CN113474463A

CN113474463A - 通过利用混合原料的微生物细胞进行的碳水化合物的发酵生产

Info

Publication number: CN113474463A
Application number: CN202080017083.9A
Authority: CN
Inventors: S·詹尼温; D·瓦滕伯格
Original assignee: Kohansen Breast Milk Oligosaccharides Co ltd
Current assignee: Kohansen Breast Milk Oligosaccharides Co ltd
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2021-10-01
Also published as: WO2020178178A1; MX2021010527A; AU2020230967A1; EP3702468A1; JP2022522366A; SG11202109034VA; US20220145342A1; EP3931340A1; BR112021017091A2; KR20220012834A

Abstract

本申请公开了用于生产目的碳水化合物的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性，并且当在含有混合单糖原料作为主要碳源和能源的培养基中培养时产生目的碳水化合物。本申请还公开了通过在作为主要碳源和能源的混合单糖原料存在下培养所述遗传工程化的微生物细胞来生产目的碳水化合物的发酵方法。

Description

通过利用混合原料的微生物细胞进行的碳水化合物的发酵生产

本发明涉及目的糖的发酵生产。本申请公开了能够产生目的糖的微生物细胞，其中所述微生物细胞在发酵期间利用混合单糖原料作为主要碳源和能源。本申请还公开了通过利用所述微生物细胞产生目的糖的方法。

背景技术

人乳包含碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。人乳的最主要的级分由碳水化合物组成。人乳中的碳水化合物级分可进一步分为(i)乳糖和(ii)寡糖(人乳寡糖，HMO)。虽然二糖乳糖(半乳糖-β1,4-葡萄糖)被婴儿用作能源，但寡糖却不被婴儿代谢。

寡糖的级分占总碳水合物级分的最高达十分之一，并且大概由150多种结构不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类特有的，因此无法在其他哺乳动物(包括乳场动物)的乳中大量发现。

最重要的人乳寡糖是2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)，它们共同占总HMO级分的最高达1/3。其他重要的HMO为乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)和乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)。除了这些中性寡糖外，还可在人乳中发现酸性HMO，如3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、唾液酸-乳-N-四糖和二唾液酸-乳-N-四糖。

值得注意的是，绝大多数HMO在其还原端包含半乳糖-β1,4--葡萄糖部分，其通过添加单糖部分(如N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或岩藻糖和/或半乳糖和/或N-乙酰神经氨酸(NeuNAc))而得到延伸。HMO的结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位(Lewis组织血型抗原，如Lewis x(LeX))密切相关。HMO与上皮表位的结构相似性解释了HMO对细菌病原体的保护特性。

人乳中寡糖的存在早已为人所知，几十年来一直对这些寡糖的生理功能进行医学研究。对于一些更丰富的人乳寡糖，已经确定了特定的功能。

除了本文前面提到的在肠道中引起局部效应外，HMO还被证明通过进入婴儿的全身循环而在婴儿中引起全身效应。此外，HMO对蛋白质-碳水化合物相互作用(例如选择蛋白-白细胞结合)的影响可调节免疫应答并减少炎症应答。此外，越来越多的人认识到HMO代表婴儿微生物群发育的关键底物。

由于总体上对各种碳水化合物(尤其是益生元寡糖)的有益特性进行了充分研究，但由于其天然来源的可获得性有限，因此非常需要一种高效且具有成本效益的单糖(例如L-岩藻糖、N-乙酰神经氨酸)、二糖(例如乳-N-二糖)和寡糖(例如2’-FL、LNnT)生产方法。

为了尝试大规模生产功能性碳水化合物，开发了其中一些碳水化合物的化学途径。然而，这些方法包括使用几种有毒化学品，这增加了污染最终产品的风险。迄今为止，还不能通过化学合成提供至少足以用于食品应用的大规模数量以及质量的功能性碳水合物。

为了避免与人乳寡糖的化学合成相关的缺点，开发了用于它们的生产的几种酶法和发酵法。已经开发了几种碳水化合物的发酵生产方法，所述碳水化合物为例如L-岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖。这些生产方法通常使用遗传工程化的细菌细胞，如重组大肠杆菌(Escherichia coli)。

通常，产生HMO的发酵生产方法以及生物催化反应都是基于作为要产生的HMO的初始受体底物的外源添加的乳糖。在这些方法中向乳糖中加入一种或多种单糖(US 7,521,212 B1；Albermannet al.,(2001)Carbohydr.Res.334(2)第97-103页)。向乳糖中添加单糖可以通过糖基转移酶或通过糖苷酶，使用合适的活化单糖底物来催化。此外，可以通过转糖苷酶反应向乳糖中添加其他单糖。

