CN116064630A - 一种基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,属于生物技术领域。上述方法是通过调节Cas蛋白的细胞内酰基化水平并通过对酰基化位点进行理性改造,获得活性高且不受细胞内环境影响的Cas蛋白,提高对目标基因的编辑效率。本发明通过实验验证了体外Cas9蛋白的乙酰化对dsDNA切割功能的影响,证实了体内小分子代谢物导致的乙酰化修饰改变了Cas9的切割活性。同时,发现在体内Cas9蛋白乙酰化改变了Cas9的切割活性。此外,通过对Cas9蛋白进行模拟突变,获得了活性较高的Cas9蛋白突变体,从而获得了高效的基因编辑工具,为理性挖掘新的改造位点提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法。
背景技术
CRISPR-Cas是一种广泛存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统,防御噬菌体和质粒的入侵。随着CRISPR-Cas系统的发现的越来越多,目前主要分为6种类型(Ⅰ-Ⅵ),其中Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型在科学研究中应用更为广泛。CRISPR-Cas9主要由两部分组成,一部分是CRISPR核酸阵列部分,噬菌体或者质粒等初次入侵宿主时,宿主摄取并整合外源入侵的一段特异性DNA片段至自身基因组CRISPR序列中,以储存和记录入侵的外源核酸片段;另一部分是Cas蛋白(核酸酶)部分,对入侵的外源DNA进行切割,以实现免疫防御功能。当噬菌体再次入侵宿主时,宿主会直接将储存在CRISPR序列中的特异性DNA片段转录加工成crRNA,和带有正电荷的Cas9蛋白结合后,引导复合物至噬菌体DNA处并对其切割。
近几年,sgRNA引导的Cas核酸酶被开发为强大的基因组编辑和基因调控的新工具。准确控制宿主细胞中Cas酶的活性对于这种生物技术的实际基因组编辑应用非常重要。许多抗CRISPR蛋白(Acrs),已经进化到可以逃避CRISPR系统,已被证明可以通过蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质修饰来调整CRISPR-Cas活性。最近,Acr介导的Cas系统的乙酰化和ADP-核糖基化已被报道。AcrIF11是一种ADP-核糖基转移酶,特异性地修饰I型Cas8f的PAM识别环中的N250残基,从而抑制其DNA结合活性并使CRISPR系统失活。AcrVA5是一种乙酰化转移酶,通过将MbCas12a的DNA结合界面上的K635残基进行乙酰化,阻断目标DNA的结合从而抑制V型Cas12a的活性。酰基化是一种主要的翻译后蛋白质修饰,在酶的活性、蛋白质的稳定性、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与DNA的结合亲和力和蛋白质的定位方面起着重要的调节作用。研究表明,蛋白质的酰基化可以通过两种不同的机制发生:依赖于酰基转移酶的酶催化的酰基化和非酶催化的酰基化(化学酰基化),后者由细胞内的高能中间体如乙酰磷酸(AcP)或短链酰基辅酶A驱动。在大肠杆菌中,与酶促乙酰化相比,用AcP进行的非酶促乙酰化更全面,特异性更低,被认为在影响蛋白质乙酰化水平方面占主导地位。另一方面,活性部位的许多赖氨酸残基对Cas与目标DNA的结合和切割活动非常重要。这些观察结果提出了一种可能性,即引入细胞的Cas9蛋白可能被细胞内乙酰磷酸或短链酰基-CoA驱动的非酶催化的酰基化共价修饰,这对宿主细胞中CRISPR的基因组编辑应用可能会产生影响,但目前没有相关技术的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,以解决上述现有技术存在的问题,通过调节Cas蛋白的细胞内酰基化水平并通过对酰基化位点进行理性改造,获得了高效的基因编辑工具,为理性挖掘新的改造位点提供了新的思路。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,通过调节Cas蛋白的细胞内酰基化水平并通过对酰基化位点进行理性改造,获得活性高且不受细胞内环境影响的Cas蛋白,提高对目标基因的编辑效率。
优选的是,所述Cas蛋白为应用于基因编辑的Cas核酸酶,更优选的,Cas核酸酶包括Cas9、Cas12等。
优选的是,所述方法是细胞内Cas蛋白的酰基化水平调控及酰基化位点理性改造,提高Cas活性及CRISPR基因编辑效率。
优选的是,通过细胞内代谢产物酰基化细胞内的外源Cas蛋白,以调控所述Cas蛋白活性。
优选的是,所述细胞内代谢产物包括乙酰磷酸、乙酰CoA、丙酰CoA或琥珀酰CoA。但不限于此。
