CN115725623A - 一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测CRISPR‑Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。本发明所述报告细胞系将纳米荧光素酶基因Nluc与管家基因ACTG1融合表达，避免了细胞内环境变化对纳米荧光素酶Nluc活性的影响；通过Nluc活性的变化反映CRISRP‑Cas蛋白的切割活性，克服了现有GFP的半衰期较长，没有办法快速响应基因位点双链断裂的情况的不足。此外，本发明所述报告细胞系还可用于筛选CRISPR‑Cas蛋白抑制剂。本发明利用构建所得报告细胞系筛选到了能够在细胞内抑制SpCas9切割活性的小分子化合物，筛选过程的操作简单，检测方便，信号稳定。

Description

一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细 胞系及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。

背景技术

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列。为了将病毒的外来入侵基因清除，细菌进化出了CRISPR-Cas系统，以此抵抗病毒的浸染。CRISPR-Cas系统存在于大多数细菌与所有的古菌中，自其被发现以来，CRISPR-Cas系统在临床应用、基础研究或者分析检测方面都体现出了极大的前景。

为了更好地利用CRISPR-Cas系统，优化CRISPR-Cas系统，提高Cas蛋白的活性和递送是当前的研究热点。另由于CRISPR-Cas蛋白的额外活性，在对靶位点编辑的同时会对其他基因位点进行编辑，造成脱靶。因此，开发CRISPR-Cas蛋白的调节剂用于控制CRISPR-Cas蛋白的活性，以提高该系统的安全性也是需要关注的方向。

深度测序虽然可以比较精确的显示CRISPR-Cas蛋白的编辑效率，但是该方法的操作复杂。绿色荧光蛋白(GFP)报告系统被广泛应用于蛋白定位追踪和高通量药物筛选，具有检测方便、价钱便宜等优点。目前，基于荧光蛋白的报告系统也被应用于评估CRISPR系统的活性；当GFP基因被编辑以后，GFP蛋白表达下降，荧光信号减弱，从而可以评价CRISPR系统的活性。但是GFP在细胞里面的半衰期较长，检测到显著的GFP荧光猝灭至少需要2天，没有办法快速响应基因位点双链断裂的情况。同时，由于CRISPR-Cas蛋白对靶位点的切割比较快，例如，SpCas9在1天左右就基本对靶位点完成了切割，至少50％的靶向切割发生在6小时内，而基于荧光蛋白的报告细胞难以快速、高效评估CRISPR-Cas蛋白的切割活性。因此，为了评估CRISPR-Cas系统在细胞里面的切割活性，需要建立灵敏、快速精确的高通量检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法。

本发明的第二个目的是提供用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

本发明的第三个目的是提供所述细胞系在检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述细胞系在制备检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的方法。

本发明的第六个目的是提供雷公藤红素、二氢丹参酮I、10-羟基喜树碱、盐酸拓扑替康中的任意一种或几种在抑制SpCas9活性或制备抑制SpCas9的抑制剂中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法，包括以下步骤：

S1.在所用报告细胞的管家基因的终止密码子前插入绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞；

S2.利用带筛选标记的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞，培养得用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

具体地，步骤S1所述报告细胞为HEK293细胞。

具体地，步骤S1所述管家基因为ACTG1。

具体地，步骤S1所述绿色荧光蛋白为增强型的绿色荧光蛋白，所述纳米荧光素酶的N端含有分泌信号肽，绿色荧光蛋白和纳米荧光素酶之间含有可以剪切的linker。

作为可选择的实施方式，步骤S1所述绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因为eGFP-P2A-Nluc，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，步骤S2利用带嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，用嘌呤霉素筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞。

利用上述制备方法，本发明获得了一种可快速、高效、灵敏地检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的细胞系。具体地，本发明以HEK293细胞作为报告细胞，将绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因(eGFP-P2A-Nluc)敲入到管家基因ACTG1的3’端的终止密码子TGA的前面，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞，命名为HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2；同时用带嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入所得单克隆细胞HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2的基因组，用嘌呤霉素筛选萤火虫荧光素酶活性高的单克隆细胞，命名为HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc-#2，培养得用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