具体地，HMO的发酵生产被证明是有效的，因为由所使用的微生物细胞的代谢提供了必需但难以合成的核苷酸活化单糖。核苷酸活化单糖的生物合成途径通常来源于宿主细胞在葡萄糖-6-磷酸或果糖-6-磷酸水平上的初级代谢。UDP-半乳糖(UDP-Gal)的生物合成途径来源于葡萄糖-6-磷酸，而GDP-岩藻糖、UDP-N-乙酰葡糖胺和CMP-N-乙酰神经氨酸的生物合成来源于果糖-6-磷酸。

微生物宿主细胞中核苷酸活化单糖的有效生物合成，以及因此通过发酵方法的所需碳水化合物的产生，显然依赖于磷酸糖如葡萄糖-6-磷酸和/或果糖-6-磷酸的持续供应。

所述发酵方法(通常基于微生物宿主细胞消耗简单且廉价的碳源和能源(例如甘油、葡萄糖、蔗糖))中的主要问题是所述宿主细胞中这种磷酸化/活化糖的有限可用性(例如由于竞争反应)，极大地削弱了产物生物合成途径的碳通量，从而削弱了这些方法的生产率。

为了克服上述缺点，开发了用于生产HMO的改进方式和方法。例如，WO 2012/007481 A2公开了能够产生糖、活化糖、核苷、糖苷、糖脂和糖蛋白的工程化的生物体，其中所述工程化的生物体表达i)编码碳水化合物水解酶的基因结合编码碳水化合物激酶的基因，ii)编码碳水化合物合酶的基因，或iii)编码碳水化合物磷酸化酶的基因，使得所述生物体能够将二糖、寡糖、多糖或其混合物裂解为活化的糖和糖，并且其中所述生物体被进一步遗传修饰，使得除了所述生物体的任何导入基因之外的至少一个其他基因被赋予较低的功能性或非功能性，并且其中所述其他基因编码将所述活化糖转化为生物质的酶和/或生物催化酶。所述工程化的生物体能够产生所需的碳水化合物，同时利用二糖如蔗糖、寡糖、多糖或其混合物。

然而，通过使用蔗糖作为唯一的碳源和能源的所述工程化的生物体生产所需化合物的主要缺点在于难以对蔗糖进行灭菌。最理想的灭菌方法是热灭菌。然而，蔗糖的热灭菌导致了相当大程度的水解，抵消了WO 2012/007481 A2中所述方法的适用性。

作为热灭菌的替代方法，可以使用蔗糖溶液的无菌过滤，但是无菌过滤具有导致不想要的细菌细胞生长的高污染风险，特别是在工业规模发酵中。

然而，由于蔗糖的可用性和低成本，其代表了生物技术应用中最有吸引力的碳源。

因此，需要提供用于发酵生产所需碳水化合物的微生物细胞，当在作为主要碳源和能源的廉价原料存在下培养时，所述微生物细胞能够产生所需碳水化合物，其中所述原料不必被微生物细胞水解以被细胞的代谢利用，以及通过在作为主要碳源和能源的所述原料存在下培养所述微生物细胞的发酵生产目的碳水化合物的方法。

该目的得以解决在于提供遗传工程化的微生物细胞以及通过提供发酵生产目的碳水化合物的方法；所述微生物细胞当在作为主要碳源和能源的混合单糖原料上培养时能够产生所需的碳水化合物，其中所述混合单糖原料由葡萄糖和至少一种选自果糖和半乳糖的其他单糖组成，并且其中所述微生物细胞具有增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性；所述方法包括在作为主要碳源和能源的所述混合单糖原料的存在下培养所述遗传工程化的微生物细胞。

发明内容

根据第一方面，本申请提供了用于生产目的碳水化合物的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性，并且当在作为主要碳源和能源的混合单糖原料存在下培养时能够产生目的碳水化合物，其中所述混合单糖原料由葡萄糖和至少一种选自果糖和半乳糖的其他单糖组成。

根据第二方面，本申请提供了如本文所述的遗传工程化的微生物细胞用于生产目的碳水化合物的用途，其中在单糖混合物存在下培养所述微生物细胞，所述单糖混合物由葡萄糖和至少一种来自果糖和半乳糖的其他单糖组成。

