárdio do ventrículo esquerdo por via cirúrgica através de toracotomia lateral esquerda, de acordo com o descrito a seguir: 0,2mL (2 x 106 células) por injeção, com 1cm de distância entre as injeções e infusão em 1cm de profundidade no epicárdio. O número de injeções (40 a 90) variou entre os pacientes de acordo com a extensão das áreas de miocárdio viável determinadas nos exames nucleares de imagem: ressonância nuclear magnética (RNM) e cintilografia, e das dimensões do ventrículo esquerdo. Acompanhamento

[000107] O ritmo cardíaco dos pacientes foi monitorado por 48 horas após a cirurgia. A avaliação clínica da CCSAC foi realizada nos meses 3, 6, 12 e 18 após a cirurgia. Ecocardiogramas foram realizados antes do tratamento e nos meses 1, 3, 6 e 12 após a cirurgia e a ressonância nuclear magnética do coração realizada pré-tratamento e nos meses 6 e 12, a fim de verificar a segurança do tratamento. Os exames nucleares de imagem (cintilografia de perfusão miocárdica com tecnécio estresse induzida e RNM) foram realizados antes da cirurgia e com 6 e 12 meses após o procedimento para avaliar a porcentagem de área isquêmica no miocárdio. É importante notar que nas análises objetivas das áreas isquêmicas do coração (cintilografia de estresse), as áreas miocárdicas isquêmicas viáveis nas paredes específicas do ventrículo esquerdo detectadas pela cintilografia de estresse com tecnécio antes da injeção da formulação celular foram consideradas, em todos os pacientes, como correspondentes a 100% de isquemia. Essas áreas isquêmicas reversíveis do coração foram consideradas como valores basais em comparação com as análises cintilográficas em 6 e 12 meses de acompanhamento. As análises cintilográficas foram realizadas somente nos meses 6 e 12 do acompanhamento.

Análise estatística

[000108] O teste não paramétrico de Friedman foi utilizado para identificar as mudanças da classe de angina na CCSAC em 3, 6 e 12 meses de acompanhamento e na área isquêmica viável do miocárdio em 6 e 12 meses de acompanhamento. Comparações post hoc foram realizadas com a utilização do teste de Wilcoxon com fator de correção de Bonferroni. A correlação entre os desfechos (classe de angina e área isquêmica viável do miocárdio após o procedimento) e o número de injeções foi identificada pelo teste de Spearman. O teste não paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para comparar a função do ventrículo esquerdo medida por ecocardiograma antes e 12 meses após o procedimento.

[000109] A melhora na perfusão miocárdica de um paciente (ou falta dela) foi correlacionada com a dose de células da linhagem monocitária de acordo com o detalhamento a seguir. Os pacientes que receberam um maior número de células da linhagem monocitária apresentaram uma redução na classe de angina (CCSAC) de IV para 0.

[000110] A Tabela 1A mostra os resultados da soroconversão completa (titulação ≥ 1:4) em indivíduos humanos imunizados somente com proteínas recombinantes ou proteínas recombinantes combinadas com OMV.

[000111] Tabela1A: Idade, sexo, Classe na CCSAC antes do tratamento, Classe na CCSAC 6 meses após o tratamento, número de monócitos injetados pela via intramiocárdica e melhoria na perfusão miocárdica seis meses após o tratamento.

[000112] A Tabela 1B abaixo mostra a variação entre a Classificação de Angina e a Área de Miocárdio Isquêmico após a infusão da formulação de CMMO enriquecida com monócitos.

*** As áreas miocárdicas isquêmicas viáveis nas paredes específicas do ventrículo esquerdo detectadas pela cintilografia de estresse com tecnécio antes da injeção da formulação celular foram consideradas, em todos os pacientes, como correspondentes a 100% de isquemia. As análises com 6 e 12 meses de acompanhamento refletem a porcentagem de redução da área de isquemia miocárdica nessas paredes.
** De acordo com a Classificação de Angina da Sociedade Cardiovascular Canadense.
& Determinada por Cintilografia de Estresse com Tecnécio.
* A variação na classe de angina e área isquêmica do miocárdio é estatisticamente significante se p < 0,0125 (0,05/4) e p < 0,025 (0,05/2), respectivamente, em relação aos valores basais (utilizado o fator de correção de Bonferroni).
Meses: meses de acompanhamento dos pacientes.

[000113] Existe uma forte correlação entre o número de monócitos injetados por via intramiocárdica e a redução ou eliminação dos sintomas de angina e entre o número de monócitos injetados por via intramiocárdica e a melhora na perfusão miocárdica, que pode ser comprovada pelos dados apresentados na tabela 1A. A figura 1 ilustra graficamente essa segunda correlação (isto é, melhora na perfusão miocárdica). Além disso, a correlação é estatisticamente significante (p < 0,05), demonstrando então a eficácia dos métodos e composições aqui descritos .

[000114] A fim de descartar o efeito do número de injeções, que em certo grau correlaciona-se à dose de células da linhagem monocitária, foi determinada a correlação entre o número de injeções e a melhora na perfusão miocárdica. A figura 2 ilustra graficamente a ausência de tal relação. Não foi observada correlação estatisticamente significante, como indicado na figura 2.

Melhora Subjetiva da Isquemia Miocárdica

[000115] Após o procedimento ReACT de injeção miocárdica, ocorreu uma melhoria progressiva na mediana da classificação de angina, variando de classe 4 (valor de referência basal) para 2,5 (p = 0,008), 2 (p = 0,008), 1 (p = 0,004) e (p = 0,004) respectivamente em 3, 6, 12 e 18 meses de acompanhamento (figura 3 e Tabela 1B).

[000116] A Tabela 2, a seguir, mostra o coeficiente de correlação de Sperman (rs) entre o conteúdo de monócitos, linfócitos e células CD34+ na formulação de CMMO, a melhora na Classificação de Angina e na porcentagem (%) de área miocárdica isquêmica no acompanhamento dos pacientes. Por razões técnicas não foram realizadas contagens e percentuais celulares para o primeiro paciente incluído no estudo, participam desta análise apenas 7 pacientes.

* De acordo com a Classificação de Angina da Sociedade Cardiovascular Canadense.
& Melhoria detectada por cintilografia de estresse com tecnécio. Meses: Meses de acompanhamento.

Melhora Objetiva na Isquemia Miocárdica

[000117] Uma redução progressiva da área de miocárdio isquêmico foi observada pela cintilografia de estresse com tecnécio após 6 meses (diminuição de 39,4%, p = 0,06) e 12 meses (diminuição de 84,4%, p < 0,004), apesar da diferença ser estatisticamente significante somente em 12 meses. É importante notar que nas análises objetivas das áreas isquêmicas do coração (cintilografia de estresse), as áreas miocárdicas isquêmicas viáveis nas paredes específicas do ventrículo esquerdo detectadas pela cintilografia de estresse com tecnécio antes da injeção da formulação celular foram consideradas, em todos os pacientes, como correspondentes a 100% de isquemia. Essas áreas do coração com isquemia reversível inicial foram consideradas como basais quando comparadas com as análises cintilográficas em 6 e 12 meses de acompanhamento (figura 4 e Tabela 1B).

