CN116254244A - 谷氨酰胺转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

谷氨酰胺转氨酶突变体及其应用 Download PDF

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CN116254244A CN202310407969.XA CN202310407969A CN116254244A CN 116254244 A CN116254244 A CN 116254244A CN 202310407969 A CN202310407969 A CN 202310407969A CN 116254244 A CN116254244 A CN 116254244A
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蓝东明
王永华
王方华
杨博
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South China University of Technology SCUT
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Abstract

本发明公开了一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明中，通过将来源于马里亚尼链霉菌(Streptomycesmarianii)的MTG的1‑19位氨基酸与商业MTG的1‑18位氨基酸进行替换后，所得到突变体的酶活力相比野生型得到了显著提高，能够更好地满足工业生产需求。本发明的SmMTG突变体丰富了MTG的种类，并为其工业应用研究提供借鉴和指导。

Description

谷氨酰胺转氨酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,TG,EC 2.3.2.13)又称转谷氨酰胺酶，是一种转移酶，能够催化γ-羧胺和伯胺中谷氨酰胺残基的酰基转移，或与水进行脱酰胺反应，使蛋白质发生共价交联，能够改善蛋白质的热稳定性、持水力等特性，有助于形成强有力的凝胶，改善蛋白制品的品质，因而被广泛应用于肉制品、乳制品等传统蛋白制品的质构改良，是一种常见的食品酶制剂。
TG酶来源广泛，存在于动物、植物、微生物中，来源于动物的TG酶需要Ca2+的激活，而微生物来源的TG酶(Microbial Transglutaminase，MTGase)不需要Ca2+的激活，可直接分泌至胞外，适用于大规模工业化生产。
现有的商品化MTG酶均来源于莫巴兰氏链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)，已实现在大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等多个表达系统的异源表达，但酶活较低(约为120U/g)，限制了在工业中的应用。因此，开发酶活更高的MTG酶非常有意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其编码基因和应用。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。
本发明的第二方面，提供了一种谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三方面，提供了上述谷氨酰胺转氨酶突变体或谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因在催化酰基转移、或脱酰胺反应中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种插入有上述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因的重组表达载体。
本发明的第五方面，提供了一种转入有上述重组表达载体的重组工程菌株。
本发明的第六方面，提供了上述重组表达载体或重组工程菌株在催化酰基转移、或脱酰胺反应中的应用。
本发明的第七方面，提供了一种催化酰基转移或脱酰胺反应中的方法，包括以下步骤：使用上述谷氨酰胺转氨酶突变体催化γ-羧胺或伯胺中的谷氨酰胺残基发生酰基转移反应、或催化γ-羧胺或伯胺与水进行脱酰胺反应。
在本发明中，通过将来源于马里亚尼链霉菌(Streptomyces marianii)的MTG的1-19位氨基酸与商业MTG的1-18位氨基酸进行替换后，所得到突变体的酶活力相比野生型得到了显著提高，能够更好地满足工业生产需求。本发明的SmMTG突变体丰富了MTG的种类，并为其工业应用研究提供借鉴和指导。
附图说明
图1为本发明实施例2中SDS-PAGE检测各突变体在BL21中的表达图；其中，1：野生型SmMTG；2：突变体SmMTG-N19；3：突变体SmMTG-N32；4：突变体SmMTG-N61。
