KR20220030271A - 헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 재료 - Google Patents
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Abstract
본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, 살아 있는 포유류(예를 들어, 인간)의 뇌로 기능적으로 통합된 GABA성 뉴런을 형성하기 위한 그리고/또는 헌팅턴병을 갖는 포유류에 존재하는 헌팅틴(Htt) 유전자(또는 HTT RNA 또는 HTT 폴리펩타이드) 하나 또는 둘 다를 변형하기 위한 방법 및 재료가 제공된다.
Description
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2019년 6월 28일에 출원된 미국 특허 출원 제62/868,499호의 이익을 주장한다. 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시내용의 일부인 것으로 여겨진다(그리고 본 출원의 개시내용에 참고로 포함된다).
연방정부 지원된 연구에 관한 성명
본 발명은 국립 보건원이 부여한 허가 번호 AG045656 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권한을 갖는다.
1. 기술분야
본 문헌은 헌팅턴병(Huntington's disease)을 갖는 포유류를 치료하기 위한 방법 및 재료에 관한 것이다. 예를 들어, 본 문헌은 살아 있는 포유류(예를 들어, 인간)의 뇌로 기능적으로 통합된 선조체 중간 가시 뉴런(MSN: medium spiny neuron)을 생성하고, 헌팅턴병을 갖는 포유류에 존재하는 헌팅틴(Htt) 유전자 하나 또는 둘 다를 변형하기 위한 방법 및 재료를 제공한다.
2. 배경 정보
헌팅턴병은 주로 Htt 유전자의 돌연변이에 의해 생겨서, HTT 폴리펩타이드에서 폴리글루타민 연장을 암호화하는 Htt 유전자에서의 트리뉴클레오타이드 CAG 반복부를 연장시킨다. Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수가 36을 초과할 때, 이는 질환을 야기할 것이고, 선조체에서의 MSN은 특히 이러한 폴리글루타민 독성에 민감하다(Ross et al., Lancet Neurol., 10:83-98 (2011); 및 Walker, Lancet, 369:218-228 (2007)). 현재, 돌연변이체 HTT 독성과 뉴런 소실의 조합 효과로 인한 헌팅턴병에 대한 효과적인 치료는 없다.
요약
본 문헌은 기능적 새로운 뉴런의 재생 및 돌연변이체 HTT 독성의 감소를 통해 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 신경교 세포(예를 들어, 반응성 성상교세포)를 헌팅턴병을 갖는 살아 있는 포유류(예를 들어, 인간)의 뇌로 기능적으로 통합된 선조체 MSN(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런)으로 전환시키도록 사용될 수 있고, 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 반응성 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런) 내의 하나 이상의 Htt 대립유전자(또는 이의 전사된 HTT RNA 또는 번역된 HTT 폴리펩타이드)를 변형시키도록 설계된 하나 이상의 유전자 치료 성분(예를 들어, 뉴클레아제, 표적화 서열, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 가이드 RNA 및/또는 공여자 핵산)은 뇌 내에 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 단백질의 존재를 감소시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 치료 성분은 편집된 Htt 대립유전자가 36개 미만의 CAG 반복부를 함유하도록 그리고/또는 편집된 Htt 대립유전자가 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드를 발현할 수 없도록 Htt 대립유전자를 편집하도록 설계될 수 있다.
선조체 내의 GABA성 MSN은 헌팅턴병 진행 동안 죽거나 퇴화한다. 본원에 기재된 것과 같이, NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산을 포유류의 뇌 내의 선조체 성상교세포에 전달하는 것은 포유류의 뇌 내에서 선조체 성상교세포를 GABA성 MSN으로 전환시킬 수 있다. 성상교세포-전환된 뉴런은 원거리 신경 돌기를 내보내고, 뇌에서 선조체로부터 담창구(GP:globus pallidus) 및 흑질 망양체부(SNr: substantia nigra pars reticulata)로 GABA성 출력을 강화할 수 있고, 뇌에서의 기존의 뉴런과 비교하여 더 적은 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입(예를 들어, 폴리글루타민 연장을 갖는 HTT 폴리펩타이드의 응집체)을 초래할 수 있다. 선조체에서의 GABA성 뉴런의 생체내 재생은 선조체 위축을 감소시키고, 운동 기능을 개선하고, 헌팅턴병 환자의 생존기간을 증가시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 재료를 사용하여 살아 있는 포유류의 뇌의 선조체 내에 새로운 MSN을 형성하는 능력을 갖는 것은 임상의 및 환자(예를 들어, 헌팅턴병 환자)가 GABA성 MSN의 상당한 사멸 또는 퇴화 후 비치료된 헌팅턴병 환자의 뇌의 구조와 비교할 때 건강한 뇌의 구조를 밀접하게 닮은 뇌 구조를 생성하게 할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료를 사용하여 헌팅턴병 진행 동안 죽거나 퇴화하는 선조체 내의 GABA성 MSN을 보충하는 능력을 갖는 것은 임상의 및 환자가 헌팅턴병 진행을 느리게 하거나 지연시키거나 역전시키게 허용할 수 있다. 예를 들어, 생체내 생성된 뉴런(예를 들어, 생체내 생성된 GABA성 MSN)은 헌팅턴병 환자에서 운동 기능 결핍을 구제하고 기대 수명을 연장할 수 있다.
일반적으로, 본 문헌의 일 양태는 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) CAG 반복부 영역을 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는 유전자 치료 성분을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, CAG 반복부 영역은 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하고, 공여자 핵산은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 서열을 대체하는 단계를 포함한다. 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 담창구(GP)로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 흑질 망양체부(SNr)로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레아제는 CRISPR-연관된(Cas) 뉴클레아제이고, 표적화 핵산 서열은 가이드 RNA(gRNA)(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 전사 활성인자-유사(TAL: transcription activator-like) 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 선조체로의 직접 주사를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 Htt 대립유전자를 편집하고, 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능을 개선하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) 유전자 치료 성분을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 운동 기능은 진전 및 발작으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함할 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능을 개선하는 방법을 특징으로 하고, 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 Htt 대립유전자를 편집하고, 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 운동 기능은 진전 및 발작으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명을 개선하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) 유전자 치료 성분을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류의 기대 수명은 약 10% 내지 약 60% 연장될 수 있다. 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함할 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명을 개선하는 방법을 특징으로 하고, 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 Htt 대립유전자를 편집하고, 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류의 기대 수명은 약 10% 내지 약 60% 연장될 수 있다. 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 선조체 위축을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) 유전자 치료 성분을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, 및 (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함한다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 선조체 위축을 감소시키는 방법을 특징으로 하고, 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 Htt 대립유전자를 편집하고, 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) 유전자 치료 성분을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함할 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 문헌은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입을 감소시키는 방법을 특징으로 하고, 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이다. 상기 방법은 (a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드는 신경교 세포에 의해 발현되고, 신경교 세포는 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및 (b) (i) 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포유류의 뇌 내의(예를 들어, 선조체 내의) 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 Htt 대립유전자를 편집하고, 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나 이들로 이루어진다). 포유류는 인간일 수 있다. 단계 (a)의 신경교 세포는 성상교세포일 수 있다. GABA성 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. GABA성 뉴런은 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함할 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 GP로 연장될 수 있다. 축삭 돌기는 포유류의 SNr로 연장될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드일 수 있거나, Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 신경교 세포에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 바이러스 벡터는 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치할 수 있고, 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 신경교 세포에 투여될 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제일 수 있고, 표적화 핵산 서열은 gRNA(또는 gRNA를 암호화하는 DNA)일 수 있다. 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인일 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 뇌로의 직접 주사(예를 들어, 선조체로의 직접 주사)를 포함할 수 있다. NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여 또는 유전자 치료 성분의 투여는 복강내, 근육내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 정맥내, 비강내 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 투여 단계 전에 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 다양한 분야-특정 사전에 의해 예시된 것처럼 본 발명이 속하는 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 상충의 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우세할 것이다. 게다가, 재료, 방법 및 실시예는 오직 예시이고, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구항으로부터 명확할 것이다.
도 1a 내지 도 1d. 예시적인 조작된 AAV2/5 Cre-FLEx 시스템은 특이적으로 성체 마우스 뇌에서 선조체 성상교세포를 감염시킨다. 도 1a. 결국 mCherry의 발현을 활성화하는 특이적으로 Cre 재조합효소의 GFAP 프로모터-제어된 발현에 의해 성상교세포를 표적화하도록 사용된 조작된 AAV2/5 작제물(GFAP::Cre 및 FLEx-CAG::mCherry-P2A-mCherry)의 도식적 다이어그램. 도 1b. Cre 재조합효소(적색 염색됨)는 AAV2/5-GFAP::Cre의 바이러스 주사 후 7일(dpi)에 특이적으로 GFAP 양성 성상교세포(녹색 염색됨)에서 검출되었다. 백색의 화살촉은 Cre 발현을 갖는 성상교세포를 나타낸다. 축척 막대: 50 μm. 도 1c. 대조군 AAV mCherry 주사 후 선조체의 면적분할 공초점 영상(상부 왼쪽)(30 dpi), 및 다양한 신경교 마커 또는 뉴런 마커(NeuN)에 의한 mCherry의 중첩 영상. S100β, GFAP 및 글루타민 합성효소(GS)는 성상교세포에 대한 마커이고; Olig2는 희소돌기아교세포에 대한 마커이고; NG2는 NG2 발현 세포에 대한 마커이고; Iba1는 미세아교세포에 대한 마커이다. 화살촉은 일부 동시국재화된 세포를 나타낸다. 축척 막대: 상부 면적분할 저배율 영상에 대해 0.5 mm 및 고배율 영상에 대해 50 μm. 도 1d. 선조체에서의 상이한 세포 마커에 의한 동시국재화에서 mCherry 양성 세포의 백분율. 대부분의 대조군 mCherry 바이러스-감염된 세포가 성상교세포였다는 것에 주목한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 2a 내지 도 2g. WT 마우스 뇌에서의 GABA성 뉴런으로의 선조체 성상교세포의 생체내 전환. 도 2a. 7 dpi에 AAV 감염된 선조체 성상교세포(GFAP, 청녹색 염색됨)에서의 mCherry(적색 염색됨, NeuroD1- p2A-mCherry 및 Dlx2-P2A-mCherry)와 함께 NeuroD1(녹색 염색됨) 및 Dlx2(청색 염색됨)의 동시발현. 도 2b. 30 dpi에, NeuroD1(녹색 염색됨) 및 Dlx2(청색 염색됨) 동시발현된 세포는 NeuN 양성 뉴런(청록색 염색됨)이 되었다. a 및 b에 대한 축척 막대: 20 μm. 도 2c. 30 dpi까지 NeuN 양성 뉴런으로 대부분 전환된 7 dpi에 선조체 성상교세포에서의 NeuroD1 및 Dlx2의 동시발현을 나타내는 요약된 데이터(7 dpi에 대해 n = 8마리 마우스, 30 dpi에 대해 n = 9마리 마우스). 도 2d. NeuroD1 및 Dlx2 동시발현에 의해 유도된 성상교세포에서 뉴런 전환 과정을 예시하는 다이어그램. 도 2e. 1개월의 시간 윈도우에 걸쳐 성상교세포로부터 뉴런으로의 점진적인 형태 변화를 예시하는 대표적인 영상. 대부분의 mCherry 양성 세포가 AAV 주사 후 조기 시점에 GFAP(청녹색 염색됨)에 의해 동시표지되지만, 나중에 GFAP 신호가 소실되고 NeuN 신호가 획득됨(녹색 역샘됨)에 주목한다. 화살촉은 NeuN에 의해 동시표지된 mCherry 양성 세포를 나타낸다. 축척 막대: 50 μm. 도 2f. 대조군(mCherry 양성 단독, 상부 그래프) 또는 NeuroD1 + Dlx2 그룹(하부 그래프)에서 바이러스 감염된 세포(mCherry 양성 세포) 중에서 세포 정체(성상교세포 대 뉴런)를 나타내는 시간 과정. 대조군에서의 대부분의 바이러스 감염된 세포는 성상교세포인 반면, NeuroD1 + Dlx2-감염된 세포는 주로 성상교세포 집단으로부터 성상교세포과 뉴런의 혼합 집단으로, 그리고 이후 주로 뉴런 집단으로 점진적으로 이동하였다. 도 2g. 선조체 성상교세포에서 NeuroD1 및 Dlx2의 전위성 발현 후(30 dpi) GAD67, GABA, DARPP32 및 파르브알부민(PV)에 의해 동시염색된 전환된 뉴런을 나타내는 공초점 영상. 화살촉은 co559 표지된 세포를 나타낸다. 축척 막대: 20 μm.(h) 선조체에서 NeuroD1 및 Dlx2에 의해 유도된 성상교세포-전환된 뉴런의 조성을 나타내는 정량화된 데이터. 대부분의 전환된 뉴런은 GABA성 뉴런이었고(80% 초과), 유의미한 비율은 DARPP32에 면역양성이었다(55.7%). 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 3a 내지 도 3b. AAV-감염된 세포에서의 NeuroD1 및 Dlx2의 전위성 발현. 도 3a. AAV2/5 주사 후 7일(7 dpi)에 Dlx2, NeuroD1, mCherry 및 NeuN의 동시염색. NeuroD1 또는 Dlx2는 7 dpi에 NeuN 양성 세포에서 검출되지 않았다. 도 3b. AAV2/5 주사 후 30일(30 dpi)에 Dlx2, NeuroD1, mCherry 및 GFAP의 동시염색. NeuroD1 및 Dlx2는 GFAP가 아니라 mCherry에 의해 동시국재화되었다. 축척 막대: 20 μm. 정량화는 도 2c에 도시되어 있다.
도 4. WT 마우스의 선조체에서의 mCherry 대조군 바이러스 감염의 시간 과정. WT 마우스를 AAV2/5 GFAP::Cre + AAV2/5 CAG::mCherry-P2A-mCherry로 주사하고, 면역조직화학 분석을 위해 상이한 시점(7, 11, 15, 21 및 30 dpi)에 희생시켰다. 대부분의 mCherry 양성 세포는 21 및 30 dpi(화살촉)에서의 오직 적은 예외로 하여 NeuN이 아니라 GFAP에 의해 동시염색되었다. 축척 막대: 50 μm. 정량화는 도 2f에 도시되어 있다.
도 5a 내지 도 5c. 선조체에서 전환 효율을 증가시키는 데 있어서 NeuroD1 및 Dlx2의 상승 효과. 도 5a. WT 마우스를 상이한 AAV2/5로 주사하고, 상이한 그룹 중에서 전환 효율을 비교하기 위해 면역염색 비교를 위해 30 dpi에 희생시켰다. 축척 막대: 50 μm. 도 5b 및 도 5c. NeuroD1 + Dlx2 그룹이 가장 높은 전환 효율을 갖고(도 5b), 가장 많은 수의 뉴런을 생성한다는 것을 나타내는 정량화된 데이터(도 5c). 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 6. WT 마우스 선조체에서 선조체 성상교세포-전환된 뉴런 중에서 뉴런 하위유형 규명. 마우스 뇌 절편을 30 dpi에 상이한 GABA성 하위유형 마커에 의해 동시염색하였다. 적은 전환된 뉴런은 소마토스타틴(SST), 신경펩타이드 Y(NPY) 또는 칼레티닌에 양성이었다. 축척 막대: 20 μm. 정량화된 데이터는 도 2h에 도시되어 있다.
도 7a 내지 도 7g. 전환 후 WT 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 성상교세포 밀도. 도 7a. AAV 주사 후 30일에 성상교세포 마커 S100β 및 뉴런 마커 NeuN을 나타내는 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 7b 내지 도 7d. 전환 후 성상교세포 증식을 나타내는, NeuroD1 + Dlx2 치료된 마우스 뇌에서 발견된 상이한 단계에서의 분열 성상교세포를 나타내는 고배율 공초점 영상. 도 7e 내지 도 7g. 유의미한 차이 없이 대조군 조건에서 또는 세포 전환 후(N+D) 뉴런 밀도(도 7e), 성상교세포 밀도(도 7f) 및 뉴런/성상교세포의 비(도 7g)를 나타내는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 8a 내지 도 8d. 세포 전환 후 WT 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 미세아교세포 밀도. 도 8a. AAV 주사 후 30일에 미세아교세포 마커 Iba1 및 뉴런 마커 NeuN을 나타내는 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 8b 내지 도 8d. 세포 전환 후 변하지 않은 뉴런 밀도(도 8b), 미세아교세포 밀도(도 8c) 및 뉴런/미세아교세포의 비(도 8d)를 나타내는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 9a 내지 도 9f. 전환된 뉴런은 GFAP::Cre 77.6 형질전환 마우스에 의해 추적된 성상교세포로부터 기원한다. 도 9a 및 도 9b. NeuroD1 + Dlx2(FLEx-NeuroD1-P2A-mCherry 및 FLEx-Dlx2-P2A-mCherry)에 의해 유도된 선조체에서 성상교세포에서 뉴런 전환 과정을 조사하기 위해 GFAP::Cre 리포터 마우스의 사용을 예시하는 실험 시각표(도 9a) 및 도식적 다이어그램(도 9b). 도 9c. 7 dpi(왼쪽 행), 28 dpi(중간 행) 및 56 dpi(오른쪽 행)에 GFAP 및 NeuN에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포(NeuroD1 + Dlx2)를 나타내는 통상적인 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 삽입도는 상이한 마커를 갖는 통상적인 세포를 나타낸다. 축척 막대: 4 μm. 도 9d. 7, 28 및 56 dpi에 S100β 및 NeuN에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포(NeuroD1 + Dlx2)의 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 삽입도 축척 막대: 4 μm. 도 9e 및 도 9f. NeuroD1 및 Dlx2 바이러스의 주사 후 GFAP::Cre 마우스에서 2개월의 시간 과정에 걸친 성상교세포에서 뉴런으로의 점진적인 이행을 나타내는 정량화된 데이터. NeuroD1 및 Dlx2-감염된 세포 중에서 성상교세포의 감소 및 뉴런의 증가 이외에, 감염된 세포의 약 40%는 28 dpi에 이행 단계에서 잡혔는데, 이것은 GFAP 신호도 NeuN 신호도 나타내지 않았다는 것에 주목한다. 성상교세포에서 뉴런 전환의 시간 과정이 AAV2/5 FLEx- NeuroD1-P2A-mCherry 및 FLEx-Dlx2-P2A-mCherry와 둘 다 조합되어 GFAP::Cre AAV2/5에 의해 유도된 것과 비교하여 GFAP::Cre 마우스에서보다 느리다는 것에 또한 주목한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 10a 내지 도 10c. GFAP::Cre77.6 형질전환 마우스 계통에서 뉴런 전환에 대한 선조체 성상교세포의 표적화. 도 10a. 58 dpi에 상이한 신경교 마커 및 뉴런 마커에 의해 동시염색된 선조체에서 대조군 AAV mCherry-감염된 세포를 나타내는 공초점 영상. 대부분의 mCherry 양성 세포는 S100β, GFAP 및 글루타민 합성효소(GS)를 포함하는 성상교세포 마커에 의해 동시국재화되었다. 매우 적은 mCherry 양성 세포는 Olig2, NG2, Iba1 또는 NeuN에 의해 동시염색되었다. 축척 막대: 20 μm. 도 10b. 상이한 마커에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포의 백분율을 나타내는 도 10a의 정량화된 데이터. mCherry 양성 세포의 95% 초과는 GFAP::Cre 77.6 마우스 계통의 선조체에서 성상교세포 마커에 양성이었다. 도 10c. GFAP::Cre 77.6 마우스 계통의 NeuroD1 + Dlx2-치료된 선조체에서, 대부분의 성상교세포-전환된 뉴런은 DARPP32에 면역양성이었다(58 dpi). 축척 막대: 20 μm. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 11a 내지 도 11f. R6/2 마우스 뇌에서 GABA성 뉴런으로의 선조체 성상교세포의 생체내 전환. 도 11a. 30 dpi에 대조군 mCherry AAV(왼쪽 패널) 또는 NeuroD1 + Dlx2 AAV(오른쪽 패널)가 주사된 R6/2 마우스 선조체의 저배율 관상 절편. 축척 막대: 0.5 mm. 도 11b. S100β(녹색 염색됨) 및 NeuN(청녹색 염색됨)에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포의 더 고배율의 영상. 화살촉은 대조군에서 S100β에 의해 동시표지된 mCherry 양성 세포를 나타내지만(상부 열), NeuroD1 + Dlx2 그룹에서 NeuN에 의해 동시표지되었다(하부 열). 축척 막대: 20 μm. 도 11c. 30 dpi까지, 대조군에서의 대부분의 mCherry 양성 세포가 S100β 양성 성상교세포였지만, NeuroD1 + Dlx2 그룹에서 대부분의 mCherry 양성 세포가 NeuN 양성 뉴런으로 전환되었다는 것을 나타내는 데이터의 요약. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.도 11d. R6/2 마우스에서 대부분의 선조체 성상교세포-전환된 뉴런은 GAD67 및 GABA에 면역양성이었다. 축척 막대: 20 μm. 도 11e. 많은 전환된 뉴런은 DARPP32에 의해 동시염색되었고, 소수는 또한 파르브알부민(PV)에 의해 동시염색되었다. 축척 막대: 20 μm. 도 11f. R6/2 마우스의 선조체에서의 전환된 뉴런의 80% 초과가 GAD67 및 GABA에 면역양성이고, 유의미한 비율이 또한 DARPP32에 면역양성이고(56.6%), 더 적은 백분율이 매우 적은 다른 GABA성 하위유형 외에 PV 양성이이라는 것(8.4%)을 나타내는 정량화된 데이터.
도 12. R6/2 마우스 선조체에서의 전환된 뉴런의 하위유형 규명. R6/2 마우스 선조체에서의 NeuroD1 + Dlx2 치료 후 선조체 성상교세포-전환된 뉴런 중에서, 불과 몇 개의 전환된 뉴런은 소마토스타틴(SST), 신경펩타이드 Y(NPY) 또는 칼레티닌에 면역양성이었다. 축척 막대: 20 μm. 정량화는 도 11f에 도시되어 있다.
도 13a 내지 도 13g. 세포 전환 후 R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 성상교세포 밀도. 도 13a. 바이러스 주사 후 30일에 R6/2 마우스 선조체에서의 성상교세포, AAV-감염된 세포 및 뉴런의 통상적인 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 13b 내지 도 13d. 전환 후 성상교세포 증식을 나타내는, NeuroD1 + Dlx2 치료 후 R6/2 마우스 선조체에서 분열 성상교세포의 상이한 단계를 나타내는 고배율 공초점 영상. 도 13e 내지 도 13g. 세포 전환이 없거나(Ctrl) 또는 있는(N+D) R6/2 마우스 선조체에서 뉴런 밀도(도 13e), 성상교세포 밀도(도 13f) 및 뉴런/성상교세포의 비(도 13g)를 예시하는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 14a 내지 도 14c. 세포 전환은 R6/2 마우스 뇌에서 선조체 성상교세포의 증식을 촉발한다. 도 14a. NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스 선조체에서 많은 증식 세포가 검출되지만, 대조군 AAV-치료된 R6/2 마우스의 선조체에서 매우 적게 검출되었다는 것을 나타내는 Ki67 면역염색의 면적분할 저배율 공초점 영상. 축척 막대: 100 μm. 도 14b. NeuroD1 + Dlx2 치료 후 R6/2 마우스 선조체에서 증식하는 성상교세포(화살촉)를 나타내는 고배율 공초점 영상. 화살은 전환된 뉴런(유사색상)을 나타낸다. 축척 막대: 10 μm. 도 14c. 증식하는 성상교세포의 수가 NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 선조체(30 dpi)에서 급격히 증가하였다는 것을 나타내고, 이것이 생체내 성상교세포에서 뉴런 전환이 성상교세포 전환 후 그 자체를 보충하도록 성상교세포의 증식을 유의미하게 자극할 수 있다는 것을 제시하는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 15a 내지 도 15d. 세포 전환 후 R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 미세아교세포 밀도. 도 15a. AAV 주사 후 30일에 미세아교세포 마커 Iba1 및 뉴런 마커 NeuN을 나타내는 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 15b 내지 도 15d. 대조군 및 NeuroD1+Dlx2 그룹에서 뉴런 밀도(도 15b), 미세아교세포 밀도(도 15c) 및 뉴런/미세아교세포의 비(도 15d)를 나타내는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 16a 내지 도 16r. R6/2 마우스 뇌 슬라이스에서의 선조체 성상교세포 전환된 뉴런의 기능적 규명. 도 16a. 자연적 뉴런(mCherry 음성, 상부 열) 및 전환된 뉴런(mCherry 양성, 하부 열)의 위상 및 형광 영상. 축척 막대: 10 μm. 도 16b. Na 양전류 K 양전류의 대표적인 트레이스는 자연적 뉴런(검정) 및 전환된 뉴런(적색 염색됨)에서 기록되었다. 도 16c. 반복 활동 전위(AP)는 단계별 전류 주입에 의해 생겼다. 자연적 뉴런 및 전환된 뉴런 둘 다에서 탈분극 자극 시 개시 활동 전위 점화에 대한 상당한 지연에 주목한다. 이러한 지연된 점화는 통상적인 MSN 전기생리학적 특성이다. 도 16d 및 도 16e. 자연적 뉴런(상부 열) 및 전환된 뉴런(하부 열)으로부터 기록된 sEPSC 및 sIPSC의 통상적인 트레이스. 도 16f 및 도 16g. Na 양전류 K 양전류의 I-V 선도는 바이러스-주사된 R6/2 마우스 및 비치료된 WT 마우스에서 선조체 뉴런으로부터 기록되었다. R6/2 마우스에서의 전환된 선조체 뉴런 및 비전환된 선조체 뉴런 둘 다에서의 Na 양전류는 WT 마우스에서 선조체 뉴런으로부터 회수된 것보다 작았다. 전환된 뉴런에서의 K 양전류는 R6/2 마우스 선조체에서 비전환된 뉴런에서보다 유의미하게 더 크다(독립 스튜던트 t-시험). *p < 0.05, **p < 0.01. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.도 16h 내지 도 16m. 야생형 뉴런과 함께 R6/2 마우스에서 전환된 뉴런 및 비전환된 뉴런 중에서 유사한 전기 특성을 나타내는 산란도의 요약 그래프: 입력 저항(도 16h), 커패시턴스(도 16i), 휴지 막 전위(도 16j), AP 문턱(도 16k), AP 진폭(도 16l) 및 AP 빈도(도 16m). R6/2 마우스에서 전환된 뉴런과 비전환된 뉴런 사이에 유의미한 차이가 없었지만, R6/2 마우스로부터의 뉴런은 야생형 뉴런과 약간의 차이를 나타냈다. 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA. 도 16n 내지 도 16q. R6/2 마우스에서 야생형 뉴런 및 전환된 뉴런 및 비전환된 뉴런 중에서 유사한 시냅스 입력을 나타내는 산란도의 요약 그래프: sEPSC 빈도(도 16n), sEPSC 진폭(도 16o), sIPSC 빈도(도 16p) 및 sIPSC(도 16q). 모든 그룹에 대해 p 값은 > 0.4임, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA. 도 16r. 전환된 뉴런 중에서 상이한 점화 패턴을 갖는 뉴런의 백분율을 나타내는 원형 도표.