优选的是,基于基因工程技术,定点突变由所述细胞内代谢产物酰基化的Cas蛋白的酰基化位点处赖氨酸为精氨酸(模拟不能酰基化的赖氨酸位点K33R/K954R/K1097R,酰基化水平为零)或者谷氨酰胺(模拟赖氨酸酰基化位点K33Q/K954Q/K1097Q,酰基化水平为100%),消除所述细胞内代谢产物对Cas蛋白酰基化的影响,提高CRISPR基因编辑效率。
优选的是,所述酰基化位点出赖氨酸包括Cas9蛋白的第33、954以及1097位赖氨酸,但不限于此。更优选的是,化脓链球菌的II型CRISPR系统的Cas9蛋白的K33、K954、K1097等。
优选的是,通过改变培养细胞的环境条件,促使所述细胞内代谢产物的累积,进而通过所述细胞内代谢产物调控所述Cas蛋白的细胞内酰基化水平。
优选的是,所述酰基化包括乙酰化、丙酰化或琥珀酰化。但不限于此。
优选的是,改变培养细胞的环境条件包括向培养细胞的培养基中添加乙酸钠,或者敲除影响细胞内代谢产物累积的基因。如,在LB培养基添加1%乙酸钠导致大肠杆菌胞内积累更多的AcP;pta基因敲除导致大肠杆菌胞内积累更多的AcP。
优选的是,所述目的基因包括EMX1基因和sfGFP基因。但不限于这两个基因。
本发明公开了以下技术效果:
本发明利用Nano-HPLC-MS/MS对化脓链球菌II型CRISPR系统Cas9蛋白的赖氨酸乙酰化位点进行鉴定,结合文献报道的Cas9与sgRNA结合或者互作的位点确定了潜在的可改造位点K33,K954和K1097。发现非酶AcP催化的K33及K1097位点的乙酰化能调节Cas9蛋白的催化活性。在体外Cas9蛋白的乙酰化对dsDNA切割功能的影响,证实了体内小分子代谢物导致的乙酰化修饰改变Cas9的切割活性。在体内模拟发生乙酰化的Cas9蛋白(K33Q/K1097Q),明显降低了CRISPR的基因编辑效率;在体内模拟不能发生乙酰化的Cas9蛋白(K1097R),明显增加了CRISPR的基因编辑效率。因此,通过改造酰基化位点调节Cas9蛋白的活性,可以成为改进CRISPR基因编辑效率的工具,这对理性改造CRISPR基因编辑工具起到非常重要的作用,也对提高其他酶的活性具有重要的指导意见。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Cas9的乙酰化切割原理图(A)、不同浓度AcP孵育下,Cas9的乙酰化水平分析(B)、不同浓度AcP催化下Cas9的切割效率图(C)以及Cas9蛋白突变体Cas9K33Q,Cas9K33R,Cas9K954Q,Cas9K954R,Cas9K1097Q和Cas9K1097R的体外切割效率比较(D);C和D图下面的数字代表切割效率,计算公式为(切割条带的加和)/(切割条带和剩余条带的加和);
图2为K33(A),K954(B)和K1097(C)的质谱图;
图3为不同浓度琥珀酰CoA孵育下,Cas9的琥珀酰化水平分析(A)、不同浓度琥珀酰CoA催化下Cas9的切割效率图(B)、不同浓度AcP孵育下,Cas12a的乙酰化水平分析(C)、不同浓度AcP催化下Cas12a的反式切割图(D)以及不同浓度AcP催化下Cas12a的顺式切割图(E);
图4为体内AcP催化的Cas9乙酰化调控Cas9蛋白的功能;(A)Δpta突变体和WT中AcP含量比较;(B)Δpta突变体和WT中全蛋白乙酰化水平比较;(C)Δpta突变体和WT中Cas9蛋白的乙酰化水平比较;(D)Δpta突变体和WT中Cas9蛋白切割效率比较;(E)1%乙酸钠添加的LB培养条件和LB培养条件下的胞内AcP含量比较;(F)1%乙酸钠添加的LB培养条件和LB培养条件下的全蛋白乙酰化水平比较;(G)1%乙酸钠添加的LB培养条件和LB培养条件下的Cas9蛋白的乙酰化水平比较;(H)1%乙酸钠添加的LB培养条件和LB培养条件下的Cas9蛋白切割效率比较。
图5为pWT-Ara-Cas9质粒元件示意图;
图6为pProBE-sfGFP的质粒元件示意图;
图7为pWT-Ara-Cas9和pProBE-sfGFP双质粒转化DH5α菌株在未添加(A)和添加(B)阿拉伯糖诱导剂的反应原理示意图;
图8为pWT-Ara-Cas9和pProBE-sfGFP双质粒转化DH5α菌株在LB培养基和添加1%乙酸钠的LB培养基条件下的切割效果测试;
图9为Cas9蛋白突变体Cas9K33Q,Cas9K33R,Cas9K954Q,Cas9K954R,Cas9K1097Q和Cas9K1097R的体内切割效率比较;
图10为pWT-Ara-BE2质粒图谱;
图11为PproBE-P117-YhaJ-pyqjF质粒图谱;
图12为菌株EaraPti构建图谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
1、材料与方法
1.1SpyCas9和LbCas12a蛋白的纯化
