CN112316115A

CN112316115A - 一种具有抑制恶性肿瘤的蛋白序列及应用

Info

Publication number: CN112316115A
Application number: CN202011155069.3A
Authority: CN
Inventors: 夏勇
Original assignee: JINING MEDICAL UNIVERSITY
Current assignee: Guangzhou Yanzhan Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112316115B

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有高效抑制恶性肿瘤的蛋白序列，还涉及编码上述蛋白序列的基因序列，以及上述蛋白序列的应用。SEQ ID NO.1所述及的蛋白序列在制备抑制恶性肿瘤制剂中的应用，是本发明所要重点保护的内容。SEQ ID NO.1蛋白序列由SEQ ID NO.2所示的基因序列所表达；此外，SEQ ID NO.2所示的基因序列也同样是本发明所要保护的内容。本发明所提供的蛋白序列具有如下的优点：在膀胱癌、肺癌等多种肿瘤细胞种均表现出色的抑制功能；抑癌作用见效快、效果显著；此外，本发明所提供的序列为人源序列，不会引起排异反应，其应用前景广阔。

Description

一种具有抑制恶性肿瘤的蛋白序列及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有抑制恶性肿瘤的蛋白序列，还涉及编码上述蛋白序列的基因序列，以及上述蛋白序列的应用。

背景技术

基因抑制恶性肿瘤的技术，已经逐渐被应用，其以效果好、副作用小而将会逐渐成为传统抑制恶性肿瘤方法的一个重要补充。

从恶性肿瘤的成因来探究，导致癌症产生最主要的原因是基因变异，包括原癌基因的扩增与过度激活和抑癌基因的丢失与沉默。对于恶性肿瘤，在传统的靶向治疗方案中，大多是针对原癌基因激活，例如EGFR突变、Myc突变、ERBB突变等进行的药物设计，但是这些药物往往容易出现肿瘤耐药、副作用强等缺点。

本发明人研究了众多的抑癌基因，其中9号染色体中的9p21.3的locus在众多癌症中都有高比例的基因丢失现象，其中在膀胱癌、肺癌、脑癌等恶性肿瘤中尤为显著。目前尚缺少基于抑癌基因缺失或表达沉默的药物，特别是基因治疗药物。由于基因治疗药物更具针对性，更能够获得较为理想的治疗效果，能大大减轻患者痛苦，并具有广阔的应用前景。开发基因治疗药物的最关键的环节是筛选高效抑癌的基因，并构建高效转染的病毒。

鉴于上述的技术问题，需要发明一种能克服上述技术问题的基因序列和蛋白序列，以突破基因在抑制恶性肿瘤中应用的瓶颈。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种对恶性肿瘤细胞具有强烈抑制作用蛋白序列SEQ ID NO.1。

此外，本发明还提供了表达上述蛋白序列的基因序列，如序列表SEQ ID NO.2所示。

上述的蛋白序列SEQ ID NO.1在制备抑制恶性肿瘤制剂中的应用；以及，

上述的SEQ ID NO.1蛋白序列由SEQ ID NO.2所示的基因序列所表达，都是本发明所要保护的范围。

本发明所述及的恶性肿瘤可以是膀胱癌细胞、肺癌细胞，也可以是其它的癌细胞，并不仅仅限于以上的两种。

一种SEQ ID NO.1所述及的蛋白序列制备的抑制恶性肿瘤制剂，同样也是本发明所要保护的内容。

以及，本发明所述及的表达上述蛋白序列SEQ ID NO.1的基因序列SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.2可以进行同义突变的变体SEQ ID NO.3；本发明所涉及到的p15Inkb蛋白序列或p16Ink4a 蛋白序列制备抑制恶性肿瘤制剂中的应用（p15Inkb蛋白序列或p16Ink4a蛋白序列所对应的为序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4）；以及对应的基因序列SEQ IDNO.6~7，也是本发明所要保护的内容。

本发明中的蛋白序列SEQ ID NO.1，还可以替换为以下基因的序列（以下序列仅仅是列举，并非穷举）：SEQ ID NO.8。包括SEQ ID NO.8所述及的蛋白序列制备的抑制恶性肿瘤制剂，也同样是本发明所要保护的范围。即，通过本发明的构思所作的蛋白序列的变形，也同样能达到表达蛋白序列SEQ ID NO.1所达到目的，像这样的本领域技术人员很容易在本发明所述及的SEQ ID NO.1的基础上进行的变换，也同样落入了本发明所要保护的范围之中。

