WO2006093205A1 - 細胞調製方法および装置 - Google Patents

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WO2006093205A1
WO2006093205A1 PCT/JP2006/303907 JP2006303907W WO2006093205A1 WO 2006093205 A1 WO2006093205 A1 WO 2006093205A1 JP 2006303907 W JP2006303907 W JP 2006303907W WO 2006093205 A1 WO2006093205 A1 WO 2006093205A1
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cell
mononuclear cells
body fluid
cells
treatment
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PCT/JP2006/303907
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English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Kobayashi
Shinya Yoshida
Hideo Niwa
Original Assignee
Kaneka Corporation
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Publication date
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Definitions

  • the present invention is a method and apparatus for easily and efficiently preparing therapeutic cells used in various cell therapies including hematopoietic stem cell transplantation and activated lymphocyte therapy, and the method and apparatus obtained by the method and the apparatus. Cell population.
  • the mononuclear cell fraction mentioned here is a cell fraction useful for cell therapy such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, monocytes, macrophages and lymphocytes contained in bone marrow, peripheral or umbilical cord blood.
  • the preparation of the mononuclear cell fraction for cell therapy includes bone marrow fluid for hematopoietic stem cell transplantation or peripheral blood mobilized with stem cells such as G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) or CY (cyclophosphamide).
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • CY cyclophosphamide
  • Non-patent document 1 Although there is a method for separating a mononuclear cell fraction using a force cell separation device (Non-patent document 1, Non-patent document 2), an expensive apparatus is required and the operation is complicated. In addition, the mononuclear cell fraction separated and collected by such a device contains unnecessary cells such as granulocytes, suggesting the possibility of inflammation at the time of transplantation, which may reduce the therapeutic effect. The performance is shown (Non-patent Document 3).
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2002-171965 added HES (hydroxyethyl starch) to collected bone marrow fluid to precipitate erythrocytes and mononuclear cells.
  • HES hydroxyethyl starch
  • a method for easily obtaining a mononuclear cell concentrate by recovering a supernatant containing cells and centrifuging the supernatant is disclosed. This method requires a simple centrifuge.
  • a target mononuclear cell concentrate can be obtained without using a large forceful and complicated operation device such as a cell separator.
  • this method concentrates the concentration of mononuclear cells by precipitating red blood cells in the bone marrow fluid, and there is no mention of any means for removing granulocytes in the bone marrow fluid. .
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-121144 discloses a system for separating mononuclear cells using umbilical cord blood force using a separation membrane. In this method, separation of mononuclear cells and red blood cells is good, but granulocytes are mixed in the recovered mononuclear cell fraction.
  • Patent Document 1 JP 2002-171965
  • Patent Document 2 JP 2004-121144 A
  • Non-patent document 1 Hematopoietic stem cell manual 3. Preparation for transplantation and hematopoietic stem cell collection Nippon Medical Center p. 225 -p. 274
  • Non-Patent Document 2 Peripheral blood stem cell transplantation Nanaedo IV Collection and storage of peripheral blood stem cells
  • Non-Patent Document 3 Circulation 106 ⁇ 2019-2025 2002
  • An object of the present invention is to remove unnecessary cells from body fluids of mammals such as peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow fluid, and the like, and to easily and efficiently separate target cells, thereby enabling cell therapy. It is an object of the present invention to provide a method and apparatus for safely and stably supplying therapeutic cells, and a therapeutic cell composition comprising a cell fraction obtained by the method and apparatus.
  • the present invention provides the following.
  • a method of preparing a cell fraction containing mononuclear cells comprising a step B of performing at least one treatment selected from
  • a method for preparing a cell fraction containing mononuclear cells comprising the step D of contacting the sample after the treatment in Step C with a granulocyte adsorbent.
  • Step A or Step D is a force that allows the sample after treatment with the body fluid or step C to pass through the column packed with the granulocyte adsorbent.
  • the method according to (1) wherein the method is carried out by bringing the treated sample into contact with each other in the same container.
  • Step B or Step C force Centrifugation of the sample during or after treatment with the body fluid or step A under a condition capable of separating mononuclear cells and red blood cells, and the body A group consisting of the addition of a cell separation agent capable of separating mononuclear cells and red blood cells to a sample during or after treatment with liquid or step A.
  • Step A and Step B, or Step C and Step D are performed in the same container.
  • the granule adsorbent is at least one selected from the group force consisting of water-insoluble particles, nonwoven fabrics, porous bodies, flat membranes, and hollow fibers according to any one of (1) to (3) The method described.
  • cell separation membrane is at least one selected from a nonwoven fabric, a porous body, a flat membrane, and a group force that also has a hollow fiber force.
  • the granulocyte adsorbent comprises an unsubstituted hydroxyl group and a substituent R in which H in the group is one type or two or more types. It is a granulocyte adsorbent containing a polymer compound having a hydroxyl group substituted by
  • the polymer compound has an unsubstituted hydroxyl group, and a polybulual alcohol or polybulual alcohol having H in the group substituted by one or more substituents R.
  • the method according to (6) which is a copolymer or polysaccharide.
  • composition for cell medicine comprising a cell fraction containing mononuclear cells, prepared by the method according to any one of (1) to (11).
  • the apparatus comprising: a second means for selecting a group force including a means having a cell separation membrane capable of separating a nucleus cell and a red blood cell.
  • the apparatus comprising means for containing a granulocyte adsorbent and a cell separating agent capable of separating mononuclear cells and red blood cells.
  • a cell medical composition comprising a cell fraction containing mononuclear cells, prepared using the device according to any one of (13) to (16).
  • unnecessary cells such as granulocytes and erythrocytes are removed from body fluids such as peripheral blood, umbilical cord blood, and bone marrow fluid of mammals, and cells containing mononuclear cells
  • body fluids such as peripheral blood, umbilical cord blood, and bone marrow fluid of mammals
  • cells containing mononuclear cells The fraction can be easily and selectively separated to prepare a therapeutic cell exhibiting a high therapeutic effect in cell therapy.
  • the mammalian body fluid referred to in the present invention is not particularly limited as long as it is a mammalian body fluid containing mononuclear cells, granulocytes and erythrocytes, but typically, peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow fluid , And their dilutions.
  • the mononuclear cells referred to in the present invention are monocytes, macrophages, lymphocytes, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, stromal cells, stromal cells, vascular endothelial cells, ⁇ contained in mammalian body fluids Cells that are useful in the field of cell medicine, such as dendritic cells and Langeron cells.
  • the granulocyte-adsorbing material referred to in the present invention can be any shape, mode, component, or material as long as it can adsorb granulocytes by contacting with a cell fluid containing granulocytes, including mammalian body fluids. Regardless of type or separation principle.
  • Examples of the shape and mode of the granulocyte adsorbent include water-insoluble particles, nonwoven fabrics, porous bodies, flat membranes, and hollow fibers, but are not particularly limited thereto. From the standpoint of the ability to adsorb granulocytes, the components and types of the granulocyte adsorbents are not particularly limited.
  • the crosslinked polyvinyl alcohol alone or a copolymer with polybulal alcohol, such as ethylene bull alcohol is used.
  • Copolymers Styrene-Buyalcohol Copolymers, Atarylate-Buyalcohol Copolymers, Acrylamide-Buyalcohol Copolymers, Synthetic Polymers such as Polyester, Polyethylene, Polystyrene, Polyurethane, and Cellulose, Sepharose, Dextrane, Agarose, Polysaccharides such as chitin and chitosan and their derivatives, more preferably Examples include rivuyl alcohol, ethylene butyl alcohol copolymer, cellulose, chitosan and their derivatives.
  • an unsubstituted hydroxyl group and H in the group are substituted by one or more substituents R.
  • a polymer compound having a hydroxyl group formed is preferably used, and more preferably, a partial acid-acetic acid cellulose cell described in Examples of the present specification to be described later is used.
  • the polymer compound having an unsubstituted hydroxyl group and a hydroxyl group in which H in the group is substituted by one or more substituents R is typically a crosslinked polyvinyl alcohol.
  • a single or a copolymer with polybulal alcohol for example, ethylene butalcoal copolymer, styrene butyalcohol copolymer, acrylate aryl alcohol copolymer, acrylamide-vinyl alcohol copolymer, or a plurality of polysaccharides
  • H in the group is substituted with one or more substituents R.
  • polysaccharide examples include, but are not limited to, cellulose, sepharose, dextran, agarose, chitin, chitosan and the like.
  • Substituent R in the present invention means an arbitrary atomic group capable of replacing H of the hydroxyl group of the polymer compound before substitution.
  • the “substituent R” is understood to be a group derived from “another compound” generated by a reaction (typically a dehydration reaction) between a hydroxyl group and “another compound”.
  • the “other compound” any compound that can react with the hydroxyl group of the polymer compound before substitution to form a conjugate of the polymer compound can be used.
  • the bond can be cleaved under alkaline conditions, particularly by contact with a mild alkaline solution.
  • non-limiting examples of “other compounds” include inorganic acids such as phosphoric acid, sulfuric acid; organic acids such as saturated or unsaturated branched or linear aliphatic monovalent, Divalent or polyvalent carboxylic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, acrylic acid, methacrylic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid; saturated or unsaturated branched or linear aromatic monovalent, 2 Monovalent or polyvalent carboxylic acids such as benzoic acid; amino acids such as glutamic acid; alcohols such as saturated or unsaturated branched or linear Aliphatic mono-, di- or polyhydric alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol mononole, isopropino-leanolone, cyclohexanol, ethyleneglycol, glycerin; saturated or unsaturated branched or linear aromatics Monovalent, divalent or polyhydric alcohols such as
  • the reaction between the acid and the polymer compound having a plurality of hydroxyl groups can be achieved by forming an ester bond in the presence of a suitable catalyst such as sulfuric acid.
  • the reaction between the alcohol and the polymer compound having a hydroxyl group can be achieved by forming an ether bond in the presence of a suitable catalyst such as sulfuric acid.
  • a hydroxyl-protecting group known in the art may be used as the substituent R. Hydroxyl protecting groups are described, for example, in T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, New York (1999).
  • Examples of the hydroxyl protecting group include an ether protecting group, an acetal protecting group, a silyl protecting group, and an ester protecting group.
  • An ether-based protecting group means a protecting group that forms an ether bond for the purpose of protecting a hydroxyl group, and is a methyl group, an ethyl group, a tert butyl group, an octyl group, an aryl group, or a benzyl group that is substituted with H of the hydroxyl group.
  • the acetal-based protecting group represents a protecting group that forms an acetal bond for the purpose of protecting the hydroxyl group, and examples thereof include a methoxyethyl group, an ethoxyethyl group, a tetrahydrovinyl group, and a tetrahydrofuranyl group.
  • a silyl-based protecting group means a protecting group that forms a silyloxy group bond for the purpose of protecting a hydroxyl group, and includes a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, and a tert-butyldiphenylsilyl group. Etc.
  • the ester-based protecting group represents a protecting group that forms an ester bond for the purpose of protecting the hydroxyl group, and includes an acetyl group, a propionyl group, an isopropyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group, a trifluoroacetyl group, A trichloroacetyl group etc. can be mentioned. [0035] It is understood that the precursor compound of the hydroxyl-protecting group is included in the "other compound”.
  • examples of the substituent R include saturated or unsaturated, linear or branched, aliphatic acyl (eg, alkoxycarbol, acetyl, oleyl, etc.), saturated or unsaturated, Linear or branched aromatic acyl (eg aryloxycarbonyl, benzoyl, cinnamoyl, etc.), saturated or unsaturated, linear or branched, alkyloxy, alkyloxy, alkyloxy More preferred substituents R include aliphatic or aromatic saturated acyl (for example, benzoyl), and most preferably acetyl. The substituent may be replaced with an optional substituent such as halogen.
  • aliphatic acyl eg, alkoxycarbol, acetyl, oleyl, etc.