도 17a 내지 도 17d. 야생형 마우스에서의 선조체 뉴런으로부터 기록된 통상적인 전기생리학적 트레이스. 도 17a. 야생형 마우스에서 선조체 뉴런으로부터 기록된 Na 양전류 K 양전류를 나타내는 대표적인 트레이스. 도 17b. WT 선조체 뉴런으로부터 기록된 활동 전위의 전형적인 트레이스. 도 17c 및 도 17d. WT 선조체 뉴런으로부터 기록된 자발적 EPSC(도 17c) 및 자발적 IPSC(도 17d)의 전형적인 트레이스.
도 18a 내지 도 18g. R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 성상교세포-전환된 뉴런의 축삭 돌기. 도 18a. vGAT(녹색 염색됨) 및 티로신 하이드록실라제(TH, 청록색 염색됨)에 대해 면역염색된 R6/2 마우스 뇌 절편의 시상도. TH 양성 세포 바디는 흑질(SNr 위)에 존재하고, 선조체에서 밀집한 TH 신경분포가 관찰되었다. 삽입도는 선조체로부터 GP 및 SNr로의 축삭 돌기를 예시하도록 오직 mCherry 채널을 나타낸다. 축척 막대: 1 mm. 도 18b. GP 및 SNr에서 vGAT에 의해 동시염색된 mCherry 양성 반점(화살촉)을 나타내는 고해상 영상(38 dpi). 축척 막대: 2 μm. 도 18c. GP 및 SNr에서의 vGAT 강도가 NeuroD1 + Dlx2 치료된 R6/2 마우스 뇌에서 유의미하게 향상되었다는 것을 나타내는 정량화된 데이터. 도 18d. R6/2 마우스 뇌에서 전환된 뉴런의 CTB 역행 추적의 실험적 설계. CTB 주사 후 7일에 면역조직화학 분석을 위해 마우스를 희생하였다. 도 18e. AAV2/5 NeuroD1 + Dlx2 주사 후 21일 또는 30일에 GP로 CTB를 주사함으로써 선조체 성상교세포-전환된 뉴런의 역행 추적. 적은 CTB(녹색 염색됨)-표지된 전환된 뉴런(적색 염색됨)은 21 dpi 그룹에서 선조체에서 검출되었지만(화살촉), 많은 더 CTB-표지된 전환된 뉴런은 30 dpi 그룹에서 관찰되었다(화살촉). 도 18f. 선조체 성상교세포-전환된 뉴런을 추적하기 위한 SNr로의 CTB 주사. 훨씬 더 적은 전환된 뉴런은 21 dpi 그룹에서 CTB에 의해 표지되었지만, CTB 표지는 30 dpi 그룹에서 선조체에서 전환된 뉴런 중에서 명확히 확인되었다(화살촉). GP(도 18e) 및 SNr(도 18f) 둘 다에서, 많은 비전환된 기존의 뉴런이 예상된 것처럼 CTB에 의해 역행 표지되었다는 것에 주목한다. e 및 f에 대한 축척 막대: 20 μm. 도 18g. 21 dpi(검정 막대, 미숙 뉴런)에서 30 dpi(회색 막대, 더 성숙한 뉴런)에 유의미한 증가를 나타낸 R6/2 마우스 선조체에서의 CTB-표지된 전환된 뉴런의 백분율을 나타내는 막대 그래프. *p < 0.05, **p < 0.01, 독립 스튜던트 t-시험. 데이터는 박스 선도로 도시된다(박스, 25% 내지 75%; 휘스커, 10% 내지 90%; 선, 중앙치).
도 19a 및 도 19b. NeuroD1 + Dlx2 치료 후 새로 전환된 뉴런으로부터의 축삭 돌기를 나타내는 R6/2 마우스 뇌의 시상도. 도 19a. NeuroD1 + Dlx2의 바이러스 주사 후 38일에 R6/2 마우스 뇌의 시상도를 나타내는 면적분할 영상. mCherry 양성 전환된 뉴런은 축삭 돌기를 GP 및 SNr 부위로 내보냈다. 도 19b. 다른 뇌 영역에 대한 mCherry 신호를 나타내는 병합 영상. 축척 막대: 1 mm. 이는 도 19a의 확대도이다.
도 20a 및 도 20b. R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 성상교세포-전환된 뉴런의 축삭 돌기. 도 20a. 대조군 AAV mCherry에 의해 주사된 R6/2 마우스(38 dpi)의 시상 면적분할 영상. mCherry 양성 신호는 GP 또는 SNr에서 검출되지 않았다. 축척 막대: 1 mm. 도 20b. 대조군 바이러스 주사 후(38 dpi) GP 및 SNr에서의 mCherry 양성 신호의 결여, 그러나 NeuroD1 + Dlx2 주사 후(38 dpi) GP 및 SNr 둘 다에서의 상당한 mCherry 양성 신호를 나타내는 고배율 영상. 축척 막대: 10 μm. mCherry 및 vGAT 반점의 고해상 영상은 도 19b에 도시되어 있고, 정량화된 데이터는 도 19c에 도시되어 있다.
도 21a 및 도 21b. CTB 주사의 부위의 검증. 도 21. GP에서의 CTB 주사의 시상도. 도 21b. SNr에서의 CTB 주사의 시상도. CTB 주사 후 7일에 마우스를 희생하였다. 축척 막대: 1 mm.
도 22a 내지 도 22c. 비수술 R6/2 마우스에서의 mHtt 봉입 및 선조체 위축. 도 22a. 비수술 R6/2 마우스에서, mHtt 봉입은 대부분 선조체 뉴런(NeuN)에서 발견되었고, 성상교세포(S100β)에서 덜 발견되었다(P60 및 P90의 연령). 축척 막대: 20 μm. 도 22b 도 22a의 정량화된 데이터. 도 22c. 수술 없이 WT 한배새끼 및 R6/2 마우스의 연속 관상 절편의 니슬 염색(P90의 연령). 축척 막대: 0.5 mm. 정량화된 데이터는 도 23d에 도시되어 있다.
도 23a 내지 도 23d. 생체내 성상교세포에서 뉴런 전환 후 R6/2 마우스에서의 선조체 위축의 감소. 도 23a. R6/2 마우스에서 선조체 성상교세포-전환된 뉴런에서의 mHtt 봉입의 감소. mHtt 응집체(점)는 대부분의 선조체 뉴런(NeuN)에서 검출되었지만, 일부 NeuroD1 + Dlx2-전환된 뉴런(화살표로 표시됨)은 mHtt 응집체를 나타내지 않았다. 화살촉은 mHtt 봉입을 갖는 2개의 전환된 뉴런(mCherry 양성)을 나타낸다. 축척 막대: 10 μm. 도 23b. 대조군 mCherry 바이러스 단독(상부 열) 또는 NeuroD1 + Dlx2 AAV(하부 열)에 의해 치료된 R6/2 마우스 뇌의 연속 관상 절편의 니슬 염색에 의한 선조체 위축의 평가. 축척 막대: 0.5 mm. 도 23c. 전환된 뉴런에서의 mHtt 봉입을 갖는 뉴런의 백분율이 대조군 바이러스-치료된 그룹에서의 이의 이웃하는 자연적 뉴런 또는 선조체 뉴런과 비교하여 유의미하게 더 낮았다는 것을 나타내는 정량화된 데이터. 도 23d. R6/2 마우스(P90-97), 대조군 바이러스에 의해 치료된 R6/2 마우스 및 NeuroD1 + Dlx2 바이러스에 의해 치료된 R6/2 마우스 중에서 상대 선조체 부피(WT로 정규화됨)의 요약 그래프. 선조체 위축은 R6/2 마우스(P90-97)에서 명확히 검출되었지만, NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 유의미하게 구제되었다. **p < 0.01, ***p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 24a 내지 도 24l. 생체내 세포 전환 후 R6/2 마우스의 기능적 개선. 도 24a. 대조군 바이러스 또는 NeuroD1 + Dlx2 바이러스에 의해 치료된 야생형 한배새끼, R6/2 마우스, R6/2 마우스 중에서 대표적인 발자국 트랙. 파선은 걸음걸이 길이(L) 및 폭(W)을 나타낸다. 도 24b 및 도 24c. 상이한 그룹 중에서 걸음걸이 길이(도 24b) 및 폭(도 24c)의 정량화된 데이터. 걸음걸이 길이는 R6/2 마우스에서 감소하였지만, 부분적으로 NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 구제되었다(본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA). 도 24d. 상이한 그룹 중에서 개방 장소 시험(20분)에서의 로코모터 활성을 나타내는 대표적인 트랙. 도 24e. 총 이동 거리가 R6/2 마우스에서 감소하였지만, NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 유의미하게 개선되었다는 것을 나타내는 정량화된 데이터(본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA). **p < 0.01, ***p < 0.001. 도 24f. 수술(바이러스 주사) 전 7일 및 수술 후 30일에 R6/2 마우스의 평균 체중. NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스는 30 dpi에 대조군 바이러스-치료된 마우스보다 더 적은 체중 감소를 나타냈다(*p < 0.05, 독립 스튜던트 t-시험). 각각의 그룹에서의 마우스 수는 각각의 막대에 표지된다. 도 24g. R6/2 마우스에서의 통상적인 움켜짐(상부) 및 비움켜짐(하부) 표현형. 도 24h. 움켜짐 표현형을 나타내는 마우스의 백분율은 NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스에서 감소되었다(*p < 0.05, 2측 피어슨 카이 제곱 시험). 도 24i. 평균 움켜짐 점수는 NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 또한 유의미하게 감소하였다(*p < 0.05, 독립 스튜던트 t-시험). 각각의 그룹에서의 마우스 수는 막대에서 표지된다. 도 24j. R6/2 마우스의 그립 강도는 NeuroD1 + Dlx2 치료 후 변하지 않았다. 도 24k. 수술 후 7일에서 수술 후 38일(종점 마우스 연령: P98)에 생존기간 계산을 나타내는 실험 다이어그램. 7 dpi 내지 38 dpi에 죽은 마우스를 기록하였다. 30 내지 37 dpi에 행동 시험을 수행하였다. 도 24l. 29마리 중 13마리의 R6/2 마우스가 대조군 바이러스 그룹에서 죽는 반면, 33마리 중 불과 2마리의 R6/2 마우스가 NeuroD1 + Dlx2 치료 그룹에서 죽었다는 것을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 그래프(p < 0.001, 2측 피어슨 카이 제곱 시험). 데이터는 박스 선도로 도시된다(박스, 25-75%; 휘스커, 10% 내지 90%; 선, 중앙치).
도 25. 인간 NeuroD1 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 목록(서열 번호 1).
도 26. 인간 Dlx2 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 목록(서열 번호 2).
도 2a 내지 도 2g. WT 마우스 뇌에서의 GABA성 뉴런으로의 선조체 성상교세포의 생체내 전환. 도 2a. 7 dpi에 AAV 감염된 선조체 성상교세포(GFAP, 청녹색 염색됨)에서의 mCherry(적색 염색됨, NeuroD1- p2A-mCherry 및 Dlx2-P2A-mCherry)와 함께 NeuroD1(녹색 염색됨) 및 Dlx2(청색 염색됨)의 동시발현. 도 2b. 30 dpi에, NeuroD1(녹색 염색됨) 및 Dlx2(청색 염색됨) 동시발현된 세포는 NeuN 양성 뉴런(청록색 염색됨)이 되었다. a 및 b에 대한 축척 막대: 20 μm. 도 2c. 30 dpi까지 NeuN 양성 뉴런으로 대부분 전환된 7 dpi에 선조체 성상교세포에서의 NeuroD1 및 Dlx2의 동시발현을 나타내는 요약된 데이터(7 dpi에 대해 n = 8마리 마우스, 30 dpi에 대해 n = 9마리 마우스). 도 2d. NeuroD1 및 Dlx2 동시발현에 의해 유도된 성상교세포에서 뉴런 전환 과정을 예시하는 다이어그램. 도 2e. 1개월의 시간 윈도우에 걸쳐 성상교세포로부터 뉴런으로의 점진적인 형태 변화를 예시하는 대표적인 영상. 대부분의 mCherry 양성 세포가 AAV 주사 후 조기 시점에 GFAP(청녹색 염색됨)에 의해 동시표지되지만, 나중에 GFAP 신호가 소실되고 NeuN 신호가 획득됨(녹색 역샘됨)에 주목한다. 화살촉은 NeuN에 의해 동시표지된 mCherry 양성 세포를 나타낸다. 축척 막대: 50 μm. 도 2f. 대조군(mCherry 양성 단독, 상부 그래프) 또는 NeuroD1 + Dlx2 그룹(하부 그래프)에서 바이러스 감염된 세포(mCherry 양성 세포) 중에서 세포 정체(성상교세포 대 뉴런)를 나타내는 시간 과정. 대조군에서의 대부분의 바이러스 감염된 세포는 성상교세포인 반면, NeuroD1 + Dlx2-감염된 세포는 주로 성상교세포 집단으로부터 성상교세포과 뉴런의 혼합 집단으로, 그리고 이후 주로 뉴런 집단으로 점진적으로 이동하였다. 도 2g. 선조체 성상교세포에서 NeuroD1 및 Dlx2의 전위성 발현 후(30 dpi) GAD67, GABA, DARPP32 및 파르브알부민(PV)에 의해 동시염색된 전환된 뉴런을 나타내는 공초점 영상. 화살촉은 co559 표지된 세포를 나타낸다. 축척 막대: 20 μm.(h) 선조체에서 NeuroD1 및 Dlx2에 의해 유도된 성상교세포-전환된 뉴런의 조성을 나타내는 정량화된 데이터. 대부분의 전환된 뉴런은 GABA성 뉴런이었고(80% 초과), 유의미한 비율은 DARPP32에 면역양성이었다(55.7%). 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 3a 내지 도 3b. AAV-감염된 세포에서의 NeuroD1 및 Dlx2의 전위성 발현. 도 3a. AAV2/5 주사 후 7일(7 dpi)에 Dlx2, NeuroD1, mCherry 및 NeuN의 동시염색. NeuroD1 또는 Dlx2는 7 dpi에 NeuN 양성 세포에서 검출되지 않았다. 도 3b. AAV2/5 주사 후 30일(30 dpi)에 Dlx2, NeuroD1, mCherry 및 GFAP의 동시염색. NeuroD1 및 Dlx2는 GFAP가 아니라 mCherry에 의해 동시국재화되었다. 축척 막대: 20 μm. 정량화는 도 2c에 도시되어 있다.
도 4. WT 마우스의 선조체에서의 mCherry 대조군 바이러스 감염의 시간 과정. WT 마우스를 AAV2/5 GFAP::Cre + AAV2/5 CAG::mCherry-P2A-mCherry로 주사하고, 면역조직화학 분석을 위해 상이한 시점(7, 11, 15, 21 및 30 dpi)에 희생시켰다. 대부분의 mCherry 양성 세포는 21 및 30 dpi(화살촉)에서의 오직 적은 예외로 하여 NeuN이 아니라 GFAP에 의해 동시염색되었다. 축척 막대: 50 μm. 정량화는 도 2f에 도시되어 있다.
도 5a 내지 도 5c. 선조체에서 전환 효율을 증가시키는 데 있어서 NeuroD1 및 Dlx2의 상승 효과. 도 5a. WT 마우스를 상이한 AAV2/5로 주사하고, 상이한 그룹 중에서 전환 효율을 비교하기 위해 면역염색 비교를 위해 30 dpi에 희생시켰다. 축척 막대: 50 μm. 도 5b 및 도 5c. NeuroD1 + Dlx2 그룹이 가장 높은 전환 효율을 갖고(도 5b), 가장 많은 수의 뉴런을 생성한다는 것을 나타내는 정량화된 데이터(도 5c). 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 6. WT 마우스 선조체에서 선조체 성상교세포-전환된 뉴런 중에서 뉴런 하위유형 규명. 마우스 뇌 절편을 30 dpi에 상이한 GABA성 하위유형 마커에 의해 동시염색하였다. 적은 전환된 뉴런은 소마토스타틴(SST), 신경펩타이드 Y(NPY) 또는 칼레티닌에 양성이었다. 축척 막대: 20 μm. 정량화된 데이터는 도 2h에 도시되어 있다.
도 7a 내지 도 7g. 전환 후 WT 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 성상교세포 밀도. 도 7a. AAV 주사 후 30일에 성상교세포 마커 S100β 및 뉴런 마커 NeuN을 나타내는 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 7b 내지 도 7d. 전환 후 성상교세포 증식을 나타내는, NeuroD1 + Dlx2 치료된 마우스 뇌에서 발견된 상이한 단계에서의 분열 성상교세포를 나타내는 고배율 공초점 영상. 도 7e 내지 도 7g. 유의미한 차이 없이 대조군 조건에서 또는 세포 전환 후(N+D) 뉴런 밀도(도 7e), 성상교세포 밀도(도 7f) 및 뉴런/성상교세포의 비(도 7g)를 나타내는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 8a 내지 도 8d. 세포 전환 후 WT 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 미세아교세포 밀도. 도 8a. AAV 주사 후 30일에 미세아교세포 마커 Iba1 및 뉴런 마커 NeuN을 나타내는 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 8b 내지 도 8d. 세포 전환 후 변하지 않은 뉴런 밀도(도 8b), 미세아교세포 밀도(도 8c) 및 뉴런/미세아교세포의 비(도 8d)를 나타내는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 9a 내지 도 9f. 전환된 뉴런은 GFAP::Cre 77.6 형질전환 마우스에 의해 추적된 성상교세포로부터 기원한다. 도 9a 및 도 9b. NeuroD1 + Dlx2(FLEx-NeuroD1-P2A-mCherry 및 FLEx-Dlx2-P2A-mCherry)에 의해 유도된 선조체에서 성상교세포에서 뉴런 전환 과정을 조사하기 위해 GFAP::Cre 리포터 마우스의 사용을 예시하는 실험 시각표(도 9a) 및 도식적 다이어그램(도 9b). 도 9c. 7 dpi(왼쪽 행), 28 dpi(중간 행) 및 56 dpi(오른쪽 행)에 GFAP 및 NeuN에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포(NeuroD1 + Dlx2)를 나타내는 통상적인 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 삽입도는 상이한 마커를 갖는 통상적인 세포를 나타낸다. 축척 막대: 4 μm. 도 9d. 7, 28 및 56 dpi에 S100β 및 NeuN에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포(NeuroD1 + Dlx2)의 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 삽입도 축척 막대: 4 μm. 도 9e 및 도 9f. NeuroD1 및 Dlx2 바이러스의 주사 후 GFAP::Cre 마우스에서 2개월의 시간 과정에 걸친 성상교세포에서 뉴런으로의 점진적인 이행을 나타내는 정량화된 데이터. NeuroD1 및 Dlx2-감염된 세포 중에서 성상교세포의 감소 및 뉴런의 증가 이외에, 감염된 세포의 약 40%는 28 dpi에 이행 단계에서 잡혔는데, 이것은 GFAP 신호도 NeuN 신호도 나타내지 않았다는 것에 주목한다. 성상교세포에서 뉴런 전환의 시간 과정이 AAV2/5 FLEx- NeuroD1-P2A-mCherry 및 FLEx-Dlx2-P2A-mCherry와 둘 다 조합되어 GFAP::Cre AAV2/5에 의해 유도된 것과 비교하여 GFAP::Cre 마우스에서보다 느리다는 것에 또한 주목한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 10a 내지 도 10c. GFAP::Cre77.6 형질전환 마우스 계통에서 뉴런 전환에 대한 선조체 성상교세포의 표적화. 도 10a. 58 dpi에 상이한 신경교 마커 및 뉴런 마커에 의해 동시염색된 선조체에서 대조군 AAV mCherry-감염된 세포를 나타내는 공초점 영상. 대부분의 mCherry 양성 세포는 S100β, GFAP 및 글루타민 합성효소(GS)를 포함하는 성상교세포 마커에 의해 동시국재화되었다. 매우 적은 mCherry 양성 세포는 Olig2, NG2, Iba1 또는 NeuN에 의해 동시염색되었다. 축척 막대: 20 μm. 도 10b. 상이한 마커에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포의 백분율을 나타내는 도 10a의 정량화된 데이터. mCherry 양성 세포의 95% 초과는 GFAP::Cre 77.6 마우스 계통의 선조체에서 성상교세포 마커에 양성이었다. 도 10c. GFAP::Cre 77.6 마우스 계통의 NeuroD1 + Dlx2-치료된 선조체에서, 대부분의 성상교세포-전환된 뉴런은 DARPP32에 면역양성이었다(58 dpi). 축척 막대: 20 μm. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 11a 내지 도 11f. R6/2 마우스 뇌에서 GABA성 뉴런으로의 선조체 성상교세포의 생체내 전환. 도 11a. 30 dpi에 대조군 mCherry AAV(왼쪽 패널) 또는 NeuroD1 + Dlx2 AAV(오른쪽 패널)가 주사된 R6/2 마우스 선조체의 저배율 관상 절편. 축척 막대: 0.5 mm. 도 11b. S100β(녹색 염색됨) 및 NeuN(청녹색 염색됨)에 의해 동시염색된 mCherry 양성 세포의 더 고배율의 영상. 화살촉은 대조군에서 S100β에 의해 동시표지된 mCherry 양성 세포를 나타내지만(상부 열), NeuroD1 + Dlx2 그룹에서 NeuN에 의해 동시표지되었다(하부 열). 축척 막대: 20 μm. 도 11c. 30 dpi까지, 대조군에서의 대부분의 mCherry 양성 세포가 S100β 양성 성상교세포였지만, NeuroD1 + Dlx2 그룹에서 대부분의 mCherry 양성 세포가 NeuN 양성 뉴런으로 전환되었다는 것을 나타내는 데이터의 요약. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.도 11d. R6/2 마우스에서 대부분의 선조체 성상교세포-전환된 뉴런은 GAD67 및 GABA에 면역양성이었다. 축척 막대: 20 μm. 도 11e. 많은 전환된 뉴런은 DARPP32에 의해 동시염색되었고, 소수는 또한 파르브알부민(PV)에 의해 동시염색되었다. 축척 막대: 20 μm. 도 11f. R6/2 마우스의 선조체에서의 전환된 뉴런의 80% 초과가 GAD67 및 GABA에 면역양성이고, 유의미한 비율이 또한 DARPP32에 면역양성이고(56.6%), 더 적은 백분율이 매우 적은 다른 GABA성 하위유형 외에 PV 양성이이라는 것(8.4%)을 나타내는 정량화된 데이터.
도 12. R6/2 마우스 선조체에서의 전환된 뉴런의 하위유형 규명. R6/2 마우스 선조체에서의 NeuroD1 + Dlx2 치료 후 선조체 성상교세포-전환된 뉴런 중에서, 불과 몇 개의 전환된 뉴런은 소마토스타틴(SST), 신경펩타이드 Y(NPY) 또는 칼레티닌에 면역양성이었다. 축척 막대: 20 μm. 정량화는 도 11f에 도시되어 있다.
도 13a 내지 도 13g. 세포 전환 후 R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 성상교세포 밀도. 도 13a. 바이러스 주사 후 30일에 R6/2 마우스 선조체에서의 성상교세포, AAV-감염된 세포 및 뉴런의 통상적인 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 13b 내지 도 13d. 전환 후 성상교세포 증식을 나타내는, NeuroD1 + Dlx2 치료 후 R6/2 마우스 선조체에서 분열 성상교세포의 상이한 단계를 나타내는 고배율 공초점 영상. 도 13e 내지 도 13g. 세포 전환이 없거나(Ctrl) 또는 있는(N+D) R6/2 마우스 선조체에서 뉴런 밀도(도 13e), 성상교세포 밀도(도 13f) 및 뉴런/성상교세포의 비(도 13g)를 예시하는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 14a 내지 도 14c. 세포 전환은 R6/2 마우스 뇌에서 선조체 성상교세포의 증식을 촉발한다. 도 14a. NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스 선조체에서 많은 증식 세포가 검출되지만, 대조군 AAV-치료된 R6/2 마우스의 선조체에서 매우 적게 검출되었다는 것을 나타내는 Ki67 면역염색의 면적분할 저배율 공초점 영상. 축척 막대: 100 μm. 도 14b. NeuroD1 + Dlx2 치료 후 R6/2 마우스 선조체에서 증식하는 성상교세포(화살촉)를 나타내는 고배율 공초점 영상. 화살은 전환된 뉴런(유사색상)을 나타낸다. 축척 막대: 10 μm. 도 14c. 증식하는 성상교세포의 수가 NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 선조체(30 dpi)에서 급격히 증가하였다는 것을 나타내고, 이것이 생체내 성상교세포에서 뉴런 전환이 성상교세포 전환 후 그 자체를 보충하도록 성상교세포의 증식을 유의미하게 자극할 수 있다는 것을 제시하는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 15a 내지 도 15d. 세포 전환 후 R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 뉴런 및 미세아교세포 밀도. 도 15a. AAV 주사 후 30일에 미세아교세포 마커 Iba1 및 뉴런 마커 NeuN을 나타내는 공초점 영상. 축척 막대: 20 μm. 도 15b 내지 도 15d. 대조군 및 NeuroD1+Dlx2 그룹에서 뉴런 밀도(도 15b), 미세아교세포 밀도(도 15c) 및 뉴런/미세아교세포의 비(도 15d)를 나타내는 요약 그래프. 데이터는 평균 ± SD로 기재되어 있다.