序列表5中，R=A or G, Y=C or T, H=A, C or T, N=A, C, G or T；

序列表6中，R=A or G, Y=C or T, H=A, C or T, N=A, C, G or T；

序列表7中，R=A or G, Y=C or T, H=A, C or T, N=A, C, G or T；

本发明中的蛋白序列，是以慢病毒表达为例，但是本发明所要保护的并非仅仅是慢病毒表达的蛋白序列，采用其他一切合适合理方式表达的上述蛋白序列但凡能达到本发明所述及效果的，也同样属于本发明的保护范围，例如在癌症防治中的应用中，还可以采用腺相关病毒、腺病毒、大肠杆菌表达、酵母表达等表达以及化学合成的上述蛋白序列。

本发明的有益效果如下：

（1）蛋白序列p15N-p16C的抗癌作用有以下优点：起效快，在蛋白表达之后3天有明显效果，并且可以在10天内对癌细胞活力达到95%以上的抑制（从附图6- 9可以看出）；

（2）从附图5可以看出，本发明所构建的慢病毒具有转染效率高、可以实时跟踪转染效率的特点；

（3）本发明的作用机制不仅仅局限于抑制CDK4/6相关的细胞周期，更重要的是可以影响癌细胞黏着斑、细胞连接分子、以及癌细胞对氧水平的反应等（见图10），这意味着蛋白序列p15N-p16C可通过新颖的机制发挥抗癌作用；

（4）本发明的序列为人源序列，不会引起排异反应，其应用前景广阔。

附图说明

图1为染色体9p21上的基因p14Arf、p16Ink4a以及p15Ink4b在膀胱癌细胞系UMUC3中表达后，对细胞生长的影响；

图2 p16N-p15C与p15N-p16C过表达质粒后，对比其与p16Ink4a、p15Ink4b对抑制癌细胞的效果；

图3为本发明表达蛋白的空间结构；

图4为本发明涉及的慢病毒载体元件构成图；

图5为本发明病毒转化效果图；上图为病毒在293T细胞内的包装情况（左图为白场照片，右图为相同视野的荧光照片）；下图为病毒感染膀胱癌细胞UMUC3细胞株的效果（左图为白场照片，右图为相同视野的荧光照片）；

图6为本发明在膀胱癌细胞有效性实验结果（起效时间、形态学）；（左图均为白场照片，右图均为相同视野的荧光照片）；

图7为本发明在膀胱癌细胞有效性实验结果（起效时间、细胞活力）；

图8为本发明在肺癌细胞有效性实验结果（与对照进行比较图、荧光照片）；

图9为本发明在肺癌细胞有效性实验结果（与对照进行比较、结晶紫染色）；

图10为从转录组学角度揭示本发明治疗膀胱癌细胞的分子机制；

图11 为本发明抗癌作用的动物体内实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

一种蛋白序列，其具有SEQ ID NO.1所示的蛋白序列（以下简称p15N-p16C），其来源如下：人源蛋白p15Ink4b序列的N端与p16Ink4b序列的C端。

表达蛋白序列SEQ ID NO.1的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

蛋白序列SEQ ID NO.1是本发明人通过对比染色体9p21区段编码的多种蛋白，如p14Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、MTAP等进行对比分析之后通过付出创造性的劳动所获得的。

本发明人通过大量的对比分析实验之后，结果发现，只有p15Ink4b与p16Ink4a对于肿瘤细胞明显有较强的抑制作用（p15Ink4b的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示，p16Ink4a的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示），结果见附图1。

图1 在膀胱癌细胞系UMUC3中，用脂质体lipofectamine2000法，在6孔板中分别转染过表达质粒（pcDNA3.1）p14Arf, p16Ink4a和p15Ink4b。转染后8小时后换液，并于12小时后将细胞培养至96孔板，以CCK-8试剂盒作为检测方法，监控细胞活力。结果显示，9p21区段表达的基因中，只有p15Ink4b与p16Ink4a能够对癌细胞有明显抑制作用。

本发明人在通过比对p15Ink4b与p16Ink4a 氨基酸序列发现，二者有很大的共性：二者都具有Ankyrin repeat domain（已知此Ankyrin domain的靶点之一为CDK4/6， CDK4/6是细胞周期的关键酶，与癌细胞过度增殖关系密切）, 二者的蛋白质序列在中间有72个氨基酸是相同的；但是二者在N端和C端的序列有较大差异。为了研究p15Ink4b与p16Ink4a的N端与C端结构域的功能，并且针对性的开发基因治疗产品，发明人构建了p16N-p15C与p15N-p16C过表达质粒，并且对膀胱癌细胞进行转染，实验发现p15N-p16C不但能结合更多的CDK4/6，而且能更加有效地抑制癌细胞增殖（如附图2所示）。