Correlação entre a formulação ReACT e a melhora

[000118] O ReACT possui uma porcentagem determinada de monócitos e essa formulação específica correlaciona-se positivamente com a resposta clínica, especificamente a melhora de classe na CCSAC (Tabela 2).

[000119] Outros tipos celulares como Linfócitos ou células CD34+ não apresentam correlação com a melhora de classe na CCSAC ou a melhoria na área de miocárdio isquêmico.

[000120] Os resultados desse estudo demonstram que o ReACT pode beneficiar os pacientes com angina refratária, que não são candidatos à revascularização miocárdica convencional e apresentam sintomas de angina no repouso apesar da máxima otimização da terapia medicamentosa. Nossos resultados demonstram uma melhora dos sintomas anginosos e diminuição na extensão da área de miocárdio isquêmico. Os mecanismos causais mais prováveis para essas melhorias são as propriedades angiogênicas da formulação ReACT.

[000121] Nesse estudo, o alívio dos sintomas anginosos inicia-se logo aos 3 meses após o procedimento e estende-se até os 12 meses, com melhora sustentada até o 18° mês; sugerindo que a angiogênese começa precocemente e continua evoluindo até 18 meses após o procedimento (ver Tabela 1B e figura 3). Além disso, sugere-se que o efeito é sustentado e não transitório já que o alívio dos sintomas melhora progressivamente em todos os pacientes; um resultado diferente de outros estudos (6). Assim, a porcentagem de isquemia miocárdica demonstra uma tendência decrescente, atingindo a significância estatística em 12 meses. O fato de a melhora dos sintomas ocorrer muito antes da melhora na perfusão pode ser explicado pela baixa resolução espacial do teste nuclear de imagem e da alta variabilidade, que impedem a detecção de pequenas mudanças; especialmente em uma população tão pequena de pacientes.

[000122] A história natural da angina refratária pode apresentar remissão espontânea mesmo na angina severa (9, 31, 54, 60). Observando, os grupos medicamente tratados em estudos randomizados, entre 0 e 19% dos pacientes incluídos nos estudos de revascularização miocárdica percutânea a laser e 0 a 32% daqueles incluídos nos estudos de revascularização miocárdica cirúrgica a laser apresentam uma melhora de pelo menos dois pontos na CCSAC em 12 meses e de 0 a 44% em 3 anos (38). Os resultados de melhora de classe na CCSAC descritos nessa invenção são muito melhores e mais convincentes, reforçados por claros teste de perfusão em estresse.

[000123] Os estudos de angina refratária incluem principalmente pacientes com disfunção ventricular esquerda moderada ou severa (13, 41, 57). Os resultados demonstram uma melhora superior dos sintomas anginosos e da qualidade de vida, ao invés de benefícios na fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE). Nesse estudo, todos os pacientes possuíam FEVE basal ≥ 45% e, como esperado, não houve mudança significativa na FEVE em 12 meses (p = 0,726). Esses resultados também sugerem angiogênese relacionada diretamente à infusão de células-tronco e não às punções miocárdicas como agentes promotores de angiogênese secundária. Por outro lado, a FEVE sustentada, assim como a melhora na perfusão miocárdica sugerem a ausência de déficit funcional relacionado à necrose do miocárdio ou fibrose que pudesse ter sido promovida pelas injeções ReACT intramiocárdicas; reforçando assim a segurança do procedimento.

[000124] A população padrão de pacientes com angina refratária, miocárdio viável e função ventricular esquerda preservada é a candidata ideal para uma terapia angiogênica utilizando as injeções intramiocárdicas ReACT . Por razões óbvias, a análise da FEVE não é um desfecho a ser considerado nesse grupo. O principal objetivo terapêutico é a melhora na perfusão miocárdica, em uma perspectiva subjetiva (CCSAC) e objetiva (exame de imagem do miocárdio induzido por estresse), utilizando a formulação ReACT.

[000125] Diferentemente dos outros estudos (12, 57), o ReACT possui uma formulação específica de células que parecem estar correlacionadas com as respostas clínicas e cintilográficas; respectivamente, uma melhora na classificação de angina e uma redução na área isquêmica do miocárdio. A melhora na CCSAC (medida subjetiva), seguida pela correlata redução da área isquêmica do miocárdio (medida objetiva) sugere fortemente a neo-angiogênese como o principal mecanismo de ação das células-tronco (figuras 3 e 4). Consequentemente, a grande fração de monócitos presente no ReACT parece estar relacionada a angiogênese para restaurar a perfusão nas áreas isquêmicas do miocárdio após o transplante de células. Os mecanismos ainda não estão bem elucidados e serão analisados na próxima fase do estudo. Apesar disso, uma correlação significante entre o número de monócitos e a melhora da resposta clínica (r = -0,759, p < 0,05) confirma fortemente um efeito relacionado às células do ReACT, nesse estudo.

[000126] Essa relação positiva entre o número de monócitos no ReACT e a melhora sustentada na classificação de angina pode indicar a importância dessas células de suporte para o mecanismo de ação das CMMO e a angiogênese miocárdica sustentada. Esses resultados também corroboram a hipótese de que os resultados desse estudo são decorrentes do efeito celular da formulação ReACT e não de efeitos não-específicos relacionados ao procedimento ReACT. Estudos controlados futuros devem fornecer mais esclarecimentos.

[000127] A medula óssea é uma fonte natural de um amplo espectro de citocinas que estão envolvidas no controle da angiogênese e do processo inflamatório. Os leucócitos da medula óssea possuem um importante papel no mecanismo de angiogênese e os neutrófilos e monócitos atuam como peças chave nesse processo (10, 24, 29, 47).

[000128] Os monócitos e promonócitos da medula óssea podem ser ativados em resposta a estímulos quimiotáticos e sofrer diferenciação em macrófagos. Os macrófagos possuem um papel fundamental na angiogênese devido à sua capacidade de secretar proteases, fatores de crescimento, monocinas e influenciar em cada fase do processo angiogênico; incluindo alterações da matriz extracelular local, indução da migração e proliferação de células endoteliais e inibição do crescimento vascular com a formação de capilares diferenciados (5, 10, 46, 51).

[000129] O número ótimo de células-tronco ou formulação ótima para promover a regeneração miocárdica continua controverso entre os diferentes pesquisadores, a maioria deles não demonstra efeito dose-dependente (18, 20). Iwasaki e outros (25) desenvolveram um dos únicos estudos que demonstrou uma correlação positiva entre o número de células-tronco injetadas e a regeneração miocárdica em ratos com infarto agudo do miocárdio experimental. Henning e outros (23) injetaram células-tronco derivadas de cordão umbilical em ratos infartados, comparando diferentes doses e vias de administração (intramiocárdica, intracoronariana ou intravenosa) e demonstraram uma alta eficácia da injeção intramiocárdica. No estudo aqui descrito, foi executado o ReACT, uma série única de múltiplas injeções com uma formulação de CMMO na concentração de 2 x 106 por punção. Não existe correlação entre o número de injeções e a variação na classificação de angina ao longo do tempo, entretanto a população do estudo é provavelmente muito pequena para chegar a qualquer associação significante e também porque o Protocolo ReACT foi desenhado para continuar incluindo pacientes; dados futuros devem ou não confirmar essa afirmação.