图2为本发明实施例3中酶活力计算标准曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本发明中，先在基因库中进行序列分析得到谷氨酰胺转氨酶(SmMTG)的基因序列，再通过基因合成得到该基因(氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2)，然后将SmMTG与商品化MTG(东圣生物科技有限公司，氨基酸序列为SEQ ID NO.9)的N端部分序列进行替换，得到3个突变体SmMTG-N19、SmMTG-N32和SmMTG-N61，其中SmMTG-N19是SmMTG的1-19位氨基酸与商品化MTG酶1-18位进行了替换，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；SmMTG-N32是SmMTG的20-32位氨基酸与商品化MTG酶19-32位进行了替换，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5，核苷酸序列为SEQ ID NO.6；SmMTG-N61是SmMTG的33-61位氨基酸与商品化MTG酶33-49位进行了替换，其氨基酸序列为SEQ ID NO.7，核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
SmMTG的氨基酸序列(WP_138057969，SEQ ID NO.1)：MANRVEGEKRESFAEEHGLTADDVRHINALNERALSLGQPDKPSGASLPSAVESPRASAAASGRVTPPAEPLDRMPDAYRTYGGRATTGVSNYIRKWQQVYSHRDGQARQMTEEQREQLSYGCVGVTWVNSGPYPTNKLAFASFDENKYKNALENTTPRPGETQAELEGRIAKESFDEGKGFKRARDVASIMNKALENAHDEGTYLSNLKAELTRNNDALRNEDARSNFYSALRNTPSFKDGEGGDYDPSRMKAVIYSKHFWSGQDPRSSANKRKYGDPEAFRPNPSTGLVDMSKDRNTSRSPGNSGESYVNFDYGWFGDQKEEDHDQTVWTHANHYHSPNGGMGPMKVYESKFRNWSAGYADFDRGTYMITFIPKSWNTAPAKVTQGWPLESmMTG的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
ATGGCTAACCGTGTTGAAGGTGAAAAACGTGAATCTTTCGCTGAAGAACA
TGGCCTGACCGCTGATGATGTTCGTCATATTAACGCGCTGAACGAACGCGC
GCTGAGCCTGGGTCAGCCGGATAAACCGTCTGGTGCTTCTCTGCCGAGCG
CGGTTGAATCTCCGCGTGCGTCTGCGGCGGCGAGCGGTCGTGTTACCCCG
CCGGCGGAACCGCTGGATCGTATGCCGGACGCGTACCGTACCTACGGCGG
CCGTGCGACTACCGGCGTTAGCAACTACATTCGTAAATGGCAGCAGGTTTA
CTCTCATCGTGATGGCCAGGCGCGTCAGATGACCGAAGAACAGCGCGAAC
AGCTGTCTTACGGTTGCGTGGGTGTTACCTGGGTTAACTCTGGTCCGTACC
CGACCAACAAACTGGCGTTCGCGTCTTTCGATGAAAACAAATACAAAAAC
GCCCTGGAAAACACCACCCCGCGTCCGGGCGAAACCCAGGCGGAACTGG
AAGGCCGCATTGCGAAAGAAAGCTTCGATGAAGGTAAAGGTTTCAAACGT
GCTCGCGATGTTGCGTCTATCATGAACAAAGCGCTGGAAAACGCGCACGA
TGAAGGCACCTACCTGTCTAACCTGAAAGCGGAACTGACCCGTAACAACG
ATGCACTGCGTAACGAAGATGCGCGTTCTAACTTCTATAGCGCGCTGCGTA
ACACTCCGAGCTTCAAAGATGGTGAAGGTGGTGATTACGATCCAAGCCGTA
TGAAAGCAGTTATTTATTCTAAACATTTCTGGTCTGGTCAGGATCCGAGATC
TAGCGCTAACAAACGCAAATACGGTGATCCGGAAGCGTTCCGTCCAAATC
CGTCTACCGGTCTGGTTGATATGAGCAAAGACCGAAACACCTCTCGTTCTC
CGGGCAACTCTGGCGAAAGCTACGTTAACTTCGATTACGGCTGGTTCGGTG
ATCAGAAAGAAGAAGATCATGATCAGACCGTTTGGACCCATGCGAACCATT
ACCATTCTCCGAACGGTGGTATGGGTCCGATGAAAGTTTACGAATCTAAAT
TCCGTAACTGGTCTGCTGGTTACGCGGATTTCGATCGTGGTACCTATATGAT
TACCTTCATTCCGAAATCTTGGAACACCGCGCCGGCGAAAGTTACCCAGG