  • Linear or branched aromatic acyl eg aryloxycarbonyl, benzoyl, cinnamoyl, etc.
  • More preferred substituents R include alipha
  • the granulocyte adsorbent used in the present invention is, for example, (a) a polymer compound having a plurality of hydroxyl groups, and one or two or more other compounds can be cleaved under alkaline conditions.
  • Such polymer-compound-compound conjugates are commercially available. It is also possible to obtain a polymer compound / compound conjugate by reacting the polymer compound with another compound according to a method known per se.
  • cellulose acetate can be obtained by adding an acetylating agent containing acetic anhydride or the like to cellulose obtained from pulp or the like.
  • cellulose acetate can also be obtained by reacting a polymer compound having a hydroxyl group (for example, cellulose) with another compound (for example, acetic acid) by a method known per se.
  • poly (acetate butyl) is prepared by feeding a powerful mixture such as monomeric butyl acetate and triallyl isocyanurate (TAIC) into an aqueous phase containing water, poly (bull alcohol), etc., with a flat stirring blade and two baffle plates. Perform thorough mixing and nitrogen substitution at room temperature in a separate flask with an internal temperature of 65 ° C. The suspension can be obtained by suspension polymerization for 5 hours.
  • TAIC monomeric butyl acetate and triallyl isocyanurate
  • the polymer compound compound conjugate includes a plurality of bonds between the hydroxyl group of the polymer compound and the other compound.
  • the conjugate is treated under mild alkaline conditions, whereby a part of the plurality of linkages is cleaved by, for example, a hydrolysis reaction.
  • the degree of cutting can be appropriately adjusted according to the type of the conjugate and the intended use of the granulocyte adsorbent.
  • the ratio of hydroxyl groups substituted by acetyl groups is preferably 35 to 53% of the total hydroxyl groups (including unsubstituted hydroxyl groups and substituted hydroxyl groups).
  • Polyacetate butyl which is preferably 35 to 49%, can be used.
  • the ratio of hydroxyl groups substituted by acetyl groups is preferably 35 to 53% of all hydroxyl groups (including unsubstituted hydroxyl groups and substituted hydroxyl groups), more preferably 40 to 53%.
  • An acetic acid cellulose source of 53%, even more preferably 45-53% can be used.
  • the substitution rate (%) of the hydroxyl group of cellulose acetate by the acetyl group can be measured, for example, as follows. After sufficiently drying the test substance, measure the dry weight with a precision balance (around 0.5 g) and place it in a flask. Add 50 ml of a solvent (for example, acetone aqueous solution) that can dissolve the test substance and stir with a stirrer at room temperature for 1 hour. Next, add 50 ml of 0.2N sodium hydroxide aqueous solution, stir for 5 minutes, and let stand at room temperature for 3 hours. Next, 50 ml of 0.2N hydrochloric acid is placed in the flask, stirred for 5 minutes, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • a solvent for example, acetone aqueous solution
  • an elemental analyzer Mericrocoder JM10 type manufactured by GA Science Lab can be used.
  • the partial decomposition reaction in step (b) is carried out under the following conditions. It is preferable to be broken.
  • the normality of the alkaline solution is preferably in the range of 0.01N (normative) to 2. ON, more preferably in the range of 0.05N to 1N, and most preferably in the range of 0.0N force and 0.5N.
  • the reaction time is preferably in the range of 1 minute to 120 minutes, more preferably in the range of 1 minute to 100 minutes, more preferably in the range of 5 minutes to 60 minutes, and most preferably in the range of 10 minutes to 40 minutes. .
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C to 90 ° C, more preferably in the range of 15 ° C to 75 ° C, and most preferably in the range of 20 ° C to 58 ° C.
  • the partial decomposition reaction in step (b) is preferably performed under the following conditions. Normality of alkaline solution is from 0.01 N (normative) to 6. ON range is preferred 0.1 N force 5. ON range is more preferred 1N to 3.8 N range is most preferred.
  • the reaction time is preferably in the range of about 1 minute to 10 hours, more preferably in the range of 30 minutes to 6 hours, and most preferably in the range of 1 hour to 5.5 hours.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C to 90 ° C, more preferably in the range of 15 ° C to 75 ° C, and most preferably in the range of 20 ° C to 58 ° C.
  • an alcohol such as methanol, ethanol, or propanol may be added.
  • the content of alcohol is 0.1% (V / V), as long as the force is within the range of 99% (V / V). 50% (V / V) is preferred, and 10% (V / V) to 40% (V / V) is more preferred.
  • the cleavage product may be purified after step (b)! /.
  • the purification method is not particularly limited, but the purification can be performed by washing such as washing with water.
  • the granulocyte adsorbent of the present invention is preferably water-insoluble.
  • the present invention is primarily a method for preparing a cell fraction containing mononuclear cells from a mammalian body fluid containing mononuclear cells, granulocytes and erythrocytes,
  • the present invention relates to a method for preparing a cell fraction containing mononuclear cells, which comprises a step B in which at least one treatment selected from them is performed.
  • Steps A and B may each be performed a plurality of times. In other words, step A and step B may be performed at least once.
  • the “sample during or after treatment in Step A” used in Step B includes samples during or after treatment in Step A multiple times. Further, the “sample during or after the treatment by the step A” includes a sample obtained by diluting or concentrating the solution during or after the treatment by the step A.
  • the method is also a method for preparing a cell fraction containing mononuclear cells from a mammalian body fluid containing mononuclear cells, granulocytes and red blood cells,
  • the present invention relates to a method for preparing a cell fraction containing mononuclear cells, comprising the step D of contacting a sample after the treatment in Step C with a granulocyte adsorbent.
  • Steps C and D may each be performed multiple times! In other words, step C and step D may be performed at least once.
  • the “sample after treatment in Step C” used in Step D includes samples during or after treatment in Step C multiple times.
  • the “sample after treatment with step C” includes a sample obtained by diluting or concentrating the solution obtained by the treatment in step C.
  • sample during or after treatment in step A” and “sample after treatment in step C” may be collectively referred to as “sample prepared from body fluid”.
  • Step A or D will be described.
  • step A or D body fluid is treated with a granulocyte adsorbent, so that at least a part of granulocytes, preferably 65 % Or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more is removed using a granulocyte adsorbent. It is a process.
  • the removal rate is the percentage of the number of removed cells in the number of cells before the removal treatment.
  • the method of treating the mammalian body fluid or the sample after the treatment by the step C with the condylar granule adsorbent is a method in which the bodily fluid or the sample and the granulocyte adsorbent are in contact with each other.
  • the body fluid or the sample is put, and a certain sputum is carried out by placing the granulocyte adsorbent in a container containing the body fluid or the sample, shaking as necessary, and collecting the body fluid containing cells from the container. .
  • the shape and material of the column used for the treatment of the granulocyte adsorbent there is no particular restriction on the shape and material of the column used for the treatment of the granulocyte adsorbent. Any material can be used as long as it can be packed without leaking outside and is not affected by elution of the column material.
  • the shape of the column is not particularly limited as long as it has a shape that allows various samples such as a columnar shape, a spindle shape, and a spiral shape to pass through the body fluid or fluid strength of a mammal.
  • the column material may be metal, glass, ceramic, synthetic polymer, etc., which may be rigid or flexible, but is preferably capable of withstanding sterilization.
  • Step B or C is a step of removing unwanted cells such as erythrocytes during the treatment of mammalian body fluids or during or after treatment by step A.
  • the granulocytes can be removed with little force as the red blood cells are substantially removed.
  • red blood cells are ⁇
  • Substantially removed '' refers to the removal of red blood cells to the extent that they do not interfere with the usefulness of the cell fraction containing mononuclear cells prepared by the method of the present invention. Means that 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more of red blood cells are removed.
  • the removal rate is the percentage of the number of removed cells in the number of cells before the removal treatment.
  • sputum cells that do not contribute to the use of cell fractions containing mononuclear cells such as red blood cells and granulocytes may be referred to as unnecessary cells.
  • step B or C centrifugation of the mammalian body fluid or sample during or after treatment by step A, addition of a cell separating agent to the body fluid or sample, and cells of the body fluid or sample Separation force by separation membrane Group force At least one selected treatment is performed.
  • the centrifugation treatment is more preferably performed under conditions capable of separating mononuclear cells and red blood cells and granulocytes, which are preferably performed under conditions capable of separating mononuclear cells and red blood cells. .
  • Such a centrifugation process can be appropriately performed by a known centrifugation process for red blood cell separation.
  • the cell separation agent is preferably a cell separation agent capable of separating mononuclear cells and erythrocytes, and is preferably a cell separation agent capable of separating erythrocytes and granulocytes. Is more preferable.
  • the cell separation membrane is a cell separation membrane capable of separating erythrocytes and granulocytes, which are preferably cell separation membranes capable of separating mononuclear cells and erythrocytes. It is more preferable.
  • a sample prepared from a mammalian body fluid or body fluid is placed in a container, although the whole container is subjected to centrifugation, it is also possible to add a specific gravity solution such as a polysaccharide such as ficoll, an inorganic substance such as percoll, and salt and cesium, and perform density gradient centrifugation.
  • a specific gravity solution such as a polysaccharide such as ficoll, an inorganic substance such as percoll, and salt and cesium, and perform density gradient centrifugation.
  • the material and shape of the container used are not particularly limited, but it is preferable to use a cell bag for centrifugation, a tube for centrifugation, or the like.
  • a cell separation agent such as HES (hydroxyethyl starch) can be used to remove unnecessary cells such as erythrocytes having a sample fluid whose body fluid or body fluid force is also prepared using the cell separation agent.
  • HES hydroxyethyl starch
  • the cells are allowed to stand or centrifuged to precipitate unwanted cells such as erythrocytes and contain mononuclear cells. Collect the cell fraction.
  • a continuous or intermittent centrifuge such as the existing blood cell component separation apparatus (for example, CS-3000 manufactured by Baxter, Multi manufactured by Haemonetics, etc.) as described above. Is possible
  • the cell separation membrane by using a cell separation membrane, unnecessary cells such as erythrocytes contained in a body fluid or a sample prepared from the body fluid are separated from mononuclear cells, and a cell fraction containing mononuclear cells selectively. Can also be recovered.
  • the cell separation membrane to be used is not particularly limited as long as it separates a cell fraction containing mononuclear cells from unnecessary cells such as erythrocytes, but is not limited to a nonwoven fabric, a porous body, a flat membrane, or a hollow membrane. Yarn is preferred.
  • erythrocytes are allowed to pass, but the outer shell is larger than erythrocytes, and mononuclear cells are not allowed to pass.
  • a cell separation membrane Using a cell separation membrane, a mammalian body fluid or a sample prepared from the body fluid passes through the cell separation membrane. In this way, red blood cells pass through the cell separation membrane, but mononuclear cells having a larger outline than the red blood cells do not pass through the cell separation membrane, and the red blood cells and the mononuclear cells are separated. Then, the side that does not permeate the cell separation membrane can be collected as a mononuclear cell-containing fraction.
  • a cell separation membrane capable of capturing red blood cells can be used as the cell separation membrane.
  • Step B or Step C When Step B or Step C is performed by a centrifugation method or a method using a cell separation agent, Step A and Step B, or Step C and Step D may be performed in the same container. Yes.
  • unnecessary body cells such as erythrocytes and mononuclear cells are typically treated with a granulocyte-adsorbing material after treatment of mammalian body fluid, and centrifuged without collecting the treated body fluid. And the mononuclear cell fraction is collected.
  • a mammalian body fluid to a container containing the granulocyte adsorbent, or adding a granulocyte adsorbent to the container containing the body fluid, and then performing shaking or the like as necessary.
  • the granulocyte adsorbent is brought into contact with the body fluid to perform the granulocyte adsorbent treatment.
  • Sarako the treated body fluid
  • An unnecessary cell such as erythrocytes and a cell fraction containing mononuclear cells are separated by centrifuging the contained container or further adding a cell separating agent to the container.