图2 构建p16N-p15C与p15N-p16C过表达质粒后，对比其与p16Ink4a、p15Ink4b对抑制癌细胞的效果。在膀胱癌系UMUC3中，用脂质体lipofectamine2000法，分别转染等量的p16Ink4a, p15Ink4b, p16N-p15C以及p15N-p16C，转染后第5天，用CCK8试剂检测细胞活力。结果显示p15N-p16C比单纯的p15Ink4b和p16Ink4a能更加有效地抑制癌细胞增殖。

本发明人利用计算机模拟展示了本发明所表达的蛋白p15N-p16C的空间结构图（见图3）：N-terminal表示N-端序列，C-terminal表示C-端序列。蛋白空间结构显示，此蛋白有多个α螺旋，是构成具有细胞周期抑制结构域-Ankyrin domain的重要组成部分，是发挥抑癌作用的重要结构域。

随后，发明人对p15N-p16C在抗肿瘤方面的性能进行了更加深入的探究：为了提高细胞转染效率，以及持续表达p15N-p16C，发明人构建了慢病毒载体（载体结构设计见图4）。

从附图5可以看出，本发明所构建的慢病毒具有转染效率高、可以实时跟踪转染效率的特点。从附图6-9中可以看出，蛋白序列p15N-p16C的抗癌作用有以下优点：第一、可以迅速有效控制癌细胞生长，并且可以在10天内对癌细胞活力达到95%以上的抑制；第二、蛋白序列p15N-p16C的结构域与人源蛋白一致，不会引起人体排异反应。

通过转录组学研究发现，本发明的作用机制，不仅仅局限于抑制CDK4/6相关的细胞周期，更重要的是可以影响癌细胞黏着斑、细胞连接分子、以及癌细胞对氧水平的反应等（见图10），这意味着蛋白序列p15N-p16C可通过多种新颖的机制发挥抗癌作用。

以慢病毒表达载体来源为例，本发明人所进行的工作如下：

1.1慢病毒表达载体来源：发明人设计序列后，按照所设计序列，从云舟生物订购慢病毒表达载体Lenti-EF1a-p15Np16C-CMV-EGFP-Puro（简称pLp15Np16C），（载体设计见附图3）。商品化的对照载体购自云舟生物（注：对照载体的元件，除了没有p15N-p16C序列，其他元件与本发明所设计载体“pLp15Np16C”完全一样）。

附图3为本发明所设计的高效表达p15N-p16C所需的慢病毒质粒。其中p15N-p16C的启动子为真核生物启动子EF1A。p15N-p16C的启动子不仅限于EF1A，其他启动子例如CMV、FEs、CAG、CBh、SV40、hPGK、UBC等能起到类似作用的启动子，都属于本发明的保护范围。

病毒包装载体：pMD2.G（pvsvg）与psPAX2购自优泽生物。

通过对p15Ink4b以及p16Ink4a的比对和结构域分析，本发明人设计了p15N-p16C的蛋白序列，并且合成了编码p15N-p16C的基因序列，构建了带有荧光标签、能够稳定转染细胞的慢病毒载体。

本发明所构建的p15N-p16C慢病毒具有优良的细胞感染能力，从图5 中可以看出，p15N-p16C慢病毒的感染效率可达80%以上。

从附图6中可以看出，本发明所构建的p15N-p16C过表达慢病毒抑制膀胱癌细胞UMUC3生长的效果，图6为UMUC3随时间变化照片（左图为白场照片，右图为相同视野的荧光照片）。可见，UMUC3细胞在感染p15N-p16C慢病毒后，随着时间的延长，细胞状态愈来愈差，在第十天左右几乎完全死亡。这证明了本发明的蛋白序列对于抑制肿瘤细胞的效果优异。

图7为用CCK8试剂盒检测本发明所构建的p15N-p16C过表达慢病毒抑制膀胱癌细胞UMUC3生长的效果。从图7中可以看出UMUC3的细胞活力随时间的变化，UMUC3细胞在感染p15N-p16C慢病毒后，随着时间的延长，细胞活力逐渐递减，在第十天左右几乎完全死亡。证实了本发明可以对膀胱癌细胞有高效抑制作用。