[000130] A via intramiocárdica de transplante da formulação de células foi escolhida com base em dados experimentais que mostram uma maior fixação miocárdica das células-tronco quando a infusão é intramiocárdica, em comparação com outras vias, como a intracoronariana (seja injeção retrógrada ou anterógrada) ou transcoronariana (33, 42, 50). Além disso, a angina refratária possui características clínicas bastante interessantes, com menores preocupações com possíveis complicações, sendo um perfil muito mais seguro para o uso da via intramiocárdica, em relação ao uso desta via em pacientes agudos (infarto agudo do miocárdio). Um estudo desenvolvido por Perin e outros (42) avaliou a segurança e exequibilidade da injeção endomiocárdica em infarto agudo do miocárdio. Não foram observadas complicações fatais e o método mostrou-se aparentemente seguro. Entretanto, os riscos de arritmia são consideráveis e não podem ser descartados quando se considera a injeção intramiocárdica diretamente em um miocárdio instável agudo.

[000131] É importante ressaltar que, apesar de promissor, se conhece as limitações do estudo. Enquanto esse estudo incluiu um pequeno número de pacientes com um longo período de acompanhamento, esse muito maior do que a maioria dos estudos publicados em angina refratária, o tamanho da amostra (8 pacientes) dificulta a determinação de eficácia, entretanto é suficiente para demonstrar a segurança. Devido a aspectos éticos e a impossibilidade de justificar o uso cirúrgico do implante intramiocárdico de placebo nessa população, esse estudo foi aberto e não randomizado; em consequência desse desenho o efeito placebo não pode ser descartado. Entretanto, é importante enfatizar que o aumento objetivo da perfusão miocárdica foi observado e manteve-se ao longo do tempo.

[000132] São necessários outros estudos clínicos para confirmar os resultados aqui expostos. Porém, a efetividade do procedimento ReACT, em conformidade com as especificações técnicas e GMP, assim como a preparação celular do ReACT, parecem levar a melhores resultados do que os previamente relatados por outros pesquisadores.

[000133] Conclui-se que o transplante cirúrgico intramiocárdico de uma preparação de células autólogas derivadas de medula óssea, em um protocolo padronizado, pode ser um procedimento seguro e efetivo na promoção de melhorias progressivas e sustentadas em pacientes com angina refratária.

Exemplo 3 - Monócitos para isquemia cerebral Técnicas de Biologia Molecular.

[000134] As técnicas de biologia molecular, já bem caracterizadas e não descritas especificamente foram, no geral, baseadas em Sambrook e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York - 1989, 1992) e Ausubel e outros (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland - 1989). As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas, em geral, de acordo com o manual PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990). Outras técnicas para reações e manipulações com ácidos nucleicos, a não ser que se afirme o contrário, foram realizadas como geralmente descritas em Sambrook e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press) e conforme estabelecido nas patentes N°4.666.828, 4.666.828, 4.683.202, 4.801.531, 5.192.659 e 5.272.057 dos Estados Unidos; incorporadas aqui para referência. A PCR in situ em combinação com a Citometria de Fluxo, podem ser utilizadas para a detecção de células contendo sequências específicas de DNA e mRNA (vide, por exemplo, Testoni e outros, Blood, 1996, 87:3822).

[000135] Os métodos padrão de imunologia, já bem caracterizados e não descritos especificamente seguiram, em geral, o que está determinado em Stites e outros (Eds.), Basic And Clinical Immunology, 8° Ed., Appleton & Lange, Norwalk, CT - 1994 e Mishell e Shigi (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York - 1980.

Imunoensaios

[000136] Em geral, os imunoensaios foram empregados para determinar um espécime por marcadores de superfície celular ou similares. Os ensaios de imunocitoquímica já são bem conhecidos. Anticorpos, tanto monoclonais quanto policlonais, podem ser utilizados nos ensaios. Quando apropriado, outros imunoensaios como o imunoensaio enzimático (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA) podem ser utilizados, de acordo com as técnicas já caracterizadas. Os imunoensaios disponíveis são amplamente descritos em patentes e na literatura científica. Vide, por exemplo, Patente U.S 3.791.932, 3.839.153, 3.850.752, 3.850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.879.262, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074, 4.098.876, 4.879.219, 5.011.771, 5.281.521 e Sambrook e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, New York, 1989). Diversas outras referências estão também disponíveis para essas técnicas.

Produção de anticorpos.

[000137] Os anticorpos podem ser monoclonais, policlonais ou recombinantes. Os anticorpos podem ser facilmente preparados para o antígeno ou porção antigênica como, por exemplo, um peptídeo sintético baseado em uma sequência, ou preparado de maneira recombinante por técnicas de clonagem, ou um produto gênico natural e/ou parte dele o qual possa ser isolado e utilizado como antígeno. Os antígenos podem ser utilizados na produção de anticorpos por tecnologias padronizadas de produção de anticorpos, que são bem conhecidas e, em geral, como descritas em Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, New York, 1988 e Borrebaeck, Antibody Engineering- A Practical Guide by W.H. Freeman and Co., 1992. Fragmentos de anticorpos podem também ser preparados a partir de anticorpos e incluir Fab e F(ab')2 através de métodos bastante conhecidos. Para a produção de anticorpos policlonais, um hospedeiro, como um coelho ou uma cabra, é imunizado com os antígenos ou fragmentos antigênicos, geralmente com um adjuvante, se necessário, acoplado a um veículo; os anticorpos para o antígeno são coletados do soro. Além disso, os anticorpos policlonais podem ser absorvidos para se tornarem monoespecíficos. Isto é, o soro pode ser exposto a determinados antígenos e os anticorpos que realizarem reação cruzada são retirados do soro tornando-o monoespecífico.

[000138] Para a produção de anticorpos monoclonais, um doador apropriado, geralmente um camundongo, é superimunizado pelos antígenos e as células esplênicas produtoras de anticorpos são isoladas. Essas células são fundidas a células imortais, como células de mieloma, para gerar células fusionadas híbridas que são imortais e secretam os anticorpos de interesse. As células são então cultivadas e os anticorpos monoclonais coletados do meio de cultura.

