CN103388007A - 一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法 - Google Patents
一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103388007A CN103388007A CN2013103151085A CN201310315108A CN103388007A CN 103388007 A CN103388007 A CN 103388007A CN 2013103151085 A CN2013103151085 A CN 2013103151085A CN 201310315108 A CN201310315108 A CN 201310315108A CN 103388007 A CN103388007 A CN 103388007A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dmscs
- cell
- tissue engineering
- spinal cord
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 title abstract 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title abstract 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 14
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000014413 Neuregulin Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108050003475 Neuregulin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 3
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 66
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 20
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 abstract description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract 3
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 16
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 5
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 5
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- CJYQQUPRURWLOW-YDLUHMIOSA-M dmsc Chemical compound [Na+].OP(=O)=O.OP(=O)=O.OP(=O)=O.[O-]P(=O)=O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O CJYQQUPRURWLOW-YDLUHMIOSA-M 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 1
- 238000001467 acupuncture Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037152 sensory function Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用人源性真皮多能干细胞制备组织工程脊髓的方法，包括如下步骤：1)分离dMSCs，传代得dMSCs原代细胞；2)将分离得到的dMSCs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增；3)将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含深神经营养素、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，梯度酒精脱水后，真空干燥；将扩增后的dMSCs，以脑源性神经营养素腺病毒表达载体感染，将细胞接种到工程脊髓材料材料上，进行培养。本发明的方法中，组织工程脊髓可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程脊髓的制备方法，尤其涉及一种真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法。
背景技术
脊髓损伤修复是临床救治的难点和重点之一，干细胞移植是治疗脊髓损伤较有前景的方法之一，但目前存在的主要问题有：1.干细胞的自体移植具有无免疫原性和使用方便等优点，但神经干细胞和胚胎干细胞等很难实现自体移植，而皮肤来源的干细胞来源丰富，可进行自体移植。皮肤来源的干细胞可在不同微环境的诱导下分化为包括神经元在内的多种类型的细胞，因而其应用于脊髓损伤修复具有良好的前景和实用价值。2.种子细胞不能更多地分化为神经元和少突胶质细胞等修复细胞，导致其修复效果不佳，因而需要寻找合适的手段诱导其更多地向神经元等分化。3.不适当的移植时机导致移植细胞不能有效地发挥其作用。有研究表明，脊髓损伤后细胞移植的较佳移植时机为伤后10天至2周左右，因而如何在这个时间窗内获得足够量的干细胞或经过合适的扩增条件获得足够量的干细胞是提高干细胞移植修复效果的一个需要解决的实际问题。4.组织工程中移植细胞的存活数量要大大少于修复所需细胞数量。因而需要寻找措施增加移植后干细胞的存活数量，或者增加内源性干细胞的动员，以提高干细胞移植的修复修复效果。