图8为本发明所构建的p15N-p16C过表达慢病毒在肺癌细胞A549细胞株的抑癌效果。图8中的上图为A549细胞感染对照慢病毒后，7天之后的状态；图8中的下图为A549细胞感染p15N-p16C过表达慢病毒后，7天之后的状态。上下图比较显示，下图中细胞状态明显异常（体积明显增大、形状异常），并且数量显著减少。p15N-p16C过表达慢病毒与对照慢病毒相比，只有一个差异：即可以表达p15N-p16C这种蛋白。所以，可以确定由于p15N-p16C的过表达，使肺癌细胞A549生长受到抑制。

图9为用结晶紫染色法对比本发明所构建的p15N-p16C过表达慢病毒在肺癌细胞A549细胞株的抑癌效果。A549细胞培养到4个35mm培养皿中，待共密度至20%时，将A549细胞随机分为2组；一组感染p15N-p16C过表达慢病毒，一组感染对照慢病毒。感染24小时后换液培养，以后每隔3天换液一次。10天后，对细胞进行结晶紫染色，并且拍照记录。结果发现，p15N-p16C的过表达A549细胞几乎停止生长，并且形态异常。证实了本发明可以对肺癌细胞具有高效抑制作用。

附图10从转录组学角度揭示本发明治疗膀胱癌细胞的分子机制。转录组学显示，蛋白序列p15N-p16C治疗膀胱癌细胞UMUC3后，在细胞生物学过程、细胞成分以及分子功能等方面发生了变化，主要集中于影响细胞黏着斑、细胞连接分子、胞外基质的变化，以及影响固醇类物质的生物合成。

本发明中以慢病毒表达载体来源，具有如下的优点：

1. 具有EGFP标签，可以实时监控病毒在细胞中的转染效率；

2. 具有真核抗性，可以筛选稳转株；

3. 具有强启动子，表达量高；

4. 抑癌蛋白的有效性：p15N-p16C对于膀胱癌细胞强烈抑制作用；

5. 在膀胱癌、肺癌等多种肿瘤细胞种均表现出色的抑癌功能。

当然，本发明仅仅是以慢病毒表达载体来源为例，来阐述p15N-p16C的蛋白序列的合成过程，以其它的方式例如腺相关病毒、腺病毒、大肠杆菌表达、酵母表达等表达以及化学合面的方式均可行。

1.2病毒制备方法：

1.2.1 293T细胞密度接近80%左右时进行传代，加入37℃预热的胰酶进行消化，将消化离心混匀后的细胞种于10mm培养皿。将细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育24h,当细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的50-60％时转染慢病毒质粒；

1.2.2 取两个无菌1.5ml EP管，分别加入200µl无血清DMEM，其中一个EP管内加入含有目的基因的病毒载体核心质粒和病毒包装质粒，病毒包装质粒按照pLp15Np16C: pMD2.G:psPAX2 = 5:2:3比例加入（总量10ug）；另一个EP管中加入20 µl lipofectamine2000 (购自Invitrogen)；