도 16a 내지 도 16r. R6/2 마우스 뇌 슬라이스에서의 선조체 성상교세포 전환된 뉴런의 기능적 규명. 도 16a. 자연적 뉴런(mCherry 음성, 상부 열) 및 전환된 뉴런(mCherry 양성, 하부 열)의 위상 및 형광 영상. 축척 막대: 10 μm. 도 16b. Na 양전류 K 양전류의 대표적인 트레이스는 자연적 뉴런(검정) 및 전환된 뉴런(적색 염색됨)에서 기록되었다. 도 16c. 반복 활동 전위(AP)는 단계별 전류 주입에 의해 생겼다. 자연적 뉴런 및 전환된 뉴런 둘 다에서 탈분극 자극 시 개시 활동 전위 점화에 대한 상당한 지연에 주목한다. 이러한 지연된 점화는 통상적인 MSN 전기생리학적 특성이다. 도 16d 및 도 16e. 자연적 뉴런(상부 열) 및 전환된 뉴런(하부 열)으로부터 기록된 sEPSC 및 sIPSC의 통상적인 트레이스. 도 16f 및 도 16g. Na 양전류 K 양전류의 I-V 선도는 바이러스-주사된 R6/2 마우스 및 비치료된 WT 마우스에서 선조체 뉴런으로부터 기록되었다. R6/2 마우스에서의 전환된 선조체 뉴런 및 비전환된 선조체 뉴런 둘 다에서의 Na 양전류는 WT 마우스에서 선조체 뉴런으로부터 회수된 것보다 작았다. 전환된 뉴런에서의 K 양전류는 R6/2 마우스 선조체에서 비전환된 뉴런에서보다 유의미하게 더 크다(독립 스튜던트 t-시험). *p < 0.05, **p < 0.01. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.도 16h 내지 도 16m. 야생형 뉴런과 함께 R6/2 마우스에서 전환된 뉴런 및 비전환된 뉴런 중에서 유사한 전기 특성을 나타내는 산란도의 요약 그래프: 입력 저항(도 16h), 커패시턴스(도 16i), 휴지 막 전위(도 16j), AP 문턱(도 16k), AP 진폭(도 16l) 및 AP 빈도(도 16m). R6/2 마우스에서 전환된 뉴런과 비전환된 뉴런 사이에 유의미한 차이가 없었지만, R6/2 마우스로부터의 뉴런은 야생형 뉴런과 약간의 차이를 나타냈다. 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA. 도 16n 내지 도 16q. R6/2 마우스에서 야생형 뉴런 및 전환된 뉴런 및 비전환된 뉴런 중에서 유사한 시냅스 입력을 나타내는 산란도의 요약 그래프: sEPSC 빈도(도 16n), sEPSC 진폭(도 16o), sIPSC 빈도(도 16p) 및 sIPSC(도 16q). 모든 그룹에 대해 p 값은 > 0.4임, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA. 도 16r. 전환된 뉴런 중에서 상이한 점화 패턴을 갖는 뉴런의 백분율을 나타내는 원형 도표.
도 17a 내지 도 17d. 야생형 마우스에서의 선조체 뉴런으로부터 기록된 통상적인 전기생리학적 트레이스. 도 17a. 야생형 마우스에서 선조체 뉴런으로부터 기록된 Na 양전류 K 양전류를 나타내는 대표적인 트레이스. 도 17b. WT 선조체 뉴런으로부터 기록된 활동 전위의 전형적인 트레이스. 도 17c 및 도 17d. WT 선조체 뉴런으로부터 기록된 자발적 EPSC(도 17c) 및 자발적 IPSC(도 17d)의 전형적인 트레이스.
도 18a 내지 도 18g. R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 성상교세포-전환된 뉴런의 축삭 돌기. 도 18a. vGAT(녹색 염색됨) 및 티로신 하이드록실라제(TH, 청록색 염색됨)에 대해 면역염색된 R6/2 마우스 뇌 절편의 시상도. TH 양성 세포 바디는 흑질(SNr 위)에 존재하고, 선조체에서 밀집한 TH 신경분포가 관찰되었다. 삽입도는 선조체로부터 GP 및 SNr로의 축삭 돌기를 예시하도록 오직 mCherry 채널을 나타낸다. 축척 막대: 1 mm. 도 18b. GP 및 SNr에서 vGAT에 의해 동시염색된 mCherry 양성 반점(화살촉)을 나타내는 고해상 영상(38 dpi). 축척 막대: 2 μm. 도 18c. GP 및 SNr에서의 vGAT 강도가 NeuroD1 + Dlx2 치료된 R6/2 마우스 뇌에서 유의미하게 향상되었다는 것을 나타내는 정량화된 데이터. 도 18d. R6/2 마우스 뇌에서 전환된 뉴런의 CTB 역행 추적의 실험적 설계. CTB 주사 후 7일에 면역조직화학 분석을 위해 마우스를 희생하였다. 도 18e. AAV2/5 NeuroD1 + Dlx2 주사 후 21일 또는 30일에 GP로 CTB를 주사함으로써 선조체 성상교세포-전환된 뉴런의 역행 추적. 적은 CTB(녹색 염색됨)-표지된 전환된 뉴런(적색 염색됨)은 21 dpi 그룹에서 선조체에서 검출되었지만(화살촉), 많은 더 CTB-표지된 전환된 뉴런은 30 dpi 그룹에서 관찰되었다(화살촉). 도 18f. 선조체 성상교세포-전환된 뉴런을 추적하기 위한 SNr로의 CTB 주사. 훨씬 더 적은 전환된 뉴런은 21 dpi 그룹에서 CTB에 의해 표지되었지만, CTB 표지는 30 dpi 그룹에서 선조체에서 전환된 뉴런 중에서 명확히 확인되었다(화살촉). GP(도 18e) 및 SNr(도 18f) 둘 다에서, 많은 비전환된 기존의 뉴런이 예상된 것처럼 CTB에 의해 역행 표지되었다는 것에 주목한다. e 및 f에 대한 축척 막대: 20 μm. 도 18g. 21 dpi(검정 막대, 미숙 뉴런)에서 30 dpi(회색 막대, 더 성숙한 뉴런)에 유의미한 증가를 나타낸 R6/2 마우스 선조체에서의 CTB-표지된 전환된 뉴런의 백분율을 나타내는 막대 그래프. *p < 0.05, **p < 0.01, 독립 스튜던트 t-시험. 데이터는 박스 선도로 도시된다(박스, 25% 내지 75%; 휘스커, 10% 내지 90%; 선, 중앙치).
도 19a 및 도 19b. NeuroD1 + Dlx2 치료 후 새로 전환된 뉴런으로부터의 축삭 돌기를 나타내는 R6/2 마우스 뇌의 시상도. 도 19a. NeuroD1 + Dlx2의 바이러스 주사 후 38일에 R6/2 마우스 뇌의 시상도를 나타내는 면적분할 영상. mCherry 양성 전환된 뉴런은 축삭 돌기를 GP 및 SNr 부위로 내보냈다. 도 19b. 다른 뇌 영역에 대한 mCherry 신호를 나타내는 병합 영상. 축척 막대: 1 mm. 이는 도 19a의 확대도이다.
도 20a 및 도 20b. R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 성상교세포-전환된 뉴런의 축삭 돌기. 도 20a. 대조군 AAV mCherry에 의해 주사된 R6/2 마우스(38 dpi)의 시상 면적분할 영상. mCherry 양성 신호는 GP 또는 SNr에서 검출되지 않았다. 축척 막대: 1 mm. 도 20b. 대조군 바이러스 주사 후(38 dpi) GP 및 SNr에서의 mCherry 양성 신호의 결여, 그러나 NeuroD1 + Dlx2 주사 후(38 dpi) GP 및 SNr 둘 다에서의 상당한 mCherry 양성 신호를 나타내는 고배율 영상. 축척 막대: 10 μm. mCherry 및 vGAT 반점의 고해상 영상은 도 19b에 도시되어 있고, 정량화된 데이터는 도 19c에 도시되어 있다.
도 21a 및 도 21b. CTB 주사의 부위의 검증. 도 21. GP에서의 CTB 주사의 시상도. 도 21b. SNr에서의 CTB 주사의 시상도. CTB 주사 후 7일에 마우스를 희생하였다. 축척 막대: 1 mm.
도 22a 내지 도 22c. 비수술 R6/2 마우스에서의 mHtt 봉입 및 선조체 위축. 도 22a. 비수술 R6/2 마우스에서, mHtt 봉입은 대부분 선조체 뉴런(NeuN)에서 발견되었고, 성상교세포(S100β)에서 덜 발견되었다(P60 및 P90의 연령). 축척 막대: 20 μm. 도 22b 도 22a의 정량화된 데이터. 도 22c. 수술 없이 WT 한배새끼 및 R6/2 마우스의 연속 관상 절편의 니슬 염색(P90의 연령). 축척 막대: 0.5 mm. 정량화된 데이터는 도 23d에 도시되어 있다.
도 23a 내지 도 23d. 생체내 성상교세포에서 뉴런 전환 후 R6/2 마우스에서의 선조체 위축의 감소. 도 23a. R6/2 마우스에서 선조체 성상교세포-전환된 뉴런에서의 mHtt 봉입의 감소. mHtt 응집체(점)는 대부분의 선조체 뉴런(NeuN)에서 검출되었지만, 일부 NeuroD1 + Dlx2-전환된 뉴런(화살표로 표시됨)은 mHtt 응집체를 나타내지 않았다. 화살촉은 mHtt 봉입을 갖는 2개의 전환된 뉴런(mCherry 양성)을 나타낸다. 축척 막대: 10 μm. 도 23b. 대조군 mCherry 바이러스 단독(상부 열) 또는 NeuroD1 + Dlx2 AAV(하부 열)에 의해 치료된 R6/2 마우스 뇌의 연속 관상 절편의 니슬 염색에 의한 선조체 위축의 평가. 축척 막대: 0.5 mm. 도 23c. 전환된 뉴런에서의 mHtt 봉입을 갖는 뉴런의 백분율이 대조군 바이러스-치료된 그룹에서의 이의 이웃하는 자연적 뉴런 또는 선조체 뉴런과 비교하여 유의미하게 더 낮았다는 것을 나타내는 정량화된 데이터. 도 23d. R6/2 마우스(P90-97), 대조군 바이러스에 의해 치료된 R6/2 마우스 및 NeuroD1 + Dlx2 바이러스에 의해 치료된 R6/2 마우스 중에서 상대 선조체 부피(WT로 정규화됨)의 요약 그래프. 선조체 위축은 R6/2 마우스(P90-97)에서 명확히 검출되었지만, NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 유의미하게 구제되었다. **p < 0.01, ***p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA. 데이터는 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
도 24a 내지 도 24l. 생체내 세포 전환 후 R6/2 마우스의 기능적 개선. 도 24a. 대조군 바이러스 또는 NeuroD1 + Dlx2 바이러스에 의해 치료된 야생형 한배새끼, R6/2 마우스, R6/2 마우스 중에서 대표적인 발자국 트랙. 파선은 걸음걸이 길이(L) 및 폭(W)을 나타낸다. 도 24b 및 도 24c. 상이한 그룹 중에서 걸음걸이 길이(도 24b) 및 폭(도 24c)의 정량화된 데이터. 걸음걸이 길이는 R6/2 마우스에서 감소하였지만, 부분적으로 NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 구제되었다(본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA). 도 24d. 상이한 그룹 중에서 개방 장소 시험(20분)에서의 로코모터 활성을 나타내는 대표적인 트랙. 도 24e. 총 이동 거리가 R6/2 마우스에서 감소하였지만, NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 유의미하게 개선되었다는 것을 나타내는 정량화된 데이터(본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA). **p < 0.01, ***p < 0.001. 도 24f. 수술(바이러스 주사) 전 7일 및 수술 후 30일에 R6/2 마우스의 평균 체중. NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스는 30 dpi에 대조군 바이러스-치료된 마우스보다 더 적은 체중 감소를 나타냈다(*p < 0.05, 독립 스튜던트 t-시험). 각각의 그룹에서의 마우스 수는 각각의 막대에 표지된다. 도 24g. R6/2 마우스에서의 통상적인 움켜짐(상부) 및 비움켜짐(하부) 표현형. 도 24h. 움켜짐 표현형을 나타내는 마우스의 백분율은 NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스에서 감소되었다(*p < 0.05, 2측 피어슨 카이 제곱 시험). 도 24i. 평균 움켜짐 점수는 NeuroD1 + Dlx2 치료에 의해 또한 유의미하게 감소하였다(*p < 0.05, 독립 스튜던트 t-시험). 각각의 그룹에서의 마우스 수는 막대에서 표지된다. 도 24j. R6/2 마우스의 그립 강도는 NeuroD1 + Dlx2 치료 후 변하지 않았다. 도 24k. 수술 후 7일에서 수술 후 38일(종점 마우스 연령: P98)에 생존기간 계산을 나타내는 실험 다이어그램. 7 dpi 내지 38 dpi에 죽은 마우스를 기록하였다. 30 내지 37 dpi에 행동 시험을 수행하였다. 도 24l. 29마리 중 13마리의 R6/2 마우스가 대조군 바이러스 그룹에서 죽는 반면, 33마리 중 불과 2마리의 R6/2 마우스가 NeuroD1 + Dlx2 치료 그룹에서 죽었다는 것을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 그래프(p < 0.001, 2측 피어슨 카이 제곱 시험). 데이터는 박스 선도로 도시된다(박스, 25-75%; 휘스커, 10% 내지 90%; 선, 중앙치).
도 25. 인간 NeuroD1 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 목록(서열 번호 1).
도 26. 인간 Dlx2 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 목록(서열 번호 2).
본원에 사용된 것과 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 달리 복수의 지시대상을 포함한다.
대안의 그룹화가 제시될 때, 그 대안의 그룹화를 구성하는 임의의 및 모든 조합이 구체적으로 고안된다. 예를 들어, 항목이 A, B, C 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되면, 본 발명자들은 개별적으로 각각의 대안(예를 들어, 단독, B 단독 등)뿐만 아니라 A, B와 D; A와 C; B와 C; 등과 같은 조합을 구체적으로 고안한다. "및/또는"이라는 용어는 2개 이상의 항목의 목록에서 사용될 때 홀로 또는 다른 기재된 항목 중 임의의 하나 이상과 조합되어 기재된 항목 중 임의의 하나를 의미한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 A 및 B 중 어느 하나 또는 둘 다를 의미하도록 의도되고 - 즉, A 단독, B 단독, 또는 조합되어 A 및 B. "A, B 및/또는 C"라는 표현은 단독, B 단독, C 단독, 및 A와 조합된 B, 및 B와 조합된 C 및 조합된 C, 또는 조합된 A, B 및 C를 의미하도록 의도된다.
본 문헌은 새로운 기능적 뉴런의 재생 및 돌연변이체 HTT 독성의 감소를 통해 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 신경교 세포(예를 들어, 반응성 성상교세포)를 헌팅턴병을 갖는 살아 있는 포유류(예를 들어, 인간)의 뇌로 기능적으로 통합된 GABA성 뉴런(예를 들어, GABA성 MSN)으로 전환시키도록 사용될 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 GABA성 뉴런을 형성하는 것은 뇌 내의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포)를 살아 있는 포유류의 뇌로 기능적으로 통합될 수 있는 GABA성 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런)으로 전환시키는 것을 포함할 수 있다. 게다가, 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다(또는 이의 전사된 HTT RNA 또는 번역된 HTT 폴리펩타이드)를 변형시키도록 설계된 하나 이상의 유전자 치료 성분(예를 들어, 뉴클레아제, 표적화 서열, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 가이드 RNA 및/또는 공여자 핵산)은 뇌 내에 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 단백질의 양을 감소시키도록 본원에 기재된 것과 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 치료 성분은 편집된 Htt 대립유전자가 36개 미만의 CAG 반복부를 함유하도록 그리고/또는 편집된 Htt 대립유전자가 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드를 발현할 수 없도록 선조체에서의 신경교 세포 및/또는 뉴런 내의 Htt 대립유전자를 편집하도록 설계될 수 있다. 일 양태에서, 조합으로 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하기 위한 방법 및 재료(예를 들어, 새로운 기능적 뉴런의 재생 및 Htt 대립유전자의 편집)는 헌팅턴병 증상의 치료 및/또는 결과 및 기대 수명의 개선에 대한 상승 효과를 갖는다.
임의의 적절한 포유류는 본원에 기재된 것과 같이 치료될 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 래트 및 마우스를 포함하는 포유류는 살아 있는 포유류의 뇌에서 GABA성 뉴런을 생성하고/하거나 하나 이상의 Htt 대립유전자를 편집하기 위해 본원에 기재된 것처럼 치료될 수 있다. 일부 경우에, 포유류는 수컷이다. 일부 경우에, 포유류는 암컷이다. 일부 경우에, 포유류는 성 중성이다. 일부 경우에, 포유류는 미숙 갓난아기이다. 일부 경우에, 미숙 갓난아기는 36주 임신 전에 태어난다. 일부 경우에, 포유류는 갓난 신생아이다. 일부 경우에, 갓난 신생아는 약 2개월령 미만이다. 일부 경우에, 포유류는 신생아이다. 일부에서, 신생아는 약 1개월령 미만이다. 일부 경우에, 포유류는 유아이다. 일부 경우에, 유아는 2개월령 내지 24개월령이다. 일부 경우에, 유아는 2개월령 내지 3개월령, 2개월령 내지 4개월령, 2개월령 내지 5개월령, 3개월령 내지 4개월령, 3개월령 내지 5개월령, 3개월령 내지 6개월령, 4개월령 내지 5개월령, 4개월령 내지 6개월령, 4개월령 내지 7개월령, 5개월령 내지 6개월령, 5개월령 내지 7개월령, 5개월령 내지 8개월령, 6개월령 내지 7개월령, 6개월령 내지 8개월령, 6개월령 내지 9개월령, 7개월령 내지 8개월령, 7개월령 내지 9개월령, 7개월령 내지 10개월령, 8개월령 내지 9개월령, 8개월령 내지 10개월령, 8개월령 내지 11개월령, 9개월령 내지 10개월령, 9개월령 내지 11개월령, 9개월령 내지 12개월령, 10개월령 내지 11개월령, 10개월령 내지 12개월령, 10개월령 내지 13개월령, 11개월령 내지 12개월령, 11개월령 내지 13개월령, 11개월령 내지 14개월령, 12개월령 내지 13개월령, 12개월령 내지 14개월령, 12개월령 내지 15개월령, 13개월령 내지 14개월령, 13개월령 내지 15개월령, 13개월령 내지 16개월령, 14개월령 내지 15개월령, 14개월령 내지 16개월령, 14개월령 내지 17개월령, 15개월령 내지 16개월령, 15개월령 내지 17개월령, 15개월령 내지 18개월령, 16개월령 내지 17개월령, 16개월령 내지 18개월령, 16개월령 내지 19개월령, 17개월령 내지 18개월령, 17개월령 내지 19개월령, 17개월령 내지 20개월령, 18개월령 내지 19개월령, 18개월령 내지 20개월령, 18개월령 내지 21개월령, 19개월령 내지 20개월령, 19개월령 내지 21개월령, 19개월령 내지 22개월령, 20개월령 내지 21개월령, 20개월령 내지 22개월령, 20개월령 내지 23개월령, 21개월령 내지 22개월령, 21개월령 내지 23개월령, 21개월령 내지 24개월령, 22개월령 내지 23개월령, 22개월령 내지 24개월령, 및 23개월령 내지 24개월령이다. 일부 경우에, 포유류는 토들러이다. 일부 경우에, 토들러는 1세 내지 4세이다. 일부 경우에, 토들러는 1세 내지 2세, 1세 내지 3세, 1세 내지 4세, 2세 내지 3세, 2세 내지 4세, 및 3세 내지 4세이다. 일부 경우에, 포유류는 어린 어린이이다. 일부 경우에, 어린 어린이는 2세 내지 5세이다. 일부 경우에, 어린 어린이는 2세 내지 3세, 2세 내지 4세, 2세 내지 5세, 3세 내지 4세, 3세 내지 5세, 및 4세 내지 5세이다. 일부 경우에, 포유류는 어린이이다. 일부 경우에, 어린이는 6세 내지 12세이다. 일부 경우에, 어린이는 6세 내지 7세, 6세 내지 8세, 6세 내지 9세, 7세 내지 8세, 7세 내지 9세, 7세 내지 10세, 8세 내지 9세, 8세 내지 10세, 8세 내지 11세, 9세 내지 10세, 9세 내지 11세, 9세 내지 12세, 10세 내지 11세, 10세 내지 12세, 및 11세 내지 12세이다. 일부 경우에, 포유류는 청소년이다. 일부 경우에, 청소년은 13세 내지 19세이다. 일 양태에서, 청소년은 13세 내지 14세, 13세 내지 15세, 13세 내지 16세, 14세 내지 15세, 14세 내지 16세, 14세 내지 17세, 15세 내지 16세, 15세 내지 17세, 15세 내지 18세, 16세 내지 17세, 16세 내지 18세, 16세 내지 19세, 17세 내지 18세, 17세 내지 19세, 및 18세 내지 19세이다. 일부 경우에, 포유류는 소아 대상체이다. 일부 경우에, 소아 대상체는 1일령 내지 18세이다. 일부 경우에, 소아 대상체는 1일령 내지 1세, 1일령 내지 2세, 1일령 내지 3세, 1세 내지 2세, 1세 내지 3세, 1세 내지 4세, 2세 내지 3세, 2세 내지 4세, 2세 내지 5세, 3세 내지 4세, 3세 내지 5세, 3세 내지 6세, 4세 내지 5세, 4세 내지 6세, 4세 내지 7세, 5세 내지 6세, 5세 내지 7세, 5세 내지 8세, 6세 내지 7세, 6세 내지 8세, 6세 내지 9세, 7세 내지 8세, 7세 내지 9세, 7세 내지 10세, 8세 내지 9세, 8세 내지 10세, 8세 내지 11세, 9세 내지 10세, 9세 내지 11세, 9세 내지 12세, 10세 내지 11세, 10세 내지 12세, 10세 내지 13세, 11세 내지 12세, 11세 내지 13세, 11세 내지 14세, 12세 내지 13세, 12세 내지 14세, 12세 내지 15세, 13세 내지 14세, 13세 내지 15세, 13세 내지 16세, 14세 내지 15세, 14세 내지 16세, 14세 내지 17세, 15세 내지 16세, 15세 내지 17세, 15세 내지 18세, 16세 내지 17세, 16세 내지 18세, 및 17세 내지 18세이다. 일부 경우에, 포유류는 노인 포유류이다. 일부 경우에, 노인 포유류는 65세 내지 95세 또는 이것 초과이다. 일부 경우에, 노인 포유류는 65세 내지 70세, 65세 내지 75세, 65세 내지 80세, 70세 내지 75세, 70세 내지 80세, 70세 내지 85세, 75세 내지 80세, 75세 내지 85세, 75세 내지 90세, 80세 내지 85세, 80세 내지 90세, 80세 내지 95세, 85세 내지 90세, 및 85세 내지 95세이다. 일부 경우에, 포유류는 성인이다. 일부 경우에, 성인 포유류는 20세 내지 95세 또는 이것 초과이다. 일부 경우에, 성인 포유류는 20세 내지 25세, 20세 내지 30세, 20세 내지 35세, 25세 내지 30세, 25세 내지 35세, 25세 내지 40세, 30세 내지 35세, 30세 내지 40세, 30세 내지 45세, 35세 내지 40세, 35세 내지 45세, 35세 내지 50세, 40세 내지 45세, 40세 내지 50세, 40세 내지 55세, 45세 내지 50세, 45세 내지 55세, 45세 내지 60세, 50세 내지 55세, 50세 내지 60세, 50세 내지 65세, 55세 내지 60세, 55세 내지 65세, 55세 내지 70세, 60세 내지 65세, 60세 내지 70세, 60세 내지 75세, 65세 내지 70세, 65세 내지 75세, 65세 내지 80세, 70세 내지 75세, 70세 내지 80세, 70세 내지 85세, 75세 내지 80세, 75세 내지 85세, 75세 내지 90세, 80세 내지 85세, 80세 내지 90세, 80세 내지 95세, 85세 내지 90세, 및 85세 내지 95세이다. 일부 경우에, 포유류는 1세 내지 5세, 2세 내지 10세, 3세 내지 18세, 21세 내지 50세, 21세 내지 40세, 21세 내지 30세, 50세 내지 90세, 60세 내지 90세, 70세 내지 90세, 60세 내지 80세, 또는 65세 내지 75세이다. 일부 경우에, 포유류는 젊은 고령 포유류(65세 내지 74세)이다. 일부 경우에, 포유류는 중고령 포유류(75세 내지 84세)이다. 일 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 고령 포유류(85세 초과)이다. 일부 경우에, 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)는 헌팅턴병 환자의 뇌에서 GABA성 뉴런을 생성하고/하거나 하나 이상의 Htt 대립유전자를 편집하기 위해 본원에 기재된 것과 같이 치료될 수 있다. 포유류는 임의의 적절한 헌팅턴병 진단 기법을 사용하여 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 예는 헌팅틴 유전자의 유전 스크린, 운동 기능 결핍의 평가, 기억 결핍의 평가, 비제한적인 예로서 우울증 및 불안을 포함하는 정신학적 병태 평가를 포함하고, 자기 공명 영상화(MRI: magnetic resonance imaging), 기능적 자기 공명 영상화(fMRI: functional magnetic resonance imaging) 및 양전자 방출 단층촬영(PET: positron emission tomography) 스캔은 헌팅턴병을 갖는 것으로 인간을 검출하도록 수행될 수 있다.