针对上述存在的问题，本领域技术人员致力于开发一种真皮来源的间充质干细胞(dermal multipotent stem cells，dMSCs)的快速增殖和诱导dMSCs更多向神经元和少突胶质细胞分化的方法。然后，以上述条件培养的人源性dMSCs为种子细胞构建组织工程脊髓，并将其利用到脊髓功能的修复上。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种利用dMSCs制备组织工程脊髓的方法，包括如下步骤：
1)、分离dMSCs
将皮肤样品酒精消毒后，胰酶消化，然后将真皮组织剪成细胞片并碎吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中，2h后，将悬浮的细胞离心后转移到dMSCs生长培养基中进行培养，6h后，弃培养液和悬浮细胞，继续培养早期贴壁细胞，反复传代，至有集落样细胞群体生成，并传代得dMSCs原代细胞。
2)、dMSCs快速扩增
将分离得到的dMSCs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增，所述扩增培养基中含有50-80ng/ml的FGF2，或者含有FGF250-100ng/ml和血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)30-50ng/ml。
3)、制备组织工程脊髓
将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含NT3、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，然后吸走培养皿中的液体，将组织工程脊髓材料经过梯度酒精脱水后，真空干燥；
将扩增后的dMSCs，以BDNF腺病毒表达载体感染，12h后收集细胞接种到上述的工程脊髓材料材料上，加入培养基培养。
进一步地，所述步骤1)中，所述皮肤样品为，0.5×4cm2的全层皮肤，所述胰酶质量体积浓度为0.25％，所述dMSCs生长培养基为：IMEM/10％胎牛血清；培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。
进一步地，所述步骤2)中，所述扩增培养基为含有50-80ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor，FGF2)，或者含有50-100ng/mlFGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)的IMDM培养基。培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。
进一步地，所述步骤3)中，组织工程脊髓材料饱和水溶液和生理盐水的体积比为1∶1，生理盐水中NT3、维甲酸和Neuregulin的浓度分别为10ng/ml、6ng/ml和10ng/ml，静置时间为30-40min。
优选地，所述步骤3)中，细胞接种密度为5×105/ml，为含10％FBS的IMDM培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。
相对于单纯的组织材料，本发明的方法中，含有10ng/ml NT3、6ng/ml维甲酸、10ng/ml Neuregulin的组织工程材料可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。
附图说明
图1是本发明分离得到的dMSCs；
图2是βIII-tubulin检测dMSCs分化为神经元细胞；
图3是DAPI、GFAP和CNPas检测dMSCs分化为少突胶质细胞；
图4是不同浓度的细胞因子对dMSCs增殖的影响：
图5是伤后3d各组大鼠脊髓中BDNF表达情况，A-D分别对应A-D组大鼠脊髓(荧光免疫组织化学，×200)；
图6是伤后7d各组大鼠功能评分。注：**：P＜0.01，*：P＜0.05和A组相比；ΔΔ：P＜0.01，ΔP＜0.05和D组相比。
本发明中所用组织工程脊髓材料为上海吉尔生化有限公司Sapeptide(sefl-assembling peptide)材料RAD15-II。
具体实施方式
实施例1分离dMSCs
脊髓损伤患者大腿内侧或背部皮肤常规消毒后，1％利多卡因麻醉，取大小约0.5×4cm2的全层皮肤。酒精消毒，剪取皮肤置于0.25％胰酶消化过夜。次日，Hank's液清洗后，去除表皮和皮下组织，将真皮组织剪成细胞碎片并吹打成细胞悬液，过滤后接种于培养瓶中，培养基为IMEM/10％胎牛血清。6h后，弃培养液和悬浮细胞，继续培养早期贴壁细胞。反复传代，至有集落样细胞群体生成，按常规方法接种和选取细胞克隆，并传代备用。分离出的dMSCs如图1所示。
其中，采用细胞免疫荧光组织化学检测dMSCs是否在诱导后向神经元和少突胶质细胞分化，采用的一抗分别是βIII-tubulin(神经元)、GFAP和CNPas(少突胶质细胞)。细胞免疫荧光组织化学的操作步骤简述如下：将dMSCs传代至24孔培养板，细胞约70％融合后加入含10ng/ml BDNF+10ng/ml NT3+6ng/ml维甲酸+5％FBS的培养基(诱导向神经元分化)或含有5％FBS+10ng/mlNeuregulin的培养基(诱导向少突胶质细胞分化)。诱导分化48h后，去除培养基，PBS漂洗后加入95％乙醇固定20min，PBS充分漂洗后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。次日倾去一抗并用PBS充分漂洗后加入对应的荧光二抗，室温孵育约30min后PBS充分漂洗，荧光显微镜下观察并拍照记录。图2显示了dMSCs能够被成功诱导为神经元细胞，图3显示了dMSCs能够被成功诱导为少突胶质细胞。