1.2.3于超净台中，室温静置5分钟，然后将两管充分混匀，室温静置20分钟；

1.2.4将上述步骤中的混合液逐滴加入细胞培养皿中，轻轻摇动细胞培养皿混匀，然后置于含5％CO₂的37℃温箱孵育；

1.2.5 16小时后吸去培养基，加入适量37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育；

1.2.6转染后48到72小时，观察到培养基变黄并且293T细胞贴壁松动时，收集含慢病毒的上清，1200rpm离心5分钟，留上清。

1.3病毒浓缩

病毒浓缩采用超速离心浓缩法

（1）取超速离心管用70%乙醇消毒并放在超净工作台中紫外灯照射30分钟；

（2）每个离心管中加入24ml的预先离心处理的病毒上清液（按照“1.2 病毒制备”方法准备）；

（3）用移液管吸取20%的蔗糖溶液，然后将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出3 ml；

（4）用PBS配平各离心管，准备超速离心；

（5）按次序将装有病毒溶液的离心管放入超速离心转头中；

（6）25000 rpm，4℃，(约80000g) 离心2小时；

（7）取出离心管，倒掉上清，将离心管倒扣在吸水纸上吸干多余的上清。吸掉剩余的液滴，在管底应当有可见的沉淀；

（8）用约1ml预冷的无菌PBS溶解沉淀，于4℃中每隔10分钟轻轻震荡，持续1小时；

（9）于4℃，500g轻微离心1分钟，使溶液集中于管底。

（10）用移液器轻柔吹打使沉淀重悬，重悬浮后的病毒悬液分装成50μl 每份，于-80 ℃冻存。

1.4细胞感染：

（1）将待转染的实验细胞平铺于35mm培养皿，12~24h后换液，最佳密度为30~50％；

（2）病毒感染前，将细胞的培养基更换为2.5%FBS的无抗生素DMEM；

（3）在培养基中加入polybrene使其终浓度为5µg/ml，按照MOI=5缓缓滴加病毒，并充分混匀；

（4）感染16小时后，更换培养基为含有10%FBS的DMEM。

实施例2

取4周龄的裸鼠Balb/C, 在SPF动物房自适应一周后，随机分为两组，一组皮下注射SW780膀胱癌细胞系（对照组），另一种注射被本发明p15N-p16C慢病毒感染后的SW780。20天后对小鼠肿瘤进行拍照。图11为小鼠体内实验验证p15N-p16C抑癌效果。结果发现，p15N-p16C处理组的小鼠未生成皮下肿瘤，这说明p15N-p16C可以有效起到抑制肿瘤的作用。

除了上述的实施例中所列举的序列，本发明中的蛋白序列SEQ ID NO.1，还可以替换为以下基因的序列（以下序列仅仅是列举，并非穷举）：SEQ ID NO.8。上述的序列经过变形，也同样能达到表达蛋白序列SEQ ID NO.1的目的。像这样的本领域技术人员很容易在本发明所述及的SEQ ID NO.1上所作的变换，也同样落入了本发明所要保护的范围之中。

序列表

<110> 济宁医学院

<120> 一种具有抑制恶性肿瘤的蛋白序列及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> 蛋白序列(Protein sequence)

<400> 1

Met Arg Glu Glu Asn Lys Gly Met Pro Ser Gly Gly Gly Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Leu Val Glu Lys Val Arg Gln

20 25 30

Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp Pro Asn Gly Val Asn Arg Phe Gly Arg

35 40 45

Arg Ala Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu

50 55 60

Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu

65 70 75 80

Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu

85 90 95

Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp

100 105 110

Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val

115 120 125

Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His

130 135 140

Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp

145 150 155

<210> 2

<211> 477

<212> DNA

<213> 基因序列(gene sequence)

<400> 2

atgcgcgagg agaacaaggg catgcccagt gggggcggca gcgatgaggg tctggccagc 60

gccgcggcgc ggggactagt ggagaaggtg cgacagctcc tggaagccgg cgcggatccc 120

aacggagtca accgtttcgg gaggcgcgcg atccaggtca tgatgatggg cagcgcccgc 180

gtggcggagc tgctgctgct ccacggcgcg gagcccaact gcgcagaccc tgccactctc 240

acccgaccgg tgcatgatgc tgcccgggag ggcttcctgg acacgctggt ggtgctgcac 300

cgggccgggg cgcggctgga cgtgcgcgat gcctggggcc gtctgcccgt ggacctggct 360

gaggagctgg gccatcgcga tgtcgcacgg tacctgcgcg cggctgcggg gggcaccaga 420

ggcagtaacc atgcccgcat agatgccgcg gaaggtccct cagacatccc cgattaa 477

<210> 3

<211> 138

<212> PRT

<213> 蛋白序列(Protein sequence)

<400> 3

Met Arg Glu Glu Asn Lys Gly Met Pro Ser Gly Gly Gly Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Leu Val Glu Lys Val Arg Gln

20 25 30

Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp Pro Asn Gly Val Asn Arg Phe Gly Arg

35 40 45

Arg Ala Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu

50 55 60

Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu

65 70 75 80

Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu

85 90 95

Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp

100 105 110

Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Arg Gly His Arg Asp Val

115 120 125

Ala Gly Tyr Leu Arg Thr Ala Thr Gly Asp

130 135

<210> 4

<211> 156

<212> PRT

<213> 蛋白序列(Protein sequence)

<400> 4

Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu

1 5 10 15

Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu

20 25 30

Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro

35 40 45

Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu

50 55 60

Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg

65 70 75 80

Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val

85 90 95

Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg

100 105 110

Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg

115 120 125

Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg

130 135 140

Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp

145 150 155

<210> 5

<211> 474

<212> DNA

<213> 基因序列(gene sequence)