  • a specific gravity solution such as Ficoll may be added, followed by density gradient centrifugation.
  • the material and shape of the container to be used are not particularly limited, but it is preferable to use a cell bag for centrifugation, a tube for centrifugation, or the like.
  • a cell separation agent such as HES
  • HES cell separation agent
  • the shape and material of the container used in steps A to D are not particularly limited, and are involved in each step. Any material can be used as long as the material (granulocyte adsorbent, cell separation agent, body fluid, etc.) is not affected by the elution of the container material that does not leak out.
  • the shape of the container is a bag
  • a blood bag a cell culture bag, or a processed product thereof, or a tube for cell treatment. , And processed it.
  • any anticoagulation measure that does not have a negative effect on the mammalian body fluid, the cell separating agent, or the granulocyte adsorbent can be applied.
  • a specific example of a preferable anticoagulant measure is to add an anticoagulant to the mammalian body fluid from the viewpoint of simplicity.
  • anticoagulants include heparin, low molecular weight heparin, nafamostat mesylate, gabexate mesylate, argatroban, or acid citrate dextrose solution (ACD solution) citrate phosphate.
  • ACD solution acid citrate dextrose solution
  • citrate-containing anticoagulants such as dextrose solution (CPD solution), and V deviation may be used.
  • the present invention also relates to an apparatus for preparing a cell fraction containing mononuclear cells from a mammalian body fluid containing mononuclear cells, granulocytes and erythrocytes.
  • the apparatus comprises a first means containing a granulocyte adsorbent, a means for centrifuging a sample during or after treatment with the body fluid or step A, a cell capable of separating mononuclear cells and red blood cells.
  • the first means is a means for performing the above steps A or D, and is a means for removing at least a part of granulocytes.
  • the second means is a means for performing the above-mentioned step B or C, and is a means for substantially removing red blood cells and removing other unnecessary cells (for example, granulocytes).
  • the meaning of the term “removing at least a part of granulocytes” and the term “substantially removing red blood cells” and the preferred range are as already defined in this specification.
  • first means and the second means are in fluid communication to facilitate movement of the treatment body fluid between the two means.
  • first means and the second means are connected by a transfer tube.
  • the tube for transfer here is not limited in its material and shape as long as it can move the treatment body fluid between both means aseptically. It is also preferable that the transfer tube has a detachable structure so that the first means and the second means can be separated when the transfer is not necessary after the processing is completed.
  • each member such as a container included in the apparatus provided by the present invention does not have a negative influence on the mammalian body fluid used, the cell separating agent, the granulocyte adsorbent and the like. Anything can be used.
  • Specific examples include synthetic polymers, metals, glass, and ceramics.
  • Specific examples of preferred non-reactive polymers as synthetic polymers include acrylonitrile butadiene styrene from the standpoint of having no negative effect on the mammalian body fluids, cell separators, and granulocyte adsorbents used.
  • Acrylonitrile polymers such as terpolymers, halogenated polymers such as polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene, polyamides, polysulfones, polycarbonates, polyethylenes, polypropylenes , Polyvinyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate butt port, nitrile butadiene styrene, polystyrene, and the like, but not limited thereto. From the same point of view, a metal with high biocompatibility is preferred as a metal.
  • Examples include forces such as stainless steel, titanium, platinum, tantalum, gold, and their alloys, as well as gold-plated alloy iron, platinum-plated alloy iron, cobalt chromium alloy, and titanium nitride coated stainless steel. It is not limited. Further, from the same viewpoint, glass and earthenware are preferable materials. Among these materials, materials that can withstand sterilization operations such as autoclave, gamma ray irradiation, and exposure to EOG (ethylene oxide gas) are more preferable. Specific examples of such materials include polypropylene, polystyrene, ⁇ Vinyl, polycarbonate, polysulfone, polymethylpentene, glass, ceramics, etc.
  • the form of the container included in the apparatus provided by the present invention is not particularly limited, but specific examples include a spherical shape, a cylindrical shape, a bag shape, and the like.
  • the size of the container included in the device provided by the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 2 from the viewpoint of the amount of mammalian body fluid to be separated. , OOOml, more preferably 0.5 to 1, OOOml, and even more preferably l to 200 ml.
  • a typical form of the first means is a column filled with the granulocyte adsorbent or a container containing the granulocyte adsorbent.
  • the column used in the first means is not particularly limited in its shape and material, so long as the granulocyte adsorbent can be packed without leaking outside and is not affected by elution of the column material. But you can use it.
  • the column shape may be various, such as a columnar shape, a spindle shape, or a spiral shape, but is not particularly limited as long as it has a shape that allows passage of a mammalian body fluid or fluid fluid prepared sample !, .
  • the column material may be metal, glass, ceramic, synthetic polymer, etc., which may be rigid or flexible, but is preferably capable of withstanding sterilization operations.
  • a container for containing the granulocyte adsorbent the granulocyte adsorbent and a sample prepared from a mammalian body fluid or body fluid can be accommodated in the container, and if necessary, shaken or Any material can be used as long as it can bring the mammalian body fluid or a sample prepared from the body fluid into contact with the granulocyte-adsorbing material.
  • the container can be easily transferred with the mammalian body fluid or a sample prepared from the body fluid, and can be kept airtight and sterilized.
  • a container for storing a mammalian body fluid may be connected to the first means.
  • the first means and the storage container are preferably connected by a removable transfer tube.
  • the second means may be a deviation form of a means for centrifuging a body fluid or a sample prepared from the body fluid, a means for containing a cell separation agent, or a means having a cell separation membrane.
  • a container for containing a mammalian body fluid is provided. Any container can be used as long as it can accommodate mammalian body fluid without leaking to the outside. Preferred examples of the container include ease of transfer of mammalian body fluid and sealing. Cell culture bags or blood bags equipped with cell transfer holes, cell transfer tubes, seals that can be sealed, etc., because sterility is maintained and they can withstand the impact of centrifugation. Furthermore, a tube for cell culture or a tube for centrifugation can be mentioned.
  • a blood component separation device can be used as the means.
  • continuous or intermittent centrifuges such as Baxter C S-3000, Haemonetics Multi, etc.
  • the blood component separation device includes a centrifuge tube.
  • the container containing the cell separating agent can be used as the means.
  • the cell separation agent may be transferred through the cell transfer hole and the cell transfer tube provided in the vessel. Independent transfer holes and transfer tubes are provided and transferred through them. It can also be done.
  • the container having the cell separation membrane therein can be used as the means.
  • Cell separation membranes can be made of any material and shape as long as unnecessary cells such as erythrocytes can be removed by passing mammalian fluid. There are no particular restrictions, but preferred specific examples include non-woven fabrics such as polyester and polyethylene terephthalate, porous materials such as polyurethane, and Egyptian cotton.
  • cell separation membranes may be selected from existing cell separation filters such as Asahi Medical Sepacel and Terumo Imgard!
  • the second means may be connected to a container for collecting the mammalian body fluid that has undergone the red blood cell removal process.
  • the second means and the collection container are connected by a detachable transfer tube.
  • the present invention is also an apparatus for preparing a cell fraction containing mononuclear cells from a mammalian body fluid containing mononuclear cells, granulocytes and erythrocytes, comprising a granulocyte adsorbent and cell separation. It is related with the said apparatus provided with the means formed by accommodating an agent in the same container. In this equipment, process A and process B or process C and process D are performed in the same container. Specifically, the method of using this device is as follows. First, after adding a mammalian body fluid to a container containing the granulocyte adsorbent, or adding the adsorbent to a container containing the bodily fluid, the adsorbent is shaken as necessary.
  • a cell separation agent such as HES is used, and after mixing the treated body fluid and the cell separation agent, the cells are allowed to stand or centrifuged to precipitate unnecessary cells such as erythrocytes. Collect cell fractions containing spheres
  • the present invention is also an apparatus for preparing a cell fraction containing mononuclear cells from a mammalian body fluid containing mononuclear cells, granulocytes and erythrocytes, which contains a granulocyte adsorbent. It is related with the said apparatus provided with the container for centrifugation and the means to centrifuge this container.
  • the means for centrifuging the container is preferably a means for centrifuging the container under conditions that allow separation of mononuclear cells and red blood cells.
  • process A and process B or process C and process D are performed in the same container.
  • the method of using this apparatus is as follows.
  • the centrifuge container is centrifuged to separate unnecessary cells such as red blood cells and cell fractions containing mononuclear cells.
  • a specific gravity solution such as Ficoll may be added and density gradient centrifugation may be performed.
  • the material and shape of the centrifuge container are not particularly limited, but it is preferable to use a centrifuge cell bag or a centrifuge tube.
  • the present invention also provides a cell medical composition
  • a cell medical composition comprising a cell fraction containing mononuclear cells obtained by the method or apparatus provided by the present invention.
  • the composition for cell medical treatment can be diluted or redispersed with a medium acceptable for clinical application using only the cell fraction provided by the present invention.
  • the clinically acceptable medium referred to here includes physiological saline, phosphate buffer, albumin solution, dextran solution, or plasma or serum in mammalian body fluid. Anything other than those listed above can be used.
  • Target diseases to be treated with the composition include vascular diseases such as ischemic heart disease, lower limb ischemic artery disease, blood diseases such as leukemia, multiple sclerosis, autoimmune diseases such as systemic erythematosus
  • vascular diseases such as ischemic heart disease, lower limb ischemic artery disease, blood diseases such as leukemia, multiple sclerosis, autoimmune diseases such as systemic erythematosus
  • the force includes cancer, osteochondral disease, skin disease, neurological disease, eye disease and the like, but is not limited thereto.
  • the mammalian body fluid to be treated by the method or apparatus disclosed by the present invention can be treated by the method or the device immediately after collection, but the mammalian body fluid is stored in a refrigerator. It can be processed later or after thawing the frozen one.
  • the following operations were performed using human peripheral blood as the mammalian body fluid, HES as the cell separation material, and partially oxidized cellulose acetate beads as the granulocyte adsorbent.
  • the solution was made into droplets by the method (vibration method) described in JP-A-63-117039 and coagulated to obtain spherical particles of cellulose acetate.
  • the obtained spherical particles had a particle size of about 300 ⁇ m.
  • the particles were mixed with a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution at a ratio of settling volume ratio of 1: 1 (VZ V) and brought into contact with each other for 30 minutes to carry out a partial hydrolysis reaction.
  • Peripheral blood was collected from healthy volunteers. This thing is a red blood cell per 1ml 4. 3 X 10 9 cells, leukocytes 4. 6 X 10 6 cells (of which mononuclear 2. 1 X 10 6 cells, granulocytes about 2. 3 X 1 0 6 Included).
  • Treatment Zone 3 After adsorbent treatment, remove 1500 / zl of HES40 (amount that gives a HES concentration of 2.57% with respect to the total volume), centrifuge at 50 g for 5 minutes, collect the supernatant, It was. Furthermore, after treatment with the adsorbent, add 2 ml of RPMI 1640 culture solution (Gibco), add 800 1 (the amount that makes the HES concentration 1% of the total volume) HES40, and centrifuge at 50 g for 5 minutes to collect the supernatant. This was designated as Treatment Zone 3.
  • control group 2 ml of peripheral blood was used as control group 1. Also, add 400 1 (the amount that makes the HES concentration 1% of the total volume) of HES40 in 2 ml of peripheral blood, centrifuge at 50 g for 5 minutes, collect the supernatant, and use this as control group 2 . In addition, 1500 ul of HES40 (amount that gives a HES concentration of 2.57% with respect to the total volume) was added to 2 ml of peripheral blood, centrifuged at 50 g for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • Control Group 4 add 2 ml of RIMI1640 culture solution to 2 ml of peripheral blood, hold 800 ul of HES40 (amount that makes the HES concentration 1% of the total volume), centrifuge at 50 g for 5 minutes, and collect the supernatant. This was designated as Control Group 4.
  • Table 1 shows the erythrocyte removal rate and granulocyte removal rate in the control and treatment groups obtained by force.