GTTGGCCGCTCGAG
突变体SmMTG-N19的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
MDNGAGEETKSYAETYRLADDVRHINALNERALSLGQPDKPSGASLPSAVES
PRASAAASGRVTPPAEPLDRMPDAYRTYGGRATTGVSNYIRKWQQVYSHRD
GQARQMTEEQREQLSYGCVGVTWVNSGPYPTNKLAFASFDENKYKNALEN
TTPRPGETQAELEGRIAKESFDEGKGFKRARDVASIMNKALENAHDEGTYLS
NLKAELTRNNDALRNEDARSNFYSALRNTPSFKDGEGGDYDPSRMKAVIYSK
HFWSGQDPRSSANKRKYGDPEAFRPNPSTGLVDMSKDRNTSRSPGNSGESYV
NFDYGWFGDQKEEDHDQTVWTHANHYHSPNGGMGPMKVYESKFRNWSA
GYADFDRGTYMITFIPKSWNTAPAKVTQGWPLE
突变体SmMTG-N19的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：
ATGGACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCCTACGCCGAAACCTACC
GCCTCGCTGATGATGTTCGTCATATTAACGCGCTGAACGAACGCGCGCTGA
GCCTGGGTCAGCCGGATAAACCGTCTGGTGCTTCTCTGCCGAGCGCGGTT
GAATCTCCGCGTGCGTCTGCGGCGGCGAGCGGTCGTGTTACCCCGCCGGC
GGAACCGCTGGATCGTATGCCGGACGCGTACCGTACCTACGGCGGCCGTG
CGACTACCGGCGTTAGCAACTACATTCGTAAATGGCAGCAGGTTTACTCTC
ATCGTGATGGCCAGGCGCGTCAGATGACCGAAGAACAGCGCGAACAGCTG
TCTTACGGTTGCGTGGGTGTTACCTGGGTTAACTCTGGTCCGTACCCGACC
AACAAACTGGCGTTCGCGTCTTTCGATGAAAACAAATACAAAAACGCCCT
GGAAAACACCACCCCGCGTCCGGGCGAAACCCAGGCGGAACTGGAAGGC
CGCATTGCGAAAGAAAGCTTCGATGAAGGTAAAGGTTTCAAACGTGCTCG
CGATGTTGCGTCTATCATGAACAAAGCGCTGGAAAACGCGCACGATGAAG
GCACCTACCTGTCTAACCTGAAAGCGGAACTGACCCGTAACAACGATGCA
CTGCGTAACGAAGATGCGCGTTCTAACTTCTATAGCGCGCTGCGTAACACT
CCGAGCTTCAAAGATGGTGAAGGTGGTGATTACGATCCAAGCCGTATGAA
AGCAGTTATTTATTCTAAACATTTCTGGTCTGGTCAGGATCCGAGATCTAGC
GCTAACAAACGCAAATACGGTGATCCGGAAGCGTTCCGTCCAAATCCGTCT
ACCGGTCTGGTTGATATGAGCAAAGACCGAAACACCTCTCGTTCTCCGGG
CAACTCTGGCGAAAGCTACGTTAACTTCGATTACGGCTGGTTCGGTGATCA
GAAAGAAGAAGATCATGATCAGACCGTTTGGACCCATGCGAACCATTACC
ATTCTCCGAACGGTGGTATGGGTCCGATGAAAGTTTACGAATCTAAATTCC
GTAACTGGTCTGCTGGTTACGCGGATTTCGATCGTGGTACCTATATGATTAC
CTTCATTCCGAAATCTTGGAACACCGCGCCGGCGAAAGTTACCCAGGGTT
GGCCGCTCGAG
突变体SmMTG-N32的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
MANRVEGEKRESFAEEHGLTTADDVANINALNESALSLGQPDKPSGASLPSAV
ESPRASAAASGRVTPPAEPLDRMPDAYRTYGGRATTGVSNYIRKWQQVYSHR
DGQARQMTEEQREQLSYGCVGVTWVNSGPYPTNKLAFASFDENKYKNALE
NTTPRPGETQAELEGRIAKESFDEGKGFKRARDVASIMNKALENAHDEGTYL
SNLKAELTRNNDALRNEDARSNFYSALRNTPSFKDGEGGDYDPSRMKAVIYS
KHFWSGQDPRSSANKRKYGDPEAFRPNPSTGLVDMSKDRNTSRSPGNSGESY
VNFDYGWFGDQKEEDHDQTVWTHANHYHSPNGGMGPMKVYESKFRNWS
AGYADFDRGTYMITFIPKSWNTAPAKVTQGWPLE