<400> 5

atgcgngarg araayaargg natgccntcn ggnggnggnt cngaygargg nctngcntcn 60

gcngcngcnc gnggnctngt ngaraargtn cgncarctnc tngargcngg ngcngayccn 120

aayggngtna aycgnttygg ncgncgngcn athcargtna tgatgatggg ntcngcncgn 180

gtngcngarc tnctnctnct ncayggngcn garccnaayt gygcngaycc ngcnacnctn 240

acncgnccng tncaygaygc ngcncgngar ggnttyctng ayacnctngt ngtnctncay 300

cgngcnggng cncgnctnga ygtncgngay gcntggggnc gnctnccngt ngayctngcn 360

gargarctng gncaycgnga ygtngcncgn tayctncgng cngcngcngg nggnacncgn 420

ggntcnaayc aygcncgnat hgaygcngcn garggnccnt cngayathcc ntaa 474

<210> 6

<211> 411

<212> DNA

<213> 基因序列(gene sequence)

<400> 6

atgcgngarg araayaargg natgccntcn ggnggnggnt cngaygargg nctngcntcn 60

gcngcngcnc gnggnctngt ngaraargtn cgncarctnc tngargcngg ngcngayccn 120

aayggngtna aycgnttygg ncgncgngcn athcargtna tgatgatggg ntcngcncgn 180

gtngcngarc tnctnctnct ncayggngcn garccnaayt gygcngaycc ngcnacnctn 240

acncgnccng tncaygaygc ngcncgngar ggnttyctng ayacnctngt ngtnctncay 300

cgngcnggng cncgnctnga ygtncgngay gcntggggnc gnctnccngt ngayctngcn 360

gargarcgng gncaycgnga ygtngcnggn tayctncgna cngcnacngg n 411

<210> 9

<211> 465

<212> DNA

<213> 基因序列(gene sequence)

<400> 9

atggarccng cngcnggntc ntcnatggar ccntcngcng aytggctngc nacngcngcn 60

gcncgnggnc gngtngarga rgtncgngcn ctnctngarg cnggngcnct nccnaaygcn 120

ccnaaytcnt ayggncgncg nccnathcar gtnatgatga tgggntcngc ncgngtngcn 180

garctnctnc tnctncaygg ngcngarccn aaytgygcng ayccngcnac nctnacncgn 240

ccngtncayg aygcngcncg ngarggntty ctngayacnc tngtngtnct ncaycgngcn 300

ggngcncgnc tngaygtncg ngaygcntgg ggncgnctnc cngtngayct ngcngargar 360

ctnggncayc gngaygtngc ncgntayctn cgngcngcng cnggnggnac ncgnggntcn 420

aaycaygcnc gnathgaygc ngcngarggn ccntcngaya thccn 465

<210> 8

<211> 158

<212> PRT

<213> 蛋白序列(Protein sequence)

<400> 8

Met Arg Glu Glu Asn Lys Gly Met Pro Ser Met Glu Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Leu Val Glu Lys Val Arg Ala

20 25 30

Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp Pro Asn Ala Pro Asn Arg Phe Gly Arg

35 40 45

Arg Ala Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu

50 55 60

Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu

65 70 75 80

Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu

85 90 95

Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp

100 105 110

Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val

115 120 125

Ala Gly Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His

130 135 140

Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp

145 150 155

Claims

1.SEQ ID NO.1所述及的蛋白序列在制备抑制恶性肿瘤制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的SEQ ID NO.1蛋白序列由SEQ ID NO.2所示的基因序列所表达。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤为膀胱癌细胞、肺癌细胞。

4.一种基因序列，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

5.p15Ink4b蛋白序列或p16Ink4a蛋白序列制备抑制恶性肿瘤制剂中的应用；以及，利用p15Ink4b蛋白序列SEQ ID NO.3或p16Ink4a 蛋白序列SEQ ID NO.4制备的抑制恶性肿瘤制剂。

6.如SEQ ID NO.5所示的基因序列；以及SEQ ID NO.5所述及的基因序列表达蛋白序列SEQ ID NO.1。

7.如SEQ ID NO.6所示的基因序列；SEQ ID NO.6所述及的基因序列表达蛋白序列SEQID NO.3。

8.如SEQ ID NO.7所示的基因序列；SEQ ID NO.7所述及的基因序列表达蛋白序列SEQID NO.4。

9.SEQ ID NO.8所述及的蛋白序列在制备抑制恶性肿瘤制剂中的应用。

10.一种SEQ ID NO.1/ SEQ ID NO.8所述及的蛋白序列制备的抑制恶性肿瘤制剂。