본원에 기재된 것과 같이, 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)는 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산을 신경교 세포가 기능적 및 통합된 GABA성 뉴런을 형성하게 촉발하는 방식으로 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포)에 투여함으로써 그리고 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에 존재하는 CAG 반복부의 수를 변형시키도록 설계된 하나 이상의 유전자 치료 성분(예를 들어, 뉴클레아제, 표적화 서열 및 공여자 핵산)을 투여함으로써 치료될 수 있다.
NeuroD1 폴리펩타이드의 예는, 제한 없이, GenBank® 수탁 번호 NP_002491(GI 번호 121114306)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. NeuroD1 폴리펩타이드는 GenBank® 수탁 번호 NM_002500(GI 번호 323462174)에 기재된 것과 같은 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. Dlx2 폴리펩타이드의 예는, 제한 없이, GenBank® 수탁 번호 NP_004396(GI 번호 4758168)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. Dlx2 폴리펩타이드는 GenBank® 수탁 번호 NM_004405(GI 번호 84043958)에 기재된 것과 같은 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일부 경우에, NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산은 다른 곳에 기재된 것과 같을 수 있다(예를 들어, WO 2017/143207 참조).
임의의 적절한 방법은 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산을 살아 있는 포유류의 뇌 내의 신경교 세포에 전달하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터와 같은 하나 이상의 벡터를 사용하여 포유류에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 별개의 벡터(예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대한 1개의 벡터 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대한 1개의 벡터)는 핵산을 신경교 세포에 전달하도록 사용될 수 있다. 일부 경우에, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 둘 다를 함유하는 단일 벡터는 핵산을 신경교 세포에 전달하도록 사용될 수 있다.
일부 경우에, 핵산(예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산)을 신경교 세포에 투여하기 위한 벡터는 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드의 일시적인 발현을 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 핵산(예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산)을 신경교 세포에 투여하기 위한 벡터는 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드의 안정한 발현을 위해 사용될 수 있다. 핵산을 투여하기 위한 벡터가 NeuroD1 폴리펩타이드 및 Dlx2 폴리펩타이드의 안정한 발현을 위해 사용될 수 있는 경우에, 벡터는 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및/또는 신경교 세포의 게놈으로 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산을 통합하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산을 신경교 세포의 게놈으로 통합하도록 조작되고, 임의의 적절한 방법은 그 핵산을 신경교 세포의 게놈으로 통합하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 치료 기법은 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산을 신경교 세포의 게놈으로 통합하도록 사용될 수 있다.
핵산(예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)을 신경교 세포에 투여하기 위한 벡터는 표준 재료(예를 들어, 패키징 세포주, 헬퍼 바이러스 및 벡터 작제물)를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, Jeffrey R. Morgan에 의해 편집된 Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), Humana Press, Totowa, NJ (2002) 및 Curtis A. Machida에 의해 편집된 Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ (2003)을 참조한다. 바이러스-기반 핵산 전달 벡터는 통상적으로 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 파필로마 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된다. 일부 경우에, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 아데노-연관된 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 혈청형 1 바이러스 벡터, AAV 혈청형 2 바이러스 벡터, AAV 혈청형 3 바이러스 벡터, AAV 혈청형 4 바이러스 벡터, AAV 혈청형 5 바이러스 벡터, AAV 혈청형 6 바이러스 벡터, AAV 혈청형 7 바이러스 벡터, AAV 혈청형 8 바이러스 벡터, AAV 혈청형 9 바이러스 벡터, AAV 혈청형 10 바이러스 벡터, AAV 혈청형 11 바이러스 벡터, AAV 혈청형 12 바이러스 벡터, 또는 재조합 AAV 혈청형 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 혈청형 2/5 바이러스 벡터), 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터를 사용하여 신경교 세포에 전달될 수 있다.
NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 이외에, 바이러스 벡터는 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 함유할 수 있다. 이러한 조절 요소는 프로모터 서열, 인핸서 서열, 반응 요소, 신호 펩타이드, 내부 리보솜 진입 서열, 폴리아데닐화 신호, 종결자 또는 핵산의 발현(예를 들어, 전사 또는 번역)을 조절하는 유도성 요소를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 포함될 수 있는 요소(들)의 선택은, 제한 없이, 유도가능성, 표적화 및 원하는 발현 수준을 포함하는 몇몇 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 프로모터는 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전사를 용이하게 하도록 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 프로모터는 (예를 들어, 테트라사이클린의 존재 하에) 항시적 또는 유도성일 수 있고, 일반 방식 또는 조직-특이적 방식으로 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 신경교 세포에서 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드의 발현을 유도하도록 사용될 수 있는 조직-특이적 프로모터의 예는, 제한 없이, GFAP, NG2, Olig2, CAG, EF1a, Aldh1L1 및 CMV 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "작동 가능하게 연결된"은 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 허용하거나 용이하게 하는 방식으로 핵산에 대한 벡터에서의 조절 요소의 배치를 지칭한다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 신경교-특이적 GFAP 프로모터 및 NeuroD1 폴리펩타이드 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다. 이 경우에, GFAP 프로모터는 이것이 신경교 세포에서 전사를 유도하도록 NeuroD1 폴리펩타이드 또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다.
NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 또한 비바이러스 벡터를 사용하여 포유류에게 투여될 수 있다. 핵산 전달에 비바이러스 벡터를 사용하는 방법은 다른 곳에 기재되어 있다. 예를 들어, Jeffrey R. Morgan에 의해 편집된 Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), Humana Press, Totowa, NJ (2002)를 참조한다. 예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 플라스미드)의 직접 주사에 의해, 또는 지질, 중합체 또는 나노구와 복합체화된 핵산 분자를 투여함으로써 포유류에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas9-매개된 유전자 편집과 같은 게놈 편집 기법은 내인성 NeuroD1 및/또는 Dlx2 유전자 발현을 활성화하도록 사용될 수 있다.
NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은, 제한 없이, 일반 분자 클로닝, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 화학 핵산 합성 기법, 및 이러한 기법의 조합을 포함하는 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, PCR 또는 RT-PCR은 NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(예를 들어, 게놈 DNA 또는 RNA)을 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 사용될 수 있다.
일부 경우에, NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드는 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산에 부가하여 또는 이것 대신에 투여될 수 있다. 예를 들어, NeuroD1 폴리펩타이드 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드는 뇌 내의 신경교 세포가 살아 있는 포유류의 뇌로 기능적으로 통합될 수 있는 GABA성 뉴런을 형성하게 촉발하도록 포유류에게 투여될 수 있다.
NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드(또는 NeuroD1 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드)를 발현하도록 설계된 핵산은 나노입자 및/또는 약물 정제, 캡슐 또는 환제로 직접적인 두개내 주사, 선조체로의 직접 주사, 복강내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 척추강내 투여, 대뇌내 투여, 뇌실질내 투여 또는 경구 전달을 통해 뇌 내의 신경교 세포(예를 들어, 선조체 내의 신경교 세포)에 전달될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "AAV 입자"라는 용어는 핵산 게놈을 세포에 전달하는 AAV 바이러스의 패키징된 캡시드 형태를 지칭한다.
일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 AAV 벡터에 의해 암호화된 AAV 입자를 포함하는 조성물은 1010개 AAV 입자/mL 내지 1014개 AAV 입자/mL의 농도로 주사된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 AAV 벡터에 의해 암호화된 AAV 입자를 포함하는 조성물은 1010개 AAV 입자/mL 내지 1011개 AAV 입자/mL, 1010개 AAV 입자/mL 내지 1012개 AAV 입자/mL, 1010개 AAV 입자/mL 내지 1013개 AAV 입자/mL, 1011개 AAV 입자/mL 내지 1012개 AAV 입자/mL, 1011개 AAV 입자/mL 내지 1013개 AAV 입자/mL, 1011개 AAV 입자/mL 내지 1014개 AAV 입자/mL, 1012개 AAV 입자/mL 내지 1013개 AAV 입자/mL, 1012개 AAV 입자/mL 내지 1014개 AAV 입자/mL, 또는 1013개 AAV 입자/mL 내지 1014개 AAV 입자/mL의 농도로 주사된다. 본원에 기재된 것과 같이, NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드(또는 NeuroD1 및/또는 Dlx2 폴리펩타이드)를 발현하도록 설계된 핵산은 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여되고, 포유류를 치료하도록 사용될 수 있다. 일부 경우에, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(또는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및/또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)를 발현하도록 설계된 핵산은 본원에 기재된 것과 같이 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있고, 포유류를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 아데노-연관된 바이러스 벡터는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계될 수 있고, 설계된 바이러스 벡터는 포유류를 치료하기 위해 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
일부 경우에, 아미노산 서열이 1개 내지 10개(예를 들어, 10개, 1개 내지 9개, 2개 내지 9개, 1개 내지 8개, 2개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 2개 또는 1개)의 아미노산 부가, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 함유한다는 점을 제외하고는 서열 번호 1에 기재된 전체 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1개 내지 10개의 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 서열 번호 1에 기재된 전체 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산(또는 폴리펩타이드 자체)이 헌팅턴병을 치료하기 위해 설계되고 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
일부 경우에, 아미노산 서열이 1개 내지 10개(예를 들어, 10개, 1개 내지 9개, 2개 내지 9개, 1개 내지 8개, 2개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 2개 또는 1개)의 아미노산 부가, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 함유한다는 점을 제외하고는 서열 번호 2에 기재된 전체 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1개 내지 10개의 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 서열 번호 2에 기재된 전체 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산(또는 폴리펩타이드 자체)이 헌팅턴병을 치료하기 위해 설계되고 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 다른 예에서, 1개 내지 10개의 아미노산 부가, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 갖는 서열 번호 1에 기재된 전체 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 1개 내지 10개의 아미노산 부가, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 갖는 서열 번호 2에 기재된 전체 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산이 헌팅턴병을 치료하기 위해 설계되고 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2에 기재된 임의의 적절한 아미노산 잔기가 결실될 수 있고, 임의의 적절한 아미노산 잔기(예를 들어, 임의의 20개의 종래의 아미노산 잔기 또는 임의의 다른 유형의 아미노산, 예컨대 오르니틴 또는 시트룰린)는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2에 기재된 서열 내에 부가되거나 치환될 수 있다. 대부분의 자연 발생 아미노산은 L-아미노산이고, 자연 발생 폴리펩타이드는 주로 L-아미노산으로 이루어진다. D-아미노산은 L-아미노산의 거울상이성질체이다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩타이드는 하나 이상의 D-아미노산을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩타이드는 ε-아미노헥산산; 하이드록실화된 아미노산, 예컨대 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, (5R)-5-하이드록시-L-리신, 알로-하이드록시리신 및 5-하이드록시-L-노르발린; 또는 글리코실화된 아미노산, 예컨대 모노사카라이드를 함유하는 아미노산(예를 들어, D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코사민 및 D-갈락토사민) 또는 모노사카라이드의 조합과 같은 화학 구조를 함유할 수 있다.
아미노산 치환은, 일부 경우에, (a) 치환의 부위에서의 펩타이드 골격의 구조, (b) 특정 부위에서의 분자의 전하 또는 소수화도, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 데 있어서의 이의 효과가 유의미하게 다르지 않은 치환을 선택함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 잔기는 측쇄 특성에 기초하여 그룹으로 나눠질 수 있다: (1) 소수성 아미노산(노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신); (2) 중성 친수성 아미노산(시스테인, 세린 및 트레오닌); (3) 산성 아미노산(아스파르트산 및 글루탐산); (4) 염기성 아미노산(아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신 및 아르기닌); (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 아미노산(글리신 및 프롤린); 및 (6) 방향족 아미노산(트립토판, 티로신 및 페닐알라닌). 이 그룹 내에 이루어진 치환은 보존적 치환으로 여겨질 수 있다. 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2에 대해 본원에 사용될 수 있는 치환의 비제한적인 예는, 제한 없이, 알라닌에 대한 발린의 치환, 아르기닌에 대한 리신의 치환, 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환, 아스파르트산에 대한 글루탐산의 치환, 시스테인에 대한 세린의 치환, 글루타민에 대한 아스파라긴의 치환, 글루탐산에 대한 아스파르트산의 치환, 글리신에 대한 프롤린의 치환, 히스티딘에 대한 아르기닌의 치환, 이소류신에 대한 류신의 치환, 류신에 대한 이소류신의 치환, 리신에 대한 아르기닌의 치환, 메티오닌에 대한 류신의 치환, 페닐알라닌에 대한 류신의 치환, 프롤린에 대한 글리신의 치환, 세린에 대한 트레오닌의 치환, 트레오닌에 대한 세린의 치환, 트립토판에 대한 티로신의 치환, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환 및/또는 발린에 대한 류신의 치환을 포함한다. 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2 내의 임의의 적절한 위치에서 이루어질 수 있는 보존적 치환의 추가의 예는 표 1에 기재되어 있다.
일부 경우에, 폴리펩타이드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하도록 설계될 수 있고, 단 이것은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 통상적으로 다른 종류의 구성원에 대해 상기 기재된 종류 중 하나의 구성원을 교환하는 것을 수반한다. 아미노산 변경이 기능적 폴리펩타이드를 야기하는지는, 예를 들어 본원에 개시된 방법을 사용하여, 폴리펩타이드의 특이적 활성을 평가함으로써 결정될 수 있다.
일부 경우에, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99.0%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖되, 서열 번호 1과 관련하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 부가, 결실 또는 치환)를 포함하는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 90% 내지 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산(또는 폴리펩타이드 자체)이 헌팅턴병을 치료하기 위해 설계되고 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
일부 경우에, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99.0%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖되, 서열 번호 2와 관련하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 부가, 결실 또는 치환)를 포함하는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 90% 내지 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 NeuroD1 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산(또는 폴리펩타이드 자체)이 헌팅턴병을 치료하기 위해 설계되고 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 다른 예에서, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 90% 내지 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 90% 내지 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 발현하도록 설계된 핵산(또는 폴리펩타이드 자체)이 헌팅턴병을 치료하기 위해 설계되고 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
정렬된 아미노산 서열에서의 일치된 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 정렬된 아미노산의 총 수로 나누고, 100을 곱해 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 일치된 위치는 정렬된 아미노산 서열에서 동일한 위치에서 동일한 아미노산이 발생하는 위치를 지칭한다. 퍼센트 서열 동일성은 또한 임의의 핵산 서열에 대해 결정될 수 있다.
특정 핵산 또는 아미노산 서열과 특정 서열 확인 번호(예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2)에 의해 언급되는 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 하기와 같이 결정된다. 처음에, 핵산 또는 아미노산 서열을 BLASTN 버전 2.0.14 및 BLASTP 버전 2.0.14를 함유하는 BLASTZ의 독립형 버전으로부터의 BLAST 2 Sequences(Bl2seq) 프로그램을 사용하여 특정 서열 확인 번호에 기재된 서열과 비교한다. BLASTZ의 이 독립형 버전은 fr.com/blast 또는 ncbi.nlm.nih.gov에서 온라인으로 얻어질 수 있다. Bl2seq 프로그램을 어떻게 사용할지를 설명하는 지시사항은 BLASTZ를 수반하는 readme 파일에서 발견될 수 있다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘 중 어느 하나를 사용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하도록 사용되지만, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하도록 사용된다. 2개의 핵산 서열을 비교하기 위해, 옵션은 하기와 같이 설정된다: -i는 비교되는 제1 핵산 서열을 함유하는 파일(예를 들어, C:\seq1.txt)에 설정되고; -j는 비교되는 제2 핵산 서열을 함유하는 파일(예를 들어, C:\seq2.txt)에 설정되고; -p는 blastn에 설정되고; -o는 임의의 원하는 파일명(예를 들어, C:\output.txt)에 설정되고; -q는 -1에 설정되고; -r은 2에 설정되고; 모든 다른 옵션은 이의 디폴트 설정에 남아 있다. 예를 들어, 하기 명령은 2개의 서열 사이의 비교를 함유하는 출력 파일을 생성하도록 사용될 수 있다: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. 2개의 아미노산 서열을 비교하기 위해, Bl2seq의 옵션은 하기와 같이 설정된다: -i는 비교되는 제1 아미노산 서열을 함유하는 파일(예를 들어, C:\seq1.txt)에 설정되고; -j는 비교되는 제2 아미노산 서열을 함유하는 파일(예를 들어, C:\seq2.txt)에 설정되고; -p는 blastp에 설정되고; -o는 임의의 원하는 파일명(예를 들어, C:\output.txt)에 설정되고; 모든 다른 옵션은 이의 디폴트 설정에 남아 있다. 예를 들어, 하기 명령은 2개의 아미노산 서열 사이의 비교를 함유하는 출력 파일을 생성하도록 사용될 수 있다: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. 2개의 비교된 서열이 상동성을 공유하면, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열과의 상동성의 영역을 제시할 것이다. 2개의 비교된 서열이 상동성을 공유하지 않으면, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열을 제시하지 않을 것이다.
정렬되면, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 계수하여 일치의 수가 결정된다. 퍼센트 서열 동일성은 일치의 수를 확인된 서열에 기재된 서열(예를 들어, 서열 번호 1)의 길이에 의해 나눈 후, 생성된 값에 100을 곱해 결정된다. 예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 서열과 정렬될 때 340개의 일치를 갖는 아미노산 서열은 서열 번호 1에 기재된 서열과 95.5% 동일하다(즉, 340 ÷ 356 x 100 = 95.5056). 퍼센트 서열 동일성 값이 소수점 첫째 자리에서 반올림된다는 점이 주목된다. 예를 들어, 75.11, 75.12, 75.13 및 75.14는 75.1로 반내림되는 반면, 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 및 75.19는 75.2로 반올림된다. 길이 값이 항상 정수일 수 있다는 것이 또한 주목된다.
(예를 들어, 뇌 내의 하나 이상의 성상교세포가 GABA성 MSN을 형성하게 촉발함으로써) 본원에 기재된 것과 같이 헌팅턴병을 갖는 살아 있는 포유류(예를 들어, 인간)의 뇌 내에 뉴런을 생성할 때, 생성된 뉴런은 임의의 적절한 유형의 뉴런일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런은 PV 양성 뉴런을 닮을 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런은 MSN일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런은 DARPP32-양성일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런은 살아 있는 포유류의 뇌 내의 먼 표적(예를 들어, 선조체 밖의 표적)으로 연장될 수 있는 하나 이상의 축삭 돌기를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런이 살아 있는 포유류의 뇌 내의 먼 표적으로 연장된 하나 이상의 축삭 돌기를 가질 때, 먼 표적은 원래의 뉴런 축삭이 뇌 발생 동안 도달하는 데까지일 수 있다. 일부 경우에, 새로 생성된 뉴런은 원래의 액손 경로를 따를 수 있다.
본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런이 살아 있는 포유류의 뇌 내의 먼 표적(예를 들어, 선조체 밖의 표적)으로 연장될 수 있는 하나 이상의 축삭 돌기를 가질 때, 먼 표적은 포유류의 뇌 내의 임의의 적절한 위치일 수 있다. 본원에 기재된 것과 같이 생성된 뉴런으로부터의 하나 이상의 축삭 돌기가 연장할 수 있는 살아 있는 포유류의 뇌 내의 먼 표적의 예는, 제한 없이, 살아 있는 포유류의 뇌 내의 SNr, GP(예를 들어, 외부 GP), 시상, 시상하부, 편도체 및/또는 피질을 포함한다.
본원에 기재된 것과 같은 선조체에서의 신경교 세포 및/또는 뉴런 내의 하나 이상의 Htt 대립유전자를 편집하도록 설계된 유전자 치료 성분(예를 들어, 유전자 편집 성분)은 임의의 적절한 유전자 치료 성분일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 편집 성분은 핵산(예를 들어, 표적화 서열 및 공여자 핵산)일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 편집 성분은 폴리펩타이드(예를 들어, 뉴클레아제)일 수 있다. 일부 경우에, 편집된 또는 생성된 Htt 대립유전자가 36개 미만의 CAG 반복부를 함유하도록 그리고/또는 편집된 또는 생성된 Htt 대립유전자가 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드를 발현할 수 없도록 하나 이상의 Htt 대립유전자를 변형시키도록 설계된 유전자 치료 성분은 포유류를 치료하기 위해 유전자 치료(예를 들어, 유전자 대체 또는 유전자 편집)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 포유류)는 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 설계된 뉴클레아제, 표적화 서열 및 선택적으로 공여자 핵산을 포유류에 투여함으로써 치료될 수 있다. 일부 경우에, 포유류에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자를 변형시키도록 설계된 뉴클레아제, 표적화 서열 및/또는 공여자 핵산은 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 전환된 뉴런)에 존재하는 CAG 반복부의 수를 감소시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유류에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에 존재하는 CAG 반복부의 수를 변형시키도록 설계된 뉴클레아제, 표적화 서열 및/또는 공여자 핵산은 포유류의 뇌 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부(예를 들어, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개 또는 이것 미만의 CAG 반복부)로 감소시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유류에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에 존재하는 CAG 반복부의 수를 변형시키도록 설계된 뉴클레아제, 표적화 서열 및 공여자 핵산은 포유류의 뇌 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 CAG 반복부의 수를 약 27개의 CAG 반복부 내지 약 35개의 CAG 반복부인 CAG 반복부의 수로 감소시키도록 사용될 수 있다. 일부 경우에, 헌팅턴병을 갖는 포유류에 존재하는 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 변형된 Htt 유전자는 기능적 HTT 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
일부 경우에, 포유류의 선조체 내의 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자(또는 이의 전사된 HTT RNA 또는 번역된 HTT 폴리펩타이드)를 변형시키도록 설계된 (공여자 핵산을 갖거나 갖지 않는) 뉴클레아제 및 표적화 서열은 이 신경교 세포 및/또는 뉴런에 의해 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드의 발현을 감소시키거나 방지하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 설계된 뉴클레아제 및 표적화 서열(및 선택적으로, 공여자 핵산)은 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 편집된 또는 생성된 Htt 대립유전자를 생성시키도록 사용될 수 있다. 이러한 편집된 또는 생성된 Htt 대립유전자의 예는, 제한 없이, 암호화된 헌팅틴 폴리펩타이드의 발현을 낮추는 변경된 프로모터 또는 인핸서를 갖는 Htt 대립유전자, 암호화된 헌팅틴 폴리펩타이드의 발현을 생성시키지 않는 변경된 프로모터 또는 인핸서를 갖는 Htt 대립유전자, CAG 반복부 영역의 상류에 존재하는 정지 코돈을 갖는 Htt 대립유전자, 하나 이상의 엑손이 결여된(예를 들어, CAG 반복부를 암호화하는 엑손이 결여된) Htt 대립유전자, HTT 발현을 감소시키거나 방지하도록 Htt 대립유전자에서 프레임 쉬프트 또는 분절 결실을 갖는 Htt 대립유전자, 및 직접 결합 또는 간접 결합을 통해 HTT RNA 또는 HTT 폴리펩타이드를 직접 감소시키는 부가된 표적 서열을 함유하는 Htt 대립유전자를 포함한다.
인간과 같은 이배체 포유류는 게놈에 존재하는 각각의 유전자의 2개의 카피를 갖는다. 일부 경우에, 헌팅턴병을 갖는 포유류는 포유류의 뇌 내의 하나 이상의 뉴런에 존재하는 Htt 유전자의 카피 둘 다에 존재하는 36개 초과의 CAG 반복부(예를 들어, 헌팅턴병에 동형접합성일 수 있음)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 헌팅턴병을 갖는 포유류는 포유류의 뇌 내의 하나 이상의 뉴런에 존재하는 Htt 유전자의 하나의 카피에 존재하는 36개 초과의 CAG 반복부(예를 들어, 헌팅턴병에 이형접합성일 수 있음)를 가질 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 재료가 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에 존재하는 하나 이상의 Htt 대립유전자를 변형(예를 들어, Htt 유전자에 존재하는 CAG 반복부의 수를 변형)시키는 것을 포함할 때, 포유류에 존재하는 Htt 유전자의 하나 또는 둘 다의 카피가 변형될 수 있다. 헌팅턴병을 갖는 포유류가 헌팅턴병에 동형접합성인 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 36개 초과의 CAG 반복부를 포함하는 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 이상의 뉴런에 존재하는 Htt 유전자의 카피 둘 다를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 헌팅턴병을 갖는 포유류가 헌팅턴병에 이형접합성인 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 36개 초과의 CAG 반복부를 포함하는 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 이상의 뉴런에 존재하는 Htt 유전자의 카피를 오직 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat) / CRISPR-연관된(Cas) 뉴클레아제(CRISPR/Cas) 기법은 생성된 대립유전자가 36개 미만의 CAG 반복부를 갖도록 그리고/또는 생성된 대립유전자가 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드를 발현할 수 없도록 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자를 대체하거나 편집하도록 사용될 수 있다.
임의의 적절한 유전자 치료 기법은 포유류의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자를 변형시키도록 사용될 수 있다. 포유류의 뇌 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용될 수 있는 유전자 치료 기법의 예는, 제한 없이, 유전자 대체(예를 들어, 상동성 재조합 또는 상동성-직접 보수를 사용), 유전자 편집, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 마이크로RNA를 포함한다.