本发明所述用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系一共有三个可以检测的指标，即绿色荧光蛋白(eGFP)荧光信号、纳米荧光素酶(Nluc)活性和萤火虫荧光素酶(Fluc)活性。在本发明构建所得细胞系中，报告基因Nluc的表达与其上游基因有关，当上游基因位点被CRISPR-Cas蛋白切割时，基因Nluc的表达量下降，显示出Nluc活性降低；如果CRISPR-Cas蛋白活性产生变化，那么Nluc活性变化的幅度也会有区别，借此可对CRISPR-Cas蛋白切割活性进行检测和评估，还可用于筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或CRISPR-Cas蛋白调节剂等。另本发明将Nluc与管家基因ACTG1融合表达，避免了细胞内环境变化对Nluc的活性产生影响。此外，Fluc作为内参蛋白能够校正由于细胞数量不同导致的误差。

本发明请求保护所述制备方法制备所得用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

本发明还请求保护所述细胞系在检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂中的应用。

本发明还请求保护所述细胞系在制备检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂的产品中的应用。

具体地，所述CRISPR-Cas蛋白调控剂为具有抑制或增强CRISPR-Cas蛋白活性的外源物，所述外源物包括合成化合物、天然产物、有机小分子化合物、脂类、糖类、蛋白质、核酸中的一种或多种。

本发明还提供了一种检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的方法，所述方法为：将表达CRISPR-Cas蛋白和靶向绿色荧光蛋白sgRNA的质粒或者CRISPR-Cas蛋白/靶向绿色荧光蛋白sgRNA复合物转染进所述用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系，同时转染CRISPR-Cas蛋白和非靶向绿色荧光蛋白sgRNA的质粒或蛋白/非靶向绿色荧光蛋白sgRNA复合物作为对照，将转染所得细胞孵育后，检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性，计算CRISPR-Cas蛋白切割效率。

具体地，在检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性时，纳米荧光素酶活性用萤火虫荧光素酶活性进行校正，校正后的酶活性为：相对荧光强度＝纳米荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性×校正因子；所述校正因子为任一常数；本申请所用常数为10或100；

CRISPR-Cas蛋白切割效率＝[(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)-(电转靶向sgRNA组相对荧光强度)]/(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)×100％。

具体地，将转染所得细胞孵育24h～48h后，检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性，计算CRISPR-Cas蛋白切割效率。

具体地，所述转染方式为电转。

上述检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的方法也可用于评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂。

本发明利用构建所得报告细胞系，筛选得到了4种可以在细胞内抑制SpCas9切割内源位点的化合物。具体地，所述4种化合物为雷公藤红素、二氢丹参酮I、10-羟基喜树碱和盐酸拓扑替康。因此，本发明还申请保护雷公藤红素、二氢丹参酮I、10-羟基喜树碱、盐酸拓扑替康中的任意一种或几种在抑制SpCas9活性或制备抑制SpCas9的抑制剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种可快速、高效、灵敏地检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系，通过将Nluc与管家基因ACTG1融合表达，避免了细胞内环境变化对Nluc的活性产生影响，而Fluc作为内参蛋白能够校正由于细胞数量不同导致的误差。本发明通过Nluc活性的变化反映CRISRP-Cas蛋白的切割活性，克服了现有GFP在细胞里面的半衰期较长，检测到显著的GFP荧光猝灭至少需要2天，没有办法快速响应基因位点双链断裂的情况的不足。

此外，利用本发明所述双荧光素酶报告细胞系可检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂，且操作简单，检测方便，信号稳定，在比较不同CRISPR-Cas蛋白或者突变体活性以及在筛选CRISPR-Cas蛋白的调控剂方面具有较大的应用前景。同时，本发明利用构建所得报告细胞系筛选到了几种可以抑制SpCas9的活性的小分子抑制剂。

附图说明

图1为本发明实施例1构建所得内源性ACTG1-eGFP-P2A-Nluc荧光素酶报告细胞，即HEK293-ACTG1-KI-Nluc单克隆细胞的鉴定结果；其中，图A为基于CRISPR-Cas9技术敲入eGFP-P2A-Nluc的原理示意图；图B为HEK293-ACTG1-KI-Nluc单克隆细胞的junction PCR结果图；图C为actin-GFP融合蛋白的Western blot检测结果。

图2为本发明实施例1构建所得双荧光素酶报告细胞系中荧光素酶活性的检测结果；其中，图A为不同HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc单克隆细胞中萤火虫荧光素酶(Fluc)和纳米荧光素酶(Nluc)的活性检测结果；图B为不同HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc单克隆细胞中萤火虫荧光素酶(Fluc)和纳米荧光素酶(Nluc)的相对活性检测结果。