实施例2dMSCs快速扩增
通常原代细胞的生长较为缓慢，为了在最佳移植时间窗内获得足够量的细胞，本实施例研究了不同生长因子对dMSCs的促增殖情况。通过文献调研可知，多种细胞因子参与干细胞增殖的调节，主要有碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor-2，FGF-2)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、白血病抑制因子(1eukemia inhibiting factor，LIF)、db-cAMP、胰岛素生长因子-1(insulin growth factor-1，IGF-1)、胰岛素生长因子-2(insulin growthfactor-2，IGF-2)、血小板源性生长因子(Plate derived growth factor，PDGF)、脑源性神经营养素(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)、神经生长因子-B(nerve growth factor-β，NGF-β)、骨形态发生蛋白-4(bone morphogentic protein4，BMP-4)和activin A等，其中FGF-2、EGF和PDGF作用最为强大。但不同细胞因子对不同种类的干细胞作用及其机制不尽相同，同时上述细胞因子在影响干细胞增殖的同时，有可能还会影响其分化和迁移等生物学功能，需要给予注意。因而在观察各种因子的促增殖效果时，还要注意各种细胞因子对分化和迁移功能的影响。需要找到一种既能有效促进干细胞增值，又不影响其分化和迁移功能的培养基配方。
其中，细胞增殖活性的测定采用3H-TdR掺入和液体闪烁计数法测量，所需[甲基-３H]胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)购自中科学院上海原子核研究所，具体方法为：dMSCs在传代时调整细胞数为细胞数为3×105/ml，向每个培养瓶加入终浓度为2μCi/ml的3H-TdR，加入上述含有不同细胞因子的培养基培养。2天后收集细胞用HClO4-H2O2法65℃水浴消化。待完全消化后，用NaOH中和消化液至pH7.0。然后取0.1ml样本，加入1.5ml乙二醇/乙醚(1∶1)溶液和5ml二甲苯液闪烁4h后用LS6500液闪计数仪(Beckman COULTERTM，USA)进行液闪计数。细胞分化采用细胞荧光免疫组化学进行检测，方法简述为：将dMSCs传代至24孔培养板，细胞约70％融合后加入上述含有不同细胞因子的培养基培养48h后，去除培养基，PBS漂洗后加入95％乙醇固定20min，PBS充分漂洗后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。次日倾去一抗并用PBS充分漂洗后加入对应的荧光二抗，室温孵育约30min后PBS充分漂洗，荧光显微镜下观察并拍照记录。细胞迁移功能采用Transwell的方法进行测定，简述如下：常规收集各种条件处理过的dMSC，取100μl细胞悬液，细胞数约1×105，接种于Transwell小室(Costar，USA)内。每组重复6个标本。约1h后，Transwell小室外加伤口液或正常组织液或生理盐水400μl。4小时后，取出Transwell小室，PBS冲洗，用棉签轻轻擦去微孔膜上层的细胞，95％酒精固定小室下层细胞，苏木素染色后高倍镜下计数。取10个视野的均数作为该样本从微孔膜上层迁移至下层的细胞数。
结果表明，对dMSCs而言，在单个因子的作用下，FGF2的作用最强，呈剂量依赖性，约在80ng/ml达到平台；联合因子的作用中，FGF2+PDGF的作用最强。两种培养条件没有影响dMSCs的分化和迁移特性。优化后的的dMSCs扩增培养基为：含有50-80ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子2(fibroblast growthfactor，FGF2)，或者含有50-100ng/ml FGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)的IMDM培养基。优化后的培养条件可增加dMSCs的增殖速度约1.2倍。
实施例3dMSCs分化神经元和少突胶质细胞分化条件的优化
脊髓损伤局部微环境不利于移植的干细胞向神经元等修复细胞分化，为此需要首先摸索出增加干细胞向神经元等修复细胞分化的条件，然后再在组织工程脊髓中复合这些条件以提高干细胞移植的修复效果。
离体实验观察dMSCs向神经元和少突胶质细胞分化的条件。诱导向神经元分化的培养基有三种：(1)5％FBS；(2)6ng/ml维甲酸；(3)10ng/mlBDNF+10ng/mlNT3+6ng/ml维甲酸+5％FBS。向雪旺氏细胞诱导共使用两种诱导培养基：(1)5％FBS；(2)5％FBS+10ng/mlNeuregulin。结果表明在10ng/mlBDNF+10ng/mlNT3+6ng/ml维甲酸+5％FBS的培养基条件下诱导dMSCs向神经元的分化几率最高，约为5％。(3)5％FBS+10ng/mlNeuregulin的培养体系诱导dMSCs向少突胶质细胞分化的几率最高，约为3.2％。