일부 경우에, 유전자 대체는 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내의 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, CAG 영역을 포함하고 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산은 신경교 세포(들) 및/또는 뉴런(들)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다의 해로운 CAG 영역을 대체하도록 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 뉴런으로 도입될 수 있다. 일부 경우에, CAG 영역을 포함하고 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산은, 게놈으로 통합될 때(예를 들어, 포유류에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자로 인프레임 통합될 때), 핵산이 기능적 HTT 폴리펩타이드를 암호화할 수 있도록, 신경교 세포 및/또는 뉴런의 게놈으로 공여자 핵산을 통합하도록 신경교 세포 및/또는 뉴런으로 도입될 수 있다.
일부 경우에, 공여자 핵산은 폴리-글루타민 영역 및 폴리-글루타민 영역의 하류에 아미노산 서열이 결여된 절두된 헌팅틴 폴리펩타이드를 암호화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 공여자 핵산은 CAG 반복부 영역의 상류에 정지 코돈을 포함하도록 설계될 수 있다.
공여자 핵산(예를 들어, CAG 영역을 포함하고 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산)은 핵산의 임의의 적절한 형태일 수 있다. 예를 들어, CAG 영역을 포함하고 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산은 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)일 수 있다. 공여자 핵산을 신경교 세포 및/또는 뉴런에 투여하기 위한 유전자 대체 또는 유전자 편집 벡터로서 사용될 수 있는 벡터의 예는, 제한 없이, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터(예를 들어, 이중 AAV 벡터 또는 삼중 AAV 벡터), 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 폭스바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 공여자 핵산은 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
변형된 Htt 대립유전자 서열(예를 들어, CAG 영역 및 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 Htt 유전자의 단편)에 부가하여, 공여자 핵산은 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에 공여자 핵산을 표적화하기 위한 하나 이상의 요소(예를 들어, 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 하나 이상의 표적화 서열)를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 서열은 상동성 아암일 수 있다. 예를 들어, 공여자 핵산(예를 들어, CAG 영역을 포함하고 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산)은 공여자 핵산을 Htt 유전자에 지향시키거나 추가로 지향시킬 수 있는 각각의 말단에서(예를 들어, 3' 말단에서 및 5' 말단에서) 상동성의 영역(예를 들어, 상동성 아암)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 공여자 핵산의 일 말단(예를 들어, 3' 말단)에서의 상동성 아암은 신경교 세포 및/또는 뉴런 내의 Htt 유전자의 상류에 게놈 영역에 상동성일 수 있고, 공여자 핵산의 다른 말단(예를 들어, 5' 말단)에서의 상동성 아암은 신경교 세포 및/또는 뉴런 내의 Htt 유전자의 하류에 게놈 영역에 상동성일 수 있다. 상동성 아암은 임의의 적절한 크기일 수 있다. 일부 경우에, 상동성 아암은 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 2500개의 뉴클레오타이드 크기일 수 있다. 일부 경우에, 상동성 아암은 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 2000개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, 상동성 아암은 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 1500개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, 상동성 아암은 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, 상동성 아암은 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 500개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
공여자 핵산(예를 들어, CAG 영역을 포함하고 이 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산)은 임의의 적절한 방법을 사용하여 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)으로 도입될 수 있다. 공여자 핵산을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하는 방법은 물리적 방법일 수 있다. 공여자 핵산을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하는 방법은 화학적 방법일 수 있다. 공여자 핵산을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하는 방법은 생물학적 방법일 수 있다. 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 공여자 핵산(예를 들어, CAG 영역을 포함하고 그 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산)을 도입하는 방법은 입자-기반 방법일 수 있다. 공여자 핵산을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법의 예는, 제한 없이, 전기천공, 유체역학적 전달, 형질주입(예를 들어, 리포펙션), 형질도입(예를 들어, 바이러스 벡터 매개된 형질도입), 지질 나노입자, 리포플렉스, 세포 침투 펩타이드, DNA 나노클루(nanoclew), 금 나노입자, 오스모사이토시스 및 프로판베타인에 의한 유도 형질도입(iTOP: induced transduction by osmocytosis and propanebetaine), 미량주사, 정맥내 주사, 근육내 주사 및 비강내 스프레이를 포함한다. 일부 경우에, 공여자 핵산은 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 형질도입될 수 있다.
일부 경우에, (예를 들어, 조작된 뉴클레아제에 의한) 유전자 편집은 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 하나 이상의 Htt 대립유전자를 변형시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집은 뉴클레아제, 표적화 서열(예를 들어, 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 핵산 서열) 및 선택적으로 공여자 핵산(예를 들어, 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 CAG 영역을 갖는 공여자 Htt 유전자의 단편 및/또는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드의 발현을 감소시키거나 방지하는 변형을 적어도 포함하는 핵산)을 포함할 수 있다. 게놈 편집에 유용한 뉴클레아제는, 제한 없이, Cas 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기(TALE) 뉴클레아제(TALEN) 및 호밍 엔도뉴클레아제(HE; 메가뉴클레아제로도 칭함)를 포함한다. 표적화 서열은 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포)및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 게놈 내의 특정 표적 서열(예를 들어, 하나 또는 둘 다의 이상의 Htt 유전자 내의 표적)에 뉴클레아제를 지향시키도록 사용될 수 있다.
일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템은 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 유전자 하나 또는 둘 다에 존재하는 CAG 반복부의 수를 변형시키도록 사용될 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 신경교 세포로 도입될 수 있다).
CRISPR/Cas 분자는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열(예를 들어, NGG)의 약 3개 내지 4개의 뉴클레오타이드 상류에 이중 가닥 절단(DSB)을 생성시키는 핵산 절단을 지향시키도록 RNA 염기 페어링을 사용하여 진핵 RNA 간섭에 기능적으로 유사한 원핵 적응 면역계의 성분이다. 핵산 DSB를 CRISPR/Cas 시스템에 의해 지향시키는 것은 Cas 뉴클레아제 및 표적 DNA 서열을 절단하도록 Cas를 지향시키는 가이드 RNA(gRNA) 표적화 서열의 2개의 성분을 요한다(Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 9(6):467-477 (2011); 및 Jinek et al., Science, 337(6096):816-821 (2012)). CRISPR/Cas 시스템은 다른 곳에 기재된 것처럼 박테리아, 효모, 인간 및 제브라피시에서 사용될 수 있다(예를 들어, Jiang et al., Nat Biotechnol, 31(3):233-239 (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res, doi:10.1093/nar/gkt135, 2013; Cong et al., Science, 339(6121):819-823 (2013); Mali et al., Science, 339(6121):823-826 (2013); Cho et al., Nat Biotechnol, 31(3):230-232 (2013); 및 Hwang et al., Nat Biotechnol, 31(3):227-229 (2013)을 참조한다).
일부 경우에, 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용된 CRISPR/Cas 시스템은 임의의 적절한 gRNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, gRNA는 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성일 수 있다.
일부 경우에, 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용된 CRISPR/Cas 시스템은 임의의 적절한 Cas 뉴클레아제를 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제의 예는, 제한 없이, Cas1, Cas2, Cas3, Cas9, Cas10 및 Cpf1을 포함한다. 일부 경우에, 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에 존재하는 CAG 반복부의 수를 변형시키도록 설계된 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 성분은 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 CRISPR/Cas9 시스템의 Cas9 뉴클레아제는 lentiCRISPRv2일 수 있다(예를 들어, Shalem et al., 2014 Science 343:84-87; 및 Sanjana et al., 2014 Nature methods 11: 783-784를 참조한다).
일부 경우에, TALEN 시스템은 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용될 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 신경교 세포로 도입될 수 있다). 전사 활성인자-유사(TAL) 효과기는 잔토모나스 속의 식물 병원성 박테리아에서 발견된다. 이 단백질은 질환에서 중요한 역할을 하거나, 숙주 DNA를 결합시키고 효과기-특이적 숙주 유전자를 활성화함으로써 방어를 촉발한다(예를 들어, Gu et al., Nature 435:1122-1125, 2005; Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:10503-10508, 2006; Kay et al., Science 318:648-651, 2007; Sugio et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:10720-10725, 2007; 및 
et al., Science 318:645-648, 2007을 참조한다). 특이성은 효과기-불완전한, 통상적으로 34개 아미노산 반복부의 가변 수에 따라 달라진다(Schornack et al., J Plant Physiol 163:256-272, 2006; 및 WO 2011/072246). 다형은 주로 반복 위치 12 및 13에 존재하고, 이것은 반복 가변-이잔기(RVD)로 지칭된다. TAL 효과기의 RVD는 약간의 축퇴성을 가지며 명확한 맥락 의존성 없이 직접적인 선형 방식으로 1개의 RVD는 1개의 뉴클레오타이드로 이의 표적 부위에서 뉴클레오타이드에 상응한다. 단백질-DNA 인식에 대한 이 기전이 표적 부위 선택 및 선택된 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 새로운 TALEN의 조작이 가능하게 한다. 예를 들어, 조작된 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 표적화 서열은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 의해 표적화된 서열에서 또는 그 근처에서 핵산 DSB를 생성할 수 있는 TALEN을 생성하도록 뉴클레아제에 융합될 수 있다. 핵산 DSB를 TALEN 시스템에 의해 지향시키는 것은 뉴클레아제 및 뉴클레아제를 표적 DNA 서열로 지향시키는 TAL 효과기 DNA-결합 도메인의 2개의 성분을 요한다(예를 들어, Schornack et al., J. Plant Physiol. 163:256, 2006을 참조한다).
포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용된 TALEN 시스템은 임의의 적절한 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레아제는 비특이적 뉴클레아제일 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레아제는 이합체로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 이합체로서 작용하는 뉴클레아제가 사용될 때, 고도로 부위-특이적인 제한 효소가 생성될 수 있다. 예를 들어, 각각의 뉴클레아제 단량체는 상이한 DNA 표적 서열을 인식하는 TAL 효과기 서열에 융합될 수 있고, 2개의 인식 부위가 가깝게 근접할 때만 불활성 단량체가 함께 합해져 기능적 효소를 생성한다. 본원에 기재된 TALEN 시스템에 사용될 수 있는 뉴클레아제의 예는, 제한 없이, FokI, HhaI, HindIII, NotI, BbvCI, EcoRI, BglI 및 AlwI를 포함한다. 예를 들어, TALEN 시스템의 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제를 포함할 수 있다(예를 들어, Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160을 참조한다).
포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용된 TALEN 시스템은 임의의 적절한 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, TAL 효과기 DNA-결합 도메인은 포유류에 존재하는 Htt 유전자에 상보성일 수 있다.
유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 TALEN 시스템)이 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용될 때, 상기 시스템은 선택적으로 공여자 핵산(예를 들어, CAG 영역을 포함하고 이 영역에서 36개 미만의 CAG 반복부를 갖는 Htt 유전자의 단편을 포함하는 공여자 핵산)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공여자 핵산의 존재 하에, 유전자 편집 시스템은 변형된 Htt 유전자(들)가 포유류의 뇌 내에 기능적 HTT 폴리펩타이드를 암호화할 수 있도록 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자를 변형시킬 수 있다. 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용된 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 TALEN 시스템)의 성분은 임의의 적절한 형식으로 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 성분은 gRNA를 암호화하는 핵산 및/또는 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 핵산으로서 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 gRNA(예를 들어, 포유류에 존재하는 Htt 유전자에 특이적인 gRNA 서열)를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 뉴클레아제)를 암호화하는 핵산은 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. 일부 경우에, CRISPR/Cas 시스템의 성분은 gRNA 및/또는 Cas 뉴클레아제로서 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 gRNA(예를 들어, 포유류에 존재하는 Htt 유전자에 특이적인 gRNA 서열) 및 적어도 하나의 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 뉴클레아제)는 하나 이상의 신경교 세포로 도입될 수 있다. 일부 경우에, TALEN은 TALEN을 암호화하는 핵산으로서 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. 일부 경우에, TALEN은 TALEN 폴리펩타이드로서 하나 이상의 신경교 세포로 도입될 수 있다.
일부 경우에, 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 TALEN 시스템)의 성분이 그 성분을 암호화하는 핵산(예를 들어, gRNA를 암호화하는 핵산 및 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, 또는 TALEN을 암호화하는 핵산)으로서 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)로 도입될때, 핵산은 임의의 적절한 형태일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 작제물(예를 들어, 발현 작제물)일 수 있다. 유전자 편집 시스템이 CRISPR/Cas 시스템일 때, 적어도 하나의 gRNA를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 별개의 핵산 작제물 또는 동일한 핵산 작제물에 있을 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 gRNA를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 단일 핵산 작제물에 있을 수 있다. 핵산 작제물은 임의의 적절한 유형의 핵산 작제물일 수 있다. 유전자 편집 시스템의 적어도 하나의 성분을 발현하도록 사용될 수 있는 핵산 작제물의 예는, 제한 없이, 발현 플라스미드 및 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 포함한다. 유전자 편집 시스템이 CRISPR/Cas 시스템일 때, 그리고 적어도 하나의 gRNA를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 핵산이 별개의 핵산 작제물에 있는 경우에, 핵산 작제물은 동일한 유형의 작제물 또는 상이한 유형의 작제물일 수 있다.
일부 경우에, 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 TALEN 시스템)의 하나 이상의 성분은 폴리펩타이드로서 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)으로 직접 도입될 수 있다. 유전자 편집 시스템이 CRISPR/Cas 시스템일 때, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 별개로 또는 함께 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. gRNA 및 Cas 뉴클레아제가 함께 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입되는 경우에, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 복합체로 있을 수 있다. gRNA 및 Cas 뉴클레아제가 복합체일 때, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 공유로 또는 비공유로 부착될 수 있다.
포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 Htt 대립유전자 하나 또는 둘 다를 변형시키도록 사용된 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 TALEN 시스템)의 성분은 임의의 적절한 방법을 사용하여 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 수 있다. 유전자 편집 시스템의 성분을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하는 방법은 물리적 방법일 수 있다. 유전자 편집 시스템의 성분을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하는 방법은 화학적 방법일 수 있다. 유전자 편집 시스템의 성분을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하는 방법은 입자-기반 방법일 수 있다. 유전자 편집 시스템의 성분을 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법의 예는, 제한 없이, 전기천공, 유체역학적 전달, 형질주입(예를 들어, 리포펙션), 형질도입(예를 들어, 바이러스 벡터 매개된 형질도입), 지질 나노입자, 리포플렉스, 세포 침투 펩타이드, DNA 나노클루, 금 나노입자, 오스모사이토시스 및 프로판베타인에 의한 유도 형질도입(iTOP) 및 미량주사를 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템의 성분이 그 성분을 암호화하는 핵산으로서 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 도입될 때, 그 성분을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런으로 형질도입될 수 있다.
일부 경우에, 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)는 함께 단일 치료로서 또는 상이한 시간에 2 이상의 치료로서 신경교 세포를 뉴런으로 전환하고, CAG 반복부를 보정하는 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
일부 경우에, 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)는 함께 단일 치료로서 또는 상이한 시간에 2 이상의 치료로서 신경교 세포를 뉴런으로 전환하고, 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 갖는 헌팅틴 폴리펩타이드를 발현하는 Htt 대립유전자를 탈활성화하는 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 치료는 적어도 연속 2일 또는 2주 동안 적어도 1일 1회 또는 적어도 1주 1회 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 치료는 적어도 연속 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일, 또는 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 15주 동안 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 치료는 적어도 연속 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 동안 적어도 1일 1회 또는 적어도 1주 1회 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 치료는 최대 연속 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일, 또는 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주 또는 20주 동안 적어도 1일 1회 또는 적어도 1주 1회 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 치료는 최대 연속 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주, 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 동안 적어도 1주 1회 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 것과 같은 치료는 적어도 연속 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월, 또는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년 또는 12년, 만성적으로는 대상체의 전생애 또는 무기한 기간 동안 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 헌팅턴병의 진행을 느리게 하거나 지연시키거나 역전시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 재료는 헌팅턴병의 하나 이상의 증상의 발생을 지연시키고/시키거나 헌팅턴병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 제거한다. 일부 경우에, 조합으로 새로운 기능적 뉴런의 재생 및 Htt 대립유전자의 편집은 헌팅턴병의 하나 이상의 증상의 발생의 지연 및/또는 헌팅턴병의 하나 이상의 증상의 감소 또는 제거에 대한 상승 효과를 갖는다.
헌팅턴병 진행의 느려짐, 지연 또는 역전을 평가하는 시험의 예는 통합 헌팅턴병 평가 척도(UHDRS: unified Huntington's disease rating scale) 점수, UHDRS 총 기능 수행능력(TFC: Total Functional Capacity), UHDRS 기능 평가, UHDRS 보행 점수, UHDRS 총 운동 점수(TMS: Total Motor Score), 해밀턴 우울증 척도(HAM-D: Hamilton depression scale), 콜롬비아-자살 중증도 평가 척도(C-SSRS: Columbia-suicide severity rating scale), 몬트리올 인지 평가(MoCA: Montreal cognitive assessment), MRI, fMRI 및 PET 스캔을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 증상은 약 10% 내지 약 99%, 또는 이것 초과만큼 느려지거나 지연될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 느려지거나 지연될 수 있다.
일부 경우에, 증상은 치료일에, 치료 후 1일에, 치료 후 3개월에, 치료 후 6개월에, 치료 후 1년에 그리고 치료 후 이후에는 매년 평가될 수 있다.
일부 경우에, 증상은 치료 후 1일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 치료 후 1일 내지 치료 후 2일, 치료 후 1일 내지 치료 후 3일, 치료 후 1일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 3일, 치료 후 2일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 4일, 치료 후 3일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 5일, 치료 후 4일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 7일, 치료 후 5일 내지 치료 후 6일, 치료 후 5일 내지 치료 후 7일, 또는 치료 후 6일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 치료 후 1주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 치료 후 1주 내지 치료 후 2주, 치료 후 1주 내지 치료 후 3주, 치료 후 1주 내지 치료 후 4주, 치료 후 2주 내지 치료 후 3주, 치료 후 2주 내지 치료 후 4주, 또는 치료 후 3주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 치료 후 1개월 내지 치료 후 12개월에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 치료 후 1개월 내지 치료 후 2개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 12개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 12개월, 또는 치료 후 11개월 내지 치료 후 12개월에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 증상은 치료 후 1년 내지 약 치료 후 20년에 평가될 수 있다. 일부 경우에 증상은 치료 후 1년 내지 치료 후 5년, 치료 후 1년 내지 치료 후 10년 , 치료 후 1년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 10년, 치료 후 5년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 20년, 치료 후 10년 내지 치료 후 15년, 치료 후 10년 내지 치료 후 20년, 또는 치료 후 15년 내지 치료 후 20년에 평가될 수 있다.
일부 경우에, 헌팅턴병의 증상은 운동 증상(예를 들어, 하나 이상의 운동 기능의 손상)일 수 있다. 예를 들어, 운동 증상은 불수의 운동의 손상 또는 수의 운동의 손상일 수 있다. 일부 경우에, 헌팅턴병의 증상은 인지 증상일 수 있다. 일부 경우에, 헌팅턴병의 증상은 정신의학적 증상일 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 재료를 사용하여 감소되거나 제거될 수 있는 헌팅턴병의 증상의 예는, 제한 없이, 소근육 운동, 진전, 발작, 무도병, 근긴장이상증, 운동이상증, 느린 또는 비정상 눈 움직임, 보행 손상, 자세 손상, 균형 손상, 담화의 어려움, 연하의 어려움, 조직화의 어려움, 우선시하기의 어려움, 업무 집중의 어려움, 적응성의 결여, 충동 억제의 결여, 폭발, 개인 자체의 행동 및/또는 능력의 지각의 결여, 생각 처리의 느려짐, 새로운 정보 학습의 어려움, 우울증, 성급함, 슬픔 또는 무관심, 사회적 위축, 불면, 피로, 에너지 결여, 강박 장애, 조병, 양극성 장애 및 체중 감소의 변경(예를 들어, 감소 또는 소실)을 포함한다.
일부 경우에, 증상은 약 10% 내지 약 99%, 또는 이것 초과만큼 감소할 수 있다. 일부 경우에, 증상은 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 65%, 약 55% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 75%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 감소할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 재료는 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에서 하나 이상의 운동 기능 결핍을 개선하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 재료는 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에서 하나 이상의 운동 기능 결핍을 구제하도록(예를 들어, 부분적으로 구제하거나 완전히 구제하도록) 사용될 수 있다. 일부 경우에, 조합으로 새로운 기능적 뉴런의 재생 및 Htt 대립유전자의 편집은 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)에서 하나 이상의 운동 기능 결핍의 개선에 대한 상승 효과를 갖는다.
임의의 적절한 방법은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능 결핍을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 체중, 움켜짐 행동, 그립 강도 보행, 손 및 발 이동 및/또는 특정 사지 조정은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능 결핍을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료일에, 치료 후 1일에, 치료 후 3개월에, 치료 후 6개월에, 치료 후 1년에 그리고 치료 후 이후에는 매년 평가될 수 있다.
일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1일 내지 치료 후 2일, 치료 후 1일 내지 치료 후 3일, 치료 후 1일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 3일, 치료 후 2일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 4일, 치료 후 3일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 5일, 치료 후 4일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 7일, 치료 후 5일 내지 치료 후 6일, 치료 후 5일 내지 치료 후 7일, 또는 치료 후 6일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1주 내지 치료 후 2주, 치료 후 1주 내지 치료 후 3주, 치료 후 1주 내지 치료 후 4주, 치료 후 2주 내지 치료 후 3주, 치료 후 2주 내지 치료 후 4주, 또는 치료 후 3주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1개월 내지 치료 후 12개월에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1개월 내지 치료 후 2개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 12개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 12개월, 또는 치료 후 11개월 내지 치료 후 12개월에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1년 내지 약 치료 후 20년에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 운동 기능 결핍은 치료 후 1년 내지 치료 후 5년, 치료 후 1년 내지 치료 후 10년, 치료 후 1년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 10년, 치료 후 5년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 20년, 치료 후 10년 내지 치료 후 15년, 치료 후 10년 내지 치료 후 20년, 또는 치료 후 15년 내지 치료 후 20년에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)의 기대 수명을 연장하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명은 (예를 들어, 본원에 기재된 것과 같이 치료되지 않은 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명과 비교하여) 약 2년 내지 약 20년 또는 이것 초과만큼 연장될 수 있다. 일부 경우에, 조합으로 새로운 기능적 뉴런의 재생 및 Htt 대립유전자의 편집은 헌팅턴병을 갖는 포유류(예를 들어, 인간)의 기대 수명의 연장에 대한 상승 효과를 갖는다. 일부 경우에, 헌팅턴을 갖는 포유류의 기대 수명은 약 2년 내지 약 5년, 약 2년 내지 약 10년, 약 2년 내지 약 15년, 약 5년 내지 10년, 약 5년 내지 약 15년, 약 5년 내지 약 20년, 약 10년 내지 약 15년, 약 10년 내지 약 20년, 또는 약 15년 내지 약 20년 연장될 수 있다. 예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명은 (예를 들어, 본원에 기재된 것과 같이 치료되지 않은 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명과 비교하여) 약 10% 내지 약 60%, 또는 이것 초과만큼 연장될 수 있다. 일부 경우에, 기대 수명은 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 55%, 약 45% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 60%, 또는 약 55% 내지 약 60%만큼 감소할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 포유류(예를 들어, 병헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 위축을 제거하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 재료는 (예를 들어, 본원에 기재된 것과 같이 치료되지 않은 포유류에서의 뉴런 및/또는 본원에 기재된 것과 같이 치료되기 전에 포유류에서의 뉴런과 같은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서의 자연적 뉴런의 위축의 양과 비교하여) 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 이것 초과만큼 헌팅턴병을 갖는 포유류의 뇌 내의 위축의 양을 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 재료는 헌팅턴병을 갖는 포유류의 뇌 내의 위축의 양을 10% 내지 100%, 예컨대 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25%, 15% 내지 30%, 20% 내지 25%, 20% 내지 30%, 20% 내지 35%, 25% 내지 30%, 25% 내지 35%, 25% 내지 40%, 30% 내지 35%, 30% 내지 40%, 35% 내지 45%, 35% 내지 50%, 40% 내지 45%, 40% 내지 50%, 40% 내지 55%, 45% 내지 50%, 45% 내지 55%, 45% 내지 60%, 50% 내지 55%, 50% 내지 60%, 50% 내지 65%, 55% 내지 60%, 55% 내지 65%, 55% 내지 70%, 60% 내지 65%, 60% 내지 70%, 60% 내지 75%, 65% 내지 70%, 65% 내지 75%, 65% 내지 80%, 70% 내지 75%, 70% 내지 80%, 70% 내지 85%, 75% 내지 80%, 75% 내지 85%, 75% 내지 90%, 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100% 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 임의의 적절한 방법은 헌팅턴병을 갖는 포유류의 뇌 내의 위축의 존재, 부재 또는 양을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 니슬(Nissle) 염색, MRI, fMRI 및/또는 PET 스캐닝은 포유류의 뇌 내의 위축의 존재, 부재 또는 양을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료일에, 치료 후 1일에, 치료 후 3개월에, 치료 후 6개월에, 치료 후 1년에 그리고 치료 후 이후에는 매년 평가될 수 있다.