突变体SmMTG-N32的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：
ATGGCTAACCGTGTTGAAGGTGAAAAACGTGAATCTTTCGCTGAAGAACA
TGGCCTGACCACGGCGGATGACGTCGCGAACATCAACGCGCTCAACGAAA
GCGCGCTGAGCCTGGGTCAGCCGGATAAACCGTCTGGTGCTTCTCTGCCG
AGCGCGGTTGAATCTCCGCGTGCGTCTGCGGCGGCGAGCGGTCGTGTTAC
CCCGCCGGCGGAACCGCTGGATCGTATGCCGGACGCGTACCGTACCTACG
GCGGCCGTGCGACTACCGGCGTTAGCAACTACATTCGTAAATGGCAGCAG
GTTTACTCTCATCGTGATGGCCAGGCGCGTCAGATGACCGAAGAACAGCG
CGAACAGCTGTCTTACGGTTGCGTGGGTGTTACCTGGGTTAACTCTGGTCC
GTACCCGACCAACAAACTGGCGTTCGCGTCTTTCGATGAAAACAAATACA
AAAACGCCCTGGAAAACACCACCCCGCGTCCGGGCGAAACCCAGGCGGA
ACTGGAAGGCCGCATTGCGAAAGAAAGCTTCGATGAAGGTAAAGGTTTCA
AACGTGCTCGCGATGTTGCGTCTATCATGAACAAAGCGCTGGAAAACGCG
CACGATGAAGGCACCTACCTGTCTAACCTGAAAGCGGAACTGACCCGTAA
CAACGATGCACTGCGTAACGAAGATGCGCGTTCTAACTTCTATAGCGCGCT
GCGTAACACTCCGAGCTTCAAAGATGGTGAAGGTGGTGATTACGATCCAA
GCCGTATGAAAGCAGTTATTTATTCTAAACATTTCTGGTCTGGTCAGGATCC
GAGATCTAGCGCTAACAAACGCAAATACGGTGATCCGGAAGCGTTCCGTC
CAAATCCGTCTACCGGTCTGGTTGATATGAGCAAAGACCGAAACACCTCTC
GTTCTCCGGGCAACTCTGGCGAAAGCTACGTTAACTTCGATTACGGCTGGT
TCGGTGATCAGAAAGAAGAAGATCATGATCAGACCGTTTGGACCCATGCG
AACCATTACCATTCTCCGAACGGTGGTATGGGTCCGATGAAAGTTTACGAA
TCTAAATTCCGTAACTGGTCTGCTGGTTACGCGGATTTCGATCGTGGTACCT
ATATGATTACCTTCATTCCGAAATCTTGGAACACCGCGCCGGCGAAAGTTA
CCCAGGGTTGGCCGCTCGAG
突变体SmMTG-N61的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：
MANRVEGEKRESFAEEHGLTADDVRHINALNERAPAASSAGPSFRAPDSDDR
VTPPAEPLDRMPDAYRTYGGRATTGVSNYIRKWQQVYSHRDGQARQMTEEQ
REQLSYGCVGVTWVNSGPYPTNKLAFASFDENKYKNALENTTPRPGETQAE
LEGRIAKESFDEGKGFKRARDVASIMNKALENAHDEGTYLSNLKAELTRNND
ALRNEDARSNFYSALRNTPSFKDGEGGDYDPSRMKAVIYSKHFWSGQDPRSS
ANKRKYGDPEAFRPNPSTGLVDMSKDRNTSRSPGNSGESYVNFDYGWFGDQ
KEEDHDQTVWTHANHYHSPNGGMGPMKVYESKFRNWSAGYADFDRGTYM
ITFIPKSWNTAPAKVTQGWPLE
突变体SmMTG-N61的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)：
ATGGCTAACCGTGTTGAAGGTGAAAAACGTGAATCTTTCGCTGAAGAACA
TGGCCTGACCGCTGATGATGTTCGTCATATTAACGCGCTGAACGAACGCGC
TCCGGCCGCTTCGAGCGCCGGCCCGTCGTTCCGGGCCCCCGACTCCGACG
ACCGTGTTACCCCGCCGGCGGAACCGCTGGATCGTATGCCGGACGCGTAC
CGTACCTACGGCGGCCGTGCGACTACCGGCGTTAGCAACTACATTCGTAAA
TGGCAGCAGGTTTACTCTCATCGTGATGGCCAGGCGCGTCAGATGACCGA
AGAACAGCGCGAACAGCTGTCTTACGGTTGCGTGGGTGTTACCTGGGTTA
ACTCTGGTCCGTACCCGACCAACAAACTGGCGTTCGCGTCTTTCGATGAA
AACAAATACAAAAACGCCCTGGAAAACACCACCCCGCGTCCGGGCGAAA
CCCAGGCGGAACTGGAAGGCCGCATTGCGAAAGAAAGCTTCGATGAAGG
TAAAGGTTTCAAACGTGCTCGCGATGTTGCGTCTATCATGAACAAAGCGCT
GGAAAACGCGCACGATGAAGGCACCTACCTGTCTAACCTGAAAGCGGAAC
TGACCCGTAACAACGATGCACTGCGTAACGAAGATGCGCGTTCTAACTTCT
ATAGCGCGCTGCGTAACACTCCGAGCTTCAAAGATGGTGAAGGTGGTGATT
ACGATCCAAGCCGTATGAAAGCAGTTATTTATTCTAAACATTTCTGGTCTGG
TCAGGATCCGAGATCTAGCGCTAACAAACGCAAATACGGTGATCCGGAAG
CGTTCCGTCCAAATCCGTCTACCGGTCTGGTTGATATGAGCAAAGACCGAA
ACACCTCTCGTTCTCCGGGCAACTCTGGCGAAAGCTACGTTAACTTCGATT
ACGGCTGGTTCGGTGATCAGAAAGAAGAAGATCATGATCAGACCGTTTGG
ACCCATGCGAACCATTACCATTCTCCGAACGGTGGTATGGGTCCGATGAAA
GTTTACGAATCTAAATTCCGTAACTGGTCTGCTGGTTACGCGGATTTCGATC
GTGGTACCTATATGATTACCTTCATTCCGAAATCTTGGAACACCGCGCCGGC
GAAAGTTACCCAGGGTTGGCCGCTCGAG
商品MTG的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：
DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASSAGPSFRAPDSDDRVTP
PAEPLDRMPDPYRPSYGRAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQRE
WLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFE
GRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDA
LRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSA
DKRKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTE
ADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSEGYSDFDRGAYVITF
IPKSWNTAPDKVKQGWP
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因。
在其中一些实施例中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的另一些实施例中，公开了上述谷氨酰胺转氨酶突变体或谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因在催化酰基转移、或脱酰胺反应中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种插入有上述编码基因的重组表达载体。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种转入有上述重组表达载体的重组工程菌。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种构建上述重组工程菌的方法，包括以下步骤：将上述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因克隆到表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，即得。
在其中一些实施例中，所述表达载体为pET22b(+)，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
在本发明的另一些实施例中，公开了上述重组表达载体或重组工程菌在催化酰基转移、或脱酰胺反应中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种催化酰基转移或脱酰胺反应中的方法，包括以下步骤：使用上述谷氨酰胺转氨酶突变体催化γ-羧胺或伯胺中的谷氨酰胺残基发生酰基转移反应、或催化γ-羧胺或伯胺与水进行脱酰胺反应。
以下实施例中，所使用的材料包括：引物、质粒pET22b(+)-SmMTG由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；大肠杆菌TOP10、BL21(DE3)感受态细胞，购自唯地生物科技有限公司；SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、DNA聚合酶(2×PrimerStar Max)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性核酸内切酶DpnⅠ，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；所有的化学药品均购自Sigma-Aldrich、麦克林试剂及阿拉丁公司，其纯度最高，无需进一步提纯即可使用。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1SmMTG突变体的构建
包括以下步骤：
1、设计突变体引物，如表1所示。
表1
Figure BDA0004182173190000111
以含有SmMTG的质粒pET22b(+)-SmMTG为模板，利用表1的引物，PCR扩增得到含突变基因的质粒。PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增程序如表3所示。
表2
Figure BDA0004182173190000121
表3
Figure BDA0004182173190000122
其中T为退火温度，选择比对应引物的Tm值低5℃。
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验确认后，PCR产物的消化纯化使用限制性核酸内切酶Dpn I进行模板消化，去除体系中含有的原始模板。消化体系如表4所示。
表4
Figure BDA0004182173190000123
Figure BDA0004182173190000131
上述体系置于37℃恒温30-60min。
2、酶切1h后，酶切产物进行PCR产物纯化，纯化产物经核酸电泳检验确认。
3、将所得纯化产物与大肠杆菌感受态细胞TOP10混合，置于冰上30min，于42℃下热激90s，迅速置于冰上2min。
4、将上步所得感受态细胞加入至1ml LB培养基中，在37℃，200rpm条件下活化45min。活化后感受态细胞于8000rpm条件下离心2min，移除大部分培养基，重悬菌体后所得转化液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin)的LB平板上，37℃培养箱中静置培养过夜后，挑取平板上单菌落接种于5ml的LB液体培养基(含100μg/mLAmp)中，于37℃，200rpm条件下过夜培养，经基因测序确定扩增结果后提取质粒备用。
实施例2SmMTG突变体的表达及蛋白纯化
1、突变体的表达
将实施例1得到的SmMTG突变体(以下均命名为SmMTG-N19、SmMTG-N32和SmMTG-N61)的质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，转化液涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin)的LB平板中，37℃培养过夜，长出的单菌落为所述表达菌株。
挑取SmMTG突变体的单菌落接种于5ml LB培养基中于37℃、220rpm条件下培养过夜，再进一步接种到500ml自诱导培养基(1％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、0.05％(w/v)葡萄糖、0.2％(w/v)乳糖、0.5％(w/v)甘油、25mMNa2HPO4、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl、5mM Na2SO4、2mM MgSO4)中进行扩大培养。37℃培养至OD600达到对数期，继续培养20h后收菌。将收集的菌体用PBS缓冲液制成悬浊液，用超声仪破壁，破壁好的悬浊液在12000rpm离心25min，收集上清上清液通过0.45μm滤膜抽滤，进一步去除菌体和杂质。
2、突变体的纯化
先用3体积的PBS缓冲液平衡Ni柱，将制备好的粗酶液进行上样；再用PBS缓冲液平衡纯化系统，待平衡后用加20mM咪唑PBS缓冲液将杂蛋白洗脱。再用洗脱液缓冲液(300mM咪唑和500mM NaCl、pH7.0的PBS缓冲液)进行洗脱，收集洗脱峰，即为纯化的酶。
3、突变体蛋白浓度检测
利用Brandford蛋白质测定试剂盒测定突变体蛋白浓度。配制牛血清蛋白的一系列浓度作为蛋白质浓度标准液，制备标准曲线。加入10μl不同浓度的标准蛋白于96孔板中，再加入200μl Brandford试剂，室温下反应5min后，于595nm处测定吸光值，根据已知蛋白浓度与对应的吸光值，得到蛋白浓度标准曲线。突变体蛋白在相同反应条件下测定595nm下的吸光值，平行试验三次以上，比对蛋白浓度标准曲线后得到突变体蛋白浓度，结果显示所有蛋白纯度均在75％以上。
实施例3SmMTG突变体的酶活动力学检测
酶活力测定选用氧肟酸比色法。酶活定义：37℃时，每分钟催化生成1μmol L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，用U表示，即1U。
具体操作步骤如下：