[000139] Para a produção de anticorpos recombinantes, o RNA mensageiro dos linfócitos-B produtores de anticorpos dos animais ou hibridomas é reversamente transcrito para obtenção do DNA complementar (cDNA). O cDNA do anticorpo, que pode ser de tamanho completo ou parcial, é amplificado e clonado em um fago ou um plasmídeo. O cDNA pode ter tamanho parcial compreendendo ao cDNA correspondente a cadeia leve ou a pesada, separada ou conectada pela sequência de ligação. O anticorpo ou fragmento de anticorpo é expressado a partir do sistema de expressão apropriado. O cDNA do anticorpo pode também ser obtido pela triagem em bibliotecas de expressão adequadas. O anticorpo pode ser ligado a um substrato sólido de suporte ou conjugado com um motivo detectável ou ligado e conjugado de acordo com as técnicas já conhecidas (para discussão geral da conjugação de motivos enzimáticos ou fluorescentes ver Johnstone & Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982). A ligação dos anticorpos em substratos sólidos de suporte também já é bem conhecida (vide Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York, 1988 and Borrebaeck, Antibody Engineering- A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., 1992). Os motivos detectáveis contemplados na presente invenção podem incluir, mas não estão limitados a, marcadores fluorescentes, metálicos, enzimáticos e radioativos. Exemplos incluem: biotina, ouro, ferritina, fosfatase alcalina, galactosidade, peroxidase, urease, fluoresceína, rodamina, trítio, Carbono 14, iodação e proteína verde fluorescente.

Terapia Gênica.

[000140] A terapia gênica, como utilizada aqui, refere-se à transferência de material genético (por exemplo: DNA ou RNA) de interesse em um hospedeiro a fim de tratar ou prevenir uma doença ou condição genética ou adquirida. O material genético de interesse codifica para um produto (por exemplo: proteína, polipeptídeo e peptídeo, RNA funcional ou antisense) o qual deseja-se produzir in vivo. Por exemplo: o material genético de interesse codifica para um hormônio, receptor, polipetídeo enzimático ou polipetídeo de valor terapêutico. Alternativamente, o material genético de interesse codifica para um gene suicida. Para revisão consultar: "Gene Therapy" em Advances in Pharmacology, Academic Press, San Diego, California, 1997.

Administração de Células para Transplante

[000141] Os monócitos da presente invenção podem ser administrados e dosados de acordo com as boas práticas clínicas, levando em consideração as condições clínicas de cada paciente individualmente, o local e o método de administração, o cronograma de administração, a idade do paciente, sexo, massa corporal e outros fatores conhecidos dos profissionais médicos. A "quantidade efetiva" farmacológica aqui proposta é então determinada a partir dessas considerações de acordo com aquilo que já é caracterizado. A quantidade deve ser efetiva para atingir uma melhora, incluindo, mas não limitado a, um aumento da taxa de sobrevida e recuperação mais rápida, ou melhora ou eliminação dos sintomas e outros indicadores, amplamente conhecidos para a medida apropriada selecionada.

[000142] Na metodologia da presente invenção, os monócitos da presente invenção podem ser administrados por diversas vias desde que apropriadas ao implante no sistema nervoso central, incluindo, mas não limitada a, administração por via parental, intravenosa e intraarterial, intratecal, intraventricular, intraparenquimal, intracranial, intracisternal, intra-estriatal e intranigral. Alternativamente, as células de sangue de cordão umbilical podem ser administradas em conjunto com agentes imunossupressores.

[000143] Composições farmacológicas correspondentes a quantidades efetivas de células de sangue de cordão umbilical também estão contempladas nessa invenção. Essas composições correspondem a um número efetivo de células, podendo ser combinadas com um veículo farmacológico adequado, aditivos e/ou excipientes. Em alguns aspectos da presente invenção, as células em solução salina estéril podem ser administradas em um paciente com necessidade de transplante. Em outro aspecto da presente invenção, as células são administradas em Solução Salina Balanceada de Hanks (SSBH) ou Isolito S, pH 7,4. Outras abordagens podem também ser utilizadas, incluindo o uso de meio de cultura livre de soro. A via preferencial de administração das células em um paciente deve ser a sistêmica em algumas indicações, ao passo que em outras indicações, a administração direta no local da doença e/ou tecido lesionado ou proximidades dele seja preferível.

[000144] Composições farmacológicas de acordo com a presente invenção compreendem preferivelmente a um número efetivo de células dentro de uma faixa que vai de 1,0 x 104 células até, cerca de 1,0 x 109 células, preferencialmente cerca de 1 x 105 a cerca de 1 x 107 células, ainda mais preferível que estejam entre cerca de 2 x 105 até cerca de 8 x 106 células, geralmente em solução, opcionalmente em combinação com os veículos farmacológicos adequados, aditivos e/ou excipientes.

[000145] Os monócitos são preferencialmente administrados com um permeabilizador da barreira hemato-encefálica. Em uma modalidade, as células são combinadas com o permeabilizador antes da administração para o paciente. Em outra modalidade, as células são administradas separadamente para o paciente em relação a administração do permeabilizador. Opcionalmente, se as células forem administradas separadamente do permeabilizador existe um espaço temporal entre a administração do permeabilizador e das células. Esse espaço temporal pode variar na faixa de tempo desde menos de um minuto para até horas ou dias. A determinação do tempo ótimo e ordem de administração é pronta e rotineiramente determinada por uma das técnicas já bem caracterizadas.

[000146] Várias publicações referenciam essa aplicação. As descobertas descritas em todas essas publicações e as referências citadas nelas foram incorporadas na sua totalidade como referência nesse pedido, a fim de descrever de maneira mais completa o estado da arte ao qual essa invenção pertence. Os exemplos a seguir não se destinam a limitar o escopo das reivindicações da invenção, mas sim a exemplificar certas modalidades. Qualquer variação nos métodos exemplificados que seja realizada por um profissional experiente estará abrangida no escopo da presente invenção.

[000147] Uma função interessante dos monócitos/macrófagos é a promoção da angiogênese relacionada a reações inflamatórias. Angiogênese, ou neovascularização, é um elemento chave nos processos inflamatórios incluindo as cascatas de reparo subsequentes (Sunderkotter, 1994 #4). Durante o início do processo inflamatório, os monócitos da circulação são extravasados para os tecidos (Bosco, 2008 #3). Inicialmente, as células endoteliais e inflamatórias vizinhas liberam uma série de materiais quimiotácticos e de adesão para regular essa passagem dos monócitos através da parede do vaso sanguíneo (Baggiolini, 2000 #9; Imhof, 2004 #2; Bosco, 2008 #3). Os monócitos extravasados movem-se através do gradiente quimiotáctico e de oxigênio que existe entre o tecido normal e o lesionado até atingirem os centros hipóxico e/ou necrótico antes de diferenciarem-se em macrófagos teciduais. Os tecidos patológicos que representam os tecidos nos quais os monócitos/macrófagos estão aptos a se acumularem são os seguintes: tumores sólidos, tecido miocárdico ou cerebral infartado, junções sinoviais na artrite crônica ou placas de ateroma, infecções bacterianas e feridas em cicatrização (Baggiolini, 2000 #9; Murdoch, 2004 #1; Bosco, 2008 #3; Mantovani, 2002 #15) -(figura 8).