일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1일 내지 치료 후 2일, 치료 후 1일 내지 치료 후 3일, 치료 후 1일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 3일, 치료 후 2일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 4일, 치료 후 3일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 5일, 치료 후 4일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 7일, 치료 후 5일 내지 치료 후 6일, 치료 후 5일 내지 치료 후 7일, 또는 치료 후 6일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1주 내지 치료 후 2주, 치료 후 1주 내지 치료 후 3주, 치료 후 1주 내지 치료 후 4주, 치료 후 2주 내지 치료 후 3주, 치료 후 2주 내지 치료 후 4주, 또는 치료 후 3주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1개월 내지 치료 후 12개월에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양 치료 후 1개월 내지 치료 후 2개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 12개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 12개월, 또는 치료 후 11개월 내지 치료 후 12개월. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1년 내지 약 치료 후 20년에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 위축의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1년 내지 치료 후 5년, 치료 후 1년 내지 치료 후 10년, 치료 후 1년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 10년, 치료 후 5년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 20년, 치료 후 10년 내지 치료 후 15년, 치료 후 10년 내지 치료 후 20년, 또는 치료 후 15년 내지 치료 후 20년에 평가될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 포유류(예를 들어, 헌팅턴병을 갖는 인간)의 뇌(예를 들어, 선조체) 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포(예를 들어, 성상교세포) 및/또는 하나 이상의 뉴런(예를 들어, 성상교세포-전환된 뉴런 및/또는 비전환된 뉴런)에 존재하는 HTT 폴리펩타이드 봉입(예를 들어, 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입)의 양을 제거하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. HTT 폴리펩타이드 봉입은 세포 내의 임의의 적절한 위치에 있을 수 있다. 예를 들어, HTT 폴리펩타이드 봉입은 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 (예를 들어, 본원에 기재된 것과 같이 치료되지 않은 포유류에서의 뉴런 및/또는 본원에 기재된 것과 같이 치료되기 전에 포유류에서의 뉴런과 같은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서의 자연적 뉴런에서의 HTT 폴리펩타이드 봉입의 양과 비교하여) 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 이것 초과만큼 헌팅턴병을 갖는 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 HTT 폴리펩타이드 봉입의 양을 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 재료는 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 HTT 폴리펩타이드 봉입의 양을 10% 내지 100%, 예컨대 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25%, 15% 내지 30%, 20% 내지 25%, 20% 내지 30%, 20% 내지 35%, 25% 내지 30%, 25% 내지 35%, 25% 내지 40%, 30% 내지 35%, 30% 내지 40%, 35% 내지 45%, 35% 내지 50%, 40% 내지 45%, 40% 내지 50%, 40% 내지 55%, 45% 내지 50%, 45% 내지 55%, 45% 내지 60%, 50% 내지 55%, 50% 내지 60%, 50% 내지 65%, 55% 내지 60%, 55% 내지 65%, 55% 내지 70%, 60% 내지 65%, 60% 내지 70%, 60% 내지 75%, 65% 내지 70%, 65% 내지 75%, 65% 내지 80%, 70% 내지 75%, 70% 내지 80%, 70% 내지 85%, 75% 내지 80%, 75% 내지 85%, 75% 내지 90%, 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100% 감소시키는 데 효과적일 수 있다.
임의의 적절한 방법은 헌팅턴병을 갖는 포유류에서의 HTT 폴리펩타이드의 봉입의 존재, 부재 또는 양을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역조직화학은 헌팅턴병을 갖는 포유류의 뇌 내에 존재하는 하나 이상의 신경교 세포 및/또는 하나 이상의 뉴런에 존재하는 HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료일에, 치료 후 1일에, 치료 후 3개월에, 치료 후 6개월에, 치료 후 1년에 그리고 치료 후 이후에는 매년 평가될 수 있다.
일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1일 내지 치료 후 2일, 치료 후 1일 내지 치료 후 3일, 치료 후 1일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 3일, 치료 후 2일 내지 치료 후 4일, 치료 후 2일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 4일, 치료 후 3일 내지 치료 후 5일, 치료 후 3일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 5일, 치료 후 4일 내지 치료 후 6일, 치료 후 4일 내지 치료 후 7일, 치료 후 5일 내지 치료 후 6일, 치료 후 5일 내지 치료 후 7일, 또는 치료 후 6일 내지 치료 후 7일에 평가될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1주 내지 치료 후 2주, 치료 후 1주 내지 치료 후 3주, 치료 후 1주 내지 치료 후 4주, 치료 후 2주 내지 치료 후 3주, 치료 후 2주 내지 치료 후 4주, 또는 치료 후 3주 내지 치료 후 4주에 평가될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1개월 내지 치료 후 12개월에 평가될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양 치료 후 1개월 내지 치료 후 2개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 1개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 3개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 2개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 4개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 3개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 5개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 4개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 6개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 5개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 7개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 6개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 8개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 7개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 9개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 8개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 10개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 9개월 내지 치료 후 12개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 11개월, 치료 후 10개월 내지 치료 후 12개월, 또는 치료 후 11개월 내지 치료 후 12개월. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1년 내지 약 치료 후 20년에 평가될 수 있다. 일부 경우에, HTT 폴리펩타이드 봉입의 존재, 부재 또는 양은 치료 후 1년 내지 치료 후 5년, 치료 후 1년 내지 치료 후 10년, 치료 후 1년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 10년, 치료 후 5년 내지 치료 후 15년, 치료 후 5년 내지 치료 후 20년, 치료 후 10년 내지 치료 후 15년, 치료 후 10년 내지 치료 후 20년, 또는 치료 후 15년 내지 치료 후 20년에 평가될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 추가로 기재될 것이고, 이 실시예는 청구항에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 -
헌팅턴병의 마우스 모델에서 선조체 성상교세포를 GABA성 뉴런으로 직접 전환시키는 유전자 치료 접근법
생체내 뉴런 전환을 위한 선조체 성상교세포의 표적화
성상교세포는 포유류 CNS에서의 세포의 대략 30%를 구성하는 풍부한 세포이고, 본질적으로 뇌에서 모든 단일 뉴런을 둘러싸서 이들이 세포 전환에 대한 이상적인 내부 원천이 되게 한다. 피질 성상교세포에서 NeuroD1인 단일 신경 전사 인자의 전위성 발현은 이를 기능적 뉴런, 주로 글루타메타제성 뉴런으로 전환시킬 수 있다(Guo et al., Cell Stem Cell 14:188-202 (2014)). 그러나, 레트로바이러스가 분열 세포에서 표적 유전자를 오직 발현할 수 있으므로, 레트로바이러스에 의한 생체내 전환된 뉴런의 총 수는 제한된다. 레트로바이러스의 이 단점을 극복하기 위해, 생체내 재프로그래밍에 대한 재조합 아데노-연관된 바이러스(혈청형 2/5, rAAV2/5)가 설계되었다. rAAV의 상이한 혈청형 중에서, rAAV2/5는 우선적으로 마우스 뇌에서 성상교세포를 감염시키는 이의 능력에 대해 사용되었다(Ortinski et al., Nat. Neurosci. 13:584-591 (2010)).
마우스 뇌에서 성상교세포-전환된 뉴런을 추적하기 위해, 성상교세포를 표적화하는 GFAP 프로모터의 제어 하에 Cre 재조합효소를 발현하는 벡터(GFAP::Cre), 및 mCherry-P2A-mCherry 또는 NeuroD1-P2A-mCherry 또는 Dlx2-P2A-mCherry의 도립된 코딩 서열을 갖는 FLEx 벡터를 포함하는 Cre-FLEx(플립-절제) 시스템이 개발되었다(도 1a). 2개의 삽입된 유전자는 P2A 자가-절단 부위에 의해 분리되고, 강한 보편적 합성 프로모터 CAG에 의해 추진된다. NeuroD1과 조합된 Dlx2가 선조체 성상교세포를 GABA성 뉴런으로 전환시킬 수 있는지와 NeuroD1 단독이 더 많은 글루타메타제성 뉴런을 생성시킬 수 있는지가 시험되었다(Guo et al., Cell Stem Cell 14:188-202 (2014)).
Cre-재조합효소가 성상교세포에서 특이적으로 과발현되는지를 시험하기 위해, AAV2/5 GFAP::Cre를 GABA성 뉴런이 농후화된 뇌 영역인 정상 마우스 선조체(2개월령 내지 5개월령)에 주사하였는데, 이는 HD 뇌에서 조기 퇴행을 나타낸다. 거의 모든 Cre-발현 세포는 성상교세포에 대한 통상적인 마커인 GFAP-양성 세포였다(99.2 ± 0.6%, n = 6마리 마우스, 바이러스 주사 후 7일 내지 21일; 도 1b). Cre-FLEx 시스템의 특이성을 추가로 조사하기 위해, AAV2/5 GFAP::Cre는 정상 마우스 선조체로 AAV2/5- CAG::FLEx-mCherry-P2A-mCherry와 함께 주사되었다. 마우스를 면역조직화학 연구를 위해 주사 후 21일 내지 30일(dpi)에 희생시켰다. mCherry-양성 세포 중에서, 이들의 대부분은 S100β(90.0 ± 0.9%), GFAP(86.6 ± 1.9%) 및 글루타민 합성효소(GS, 92.9 ± 1.3%)를 포함하는 성상교세포-특이적 마커를 발현하였고, 매우 소수가 Olig2(1.1 ± 0.3%), NG2(3.2 ± 1.5%) 및 Iba1(비검출됨, 각각의 그룹에 대해 n ≥ 6마리 마우스; 도 1c, 도 1d)과 같은 다른 신경교 마커를 발현하였다. 적은 mCherry-발현 세포는 NeuN-양성이었고(10.5 ± 0.7%, n = 11마리 마우스; 도 1c, 도 1d), 이는 매우 적은 수의 선조체 뉴런이 AAV2/5 Cre-FLEx 시스템에 의해 표적화되었다는 것을 나타낸다.
NeuroD1 및 Dlx2는 선조체 성상교세포를 GABA성 뉴런으로 재프로그래밍한다
AAV Cre-FLEx 시스템이 AAV2/5 GFAP::Cre를 AAV2/5-CAG::Dlx2-P2A-mCherry 및 CAG::NeuroD1-P2A-mCherry와 함께 성체 야생형(WT) 마우스(2개월령 내지 5개월령)에 주사함으로써 선조체에서 뉴런으로의 성상교세포의 전환을 유도할 수 있었는지가 다음에 시험되었다. 7 dpi에, 선조체에서의 모든 바이러스 감염된 세포(mCherry 양성)가 GFAP+ 성상교세포였고, 이들 중에서 mCherry 양성 세포의 81.5%는 NeuroD1(ND1) 및 Dlx2 둘 다를 또한 동시발현하였지만, mCherry 양성 세포의 불과 12.1%는 ND1도 Dlx2 발현도 나타내지 않았다(도 2a, 도 2c에 정량화됨)는 것이 발견되었다. 적은 백분율(5% 미만)의 mCherry 양성 세포(주로 신경교 세포)는 전사 인자 중 하나(ND1 양성 또는 Dlx2 양성 중 어느 하나)를 오직 발현하였지만, 7 dpi에 NeuN 양성 뉴런에서 TF 중 어느 것도 검출되지 않았다(도 2a 및 도 3a). 그에 반해서, 30 dpi까지, ND1 및 Dlx2 신호의 대부분이 NeuN 양성 뉴런에서 동시발현되었고(72.7%; 도 2b, 도 2c에서 정량화됨, 검정 점; 도 3b), 오직 적은 수의 성상교세포가 있었다(4.1%, 도 2c, 회색 점)는 것이 발견되었다. 이 결과는 NeuroD1 및 Dlx2의 동시발현이 선조체 성상교세포를 뉴런으로 전환시킬 수 있다는 것을 제시한다(도 2d).
선조체에서 성상교세포에서 뉴런 전환 과정의 시간 과정을 추가로 조사하기 위해, 7 dpi 및 30 dpi 이외에 11 dpi, 15 dpi 및 21 dpi의 3의 더 많은 시점이 분석되었다(도 2e). 11 dpi에 적은 백분율(17.8%)의 mCherry 양성 세포가 NeuroD1 + Dlx2(N+D)를 동시발현한 후 NeuN 양성 신호를 나타냈고, 이러한 뉴런 전환 백분율이 연속하여 15 dpi에 33.6%로 증가하고 21 dpi에 74.1%로 증가하였다(도 2e, 도 2f)는 것이 발견되었다. 이 경향과 대등하게, 더욱 더 많은 mCherry 양성 세포가 NeuN과 동시국재화되었지만, 더욱 더 적은 mCherry 양성 세포가 7 dpi(83.5% GFAP+)에서 30 dpi(14.2% GFAP+)에 GFAP와 동시국재화되었다(도 2e, 도 2f). AAV2/5 mCherry 단독에 의해 감염된 대조군에서, 대부분의 mCherry 양성 세포는 GFAP+ 성상교세포였고, 매우 적은 mCherry 양성 세포는 그 시점에 걸쳐 NeuN 신호에 의해 동시표지되었다(도 2f, 도 4). NeuroD1 또는 Dlx2 단독이 성상교세포를 뉴런으로 전환시킬 수 있으므로, 이의 개별 효과는 WT 마우스 선조체로 mCherry 대조군, NeuroD1, Dlx2 및 NeuroD1 + Dlx2를 주사함으로써 추가로 비교되었다. 선조체 성상교세포에서 NeuroD1 또는 Dlx2 중 어느 하나 단독을 발현하는 것이 또한 NeuN에 의해 동시표지된 mCherry 양성 세포를 많이 생성시켰지만, 전환 효율 및 전환된 뉴런의 수가 NeuroD1 + Dlx2 그룹보다 훨씬 낮았다(도 5a 내지 도 5c)는 것이 발견되었다. 이 결과는 NeuroD1 및 Dlx2가 함께 선조체 성상교세포를 뉴런로 전환시키는 데 있어서 상승 효과를 갖는다는 것을 제시한다.
선조체에서 NeuroD1 + Dlx2 유도된 성상교세포에서 뉴런 전환 후 뉴런 하위유형을 확인하기 위해, GABA성 뉴런에 대해 GAD67 및 GABA; MSN에 대해 DARPP32; 및 선조체 인터뉴런에 대해 파르브알부민(PV), 소마토스타틴(SST), 뉴런 펩타이드 Y 및 칼레티닌(CalR)을 포함하는 다양한 GABA성 마커에 의해 일련의 면역염색 실험을 수행하였다. 대부분의 mCherry 양성 세포(30 dpi)가 GAD67 양성(83.9%, n = 10마리 마우스) 또는 GABA 양성(85.0%, n = 10마리 마우스) GABA성 뉴런이었다(도 2g, 도 2h)는 것이 발견되었다. 더욱이, 대부분의 전환된 뉴런은 DARPP32 양성이었고(55.7%, n = 7마리 마우스; 도 2g, 도 2h), 적은 백분율의 전환된 뉴런은 PV+ 인터뉴런이었고(9.6%; 도 2g, 도 2h), 인터뉴런의 다른 하위유형은 훨씬 더 적었다(< 5%; 도 2h, 도 6). 마치기 위해, NeuroD1과 함께 Dlx2는 선조체 성상교세포를 DARPP32 양성 GABA성 뉴런으로 효율적으로 전환할 수 있다.
선조체 성상교세포를 뉴런으로 전환한 후 뉴런 대 성상교세포 비가 변경되는지를 검사하기 위해, AAV 주사 후 30일에 선조체에서 뉴런/성상교세포 비(도 7) 및 뉴런/미세아교세포 비(도 8)를 분석하였다. NeuN 및 S100β 면역염색에 따르면, 전체 뉴런 밀도 및 성상교세포 밀도뿐만 아니라 뉴런/성상교세포 비는 성상교세포에서 뉴런 전환 후 유의미하게 변하지 않았다(도 7). 이는 성상교세포가 증식성 세포이고 뉴런 전환 후 분열할 수 있다는 사실로 인할 수 있었다. 실제로, NeuroD1 + Dlx2 치료 후 30일에 선조체에서 세포 분열의 상이한 단게에서 S100β 양성 성상교세포가 관찰되었다(도 7b 내지 도 7d). 유사하게, NeuN 및 Iba1 면역염색에 의해, 성상교세포에서 뉴런 전환 후 뉴런 밀도 및 미세아교세포 밀도에서도 뉴런/미세아교세포 비에서도 유의미한 변화가 발견되지 않았다(도 8). 이와 같이, 뉴런 밀도 및 신경교 밀도는 생체내 세포 전환 후 변경되지 않는다.
전환된 뉴런이 성상교세포로부터 기원하였는지를 추가로 검증하기 위해, 대조군으로서 AAV2/5 FLEx-mCherry 단독 또는 AAV2/5 FLEx-NeuroD1-mCherry + FLEx-Dlx2-mCherry 중 어느 하나를 성상교세포에서 Cre가 특이적으로 발현된 GFAP::Cre 형질전환 마우스(Cre77.6, Jackson Lab)의 선조체에 주사하였다(도 9a, 도 9b). 대조군 바이러스 FLEx-mCherry는, 다른 유형의 신경교 세포 또는 뉴런(< 5%, 각각의 그룹에 대해 n = 7마리 마우스; 도 10a, 도 10b)보다는, 특이적으로 Cre77.6 형질전환 마우스 뇌에서 성상교세포에서 발현되었다(S100β 양성, 97.4%, n = 9마리 마우스; GFAP 양성, 94.3%, n = 8마리 마우스; GS 양성, 97.8%, n = 7마리 마우스). 불과 2% 미만의 선조체 뉴런이 대조군 조건에서 mCherry에 의해 표지되었다(n = 9마리 마우스; 3마리의 마우스는 28 dpi에 희생되었고, 6마리의 마우스는 58 dpi에 희생되었다). Cre77.6 형질전환 마우스의 선조체로의 NeuroD1 + Dlx2 바이러스의 주사는 바이러스 감염 후 상이한 시점에 이행 전환 과정을 밝혀냈다. 구체적으로는, ND1 + Dlx2 그룹에서의 mCherry 양성 세포는 NeuN 신호가 아니라 강한 GFAP 및 S100β 신호에 의해 7 dpi에 성상교세포 형태를 나타냈다(도 9c, 도 9d; 왼쪽 행). 28 dpi까지, 많은 mCherry 양성 세포는 GFAP 및 S100β 신호를 소실하였지만, NeuN 음성으로 있어서(GFAP 음성 및 NeuN 음성 또는 S100β 음성 및 NeuN 음성), 이행 단계를 제시한다(도 9c, 도 9d; 중간 행). 56 dpi에, 대부분의 mCherry 양성 세포는 NeuN 양성이 되었고, 이는 성상교세포에서 뉴런 전환 과정의 완료를 제안한다(GFAP 음성 및 NeuN 양성 또는 S100β 음성 및 NeuN 양성; 도 9c, 도 9d, 오른쪽 행). 정량화는 대부분의 mCherry 양성 세포가 시작(7 dpi) 시 성상교세포였고(GFAP 양성 및 NeuN 음성: 97.8%, n = 6마리 마우스; S100β 양성 및 NeuN 음성: 98.1%, n = 6마리 마우스), 이어서 많은 일시적 세포가 28 dpi에 관찰되었고(GFAP 양성 및 NeuN 음성: 46.0%, n = 6마리 마우스; S100β 양성 및 NeuN 음성: 47.8%, n = 6마리 마우스), mCherry 양성 뉴런의 풍부도가 56 dpi에 검출되었다(GFAP 음성 및 NeuN 양성: 59.1%, n = 6마리 마우스; S100β 음성 및 NeuN 양성: 58.2%, n = 6마리 마우스; 도 9e, 도 9f)는 것을 나타냈다. 더욱이, Cre77.6 마우스의 선조체에서의 ND1 + Dlx2 전환된 뉴런의 대부분이 DARPP32 양성 MSN였다(61.5 ± 2.6%, n = 8마리 마우스; 도 10c)는 것이 또한 발견되었다. 이 결과는 선조체 성상교세포가 NeuroD1 및 Dlx2의 전위성 발현 후 MSN으로 재프로그래밍될 수 있다는 것을 추가로 입증한다.
R6/2 마우스 모델에서 GABA성 뉴런으로의 선조체 성상교세포의 전환
WT 마우스에서 선조체 성상교세포의 GABA성 뉴런으로의 전환을 성공적으로 시험한 후, HD의 마우스 모델에서 GABA성 뉴런을 재생성하도록 이 새로운 전략이 사용될 수 있는지가 다음에 조사되었다. HD에 대한 R6/2 형질전환 마우스 모델이 사용되었는데, 이 모델은 발병 과정의 면에서 잘 규명되었고, 치료 중재를 개발하는 데 있어서 널리 사용되었다(Pouladi et al., Nat. Rev. Neurosci. 14:708-721 (2013)). R6/2 마우스의 선조체에서 GABA성 뉴런을 재생성하기 위해, HD 마우스가 신경학적 표현형을 나타내기 시작할 때 AAV2/5 NeuroD1 및 Dlx2를 2개월령의 마우스 연령(암컷 및 수컷 둘 다)에 함께 주사하였다. 바이러스 주사 후 1달에, mCherry 대조군에서, 성상교세포-유사 형태를 갖고 S100β에 면역양성인 많은 감염된 세포(mCherry 양성)가 관찰되었지만(도 11a, 왼쪽 패널; 및 도 11b, 상부 열); NeuroD1 + Dlx2 감염된 세포(mCherry 양성)는 NeuN에 면역양성이 되었다(도 11a, 오른쪽 패널; 및 도 11b, 하부 열). 정량화된 데이터는 대조군에서 mCherry 양성 세포의 86.7%(n = 6마리 마우스)가 S100β에 의해 표지되었고, 세포의 불과 9.2%(n = 6마리 마우스)가 NeuN에 의해 표지되었다(도 11c)는 것을 나타냈다. NeuroD1 + Dlx2 치료된 마우스에서, 바이러스 감염된 세포의 78.6%(n = 7마리 마우스)는 NeuN에 의해 표지되었지만, mCherry 양성 세포의 불과 15.3%는 S100β에 의해 표지되었다(도 11c). 따라서, 이 결과는 R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 성상교세포가 또한 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 입증한다.
다음에, GABA성 뉴런의 어떤 특정 하위유형이 NeuroD1 + Dlx2 AAV2/5를 주사한 후(38 dpi) R6/2 마우스 선조체에서 성상교세포로부터 전환되었는지를 결정하기 위해 mCherry를 다양한 GABA성 마커에 의해 동시염색하였다. 대부분의 성상교세포- 전환된 뉴런이 GAD67(82.4%, n = 8마리 마우스) 또는 GABA(88.7%, n = 8마리 마우스; 도 11d, 도 11f)에 면역양성이라는 것이 발견되었고, 이는 GABA성 뉴런 정체를 제시한다. 더욱이, 전환된 세포의 56.6%는 DARPP32-양성 MSN였다(n = 9마리 마우스, 도 11e, 도 11f). PV에 면역양성인 적은 성상교세포- 전환된 뉴런이 또한 있었지만(8.4%, n = 9마리 마우스; 도 11e, 도 11f), 이들은 SST, NPY 및 CalR에 드물게 양성이었다(모두 < 5%; 도 11f 및 도 12). 이 결과는 R6/2 마우스의 선조체 성상교세포에서 NeuroD1 + Dlx2의 전위성 발현이 치료학적 치료를 위해 상당한 수의 MSN을 재생성할 수 있다는 것을 입증한다.
생체내 성상교세포로 전환이 R6/2 마우스의 선조체에서 신경교 및 뉴런 밀도를 변화시킬 수 있는지가 추가로 조사되었다. 뉴런 및 성상교세포의 세포 밀도, 및 뉴런/성상교세포 비(도 13) 및 뉴런/미세아교세포 비(도 15)는 세포 전환이 있거나 없는 R6/2 마우스에서 분석되었다. 야생형 마우스 선조체와 유사하게, 생체내 세포 전환 후 R6/2 마우스의 선조체에서 세포 밀도에서도 뉴런/신경교 비에서도 유의미한 변화가 발견되지 않았다. NeuroD1 + Dlx2 치료 후 R6/2 마우스 선조체에서의 많은 분열 성상교세포가 또한 관찰되었고(도 13b 내지 도 13d), 이는 성상교세포에서 뉴런 전환이 성상교세포의 증식을 자극할 수 있다는 것을 제시한다. 이 확률을 시험하기 위해, Ki67-표지된 분열 성상교세포를 R6/2 마우스 선조체에서 대조군과 NeuroD1 + Dlx2 그룹 사이에 비교하였다(30 dpi). 대조군과 비교하여, NeuroD1 + Dlx2 그룹에서의 Ki67 양성 성상교세포의 수가 약 15배만큼 유의마하게 증가하였다(p < 0.001, 독립 스튜던트 t-시험; 도 14)는 것이 발견되었다. 이 데이터는 생체내 세포 전환이 성상교세포 증식을 용이하게 한다는 것을 제시하여 성상교세포가 왜 결코 전환된 부위에서 고갈되지 않는지를 설명한다.
R6/2 마우스 뇌에서 전환된 선조체 뉴런의 기능적 분석
자연적 뉴런과 비교하여 성상교세포-전환된 뉴런(mCherry 양성; 도 16a)의 기능적 특성(mCherry-; 도 16a)은 AAV 감염 후 30 내지 32 dpi에 R6/2 마우스로부터 급성 선조체 슬라이스에서 전체-세포 기록을 사용하여 평가되었다. Na 양전류 K 양전류(도 16b 내지 도 16g)가 비교되었고, R6/2 마우스에서 전환된 뉴런과 이웃하는 비전환된 뉴런의 Na 양전류 사이의 유의미한 차이가 없었지만, Na 양전류 및 K 양전류 둘 다는 WT 마우스에서 기록된 것보다 유의미하게 더 적은 것으로 발견되었다(도 16f). K 양전류에 대해, 전환된 뉴런은 WT 뉴런과 유사한 진폭을 나타냈지만, R6/2 마우스의 비전환된 뉴런은 약간 더 적은 진폭을 나타냈다(도 16g; 3마리의 마우스로부터 n = 15개 뉴런/그룹). 다음에, 활동 전위 점화를 위해, 18개 중 17개의 mCherry 양성 세포 및 17개의 자연적 뉴런이 단계 전류 주사에 의해 야기될 때 반복적 활동 전위를 점화시킬 수 있었다(도 16c, 3마리의 마우스로부터의 총 35개의 세포가 기록되었음)는 것이 발견되었다. 세포막 입력 저항, 세포막 커패시턴스, 휴지 막 전위(RMP), 활동 전위(AP) 문턱, AP 진폭 및 AP 빈도와 같은 기본적인 전기 특성과 관련하여, 자연적 뉴런과 전환된 뉴런 사이에 유의미한 차이가 발견되지 않았다(도 16h 내지 도 16m). WT 마우스에서의 선조체 뉴런과 비교할 때, R6/2 마우스에서의 전환된 뉴런은 더 높은 입력 저항, 더 낮은 세포 캐퍼시턴스, 더 낮은 휴지 막 전위 및 더 낮은 활동 전위 진폭을 가졌고(도 16h 내지 도 16m), 이는 전환 후 1개월에 이들 새로 전환된 뉴런이 아직 완전히 성숙되지 않았다는 것을 제시한다.