在离体实验的基础上，观察了使用BDNF的腺病毒表达载体(Adv-BDNF)感染的dMSCs移植后对脊髓损伤修复效果的影响。方法：成年大鼠72只采用改良Allen重物打击法制作脊髓损伤模型[7]，简述如下：将麻醉的大鼠俯卧位固定后显露T10节段的脊髓，用重20g、打击头直径为2.5mm的打击器自2.5cm高度自由落下，造成T10节段脊髓打击伤。然后随机分为4组：A组接受Adv-BDNF感染的dMSCs移植(n＝18)，移植前4h向dMSCs培养基中加入0.2ml第3代Adv-BDNF毒原液(病毒滴度约为1.5×1010PFU/ml，其中PFU为Plaque-formating unit，即空斑形成单位)。继续培养4h后，收集dMSCs调增细胞密度为1×107/ml，取100μl使用Hamilton注射器于损伤脊髓处缓慢注射。为防止细胞渗漏，注射完毕后保留注射器于原位5min。B组接受没有感染病毒载体的dMSCs移植(n＝18)，收集生长状态良好的dMSCs，调整到A组同样的密度，同样的方法注射到SCI(脊髓损伤)局部。C组接受单纯Adv-BDNF注射(n＝18)，SCI后在损伤局部注射100μl第3代Adv-BDNF毒原液，病毒滴度同上。D组不接受细胞移植或病毒注射，为单纯损伤对照组(n＝18)。为防止膀胱感染，术后每天行人工挤压膀胱排尿2次。然后采用免疫荧光组织化学检测损伤SCI局部BDNF的表达情况，简述如下：移植后3d和7d每组取6只大鼠致死后取材，95％酒精固定后常规制备5μm石蜡切片，PBS漂洗3次，然后加非特异性封闭血清封闭后加一抗，4℃孵育过夜。PBS漂洗3次后加入相对应的荧光二抗，室温孵育1h。荧光显微镜观察。
采用流式细胞仪计数检测损伤脊髓局部的细胞凋亡情况，方法简述如下：取伤后3d大鼠脊髓，每组6只，常规消化后离心取细胞用冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。离心收集细胞，以lmL的PBS洗细胞一次，加入500μL含50ug/mL溴化乙锭、100μg/mL RNase A、0.2％Triton X-100的PBS，上机检测凋亡细胞的百分比。
结果表明，Adv-BDNF感染的dMSCs移植后的修复效果优于单纯dMSCs移植组，向神经元分化的几率也较高，细胞存活数量高(图5)，伴有更好的功能恢复(图6)。
图5显示的是伤后3d SCI局部BDNF阳性细胞(绿色荧光)，可见A组大鼠损伤脊髓中有多量BDNF阳性细胞，大部分为长梭状，少量为神经元样细胞(图5A)，提示大部分BDNF阳性细胞为dMSCs，其余可能为少量dMSCs坏死崩解后释放的病毒感染SCI局部的神经元引起其表达阳性，还有可能是SCI引起SCI局部反应出现BDNF阳性细胞。C组大鼠局部可见到多量的BDNF阳性细胞，多为神经元形状(图5C)，提示Adv-BDNF局部注射可有效地感染SCI局部的神经细胞。B组和D组SCI局部BDNF阳性细胞数量明显为少(图5B和D)。伤后7d，A组和C组大鼠SCI局部BDNF阳性细胞数量无明显减少，B组和D组数量无明显变化。
SCI急性期(1-3d)为局部细胞凋亡的高峰期，所以我们选择了3d这个时相点观察细胞的凋亡情况。结果显示，A组大鼠SCI局部细胞的凋亡率约为4.7％±0.36％，略低于C组(4.9％±0.29％)，但无显著差异(t＝2.43，P＞0.05)，但明显低于B组6.2％±0.42％，t＝8.654，P＜0.05)和D组6.7％±0.45％，t＝9.243，P＜0.05)。
伤后7d评价BBB法评价各组大鼠功能恢复情况(图6)，结果显示，A组大鼠功能恢复最好，明显好于其他各组(P＜0.05)。而B组和C组大鼠功能恢复相当，无显著差异(P＞0.05)，均高于D组(P＜0.05)。
实施例4制备组织工程脊髓
在室温下饱和水溶液1ml，滴加到35mm的盛有1ml含10ng/mlNT3、6ng/ml维甲酸、10ng/mlNeuregulin生理盐水溶液的培养皿中，底部预先放置一大小约2cm×2cm的盖玻片。静置30-40min后，动作轻柔地从边缘吸走培养皿中的液体。将Sapeptide材料经过梯度酒精(30％、50％、70％、90％和100％)脱水后，在用真空干燥器干燥。
上述方法分离培养和扩增dMSCs后，以BDNF腺病毒表达载体感染之，12h后收集细胞并计数以5×105/ml的密度接种到Sapeptide材料上，加入1ml培养基，每4h观察并根据情况再次添加适量培养基，培养24h进行离体观察，或者培养12h进行在体移植。
离体观察的项目有细胞的分化和增殖情况。其中，分化使用细胞免疫组织化学的方法，具体操作同前，增殖采用针对Ki67的细胞免疫组织化学，具体操作同前。结果发现，相对于单纯的组织材料，含有1NT3、6ng/ml维甲酸、10ng/mlNeuregulin的组织工程材料可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。
然后我们将构建负载BDNF腺病毒感染的dMSC的组织材料移植到小鼠体内，移植后1w、2w和3w常规收集标本，分别进行针对GFP的实时定量PCR(SybGreen技术)计量脊髓中存活的细胞量、免疫组织化学分析细胞的分化情况、BBB功能评定小鼠神经功能恢复情况。其中，小鼠模型同前，BBB评分法简述如下：A.通过观察下肢针刺反射评估感觉功能：0，无反射；1，一侧肢体反射；2，两侧肢体反射；3，头从一侧转向刺激；4，头从两侧转向刺激；5，一侧对照肢体收缩；6，两侧对照肢体收缩；运动功能评分系统：0，无后肢运动(BBB评分0)；1，痉挛的、非控制性一侧后肢运动(BBB评分1-2)；2，痉挛的、非控制性两侧后肢运动(BBB评分3-5)；3，一侧后肢控制性运动(BBB评分6-7)；4，两侧后肢控制性运动(BBB评分8-9)；5，一侧后肢辅助行走(BBB评分10-12)；6，两侧后肢辅助行走(BBB评分13-21)。
观察结果表明，复合组织材料移植后细胞存活量明显高于对照组，移植细胞向神经元和分化的比例为2.8％，明显高于对照组，同时，小鼠的功能恢复明显高于对照组。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种利用dMSCs制备组织工程脊髓的方法，包括以下步骤：
1)、分离dMSCs
将皮肤样品酒精消毒后，胰酶消化，然后将真皮组织剪成细胞片并碎吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中，2h后，将悬浮的细胞离心后转移到dMSCs生长培养基中进行培养，6h后，弃培养液和悬浮细胞，继续培养早期贴壁细胞，反复传代，至有集落样细胞群体生成，并传代得dMSCs原代细胞；
2)、dMSCs快速扩增