[000148] Depois da diferenciação dos monócitos em macrófagos tissulares, estes dividem-se em duas populações polarizadas, M1 e M2 (Mantovani, 2004 #67; Sica, 2006 #16; Mantovani, 2002 #15). Enquanto os macrófagos polarizados M1 são células fortemente inflamatórias que produzem citocinas pró-inflamatórias e fagocitam patógenos, os macrófagos M2 modulam a resposta inflamatória e auxiliam na angiogênese e no reparo tecidual (Mantovani, 2004 #67; Sica, 2006 #16; Mantovani, 2002 #15). De maneira interessante, na expressão gênica dos macrófagos, os genes para a combinação dos grupos M1 e M2, no início do processo de cicatrização da ferida, é convertida posteriormente em genes M2 (Deonarine, 2007 #68). Durante os estágios iniciais do processo de cicatrização, os macrófagos M1 levam a uma reação inflamatória direta que limpa a ferida e remove os debris microbianos e/ou de tecido danificado enquanto simultaneamente, os macrófagos M2 iniciam o reparo tecidual e a angiogênese. Nos estágios finais, quando a limpeza realizada pelos macrófagos M1 está praticamente terminada, os macrófagos M2 prevalecem e seguem com o seu trabalho de regeneração tecidual e angiogênese (Deonarine, 2007 #68). Diversas evidências sugerem o recrutamento de monócitos/macrófagos para o auxílio na modulação e regulação da neovascularização em tecidos isquêmicos, tumores e inflamações crônicas como artrite e aterosclerose.

Angiogênese na Isquemia

[000149] Nos últimos anos, foi demonstrada a importância dos monócitos/macrófagos circulantes na neovascularização em doenças isquêmicas (Shireman, 2007 #23; Herold, 2004 #33; Capoccia, 2008 #32). A arteriogênese, crescimento estrutural pré-estabelecido das redes arteriolares em artérias colaterais efetivas, parece ser iniciado pelo aumento da tensão de fluídos, que resulta da obstrução das artérias, dentro das artérias colaterais em desenvolvimento e não induzida por hipóxia tecidual ou isquemia (Ito, 1997 #41; Heil, 2006 #19). Em contraste, a angiogênese, formação de novos capilares a partir de um vaso sanguíneo pré-existente, é induzida por hipóxia e a densidade capilar aumenta nos locais onde há isquemia aguda ou severa (Scholz, 2002 #20; Ito, 1997 #41).

[000150] Tanto a arteriogênese quanto a angiogênese induzem a neovascularização através de diferentes mecanismos, monócitos/macrófagos contribuem de forma essencial para os dois processos. Na arteriogênese, a obstrução abrupta do fluxo arterial, causada por um êmbolo ou uma estenose progressiva, aumenta a tensão de fluído na rede arteriolar e em consequência aumentam significativamente a adesão de moléculas e quimiocinas como, as moléculas de adesão endotelial (Nagel, 1994 #21) e proteína quimio-atratora de monócitos (MCP - 1) (Eischen, 1991 #22). Os monócitos do sangue são ativados e recrutados para as artérias colaterais pelas MCP-1. Uma vez lá, eles migram através da parede do vaso pela ligação a moléculas de adesão e/ou diferenciam-se em macrófagos teciduais; antes produzindo uma grande quantidade de fatores de crescimento e citocinas (Sunderkotter, 1994 #4), que podem promover a proliferação celular do endotélio e do músculo liso (Heil, 2006 #19; Shireman, 2007 #23).

[000151] A angiogênese é uma combinação de processos mais complexos, muitos dos quais são regulados pelo fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e os seus receptores (VEGFR) que, comprovadamente, iniciam a angiogênese (Shireman, 2007 #23). Dados recentes sugerem um papel crítico das angiopoietinas (Ang-1 e 2) e seus receptores (Tie) nos estágios secundários do processo de angiogênese como a maturação, estabilização e remodelamento dos vasos (Thurston, 2003 #57). A hipóxia e a necrose tecidual afetam significativamente a produção de VEGF/VEGFR e angiopoietina/receptor Tie (Milkiewicz, 2006 #24; Zhang, 2005 #56; Beck, 200 #58; Murdoch, 2007 #59). Por sua vez, VEGF e angiopoietina induzem o recrutamento de células progenitoras endoteliais e monócitos/macrófagos (Tammela, 2005 #25; Murdoch, 2007 #59).

[000152] Os monócitos/macrófagos recrutados promovem a angiogênese a partir de diversos mecanismos em potencial, como descrito a seguir. Primeiro mecanismo: os macrófagos degradam a matriz extracelular utilizando metaloproteinases de matriz e enzimas proteolíticas, orientando a migração das células endoteliais (Moldovan, 2005 #26). Por caminhos através da matriz extracelular, os fatores de crescimento e células endoteliais são mobilizados a partir dos vasos já estabelecidos para formar novos capilares (Shireman, 2007 #23).

[000153] Segundo mecanismo: Os monócitos/macrófagos liberam diversas citocinas pró-angiogênicas como, o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), VEGF, interleucina-8 (IL-8), substância P, fator de necrose tumoral α (TNF-α), fator transformador de crescimento α e β (TGF-α e -β) e prostaglandinas (Sunderkotter, 1994 #4, Moldovan, 2005 #26) que atuam direta ou indiretamente na promoção da proliferação e migração de células endoteliais ou formação de vasos (Shireman, 2007 #23; Sunderkotter, 1994 #4). Embora, assim como os fatores pró-angiogênicos, os monócitos/macrófagos sejam também capazes de liberar citocinas anti-angiogênicas como a trombospondina 1, interferon-α e -γ (Sunderkotter, 1994 #4); a sua produção de citocinas inibitórias é regulada por fatores pró-angiogênicos. Como, por exemplo, IL-12 é inibida pelo aumento de Ang-2 (Murdoch, 2007 #59).

[000154] Terceiro: os monócitos/macrófagos podem diferenciarem-se em células endoteliais, as quais auxiliam diretamente na produção da parede do vaso (Moldova, 2005 #26; Moldovan, 2000 #28; Anghelina, 2006 #27). Com a estimulação do fator pró-angiogênico específico, os progenitores de monócitos/macrófagos podem se transdiferenciar em células semelhantes às endoteliais, que são diretamente incorporadas em novos vasos sanguíneos (Schmeisser, 2003 #30; Schmeisser, 2002 #29; Shireman, 2007 #23; Hoenig, 2008 #31).

[000155] Quarto: As células endoteliais produzem MCP-1 (Marumo, 1999 #34; Lakshminarayanan, 2001 #35) assim como VEGF (Moldovan, 2005 #26) e angiopoietina (Murdoch, 2007 #59) quando expostas a VEGF ou hipóxia; todos esses fatores ativam e atraem monócitos/macrófagos (Shireman, 2007 #23). Inversamente, os monócitos/macrófagos não só regulam positivamente Tie-2 (receptor de angiopoietina) (Murdoch, 2007 #59) como também secretam MCP-1 e VEGF quando ativados por hipóxia, o que influencia as células endoteliais e até eles mesmos, por efeitos parácrinos e autócrinos e, como consequência, redobra o efeito no processo de angiogênese (Ferrara, 2004 #60).