将质粒pET28a-SpyCas9和pET28a-LbCas12a分别转化BL21(DB3.1)感受态,挑取单克隆于5mL LB中,过夜培养后再次接种至5mL LB中活化,然后将5mL菌液接种至100mL LB培养基中培养。当OD值达到0.6-0.8,加入0.5mM IPTG,18℃过夜诱导His-SpyCas9和His-LbCas12a重组蛋白。4000g,4℃离心10分钟收集细胞后,使用1×PBS重悬,离心弃上清。再次使用1×PBS缓冲液重浮细胞,超声处理裂解细胞,然后9000g,4℃离心10分钟收集上清。我们通过Ni-NTA琼脂糖树脂(TransGen Biotech)纯化Cas9蛋白。首先,用10mL缓冲液A(10mM咪唑,50mM磷酸二氢钠,300mM氯化钠,pH8.0)平衡预装的Ni-NTA琼脂糖柱。第二,将裂解液的上清液流过柱子,并加入20mL Buffer B(20mM咪唑,50mM磷酸二氢钠,300mM氯化钠,pH8.0)以除去其他蛋白质。第三,加入20mL缓冲液C(50mM咪唑,50mM磷酸二氢钠,300mM氯化钠,pH8.0)以进一步去除其他蛋白质。最后,用5mL缓冲液D(250mM咪唑,50mM磷酸二氢钠,300mM氯化钠,pH8.0)洗脱,得到Cas9蛋白。使用Ultra Centrifugal Filters(UFC9030)离心管浓缩Cas9蛋白。通过Coomassie染色SDS-PAGE胶分析鉴定Cas9蛋白,并用BCA试剂测定蛋白浓度(以BSA为标准)。
LbCas12a的纯化方法与Cas9略有不同。将菌体收集后,先用1×PBS缓冲液清洗一次,离心去上清,然后将细胞重悬于缓冲液E(10mM咪唑,50mM Tris-HCl,1.5M氯化钠,1mM二硫苏糖醇,pH 8.0)中。通过超声处理裂解细胞,9000g,4℃离心10分钟收集上清。同时用缓冲液E平衡好Ni-NTA琼脂糖树脂后,加入破碎后收集的上清液,待上清液上柱完成后加入缓冲液F(30mM咪唑,50mM Tris-HCl,1.5M氯化钠,1mM二硫苏糖醇,pH 8.0)来清洗其他蛋白质。然后,使用缓冲液G(600mM咪唑,50mM Tris-HCl,1.5M氯化钠,1mM二硫苏糖醇,pH 8.0)洗脱LbCas12a蛋白。最后,使用缓冲液H(50mM Tris-HCl,200mM氯化钠,1mM二硫苏糖醇,5%甘油,pH 8.0)作为储备溶液。
1.2Western blot实验鉴定AcP催化的Cas9/Cas12a蛋白乙酰化依赖于浓度变化
将纯化的Cas9/Cas12a蛋白定量后用于AcP乙酰化实验,反应体系如下表1:
表1
将不同浓度的AcP和Cas9或Cas12a混合后的反应体系在37℃水浴锅中孵育5h,反应结束后取25μL混合液加至10%浓度的蛋白胶上电泳(80V,30min;120V,2h)。电泳后,将蛋白胶以恒流380mA下转膜90min,将Cas9/Cas12a蛋白转移至PVDF膜上,期间更换冰袋防止转膜液过热;转膜完成后,膜正面朝上置于孵育盒中,加入10mL TBST缓冲液清洗PVDF三次,随后加入10mL封闭液(含有5%牛血清白蛋白的TBST缓冲液)封闭2h,然后加入2μL鼠源乙酰化抗体封闭1.5h或者4℃封闭过夜。弃去封闭液,加入10mL TBST缓冲液清洗三次,然后在10mLTBST缓冲液中加入2μL Anti-mouse HRP,室温孵育55min,使用TBST缓冲液清洗三次。加入等体积比例的ECL化学发光试剂盒中的A液和B液,使用ECL化学发光凝胶成像分析系统对其进行成像分析。
1.3体外不同浓度AcP孵育后的Cas9的切割效率
Cas9的乙酰化切割总体系为20μL,首先将100nM Cas9和不同浓度的AcP(0/5/10/20/40mM)加至切割缓冲液(100mM氯化钠,50mM Tris-HCl,10mM氯化镁,pH7.9)中,常温孵育20min;随后加入200nM sgRNA(5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’),37℃孵育10min;加入10nMEMX1片段孵育1h;加入2μL蛋白酶K,65℃孵育10min;加入2μL DNA loading,用2%的琼脂糖凝胶跑胶;通过Image J测定条带的灰度值以获得Cas9在不同浓度AcP催化条件下的切割效率。
EMX1片段序列(SEQ ID NO:1):