  • the red blood cell removal rate was 99%, and the granulocyte removal rate was excellent at about 95%.
  • porcine bone marrow fluid as a mammalian body fluid
  • HES as a cell separating agent
  • partially oxidized cellulose acetate beads as a granulocyte adsorbent.
  • Cellulose acetate was dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide and propylene glycol, and this solution was formed into droplets by the method described in JP-A-63-117039 (vibration method) and solidified to obtain spherical particles of cellulose acetate. .
  • the obtained spherical particles had a particle size of about 300 ⁇ m.
  • the particles were mixed with a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution at a ratio of settling volume ratio of 1: 1 (VZ V) and brought into contact with each other for 30 minutes to carry out a partial hydrolysis reaction.
  • Bone marrow fluid was collected from the iliac bone of a miniature pig (crown, 30 kg). This is 5 OX 10 9 erythrocytes per ml, 1. OX 10 7 leukocytes (including 3. OX 10 6 mononuclear cell fraction cells, 5. OX 10 6 granulocytes per ml) ) It was included.
  • Treatment Zone 6 After treatment with the adsorbent, add 1500ul (the amount that makes the HES concentration 2.57% of the total amount) HES40, centrifuge at 50g for 5 minutes, collect the supernatant, and this was designated as treatment zone 5 . After treatment with the adsorbent, add 2 ml of RIMI 1640 culture solution (Gibco), add 800 ul of HES40 (amount that makes the HES concentration 1% of the total volume), centrifuge at 50 g for 5 minutes, and collect the supernatant. This was designated as Treatment Zone 6.
  • control group 2 ml of peripheral blood was used as control group 5.
  • 400 ul of HES40 (amount that gives a HES concentration of 1% to the total volume) was added to 2 ml of peripheral blood, centrifuged at 50 g for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • 1500 ul (HES concentration 2.57% of the total volume) of HES40 was added to 2 ml of peripheral blood, centrifuged at 50 g for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • Table 2 shows the physical properties of the control and treatment groups obtained by force.
  • control groups 6-8 red blood cells could be removed, but granulocyte fraction removal was about 3-20%, whereas in treatment groups 4-6, both red blood cells and granulocytes were over 80%. In the treatment groups 5 and 6, the granulocyte fraction removal rate was 90% or more.

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Abstract

　哺乳動物体液から、赤血球、顆粒球等の不要な細胞を除去し、単核球を含む細胞画分を調製する簡便な方法、および装置を提供する。 　顆粒球吸着材による処理と遠心分離、細胞分離剤、または細胞分離フィルターを使用した不要細胞の除去との組合せにより、単核球を含む細胞画分を調製する。本発明はまた、単核球を含む細胞画分を調製する装置であって、哺乳動物の体液を顆粒球吸着材で処理する手段と、該処理細胞画分を遠心分離法、細胞分離剤を用いた方法、または細胞分離膜を用いた方法により、赤血球などの不要細胞画分を除去する手段とからなる細胞調製装置を提供する。

Description

明 細 書
細胞調製方法および装置
技術分野
[0001] 本発明は造血幹細胞移植や活性化リンパ球療法をはじめ様々な細胞療法に用い られる治療用細胞を簡便かつ効率的に調製する方法および装置、また該方法およ び該装置によって得られた細胞集団に関する。
背景技術
[0002] 白血病患者に対する造血幹細胞移植や癌患者に対する活性化リンパ球療法が実 用的な治療方法として確立され、さらには虚血性心疾患や下肢虚血性動脈疾患患 者への骨髄または末梢血由来の単核球画分移植療法などが臨床応用されて ヽる。 これら単核球画分移植療法においては、遠心分離または比重液を使用した遠心分 離方法が広く使用されている。しカゝしながら、これら方法で調製される単核球画分に は、治療に有効ではない不要細胞が混在するため、不要細胞を除去、ならびに単核 球を選択的に濃縮する方法の開発が、治療効果を高めるために望まれている。ここ でいう単核球画分とは、骨髄、末梢または臍帯血に含まれる間葉系幹細胞、造血幹 細胞、血管前駆細胞、単球、マクロファージ、リンパ球などの細胞治療に有用な細胞 画分を言う。細胞治療用の単核球画分の調製方法としては、造血幹細胞移植のため の骨髄液または G— CSF (顆粒球コロニー刺激因子)や CY (シクロフォスフアミド)等 により幹細胞を動員した末梢血力 細胞分離装置を用いた単核球画分の分離方法（ 非特許文献 1、非特許文献 2)があるが、高価な装置を必要とし、操作も煩雑である。 また、このような装置により分離 ·回収された単核球画分には顆粒球等の不要細胞が 混在しており移植時の炎症惹起の可能性が示唆されており、治療効果を低減する可 能性が示されて 、る (非特許文献 3)。
[0003] 上記の観点力 種々の検討がなされており、例えば、特開 2002— 171965は、採 取された骨髄液に HES (ヒドロキシェチル澱粉)を添加して赤血球を沈降させ、単核 球細胞を含む上清を回収し、これを遠心分離することにより簡便に単核球細胞濃縮 物を得る方法を開示する。この方法にぉ 、て必要な機器は簡単な遠心分離機であり 、細胞分離装置のような大掛力りで煩雑な操作を要する機器を用いることなぐ目的 の単核球細胞濃縮物を得ることができる。しかし、この方法は骨髄液中の赤血球を沈 殿させることによって単核球の濃度を濃縮するものであり、骨髄液中の顆粒球の除去 する手段にっ 、ては何ら言及されて 、な 、。
[0004] 特開 2004— 121144は、臍帯血力も分離膜を使用して単核球を分離するシステム を開示する。本方法では、単核球と赤血球との分離は良好であるが、回収される単 核球画分には顆粒球が混在する。
特許文献 1 :特開 2002— 171965
特許文献 2：特開 2004 - 121144
非特許文献 1 :造血幹細胞マニュアル 3.移植の準備と造血幹細胞採取 日本医学 館 p. 225 -p. 274
非特許文献 2 :末梢血幹細胞移植の実際 南江堂 IV 末梢血幹細胞の採取、保存
、品質管理 3.成人における採取方法 p. 62— p. 67
非特許文献 3 : Circulation 106卷 2019 - 2025 2002年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、哺乳動物の体液、たとえば、末梢血、臍帯血、骨髄液等から、不 要な細胞を除去するとともに、目的の細胞を簡便かつ効率的に分離し、細胞療法に おける治療用細胞を安全かつ安定に供給する方法、および装置、さらにそれらによ つて得られた細胞画分からなる治療用細胞組成物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を進めた結果、特定の細胞の選 択的吸着法と遠心分離、細胞分離剤、または細胞分離膜を用いた細胞分離法とを 組み合わせることにより、細胞医療に有用な単核球を含む細胞画分を選択的に分離 する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
[0007] 本発明が提供するものは以下の通りである。
[0008] (1)単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液からの、単核球を含む 細胞画分の調製法であって、 前記体液を顆粒球吸着材と接触させる工程 Aと、
工程 Aによる処理中または処理後の試料の、単核球と赤血球とを分離することがで きる条件下での遠心分離、工程 Aによる処理中または処理後の試料への、単核球と 赤血球とを分離することができる細胞分離剤の添加、および工程 Aによる処理中また は処理後の試料の、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜による分 離カゝらなる群カゝら選択される少なくとも 1種の処理を行う工程 Bとを含む、単核球を含 む細胞画分の調製法、あるいは
前記体液の、単核球と赤血球とを分離することができる条件下での遠心分離、前記 体液への、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤の添加、および前 記体液の、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜による分離からなる 群カゝら選択される少なくとも 1種の処理を行う工程 Cと、
工程 Cによる処理後の試料を顆粒球吸着材と接触させる工程 Dとを含む、単核球を 含む細胞画分の調製法。
[0009] (2)工程 Aまたは工程 Dが、顆粒球吸着材が充填されたカラムに前記体液またはェ 程 Cによる処理後の試料を通過させる力 顆粒球吸着材と前記体液または工程じに よる処理後の試料とを同一容器内で接触させることにより行われる（1)記載の方法。
[0010] (3)工程 Bまたは工程 C力 前記体液または工程 Aによる処理中または処理後の試 料の、単核球と赤血球とを分離することができる条件下での遠心分離、および前記体 液または工程 Aによる処理中または処理後の試料への、単核球と赤血球とを分離す ることができる細胞分離剤の添加からなる群力 選択される少なくとも 1種の処理を行 う工程であり、かつ
工程 Aと工程 B、あるいは工程 Cと工程 Dとが同一容器内で行われる、（1)記載の 方法。
[0011] (4)顆粒吸着材が、水不溶性粒子、不織布、多孔質体、平膜、および中空糸からな る群力 選ばれる少なくとも 1種である（1)〜（3)のいずれかに記載の方法。
[0012] (5)細胞分離膜が、不織布、多孔質体、平膜、および中空糸力もなる群力 選ばれる 少なくとも 1種である（1)、 (2)または (4)記載の方法。
[0013] (6)顆粒球吸着材が、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換基 R によって置換された水酸基とを有する重合体化合物を含有する顆粒球吸着材である
、（1)〜（5)のいずれかに記載の方法。
[0014] (7)前記重合体化合物が、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置 換基 Rによって置換された水酸基とを有するポリビュルアルコール、ポリビュルアルコ ール共重合体または多糖類である（6)記載の方法。
[0015] (8)置換基 Rがァシルである（6)または（7)記載の方法。
[0016] (9)水不溶性である（6)〜（8)の 、ずれかに記載の方法。
[0017] (10)置換基 Rによって置換されている水酸基の割合が全水酸基の 35〜53%である