Angiogênese em tumores e inflamações crônicas

[000156] Nas últimas décadas, surgiram diversas evidências de que, em conjunto com as células tumorais, os monócitos/macrófagos também possuem um importante papel na angiogênese e progressão dos tumores (Sunderkotter, 1994 #4), visto que os tecidos neoplásicos exibem neovascularização somente com macrófagos (Mostafa, 1980 #64) e animais com ausência de monócitos apresentam uma diminuição significativa da angiogênese tumoral (Evans, 1977 #63). O número de macrófagos em um tecido tumoral é maior do que em qualquer outro tecido normal (Gouon-Evans, 2002 #79). Além da auto-proliferação dos macrófagos teciduais o aumento da mobilização e diferenciação dos monócitos circulantes resulta provavelmente no aumento dos macrófagos no tecido tumoral (Mantovani, 2002 #15; Schmid, 2007 #13). As citocinas inflamatórias que são induzidas pelas células tumorais e hipóxia central atraem os monócitos/macrófagos para as áreas de necrose e crescimento neoplásicos (Pugh-Humphreys, 1992 #44; Coussens, 2002 #78).

[000157] Acima de tudo, os monócitos/macrófagos parecem ser recrutados para promover a neovascularização que é crítica para o crescimento e progressão tumoral. Na maioria dos tumores, a subpopulação de macrófagos M2 é significativamente maior dentre os macrófagos associados ao tumor (MAT), o que potencializa a angiogênese, quando comparada a subpopulação M1, que mata as células tumorais (Sironi, 2006 #17; Mantovani, 2002 #15; Sica, 2006 #16). Os MAT M2 secretam muitos fatores pró-angiogênicos como, VEGF, TNF-α , IL-8, TGF-β e bFGF (Mantovani, 2002 #15; Sica, 2006 #16; Murdoch, 2004 #1; Nozawa, 2006 #18; Schmid, 2007 #13; Mantovani, 2004 #67) e um largo espectro de enzimas proteolíticas (Nozawa, 2006 #18) que podem degradar a matriz extracelular e por sua vez orientar a migração das células endoteliais para a angiogênese (Moldovan, 2005 #26; Schmid, 2007 #13). É importante salientar que correlações significativas entre MAT e as densidades vasculares tem sido observadas em câncer de cólon (Oosterling, 2005 #10), câncer de mama (Leek, 2002 #12) e câncer de pâncreas (Eposito, 2004 #11), o que sugere que os MAT potencializam a angiogênese tumoral (Schmid, 2007 #13). Além disso, o forte recrutamento de MAT está significativamente relacionado ao mau prognóstico em alguns tipos de tumor (Leek, 2002 #12; Oosterlig, 2005 #10).

[000158] A angiogênese também pode contribuir para patologias inflamatórias crônicas. O estado inflamatório crônico pode ser mantido em virtude da formação de novos vasos, que continuamente carreiam células inflamatórias e levam oxigênio e nutrientes para a área inflamatória (Jackson, 1997 #37). Os mecanismos e características da neovascularização relacionada com a inflamação crônica não difere daqueles de angiogênese induzida pela isquemia ou tumores. A maioria das citocinas e fatores de crescimento que sabidamente regulam a angiogênese podem ser produzidos por monócitos/macrófagos (Sunderkotter, 1994 #4). Durante a formação do pannus, na artrite reumatoide, e da placa, na aterosclerose, o tecido inflamado proliferativo contém um grande número de células inflamatórias, especialmente monócitos/macrófagos, novos vasos em formação e mediadores derivados da inflamação (Jackson, 1997 #37). Como resultado final, esse aumento de monócitos/macrófagos pode ser observado na maioria das áreas inflamatórias onde a angiogênese está ocorrendo em um ambiente anormal, incluindo condições patológicas como a isquemia, tumores, doenças inflamatórias crônicas bem como feridas em cicatrização (Wagner, 2008 #38; Jackson, 1997 #37; Sunderkotter, 1994 #4; Hunt, 1984 #39).

Monócitos versus Células-tronco em Transplantes

[000159] Diversos estudos estão sendo realizados para determinar o potencial terapêutico de monócitos/macrófagos na arteriogênese e/ou angiogênese primária em modelos de doenças isquêmicas (Buschmann, 2001 #42; Heil, 2002 #43; Herold, 2004 #33; Ito, 1997 #45; Hirose, 2008 #65). Na arteriogênese e angiogênese, os monócitos parecem ser uma nova e atraente célula-alvo para terapias celulares que visam a promoção do crescimento de vasos colaterais seguido de regeneração tecidual; podendo atenuar a isquemia tecidual local e melhorar os desfechos clínicos (Sasayama, 1992 #40; Krupinski, 1994 #54). A neovascularização a partir de monócitos endógenos pode ser diretamente induzida por uma infusão de MCP-1 (Ito, 1997 #45), ou fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) (Buschmann, 2001 #42), ou indiretamente através de um efeito rebote depois da administração de 5-fluoracil (Heil, 2002 #43). Todas essas moléculas podem promover o deslocamento e acúmulo de células em torno das artérias colaterais ou proliferação de monócitos endógenos.

[000160] Além disso, a neovascularização pode ser ativada pelo transplante de monócitos exógenos autólogos ou alogênicos com ou sem alterações promovidas ex vivo. Com o desenvolvimento de um método efetivo para o isolamento dos monócitos do sangue periférico (Herold, 2006 #46; Gonzalez-Barderas, 2004 #47; de Almeida, 2000 #48; Renik, 2003 #49) um estoque autólogo de monócitos pode ser feito. Apesar de o sangue periférico fornecer um número finito de monócitos, a estocagem dos monócitos coletados através de diversas leucofereses de monócitos autólogos do sangue periférico do paciente, pode levar ao acúmulo de uma quantidade de células adequada para o uso futuro (Herold, 2006 #46). O avanço da engenharia tecidual ex vivo levou a novas estratégias utilizando os monócitos como veículo para a transfecção de genes terapêuticos, como, por exemplo, o GM-CSF para a promoção de neovascularização (Harold, 2004 #33); assim como um efetor direto para o transplante celular. Esse desenvolvimento técnico desde o isolamento celular até a aplicação deve tornar os monócitos mais promissores para a medicina regenerativa, especialmente em termos de aumento da arteriogênese e da angiogênese.