agcctcagtcttcccatcaggctctcagctcagcctgagtgttgaggccccagtggctgctctgggggcctcctgagtttctcatctgtgcccctccctccctggcccaggtgaaggtgtggttccagaaccggaggacaaagtacaaacggcagaagctggaggaggaagggcctgagtccgagcagaagaagaagggctcccatcacatcaaccggtggcgcattgccacgaagcaggccaatggggaggacatcgatgtcacctccaatgactagggtgggcaaccacaaacccacgagggcagagtgctgcttgctgctggccaggcccctgcgtgggcccaagctggactctggccactccctggccaggctttggggaggcctggagtcatggccccacagggcttgaagcccggggccgccattgacagagggacaagcaatgggctggctgaggcctgggaccacttggccttctcctcggagagcctgcctgcctgggcgggcccgcccgccaccgcagcctcccagctgctctccgtgtctccaatctcccttttgttttgatgcatttctgttttaatttattttccaggcaccactgtagtttagtgatccccagtgtcccccttccctatgggaataataaaagtctctctcttaatgacacgggcatccagctccagccccagagcctggggtggtagattccggctctgagggccagtgggggctggtagagcaaacgcgttcagggcctgggagcctggggtggggtactggtggagggggtca。
EMX1片段扩增引物为:
EMX1-F:5′-agcctcagtcttcccatcagg-3′;
EMX1-R:5′-tgaccccctccaccagtacc-3′。
利用上述因为由生物合成公司合成EMX1片段。
1.4体外不同浓度AcP孵育后的Cas12a的切割效率
Cas12a的顺式切割如Cas9的体外切割。Cas12a的反式切割步骤如下,首先将100nM的LbCas12a蛋白与0、10、20mM的AcP在室温裂解缓冲液中孵育20分钟,然后在裂解混合物中加入100ng FimA片段和1μL 20μM ssDNA,立即将反应混合物转移到黑色的384孔板,放置于酶标仪上测定荧光。
FimA片段序列(SEQ ID NO:2):
atgacctctactattgcgagtctgatgtttgtcgctggcgcagcggttgcggctgatcctactccggtgagcgtgagtggcggtactattcatttcgaaggtaaactggttaatgcagcctgtgccgtcagcactaaatccgccgatcaaacggtgacgctgggtcaataccgtaccgccagctttacggcgattggtaatacgactgcgcaggtgcctttctccatcgtcctgaatgactgcgatccgaaagtggcggccaacgctgccgtggctttctctggtcaggcagataacaccaaccctaatttgctggctgtctcctctgcggacaatagcactaccgcaaccggcgtcgggattgagattcttgataatacctcttcaccgttgaagccggacggcgcgaccttctcggcgaagcagtcgctggttgaaggcaccaatacgctgcgttttaccgcacgctataaggcaaccgccgccgccacgacgccaggccaggctaatgccgacgccacctttatcatgaaatacgaataa。
FimA-F:5′-atgacctctactattgcgagtctgatg-3′;
FimA-R:5′-ttattcgtatttcatgataaaggtggcgtc-3′。
ssDNA序列:FAM-TTATT-BHQ。
1.5pWT-Ara-Cas9质粒的构建
以实验室保存质粒pWT-Ara-APOBEC1-dCas9-UGI(即pWT-Ara-BE2,见图10)为模板,以pWT-Ara-F和pWT-Ara-R为引物,扩增骨架片段pWT-Ara,同时以dCas9-F和dCas9-R为引物扩增插入片段dCas9。片段pWT-Ara和dCas9同源重组后获得质粒pWT-Ara-dCas9,以此为模板,以A10D-F和A10D-R为引物,定点突变试剂盒进行定点突变,获得pWT-Ara-Cas9n。反应体系为25μL,包含10ng质粒模板,0.2μM正向引物,0.2μM反向引物,12.5μL 2xTransStart FastPfu Fly PCR SuperMix和适量的ddH2O。反应程序为94℃预变性5min,94℃变性20sec,55℃退火20sec,72℃延伸5min,共循环22次,最后72℃再延伸10min。
扩增完成后,取5μL PCR产物,用于琼脂糖凝胶检测,条带验证正确后,取0.5μL II型限制性内切酶(DMT酶)加至20μL PCR产物中,37℃孵育1h,消化残余的非突变型质粒模板。然后取消化液10μL转化DH5α,涂在含有硫酸链霉素的LB固体平板上,过夜培养,挑取3个单克隆,过夜培养,提取质粒后测序。使用引物cx-A10D-R对提取的质粒进行测序。测序正确后,以此为模板,以A840H-F和A840H-R为引物,进行定点突变,获得pWT-Ara-Cas9,提取质粒后送至擎科生物公司进行测序,测序引物为cx-A840H-R。引物如下:
pWT-Ara-F:5′-TGAGTCAGCTAGGAGGTGACTAAACGGAGCCAATGTACGC-3′;
pWT-Ara-R:5′-CCTATTGAGTATTTCTTATCCATTTTTTATAACCTCCTTA-3′;
dCas9-F:5′-GATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCG-3′;
dCas9-R:5′-GTCACCTCCTAGCTGACTCAAATCAATG-3′;
A10D-F:5′-ACTCAATAGGCTTAGACATCGGCACAA-3′;
A10D-R:5′-GTCTAAGCCTATTGAGTATTTCTTAT-3′;
cx-A10D-R:5′-GCGCTAAGGCCAAATAGATTAAG-3′;
A840H-F:5′-GATTATGATGTCGATCACATTGTTCCA-3′;
A840H-R:5′-TGATCGACATCATAATCACTTAAACG-3′;
cx-A840H-R:5′-AGCAGTTCCAACGACGGCAT-3′。
1.6pProBE-sfGFP质粒的构建
使用限制性内切酶HindⅢ和MfeⅠ对提取的质粒pPROBE-P117-YhaJ-PyqjF(图谱见图11)进行酶切获得骨架;以实验室保存菌株EAraPti(该菌株是将pTac-sfGFP-kan序列插至MG1655菌株LacZ基因1-1351bp处,图谱见图12)为模板,以sfGFP-F和sfGFP-R为引物,扩增pTac-sfGFP片段。骨架片段pProBE和pTac-sfGFP片段重组后获得质粒pProBE-sfGFP。引物如下:
sfGFP-F:5′-Tgccaggaattggggatcggaagcttttgacaattaatcatcggctc-3′;
sfGFP-R:5′-taaaaggacagggccatcgccaattgtcatttgtacagttcatccaaac-3′。
扩增反应体系为50μL,包含25μL 2×Phanta Max Buffer,1μL dNTP Mix(10mMeach),2μLsfGFP-F(10μM),2μL sfGFP-R(10μM),1μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase,1μL菌液作为模板DNA。
扩增程序为5℃预变性5min,95℃变性15sec,退火56℃,72℃延伸1min,72℃彻底延伸10min,12℃降温5min。
1.7pWT-Ara-Cas9和pProBE-sfGFP双质粒共转株系的获得
将pWT-Ara-Cas9和pProBE-sfGFP共同热激转入大肠杆菌感受态DH5α中,37℃活化2h后涂布在含有硫酸链霉素(50μg/mL)和四环素(50μg/mL)的LB固体平板上,37℃过夜培养后挑取单菌落筛选正确的转化子。使用测序引物cx-K990-F和cx-SmR-R扩增片段验证pWT-Ara-Cas9是否成功转入,如果扩出的产物跑核酸胶有1481bp的条带,证明pWT-Ara-Cas9成功转入;使用测序引物cx-pTT-F和cx-APO-dn-R扩增片段验证pProBE-sfGFP是否成功转入,如果扩出的产物跑核酸胶有970bp的条带,证明pProBE-sfGFP成功转入。引物如下:
cx-K990-F:5′-ATGCCGTCGTTGGAACTGCT-3′;
cx-SmR-R:5′-CAAATAAACGCCATGGGCAT-3′;
cx-pTT-F:5′-CAGGAATTGGGGATCGGAAGC-3′;
cx-APO-dn-R:5′-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG-3′。
1.8不同培养条件下AcP含量的测定
首先我们构建了质粒pProEX-THb-Cas9,使用引物ppro-thb-F、ppro-thb-R对载体片段pProEX-THb进行扩增;同时使用引物对Cas9片段进行了扩增,将pProEX-THb片段和Cas9片段进行重组并转化DH5α,使用通用引物M13/pUC Reverse和pTrcHis Reverse进行PCR扩增并测序,获得正确的单克隆。接着将质粒转化WT(MG1655)感受态,获得菌株pProEX-THb-Cas9/WT。
为了模拟乙酰化环境,对LB培养基和添加1%乙酸钠的LB培养基培养的pProEX-THb-Cas9/WT菌株胞内AcP进行了分析。将双质粒转化株系活化后接种至LB培养基和添加1%乙酸钠的LB培养基中,37℃过夜培养。3000g,离心10min,弃上清;用冷冻的缓冲液(10mMpH 7.5的磷酸钠,10mM氯化镁和1mM EDTA)悬浮细胞至OD约为0.5,取500μL用于下一步反应;在缓冲液悬浮的液体中加入1/4体积冰的3M高氯酸;冰上孵育30min,10000g,4℃离心2min;取上清,缓慢加入1/4体积的饱和的碳酸氢钾。离心,取上清并加入活性炭,冰上孵育15min,使用0.22μm的过滤器去除活性炭。取上清,准备ATP转化实验:200μL裂解液,1μL100mM氯化镁,30μL 100μM超纯的ADP,0.5μL 3.34mg/μL乙酸激酶,37℃孵育90min。取100μL转化液和100μL CellTiter-Glo检测试剂至白色不透明384孔板,利用酶标仪Luminescence法测定ATP的含量。根据ATP标准曲线,计算转化后ATP的含量。
ppro-thb-F:5′-AAGCTTGGCTGTTTTGGCGG-3′
ppro-thb-R:5′-AATTCCGGATCCCATGGCGC-3′
Cas9-F:5′-TCAGGGCGCCATGGGATCCGGAATTATGgataagaaatactcaatagg-3′
Cas9-R:5′-TCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTgtcacctcctagctgactca-3′
M13/pUC Reverse:5′-AGCGGATAACAATTTCACACAG-3′
pTrcHis Reverse:5′-GATTTAATCTGTATCAGG-3′
1.9CRISPR敲除效率的测试
挑取双质粒共转成功的单克隆,37℃过夜培养12h。同时准备4管装有5mL LB液体培养基的15mL离心管,ⅰ管加入硫酸链霉素和四环素;ⅱ管加入硫酸链霉素、四环素和阿拉伯糖;ⅲ管加入1%乙酸钠、硫酸链霉素和四环素;ⅳ管加入1%乙酸钠、硫酸链霉素、四环素和阿拉伯糖。将4种培养基分别分装至24孔板中,每孔800μL。每孔中加入4μL活化后的菌液,培养12h后。分别收集菌液600μL,离心弃上清,使用RNA提取试剂盒提取细菌中总的RNA进行,使用琼脂糖胶对RNA的提取质量进行检测,使用酶标仪对RNA的浓度进行测定。
随后使用反转录试剂盒将提取的RNA的反转录为cDNA,反应体系为:500ng总RNA,4μL 5×EasyAll-in-One SuperMix for qPCR,4μL gDNA Remover,加入ddH2O补足20μL体系。移液枪轻轻混匀体系,42℃孵育15min,85℃加热5sec。cDNA浓度一般在700-900ng/μL。使用DEPC水将cDNA稀释10倍后用于qPCR的模板。qPCR反应体系为20μL:70ng cDNA模板,10μΜ正向引物,10μΜ反向引物,10μL 2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix和适量的ddH2O。将上述体系置于荧光定量PCR仪中,使用qPCR两步法:94℃预变性30sec;94℃变性5sec,60℃退火和延伸30sec,进行40次循环,仪器实时测定溶液的荧光信号,并给出荧光阈值(CT)。检测sfGFP表达量的引物由双下划线标记。sgRNA互补配对的序列由单划线标记出。根据所获得的目标基因(sfGFP)和内参基因(16S rRNA)的CT值,计算sfGFP的转录水平2-△CT,△CT为sfGFP的CT值与16S rRNA CT值的差值。未加入阿拉伯糖诱导剂获得的转录水平与加入阿拉伯糖诱导剂后获得的转录水平的比值为Cas9的切割活性,比值越大,说明Cas9的活性越强;反之,越弱。
靶基因sfGFP的荧光定量引物为:
qRT-sfGFP-F:5′-GTTCACTGGTGTCGTCCCTA-3′;
qRT-sfGFP-R:5′-GCCAAGGTACCGGCAGTTTA-3′。
内参基因16S rRNA的荧光定量引物为:
qRT-16S rRNA-F:5′-TCGCGTTGCATCGAATTAAA-3′;
qRT-16S rRNA-R:5′-CCCCCTGGACGAAGACTGAC-3′。
1.10Nano-HPLC-MS/MS质谱鉴定乙酰化位点
对0mM AcP和40mM AcP孵育后的Cas9在10%的SDS-PAGE分离,染色后割胶收集目标Cas9蛋白,准备质谱分析,方法参考Jacek R描述的FASP(filter-aidedsample preparation)步骤。第一步,在10μg蛋白中加入10μL SDT缓冲溶液(4%SDS,100mM DTT,150mM Tris-HCl pH 8.0)中,置于90℃条件下溶解5min。第二步,用200μL UA缓冲液(8M urea,150mM Tris-HCl,pH 8.0)反复超滤洗掉清洗剂、DTT和其他低分子量组分。向上述溶液中加入50μL 0.05M碘乙酰胺,以封闭还原性的半胱氨酸残基,将样品在黑暗条件下孵育30min。第三步,用100μL UA缓冲溶液和100μL 25mM NH4HCO3依次加入清洗滤器。第五步,用40μL含有2μg胰蛋白酶的25mM NH4HCO3悬浮蛋白,于37℃消化。MS/MS质谱分析采用MASCOT搜索引擎(Matrix Science,London,UK;version 2.2)在化脓性链球菌血清型M1数据库中进行搜索。蛋白质质谱鉴定方法参数设置如下:肽段质量公差=20ppm,MS/MS公差=0.1Da,酶=胰蛋白酶,未切断的=2,固定修饰:脲甲基(C),可变修饰:氧化修饰(M),乙酰化(K,N端)。所有获取的数据都基于99%的置信度,错误发现率(FDR)不超过1%。
1.11将K33,K954和K1097位点进行谷氨酰胺和精氨酸突变
利用定点突变试剂盒,以pWT-Ara-Cas9为模板,以K33Q-F/R,K33R-F/R,K954Q-F/R,K954R-F/R,K1097Q-F/R,K1097R-F/R为引物扩增,获得的产物用DMT消化后,转化DH5α,挑取单菌落提取质粒后,然后分别用引物cx-10A-R,cx-954R和cx-1097R进行测序,获得突变成功的pWT-Ara-Cas9K33Q/K33R/K954Q/K954R/K1097Q/K1097R。引物如下:
K33Q-F:5′-ccgtctaaaaagttcCaggttctggg-3′;
K33Q-R:5′-Ggaactttttagacggaaccttatat-3′;
K33R-F:5′-cgtctaaaaagttcaGggttctggga-3′;
K33R-R:5′-Ctgaactttttagacggaaccttat-3′;
K954Q-F:5′-cttattcgagaggttCaagtgattac-3′;
K954Q-R:5′-Gaacctctcgaataagtttatcattt-3′;
K954R-F:5′-ttattcgagaggttaGagtgattacc-3′;
K954R-R:5′-Ctaacctctcgaataagtttatcat-3′;
K1097Q-F:5′-gtcaatattgtcaagCaaacagaagt-3′;
K1097Q-R:5′-Gcttgacaatattgacttggggcatg-3′;
K1097R-F:5′-tcaatattgtcaagaGaacagaagta-3′;
K1097R-R:5′-Ctcttgacaatattgacttggggca-3′;
cx-10A-R:5′-GCGCTAAGGCCAAATAGATTAAG-3′;
cx-954R:5′-GCGGTTGCTTTGCCTATTTC-3′;
cx-1097R:5′-atgccgtcgttggaactgct-3′。
2、结果与分析
2.1体外AcP催化的Cas9酰化调控Cas9蛋白的功能
将Cas9蛋白和不同浓度的AcP(0/10/15/20/40mM)在37℃孵育5h,WB分析发现Cas9蛋白能够发生依赖于浓度梯度变化的乙酰化(图1中B)。体外不同浓度AcP催化Cas9后切割靶基因EMX1实验,原理图如图1中A,切割结果显示随着AcP浓度的增加,Cas9的切割活性逐渐降低,在15mM时未见明显的切割条带(图1中C)。质谱分析联合Cas9蛋白结构分析发现,K33,K954和K1097是三个关键的乙酰化的赖氨酸位点(图2);三个位点均在酶切酶(RuvC)切割结构域上,K33和K1097分别直接和sgRNA的G81和U66/U67互作,K954和远端DNA双链体互作。乙酰化定点突变蛋白Cas9K33Q,Cas9K33R,Cas9K954Q,Cas9K954R,Cas9K1097Q,Cas9K1097R的体外切割实验显示,K33及K1097位点的乙酰化明显降低了Cas9的切割活性,而K954位点乙酰化几乎没有影响(图1中D),表明K33及K1097位点的乙酰化能调节Cas9蛋白的功能。
同时,我们将Cas9和不同浓度的琥珀酰CoA进行孵育,发现Cas9能够发生琥珀酰CoA非酶催化的琥珀酰化并且依赖于浓度梯度变化(图3中A)。体外不同浓度琥珀酰CoA催化Cas9后切割靶基因EMX1实验,切割结果显示随着琥珀酰CoA浓度的增加,Cas9的切割活性逐渐降低(图3中B)。进一步地,我们验证了酰化对Cas的调控是否具有普遍性。我们对Cas12a是否发生AcP催化的乙酰化及乙酰化后对顺/反式切割的影响进行了验证,发现Cas12a能够发生AcP催化的乙酰化(图3中C),并且随着乙酰化程度的增强,切割效率逐渐降低(图3中D和E)。
2.2体内AcP催化的Cas9乙酰化调控Cas9蛋白的功能
我们使用Δpta突变体模拟乙酰化环境,其在添加0.27%乙酸钠的LB培养基中培养时,可以积累更多的AcP(图4中A、B)。分别纯化Δpta和WT菌株中的Cas9蛋白,并进行WB分析乙酰化水平和切割实验,结果显示Δpta中Cas9的乙酰化水平明显高于WT,同时切割结果显示Δpta中Cas9的切割活性明显低于WT(图4中C、D)。此外,我们使用1%乙酸钠添加的LB培养基模拟乙酰化环境,相比LB培养基培养有更多的AcP积累(图4中E、F)。分别纯化两种培养条件下的Cas9蛋白,接着进行WB分析乙酰化水平和切割实验,发现1%乙酸钠添加的LB培养基中纯化的Cas9蛋白乙酰化水平明显高于WT,切割活性明显低于WT(图4中G、H)。
为了进一步验证体内AcP驱动的乙酰化对Cas9功能的调控,我们构建了一个基于Cas9-sfGFP的敲除系统,即pWT-Ara-Cas9和pProBE-sfGFP共转WT的双质粒共转菌株(如图5和图6)。分别将共转菌株在添加1%乙酸钠的LB培养基和LB培养基中培养12h后,qPCR检测sfGFP的表达量(如图7中A、B),结果显示添加1% NaAc的LB培养基培养条件下的切割效率相比LB培养基培养条件降低了约12.5倍(图8)。同时我们也通过定点突变获得了pWT-Ara-Cas9K33Q,pWT-Ara-Cas9K33R,pWT-Ara-Cas9K954Q,pWT-Ara-Cas9K954R,pWT-Ara-Cas9K1097Q,pWT-Ara-Cas9K1097R,分别将各突变体和pProBE-sfGFP共转至WT菌株中,共转株在LB培养基中培养12h后,qPCR检测sfGFP的表达量,结果显示,K33Q和K1097Q的切割活性显著降低;K33R的切割活性和野生型相当,K1097R切割活性显著高于野生型(图9),K1097R有望成为一种潜在的基因组编辑工具。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,通过调节Cas蛋白的细胞内酰基化水平并通过对酰基化位点进行改造,获得活性高且不受细胞内环境影响的Cas蛋白,提高对目标基因的编辑效率。
2.根据权利要求1所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,所述Cas蛋白为应用于基因编辑的Cas核酸酶。
3.根据权利要求1所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,所述方法是细胞内Cas蛋白的酰基化水平调控及酰基化位点理性改造,提高Cas活性及CRISPR基因编辑效率。
4.根据权利要求3所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,通过细胞内代谢产物酰基化细胞内的外源Cas蛋白,以调控所述Cas蛋白活性。
5.根据权利要求4所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率方法,其特征在于,所述细胞内代谢产物包括乙酰磷酸、乙酰CoA、丙酰CoA或琥珀酰CoA。
6.根据权利要求5所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,基于基因工程技术,定点突变由所述细胞内代谢产物酰基化的Cas蛋白的酰基化位点处赖氨酸为精氨酸或者谷氨酰胺,消除所述细胞内代谢产物对Cas蛋白酰基化的影响,提高CRISPR基因编辑效率。
7.根据权利要求4所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,通过改变培养细胞的环境条件,促使所述细胞内代谢产物的累积,进而通过所述细胞内代谢产物调控所述Cas蛋白的细胞内酰基化水平。
8.根据权利要求7所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,所述酰基化包括乙酰化、丙酰化或琥珀酰化。
9.根据权利要求7所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,改变培养细胞的环境条件包括向培养细胞的培养基中添加乙酸钠,或者敲除影响细胞内代谢产物累积的基因。
10.根据权利要求1所述的基于Cas蛋白酰基化修饰工程改进CRISPR基因编辑效率的方法,其特征在于,所述目的基因包括EMX1基因和sfGFP基因。
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ZHAO L, YOU D, WANG T, ET AL.: "Acylation driven by intracellular metabolites in host cells inhibits Cas9 activity used for genome editing", PNAS NEXUS, vol. 1, no. 5, 6 December 2022 (2022-12-06), pages 1 - 11 * |
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