将分离得到的dMSCs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增，所述扩增培养基中含有50-80ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子2，或者含有FGF250-100ng/ml和血小板源性生长因子30-50ng/ml。
3)、制备组织工程脊髓
将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含NT3、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，然后吸走培养皿中的液体，将组织工程脊髓材料经过梯度酒精脱水后，真空干燥；将扩增后的dMSCs，以脑源性神经营养素腺病毒表达载体感染，12h后收集细胞接种到上述的工程脊髓材料材料上，加入培养基培养。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中，所述皮肤样品为，0.5×4cm2的全层皮肤。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中，所述胰酶质量体积浓度为0.25％，所述dMSCs生长培养基为：IMEM/10％胎牛血清；培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)中，所述扩增培养基为：含有50-80ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子2，或者含有50-100ng/ml FGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子的IMDM培养基。培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤3)中，所述组织工程脊髓材料饱和水溶液和所述生理盐水的体积比为1∶1，所述生理盐水中NT3、维甲酸和Neuregulin的浓度分别为10ng/ml、6ng/ml和10ng/ml，所述静置时间为30-40min。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤3)中，细胞接种密度为5×105/ml，培养基组分为含10％FBS的IMDM培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310315108.5A CN103388007B (zh) | 2013-07-25 | 2013-07-25 | 一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310315108.5A CN103388007B (zh) | 2013-07-25 | 2013-07-25 | 一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103388007A true CN103388007A (zh) | 2013-11-13 |
| CN103388007B CN103388007B (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=49532429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310315108.5A Active CN103388007B (zh) | 2013-07-25 | 2013-07-25 | 一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103388007B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106995796A (zh) * | 2016-01-26 | 2017-08-01 | 李建业 | 基于细胞因子的细胞处理方法、试剂盒及冻干粉 |
| CN113583948A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-11-02 | 天津长和生物技术有限公司 | Cd200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1833021A (zh) * | 2003-07-18 | 2006-09-13 | 大冢制药株式会社 | 少突胶质祖细胞和获得及培养它们的方法 |
| WO2007098541A1 (en) * | 2006-02-28 | 2007-09-07 | Regenertech Pty Limited | Tissue regeneration ii |
-
2013
- 2013-07-25 CN CN201310315108.5A patent/CN103388007B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1833021A (zh) * | 2003-07-18 | 2006-09-13 | 大冢制药株式会社 | 少突胶质祖细胞和获得及培养它们的方法 |
| WO2007098541A1 (en) * | 2006-02-28 | 2007-09-07 | Regenertech Pty Limited | Tissue regeneration ii |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 侯天勇 等: "脊髓神经干细胞在sapeptide材料上增殖与分化的研究", 《中华创伤杂志》 * |
| 宗兆文 等: "BDNF基因修饰真皮多能干细胞移植对脊髓损伤的修复作用", 《重庆医学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106995796A (zh) * | 2016-01-26 | 2017-08-01 | 李建业 | 基于细胞因子的细胞处理方法、试剂盒及冻干粉 |