상이한 하위유형의 GABA성 뉴런은 명확한 AP 점화 패턴 특징을 갖는다. AP를 점화할 수 없는 단일 mCherry 양성 세포를 배제한 성상교세포-전환된 뉴런의 AP 점화 패턴을 분석할 때, 대부분의 전환된 뉴런(72.2%)은 선조체에서의 통상적인 MSN 점화 패턴과 일치하는 자극 시 초기 AP 스파이크에 대한 긴 지연으로 정기적 점화 빈도(< 80 Hz, n = 13)를 나타냈다(도 16c 내지 도 16r). 22.2%의 전환된 뉴런이 통상적인 PV 뉴런 점화 패턴과 일치하는 빠른 점화 빈도(> 80 Hz, n = 4; 도 16r)를 나타냈다는 것이 또한 발견되었다. 더욱이, 성상교세포-전환된 뉴런이 국소 시냅스 회로에 통합될 수 있었는지는 전환된 뉴런에 대한 기능적 시냅스 입력을 나타내는 자발적 시냅스후 전류(sPSC: spontaneous postsynaptic current)를 검사함으로써 조사되었다. 대표적인 트레이스에 의해 표시된 것처럼(도 16d, 도 16e), 자발적 흥분 시냅스후 전류(sEPSC: spontaneous excitatory postsynaptic current) 및 자발적 억제 시냅스후 전류(sIPSC: spontaneous inhibitory postsynaptic current) 둘 다는 모든 자연적 뉴런(3마리의 마우스로부터 n = 9) 및 전환된 뉴런(3마리의 마우스로부터 n = 11)에서 검출되었다. 더욱이, 정량적 분석은 R6/2 마우스에서의 자연적 뉴런 및 전환된 뉴런뿐만 아니라(도 16n 내지 도 16q), WT 마우스에서의 선조체 뉴런(도 17c, 도 17d) 중에서 sEPSC 및 sIPSC 둘 다의 빈도 및 진폭에서 유의미한 차이를 발견하지 못했다. 종합하면, 전기생리학적 분석은 R6/2 마우스 뇌에서의 선조체 성상교세포가 통상적인 기능적 GABA성 뉴런으로 전환될 수 있다는 것을 제시하고, 이는 국소 시냅스 전류로 추가로 통합될 수 있다.
성상교세포-전환된 뉴런의 축삭 돌기
선조체 MSN은 축삭 돌기를 기저핵, 외부 담창구(GP) 및 흑질 망양체부(SNr) 내의 2개의 명확한 핵으로 보낸다. 선조체에서의 심각한 MSN 소실로 인해, 이들 2개의 출력 경로는 HD 뇌에서 심하게 파괴된다. 따라서, 선조체에서의 성상교세포-전환된 뉴런이 이의 축삭 돌기를 이의 원위 표적으로 내보내는지가 조사되었다. 실제로, 선조체로부터 GP 및 SNr로 연장하는 깨끗한 mCherry 양성 축삭 트랙은 NeuroD1 + Dlx2 치료된 R6/2 마우스에서 발견되었지만(도 18a; 및 도 19), 이러한 mCherry 양성 축삭 트랙은 대조군 마우스에서 검출되지 않았다(도 20a). 추가의 면역염색은 GP 및 SNr 둘 다에서의 mCherry 양성 반점(축삭 신경 종말)이 시냅스전 GABA성 신경 종말의 마커인 vGAT에 의해 동시표지되었다는 것을 나타냈다(도 18b). 정량화된 데이터는 GP 및 SNr에서 vGAT의 강도가 NeuroD1 + Dlx2 치료된 R6/2 마우스 뇌에서 유의미하게 증가하였다는 것을 나타냈다(도 18c 및 도 20b). 이 발견은 성상교세포-전환된 뉴런이 R6/2 마우스 뇌에서 GABA성 신경 돌기를 내보내고 선조체로부터 GP 및 SNr로 GABA성 출력을 강화할 수 있다는 것을 입증한다.
R6/2 마우스 뇌에서 NeuroD1 + Dlx2 유도된 생체내 전환 후 축삭 돌기의 진행을 추가로 조사하기 위해, 콜레라 독소 하위단위 B(CTB)인 역행 트레이서를 21 dpi 또는 30 dpi인 2의 상이한 시점에 GP 또는 SNr로 주사하였다. CTB 주사 후 7일에, 마우스를 선조체에서 CTB-표지된 뉴런의 분석을 위해 희생시켰다(도 18d에서 도식적 예시 참조). CTB 주사된 부위를 입증하기 위해 시상 뇌 절편을 만들었다(도 21). CTB가 21 dpi에 주사될 때, 많은 CTB-표지된 자연적 뉴런(NeuN 양성, mCherry 음성)이 선조체에서 발견되었지만, 매우 적은 전환된 뉴런(NeuN 양성, mCherry 양성)이 CTB에 의해 표지되었다(GP = 8.2%, 5마리의 마우스로부터 n = 509; SNr = 3.5%, 5마리의 마우스로부터 n = 483; 도 18e 내지 도 18g). 그러나, CTB가 30 dpi에서 주사될 때, 자연적 뉴런에서 검출될 뿐만 아니라 전환된 뉴런에서도 CTB가 검출되는 것으로 발견되었다(도 18e, 도 18f). 정량화된 데이터는 CTB가 21 dpi와 비교하여 30 dpi에 주사될 때 CTB-표지된 전환된 뉴런의 백분율이 유의미하게 증가하였다는 것을 나타냈다(GP = 27.7%, 5마리의 마우스로부터 n = 535, p = 0.014; SNr = 29.4%, 5마리의 마우스로부터 n = 511, p = 0.004, 독립 스튜던트 t-시험; 도 18g). 따라서, 이 데이터는 생체내 전환된 MSN이 R6/2 마우스 뇌에서 이의 축삭 돌기를 GP 및 SNr로 연장할 수 있다는 것을 입증한다.
생체내 세포 전환에 의한 R6/2 마우스에서의 신경퇴행의 완화
헌팅턴병은 헌팅틴(Htt)을 암호화하는 유전자에서 돌연변이와 연관된 상염색체 우성 장애이다. 돌연변이는 과도한 폴리글루타민 반복으로 이어져서 돌연변이체 Htt(mHtt)를 생성시키는데, 이것은 미스폴딩하여 특히 선조체에서 응집 및 후속하는 신경퇴행을 야기한다. 전환된 뉴런 내의 mHtt 응집(봉입)이 조사되었다. 새로 생성된 뉴런이 성상교세포로부터 전환되고 mHtt 응집이 R6/2 마우스 선조체에서 뉴런 및 성상교세포에서 둘 다에서 검출되므로, 선조체 성상교세포 및 뉴런에서의 mHtt 봉입의 진행은 R6/2 마우스 선조체에서 60일령(P60) 및 90일령(P90)과 비교되었다. mHtt 핵 봉입이 P60에 S100β 양성 성상교세포의 20.6% 및 뉴런의 71.1%에서 검출되었다는 것이 발견되었다(도 22a). 3개월령에서, 35.8%의 성상교세포 및 75.5%의 뉴런은 mHtt 봉입을 나타냈다(도 22b). 이 데이터는 성상교세포가 R6/2 마우스 선조체에서 뉴런보다 mHtt 봉입을 덜 갖는다는 것을 제시한다. 흥미롭게도, 성상교세포-전환된 뉴런(51.1%, 12마리의 마우스로부터 n = 151개 뉴런)이 자연적 뉴런(77.1%, 12마리의 마우스로부터 n = 655개 뉴런; p < 0.002, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA), 또는 대조군에서의 뉴런(80.3%, 11마라의 마우스로부터 n = 709개 뉴런; p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA)과 비교할 때 mHtt 봉입을 덜 나타냈다는 것이 발견되었다(도 23a, 도 23c). 이 결과는 R6/2 마우스 선조체에서 뉴런이 성상교세포보다 더 많은 mHtt 핵 봉입을 갖고, 성상교세포-전환된 뉴런이 기존의 뉴런보다 더 적은 mHtt 핵 봉입을 갖는다는 것을 나타낸다.
신경퇴행에 의해 생긴 선조체 위축은 R6/2 마우스 뇌에서 이전에 보고되었다(Paul et al., Nature 509:96-100 (2014)). R6/2 한배새끼와 야생형(WT) 한배새끼 사이의 상대 선조체 부피가 검사되었다. 명확한 선조체 위축은 이의 WT 한배새끼와 비교하여 R6/2 마우스에서 관찰되었다(도 22c). 정량화 데이터는 3개월령 R6/2 마우스에서 선조체 부피의 31.8% 감소를 나타냈다(n = 9마리 마우스, p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA; 도 23d). 선조체 위축이 대조군 바이러스-치료된 R6/2 마우스와 비교하여 NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스에서 완화되었다는 것이 발견되었다(도 23b; AAV2/5는 P60에 주사되었고, 마우스는 P98에 희생되었다). 정량화된 데이터는 대조군 바이러스-치료된 그룹(n = 6마리 마우스)에서 30.3%의 선조체 위축, 그러나 NeuroD1 + Dlx2 그룹에서 불과 16.9%의 선조체 위축을 나타냈다(n = 7마리 마우스, p = 0.004, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA; 도 23d). 따라서, 이 결과는 생체내 성상교세포에서 뉴런 전환 접근법이 R6/2 마우스에서 선조체 위축을 감소시킬 수 있다는 것을 제시한다.
생체내 세포 전환에 의한 R6/2 마우스에서의 표현형 결핍의 감소
R6/2 마우스는 HD 환자의 많은 특징을 모방하는 진행적인 신경학적 표현형을 나타낸다. 일련의 행동 시험을 사용하여 생체내 세포 전환 접근법이 R6/2 마우스에서 비정상 표현형을 완화할 수 있는지가 조사되었다. WT 한배새끼(P90-97)와 비교하여 R6/2 마우스에서의 보행 변화를 평가하도록 캣워크 행동 시험이 수행되었다. 평균 걸음걸이 길이가 WT 한배새끼와 비교할 때 R6/2 마우스에서 유의미하게 감소되었다는 것이 발견되었다(WT = 5.80 ± 0.30 cm, n = 13마리 마우스, 6마리의 수컷 및 7마리의 암컷; R6/2 = 3.91 ± 0.11 cm, n = 10, 3마리의 수컷 및 7마리의 암컷; p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA; 도 24a, 도 24b). 유전자 치료의 효과를 시험하기 위해, R6/2 마우스는 P60에 양측으로 두개내 AAV2/5 주사를 받았고, 바이러스 주사 후 30일 내지 37일 후 캣워크 행동 시험을 겪었다(도 24k). 대조군 AAV2/5 mCherry-주사된 마우스(3.95 ± 0.14 cm, n = 13, 6마리의 수컷 및 7마리의 암컷; 도 24a, 도 24b)와 비교하여 NeuroD1 + Dlx2 치료된 마우스(4.91 ± 0.13 cm, n = 19, 8마리의 수컷 및 11마리의 암컷; p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA)에서 걸음걸이 길이가 유의미하게 개선되었다는 것이 발견되었다. 상이한 그룹 사이에 발자국 폭의 유의미한 차이가 없었다(도 24a, 도 24c). 개방 장소 시험에 의해 로코모션 활동을 평가하였다. (20분에) R6/2 마우스의 총 이동 거리가 WT 한배새끼(6163.8 ± 263.0 cm, n = 14, 7마리의 수컷 및 7마리의 암컷; 도 24d, 도 24e)와 비교하여 급격한 감소(1886 ± 252 cm, n = 12, 5마리의 수컷 및 7마리의 암컷; p < 0.001, 본페로니 사후 시험에 의해 1방향 ANOVA)를 나타냈다는 것이 발견되었다. 걷는 거리는 mCherry-치료된 R6/2 마우스(2023 ± 331 cm, n = 12마리 마우스, 5마리의 수컷 및 7마리의 암컷 마우스; 본페로니 사후 시험에 의한 1방향 ANOVA ; 도 24d, 도 24e)와 비교하여 NeuroD1 + Dlx2-치료된 R6/2 마우스(3648 ± 367 cm, n = 18마리 마우스, 10마리의 수컷 및 8마리의 암컷 마우스)에서 유의미한 증가를 나타냈다. 이 결과는 생체내 세포 전환 접근법이 R6/2 마우스의 운동 기능을 유의미하게 개선한다는 것을 제안한다.
게다가, 유전자 요법 치료 후 R6/2 마우스의 체중, 움켜짐 행동 및 그립 강도를 검사하였다. R6/2 마우스가 8주령에 체중이 감소하였다는 것이 보고되었다(Menalled et al., Neurobiol. Dis. 35:319-336 (2009)). 유전자 치료 효과를 시험하기 위해, R6/2 마우스를 2개의 그룹으로 무작위로 나누고, 수술 전 7일에 체중을 측정하였다. 2개의 그룹 사이에 유의미한 차이가 발견되지 않았다(p = 0.367; 도 24f). NeuroD1 + Dlx2로 치료된 R6/2 마우스는 30 dpi에 대조군 바이러스가 주사된 R6/2 마우스보다 체중이 덜 감소하였다(Ctrl = 21.13 ± 0.39 g, n = 25, 9마리의 암컷 및 16마리의 수컷; N + D = 22.42 ± 0.38 g, n = 28, 11마리의 암컷 및 17마리의 수컷; p = 0.021, 독립 스튜던트 t-시험; 도 24f). 다음에, R6/2 마우스에서 근긴장이상증 및 운동이상증을 측정하도록 발 움켜짐 시험을 사용하였다. 대부분의 R6/2 마우스에서 통상적인 움켜짐 표현형(도 24g, 상부 패널)이 관찰되었다. 그러나, 움켜짐을 나타낸 R6/2 마우스의 백분율은 NeuroD1 + Dlx2 치료 후 유의미하게 감소하였다(Ctrl = 88.2%, n = 34, 14마리의 암컷 및 20마리의 수컷; N + D = 67.7%, n = 31, 13마리의 암컷 및 18마리의 수컷; p = 0.045, 2측 피어슨 카이 제곱 시험; 도 24h). 더욱이, NeuroD1 + Dlx2 그룹에서 움켜짐 점수가 또한 유의미하게 감소하였다(대조군 = 3.4 ± 0.4, n = 34, 14마리의 암컷 및 20마리의 수컷; N + D = 2.3 ± 0.4, n = 31, 13마리의 암컷 및 18마리의 수컷; p = 0.040, 독립 스튜던트 t-시험; 도 24i). 그립 강도를 측정하고, 바이러스 치료된 대조군과 NeuroD1 + Dlx2 치료된 R6/2 마우스 사이에 유의미한 차이가 없었다는 것이 발견되었다(도 24j). 현저하게, R6/2 마우스의 생존기간이 38 dpi(2개월령에 바이러스 주사)에 분석될 때, NeuroD1 + Dlx2가 주사된 R6/2 마우스의 93.9%는 여전히 살아 있었지만, 대조군 AAV2/5 mCherry 주사를 받은 R6/2 마우스의 44.8%가 죽었고, 이는 이 연령에서의 R6/2 마우스에 대해 기대되었다(P < 0.001, 2측 피어슨 카이 제곱 시험; 도 24l). 대체적으로, 이 결과는 R6/2 마우스의 선조체에서의 GABA성 뉴런의 생체내 재생이 부분적으로 표현형 결핍을 구제하고 기대 수명을 연장할 수 있다는 것을 입증한다.
방법 및 재료
동물
동물을 먹이 및 물에 대한 자유 접근에 의해 12시간 : 12시간 광 : 암 사이클에서 수용하였다. R6/2 균주(B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/3J)를 난소 이식 반접합자 암컷 x B6CBAF1/J 수컷에 의해 유지시키고, Jackson Laboratory로부터 둘 다를 구입하였다. 마우스를 이유 후(P21-27) PCR에 의해 유전자형분석하고, 돌연변이가 없는 한배새끼를 정상 마우스(2개월령 내지 5개월령)로서 사용하였다. R6/2 형질전환 마우스의 일부를 4주령 내지 6주령에 Jackson Laboratory로부터 직접 구입하였다. 또한 Jackson Laboratory로부터 GFAP::Cre 형질전환 마우스(B6.Cg-Tg(Gfapcre) 77.6Mvs/2J, Cre77.6)를 구입하였다. AAV 주사에 대해 2개월령 내지 5개월령 반접합성 마우스를 사용하였다. 이 연구에 수컷 마우스 및 암컷 마우스 둘 다를 사용하였다. 실험 프로토콜은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지침에 따라 펜실베니아 주립 대학교 IACUC에 의해 허가되었다.
AAV 생성
293개의 AAV 세포(Cell Biolabs)에서 재조합 AAV2/5를 제조하였다. 간단히, pAAV 발현 벡터, pAAV5-RC(Cell Biolab) 및 pHelper(Cell Biolab)의 삼중 플라스미드의 형질주입에 대해 폴리에틸렌이민(PEI, 선형, MW 25,000)을 사용하였다. 형질주입 후 72시간에, 세포를 수확하고 원심분리하였다. 이후, 세포를 드라이 아이스/에탄올 및 37℃ 수욕에 놓아 4회 주기적으로 동결하고 해동하였다. AAV 미정제 용리물은 Beckman SW55Ti 회전자에 의해 불연속 이오딕사놀 구배에서 54,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리에 의해 정제되었다. 바이러스-함유 층을 추출하고, Millipore Amicon Ultra Centrifugal Filter에 의해 농축하였다. GFAP::Cre에 대한 주사당 AAV2/5 게놈 카피(GC)는 3.55 x 107 GC이고; CAG::FLEx-mCherry-P2A-mCherry에 대해, 이것은 2.54 x 109 GC이고; CAG::FLEx-NeuroD1-P2AmCherry에 대해, 이것은 1.59 x 109 GC이고; CAG::FLEx-Dlx2-P2A-mCherry에 대해, 이것은 2.42 x 109 GC이다. 바이러스 역가는 QuickTiter™ AAV Quantitation Kit(Cell Biolabs)에 의해 결정될 때 GFAP::Cre에 대해 7.7 x 1010 GC/mL였고; FLEx-mCherry-P2A-mCherry에 대해 1.65 x 1012 GC/mL였고; FLEx-NeuroD1-P2A-mCherry에 대해 2.07 x 1012 GC/mL였고, FLEx-Dlx2-P2AmCherry에 대해 3.14 x 1012 GC/mL였다.
정위 바이러스 주사
AAV 주사를 위해 2개월령 내지 5개월령 야생형 마우스 또는 2개월령 R6/2 마우스에서 뇌 수술을 수행하였다. 마우스를 복막으로 케타민/자일라신(120 mg/kg 및 16 mg/kg)을 주사하여 마취시킨 후, 털을 손질하고, 정위 설정에 놓았다. 보호 목적을 위해 인공 안연고를 적용하여 눈을 덮었다. 수술에 걸쳐 R6/2 마우스에 대해 산소가 제공되었다. 수술을 중앙선 두피 절제에 의해 시작한 후, 선조체(AP +0.6 mm, ML ±1.8 mm, DV -3.5 mm)로 두개내 주사를 위해 두개에 (약 1 mm) 드릴 홀을 생성하였다. 각각의 마우스는 5 μL의 주사기 및 34G 바늘침을 사용하여 AAV2/5의 양측 주사를 받았다. 주사 부피는 2 μL였고, 유속은 0.2 μL/분에서 조절되었다. 일부 R6/2 마우스는 AAV2/5 주사 후 2차 수술을 받았고, 여기서 CTB(ThermoFisher, C34775)가 전달되었다. 마우스를 2.5% 아베르틴(250 내지 325 mg/kg)에 의해 마취시키고, 수술 동안 산소가 공급되었다. CTB(0.5 μg/부위)를 선조체 MSN의 돌기의 2개의 표적 부위인 담창구(AP -0.2 mm, ML 1.8 mm, DV -4.0 mm) 또는 흑질 망양체부(AP -3.0 mm, ML 1.7 mm, DV -4.0 mm)에 주사하였다. 바이러스 주사 후, 바늘침을 적어도 10분 동안 제자리에 유지시킨 후 천천히 빼냈다. 브레그마로부터 좌표가 측정되었다.
면역조직화학 및 분석
뇌 슬라이스 면역염색을 위해, 동물을 2.5% 아베르틴으로 깊게 마취시키고, 이후 혈액을 세척하도록 아주 차가운 인공 뇌척수액(aCSF)으로 빨리 관류시켰다. 이후, 뇌를 신속히 제거하고, 암소에서 4℃에서 밤새 4% PFA에 후고정하였다. 고정 후, 샘플을 비브라톰(Leica, VTS1000)에 의해 40 μm 절편으로 절단하였다. 각각 10분 동안 뇌 슬라이스를 인산염 완충 용액(PBS, pH: 7.35, OSM: 300) 중에 3회 세척하였다. 0.3% 트리톤 PBS + 5% 일반 당나귀 혈청(NDS)에서 2시간 동안 차단을 수행하였다. 1차 항체를 0.05% 트리톤 PBS + 5% NDS에 희석하고, 4℃에서 습윤 환경에서 2일 밤 동안 항온처리하였다(1차 항체 정보를 위해 표 2 참조). PBS 중에 3회 세척한 후, 샘플을 실온에서 2시간 동안 Alexa Flour 405, 또는 Alexa Flour 488, 또는 Cy3, 또는 Alexa Flour 647(1:500, Jackson ImmunoResearch)에 접합된 적절한 2차 항체와 항온처리한 후, PBS 중에 광범위하게 세척하였다. 2차 항체를 0.05% 트리톤 PBS + 5% NDS에 희석하였다. GAD67 및 GABA 면역염색을 위해, 샘플을 4% PFA 및 0.2% 글루타르알데하이드에 고정하고, 절편을 30분 동안 0.05% Triton PBS에 온화하게 침투시켰고, 면역염색 절차의 나머지 동안 Triton을 제거하였다. 샘플을 유리 슬라이드에 탑재하고, 암소에서 4℃에서 저장하였다.
Zeiss 공초점 현미경(LSM 800)에 의해 영상을 획득하였다. 정량화를 위해, 공초점 영상화를 위해 선조체에서의 2개 내지 6개의 영역을 무작위로 선택하였다(20x 렌즈 2개 내지 4개 영역; 40x 렌즈 4개 내지 6개 영역). Zeiss 소프트웨어 ZEN에 의해 대부분의 영상화 분석을 수행하였다. 분석에 대한 인간 바이어스의 영향을 피하기 위해, 마우스 정보의 일부는 공초점 영상화 동안 맹검이었다. 더욱이, 영상 분석은 맹검으로 추가로 수행되었다: 정량화를 한 사람은 주사된 바이러스 정보를 알지 못했다. 정량화 후, 다른 사람은 마우스 정보를 해독하였다. vGAT의 강도를 정량화하기 위해 영상 J 소프트웨어를 사용하였다.
전기생리학
뇌 슬라이스를 AAV 주사 후 30일 내지 32일에 준비하였고, 절단 용액(mM 단위: 93 NMDG, 93 HCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 15 글루코스, 12 N-아세틸-L-시스테인, 5 아스코르브산나트륨, 2 티오우레아, 3 피루브산나트륨, 7 MgSO4, 0.5 CaCl2, pH 7.3 내지 7.4, 300 mOsmo, 용액을 95% O2/5% CO2에 의해 버블링함)에서 실온에서 비브라톰(Leica, VTS1200)에 의해 300 μm 두께의 관상 절편으로 절단하였다. 이후, 슬라이스를 연속 95% O2/5% CO2 버블링에 의해 홀딩 용액으로 옮겼다 (mM 단위): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 15 글루코스, 12 N-아세틸-L-시스테인, 5 아스코르브산나트륨, 2 티오우레아, 3 피루브산나트륨, 2 MgSO4 및 2 CaCl2. 0.5 내지 1시간 회수 후, 슬라이스를 전기생리학 연구를 위해 챔버로 옮겼다. 기록 챔버를 119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2 및 10 mM 글루코스를 함유하는 인공 뇌척수액(ACSF)으로 충전하고, 끊임없이 32℃ 내지 33℃에서 95% O2 및 5% CO2에 의해 버블링하였다. 135 mM K-글루코네이트, 5 mM Na포스포크레아틴, 10 mM KCl, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM MgATP 및 0.5 mM Na2GTP(pH 7.3, KOH, 290 mOsm/L에 의해 조정됨)로 이루어진 피펫 용액을 사용하여 전체-세포 기록을 수행하였다. 자발적 시냅스 사건을 기록하기 위해, K 양성 채널을 차단하고 노이즈를 감소시키도록 피펫 용액 중의 칼륨 글루코네이트를 Cs-메탄설포네이트로 대체하였다. 피펫 저항은 통상적으로 4 내지 6 MΩ이고, 직렬 저항은 대략 20 내지 40 MΩ였다. 막 전위를 sEPSC 기록을 위해 -70 mV에서 유지시키고, sIPSC 기록을 위해 0 mV에서 유지시켰다. 데이터를 pClamp 9 소프트웨어(Molecular Devices, 캘리포니아주 팔로 알토)를 사용하여 수집하고, 10 kHz에서 샘플링하고, 1 kHz에서 여과시키고, 이후 pClamp 9 Clampfit 및 MiniAnalysis 소프트웨어(Synaptosoft, 조지아주 디카터)에 의해 분석하였다.