(6)〜（9)の 、ずれかに記載の方法。
[0018] (11)前記重合体化合物が、ァセチル基によって置換されている水酸基の割合が全 水酸基の 35〜53%である酢酸セルロースである（10)記載の方法。
[0019] (12) (1)〜（11)のいずれかに記載の方法により調製された、単核球を含む細胞画 分を含む細胞医療用組成物。
[0020] (13)単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単核球を含む 細胞画分を調製するための装置であって、
顆粒球吸着材を収容してなる第 1手段と、
前記体液または（1)に定義される工程 Aによる処理中または処理後の試料を遠心 分離する手段、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤を収容してなる 手段、および単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜を備えた手段から なる群力も選択される第 2手段とを備える、前記装置。
[0021] (14)第 1手段と第 2手段とが液体連通している、（13)記載の装置。
[0022] (15)単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単核球を含む 細胞画分を調製するための装置であって、
顆粒球吸着材と、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤とを収容し てなる手段を備える、前記装置。
[0023] (16)単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単核球を含む 細胞画分を調製するための装置であって、
顆粒球吸着材を収容してなる遠心分離用容器と、該容器を遠心する手段とを備え る、前記装置。
[0024] (17) (13)〜（16)のいずれかに記載の装置を用いて調製された、単核球を含む細 胞画分を含む細胞医療用組成物。
発明の効果
[0025] 本発明の方法または装置を用いることにより、哺乳動物の末梢血、臍帯血、骨髄液 等の体液から、顆粒球および赤血球等の不要な細胞を除去するとともに、単核球を 含む細胞画分を簡便かつ選択的に分離し、細胞療法において高い治療効果を示す 治療用細胞を調製することができる。
[0026] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005— 058748号の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[0027] 本発明に言う哺乳動物の体液とは、単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳 動物の体液である限り特に限定されないが、典型的には、末梢血、臍帯血、骨髄液、 およびそれらの希釈液を言う。
[0028] また、本発明に言う単核球とは、哺乳動物の体液に含まれる単球、マクロファージ、 リンパ球、造血幹細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、ストローマ細胞、血管内皮細胞、 榭状細胞、ランゲルノヽンス細胞など、細胞医療の分野で有用とされる細胞を言う。
[0029] 本発明に言う顆粒球吸着材とは、哺乳動物体液をはじめ、顆粒球を含む細胞液と 接触させることにより顆粒球を吸着できるものであれば、その形状、様態、成分、素材 の種類、また分離の原理を問わない。顆粒球吸着材の形状、様態としては、水不溶 性粒子、不織布、多孔質体、平膜、および中空糸などが挙げられるが、特にこれらに 限定されるものではない。顆粒球吸着材の成分、素材の種類も特に限定されるもの ではなぐ顆粒球吸着能の観点から、好ましくは、架橋ポリビニルアルコール単独、あ るいはポリビュルアルコールとの共重合体、例えばエチレン ビュルアルコール共重 合体、スチレン ビュルアルコール共重合体、アタリレート ビュルアルコール共重 合体、アクリルアミドービュルアルコール共重合体、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ スチレン、ポリウレタン等の合成ポリマー、およびセルロース、セファロース、デキストラ ン、ァガロース、キチン、キトサン等の多糖類やそれらの誘導体、さらに好ましくは、ポ リビュルアルコール、エチレン ビュルアルコール共重合体、セルロース、キトサンや それらの誘導体が挙げられ、そのなかでも、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種また は 2種以上の置換基 Rによって置換された水酸基とを有する重合体ィ匕合物が好ましく 用いられ、より好ましくは、後述の本明細書実施例に記載された部分酸ィ匕酢酸セル口 ースが用いられる。
[0030] 前記の、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換基 Rによって置 換された水酸基とを有する重合体化合物は、典型的には、架橋ポリビニルアルコー ル単独、あるいはポリビュルアルコールとの共重合体、例えばエチレン ビュルアル コール共重合体、スチレン ビュルアルコール共重合体、アタリレート ビュルアル コール共重合体、アクリルアミドービニルアルコール共重合体、あるいは多糖類が有 する複数の水酸基の一部において、基中の Hが 1種または 2種以上の置換基 Rによ つて置換されたものである。前記多糖類としては、これらに限定されるものではないが 、セルロース、セファロース、デキストラン、ァガロース、キチン、キトサンなどが挙げら れる。好ましくは、ポリビュルアルコール、エチレン ビュルアルコール共重合体、セ ルロース、キトサンなどの重合体ィ匕合物の有する水酸基の一部において、基中の H 力 S 1種または 2種以上の置換基 Rによって置換されたものである。
[0031] 本発明における「置換基 R」は、前記の、置換前の重合体ィ匕合物の水酸基の Hを置 換しうる任意の原子団を意味する。具体的には、「置換基 R」は、水酸基と「他の化合 物」との反応 (典型的には脱水反応）により生じる、「他の化合物」に由来する基であ ると理解される。ここで「他の化合物」としては、前記の、置換前の重合体化合物の水 酸基と反応し、重合体化合物 化合物の結合体を形成し得る任意の化合物を使用 し得る。ここで、該結合は、アルカリ性条件下で、特に温和なアルカリ溶液との接触に より、切断され得るものが好ましい。具体的には、「他の化合物」の非限定的な例とし ては、無機酸、例えばリン酸、硫酸;有機酸、例えば、飽和または不飽和の分枝また は直鎖脂肪族 1価、 2価または多価カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪 酸、アクリル酸、メタクリル酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸;飽和または不飽和 の分枝または直鎖芳香族 1価、 2価または多価カルボン酸、例えば安息香酸;ァミノ 酸、例えばグルタミン酸;アルコール、例えば、飽和または不飽和の分枝または直鎖 脂肪族 1価、 2価または多価アルコール、例えばメタノール、エタノール、 1 プロパノ 一ノレ、イソプロピノレアノレコーノレ、シクロへキサノーノレ、エチレングリコーノレ、グリセリン； 飽和または不飽和の分枝または直鎖芳香族 1価、 2価または多価アルコール、例え ばベンゾィルアルコール；が挙げられる。好ましくは、飽和脂肪族カルボン酸、例えば ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン酸、ステアリン酸;または安息香酸を使 用することができる。
[0032] 前記酸と、複数の水酸基を有する重合体化合物との反応は、適切な触媒、例えば 硫酸の存在下、エステル結合を形成させることによって達成し得る。前記アルコール と、水酸基を有する重合体化合物との反応は、適切な触媒、例えば硫酸の存在下、 エーテル結合を形成させることによって達成し得る。
[0033] あるいは、置換基 Rとしては、当業界周知の水酸基の保護基を利用してもよい。水 酸基の保護基は、例えば、 T. H. Greeneおよび P. G. M. Wuts, Protective Gro ups in Organic Synthesisゝ第 3版、 John Wiley & Sons、ニューヨーク（1999年 )に記載されている。
[0034] 水酸基の保護基の例としては、エーテル系の保護基、ァセタール系の保護基、シリ ル系の保護基またはエステル系の保護基が挙げられる。エーテル系の保護基とは水 酸基を保護する目的でエーテル結合を形成する保護基を意味し、水酸基の Hと置換 されたメチル基、ェチル基、 tert ブチル基、ォクチル基、ァリル基、ベンジル基、 p —メトキシメチル基、フルォレニル基、トリチル基、ベンズヒドリル基等を挙げることが できる。ァセタール系の保護基とは水酸基を保護する目的でァセタール結合を形成 する保護基を表わし、例えば、メトキシェチル基、エトキシェチル基、テトラヒドロビラ -ル基、テトラヒドロフラ-ル基等を挙げることができる。シリル系の保護基とは、水酸 基を保護する目的でシリルォキシ基結合を形成する保護基を意味し、トリメチルシリ ル基、トリェチルシリル基、 tert—ブチルジメチルシリル基、 tert—ブチルジフヱ-ル シリル基等を挙げることができる。また、エステル系の保護基とは、水酸基を保護する 目的でエステル結合を形成する保護基を表わし、ァセチル基、プロピオニル基、イソ プロピオ-ル基、ピバロイル基、ベンゾィル基、トリフルォロアセチル基、トリクロロアセ チル基等を挙げることができる。 [0035] 前記水酸基の保護基の前駆体化合物は、前記「他の化合物」に含まれることが理 解される。
[0036] 好ま 、置換基 Rの例としては、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の、脂肪 族ァシル（例えばアルコキシカルボ-ル、ァセチル、ォレイルなど）、飽和または不飽 和の、直鎖または分枝鎖の芳香族ァシル (例えばァリールォキシカルボニル、ベンゾ ィル、シンナモイルなど）、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の、アルキルォキ シ、ァルケ-ルォキシ、アルキ-ルォキシなどが挙げられ、より好ましい置換基 Rとし ては脂肪族または芳香族の、飽和ァシル (例えばベンゾィルなど）が挙げられ、最も 好ましくはァセチルが挙げられる。前記置換基は任意の置換基例えばハロゲンで置 換されてもよい。
[0037] 本発明に用いられる顆粒球吸着材は、例えば、（a)複数の水酸基を有する重合体 化合物の水酸基と 1種または 2種以上の他の化合物とがアルカリ性条件下で切断可 能な様式で結合して形成された重合体化合物 化合物の結合体を得る工程、およ び (b)前記結合体をアルカリ性条件下で処理して、前記重合体化合物の水酸基と前 記他の化合物との結合の一部を切断する工程を含む方法により製造することができ る。
[0038] 工程 (a)について。前記重合体ィ匕合物-化合物結合体 (例えば酢酸セルロース、 ポリ酢酸ビニル）は商業的に入手可能である。また前記重合体化合物と他の化合物 とを自体公知の方法にしたがって反応させて重合体化合物 化合物結合体を入手 することも可能である。例えばパルプ等より得られるセルロースに、無水酢酸等を含 むァセチル化剤を添加することによって酢酸セルロースを得ることができる。或 、は、 水酸基を有する重合体化合物（例えばセルロース）を、 自体公知の方法により、他の 化合物（例えば酢酸）と反応させることによつても酢酸セルロースを得ることができる。 更にまた、水酸基を有する単量体化合物と他の化合物とが結合したものを重合させ ることにより前記結合体を得ることも可能である。例えば、ポリ酢酸ビュルは、単量体 酢酸ビュル、トリアリルイソシァヌレート (TAIC)など力 なる混合物を、水、ポリビュル アルコールなどを含む水相に仕込み、平板状の撹拌翼と 2枚の邪魔板を有するセパ ラブルフラスコ中で室温にて、十分な撹拌混合および窒素置換を行い、内温を 65°C に 5時間保持して懸濁重合することにより得ることができる。
[0039] 工程 (b)について。前記重合体化合物 化合物結合体には、前記重合体化合物 の水酸基と前記他の化合物との結合が複数含まれて!/、る。工程 (b)では前記結合体 を温和なアルカリ性条件下で処理することにより、前記複数の結合の一部を例えば 加水分解反応により切断する。切断の程度は結合体の種類および顆粒球吸着材の 使用目的に応じて適宜調整できる。本発明の顆粒球吸着材としては、例えば、ァセ チル基によって置換されて!、る水酸基の割合が全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸 基を含む）の好ましくは 35〜53%、より好ましくは 35〜49%であるポリ酢酸ビュルが 使用できる。本発明の顆粒球吸着材としては、例えば、ァセチル基によって置換され て 、る水酸基の割合が全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸基を含む)の好ましくは 3 5〜53%、より好ましくは 40〜53%、より一層好ましくは 45〜53%である酢酸セル口 ースが使用できる。
[0040] 本明細書にぉ ヽて「重合体化合物の全水酸基 (無置換水酸基と置換水酸基を含 む)のうち置換基 Rにより置換されている水酸基の割合」を、「水酸基の置換基 Rによ る置換率」、「置換基 Rによる置換率」または単に「置換率」と称することがある。