[000161] Existem diversas vantagens no transplante de monócitos quando comparado com o de células-tronco. Primeiro, diferentemente das células-tronco/progenitoras eles não possuem a capacidade de autorrenovação e proliferação, diminuindo assim o potencial neoplásico do transplante de células. Segundo, eles não podem diferenciar-se em outras linhagens celulares, o que pode excluir efeitos indesejáveis em tecidos específicos se os monócitos são transplantados diretamente ou migram para os tecidos-alvo. Terceiro, diferentemente dos tecidos embrionários e fetais, os monócitos estão livres de questões éticas e morais para a obtenção e transplante já que eles podem ser facilmente coletados do sangue perinatal, periférico adulto ou medula óssea. Quarto, o transplante de monócitos pode evitar uma reação imune como a doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), que frequentemente ocorre após o transplante de leucócitos alogênicos ou transplante de medula óssea em que não existe compatibilidade total do antígeno leucocitário humano (HLA) entre doador e receptor. GVHD é uma reação imune que resulta da ativação das células-T no enxerto (células do doador) após detectarem o tecido do receptor como antigenicamente diferente (Brichard, 2001 #75). As células-T ativadas do doador produzem citocinas citotóxicas e inflamatórias em abundância e atacam o tecido do receptor. No que diz respeito a GVDH, independentemente da compatibilidade de HLA, o transplante somente da fração de monócitos deve ser muito mais seguro do que o transplante da fração mononuclear da medula óssea ou da fração mobilizada por GM-CSF do sangue periférico, as quais certamente contêm linfócitos. Finalmente, os monócitos/macrófagos podem secretar diversas citocinas, fatores de crescimento e substâncias tróficas que podem diretamente promover a regeneração de outro tecido assim como a angiogênese (Sunderkotter, 1994 #4). Por exemplo, o VEGF é sabidamente capaz de estimular a neurogênese (Jin, 2002 #55; Teng, 2008 #61).

Monócitos do Sangue de Cordão Umbilical

[000162] Os monócitos correspondem a cerca de 5 a 10% dos leucócitos no sangue periférico humano (Gordon, 2005 #72; Mielcarek, 1997 #74), enquanto que correspondem a 2% das células mononucleares de medula óssea (MO) (Mielcarek, 1997 #74). Em contraste, não foi relatada diferença entre o conteúdo de monócitos entre o sangue de cordão umbilical (SCU) e o sangue periférico adulto (Sorg, 2001 #73; Mills, 1996 #71). Assim, a MO e o SCU, assim como o sangue periférico são potenciais candidatos a fontes de monócitos/macrófagos autólogos e alogênicos. Na realidade, MO e SCU são atualmente as fontes padrão ouro de células progenitoras hematopoiéticas utilizadas para reconstituir as linhagens sanguíneas, após terapias mieloablativas, em doenças hematológicas malignas e não-malignas. Porém, o potencial da população de células-tronco dessas fontes para terapias celulares também foi demonstrado em outras doenças degenerativas, especialmente as doenças isquêmicas. Existem inúmeras evidências de que o transplante de células-tronco de medula óssea ou sangue de cordão umbilical em áreas isquêmicas, por transplante local direto ou injeção no sangue, pode melhorar as lesões patológicas e o dano funcional (Henning, 2007 #70; Chen, 2003 #51; Willing, 2003 #52; Newcomb, 2007 #26; Chang, 2007 #143). Essa melhora parece, em parte, resultar da angiogênese induzida pelas células-tronco no núcleo isquêmico ou peri-isquêmico (Chen, 2003 #51; Taguchi, 2004 #53; Chang, 2007 #143) apesar de o mecanismo pelo qual essas células exercem os seus efeitos angiogênicos ainda não estar completamente elucidado.

[000163] Essencialmente, os monócitos do SCU são únicos quando comparados àqueles derivados da MO ou do sangue periférico (Newcomb, 2007 #26). Somente os monócitos adultos são ativados pelo fator de crescimento de hepatócitos, que é essencial para as funções normais dos monócitos como a apresentação de antígenos (Jiang, 2001 #154). Os monócitos de SCU expressam menos antígenos leucocitários humanos (DR) do que as células adultas, por isso a sua capacidade citotóxica é menor (Theilgaard-Monch, 2001 3155). Além disso, os monócitos de SCU não se diferenciam em células dendríticas maduras na mesma proporção que os monócitos maduros, mesmo com a estimulação por IL-4 e GM-CSF (Liu, 2001 #66); as células dendríticas possuem um papel fundamental na ativação de células-T naives. As funções secretórias também são diferentes entre os monócitos de SCU e os de sangue adulto. A menor secreção de IL-Ιβ e TNF-α, ambos os quais estimulam a inflamação e possuem um papel principal nas reações imunes como a GVHD (Hill, 1997 #76), está mais relacionada às diferenças na expressão de antígenos monocitários como CD64, CD14, CD33 e CD45RO em monócitos de SCU depois da exposição ao intérferon-γ recombinante do que nos monócitos de sangue adulto (Brichard, 2001 #75). Os monócitos/macrófagos CD14+ dos tecidos deciduais uterinos e sangue de uma mulher grávida normal são predominantemente do subgrupo M2, que modula a reação imune materno-fetal e promove o remodelamento tecidual e a angiogênese para a manutenção de uma gravidez de sucesso (Gustafsson, 2008 #69). Esses achados sugerem que a maioria dos monócitos do SCU podem se tornar polarizados para macrófagos M2, os quais possuem uma menor atividade inflamatória e maior angiogênica, visto que os macrófagos deciduais provavelmente são, em parte, diferenciados dos monócitos de SCU.

[000164] A imaturidade da função estimulatória imune e inflamatória dos monócitos de SCU pode contribuir para uma baixa incidência de rejeição imune, incluindo a GVHD e/ou inibição da reação inflamatória nociva após o transplante; mesmo no caso dos monócitos derivados de fontes alogênicas. Embora o transplante de monócitos de MO ou sangue periférico autólogos possa evitar a rejeição imune e a GVHD; a coleta de MO necessita de um tempo adicional, custo e exigência física dos pacientes. As repetidas coletas e isolamentos de monócitos do sangue periférico do próprio paciente também necessita de tempo e custo extras. Em contrapartida, considerando-os como alvo para as terapias celulares, uma das maiores vantagens dos monócitos de SCU, em comparação com os monócitos adultos autólogos, é a rápida disponibilidade. Por exemplo, em pacientes com acidente vascular cerebral, o "momento adequado" é crítico e pode não ser viável coletar, manipular e processar células com boa qualidade, em condições de boas práticas de manipulação (GMP) atuais, para o paciente, dentro da janela terapêutica. Quando são consideradas a exequibilidade e a segurança, os monócitos de SCU são as células alogênicas mais promissoras que podem ser completamente manipuladas com antecedência ao transplante sem prejuízos ao doador ou ao receptor, mesmo se as células não apresentarem compatibilidade imunológica com os receptores.

[000165] Essa superioridade dos monócitos de SCU sobre os de MO ou sangue periférico deve levar a uma mais intensa exploração do seu papel promissor nas terapias celulares. Recentemente, o grupo demonstrou que o transplante de células de SCU humano sem a subpopulação de monócitos (CD14+) falhou na melhora do desfecho neurológico na mesma medida que o transplante de outras células de SCU (ausência de células-T, ausência de células-B, ausência de células CD133+ ou fração mononuclear total), em modelos de rato com oclusão da artéria cerebral média (Womble e outros, 2008). No que diz respeito a angiogênese, esses achados sugerem que o transplante de SCU humano sem monócitos não pode induzir adequadamente a angiogênese e, por sua vez, não melhora a disfunção neuronal. Por fim, a subpopulação de monócitos de SCU deve ser essencial para a recuperação induzida por SCU no AVC.