根据第三方面，本申请提供了一种用于发酵生产目的碳水化合物的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供能够产生目的碳水化合物的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性；

b)在允许产生所述目的碳水化合物的培养基中培养所述遗传工程化的微生物细胞，其中所述培养基包含作为主要碳源和能源的混合单糖原料，其中所述混合单糖原料由葡萄糖和至少一种选自果糖和半乳糖的其他单糖组成；和

c)回收所述目的碳水化合物。

在第四方面，本申请提供了已通过遗传工程化的微生物细胞和/或通过本文所述方法产生的目的碳水化合物在制备药物和/或营养组合物中的用途。

附图说明

图1示出了示例性野生型微生物细胞(例如大肠杆菌(E.coli))的示意图，其说明了导致和源自磷酸糖果糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的天然存在的代谢途径。

图2示出了本发明的示例性遗传修饰的微生物细胞的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图3示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图4示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指出了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图5示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加和细胞内果糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图6示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加和细胞内果糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图7示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加和细胞内果糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图8示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加和细胞内果糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图9示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内葡萄糖-6-磷酸可用性增加和细胞内果糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图10示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的细胞内可用性增加的遗传修饰。

图11示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸可用性增加的遗传修饰。

图12示出了本发明的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图，其中指示了导致细胞内半乳糖-1-磷酸和果糖-6-磷酸的可用性增加的遗传修饰。

图13示出了在葡萄糖(A)或由葡萄糖和果糖(B)作为唯一碳源和能源组成的混合单糖原料上培养期间大肠杆菌菌株的生长特性。

具体实施方式

根据第一方面，提供了能够产生目的碳水化合物的遗传工程化的微生物细胞。在另一个实施方案中，目的碳水化合物是遗传工程化的微生物细胞的野生型祖细胞中不天然存在的碳水化合物。

与相应野生型细胞中所述至少一种磷酸糖的细胞内可用性相比，所述微生物细胞具有增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性。所述遗传工程化的微生物细胞能够产生所述目的碳水化合物，并且当在包含作为用于微生物细胞的主要碳源和能源的混合单糖原料的培养基中培养时产生所述目的碳水化合物，其中所述混合单糖原料由葡萄糖和至少一种选自果糖和半乳糖的其他单糖组成。

遗传工程化的微生物细胞由于被遗传工程化而能够产生目的碳水化合物。因此，遗传工程化的微生物细胞表达一个或多个异源基因，其中由所述异源基因编码的多肽的活性使微生物细胞能够合成目的碳水化合物。

本文使用的术语“功能性基因”是指一种核酸分子，它包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列，它还包含可操作地连接到所述编码蛋白质的核苷酸序列的调节序列，使得编码该蛋白质或多肽的核苷酸序列可以在具有所述功能性基因的微生物细胞中/通过具有所述功能性基因的微生物细胞表达。因此，当在允许功能性基因表达的条件下培养时，所述功能性基因被表达，而表达所述功能性基因的微生物细胞通常包含由该功能性基因的蛋白质编码区编码的蛋白质或多肽。正如本文所使用的，术语“核酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，它包括天然核苷酸的已知类似物，它们以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交。除非另有说明，特定的核酸序列包括其互补序列。

本文使用的术语“可操作地连接的”应当意指核酸表达调控序列(例如启动子、信号序列或一系列转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能连接，其中表达调控序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。相应地，术语“启动子”指通常在DNA聚合物中的基因“之前”并且提供向mRNA的转录的起始位点的DNA序列。“调节子”DNA序列也通常在给定DNA聚合物中的基因的“上游”(即之前)，结合决定转录起始频率(或速率)的蛋白。这些位于功能性DNA聚合物中的所选基因(或一系列基因)之前的序列统称为“启动子/调节子”或“调控”DNA序列，它们共同合作以确定基因的转录(和最终表达)是否发生。在DNA聚合物中的基因“之后”并且提供向mRNA的转录的终止信号的DNA序列被称为转录“终止子”序列。