니슬 염색 및 상대 선조체 부피의 정량화
선조체 위축을 평가하기 위해, 뇌를 슬라이스하고, 연속 방식으로 수집하여 선조체 부피가 계산되도록 브레그마에 비해 전방/후방 절편의 정확한 확인을 허용하였다. 선조체 부피를 계산하기 위해 전체 선조체를 덮는 5번째마다의 절편(브레그마의 전방 및 후방)이 포함되었다. 샘플을 유리 슬라이드에 얹고, 실온에서 24시간 동안 건조되게 하고, 이후 크리스털 바이올렛에 의해 염색하였다. Keyence 현미경(BZ9000)에 의해 염색된 절편의 사진을 찍었다. 선조체 부위를 마우스 뇌 지도책에 따라 윤곽화하고, Image J 소프트웨어에 의해 선조체의 크기를 맹검으로 측정하였다. 선조체 부피를 카발리에리(Cavalieri) 원칙을 사용하여 계산하였다(부피 = s1d1 + s2d2 + ... + sndn s, s는 표면적이고, d는 2개의 절편 사이의 거리임). 모든 값을 야생형 한배새끼에서 선조체 부피로 정규화하였다.
행동 시험 및 분석
마우스를 케이지의 이동과 연관된 스트레스의 효과를 감소시키기 위해 1시간 동안 행동 시험 룸에 순응시켰다. 행동 시험에 암컷 및 수컷 마우스 둘 다가 포함되었고, 암컷 및 수컷 마우스 숫자는 결과 부문에 기술되어 있다.
캣워크. CatWalk XT 10.6(Noldus) 시스템은 R6/2 마우스에서 보행 결핍을 분석하도록 사용되었다. 생체내 세포 전환의 치료 효과를 평가하기 위해 걸음걸이 길이 및 발자국 폭을 분석하였다. 최대 실행 지속기간은 마우스의 자연 보행 패턴의 변동을 감소시키기 위해 60%의 최대 속도 변경으로 6초였다. 재현가능성을 보장하기 위해 마우스마다 3회 순응 실험을 획득하였다. 각각의 실험 전에 통로를 70% 에탄올에 의해 세정하고 건조시키고, 이후 임의의 남은 알코올 냄새를 감소시키기 위해 패닝하였다. 실험 기간 동안 룸 광을 껐다. 시스템 소프트웨어(CatWalk XT 10.6, Noldus)에 의해 마우스 보행을 자동으로 분석하였다. 마우스 배설물, 노이즈-점, 꼬리 및 배와 같은 거짓 발자국의 검출을 피하기 위해, 분석 결과는 시각적으로 추가로 확인되고 맹검으로 수정되었다.
개방 장소 시험. R6/2 마우스에서 로코모션 활동을 평가하도록 개방 장소 시험을 사용하였다. 연구 무대는 백색 개방-상부 박스(50×50×30 cm3)였고, 시험을 시작하기 위해 중앙에 마우스를 가볍게 두었다. 컴퓨터 프로그램(EthoVision XT Version 8, Noldus)은 무대에 보정되었고, 동적 공제를 사용하여 마우스의 중앙-점, 노이즈-점 및 꼬리-점을 추적하도록 설정되었다. 마우스는 20분 동안 개방 박스에서 자유로이 이동하였고, 이의 경로가 자동으로 추적되었고, 소프트웨어(Ethovision XT Version 8)에 의해 분석되었다.
움켜짐. 근긴장이상증 및 운동이상증을 측정하기 위해 움켜짐 시험을 사용하였다. 14초 동안 꼬리에 의해 위아래를 뒤집어 마우스를 매달았다. 각각의 간격을 2초로 하여 14초 실험을 7개의 간격으로 나눴다. 동물에 0(무 움켜짐) 또는 1(움켜짐)의 점수가 제공되었다. 각각의 마우스에 대해 7개의 간격에 대한 점수를 합하여 7의 최대 점수가 되게 하였다. 움켜짐은 각각 2초 간격 내에 임의의 기간 동안 발이 가로질러 가슴까지 껴안는 행동으로 정의되었다. 시험을 비디오 기록하고, 후에 맹검 방식으로 분석하였다.
마우스 체중. R6/2 마우스 모델이 3개월령 후 20% 이하의 체중 감소를 갖는 것으로 공지되면서, 임의의 심한 체중 감소를 관찰하도록 마우스 체중이 추적되었다. 마우스를 동물의 홈룸에서 허가된 벤트 후드 내에서 화요일마다 오후 5:00에 개별적으로 체중을 쟀다.
그립 강도. 마우스 앞발의 강도를 정량적으로 측정하기 위해 그립 강도 시험을 사용하였다. 그램으로 기록하도록 그립 강도 미터(BIO-GS3, Bioseb)가 설정되었다. 각각의 마우스는 이들의 꼬리가 잡혀 있고, 이들의 2개의 앞발로만 금속 그리드를 잡게 하였다. 각각의 실험에 대한 최대 강도를 기록하기 위해 실패까지 마우스를 당겼다. 각각의 마우스를 시점마다 3회 시험하고, 이후 3개의 실험을 평균하여 시험된 각각의 시점에 대해 평균 그립 강도를 계산하였다.
통계
모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시되었다. 2측 스튜던트 t-시험(쌍별 또는 독립)은 2개-그룹 비교 사이의 통계 유의성을 결정하도록 수행되었고, 카이 제곱 시험은 2개 그룹 사이의 백분율의 차이를 비교하도록 사용되었다. 다수의 그룹 비교를 위해 1방향 ANOVA 분석(GraphPad Prism 7.0), 이어서 본페로니 사후 시험을 사용하였다. P < 0.05는 통계학적으로 유의미한 것으로 여겨졌다.
실시예 2 - 선조체 성상교세포를 Htt 유전자의 유전자 편집과 커플링된 GABA성 뉴런으로 직접 전환시키기 위한 유전자 치료 접근법
CRISPR/Cas9 요소의 설계 및 재조합 AAV의 생성
Htt 유전자에 상보성인 표적 서열이 확인된다. Htt 유전자를 표적화하도록 가이드 RNA(gRNA) 서열이 설계된다. 공여자 서열은 Htt 유전자의 CAG 반복부의 수를 36개 미만으로 변형시키도록 설계된다. Htt 특이적 gRNA, Cas9 뉴클레아제 및 공여자 서열은 AAV 벡터, 예를 들어 AAV-Cas9-Htt-P2A-mCherry로 패키징된다. Htt 특이적 gRNA, Cas9 뉴클레아제 및 공여자 서열은 AAV-Cas9-P2A-mCherry, AAV-Htt-P2A-mCherry의 2개의 벡터로 또한 패키징될 수 있다. 실시예 1에 기재된 것과 같이 재조합 AAV 입자를 제조한다.
정위 바이러스 주사
재조합 AAV 입자(AAV-Cas9-Htt-P2A-mCherry)를 실시예 1로부터의 재조합 AAV2/5(GFAP::Cre, CAG::FLEx-NeuroD1-P2AmCherry, CAG::FLEx-Dlx2-P2A-mCherry)와 동시에 R6/2 마우스의 선조체로 주사한다. 이 조합 치료를 받는 대상체를 실시예 1에 기재된 것과 같이 캣워크, 개방 장소 시험, 움켜짐, 마우스 체중 및 그립 강도와 같은 행동 시험에 의해 시험한다. 행동 시험 결과를 상승 효과를 확인하기 위해 (i) 치료를 받지 않는 대조군, (ii) (실시예 1로부터의) GFAP::Cre, CAG::FLEx-NeuroD1-P2A-mCherry, CAG::FLEx-Dlx2-P2A-mCherry 단독에 의한 AAV 치료를 받는대조군 및 (iii) AAV-Cas9-Htt-P2A-mCherryy를 받는 대조군에 대해 비교한다.
재조합 AAV 입자(AAV-Cas9-P2A-mCherry 및 AAV-Htt-P2A-mCherry)를 실시예 1로부터의 재조합 AAV2/5(GFAP::Cre, CAG::FLEx-NeuroD1-P2AmCherry, CAG::FLEx-Dlx2-P2A-mCherry)와 동시에 R6/2 마우스의 선조체로 주사한다. 이 조합 치료를 받는 대상체를 실시예 1에 기재된 것과 같이 캣워크, 개방 장소 시험, 움켜짐, 마우스 체중 및 그립 강도와 같은 행동 시험에 의해 시험한다. 행동 시험 결과를 상승 효과를 확인하기 위해 (i) 치료를 받지 않는 대조군, (ii) (실시예 1로부터의) GFAP::Cre, CAG::FLEx-NeuroD1-P2A-mCherry, CAG::FLEx-Dlx2-P2A-mCherry 단독에 의한 AAV 치료를 받는 대조군 및 (iii) AAV-Cas9-P2A-mCherry 및 AAV-Htt-P2A-mCherry를 받는 대조군에 대해 비교한다.
실시예 3 - 추가 실시형태.
실시형태 1. 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) CAG 반복부 영역을 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 CAG 반복부 영역은 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하고, 상기 공여자 핵산은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 서열을 대체하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 3. 실시형태 1 내지 실시형태 2 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 5. 실시형태 1 내지 실시형태 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 담창구(GP)로 연장된, 방법.
실시형태 7. 실시형태 5에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 흑질 망양체부(SNr)로 연장된, 방법.
실시형태 8. 실시형태 1 내지 실시형태 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 9. 실시형태 1 내지 실시형태 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 10. 실시형태 9에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 11. 실시형태 10에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 12. 실시형태 1 내지 실시형태 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 13. 실시형태 1 내지 실시형태 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 14. 실시형태 1 내지 실시형태 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 15. 실시형태 1 내지 실시형태 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 CRISPR-연관된(Cas) 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 가이드 RNA(gRNA)인, 방법.
실시형태 16. 실시형태 1 내지 실시형태 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 전사 활성인자-유사(TAL) 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 17. 실시형태 1 내지 실시형태 16 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 선조체로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 18. 실시형태 1 내지 실시형태 16 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 19. 실시형태 1 내지 실시형태 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 20. 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 21. 실시형태 20에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 22. 실시형태 20 내지 실시형태 21 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 23. 실시형태 20 내지 실시형태 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 24. 실시형태 20 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 25. 실시형태 24에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 26. 실시형태 24에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 27. 실시형태 20 내지 실시형태 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 28. 실시형태 20 내지 실시형태 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 29. 실시형태 28에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 31. 실시형태 20 내지 실시형태 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 32. 실시형태 20 내지 실시형태 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 33. 실시형태 20 내지 실시형태 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 34. 실시형태 20 내지 실시형태 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 35. 실시형태 20 내지 실시형태 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 36. 실시형태 20 내지 실시형태 35 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 37. 실시형태 20 내지 실시형태 35 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 38. 실시형태 20 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 39. 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 40. 실시형태 39에 있어서, 상기 운동 기능은 소근육 운동, 진전, 발작, 무도병, 근긴장이상증, 운동이상증, 느린 또는 비정상 눈 움직임, 보행 손상, 자세 손상, 균형 손상, 담화의 어려움, 연하의 어려움, 조직화의 어려움, 우선시하기의 어려움, 업무 집중의 어려움, 적응성의 결여, 충동 억제의 결여, 폭발, 개인 자체의 행동 및/또는 능력의 지각의 결여, 생각 처리의 느려짐, 새로운 정보 학습의 어려움, 우울증, 성급함, 슬픔 또는 무관심, 사회적 위축, 불면, 피로, 에너지 결여, 강박 장애, 조병, 양극성 장애 및 체중 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 41. 실시형태 39 내지 실시형태 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 42. 실시형태 39 내지 실시형태 41 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 43. 실시형태 39 내지 실시형태 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 44. 실시형태 39 내지 실시형태 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 45. 실시형태 44에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 46. 실시형태 44에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 47. 실시형태 39 내지 실시형태 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 48. 실시형태 39 내지 실시형태 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 49. 실시형태 48에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 50. 실시형태 50에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 51. 실시형태 39 내지 실시형태 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 52. 실시형태 39 내지 실시형태 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 53. 실시형태 39 내지 실시형태 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 54. 실시형태 39 내지 실시형태 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는, 방법.
실시형태 55. 실시형태 54에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 56. 실시형태 54에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 57. 실시형태 39 내지 실시형태 56 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 58. 실시형태 39 내지 실시형태 56 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 59. 실시형태 39 내지 실시형태 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 60. 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능을 개선하는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, 상기 운동 기능은 소근육 운동, 진전, 발작, 무도병, 근긴장이상증, 운동이상증, 느린 또는 비정상 눈 움직임, 보행 손상, 자세 손상, 균형 손상, 담화의 어려움, 연하의 어려움, 조직화의 어려움, 우선시하기의 어려움, 업무 집중의 어려움, 적응성의 결여, 충동 억제의 결여, 폭발, 개인 자체의 행동 및/또는 능력의 지각의 결여, 생각 처리의 느려짐, 새로운 정보 학습의 어려움, 우울증, 성급함, 슬픔 또는 무관심, 사회적 위축, 불면, 피로, 에너지 결여, 강박 장애, 조병, 양극성 장애 및 체중 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 62. 실시형태 60 내지 실시형태 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 63. 실시형태 60 내지 실시형태 62 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 64. 실시형태 60 내지 실시형태 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 65. 실시형태 60 내지 실시형태 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 66. 실시형태 65에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 67. 실시형태 65에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 68. 실시형태 60 내지 실시형태 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 69. 실시형태 60 내지 실시형태 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 71. 실시형태 70에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 72. 실시형태 60 내지 실시형태 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 73. 실시형태 60 내지 실시형태 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 74. 실시형태 60 내지 실시형태 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 75. 실시형태 60 내지 실시형태 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 76. 실시형태 60 내지 실시형태 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 77. 실시형태 60 내지 실시형태 76 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 78. 실시형태 60 내지 실시형태 77 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 79. 실시형태 60 내지 실시형태 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 80. 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 81. 실시형태 80에 있어서, 상기 포유류의 상기 기대 수명은 약 10% 내지 약 60% 연장된, 방법.
실시형태 82. 실시형태 80 내지 실시형태 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 83. 실시형태 80 내지 실시형태 82 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 84. 실시형태 80 내지 실시형태 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 85. 실시형태 80 내지 실시형태 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 86. 실시형태 85에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 87. 실시형태 85에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 88. 실시형태 80 내지 실시형태 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 89. 실시형태 80 내지 실시형태 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 90. 실시형태 89에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 91. 실시형태 90에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 92. 실시형태 80 내지 실시형태 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 93. 실시형태 80 내지 실시형태 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 94. 실시형태 80 내지 실시형태 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 95. 실시형태 80 내지 실시형태 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는, 방법.
실시형태 96. 실시형태 95에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 97. 실시형태 95에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 98. 실시형태 80 내지 실시형태 97 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 99. 실시형태 80 내지 실시형태 97 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 100. 실시형태 80 내지 실시형태 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 101. 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명을 개선하는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 102. 실시형태 101에 있어서, 상기 포유류의 상기 기대 수명은 약 10% 내지 약 60% 연장된, 방법.
실시형태 103. 실시형태 101 내지 실시형태 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 104. 실시형태 101 내지 실시형태 103 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 105. 실시형태 101 내지 실시형태 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 106. 실시형태 101 내지 실시형태 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 107. 실시형태 106에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 108. 실시형태 106에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 109. 실시형태 101 내지 실시형태 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 110. 실시형태 101 내지 실시형태 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 111. 실시형태 110에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 112. 실시형태 111에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 113. 실시형태 101 내지 실시형태 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 114. 실시형태 101 내지 실시형태 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 115. 실시형태 101 내지 실시형태 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 116. 실시형태 115에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 117. 실시형태 115에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 118. 실시형태 101 내지 실시형태 117 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 119. 실시형태 101 내지 실시형태 118 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 정맥내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 120. 실시형태 101 내지 실시형태 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 121. 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 선조체 위축을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 122. 실시형태 121에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 123. 실시형태 121 내지 실시형태 122 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 124. 실시형태 121 내지 실시형태 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 125. 실시형태 121 내지 실시형태 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 126. 실시형태 125에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 127. 실시형태 125에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 128. 실시형태 121 내지 실시형태 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 129. 실시형태 121 내지 실시형태 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 130. 실시형태 129에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 131. 실시형태 130에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 132. 실시형태 121 내지 실시형태 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 133. 실시형태 121 내지 실시형태 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 134. 실시형태 121 내지 실시형태 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 135. 실시형태 121 내지 실시형태 134 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, 및 (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 136. 실시형태 135에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 137. 실시형태 135에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 138. 실시형태 121 내지 실시형태 137 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 139. 실시형태 121 내지 실시형태 137 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 140. 실시형태 121 내지 실시형태 139 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 141. 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 선조체 위축을 감소시키는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 142. 실시형태 141에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 143. 실시형태 141 내지 실시형태 142 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 144. 실시형태 141 내지 실시형태 143 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 145. 실시형태 141 내지 실시형태 144 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 146. 실시형태 145에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 147. 실시형태 145에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 148. 실시형태 141 내지 실시형태 147 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 149. 실시형태 141 내지 실시형태 148 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 150. 실시형태 149에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 151. 실시형태 150에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 152. 실시형태 141 내지 실시형태 151 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 153. 실시형태 141 내지 실시형태 151 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 154. 실시형태 141 내지 실시형태 453 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 155. 실시형태 141 내지 실시형태 153 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 156. 실시형태 141 내지 실시형태 153 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 157. 실시형태 141 내지 실시형태 156 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 158. 실시형태 141 내지 실시형태 157 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 정맥내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 159. 실시형태 140 내지 실시형태 157 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 160. 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 161. 실시형태 160에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 162. 실시형태 160 내지 실시형태 161 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 163. 실시형태 160 내지 실시형태 162 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 164. 실시형태 160 내지 실시형태 163 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 165. 실시형태 164에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 166. 실시형태 164에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 167. 실시형태 160 내지 실시형태 166 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 168. 실시형태 160 내지 실시형태 167 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 169. 실시형태 168에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 170. 실시형태 169에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 171. 실시형태 160 내지 실시형태 170 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 172. 실시형태 160 내지 실시형태 171 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 173. 실시형태 160 내지 실시형태 172 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 174. 실시형태 160 내지 실시형태 173 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는, 방법.
실시형태 175. 실시형태 174에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 176. 실시형태 174에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 177. 실시형태 160 내지 실시형태 176 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 178. 실시형태 160 내지 실시형태 177 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 179. 실시형태 160 내지 실시형태 178 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 180. 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입을 감소시키는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 181. 실시형태 180에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
실시형태 182. 실시형태 180 내지 실시형태 181 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
실시형태 183. 실시형태 180 내지 실시형태 182 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
실시형태 184. 실시형태 180 내지 실시형태 183 중 어느 하나에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기를 포함하는, 방법.
실시형태 185. 실시형태 184에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
실시형태 186. 실시형태 184에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
실시형태 187. 실시형태 180 내지 실시형태 186 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
실시형태 188. 실시형태 180 내지 실시형태 187 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 189. 실시형태 188에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 190. 실시형태 189에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
실시형태 191. 실시형태 180 내지 실시형태 190 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 192. 실시형태 180 내지 실시형태 190 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
실시형태 193. 실시형태 180 내지 실시형태 192 중 어느 하나에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
실시형태 194. 실시형태 180 내지 실시형태 196 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
실시형태 195. 실시형태 180 내지 실시형태 196 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
실시형태 196. 실시형태 180 내지 실시형태 195 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
실시형태 197. 실시형태 180 내지 실시형태 195 중 어느 하나에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
실시형태 198. 실시형태 180 내지 실시형태 197 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
다른 실시형태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되어 있지만, 상기 설명이 본 발명을 예시하고 이의 범위를 제한하지 않도록 의도되는 것으로 이해되어야 하고, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정된다. 다른 양태, 이점 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 356
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Thr Lys Ser Tyr Ser Glu Ser Gly Leu Met Gly Glu Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Gly Pro Pro Ser Trp Thr Asp Glu Cys Leu Ser Ser Gln Asp Glu
20 25 30
Glu His Glu Ala Asp Lys Lys Glu Asp Asp Leu Glu Ala Met Asn Ala
35 40 45
Glu Glu Asp Ser Leu Arg Asn Gly Gly Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
50 55 60
Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys
65 70 75 80
Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu
85 90 95
Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn
100 105 110
Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Val Val
115 120 125
Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg
130 135 140
Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly
145 150 155 160
Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu
165 170 175
Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro
180 185 190
Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Gln Asp Met Pro Pro His Leu Pro
195 200 205
Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro
210 215 220
Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe
225 230 235 240
His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe
245 250 255
Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro
260 265 270
Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu
275 280 285
Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro
290 295 300
Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Gly
305 310 315 320
Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe
325 330 335
Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala
340 345 350
Ile Phe His Asp
355
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Thr Gly Val Phe Asp Ser Leu Val Ala Asp Met His Ser Thr Gln
1 5 10 15
Ile Ala Ala Ser Ser Thr Tyr His Gln His Gln Gln Pro Pro Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu His
35 40 45
Lys Pro Gln Glu Ser Pro Thr Leu Pro Val Ser Thr Ala Thr Asp Ser
50 55 60
Ser Tyr Tyr Thr Asn Gln Gln His Pro Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Pro Tyr Ala His Met Gly Ser Tyr Gln Tyr Gln Ala Ser Gly
85 90 95
Leu Asn Asn Val Pro Tyr Ser Ala Lys Ser Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr
100 105 110
Thr Ala Ala Tyr Thr Ser Tyr Ala Pro Tyr Gly Thr Ser Ser Ser Pro
115 120 125
Ala Asn Asn Glu Pro Glu Lys Glu Asp Leu Glu Pro Glu Ile Arg Ile
130 135 140
Val Asn Gly Lys Pro Lys Lys Val Arg Lys Pro Arg Thr Ile Tyr Ser
145 150 155 160
Ser Phe Gln Leu Ala Ala Leu Gln Arg Arg Phe Gln Lys Thr Gln Tyr
165 170 175
Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly Leu Thr
180 185 190
Gln Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ser Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Met Trp Lys Ser Gly Glu Ile Pro Ser Glu Gln His Pro Gly Ala
210 215 220
Ser Ala Ser Pro Pro Cys Ala Ser Pro Pro Val Ser Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Trp Asp Phe Gly Val Pro Gln Arg Met Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Ser Gly Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ser Ala Phe Leu Gly Asn Tyr Pro Trp Tyr His Gln Thr Ser Gly
275 280 285
Ser Ala Ser His Leu Gln Ala Thr Ala Pro Leu Leu His Pro Thr Gln
290 295 300
Thr Pro Gln Pro His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ala
305 310 315 320
Pro Val Ser Ala Gly Thr Ile Phe
325
Claims (30)
- 헌팅턴병(Huntington's disease)을 갖는 포유류에서 운동 기능을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 운동 기능은 진전 및 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 상기 신경교 세포는 성상교세포인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 DARPP32-양성인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GABA성 뉴런은 상기 선조체로부터 연장된 축삭 돌기(axonal projection)를 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 GP로 연장된, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 축삭 돌기는 상기 포유류의 SNr로 연장된, 방법.
- 제39항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드는 인간 NeuroD1 폴리펩타이드이거나, 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 인간 Dlx2 폴리펩타이드인, 방법.
- 제39항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 바이러스 벡터의 형태로 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 벡터인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 아데노-연관된 바이러스 벡터는 아데노-연관된 혈청형 2/5 바이러스 벡터인, 방법.
- 제39항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 동일한 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 바이러스 벡터는 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
- 제39항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 별개의 바이러스 벡터에 위치하고, 상기 별개의 바이러스 벡터의 각각은 단계 (a)의 상기 신경교 세포에 투여되는, 방법.
- 제39항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 또는 상기 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 방법.
- 제39항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 치료 성분은 (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이고, 상기 표적화 핵산 서열은 gRNA인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 FokI 뉴클레아제, HhaI 뉴클레아제, HindIII 뉴클레아제, NotI 뉴클레아제, BbvCI 뉴클레아제, EcoRI 뉴클레아제, BglI 뉴클레아제 및 AlwI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 표적화 핵산 서열은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인인, 방법.
- 제39항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 상기 뇌로의 직접 주사를 포함하는, 방법.
- 제39항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산의 상기 투여 또는 상기 유전자 치료 성분의 상기 투여는 복강내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 대뇌내, 뇌실질내, 비강내 또는 경구 투여를 포함하는, 방법.
- 제39항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 상기 포유류를 헌팅턴병을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
- 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, (ii) 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열 및 (iii) CAG 반복부 영역을 포함하는 공여자 Htt 유전자의 단편을 적어도 포함하는 공여자 핵산을 포함하는 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 CAG 반복부 영역은 36개 미만의 CAG 반복부를 포함하고, 상기 공여자 핵산은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자의 서열을 대체하는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 운동 기능을 개선하는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류의 기대 수명을 개선하는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 선조체 위축을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 선조체 위축을 감소시키는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) 유전자 치료 성분을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 유전자 치료 성분은 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 존재하는 하나 또는 둘 다의 Htt 유전자에서의 CAG 반복부의 수를 36개 미만의 CAG 반복부로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법. - 헌팅턴병을 갖는 포유류에서 핵 HTT 폴리펩타이드 봉입을 감소시키는 방법으로서, 상기 포유류는 36개 초과의 CAG 반복부를 갖는 Htt 대립유전자에 이형접합성이고, 상기 방법은
(a) NeuroD1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 Dlx2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 포유류의 선조체 내의 신경교 세포에 투여하는 단계이되, 상기 NeuroD1 폴리펩타이드 및 상기 Dlx2 폴리펩타이드는 상기 신경교 세포에 의해 발현되고, 상기 신경교 세포는 상기 선조체 내에 GABA성 뉴런을 형성하는 단계; 및
(b) (i) 뉴클레아제 또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 (ii) 상기 Htt 대립유전자의 적어도 일부에 상보성인 표적화 핵산 서열을 포함하는 조성물을 상기 포유류의 뇌 내의 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다에 투여하는 단계이되, 상기 조성물은 편집된 Htt 대립유전자를 형성하도록 신경교 세포, 뉴런 또는 둘 다의 상기 Htt 대립유전자를 편집하고, 상기 편집된 Htt 대립유전자는 11개 초과의 연속 글루타민 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 없는 단계를 포함하는, 방법.
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