CN111690673A - 一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法 - Google Patents
一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111690673A CN111690673A CN202010571400.3A CN202010571400A CN111690673A CN 111690673 A CN111690673 A CN 111690673A CN 202010571400 A CN202010571400 A CN 202010571400A CN 111690673 A CN111690673 A CN 111690673A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pgcs
- lncrna
- formation
- bmp4
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，属于生物技术领域。利用在线软件ORF Finder预测lncRNA‑BMP4可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过Western Blot检测获得的诱导蛋白。本方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。本发明将lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的研究扩展到家禽领域，并准确定位到lncRNA‑BMP4上，刷新了不同物种中lncRNA通过编码小肽形成功能的范畴。
Description
技术领域
本发明涉及一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，属于生物技术领域。
背景技术
自Ingolia 等在2009 年通过 Ribo-seq 高通量测序发现体内候选转录本与核糖体的关联度很高，并且许多研究都报道 lncRNA 与核糖体有很强的相关性，但不是所有的lncRNA都是主动翻译的。目前已发现了许多由lncRNA上的sORFs编码的小肽，但只有少数被描述过生物学功能。这些小肽通常是保守的，并广泛参与了生物学过程。
Huang等报道了lncRNA HOXB-AS3编码产生一个53个氨基酸的保守多肽，该多肽能够抑制结肠癌细胞的生长、克隆形成和侵袭转移，但 lncRNA本身不发挥功能。除此以外，小肽也参与其他生物学过程。在 K562和HEK293T细胞系中，Lima等通过蛋白组学方法鉴定了小肽 NOBODY，该小肽通过与 mRNA 的脱帽蛋白复合物相互作用来调控 P-body mRNA的加工。然而到目前为止，在家禽上未有报道，且仍未找到通过编码小肽参与家禽PGCs生成的关键lncRNA。
发明内容
本发明旨在针对上述现有技术的不足，提供一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法。
本发明的技术方案如下：
利用在线软件 ORF Finder预测lncRNA-BMP4 可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过 Western Blot 检测获得的诱导蛋白。
进一步的，将 ORF连入 pcDNA-3.1 载体中，构建小肽过表达载体 oeORF；将突变了 ORF 起始密码子的lncRNA-BMP4 连入 pcDNA-3.1 载体中，构建骨架链过表达标签载体oelnc-ORFmut。在ESCs向PGCs诱导过程中通过细胞形态学观察类胚体形成，qRT-PCR 检测PGCs 形成相关基因，间接免疫荧光检测 PGCs 标记蛋白，流式细胞分析检测PGCs 阳性细胞率等方法检测小肽和lncRNA-BMP4 骨架链在PGCs形成过程中的功能。
在 ESCs、PGCs 中转染 oe-ORF，通过Chip实验验证小肽是否作为转录因子结合在BMP4 启动子区域。双荧光素酶验证小肽对 BMP4 启动活性的影响。
本发明的有益效果如下：
本方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。实验者两个月就能完成。本发明将lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的研究扩展到家禽领域，并准确定位到lncRNA-BMP4上，刷新了不同物种中lncRNA通过编码小肽形成功能的范畴。
具体实施方式
本发明中所需原材料（括号为厂商）：
DMEM高糖培养基（Hyclone），FBS(Gibco), 青链霉素（碧云天），KO-DMEM（Gibco）,鸡血清（Gibco），非必须氨基酸（sigma），β-巯基乙醇（sigma），hSCF(sigma)，bfgf（sigma），Lif（密理博），BMP4(Prospec)，Cvh（abcam），TRIzol、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自北京天根公司。FuGENE®HD Transfection Reagen 和双荧光素酶报告基因检测系统（Promega），BL 感受态、超级感受态、引物合成及测序均由北京擎科生物公司完成。PET-28a（+）载体由实验室保存。
本发明中所需培养基配方为：
普通培养基配方：90 %高糖 DMEM 培养基中添加 10% FBS，100 U/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素。
因子培养基配方：85 % KO-DMEM培养基中添加 10 % FBS，2.5 % 鸡血清，100U/mL青霉素，100 U/mL 链霉素，0.4μmol/L 非必需氨基酸，2 mmol/L 谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，10 ng/μL 鼠 LIF，10 ng/μL bFGF，5 ng/mL hSCF。
本发明具体步骤为：
1.检测lncRNA-BMP4编码蛋白的能力
利用在线软件ORF Finder预测lncRNA-BMP4 可能存在的开放阅读框。根据预测所得的ORF，设计扩增引物并引入酶切位点EcoRI和Xho I，进行1.5%凝胶电泳扩增，分别将ORF的PCR扩增产物和 PET-28a（+）载体进行连接，转化后测序；
将构建好的融合表达载体，转化进入 BL 感受态中，涂板后挑取固体培养基上出现的单个菌落扩摇，当 OD 值达到 0.6 时，加入 2 mM 的 IPTG 诱导表达。再分别继续 26 ℃摇床培养 3 h，离心去上清后，给菌块称重，加入10 mL/克菌块的蛋白抽提剂 I，漩涡震荡后室温孵育 20 min。再离心收集上清即为诱导获得蛋白，使用 BCA 法测定获得蛋白浓度，Western Blot 检测蛋白表达。
验证小肽和 lncRNA-BMP4 骨架链功能
分离ESCs，在因子培养基中培养24h，待生长状态良好时，进行质粒转染，共分为4组。一组转染lncRNA-BMP4过表达载体，一组转染小肽过表达载体oeORF，一组转染骨架链过表达载体oelnc-ORFmut，还有一组做空白对照。24h后将因子培养基更换为BMP4诱导培养基，更换时记为第0d，在诱导的0、2、4、6d分别取样进行相关实验的检测：
1)在 2、4、6 d 时通过荧光倒置显微镜分别观察各组类胚体出现的数量，并拍照记录。
2)收集诱导的 0、2、4、6 d 细胞，TRIzol 法提取 RNA，反转录为 cDNA，再以 β-actin 为内参，参照天根公司 SuperReal 彩色荧光定量预混试剂(SYBR Green)说明书进行荧光定量检测 PGCs 形成过程中相关基因的表达
3)在 BMP4 诱导的第 4 d，分别对各组进行间接免疫荧光分析，各组细胞分别经过固定、透膜、封闭后，孵育一抗过夜，清洗后换成二抗，最后用 DAPI 复染，在荧光倒置显微镜下观察不同荧光通道并拍照记录。
4)在 BMP4 诱导的第 4 d，分别对各组进行流式细胞分析，各组细胞分别经过固定、透膜、封闭后，孵育一抗过夜，清洗后换成二抗，2 h 后将各组细胞分别上机检测阳性细胞率。
检测小肽对 BMP4 启动子活性的作用
一、Chip 验证小肽结合在 BMP4 启动子区域
（1）交联：分别收集各组细胞，培养基调整至8mL，加入500μL的16%甲醛使工作液浓度为1%，室温孵育10 min。再加入800L 10×甘氨酸，冰上孵育5min后，1000r/min离心5min，弃上清。使用含蛋白酶抑制剂的PBS清洗两遍后以同样转速收集细胞沉淀。加入1mL SDS细胞裂解液重悬细胞，分装成三管保存于-80 ℃。
（2）超声波破碎DNA：将1中分装的细胞裂解液在冰水混合物中准备超声，超声5s，关停10s，共重复五分钟，防止过热。结束后以12000 r/min离心10 min，弃沉淀。取上清100μL进行后续实验。
（3）交联蛋白/DNA：在上一步破碎的IP样品中加入900μL含蛋白酶抑制剂II的稀释缓冲液，然后将其分为IgG组、阳性对照组和目的抗体组。每组加入60μLG琼脂糖蛋白，4℃孵育1h后，5000r/min沉淀琼脂糖。取上清10uL作为Input。收集剩余上清，在IgG组中加入1μg鼠IgG抗体；阳性对照组中加入1μgRNA Polymerase II抗体；目的抗体组加入1μgHis抗体。4℃旋转孵育过夜。第二天将每管加入60μL琼脂糖蛋白，4℃孵育1h后，5000r/min沉淀琼脂糖，弃上清。将沉淀依次经过低盐免疫复合物清洗缓冲液、高盐免疫复合物清洗缓冲液、LicI免疫复合物清洗缓冲液、TE缓冲液各一次。
（4）洗脱DNA：在Input组中加入200μL洗脱缓冲液，其余三个组中先加入100μL洗脱缓冲液，室温孵育15mins，收集上清，再在沉淀中加入100μL洗脱缓冲液，继续收集上清，总共收集200μL。
（5）反向交联：向所有试管（IP和Input）中加入8uL 5M NaCl，65 ℃孵育5h，再加入1μL RNaseA，37 ℃孵育30 mins。再加入4 μL 0.5M EDTA，8μL1M Tris-HCI和1LL蛋白酶K，45 ℃孵育2h。
将收集到的 DNA 检测浓度后进行荧光定量检测 BMP4 启动子的结合，以 β-actin为内参，将 BMP4 启动子全长分为 15 个部分，分别设计 Chip-qPCR 引物。
二、双荧光素酶验证小肽对 BMP4 启动活性的影响
（1）构建缺失小肽结合位点的 BMP4 启动子双荧光素酶重组载
体 BMP4-promoter-mut，将构建成功的载体送公司测序比对，100%正确后用于后续实验。设计以下分组转染 DF-1：（1）BMP4-promoter-wt 与 oe-ORF 共转染；（2）BMP4-promoter-mut 与 oe-ORF 共转染；（3）单转 BMP4-promoter-wt；（4）以单转 pGL3-basic为空白对照，双荧光素酶检测小肽对BMP4 启动活性的影响。
Claims (4)
1.一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，利用在线软件 ORFFinder预测lncRNA-BMP4 可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过 WesternBlot 检测获得的诱导蛋白。
2.如权利要求1所述的一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，将 ORF连入 pcDNA-3.1 载体中，构建小肽过表达载体 oeORF；将突变了 ORF 起始密码子的lncRNA-BMP4 连入 pcDNA-3.1 载体中，构建骨架链过表达标签载体 oelnc-ORFmut；
在ESCs向PGCs诱导过程中通过细胞形态学观察类胚体形成，qRT-PCR 检测 PGCs 形成相关基因，间接免疫荧光检测 PGCs 标记蛋白，流式细胞分析检测PGCs 阳性细胞率，以检测小肽和lncRNA-BMP4 骨架链在PGCs形成过程中的功能。
3.如权利要求2所述的一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，在 ESCs、PGCs 中转染 oe-ORF，通过Chip实验验证小肽是否作为转录因子结合在 BMP4 启动子区域。
4.如权利要求3所述的一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，采用双荧光素酶验证小肽对 BMP4 启动活性的影响。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010571400.3A CN111690673A (zh) | 2020-06-22 | 2020-06-22 | 一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010571400.3A CN111690673A (zh) | 2020-06-22 | 2020-06-22 | 一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111690673A true CN111690673A (zh) | 2020-09-22 |
Family
ID=72482645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010571400.3A Pending CN111690673A (zh) | 2020-06-22 | 2020-06-22 | 一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111690673A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170183652A1 (en) * | 2014-04-22 | 2017-06-29 | Medizinische Hochschule Hannover | Lncrnas for therapy and diagnosis of cardiac hypertrophy |
| US20190071736A1 (en) * | 2017-09-07 | 2019-03-07 | Kyoto University | Vector and gene introduction agent for monitoring and visualizing cell differentiation using expression of micro rna as indicator and monitoring and visualizing method using thereof |
| CN110556163A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-12-10 | 广州基迪奥生物科技有限公司 | 一种基于翻译组的长链非编码rna翻译小肽的分析方法 |
-
2020
- 2020-06-22 CN CN202010571400.3A patent/CN111690673A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170183652A1 (en) * | 2014-04-22 | 2017-06-29 | Medizinische Hochschule Hannover | Lncrnas for therapy and diagnosis of cardiac hypertrophy |
| US20190071736A1 (en) * | 2017-09-07 | 2019-03-07 | Kyoto University | Vector and gene introduction agent for monitoring and visualizing cell differentiation using expression of micro rna as indicator and monitoring and visualizing method using thereof |
| CN110556163A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-12-10 | 广州基迪奥生物科技有限公司 | 一种基于翻译组的长链非编码rna翻译小肽的分析方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHEN,J.C. 等: "LncRNA Functions as a New Emerging Epigenetic Factor in Determining the Fate of Stem Cells", 《FRONTIERS IN GENETICS》 * |
| ZUO,Q.S. 等: "Dual regulatory actions of LncBMP4 on BMP4 promote chicken primordial germ cell formation", 《EMBO REPORTS》 * |
| 赵佳等: "LncRNA中sORFs分布特征研究", 《德州学院学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schütze et al. | Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells | |
| Huber et al. | SecA interacts with ribosomes in order to facilitate posttranslational translocation in bacteria | |
| Lee et al. | Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells | |
| Bartoschek et al. | Identification of permissive amber suppression sites for efficient non-canonical amino acid incorporation in mammalian cells | |
| CN109679932A (zh) | 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用 | |
| CA2939541C (en) | Hybrid proteins and uses thereof | |
| CN107893085B (zh) | 一种可用于孤核受体活性调节剂筛选的双荧光素酶报告基因质粒及其构建与应用 | |
| CN114487386A (zh) | 一种禽源外泌体的elisa检测方法 | |
| JP6960409B2 (ja) | プロモーター | |
| CN116949004B (zh) | 一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用 | |
| CN111500583B (zh) | 特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体及其应用 | |
| CN111690673A (zh) | 一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法 | |
| CA2589060A1 (en) | Hemopexin-like structure as polypeptide-scaffold | |
| CN113201543B (zh) | 企鹅珍珠贝Tyr基因的启动子及其应用 | |
| CN115725675A (zh) | 一种长片段基因的生物合成方法及应用 | |
| KR101599138B1 (ko) | 재조합 단백질 발현 증진을 위한 유전자 절편을 포함하는 벡터 및 이의 용도 | |
| Hinz et al. | Simplifying the detection of surface presentation levels in yeast surface display by intracellular tGFP Expression | |
| CN112877332A (zh) | 一种由双荧光素酶报告基因检测鸡ripk2启动子活性的方法 | |
| CN113025579A (zh) | 一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系及其构建方法 | |
| CN108004241B (zh) | 烟草硝酸还原酶nia2启动子、其表达载体及其应用 | |
| CN114517199B (zh) | 企鹅珍珠贝Mitf基因的启动子及其应用 | |
| Schofield et al. | Sequencing and affinity determination of antigen-specific B lymphocytes from peripheral blood | |
| CN115725623A (zh) | 一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用 | |
| CN116790643A (zh) | 编码突变体的核酸分子、重组蛋白及其应用 | |
| CN116790648A (zh) | 用于转座酶定向进化的辅助P-质粒、转座酶定向进化的系统及Tn5转座酶突变体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200922 |