术语“重组”，在本文中用于细菌宿主细胞时表示所述细菌细胞复制异源核酸，或表达由异源核酸(即“对所述细胞而言是外源的”序列)编码的肽或蛋白。重组细胞可包含在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因。重组细胞还可包含在天然形式的细胞中存在的基因，其中所述基因被修饰并通过人工方式被重新引入到细胞中。该术语还涵盖了包含对细胞而言为内源的且已被修饰的核酸的细胞，而未将所述核酸从细胞移出；这类修饰包括通过基因替换、位点特异性突变以及相关技术获得的那些。因此，“重组多肽”是通过重组细胞产生的多肽。本文使用的“异源序列”或“异源核酸”是源自特定宿主细胞以外的来源(例如来自不同的物种)的核酸，或者，如果来自相同来源，则由其天然形式被修饰。因此，与启动子可操作地连接的异源核酸来自与启动子的来源不同的来源，或者，如果来自相同的来源，则由其天然形式被修饰。异源序列可被稳定地引入(例如通过转染、转化、缀合或转导)到宿主微生物细胞的基因组中，其中可应用的技术取决于待引入所述序列的宿主细胞。各种技术是本领域技术人员已知的，并且例如公开于Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)。

因此，“遗传工程化的宿主细胞”或“遗传工程化的微生物细胞”应理解为已被转化或被转染的细菌细胞或酵母细胞，或能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细菌细胞或酵母细胞。

因此，本发明中使用的核酸序列可例如被包含于载体中，所述载体将被稳定转化/转染或以其他方式被引入到宿主微生物细胞中。

多种表达系统可用于产生本发明的多肽。这类载体尤其包括染色体衍生载体、附加体衍生载体和病毒衍生载体，例如衍生自细菌质粒、衍生自噬菌体、衍生自转座子、衍生自酵母附加体、衍生自插入元件、衍生自酵母染色体元件、衍生自病毒的载体，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些。表达系统构建体可包含调控区，其调节以及引起表达。通常，任何在宿主中适于维持、增殖或表达多核苷酸和适于合成多肽的系统或载体可在这方面用于表达。通过多种公知和常规技术(例如上文Sambrook et al.中所述的那些)中的任何技术，可将适合的DNA序列插入到表达系统中。

本领域中涉及“重组DNA”方法的专利和文献出版物很多，这些方法用于分离、合成、纯化和扩增遗传物质以用于转化所选的宿主生物体。因此，使用包含所选的外源(即外源的或“异源的”)DNA序列的“杂合”病毒或环形质粒DNA来转化宿主生物体是公知常识。本领域中已知的程序首先包括通过酶切环形病毒或质粒DNA以形成线性DNA链来产生转化载体。通过使用相同/相似的酶以线性形式制备所选的外源DNA链，所述DNA链通常包含编码所需蛋白质产物的序列。线性病毒或质粒DNA与外源DNA在存在能够进行恢复过程的连接酶的情况下孵育，并形成“杂交”载体，其包含“拼接”到病毒或环形DNA质粒中的所选的外源DNA片段。

术语“编码……的核苷酸序列”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA，并且通常代表编码某一多肽或蛋白的基因的部分。该术语包括但不限于单链和双链DNA，作为单链区和双链区的混合物或单链区、双链区和三链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，作为单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子(所述DNA和RNA可以是单链或更通常是双链或三链区，或单链区和双链区的混合物)。该术语还涵盖了多核苷酸，其包含编码多肽的单个连续区或不连续区(例如，被整合的噬菌体或插入序列或编辑所中断)以及也可包含编码序列和/或非编码序列的其他区域。

本文使用的术语“变体”是指这样的多核苷酸或多肽，即其分别不同于参照多核苷酸或多肽，但是保留了参照多核苷酸或多肽的必需(酶)特性。典型的多核苷酸变体的核苷酸序列与另一参照多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短，如下文讨论的。典型的多肽变体的氨基酸序列与另一参照多肽不同。通常，差异是有限的，使得参照多肽和变体的序列在整体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参照多肽的氨基酸序列的差异可以为任意组合的一个或多个置换、添加、缺失。被置换或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或可以是已知非天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可通过诱变技术、通过直接合成和通过本领域技术人员已知的其他重组方法来制备。

在本发明的范围内，那些术语还包括核酸/多核苷酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和物种间同源物，其氨基酸序列与野生型蛋白质编码的多肽具有大于约60％的氨基酸序列同一性，65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域上。

因此，本文公开的任何基因/蛋白的“功能性变体”意欲指仍然保留与衍生出各片段的基因或蛋白相同或略低活性的基因/蛋白的序列变体。

所述遗传工程化的微生物细胞具有至少一种单糖转运蛋白，用于将至少一种单糖从培养所述微生物细胞的培养基中转运到其细胞质中。所述至少一种单糖转运蛋白转运选自葡萄糖、果糖和半乳糖的单糖。