1、试剂的配制
(1)、0.2mol/L Tris-Hac：2.42g Tris溶解于95ml超纯水，加入冰乙酸调节至6.0后，定容至100ml。
(2)、底物试剂A液：Z-Gln-Gly20mg，盐酸羟胺13.898mg，谷胱甘肽(还原型)6.074mg，加入0.2mol/L的Tris-HAc缓冲液2ml，4℃保存，有效期五天。
(3)、终止试剂B液：3mol/L的HCl，5％氯化铁溶液，12％三氯乙酸，按照1:1:1比例配制，4℃避光保存。
2、标准曲线的绘制
将配制好的(20mmol/L)L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液，使用pH6.0的Tris-HAc缓冲液进行梯度稀释，得到0，0.5，1，2，5，10，15mmol/L浓度的标准液。取稀释好的标准液各50μL分别置于干净离心管中，37℃水浴保温30min后，加入50μLB液终止反应并显色。显色液经12000r/min离心1min，移液枪吸取100μL显色上清液置于96孔酶标板，在酶标仪525nm波长下，测定吸光值(A)。以L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸的浓度(mmol/)为横坐标，OD525nm下吸光值为纵坐标，绘制出L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸含量的标准曲线。
3、酶活测定
取50μL酶液置于1.5ml离心管中，加入50μL底物A液混合均匀，放入37℃水浴保温30min后，加入50μL B液终止反应并显色。12000r/min离心1min，移液枪吸取100μL显色上清液置于96孔酶标板，在酶标仪525nm波长下，测定上清液吸光值；另取50μL上清煮沸灭活，其余步骤同上，作为对照用于样品测定吸光度时调零。
SmMTG野生型与突变体的酶活比对结果如表2所示。
表2SmMTG野生型与突变体酶活比对
SmMTG野生型 商品MTG SmMTG-N19 SmMTG-N32 SmMTG-61
比酶活(U/g) 121 124 196 133 116
从表2结果可知，SmMTG野生型的酶活力为121U/g，商品MTG的酶活力为124U/g，突变体SmMTG-N19的酶活显著高于其他突变体、野生型和商品MTG的比酶活，约为SmMTG野生型和商品MTG比酶活的1.6倍，能够更好的满足工业生产需求。
实施例4SmMTG突变体在食品中的应用
取1公斤生牛肉(超市购得)切碎，将其揉为直径为3CM的手工肉丸，分为三组，加入不同酶量的突变体SmMTG-N19，酶加量分别为0U/g、0.2U/g、0.4U/g(其中空白组加入相同体积的水控制变量)，再将每个肉丸手揉5min确保酶混合均匀，将手工肉丸置于4℃中冷藏24h，于沸水中煮5min，观察沸水中肉丸是否有松散现象，以及比较煮沸后肉丸的弹性及咀嚼性。
实验结果表明，与空白组相比，添加0.2U/g、0.4U/g的突变体SmMTG-N19的肉丸，松散程度明显降低，煮沸后，肉丸的弹性及咀嚼性均有明显提升，且添加0.4U/g的突变体SmMTG-N19的肉丸效果更好。说明突变体SmMTG-N19可用于改变牛肉丸的凝胶特性，增强肉丸的持水性和质构特性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种谷氨酰胺转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
4.权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶突变体、或权利要求2或3所述的谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因在催化酰基转移、或脱酰胺反应中的应用。
5.一种插入有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。
6.一种转化有权利要求5所述重组表达载体的重组工程菌。
7.一种构建权利要求6所述重组工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2或3所述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因克隆到表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pET22b，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
9.权利要求5所述重组表达载体或权利要求6所述重组工程菌在催化酰基转移、或脱酰胺反应中的应用。
10.一种催化酰基转移或脱酰胺反应中的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶突变体催化γ-羧胺或伯胺中的谷氨酰胺残基发生酰基转移反应、或催化γ-羧胺或伯胺与水进行脱酰胺反应。
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