| CN113583948A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-11-02 | 天津长和生物技术有限公司 | Cd200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基 |
| CN113583948B (zh) * | 2021-06-15 | 2022-06-14 | 天津长和生物技术有限公司 | Cd200+亚群脐带间充质干细胞的培养方法及其所用的培养基 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103388007B (zh) | 2016-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103667182B (zh) | 一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基 | |
| CN104263697B (zh) | 一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法 | |
| CN101748096B (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| CN102002475B (zh) | 人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法 | |
| CN103251649B (zh) | 人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备方法 | |
| CN106109496A (zh) | 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法 | |
| KR20100065338A (ko) | 인간 또는 동물 배아에서 중간엽 줄기세포를 추출 및 그 분비물을 추출하는 방법 | |
| CN104622902B (zh) | 一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂 | |
| CN103275922B (zh) | 一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法 | |
| CN105779383A (zh) | 一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用 | |
| CN105039247B (zh) | 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用 | |
| CN104173252B (zh) | 一种含自体基质细胞的生物美容制剂 | |
| CN105255822A (zh) | 临床治疗级细胞治疗用毛囊干细胞细胞外基质筛选培养方法 | |
| CN103087977A (zh) | 一种体外高效扩增动物细胞的培养液及其用途 | |
| CN109988746A (zh) | 一种间充质干细胞成脂诱导分化方法 | |
| CN101215546A (zh) | 利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法 | |
| Wang et al. | Hair follicle stem cells isolated from newborn Yangtze River Delta White Goats | |
| CN105754935A (zh) | 一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的诱导培养基及其应用 | |
| CN103388007A (zh) | 一种利用真皮来源的间充质干细胞制备组织工程脊髓的方法 | |
| CN103865873A (zh) | 亚全能干细胞分泌的外来体及其应用 | |
| CN108715831A (zh) | 间充质干细胞条件培养基在改善缺氧/复氧诱导的细胞损伤中的应用 | |
| CN105670989A (zh) | 高效诱导成体细胞表观重编程的试剂盒及其方法 | |
| CN103396984B (zh) | 一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法 | |
| CN111228311A (zh) | 保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法 | |
| CN101407790B (zh) | 一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20191115 Address after: Chongqing city Shapingba street 400038 gaotanyan No. 30 Patentee after: PLA Military Medical University Address before: Chongqing city Yuzhong District Daping 400042 Yangtze River Branch No. 10 Co-patentee before: Chen Sixu Patentee before: Zong Zhaowen |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: PLA Military Medical University Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |