CN108884022A - 用于治疗神经元的过度兴奋的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗脊髓损伤后GABA介导的突触前抑制的丧失的疗法。该治疗方案包括在脊髓创伤或缺血性损伤后，GAD65(谷氨酸脱羧酶)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)脊髓节段特异性上调以调节患者的慢性痉挛。

Description

用于治疗神经元的过度兴奋的方法和组合物
相关文献的交叉引用
本申请要求根据35 U.S.C.§119(e)于2016年3月28日提交的美国系列号62/314,128的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
资助信息
本发明是在国立卫生研究院授予的资助号NS051644-02A2的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明一般涉及治疗脊髓损伤，且更具体地涉及脊髓创伤或缺血性损伤后调节患者的慢性痉挛的联合治疗方案。
背景技术
脊髓损伤(创伤性或缺血性)可导致临床上定义的痉挛和僵硬的发展。导致脊髓损伤后出现痉挛的潜在机制之一被认为是局部节段性抑制的丧失，并且由此导致：i)强直运动神经元放电增加，ii)肌肉伸展期间初级传入输入增加，和/或iii)加剧对外周感觉刺激(即异常性疼痛)的反应。已显示γ-氨基丁酸(GABA)介导的突触前、周期性和相互的突触后抑制的丧失以及其在屈肌传入途径中的抑制作用的丧失代表了关键机制之一。
然而，有趣的是，先前的研究已经显示Th12横断的猫的腰椎脊髓节段中脊髓实质GAD67的表达显著增加。类似地，在出生后第5天进行了胸正中脊髓横断的成年大鼠中，已经显示出在α-运动神经元膜附加(apposing)的抑制性小结(boutons)的密度增加。这些数据表明脊髓中间神经元中GABA合成酶的静态增加或者在没有特定的抑制性神经元驱动活性的存在下，脊髓创伤后与α-运动神经元的抑制性接触数量的增加，不足以预防痉挛/反射亢进的发展。除了减弱抑制的作用外，已经表明其他一些潜在的机制有助于脊髓创伤后痉挛的发展，包括：i)α-运动神经元5-HT2C受体活性的进行性增加，其在没有脑源性5-羟色胺的存在下自发变得活跃，或ii)运动神经元中氯化钾共转运蛋白KCC2的下调，并引起GABA介导的去极化。共同地，这些数据表明导致脊髓损伤(创伤性或缺血性)后痉挛发展的机制是复杂的，并且可以根据所使用的模型以及诱导损伤时实验动物的年龄而变化。
临床药物治疗研究表明，全身性施用或脊髓施用巴氯芬(GABAB受体激动剂)的使用代表了最有效的抗痉挛药物治疗。虽然对于调节不同病因(包括脊髓创伤、肌萎缩脊髓侧索硬化症或中枢性中风)的痉挛是有效的，，但诸如一般镇静和进行性耐受性发展的主要副作用常常限制其长期使用。全身性施用诸如噻加宾(GABA再摄取抑制剂)的类GABA化合物的使用在临床上可接受的剂量中仅表现出弱的或不表现出抗痉挛作用，其与全身性递送后，脑或脊髓实质GABA释放的相对适度的增强相关。此外，目前可用的脊髓药物递送系统(诸如硬膜外或鞘内递送)不允许脊髓节段限制性治疗效果。这是因为影响个体肌肉群痉挛的起源可以被体部映射到特定的脊髓节段，所以通过减少不想要的副作用，节段靶向的抗痉挛治疗的发展比目前的治疗方法将具有明显的优势。因此，存在对新颖的抗痉挛治疗的需求。
发明内容
本发明基于以下观察结果：在具有缺血诱导的痉挛的大鼠中由GAD65(谷氨酸脱羧酶)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗引起抗痉挛作用，并且这样的联合治疗引起肌肉痉挛减少。
因此，本发明提供了治疗受试者痉挛的方法。该方法包括上调GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因，从而治疗受试者的痉挛。GAD65基因和VGAT基因的上调可以是GAD65基因和VGAT基因的脊髓特异性上调，通过向受试者施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT，从而减少痉挛。GAD65基因和VGAT基因可能过表达。载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体(AAV)。AAV可以是AAV 9型(AAV9)。在各种实施方案中，将病毒载体直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。
在另一方面，本发明提供治疗受试者痉挛的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的病毒载体，其包含编码GAD65基因和VGAT基因的多核苷酸，从而治疗受试者的痉挛。载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体(AAV)，并且可以直接施用于受试者的脊髓。AAV可以是AAV9型(AAV9)。在各种实施方案中，将载体直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。
在另一方面，本发明提供了用于治疗患有脊髓损伤的受试者的治疗方案。该治疗方案包括施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT，从而减少痉挛。GAD65和VGAT的上调包括施用编码GAD65和VGAT的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT并减少痉挛。载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体，并且可以直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。在各种实施方案中，将载体直接施用至受试者的脊髓实质、至受试者的鞘内空间、至受试者的脊髓软膜下空间或至受试者的外周痉挛肌肉。
另一方面，本发明提供了表达盒，其包含与编码GAD65和VGAT的多核苷酸功能性连接的启动子或调节序列。还提供了诸如AAV9的载体，其包括诸如与编码GAD65和VGAT的多核苷酸功能性连接的启动子的调节序列。
附图说明
图1为显示用于实施本发明方法的示例性方法学的示意图。
图2为显示腰椎软膜下AAV9-UBI-GFP递送后实现的转基因表达的分布的示意图。可以看到遍及灰质的中间神经元中广泛GFP表达。使用软膜下递送方法将编码GAD65(谷氨酸脱羧酶65)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的AAV9病毒注射到靶向节段中。
图3A-图3D为显示慢性脊髓横断诱导的痉挛的大鼠腰椎软膜下AAV9-UBI-GAD65+VGAT递送后，有效的抗痉挛和抗疼痛作用的图。
图4A-图4D为显示通过腰椎软膜下AAV9-UBI-GAD65+VGAT递送，在脊髓兴奋性中间神经元中混合抑制性-兴奋性神经递质表型的诱导的示意图。在第8周，经注射GAD65/VGAT基因的节段的免疫荧光分析显示两种基因的显著上调和混合抑制性/兴奋性神经递质表型的出现(GAD65或VGAT与VGLUT2(囊泡谷氨酸转运蛋白)的共表达)，(图4A和4B)。在注射对照AAV9的动物中没有发现共表达(图4C和4D)。这些数据证实了GAD65/VGAT过表达的神经元中抑制性驱动的有效诱导，其可能介导肌肉痉挛的减少。
图5为显示在腰椎软膜下AAV9-UBI-GAD65+VGAT递送后，痉挛大鼠中腰椎脊髓中混合的抑制性-兴奋性中间神经元和突出的DRG神经元的数量显著增加的示意图。该表显示了GAD65和VGAT表达的定量分析。
具体实施方式
本发明基于以下观察结果：具有缺血诱导的痉挛大鼠中由GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗引起抗痉挛作用，且这种联合治疗会引起肌肉痉挛减少。
在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明不限于所述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限定，因为本发明的范围仅由所附权利要求限定。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。因此，例如，提及“该方法/所述方法”时包括在阅读本公开等后对于本领域技术人员而言变得显而易见的一种或更多种方法，和/或本文所述类型的步骤。术语“包括(comprising)”其可与“包含(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”互换使用，是包含性或开放式语言，并且不排除另外的，未列举的要素或方法步骤。短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的基础和新颖特征的那些。本发明考虑了对应于这些短语中的每一个的范围的本发明组合物和方法的实施方案。因此，包含所列举的要素或步骤的组合物或方法考虑了其中所述组合物或方法基本上由这些要素或步骤组成的特定实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料进行描述。
如本文所用的术语“受试者”是指进行本发明方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但是如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此受试者的定义还包括其他动物，包括诸如啮齿动物(包括老鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子的哺乳动物，包括牛、马、山羊、绵羊、猪等的农场动物，以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
如本文所用，“治疗效果”包括如本文所述的治疗益处和/或预防益处。
如本文所用，术语“减少”和“抑制”是一起使用的，因为意识到在某些情况下，减少可以降低至低于特定试验的检测水平。因此，可能并不总是清楚表达水平或活性是否“减少”至低于试验检测水平，或者被完全“抑制”。然而，在根据本发明的治疗后，其将是清楚可确定的。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指将组合物施用于具有不期望情况的受试者或系统。该情况可包括疾病或障碍。“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指将组合物施用于有患病风险的受试者或系统。该病症可包括对疾病或障碍的易感性。向受试者施用组合物(治疗和/或预防)的效果可以是，但不限于，一种或多种病症症状的停止、一种或多种情况症状的减少或预防、病症严重程度的降低、病症的完全消除、特定事件或特征的发展或进展的稳定或延迟，或特定事件或特征将发生的机会的最小化。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于如下氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以通过其通常接受的单字母代码来指代。
如本文所用，“调节基因”或“调节序列”是编码控制其他基因表达的产物(例如转录因子)的核酸序列。
如本文所用，“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是置于适当调节序列控制下，在体外或体内转录成mRNA(在DNA的情况下)并翻译成多肽(在mRNA的情况下)的核酸序列。编码序列的边界由5'末端的起始密码子(N末端)和3'末端的翻译终止无义密码子(C末端)确定。编码序列可包括但不限于来自真核mRNA的cDNA、来自真核DNA的基因组DNA序列和合成的核酸。转录终止序列通常位于编码序列的3'端。
如本文所用，“启动子”定义为通常位于基因上游的调节DNA序列，其通过指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成来介导转录起始。启动子可以是组成型活性启动子(即，持续处于活跃/“ON”状态的启动子)；其可以是诱导型启动子(即，受外部刺激控制(例如特定化合物或蛋白质的存在)的处于活性/“ON”或非活性/“OFF”状态的启动子)；其可以是空间限制的启动子(即转录控制元件、增强子等)(例如，组织特异性启动子、特定细胞类型启动子等)，；以及其可以是时间限制的启动子(即，在胚胎发育的特定阶段或在生物过程的特定阶段期间，启动子处于“ON”状态或“OFF”状态)。
如本文所用，术语“基因”是指包含结构基因的编码区的脱氧核糖核苷酸序列。“基因”还可以包括位于5'和3'末端的编码区附近的非翻译序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'端并且存在于mRNA上的序列称为5'端非翻译序列。位于编码区3'端或下游并且存在于mRNA上的序列称为3'端非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有用被称为“内含子”或“插入区域”或“插入序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成异源核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可能含有诸如增强子的调节元件。内含子被从核或初级转录物中移除或“剪接”出来；因此，在信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译过程中起作用以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
如本文所用，术语“功能性连接”和“可操作地连接”可互换使用，并且指两个或更多个DNA区段之间的功能关系，特别是待表达的基因序列和控制其表达的那些序列的功能关系。例如，如果启动子/增强子序列(包括顺式作用转录控制元件的任何组合)在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。与转录的基因序列可操作地连接的启动子调节序列在物理上与转录序列邻接。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将意识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和除了TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列，技术人员将意识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个改变、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸)是“保守地修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸替换氨基酸。提供本领域熟知的功能相似的氨基酸的保守取代表。此类保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。
保守取代可以包括诸如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等的取代。由于结构原因，由此衍生的氨基酸组可能是保守的。这些组可以以维恩图的形式描述(LivingstoneC.D.and Barton G.J.(1993)"Protein sequence alignments:a strategy for thehierarchical analysis of residue conservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)"The classification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119；205-218)。例如，可以根据下表描述保守取代，该表描述了通常接受的氨基酸的维恩图分组。
表1：氨基酸分组
“序列一致性百分比”通过在比较窗口比较两个最佳比对序列来确定，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与参考序列(例如，本发明的多肽)相比的添加或缺失(即，空位gaps)，而参考序列不包含添加或缺失的参考序列。通过确定在两个序列中出现一致核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以得到序列一致性的百分比来计算比例。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或百分比“一致性”是指相同序列的两个或更多个序列或子序列。当在比较窗口进行比较和比对以获得最大对应关系，或者在使用以下序列比对算法之一或通过手动比对和目视检查时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上，或当未指定时在整条序列上具有60％，可选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)，则两个序列“基本一致”。本发明提供分别与本文示例的多肽基本相同的多肽及其用途，包括但不限于用于治疗或预防神经疾病或障碍(例如神经退行性疾病或障碍)，和/或治疗SCI。可选地，一致性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更优选长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域上，或参考序列的整个长度上。
对于序列比较，通常一条序列充当参考序列，测试序列与参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括涉及选自由20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成的组的任一数量的连续位置的片段，其中序列与具有相同数量连续位置的参考序列进行最佳比对之后，序列可与参考序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的寻找相似性方法，通过这些算法的计算机化(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis)实现，或通过手动比对和目视检查(参见，例如，Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology(1995 supplement))进行。
适用于确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402，和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字(words)来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul et al.,同上)。这些最初的相邻字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。只要可以增加累积比对得分，字命中就沿着每条序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的扩展：累积比对得分从其最大实现值下降数量X；由于一个或更多个负评分残基比对的累积，累积评分为零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。
BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计学分析(参见，例如，Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及其互补物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。在各种实施方案中，当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物(例如，细胞中存在的其他核酸或蛋白质)纯化时分离核酸，标准技术包括从包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术。参见例如F.Ausubel,et al.,ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。在各种实施方案中，核酸例如是DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
如本文所用，“药学上可接受的载体”涵盖任何标准药物载体，诸如磷酸缓冲盐水溶液、水和乳液(诸如油/水或水/油乳液)，和各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“神经元”包括神经元及其一部分或多个部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。本文所用的术语“神经元”表示神经系统细胞，其包括中央细胞体或体细胞，以及两种类型的延伸或突出：树突，通常大多数神经元信号通过树突传递至细胞体，和轴突，通常大多数神经元信号通过轴突从细胞体传递到效应细胞(诸如靶神经元或肌肉)。神经元可以将信息从组织和器官传递到中枢神经系统(传入神经元或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传出神经元或运动神经元)。其他神经元，称为中间神经元，将神经元连接于中枢神经系统(大脑和脊髓)内。可以进行根据本发明的治疗或方法的神经元类型的某些具体实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮质神经元。
术语“神经元退化”广泛使用并且指神经元细胞中的任何病理变化，包括但不限于神经元细胞的死亡或丧失，细胞死亡之前的任何变化，以及神经细胞的活动或功能的任何减少或丧失。病理变化可以是自发的或可以由任何事件诱导，并且包括，例如，与细胞凋亡相关的病理变化。神经元可以是任何神经元，包括但不限于感觉的、交感神经的、副交感神经的或肠的，例如背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元(例如来自脊髓的神经元)。神经元退化或细胞损失是多种神经疾病或障碍的特征(例如神经退行性疾病或失调)。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是运动神经元。在一些实施方案中，神经元是受损的脊髓神经元。
如本文所用，“痉挛”是指某些肌肉连续收缩的状况。这种收缩导致肌肉僵硬或紧绷，并且可能干扰正常运动、言语和步态。痉挛主要发生在中枢神经系统(CNS)的障碍中，以诸如痉挛性双瘫或上运动神经元综合征的病变形式影响上运动神经元，并且还可存在于各种类型的多发性硬化症中，其中以对髓鞘的逐渐恶化的攻击的症状出现，并且因此与神经肌肉性脑瘫根性痉挛紊乱中存在的痉挛类型无关。不受理论束缚，当脊髓和/或中枢神经系统损伤导致的对α运动神经元的兴奋性和抑制性输入发生不平衡时，就会出现痉挛。损伤导致神经系统和肌肉之间信号平衡的改变，导致肌肉的兴奋性增加。痉挛发生在大脑和/或脊髓受损或无法正常发育的情况下；这些包括脑瘫、多发性硬化、脊髓损伤和后天性脑损伤，包括中风。
如本文所用，“神经退行性障碍”或“神经障碍”是指导致神经细胞或神经细胞群的形态和/或功能异常的障碍。神经退行性障碍可导致受试者中正常神经功能受损或不存在，或者异常神经功能的存在。例如，神经退行性障碍可能是疾病、损伤和/或衰老的结果。形态和功能异常的非限制性实例包括神经细胞的物理退化和/或死亡、神经细胞的异常生长模式、神经细胞之间的物理连接的异常、神经细胞产生的实质(substance)或物质(substances)(例如神经递质)的生成不足或过度生成、神经细胞产生通常产生的实质或物质失败，以异常模式或异常时间产生物质(例如神经递质)和/或传输电脉冲。神经退行性变可发生在受试者的大脑的任何区域中，并且可见于许多疾病，包括例如头部创伤、中风、ALS、多发性硬化、亨廷顿氏病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
如本文所用，术语“伤害感受”是指感觉神经系统对某些有害或潜在有害刺激的反应。在伤害感受中，称为伤害感受器的感觉神经细胞的强烈的化学(例如，眼睛中的辣椒粉)、机械(例如，切割，粉碎)，或热(热和冷)刺激产生沿着神经纤维链从脊髓传导到大脑的信号。伤害感受引发各种生理和行为反应，并且通常导致有感觉的疼痛的主观体验。
γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是哺乳动物中的主要抑制性和兴奋性神经递质。GABA和谷氨酸之间的平衡控制着各种过程，如神经发生、运动、生物钟、组织发育和血糖调节。GABA由谷氨酸通过65kDa和67kDa的吡哆醛磷酸盐(PLP)依赖性酶谷氨酸脱羧酶(GAD65和GAD67)亚型合成。Bu et al.(1992)Proc Natl Acad Sci 89:2115-2119中已经分离并克隆了人GAD65和GAD67。人GAD65 cDNA编码分子量为65,000的多肽，具有585个氨基酸残基(Genbank登录号NM000818；M81882)，人GAD67编码分子量为67,000的多肽，具有594个氨基酸残基(Genbank登录号NM013445；M81883)；其中每一个都通过引用并入本文。另见美国公开号2016/0081956，其通过引用并入本文。
人GAD65的其他核酸和氨基酸序列是本领域已知的。参见，例如，GenBank登录号：Q05329，人谷氨酸脱羧酶2(GAD2/GAD65)，其提供氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
还参见，例如，GenBank登录号：X69936，谷氨酸脱羧酶(GAD2/GAD65)的智人mRNA，其提供核酸序列(SEQ ID NO:2)：
GABA通过与突触前和突触后神经元过程的质膜中的特异性跨膜受体结合而作用于脑中的抑制性突触。这种结合引起离子通道的打开，使带负电的氯离子流入细胞或带正电的钾离子流出细胞。该作用引起跨膜电位的负变化，通常引起超极化。已知两类通用的GABA受体：GABAA，该受体是配体门控离子通道复合物的一部分，和GABAB代谢型受体，其是通过中间体(G蛋白)打开或关闭离子通道的G蛋白偶联受体。
脊髓损伤后GABA介导的突触前抑制的丧失在脊髓反射的进行性增加和痉挛的出现中起关键作用。临床研究表明，使用巴氯芬(GABAB受体激动剂)，虽然对调节痉挛有效，但与一般镇静和进行性耐受性发展等主要副作用相关。本研究评估了由GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗是否会引起抗痉挛作用。
VGAT(囊泡GABA转运蛋白)(也称为囊泡抑制性氨基酸转运蛋白(VIAAT))是人体中由SLC32A1基因(也称为VGAT基因)编码的蛋白质。VGAT高度集中在脑和脊髓中GABA能神经元的神经末梢，但也集中在甘氨酸能神经末梢。Caudhry,et al.,J.Neurosci.,18(23):9733-9750(1998)，通过引用并入本文。人VGAT的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。参见，例如，GenBank登录号：Q9H598，人囊泡抑制性氨基酸转运蛋白(VIAAT/VGAT)，其提供氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
还参见，例如，GenBank登录号：NM_080552，智人溶质载体家族32成员1(SLC32A1)，mRNA，其提供核酸序列(SEQ ID NO:4)：
相应地，在一个方面，本发明提供了包含编码GAD65和VGAT的核苷酸序列的载体。与GAD65或其功能片段具有至少60％同源性的核苷酸序列所编码的多肽也在本发明的范围内。与GAD65或其功能片段具有约70％的同源性、约75％的同源性、约80％的同源性、约85％的同源性、约90％的同源性、约95％的同源性、约99％同源性的核苷酸序列所编码的多肽。与VGAT或其功能片段具有至少60％同源性的核苷酸序列所编码的多肽也在本发明的范围内。与VGAT或其功能片段具有约70％的同源性、约75％的同源性、约80％的同源性、约85％的同源性、约90％的同源性、约95％的同源性、约99％同源性的核苷酸序列编码的多肽。
进入脊髓GABA能抑制性中间神经元的促进性脊髓输入的活性降低或完全丧失以及导致局部节段性抑制的减少已被假定为导致脊髓损伤(SCI)患者肌肉痉挛发展的关键机制之一。相比之下，在脊髓缺血的短暂发作之后看到的脊髓抑制性中间神经元的丧失导致了功能定义的肌肉痉挛和僵硬的发展。独立于损伤性质(例如，脊髓创伤或局部缺血)，临床和实验动物药理学研究表明，在用最常用的抗痉挛剂巴氯芬(GABAB受体激动剂)进行全身或脊髓治疗后具有相当和有效的抗痉挛作用。巴氯芬介导的超极化作用的主要部位被认为是在突触前的Ia传入神经。
然而，全身性巴氯芬治疗的主要限制之一是局部脊髓节段限制效应的缺乏，以及实现临床相关的痉挛缓解所需的相对高剂量经常产生不希望的诸如镇静的全身副作用。使用慢性鞘内导管直接脊髓递送巴氯芬提供了更多的位点限制效应，具有不太明显的全身性活性，但是其需要外科手术干预和随后的与慢性鞘内导管插入术相关的并发症(诸如已经被描述的脑脊液漏或感染)。更重要的是，IT巴氯芬的有效长期使用的限制包括巴氯芬耐受性的发展(即剂量逐渐升高以达到一致的抗痉挛作用)和突然终止巴氯芬治疗后的戒断。
在感染的星形胶质细胞(神经元的对照)中优先表达GAD65基因似乎提供了关于预期的GABA介导的抗痉挛作用的特定优势(参见例如WO2014/116652，通过引用并入本文)。如已在体外所表明的，原代星形胶质细胞的感染导致细胞外GABA浓度的Ca2+独立增加。因此，预期脊髓实质中星形胶质细胞介导的GABA释放将独立于局部神经元抑制电路的功能性和连接性，并且将特异性地对Ia传入神经元和/或α-运动神经元上表达的GABAB受体发挥其超极化作用。星形胶质细胞产生的GABA的生物活性通过其在优先表达GABAA受体培养的hNT神经元上的去极化诱导作用来证实。
GAD65和VGAT双基因疗法的使用代表了旨在增加区域神经元抑制的新方法，该方法先前未在脊髓或脑递送的背景下测试。这一发现的核心在于两个基因都需要被上调，以实现对本来过度兴奋的神经元的功能相关抑制。该治疗效果的效力表明在突触间隙中有足够量的可释放的GABA是可用的以诱导突触后膜的抑制，引起α-运动神经元兴奋性降低并引起肌肉痉挛的抑制。
因此，另一方面，本发明提供了通过脊髓特异性上调GAD65基因和VGAT基因来治疗受试者痉挛的方法。在各种实施方案中，GAD65和VGAT的上调包括施用编码GAD65和VGAT的病毒载体，并在受试者的脊髓中表达GAD65和VGAT，从而降低受试者的痉挛。
病毒载体对于将实施本发明方法的多核苷酸引入靶细胞中是非常有用的。已经开发了用于特定宿主系统，特别是哺乳动物系统的病毒载体，包括例如逆转录病毒载体、诸如基于人免疫缺陷病毒(HIV)的那些其他慢病毒载体、腺病毒载体(AV)、腺相关病毒载体(AAV)、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等(参见Miller and Rosman,BioTechniques 7:980-990,1992；Anderson et al.,Nature 392:25-30 Suppl.,1998；Verma and Somia,Nature389:239-242,1997；Wilson,New Engl.J.Med.334:1185-1187(1996)，其各自通过引用并入本文)。在本发明的一个方面，使用慢病毒、AV或AAV。腺病毒代表最大的无包膜病毒，因为其有能够通过核内体转运(即，不需要包膜融合)的最大尺寸。病毒体还具有与衣壳的每个五邻体基质相关的独特“刺突”或纤维，其有助于与宿主细胞的附着。AAV是一种依赖性细小病毒，根据定义，其需要与另一种病毒(通常是腺病毒或疱疹病毒)共感染，以启动和维持生产性感染周期。在没有这种辅助病毒的情况下，AAV仍然能够通过受体介导的结合和内化感染或转导靶细胞，穿透非分裂细胞和分裂细胞中的细胞核。
一旦进入细胞核，病毒就会脱壳并且转基因以许多不同的形式表达-其中最持久的是环状单体。AAV将整合到1-5％的稳定转导的细胞的基因组中(Nakai et al.,J.Virol.76:11343-349,2002)。转基因的表达可以分外地稳定。因为在没有辅助病毒的存在下不会从AAV感染产生子代病毒，所以转导的程度仅限于被病毒感染的初始细胞。正是这一特征使AAV成为本发明的合适的基因治疗载体。
描述可用于本发明方法的腺病毒载体和其他病毒载体的其他参考文献包括以下：Horwitz,M.S.,Adenoviridae and Their Replication,in Fields,B.,et al.(eds.)Virology,Vol.2,Raven Press New York,pp.1679-1721,1990)；Graham,F.,et al.,pp.109-128 in Methods in Molecular Biology,Vol.7:Gene Transfer and ExpressionProtocols,Murray,E.(ed.),Humana Press,Clifton,N.J.(1991)；Miller,N.,et al.,FASEB Journal 9:190-199,1995；Schreier,H,Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159,1994；Schneider and French,Circulation 88:1937-1942,1993；Curiel D.T.,etal.,Human Gene Therapy 3:147-154,1992；Graham,F.L.,et al.,WO 95/00655(5Jan.1995)；Falck-Pedersen,E.S.,WO 95/16772(22Jun.1995)；Denefle,P.et al.,WO 95/23867(8Sep.1995)；Haddada,H.et al.,WO 94/26914(24Nov.1994)；Perricaudet,M.etal.,WO 95/02697(26Jan.1995)；Zhang,W.,et al.,WO 95/25071(12Oct.1995).多种腺病毒质粒也可从商业来源获得，包括，例如，Microbix Biosystems of Toronto,Ontario(参见,例如Microbix Product Information Sheet:Plasmids for Adenovirus VectorConstruction,1996)。
描述可用于本发明方法的AAV载体的其他参考文献包括以下：Carter,B.,Handbook of Parvoviruses,vol.I,pp.169-228,1990；Berns,Virology,pp.1743-1764(Raven Press 1990)；Carter,B.,Curr.Opin.Biotechnol.,3:533-539,1992；Muzyczka,N.,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:92-129,1992；Flotte,T.R.,et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356,1992；Chatterjee et al.,Ann.NYAcad.Sci.,770:79-90,1995；Flotte,T.R.,et al.,WO 95/13365(18 May 1995)；Trempe,J.P.,et al.,WO 95/13392(18 May 1995)；Kotin,R.,Human Gene Therapy,5:793-801,1994；Flotte,T.R.,et al.,Gene Therapy 2:357-362,1995；Allen,J.M.,WO 96/17947(13Jun.1996)；and Du et al.,Gene Therapy 3:254-261,1996.
如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV和现在已知的任何其他AAV。在一个实施方案中，AAV是AAV 2型。在另一个实施方案中，AAV是AAV 9型。
取决于所用的宿主细胞/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(Bitter et al.,Meth.Enzymol.153:516 544,1987)。如上所定义，对“启动子”或“启动子序列”的提及应在其最广泛的背景下进行，并且包括能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核核仁RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调节区。本文考虑的“启动子”还可以包括经典基因组基因的转录调控序列，包括Goldberg-Hogness框，其是在真核细胞中准确转录起始所必需的，具有或不具有CAT框序列和额外的调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。
将序列置于启动子序列的调节控制下意指放置所述分子使得表达受启动子序列控制。启动子通常位于其控制的基因的5'端(上游)。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常启动子位置可以距基因转录起始位点的距离与该启动子与其在其天然环境中控制的基因(即该启动子来自的基因)之间的距离大致相同。如本领域所知，该距离的一些变化可以调整而不丧失启动子功能。类似地，调节序列元件相对于待置于其控制下的异源基因的定位通过元件在其天然环境(即其来自的基因)中的定位来定义。同样，如本领域中已知的，也可以发生该距离的一些变化。
对本发明的方法和治疗方案有用的示例性启动子包括但不限于人泛素启动子和人突触蛋白启动子。然而，可以使用其他已知的组织特异性或细胞特异性启动子。
用于产生重组AAV粒子的合适宿主细胞包括但不限于微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以或已经用作外源核酸分子的接受者。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已经用外源核酸分子转染的细胞。宿主细胞包括任何真核细胞或细胞系，只要细胞或细胞系与待表达的蛋白质，选择的选择系统或使用的发酵系统相容。
可以通过将AAV载体溶解、悬浮或乳化在合适的药学上可接受的载体或稀释剂中，将AAV载体配制成注射或施用制剂。这种药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括水性或非水性溶剂，诸如油、合成脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸酯或丙二醇；如果需要，可使用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
如果不能获得对细胞类型特异的病毒载体，则可以修饰载体以表达对靶细胞上表达的配体(或受体)特异的受体(或配体)，或者可以将其包封在脂质体内，其也可以修饰以包括这样的配体(或受体)。可以通过各种方法将肽试剂引入细胞，包括例如，通过改造肽以包含诸如人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导结构域的蛋白质转导结构域，其可以促进肽向细胞的转移。此外，还有各种基于生物材料的技术，诸如纳米笼和药物递送晶片(诸如用于脑癌化学治疗剂)，其也可以被修改以适应该技术。
除了在使用慢病毒载体后整合基因转移的细胞外，还有报道在AAV-GAD65注射到丘脑底核中后成功过表达GAD65基因。在那些研究中，在AAV-GAD65注射后4-5个月观察到持续的GAD65表达。更重要的是，最近的系统数据证明，即使在有限数量的AAV注射(1-2次注射)后，基于AAV的基因递送到大鼠或小型猪纹状体中的效率也很高。因此，在另一个实施方案中，本发明使用基于AAV的，基因组非整合的GAD65编码和VGAT编码载体来实现节段特异性GAD65和VGAT表达。
通过联合GAD65和VGAT的脊髓递送，实现了脊髓痉挛抑制的显著且功能相关的增加。在充分表征的大鼠脊髓损伤诱导的肌肉痉挛模型中测试脊髓抑制的效力。该动物模型的特征在于存在高度发展的脊髓反射亢进并且致使在脊髓损伤后的慢性阶段明显存在肌肉痉挛。接受脊髓软膜下注射GAD65+VGAT(在AAV9-UBI载体中递送)的慢性痉挛动物显示在基因递送后5周观察到的痉挛反应的显著抑制，并且这种显著的治疗效果持续至少第8周。免疫荧光分析显示在脊髓中间神经元中混合的抑制性-兴奋性神经递质表型的出现，如通过GAD65和VGAT表达与谷氨酸能标记物VGLUT1和VGLUT2的共定位所证明。在注射对照GFP载体的动物中没有观察到抗痉挛作用，并且未检测到GAD65和VGAT表达与谷氨酸能标记物VGLUT1和VGLUT2的共定位。
可以使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种来实现或进行本组合治疗的施用。如本文所用，术语“施用(administration)”或“施用(administering)”定义为包括在进行本发明的方法时，向受试者提供本发明的化合物或药物组合物的行为。示例性施用途径包括但不限于静脉内、关节内、脑池内、眼内、心室内、鞘内、软膜下、肌肉内、腹腔内、皮内、腔内等，以及其任何两种或更多种的组合。在某些实施方案中，AAV可以直接递送到脊髓实质，脊髓的鞘内空间，进入受试者的脊髓软膜下空间，和/或进入外周痉挛肌，以实现GAD65基因和VGAT基因的脊髓上调。参见例如WO2016/122791，其通过引用并入本文。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指研究人员，兽医、医生或其他临床医生正在寻求的引起组织、系统、动物或人的生物或医学反应(如GAD65基因和VGAT基因的脊髓上调)的化合物或组合物的量。因此，术语“治疗有效量”在本文中用于表示当在一段时间内重复施用于患病区域时引起疾病状况显著改善的制剂的任何量。该量将随所治疗的病症、病症的进展阶段以及所用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定的实例中，适当的量对于本领域技术人员来说是显而易见的，或者能够通过常规实验确定。例如，关于受试者治疗方法，例如编码GAD65基因和VGAT基因的AAV或包含编码GAD65基因和VGAT基因的AAV的组合物的“治疗有效量”是指制剂中的AAV的量，当其作为所需治疗方案的一部分应用时，使GAD65基因和VGAT基因的上调。
可以使用常规计算方法基于动物数据来确定递送载体的治疗或预防有效量。除其他因素外，适当的剂量将取决于所选择的转移载体的特异性、施用途径、被治疗的哺乳动物(例如，人或非人灵长类动物或其他哺乳动物)、待治疗的受试者的年龄、体重和一般状况、待治疗障碍的严重程度，所治疗主体内区域的位置和施用方式。因此，适当的剂量可以因患者而异。本领域技术人员可以容易地确定合适的有效量。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。此外，受试者可以施用多个适当的剂量。本领域技术人员可以容易地确定剂量的适当数量。然而，可能需要考虑替代的施用途径，或平衡治疗益处与任何副作用以调整剂量。这些剂量可以根据使用重组载体的治疗应用而变化。
可选地，根据本发明的AAV介导的递送可以与通过其他病毒和非病毒载体的递送联合。可以根据本领域已知的方法容易地选择和产生此类其它病毒载体包括但不限于，腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体和杆状病毒载体。类似地，可以根据本领域已知的方法容易地选择和产生非病毒载体，包括但不限于脂质体、基于脂质的载体、复合载体、分子缀合物、多胺和聚阳离子载体。当通过这些替代途径施用时，剂量在上述范围内是理想的。
另一方面，本发明还提供了治疗患有脊髓损伤的受试者的治疗方案。该治疗方案包括施用GAD65基因和VGAT基因的脊髓特异性上调。如上文详细讨论的，GAD65和VGAT的上调可包括施用编码GAD65和VGAT的病毒载体，其中GAD65和VGAT表达并治疗脊髓损伤。
此外，本发明的方法可用于治疗诸如周围神经病的神经损伤，其通过暴露于有毒化合物，包括重金属(例如铅、砷和汞)和工业溶剂，以及药，包括化学治疗剂(如长春新碱和顺铂)、氨苯砜、HIV药物(如齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎鲁西汀、利托那韦和安普那韦)、降胆固醇药物(如洛伐他汀、吲达帕米和吉非罗齐)、心脏或血压药物(如胺碘酮、肼苯哒嗪、哌克昔林)和甲硝唑而导致。
本发明的方法还可用于治疗由物理、机械或化学创伤导致的对神经系统的损伤。因此，该方法可用于治疗由物理伤害(与例如烧伤、枪伤、手术和事故相关)、局部缺血，长时间暴露于低温(例如，霜冻)，以及由于例如中风或颅内出血(例如脑出血)对中枢神经系统的损害导致的周围神经损伤。同样地，本发明的方法可用于治疗由这些创伤引起的慢性疼痛/伤害感受。
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例1
使用软膜下递送方法将编码GAD65(谷氨酸脱羧酶65)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的AAV9病毒注射到靶向节段中(图1)。使用具有脊髓损伤诱导的肌肉痉挛的动物(大鼠)。在腰椎软膜下AAV9-UBI-GFP递送后实现的转基因表达的分布如图2所示。可以看到在穿过灰质的中间神经元中的广泛GFP表达。
在基因递送后，测量GAD65和VGAT基因递送后长达8周的痉挛反应。在对照痉挛动物中，使用对照AAV9-UBI-GFP。图3A-3D显示注射AAV9-UBI-GAD65+VGAT的动物的痉挛反应逐渐减少。基因递送后至少8周持续显著的抗痉挛作用(图3A和3B)。如果与注射对照AAV9的动物相比，心律依赖性抑郁(rate-dependent depression)(代表改变脊髓抑制的指标)的测量显示出显著的恢复(图3C)。
在第8周，注射GAD65/VGAT基因的节段的免疫荧光分析显示两种基因的显著上调和混合抑制性/兴奋性神经递质表型的出现(GAD65或VGAT与VGLUT2(囊泡谷氨酸转运蛋白)的共表达)，(图4A和4B)。在注射对照AAV9的动物中未观察到共表达(图4C和4D)。这些数据证实了GAD65/VGAT过表达神经元中抑制驱动的有效诱导，其可能介导肌肉痉挛的减少。
尽管已经参考上述示例描述了本发明，但是应该理解的是修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以上权利要求的限制。

Claims (25)

1.一种治疗受试者痉挛的方法，包括上调GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因，从而治疗受试者的痉挛。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述GAD65基因和VGAT基因的上调是所述GAD65基因和VGAT基因的脊髓特异性上调。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述GAD65基因和VGAT基因的上调包括向受试者施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中表达GAD65和VGAT，从而降低痉挛。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述GAD65和VGAT过表达。
5.权利要求3所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体、腺病毒载体(AV)或腺相关载体(AAV)。
6.权利要求5所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体。
7.权利要求5所述的方法，其中，所述载体是AAV。
8.权利要求7所述的方法，其中，所述AAV是AAV9。
9.权利要求3所述的方法，其中，所述病毒载体直接施用至所述受试者的脊髓实质至所述受试者的鞘内空间、至所述受试者的脊髓软膜下空间或至所述受试者的外周痉挛肌肉。
10.一种治疗受试者痉挛的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的病毒载体，所述病毒载体包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸，从而治疗受试者的痉挛。
11.权利要求10所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体、AV或AAV。
12.权利要求11所述的方法，其中，所述载体是AAV。
13.权利要求12所述的方法，其中，所述AAV是AAV9。
14.权利要求10所述的方法，其中，所述载体直接施用至所述受试者的脊髓实质、至所述受试者的鞘内空间、至所述受试者的脊髓软膜下空间或至所述受试者的外周痉挛肌肉。
15.一种用于治疗患有脊髓损伤的受试者的治疗方案，包括施用包含编码GAD65和VGAT的多核苷酸的病毒载体，其中，表达GAD65和VGAT，从而治疗脊髓损伤。
16.权利要求15所述的治疗方案，其中，所述GAD65和VGAT过表达。
17.权利要求15所述的治疗方案，其中，所述载体是慢病毒载体、AV或AAV。
18.权利要求17所述的治疗方案，其中，所述载体是慢病毒载体。
19.权利要求17所述的治疗方案，其中，所述载体是AAV。
20.权利要求19所述的治疗方案，其中，所述AAV是AAV9。
21.权利要求15所述的治疗方案，其中，所述载体直接施用至受试者的脊髓实质、至所述受试者的鞘内空间、至所述受试者的脊髓软膜下空间或至所述受试者的外周痉挛肌肉。
22.载体，包含与编码GAD65和VGAT的多核苷酸功能性连接的启动子。
23.权利要求22所述的载体，其中，所述载体是选自由慢病毒、腺病毒和AAV载体组成的组的病毒载体。
24.权利要求23所述的载体，其中，所述载体是AAV9-UBI-GAD65+VGAT。
25.一种分离的哺乳动物宿主细胞，含有根据权利要求22所述的载体。
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