[0041] 酢酸セルロースの水酸基のァセチル基による置換率（％)は、例えば以下のように 測定することができる。被検物質を十分に乾燥させた後、乾燥重量を精密天秤にて 測定し (0. 5g前後）、フラスコに入れる。被検物質を溶解し得る溶媒 (例えばアセトン 水溶液)を 50ml添加し、室温にて 1時間、スターラーにて攪拌する。次に 0. 2規定水 酸ィ匕ナトリウム水溶液 50mlを添加し、 5分間攪拌後、 3時間室温にて静置する。次に 0. 2規定塩酸 50mlを該フラスコ中に入れ 5分間攪拌後、 1時間室温にて静置する。 次にフエノールフタレイン液 2, 3滴をフラスコ中に入れ、 0. 1規定水酸ィ匕ナトリウム水 溶液をビュレットにて滴下し、溶液が淡い赤色に変化したときを終点として、滴定量（ A (ml) )を求める。また被検物質を入れな!/、以外は前記と同様の操作を行って同様 に滴定量 (B (ml) )を求める。以上の測定力も酢酸セルロースのァセチル基による置 換率（％) )は、下式により求めることができる。
[0042] 置換率（％) = (A— B) F X O. 6005Z被検物質重量 (g)
F：滴定に使用した 0. 1規定水酸化ナトリウム水溶液のファクター 温和なアルカリ性条件は、当業者が過度の実験なくして達成できる。
[0043] 酢酸セルロース以外の他の重合化合物（ポリ酢酸ビニル等）の水酸基の置換基尺に よる置換率（％)は、元素分析や赤外吸収スペクトルなどによる分析により、或いは、 公知の方法でケンィ匕率 (酸ィ匕度)を求めた後にその数値力も逆算 (置換率 = 100- ケン化率 (％) )すること〖こより求められる。元素分析により水酸基の置換率を求める場 合は、ジエイ ·サイエンス ·ラボ製の元素分析装置 (マイクロコーダ一 JM10型)等を使 用することができる。
[0044] 工程 (a)で得られる重合体ィ匕合物 化合物の結合体が酢酸セルロース等の水酸 基置換多糖類である場合、工程 (b)における部分的分解反応は次の条件で行われ ることが好ましい。アルカリ溶液の規定度は 0. 01N (規定)から 2. ONの範囲が好ま しぐ 0. 05Nから 1Nの範囲がより好ましぐ 0. 07N力ら 0. 5Nの範囲が最も好ましい 。反応時間は 1分間から 120分間の範囲が好ましぐ 1分間から 100分間の範囲がよ り好ましぐ 5分間から 60分間の範囲がより好ましぐ 10分間から 40分間の範囲が最 も好ましい。反応温度は 10°Cから 90°Cの範囲が好ましぐ 15°Cから 75°Cの範囲がよ り好ましぐ 20°Cから 58°Cの範囲が最も好ましい。
[0045] 工程 (a)で得られる重合体ィ匕合物 化合物の結合体がポリ酢酸ビニルである場合 、工程 (b)における部分的分解反応は次の条件で行われることが好ましい。アルカリ 溶液の規定度は 0. 01N (規定）から 6. ONの範囲が好ましぐ 0. 1N力 5. ONの範 囲がより好ましぐ 1Nから 3. 8Nの範囲が最も好ましい。反応時間は約 1分間から 10 時間の範囲が好ましぐ 30分間から 6時間の範囲がより好ましぐ 1時間から 5. 5時間 の範囲が最も好ましい。反応温度は 10°Cから 90°Cの範囲が好ましぐ 15°Cから 75 °Cの範囲がより好ましぐ 20°Cから 58°Cの範囲が最も好ましい。
[0046] アルカリ溶液中には、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコールが添カロ されていてもよい。この場合、アルコールの含有率は、 0. 1% (V/V)力も 99% (V/ V)の範囲内にあれば、いずれの含有率で処理してもよいが、 5% (VZV)力も 50% ( V/V)が好ましぐ 10% (V/V)から 40% (V/V)がより好まし 、。
[0047] 所望であれば工程 (b)の後、前記切断生成物を精製してもよ!/、。精製方法は特に 限定されないが、例えば水洗等の洗浄により精製を行うことができる。 [0048] 本発明の顆粒球吸着材は水不溶性であることが好ま 、。
[0049] 本発明は第一に、単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液からの 、単核球を含む細胞画分の調製法であって、
前記体液を顆粒球吸着材と接触させる工程 Aと、
工程 Aによる処理中または処理後の試料の、単核球と赤血球とを分離することがで きる条件下での遠心分離、工程 Aによる処理中または処理後の試料への、単核球と 赤血球とを分離することができる細胞分離剤の添加、および工程 Aによる処理中また は処理後の試料の、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜による分 離カゝらなる群カゝら選択される少なくとも 1種の処理を行う工程 Bとを含む、単核球を含 む細胞画分の調製法に関する。
[0050] 工程 Aおよび Bは、それぞれ複数回行ってもよい。換言すれば、工程 Aと工程 Bとは それぞれ少なくとも 1回行われればよい。工程 Bに用いられる「工程 Aによる処理中ま たは処理後の試料」には、複数回の工程 Aによる処理中または後の試料も包含され る。また、「工程 Aによる処理中または処理後の試料」には、工程 Aによる処理中また は処理後の溶液を希釈または濃縮した試料も包含される。
[0051] 本方法はまた、単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液からの、 単核球を含む細胞画分の調製法であって、
前記体液の、単核球と赤血球とを分離することができる条件下での遠心分離、前記 体液への、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤の添加、および前 記体液の、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜による分離からなる 群カゝら選択される少なくとも 1種の処理を行う工程 Cと、
工程 Cによる処理後の試料を顆粒球吸着材と接触させる工程 Dとを含む、単核球を 含む細胞画分の調製法に関する。
[0052] 工程 Cおよび Dは、それぞれ複数回行ってもよ!ヽ。換言すれば、工程 Cと工程 Dと はそれぞれ少なくとも 1回行われればよい。工程 Dに用いられる「工程 Cによる処理後 の試料」には、複数回の工程 Cによる処理中または後の試料も包含される。また、「ェ 程 Cによる処理後の試料」には、工程 Cの処理により得られた溶液を希釈または濃縮 した試料も包含される。 [0053] 本明細書では、「工程 Aによる処理中または処理後の試料」、および「工程 Cによる 処理後の試料」を総称して、「体液から調製された試料」と称する場合がある。
[0054] 工程 Aまたは Dについて説明する。
[0055] 工程 Aまたは Dは、体液を顆粒球吸着材で処理することにより、哺乳動物の体液ま たは工程 Cによる処理後の試料から、主として、顆粒球の少なくとも 1部、好ましくは 6 5%以上、より好ましくは 75%以上、より好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以 上、より好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上を、顆粒球吸着材を用いて除 去する工程である。除去率は除去処理前の細胞の個数に占める、除去された細胞の 個数の割合を百分率で示したものである。
[0056] 工程 Aまたは Dにおいて、哺乳動物の体液または工程 Cによる処理後の試料を顆 粒球吸着材で処理する方法は、該体液または該試料と該顆粒球吸着材が接触する 方法であれば、特定に限定されるものではないが、具体的には、顆粒球吸着材が充 填されたカラムに該体液または該試料を通過させ通過液を回収する力 顆粒球吸着 材を含む容器に該体液または該試料を入れ、ある ヽは該体液または該試料を含む 容器に顆粒球吸着材を入れ、必要に応じて振盪し、該容器から細胞を含む体液を回 収することにより実施される。
[0057] 本発明により提供される、単核球を含む細胞画分の調製法にぉ ヽて、顆粒球吸着 材処理に用いられるカラムの形状、材質について特に制限は無ぐ顆粒球吸着材が 外に漏れ出ることなく充填でき、カラム材質の溶出による影響がないものであればど のようなものでも使用できる。カラムの形状としては、柱状、錘状、らせん状等様々な ものが考えられる力 哺乳動物の体液または体液力 調製された試料が通過できる 形状のものであれば、特に限定されない。カラムの材質としては、金属、ガラス、セラミ ック、合成ポリマー等が考えられ、剛性のあるものであっても、柔軟なものであってもよ いが、滅菌操作に耐えられるものが好ましい。
[0058] 次に工程 Bまたは Cについて説明する。
[0059] 工程 Bまたは Cは、哺乳動物の体液または工程 Aによる処理中または処理後の試 料力も赤血球などの不要細胞を除去する工程である。工程 Bまたは Cでは赤血球が 実質的に除去されるだけでなぐ顆粒球も少な力もず除去され得る。ここで「赤血球が 実質的に除去される」とは、本発明の方法により調製される、単核球を含む細胞画分 の用途における有用性を妨げない程度にまで赤血球が除去されることを指し、典型 的には 90%以上、より好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の赤血球が除 去されることをいう。除去率は除去処理前の細胞の個数に占める、除去された細胞の 個数の割合を百分率で示したものである。
[0060] 本明細書では、赤血球や、顆粒球などの、単核球を含む細胞画分の用途に寄与し な ヽ細胞を不要細胞と称する場合がある。
[0061] 工程 Bまたは Cでは、哺乳動物の体液または工程 Aによる処理中または処理後の 試料の遠心分離、前記体液または前記試料への細胞分離剤の添加、および前記体 液または前記試料の細胞分離膜による分離力 なる群力 選択される少なくとも 1種 の処理を行う。前記遠心分離処理は、単核球と赤血球とを分離することができる条件 下で行われることが好ましぐ単核球と、赤血球および顆粒球とを分離できる条件下 で行われることがより好ましい。このような遠心分離処理は、公知の赤血球分離を目 的とした遠心分離処理によって適宜行うことができる。また、遠心分離する手段として 、既存の血球成分分離装置（例えば、 Baxter社製 CS— 3000、 Haemonetics社製 Multiなど)などの連続、または間歇遠心分離装置を用いることも可能である。前記 細胞分離剤は、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤であることが好 ましぐ単核球と、赤血球および顆粒球とを分離することができる細胞分離剤であるこ とがより好ましい。前記細胞分離膜は、単核球と赤血球とを分離することができる細胞 分離膜であることが好ましぐ単核球と、赤血球および顆粒球とを分離することができ る細胞分離膜であることがより好ましい。
[0062] 哺乳動物の体液または体液から調製された試料から遠心分離法により赤血球など の不要細胞を除去する場合、具体的には、哺乳動物の体液または体液から調製され た試料を容器に入れ、容器ごと遠心分離に付すことによりなされるが、フイコール等 の多糖類、パーコール、塩ィ匕セシウム等の無機物等の比重液を添加して、密度勾配 遠心分離することも可能である。使用される容器の材質、形状は特に限定されるもの ではないが、遠心分離用細胞バッグ、または遠心分離用チューブなどを使用すること が好ましい。 [0063] また、細胞分離剤を用いた、体液または体液力も調製された試料力もの赤血球など の不要細胞の除去においては、 HES (ヒドロキシェチル澱粉)などの細胞分離剤が 使用できる。具体的には、体液または体液から調製された試料と細胞分離剤とを混 合した後、静置する、あるいは遠心分離することにより、赤血球などの不要細胞を沈 殿させ、単核球を含む細胞画分を回収する。また、遠心分離する手段として、前述し たような、既存の血球成分分離装置（例えば、 Baxter社製 CS— 3000、 Haemoneti cs社製 Multiなど)などの連続、または間歇遠心分離装置を用いることも可能である
[0064] また、細胞分離膜を使用することによって、体液または体液から調製された試料に ふくまれる赤血球などの不要細胞と単核球とを分離し、選択的に単核球を含む細胞 画分を回収することもできる。この場合、使用する細胞分離膜は、赤血球などの不要 細胞と単核球を含む細胞画分を分離するものであれば特に限定されるものでないが 、不織布、多孔質体、平膜、あるいは中空糸が好ましい。細胞分離膜として、赤血球 は通過させるが赤血球よりも外郭が大き 、単核球は通過させな 、細胞分離膜を用い 、哺乳動物の体液または体液から調製された試料を当該細胞分離膜を通過するよう に通液させると、赤血球は当該細胞分離膜を通過するが、赤血球よりも外郭が大き い単核球は細胞分離膜を通過せず、赤血球と単核球とは分離される。そして、細胞 分離膜を透過しなカゝつた側を単核球含有画分として回収することができる。かかる形 態が典型的な例であるが、これには限定されず、例えば細胞分離膜として、赤血球を 捕捉できる細胞分離膜を用いることもできる。
[0065] 工程 Bまたは工程 Cが遠心分離法または細胞分離剤を用いた方法により行われる 場合には、工程 Aと工程 B、あるいは工程 Cと工程 Dとが同一容器内で行われてもよ い。力かる実施形態においては、典型的には、哺乳動物の体液を顆粒球吸着材で 処理し、該処理体液を回収することなく遠心分離、または細胞分離剤により赤血球な どの不要細胞と単核球を含む細胞画分とを分離し、該単核球画分が回収される。具 体的には、顆粒球吸着材が含まれる容器に哺乳動物の体液を加える、あるいは該体 液が含まれる容器に顆粒球吸着材を加えた後、必要に応じて振盪等を行うことにより 、顆粒球吸着材と体液を接触させ、顆粒球吸着材処理を行う。さら〖こ、該処理体液の 含まれる容器を遠心分離する、またはさらに該容器に細胞分離剤を添加することによ り赤血球などの不要細胞と単核球を含む細胞画分とを分離する。遠心分離により単 核球画分を分離する場合には、フイコールなどの比重液を添加し、密度勾配遠心分 離してもよい。使用する容器の材質、形状は特に限定されるものではないが、遠心分 離用細胞バッグ、または遠心分離用チューブなどを使用することが好ましい。また、 細胞分離剤を用いて単核球画分を分離する場合には、 HESなどの細胞分離剤を使 用し、該処理体液と細胞分離剤を混合した後、静置する、あるいは遠心分離すること により、赤血球などの不要細胞を沈殿させ、単核球を含む細胞画分を回収する。