[000166] Além disso, foi demonstrada também a melhora na disfunção motora e de memória após o transplante intravenoso de monócitos/macrófagos de SCU humano em modelos de camundongo da Síndrome de Sanfilippo tipo B (Mucopolissacarídeo III B - MPS III B) (Gabuzova-Davis e outros, 2008). Na MPS III B, a deficiência da enzima α-N-acetilglucosaminidase (Naglu) leva ao acúmulo de heparan sulfato (HS), uma glicosaminoglicana, entre as células e finalmente provoca anomalias progressivas no cérebro e órgãos sistêmicos. Embora as glicosaminoglicanas sejam conhecidas como moléculas da matriz extracelular que possuem influência na habilidade de fagocitose dos macrófagos, a função dos monócitos/macrófagos em uma condição patológica rica em HS como a síndrome de Sanfilippo não é clara. Nesse estudo, assim como a melhoria neurológica, uma análise histopatológica mostrou que o número de micróglias (macrófagos do cérebro) aumentou em todas as áreas do hipocampo dos camundongos mutantes Naglu tratados com monócitos e os níveis de HS foram reduzidos no fígado desses animais tratados. Além disso, a distensão da bexiga urinária, geralmente um problema significativo que ocorre com os camundongos afligidos pela idade, foi também melhorada nos camundongos tratados. Esses resultados sugerem que a administração de monócitos/macrófagos de SCU humano deve beneficiar a modelagem dos camundongos MPS III B, provavelmente porque as células transplantadas possuem influência nos mecanismos de fagocitose nos ambientes ricos em HS nessa doença (Gabuzova-Davis e outros, 2008).

[000167] Logicamente, a capacidade dos monócitos para o transplante celular precisa ser cuidadosamente avaliada antes da aplicação terapêutica clínica, considerando que o seu papel específico e função na modulação das respostas imune e inflamatórias ainda não é completamente conhecido. O seu potencial deletério na vascularização tumoral, retinopatia diabética, pannus da artrite e desenvolvimento da placa aterosclerótica também necessita de uma investigação aprofundada (Herold, 2006 #46). Entretanto, esses efeitos colaterais perigosos podem ser prevenidos pela avaliação cuidadosa, se o provável paciente possui ou não alguma doença pré-existente, diabetes descontrolada, artrite, aterosclerose. Se durante a avaliação pré-tratamento for confirmado que o paciente possui alguma doença pré-existente que pode ser potencializada pelo transplante de monócitos, então esses devem ser excluídos antes do transplante celular. Isto é improvável, desde que complicações relacionadas aos monócitos, considerando todo o conhecimento acerca deles, não foram relatadas como, a progressão de doenças crônicas ou neoplásicas após o transplante de MO ou SCU em pacientes com doenças hematológicas malignas e não-malignas, mesmo os monócitos compondo uma porção considerável da MO e do SCU.

[000168] Em contrapartida, o uso de monócitos de SCU pode prevenir os possíveis efeitos nocivos ou exercer efeitos anti-inflamatórios. Existem diversas evidências de que as células mononucleares de SCU proporcionam reações anti-inflamatórias em diversas doenças. Anteriormente, demonstramos que o transplante de células mononucleares de SCU humano diminui significativamente o número de células CD45+/CD11b+ (microglias/macrófagos) e CD45+/B220+ (células-B) no cérebro de ratos com oclusão da artéria cerebral média (Vendrame, 2005 #106). Além disso, o transplante de SCU diminui as citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α e IL-Ιβ (Vendrame, 2005 #106). Recentemente, Foi revelado que o transplante de células mononucleares de SCU humano, pela via de injeção intravenosa, em ratos envelhecidos, pode significativamente reduzir o número de microglias ativadas e aumentar a neurogênese (Bachstetter, 2008 #5). A microgliose crônica reflete a reação inflamatória no tecido cerebral e está envolvida no dano de estruturas neurais em lesões isquêmicas, assim como em doenças neurodegenerativas, como as doenças Parkinson e Alzheimer (Streit, 1999 #9). Assim, esses achados sugerem que as células mononucleares de SCU melhoram o ambiente hostil do hipocampo envelhecido através da reação anti-inflamatória e subsequentemente regeneram o potencial das células-tronco/progenitoras neurais envelhecidas. Com base nos estudos anteriormente descritos, a fração de monócitos compreendida nas células mononucleares de SCU é considerável e deve possuir um potencial de reação anti-inflamatória que deve ser parcialmente responsável pelas melhorias funcionais observadas na lesão em modelos animais, incluindo o acidente vascular cerebral.

[000169] Concluindo, os monócitos/macrófagos devem fornecer uma alternativa promissora para o transplante de células-tronco com finalidade terapêutica pela capacidade de promover arteriogênese e angiogênese em diversas doenças. Esses monócitos devem ser os primeiros candidatos dentre diversos tipos celulares devido a sua segurança, exequibilidade e múltiplas funções, como as reações anti-inflamatórias e também a angiogênese.

[000170] A invenção foi descrita de maneira ilustrativa e a terminologia utilizada deve ser entendida como destinada a constar na natureza da descrição ao invés de ser uma limitação. Obviamente, muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz das descrições anteriores e das habilidades já conhecidas, em posse desses conhecimentos, podem ser geradas modalidade e modificações adicionais sem sair do espírito ou exceder o escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ser entendido que dentro do escopo das reivindicações anexas, a invenção pode ser praticada de outras formas além das especificamente descritas. Assim, deve ser entendido que os desenhos e descrições foram aqui enunciados como exemplos para facilitar a compreensão da invenção e não devem ser interpretados como uma limitação do escopo.

Claims

Uso de uma população terapêutica de células enriquecida com células da linhagem monocitária, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento de isquemia a ser injetada no tecido isquêmico de um indivíduo,
em que a população terapêutica de células é uma população de células mononucleares, e
em que a população terapêutica de células contém pelo menos 107 células da linhagem monocitária.
Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a isquemia é a isquemia cardíaca e o tecido isquêmico é o miocárdio isquêmico.
Uso de uma população terapêutica de células enriquecida com células da linhagem monocitária, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento da angina pectoris a ser injetada no miocárdio de um indivíduo,
em que a população terapêutica de células é uma população de células mononucleares, e
em que a população terapêutica de células contém pelo menos 107 células da linhagem monocitária.
Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a população terapêutica de células enriquecida com células da linhagem monocitária é autóloga ou alogênica para o indivíduo.
Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, antes de injeção, realiza-se ainda uma etapa selecionada dentre as descritas a seguir: isolamento das células terapêuticas de uma amostra usando um método de enriquecimento das células da linhagem monocitária; cultivo de uma população terapêutica de células sob condições de enriquecimento das células da linhagem monocitária e adição de células da linhagem monocitária em uma população terapêutica de células.