图3为本发明所得原核纯化的SpCas9蛋白的考染结果图。

图4为本发明实施例1构建所得双荧光素酶报告细胞系电转PX330质粒(靶向eGFP位点)后不同时间点SpCas9对eGFP靶位点的切割效率。

图5为本发明实施例1构建所得双荧光素酶报告细胞系电转SpCas9蛋白/sgRNA(靶向eGFP位点)复合物后不同时间点SpCas9对eGFP靶位点的切割效率。

图6为本发明实施例1构建所得双荧光素酶报告细胞系电转PTE4396质粒(靶向eGFP位点)30h后AsCpf1对eGFP靶位点的切割效率。

图7为本发明实施例1构建所得双荧光素酶报告细胞系电转PTE4398质粒(靶向eGFP位点)24h后LbCpf1对eGFP靶位点的切割效率。

图8为本发明实施例1中双荧光素酶报告细胞系用于筛选SpCas9蛋白调节剂模型的Z’因子测定图。

图9为本发明实施例3中197个化合物对SpCas9活性影响的测试结果。

图10为本发明实施例4中所用的四种化合物对SpCas9在HEK293T细胞中切割EMX1-1靶位点活性影响的测试结果；其中，C1为雷公藤红素；G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康。

图11为本发明实施例5中所用的四种化合物对SpCas9在U2OS细胞中切割EMX1-1靶位点活性影响的测试结果；其中，C1为雷公藤红素；G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康。

图12为本发明实施例5中所用的三种化合物对SpCas9在U2OS细胞中切割EMX1-2靶位点活性影响的测试结果；其中，G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康。

图13为本发明实施例5中所用的三种化合物对SpCas9在U2OS细胞中切割RUNX1-1靶位点活性影响的测试结果；其中，G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康。

图14为本发明实施例5中所用的三种化合物对SpCas9在U2OS细胞中切割ZSCAN2靶位点活性影响的测试结果；其中，G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康。

图15为本发明实施例5中所用的三种化合物对SpCas9在U2OS细胞中切割VEGFA-3靶位点活性影响的测试结果；其中，G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 双荧光素酶报告细胞系的构建

本实施例以HEK293细胞作为报告细胞，构建用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

1、构建内源性ACTG1-eGFP-P2A-Nluc荧光素酶报告细胞

利用CRISPR-Cas9技术，在HEK293细胞的管家基因ACTG1的终止密码子(TGA)前插入绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因，所述绿色荧光蛋白为增强型的绿色荧光蛋白，所述纳米荧光素酶的N端还含有分泌信号肽，绿色荧光蛋白和纳米荧光素酶之间含有可以剪切的linker。

具体地，本实施例所用绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因为eGFP-P2A-Nluc，即将eGFP与Nluc基因用P2A连接；P2A是一个自剪切的linker，来源于猪捷申病毒(porcine teschovirus-1)；Nluc的N端含有分泌肽的信号，在产生以后能够分泌到细胞外，从而可以通过细胞裂解液或者细胞上清检测Nluc活性；eGFP-P2A-Nluc的碱基序列如下(SEQ ID NO.1)所示：

GGTGGCGGAGGGTCTGGAGGGGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGAATTCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCTGCAGATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGCCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGACCGGTTAA

在eGFP-P2A-Nluc融合基因的上游和下游分别有800bp左右的同源臂，序列与Cas9切割位点上下游序列一致。在Cas9切割目标位点以后，细胞会启动同源重组的修复机制，将同源片段插入到ACTG1的3’端。基于CRISPR-Cas9技术敲入eGFP-P2A-Nluc的原理示意图如图1中的A所示，图中的KI cassette为代表插入序列Gly linker-eGFP-P2A-Nluc。

将sgRNA序列(sgRNA靶向位点序列为：ACGCATCTGCTGAGTCCGTT，PAM为TAG)克隆到PX330载体，将测序正确的质粒与包含同源重组模板的质粒一起转染HEK293细胞，转染72h后通过三轮流式细胞仪分选GFP阳性的细胞，用有限稀释法得到单克隆细胞，细胞扩增达到合适数量以后，收集细胞，分别通过PCR和免疫印迹检测不同单克隆细胞的敲入情况，筛选HEK293-ACTG1-KI-Nluc单克隆细胞。