[0066] 本発明により提供される、単核球を含む細胞画分の調製法にお!ヽて、工程 A〜D に使用する容器の形状、材質についても特に制限はなぐ各工程に関与する材料（ 顆粒球吸着材、細胞分離剤、体液等)が外に漏れ出ることなぐ容器材質の溶出によ る影響がないものであればどのようなものでも使用できる。容器の形状としては、袋状
、筒状、箱状、チューブ状等が考えられるが、閉鎖性の確保、および操作のしゃすさ の観点から、好ましくは血液バッグ、細胞培養バッグ、あるいはそれらを加工したもの 、または細胞処理用チューブ、およびそれを加工したものである。
[0067] 本発明により提供される、単核球を含む細胞画分の調製法により哺乳動物体液を 処理する過程にお！ヽては、該哺乳動物体液に対して抗凝固措置を取ることが好まし い。この場合、該哺乳動物体液、あるいは、細胞分離剤、顆粒球吸着材に対して、負 の影響を与えない抗凝固措置であれば、いかなるものも適用することができる。好ま しい抗凝固措置の具体例としては、簡便さの観点から、該哺乳動物体液に抗凝固剤 を添加することが挙げられる。抗凝固剤の具体例としては、へパリン、低分子量へパリ ン、メシル酸ナファモスタツト、メシル酸ガべキサート、アルガトロバン、あるいは、ァシ ッド ·シトレート'デキストロース液（ACD液）ゃシトレート ·フォスフェート ·デキストロー ス液 (CPD液)等のクェン酸含有抗凝固剤などがあり、 Vヽずれを用いてもょ 、。
[0068] 本発明はまた、単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単 核球を含む細胞画分を調製するための装置に関する。当該装置は、顆粒球吸着材 を収容してなる第 1手段と、前記体液または工程 Aによる処理中または処理後の試料 を遠心分離する手段、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤を収容し てなる手段、および単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜を備えた手 段力 なる群力 選択される第 2手段とを備える。前記遠心分離手段は、単核球と赤 血球とを分離することができる条件下で遠心分離を行うことができるものであることが 好ましい。
[0069] 第 1手段は、上記の工程 Aまたは Dを行うための手段であり、顆粒球の少なくとも 1 部を除去するための手段である。第 2手段は上記の工程 Bまたは Cを行うための手段 であり、赤血球を実質的に除去するとともに、その他の不要細胞 (例えば顆粒球)を 除去するための手段である。ここで、「顆粒球の少なくとも 1部を除去する」という文言 と、「赤血球を実質的に除去する」という文言の意味と好適な範囲については本明細 書で既に定義したとおりである。
[0070] 第 1手段と第 2手段とは両手段間の処理体液の移動を容易にするため液体連通し ていることが好ましぐ具体的には、移送用のチューブで連結されていることが好まし い。ここで言う移送用のチューブとは、処理体液を無菌的に両手段間を移動させるこ とができるものであれば、その材質、形状に制限はない。該移送用チューブはまた、 処理終了後、移送の必要がなくなれば、第 1手段と第 2手段とを切り離すことができる ように、脱着可能な構造を有して 、ることが好ま 、。
[0071] 本発明により提供される装置に含まれる容器等の各部材の材質は、使用される哺 乳動物体液、細胞分離剤、および顆粒球吸着材等に対して負の影響を与えないも のであれば、いかなるものであっても使用することができる。具体的には、合成ポリマ 一、金属、ガラス、陶器等が挙げられる。使用される哺乳動物体液、細胞分離剤、お よび顆粒球吸着材に対して負の影響を与えないという観点から、合成ポリマーとして は非反応性ポリマーが好ましぐ具体例としては、アクリロニトリルブタジエンスチレン ターポリマー等のアクリロニトリルポリマー等、ハロゲンィ匕ポリマー、例えばポリテトラフ ノレォロエチレン、ポリクロロトリフノレオ口エチレン、コポリマーテトラフノレォロエチレンお よびへキサフルォロプロピレン等、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエ チレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアタリ口 二トリルブタジエンスチレン、ポリスチレン等が挙げられる力 これらに限定されること はない。また、同じ観点から、金属としては、生体適合性が高い金属が好ましぐ具体 例としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに 金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミゥム合金、および窒化チタン被覆ス テンレス鋼等が挙げられる力 これらに限定されるものではない。さらに同じ観点から 、ガラス、および陶器は好ましい材質である。以上の中でも、オートクレープ、ガンマ 線照射、 EOG (エチレンオキサイドガス）の暴露等の滅菌操作に耐えうる材質が更に 好ましぐこのような材質としては、具体的には、ポリプロピレン、ポリスチレン、塩ィ匕ビ ニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテン、ガラス、陶器等が挙 げられる。
[0072] 本発明により提供される装置に含まれる容器の形態は、特に限定はされないが、具 体的には、球状、筒状、袋状等が挙げられる。
[0073] 本発明により提供される装置に含まれる容器の大きさについても、特に限定される ものではないが、分離の対象とする哺乳動物体液の量の観点から、好ましくは 0. 1〜 2, OOOml,より好ましくは 0. 5〜1, OOOml,さらにより好ましくは l〜200mlである。
[0074] 本発明により提供される装置について、さらに詳細に説明する。
[0075] 第 1手段の典型的な形態は、顆粒球吸着材を充填してなるカラム、または顆粒球吸 着材を収容してなる容器である。第 1手段において用いられるカラムは、その形状、 材質について特に制限は無ぐ顆粒球吸着材が外に漏れ出ることなく充填でき、カラ ム材質の溶出による影響がないものであればどのようなものでも使用できる。カラムの 形状としては、柱状、錘状、らせん状等様々なものが考えられるが、哺乳動物体液ま たは体液力 調製された試料が通過できる形状のものであれば、特に限定されな!、 。カラムの材質としては、金属、ガラス、セラミック、合成ポリマー等が考えられ、剛性 のあるものであっても、柔軟なものであってもよいが、滅菌操作に耐えられるものが好 ましい。また、顆粒球吸着材を収容するための容器としては、該容器中に顆粒球吸 着材と、哺乳動物体液または体液から調製された試料を収容することができ、必要で あれば振盪、あるいは転倒させることにより、該哺乳動物体液または体液から調製さ れた試料と該顆粒球吸着材とを接触させることができるものであれば、 、かなるもの でも使用可能である。該容器としては、該哺乳動物体液または体液から調製された 試料を移入しやすいこと、また、密閉性および無菌性が保たれること、さらに振盪、あ るいは転倒などの衝撃に耐えうることから、細胞移入孔、細胞移入用チューブ、密閉 できる活栓などを具備した細胞培養用バッグ、または血液バッグ、さらに細胞培養用 チューブ、または遠心分離用チューブなどが好ましい具体例として挙げられる。さら に第 1手段には、哺乳動物体液を貯留する容器が連結されていてもよい。この場合、 第 1手段と貯留容器は、脱着可能な移送用チューブで連結されていることが好ましい
[0076] 第 2手段は、体液または体液から調製された試料を遠心分離する手段、細胞分離 剤を収容してなる手段、または細胞分離膜を備えた手段の 、ずれの形態であっても 、哺乳動物体液を収容するための容器を少なくとも具備する。該容器は、哺乳動物 体液を外部に漏れ出すことなく収容できるものであれば、どのようなものでも使用でき る力 好ましい具体例としては、哺乳動物体液を移入しやすいこと、また、密閉性およ び無菌性が保たれること、さらにまた、遠心分離操作による衝撃に耐えうることから、 細胞移入孔、細胞移入用チューブ、密閉できる活栓などを具備した細胞培養用バッ グ、または血液バッグ、さらに細胞培養用チューブ、または遠心分離用チューブなど が挙げられる。
[0077] 第 2手段が、体液または体液から調製された試料を遠心分離する手段である場合、 当該手段として、血液成分分離装置を用いることができる。この場合、 Baxter社製 C S— 3000、 Haemonetics社製 Multiなど）などの連続、または間歇遠心分離装置が 好ましい具体例として挙げられる力 これらに限定されることはない。血液成分分離 装置には、遠心分離用チューブが含まれる。
[0078] 第 2手段が細胞分離剤を収容してなる手段である場合、当該手段として、細胞分離 剤が収容されてなる上記の容器を用いることができる。この場合、細胞分離剤は該容 器に具備された細胞移入孔、および細胞移入用チューブを介して移入されてもょ ヽ 力 独立した移入孔、および移入用チューブを設け、それらを介して移入されることも できる。
[0079] 第 2手段が細胞分離膜を備えた手段である場合、当該手段として、細胞分離膜を 内部に備えた上記の容器を用いることができる。細胞分離膜は、哺乳動物体液を通 過させることにより、赤血球などの不要細胞を除去できるものであれば、材質、形状な どに特に制限はないが、好ましい具体例としては、ポリエステル、ポリエチレンテレフ タレートなどの不織布、ポリウレタンなどの多孔質材料、あるいはエジプト綿などが挙 げられる力 これら〖こ限定されることはない。また、細胞分離膜は、旭メディカル製セ パセル、テルモ製ィムガードなどの既存の細胞分離フィルタ一力 選択されてもよ!ヽ
[0080] さらに、第 2手段には、赤血球除去処理を終了した哺乳動物体液を回収するため の容器が連結されていてもよい。この場合、第 2手段と該回収容器は、脱着可能な移 送用チューブで連結されて 、ることが好まし 、。
[0081] 本発明はまた、単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単 核球を含む細胞画分を調製するための装置であって、顆粒球吸着材と細胞分離剤と を同一容器内に収容してなる手段を備える、前記装置に関する。本装置では、工程 Aと工程 B、あるいは工程 Cと工程 Dとが同一容器内で行われる。本装置の使用方法 は具体的には次のようなものである。まず、顆粒球吸着材が収容されてなる容器に哺 乳動物体液を加える、あるいは該体液が含まれる容器に該吸着材を加えた後、必要 に応じて振盪等を行うことにより、該吸着材と該体液を接触させ、顆粒球吸着材処理 を行う。次いで、該容器に細胞分離剤を添加することにより赤血球などの不要細胞と 単核球を含む細胞画分とを分離する。細胞分離剤としては HESなどの細胞分離剤 を使用し、該処理体液と細胞分離剤を混合した後、静置する、あるいは遠心分離す ることにより、赤血球などの不要細胞を沈殿させ、単核球を含む細胞画分を回収する
[0082] 本発明はまた、単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単 核球を含む細胞画分を調製するための装置であって、顆粒球吸着材を収容してなる 遠心分離用容器と、該容器を遠心する手段とを備える、前記装置に関する。容器を 遠心する手段は、単核球と赤血球とを分離することができる条件下で容器を遠心でき る手段であることが好ましい。本装置では、工程 Aと工程 B、あるいは工程 Cと工程 D とが同一容器内で行われる。本装置の使用方法は具体的には次のようなものである 。まず、顆粒球吸着材が収容されてなる遠心分離用容器に哺乳動物体液を加える、 あるいは該体液が含まれる遠心分離用容器に該吸着材を加えた後、必要に応じて 振盪等を行うことにより、該吸着材と該体液を接触させ、顆粒球吸着材処理を行う。 次いで、遠心分離用容器を遠心して、赤血球などの不要細胞と単核球を含む細胞 画分とを分離する。遠心分離の際には、フイコールなどの比重液を添加し、密度勾配 遠心分離を行ってもよい。遠心分離用容器の材質、形状は特に限定されるものでは ないが、遠心分離用細胞バッグ、または遠心分離用チューブなどを使用することが好 ましい。
[0083] 本発明はまた、本発明により提供された方法、または装置により得られた、単核球を 含む細胞画分を含む細胞医療用組成物を提供する。該細胞医療用組成物には、本 発明により提供された細胞画分だけでなぐ臨床適用上許容される媒体により希釈、 または再分散することが可能である。ここで言う臨床適用上許容される媒体とは、生 理食塩水、リン酸緩衝液、アルブミン溶液、デキストラン溶液、あるいは哺乳動物体液 中の血漿、または血清などが挙げられる力 医療用途に用いられるものであれば、上 記以外のものでも使用することができる。
[0084] 該組成物により治療する対象疾患としては、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈疾患 等の血管疾患、白血病等の血液疾患、多発性硬化症、全身性エリトマト一デス等の 自己免疫疾患、あるいは、癌、骨軟骨疾患、皮膚疾患、神経疾患、眼疾患等が挙げ られる力 これらに限定されるものではない。
[0085] 本発明により開示された方法、あるいは装置の処理対象となる哺乳動物体液は、採 取後すぐに該方法、あるいは該デバイスにより処理することができるが、該哺乳動物 体液を冷蔵保存した後、または冷凍保存したものを解凍した後、処理することもでき る。
実施例
[0086] 以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明方法の実施例を挙げる。
[0087] (実施例 1)
哺乳動物体液としてヒト末梢血、細胞分離材として HES、顆粒球吸着材として部分 酸ィ匕酢酸セルロースビーズを用いて以下の操作を行った。
[0088] (1)部分酸化酢酸セルロースの調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し 、この溶液を特開昭 63— 117039に記載された方法 (振動法）により液滴化し、凝固 させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約 300 μ mであった。この粒子を沈降体積比で、 0. 1規定水酸ィ匕ナトリウム水溶液と 1 : 1 (VZ V)の割合で混合し、 30分間接触させることにより、部分加水分解反応を行った。吸 着体沈降体積の約 200倍量の蒸留水にて洗浄後、生理食塩水液 (最終濃度で 5IU Zmlのへパリンを含む）にて置換を行い、部分鹼ィ匕酢酸セルロースビーズを得た。こ のときの部分鹼化酢酸セルロースビーズの鹼化度は、 47. 5% (置換率は 52. 5%) であった。
[0089] (2)ヒト末梢血の調製
健常人ボランティアカゝら末梢血を採取した。このものは、 1mlあたり赤血球を 4. 3 X 109個、白血球を 4. 6 X 106個（そのうち単核球が 2. 1 X 106個、顆粒球が約 2. 3 X 1 06個）が含まれるものであった。
[0090] (3)末梢血の処理
(1)で調製した沈降体積 lmlの部分鹼ィ匕酢酸セルロースビーズに（2)で調製した 末梢血を 2mlカロえ、 37°C、 1時間、 20rpmで撹拌しながらインキュベートした。この操 作を吸着材処理とした。吸着材処理後、細胞分離剤として 400 1 (全量に対して HE S濃度が 1%となる量）の HES40 (NIPRO社製、 6%HES含有 0.9%食塩液）を加え 、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを処理区 1とした。また、吸着材処理後 、 1500 /z l (全量に対して HES濃度力 2. 57%となる量）の HES40をカロえ、 50gで 5 分間遠心して、上清を回収し、これを処理区 2とした。さらに、吸着材処理後、 RPMI 1640培養液（Gibco)を 2ml加え、 800 1 (全量に対して HES濃度が 1%となる量） の HES40を加え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを処理区 3とした。
[0091] 対照区としては、末梢血 2mlを対照区 1とした。また、末梢血 2mlに 400 1 (全量に 対して HES濃度が 1%となる量）の HES40をカ卩え、 50gで 5分間遠心して、上清を回 収し、これを対照区 2とした。また、末梢血 2mlに 1500ul (全量に対して HES濃度が 2. 57%となる量）の HES40を加え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを対 照区 3とした。さらに、末梢血 2mlに RIMI1640培養液を 2ml加え、 800ul (全量に対 して HES濃度が 1%となる量）の HES40をカ卩え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収 し、これを対照区 4とした。
力べして得られた対照区および処理区の赤血球除去率および顆粒球除去率を表 1 に示した。
[表 1] 表 1 . ヒ ト末梢血に対する赤 ώ_球除去率および頼拉球除去率
Figure imgf000023_0001
[0093] 対照区 2〜4においては、赤血球除去率は全て 98%以上と優れていた力 顆粒球 除去率は最も高い対照区 2で 64%に留まり、対照区 3, 4では 30%程度であった。
[0094] 処理区においては、赤血球除去率は全て 99%であり、更に顆粒球除去率は 95% 程度と優れたものであった。
[0095] 単核球回収率については、処理区と対照区 2〜4間で大きな差は見られな力つた。
[0096] (実施例 2)
哺乳動物体液としてブタ骨髄液、細胞分離剤として HES、顆粒球吸着材として部 分酸ィ匕酢酸セルロースビーズを用いて以下の操作を行った。
[0097] (1)部分酸化酢酸セルロースの調製
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し 、この溶液を特開昭 63— 117039に記載された方法 (振動法）により液滴化し、凝固 させて酢酸セルロースの球形の粒子を得た。得られた球形粒子の粒径は、約 300 μ mであった。この粒子を沈降体積比で、 0. 1規定水酸ィ匕ナトリウム水溶液と 1 : 1 (VZ V)の割合で混合し、 30分間接触させることにより、部分加水分解反応を行った。吸 着体沈降体積の約 200倍量の蒸留水にて洗浄後、生理食塩水液 (最終濃度で 5IU Zmlのへパリンを含む）にて置換を行い、部分鹼ィ匕酢酸セルロースビーズを得た。こ のときの部分鹼化酢酸セルロースビーズの鹼化度は、 47. 5% (置換率は 52. 5%) であった。 [0098] (2)ブタ骨髄液の調製
ミニブタ (クラウン、 30kg)の腸骨より骨髄液を採取した。このものは、 1mlあたり赤血 球が 5. O X 109個、白血球が 1. O X 107個（そのうち単核球画分細胞が 3. O X 106個 、顆粒球が5. O X 106個）含まれるものであった。
[0099] (3)骨髄液の処理
(1)で調製した沈降体積 lmlの部分鹼ィ匕酢酸セルロースビーズに（2)で調製した ブタ骨髄液を 2ml加え、 37°C、 1時間、 20rpmで撹拌しながらインキュベートした。こ の操作を吸着材処理とした。吸着材処理後、 400ul (全量に対して HES濃度が 1%と なる量）の HES40 (NIPRO社製、 6%ヒドロキシェチルデンプン加 0.9%食塩液）を 加え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを処理区 4とした。また、吸着材処 理後、 1500ul (全量に対して HES濃度が 2. 57%となる量）の HES40を加え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを処理区 5とした。さらに、吸着材処理後、 RIMI 1640培養液（Gibco)を 2ml加え、 800ul (全量に対して HES濃度が 1%となる量）の HES40を加え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを処理区 6とした。
[0100] 対照区としては、末梢血 2mlを対照区 5とした。また、末梢血 2mlに 400ul (全量に 対して HES濃度が 1%となる量）の HES40をカ卩え、 50gで 5分間遠心して、上清を回 収し、これを対照区 6とした。また、末梢血 2mlに 1500ul (全量に対して HES濃度が 2. 57%となる量）の HES40を加え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収し、これを対 照区 7とした。さらに、末梢血 2mlに RIMI1640培養液を 2ml加え、 800ul (全量に対 して HES濃度が 1%となる量）の HES40をカ卩え、 50gで 5分間遠心して、上清を回収 し、これを対照区 8とした。
[0101] 力べして得られた対照区および処理区の物性を表 2に示した。
[表 2] 表 2 . ブタ骨髓液に対する赤血球除去率および顆粒球除去率
Figure imgf000025_0001
[0102] 対照区 6〜8では、赤血球は除去できるものの、顆粒球画分除去は 3〜20%程度 であったのに対し、処理区 4〜6では赤血球、顆粒球共に 80%以上であり、処理区 5 、 6では顆粒球画分除去率が 90%以上であった。
[0103] 単核球回収率については、処理区と対照区 6〜8間で大きな差は見られな力つた。
[0104] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液からの、単核球を含む細 胞画分の調製法であって、
前記体液を顆粒球吸着材と接触させる工程 Aと、
工程 Aによる処理中または処理後の試料の、単核球と赤血球とを分離することがで きる条件下での遠心分離、工程 Aによる処理中または処理後の試料への、単核球と 赤血球とを分離することができる細胞分離剤の添加、および工程 Aによる処理中また は処理後の試料の、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜による分 離カゝらなる群カゝら選択される少なくとも 1種の処理を行う工程 Bとを含む、単核球を含 む細胞画分の調製法、あるいは
前記体液の、単核球と赤血球とを分離することができる条件下での遠心分離、前記 体液への、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤の添加、および前 記体液の、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜による分離からなる 群カゝら選択される少なくとも 1種の処理を行う工程 Cと、
工程 Cによる処理後の試料を顆粒球吸着材と接触させる工程 Dとを含む、単核球を 含む細胞画分の調製法。
[2] 工程 Aまたは工程 Dが、顆粒球吸着材が充填されたカラムに前記体液または工程 Cによる処理後の試料を通過させる力 顆粒球吸着材と前記体液または工程 Cによる 処理後の試料とを同一容器内で接触させることにより行われる請求項 1記載の方法。
[3] 工程 Bまたは工程 C力 前記体液または工程 Aによる処理中または処理後の試料 の、単核球と赤血球とを分離することができる条件下での遠心分離、および前記体液 または工程 Aによる処理中または処理後の試料への、単核球と赤血球とを分離する ことができる細胞分離剤の添加からなる群力 選択される少なくとも 1種の処理を行う 工程であり、かつ
工程 Aと工程 B、あるいは工程 Cと工程 Dとが同一容器内で行われる、請求項 1記 載の方法。
[4] 顆粒吸着材が、水不溶性粒子、不織布、多孔質体、平膜、および中空糸からなる 群力 選ばれる少なくとも 1種である請求項 1〜3のいずれ力 1項記載の方法。
[5] 細胞分離膜が、不織布、多孔質体、平膜、および中空糸力もなる群力 選ばれる少 なくとも 1種である請求項 1、 2または 4記載の方法。
[6] 顆粒球吸着材カ 無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換基尺に よって置換された水酸基とを有する重合体化合物を含有する顆粒球吸着材である、 請求項 1〜5のいずれか 1項記載の方法。
[7] 前記重合体化合物が、無置換の水酸基と、基中の Hが 1種または 2種以上の置換 基 Rによって置換された水酸基とを有するポリビュルアルコール、ポリビュルアルコー ル共重合体または多糖類である請求項 6記載の方法。
[8] 置換基 Rがァシルである請求項 6または 7記載の方法。
[9] 水不溶性である請求項 6〜8の！、ずれか 1項記載の方法。
[10] 置換基 Rによって置換されている水酸基の割合が全水酸基の 35〜53%である請 求項 6〜9の!、ずれか 1項記載の方法。
[11] 前記重合体ィ匕合物が、ァセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸 基の 35〜53%である酢酸セルロースである請求項 10記載の方法。
[12] 請求項 1〜11のいずれか 1項記載の方法により調製された、単核球を含む細胞画 分を含む細胞医療用組成物。
[13] 単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単核球を含む細胞 画分を調製するための装置であって、
顆粒球吸着材を収容してなる第 1手段と、
前記体液または請求項 1に定義される工程 Aによる処理中または処理後の試料を 遠心分離する手段、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤を収容し てなる手段、および単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離膜を備えた手 段力 なる群力 選択される第 2手段とを備える、前記装置。
[14] 第 1手段と第 2手段とが液体連通している、請求項 13記載の装置。
[15] 単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単核球を含む細胞 画分を調製するための装置であって、
顆粒球吸着材と、単核球と赤血球とを分離することができる細胞分離剤とを収容し てなる手段を備える、前記装置。
[16] 単核球、顆粒球および赤血球を含有する哺乳動物の体液から、単核球を含む細胞 画分を調製するための装置であって、
顆粒球吸着材を収容してなる遠心分離用容器と、該容器を遠心する手段とを備え る、前記装置。
[17] 請求項 13〜16のいずれか 1項記載の装置を用いて調製された、単核球を含む細 胞画分を含む細胞医療用組成物。
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