HEK293-ACTG1-KI-Nluc单克隆细胞的junction PCR结果如图1中的B所示；actin-GFP融合蛋白的Western blot检测结果如图1中的C所示。由图1中的B和C可知，本发明成功构建得到了内源性ACTG1-eGFP-P2A-Nluc荧光素酶报告细胞，即HEK293-ACTG1-KI-Nluc单克隆细胞。

2、用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的构建

将Fluc基因克隆到pLenti-EF1α-N-HAFL-IRES-puro中，用293T细胞包装慢病毒浸染所得HEK293-ACTG1-KI-Nluc单克隆细胞，具体为HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2细胞株，48小时后，用1μg/mL的嘌呤霉素筛选7天；用有限稀释法挑选单克隆细胞，细胞扩增至合适数量，收集细胞裂解细胞，检测Nluc活性和Fluc活性。

本实施例构建所得双荧光素酶报告细胞系中荧光素酶活性的检测结果如图2所示；图2中的A为不同HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc单克隆细胞中萤火虫荧光素酶(Fluc)和纳米荧光素酶(Nluc)的活性检测结果；图2中的B为不同HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc单克隆细胞中萤火虫荧光素酶(Fluc)和纳米荧光素酶(Nluc)的相对活性检测结果。由图2可知，本发明成功构建得到了Fluc和Nluc双荧光素酶报告细胞系；其中，HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc-#2单克隆细胞的Fluc活性较高，选择此细胞系进行后续实验。

实施例2 检测CRISPR-Cas蛋白在细胞内的切割活性

本实施例利用实施例1构建所得双荧光素酶报告细胞系检测了CRISPR-Cas蛋白在细胞内的切割活性。具体地，所用双荧光素酶报告细胞系为HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc-#2。

本实施例所用纳米荧光素酶检测试剂盒(

Luciferase Assay System)购自美国Promega公司，货号为N1120；萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，货号为RG006；T7 RNA polymerase为Thermo公司产品；PTE4396(Addgene:#74041)；PTE4398(Addgene:#74042)。

实验方法：

1、载体构建

设计并订购gRNA模板单链DNA，退火后分别连接至PX330(Bbs I酶切)，PTE4396(Esp 3I酶切)，PTE4398(Esp 3I酶切)质粒并转化工程菌，转化后挑取单克隆菌落测序，选择测序结果显示成功构建得到重组载体的菌落，提取质粒。其中，PX330为表达SpCas9和空载sgRNA的质粒；PTE4396为表达AsCpf1和空载crRNA的质粒；PTE4398为表达LbCpf1和空载crRNA的质粒。

gRNA模板单链DNA的序列如下所示：

PX330-sgGFP-FP：CACCGGGCACGGGCAGCTTGCCGG

PX330-sgGFP-RP：AAACCCGGCAAGCTGCCCGTGCCC

PTE4396/PTE4398-sgGFP-FP：AGATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGG

PTE4396/PTE4398-sgGFP-RP：AAAACCTGGTCGAGCTGGACGGCGACG

2、原核纯化SpCas9蛋白

将pET28a-N-6×His-TEV-NLS-SpCas9重组质粒转化到BL21-star(DE3)感受态细胞中，均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养；挑取单克隆细胞接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养16h；以体积比为1:100的比例接种于相同的液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀在0.6～0.8之间，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG，18℃诱导24h；诱导培养结束后，4℃、4000rpm离心10min收集菌体，每100mL培养基加入5mL裂解液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，20mM咪唑，5％甘油)，充分重悬后用超声破碎仪裂解菌体，直至菌体悬浊液澄清；4℃、10000rpm离心30min收集上清液，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤；所得滤液通过His亲和层析柱，用5倍柱体积裂解液洗脱，然后用洗脱液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，250mM咪唑，5％甘油)洗脱，收集洗脱液；洗脱液用Superdex 200凝胶过滤层析柱进一步纯化，浓缩后得到纯度较高的目的蛋白，用BCA试剂盒测试蛋白浓度，分装后-80℃保存。

所得原核纯化的SpCas9蛋白的考染结果图如图3所示，由图3可知，本发明成功纯化得到了SpCas9蛋白。

3、体外转录sgRNA

转录模板由引物(sgRNA-FP：TGTAATACGACTCACTATAGGG，sgRNA-RP：AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA)退火产生，T7聚合酶和缓冲液均来自于体外转录试剂盒。20μL转录体系里面包含5μM的转录模板，在37℃反应4～5小时，加入1μL DNA酶，37℃反应15min用来消化转录模板；用RNA回收试剂盒回收sgRNA，纯化得到的RNA测试浓度后分装并-80℃保存。

4、制备SpCas9/sgRNA复合物

将纯化的SpCas9蛋白与体外转录的sgRNA按照摩尔浓度比为1:1.2混合以后，室温放置30min。

5、电转

将HEK293-ACTG1-KI-Nluc-#2-Fluc-#2细胞铺板于10cm皿中，待细胞生长到大约80％的密度，移除上清，用PBS洗涤细胞两次；加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化液，30s后，加入1mL含血清的细胞培养基；分别取800μL的细胞重悬液加入到2个1.5mL EP管中，500rpm转速下离心20min；吸出上清，往细胞沉淀中加入100μL的电转缓冲液，取20μL上述细胞重悬液加入440ng待转染质粒或者20pmol SpCas9/sgRNA复合物；然后加入到电转板条中，使用Lonza4D X模块和仪器推荐的电转程序；电转以后加入100微升预热的培养，重悬后吸取到适量培养基中，接种于96孔板中，置于细胞培养箱中。

6、检测荧光素酶活性

细胞培养一段时间以后，移除细胞培养基，用PBS洗涤一次，加入50μL报告基因细胞裂解液，室温裂解5min后，分别取20μL于两个白色96孔板中，按照试剂盒方法分别检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性。

7、数据处理

每孔的Nluc活性用Fluc活性进行校正，校正后的酶活性为：RLU(相对荧光强度)＝Nluc活性/Fluc活性×校正因子；所述校正因子为任一常数。

本实施例所用常数为100。

切割效率＝[(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)-(电转靶向sgRNA组相对荧光强度)]/(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)×100％。

实验结果：

本发明所得双荧光素酶报告细胞系电转PX330质粒后不同时间点SpCas9对eGFP靶位点的切割效率结果如图4所示，由图4可知，本发明构建所得双荧光素酶报告细胞系在不同时间点均可以反应出SpCas9对靶位点的切割效率。

本发明所得双荧光素酶报告细胞系电转SpCas9蛋白/sgRNA复合物后不同时间点SpCas9对eGFP靶位点的切割效率如图5所示，由图5可知，本发明构建所得双荧光素酶报告细胞系可以检测SpCas9蛋白/sgRNA复合物对靶位点的切割效率。

本发明所得双荧光素酶报告细胞系电转PTE4396质粒30h后AsCpf1对eGFP靶位点的切割效率如图6所示；本发明所得双荧光素酶报告细胞系电转PTE4398质粒24h后LbCpf1对eGFP靶位点的切割效率如图7所示。由图6和图7可知，本发明构建所得双荧光素酶报告细胞系可以用于检测AsCpf1、LbCpf1对靶位点的切割效率。

实施例3 CRISPR-Cas蛋白调节剂的筛选

本发明利用实施例2.5中电转所得细胞铺板于含有不同化合物(共197个化合物，所用化合物源于陶氏化学或者发明人所在实验室的化合物库，这些化合物前期已经通过体外实验进行了一轮筛选，结果显示这些化合物可以影响SpCas9/sgRNA复合物与DNA的结合)的96孔板中，使化合物的终浓度为10μM，以只含有DMSO的孔板作为对照组；每个实验设置2～3个平行组；DMSO对照组设置10个以上平行组。化合物的相对抑制率＝(DMSO对照组切割效率-实验组切割效率)/DMSO对照组切割效率×100％；如果抑制率为负值，则代表化合物是激活剂；如果抑制率为正值，则代表化合物为抑制剂。

本发明通过在4块96孔板中，测试电转PX330-sgGFP组中DMSO对照组的切割效率，计算了该筛选方法的Z因子，用于筛选SpCas9蛋白调节剂模型的Z’因子测定图如图8所示，由图8可知，Z因子为0.640，满足高通量筛选要求。

本实施例所用197个化合物对SpCas9活性影响的测试结果如图9所示，由图9可知，经过报告细胞系筛选，在197个化合物中，有31个化合物对SpCas9的抑制率介于20％～100％之间，表明这些化合物有进一步应用的潜能。进一步地，本发明选择了4个化合物(C1、G1、G2和R5，C1为雷公藤红素；G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康)进行了其对SpCas9切割内源位点的功能验证。

实施例4 筛选出的四种小分子化合物抑制对SpCas9切割内源位点的功能验证

在293T或者U2OS细胞中分别电转靶向内源基因位点(EMX1-1、EMX1-2、RUNX1-1、ZSCAN2、VEGFA-3)的PX330质粒，铺板于含有化合物的12孔板中，DMSO组作为对照。24小时后，收集细胞提取细胞基因组；使用带有测序接头的引物和KOD PCR试剂盒(Toyobo)扩增靶向位点，以生成深度测序文库；使用150Hiseq 2000(Illumina)平台对样本进行单端测序；使用MATLAB拆分测序文件，并使用CRISPResso2分析indels的比例。

四种化合物(C1、G1、G2和R5，其中，C1为雷公藤红素；G1为二氢丹参酮I；G2为10-羟基喜树碱；R5为盐酸拓扑替康)对SpCas9在HEK293T细胞中切割EMX1-1靶位点活性影响的测试结果如图10所示，由图10可知，对照组indel的比例为29.1％，C1处理组indel比例为24％，G2处理组indel比例为12.6％，R5处理组indel比例为14.5％，表明C1、G2和R5在HEK293T细胞中可以抑制SpCas9对EMX1-1靶位点的切割。

四种化合物(C1、G1、G2和R5)对SpCas9在U2OS细胞中切割EMX1-1靶位点活性影响的测试结果如图11所示，由图11可知，对照组indel的比例为33.7％，G1处理组indel比例为16.2％，G2处理组indel比例为21％，R5处理组indel比例为25.8％，表明G1、G2和R5在U2OS细胞中可以抑制SpCas9对EMX1-1靶位点的切割。

三种化合物(G1、G2和R5)对SpCas9在U2OS细胞中切割EMX1-2、RUNX1-1、ZSCAN2、VEGFA-3靶位点活性影响的测试结果依次如图12～15所示，由图12～15所示结果可知，G1、G2和R5在U2OS细胞中也可以抑制SpCas9对EMX1-2、RUNX1-1、ZSCAN2、VEGFA-3靶点的切割活性，但是不同的位点的抑制作用不同。

上述结果表明，本发明构建的基于纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的双荧光素酶报告基因可以快速灵敏检测CRISPR-Cas蛋白的切割活性，在比较不同CRISPR-Cas蛋白或者变体活性以及在筛选CRISPR-Cas蛋白的调控剂方面具有较大的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.在所用报告细胞的管家基因的终止密码子前插入绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞；

S2.利用带筛选标记的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞，培养得到用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述报告细胞为HEK293细胞，所述管家基因为ACTG1。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述绿色荧光蛋白为增强型的绿色荧光蛋白，所述纳米荧光素酶的N端含有分泌信号肽，绿色荧光蛋白和纳米荧光素酶之间含有可以剪切的linker。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2利用带嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，用嘌呤霉素筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞。

5.权利要求1～4任一所述制备方法制备所得用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

6.权利要求5所述细胞系在检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂中的应用。

7.权利要求5所述细胞系在制备检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂的产品中的应用。

8.一种检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的方法，其特征在于，所述方法为：将表达CRISPR-Cas蛋白和靶向绿色荧光蛋白sgRNA的质粒或者CRISPR-Cas蛋白/靶向绿色荧光蛋白sgRNA复合物转染进权利要求6所述细胞系，同时转染CRISPR-Cas蛋白和非靶向绿色荧光蛋白sgRNA的质粒或蛋白/非靶向绿色荧光蛋白sgRNA复合物作为对照，将转染所得细胞孵育后，检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性，计算CRISPR-Cas蛋白切割效率。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，在检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性时，纳米荧光素酶活性用萤火虫荧光素酶活性进行校正，校正后的酶活性为：相对荧光强度＝纳米荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性×校正因子；所述校正因子为任一常数；

CRISPR-Cas蛋白切割效率＝[(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)-(电转靶向sgRNA组相对荧光强度)]/(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)×100％。

10.雷公藤红素、二氢丹参酮I、10-羟基喜树碱、盐酸拓扑替康中的任意一种或几种在抑制SpCas9活性或制备抑制SpCas9的抑制剂中的应用。

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