跨细胞膜转运的单糖必须被磷酸化，以便变得可用于细胞的代谢。取决于将单糖转运跨细胞膜的单糖转运蛋白，单糖被直接磷酸化，即当被转移到细胞中时，或者随后被合适的激酶磷酸化。单糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶依赖性转运(PEP-PTS)的转运导致直接磷酸化，而单糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性转运(非PEP-PTS)的转运则需要随后通过细胞内激酶对单糖进行磷酸化。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，微生物细胞包含葡萄糖转运磷酸转移酶系统(PtsG)。葡萄糖转运磷酸转移酶系统催化进入的葡萄糖的磷酸化，并伴随其跨细胞膜的转运。

Pts系统的一般机制如下：磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的磷酰基通过信号转导途径转移到酶I(EI)，所述酶I(EI)又将其转移到磷酰基载体组氨酸蛋白(HPr)上。然后磷酸-HPr将磷酰基转移到糖特异性通透酶——一种称为酶2(EII)的膜结合复合物，其将糖转运到细胞。EII由至少三个结构上不同的结构域IIA、IIB和IIC组成。它们可以在单条多肽链中融合在一起，或作为两条或三条相互作用的链存在，以前称为酶II(EII)和III(EIII)。

第一结构域(IIA或EIIA)携带第一通透酶特异性磷酸化位点——由磷酸-HPr磷酸化的组氨酸。第二结构域(IIB或EIIB)由磷酸-IIA在半胱氨酰或组氨酰残基上磷酸化，这取决于所转运的糖。最后，磷酰基从IIB结构域转移到糖底物，伴随着IIC结构域处理的糖摄取。该第三结构域(IIC或EIIC)形成转运通道和特异性底物结合位点。

因此，PtsG系统获得外源葡萄糖，并在微生物细胞中提供葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸可用于UDP-半乳糖生物合成途径和/或转化为果糖-6-磷酸，而果糖-6-磷酸又可用于在中心代谢中和/或例如在核苷酸活化糖(如GDP-岩藻糖)的生物合成中产生高能三磷酸(energy-rich triphosphate)。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含果糖转运蛋白，其用于将果糖(Fru)从培养基中转运到微生物细胞的细胞质中。一种用于摄取游离果糖的合适的果糖转运蛋白为如Kornberg et al.PNAS 97:1808-1812(2000)描述的同种型(PtsG-F)。

然后内化的果糖可被果糖激酶(FrK)磷酸化，以提供果糖-6-磷酸(Fru-6-P)。果糖-6-磷酸可用于UDP-半乳糖生物合成途径和/或其他代谢途径，如在中心代谢中和/或例如在核苷酸活化糖(如GDP-岩藻糖)的生物合成中产生高能三磷酸。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含果糖转运磷酸转移酶系统(PtsF)。果糖转运磷酸转移酶系统催化进入的果糖的磷酸化，伴随其跨细胞膜的转运。

因此，PtsF系统获得外源果糖，并在微生物细胞中提供果糖-1-磷酸。PtsF系统包含跨膜蛋白FruA、1-磷酸果糖激酶(FruK)和二磷酰基转移蛋白FruB。通过FruA和FruB转运果糖，以在细胞质中提供果糖-1-磷酸。果糖-1-磷酸可被磷酸果糖激酶(FruK)进一步磷酸化，以产生果糖-1,6-二磷酸，而果糖-1,6-二磷酸又可被微生物细胞用于在中心代谢中产生高能三磷酸。

另一个合适的PtsF系统包含LevD、LevE、LevF和LevG。LevD为果糖特异性磷酸转移酶IIA组分。LevE为果糖特异性磷酸转移酶IIB组分。LevF为果糖通透酶IIC组分，LevG为果糖通透酶IID组分。已知对应的基因levD、levE、levF和levG例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(菌株168)。所述PtsF系统在细胞中提供果糖-1-磷酸。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有UDP-半乳糖生物合成途径，用于细胞内UDP-半乳糖(UDP-Gal)的形成。需要UDP-半乳糖作为半乳糖基转移酶的底物，其中所述半乳糖基转移酶的活性可导致半乳糖基化二糖或半乳糖基化寡糖的形成。

UDP-半乳糖可以由微生物细胞的天然存在的代谢提供，即通过催化葡萄糖1-磷酸和葡萄糖6-磷酸的相互转化的磷酸葡萄糖变位酶，催化来自葡萄糖-1-磷酸和UTP的UDP-葡萄糖的形成的UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰转移酶，以及催化UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆转化的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的活性。

UDP-半乳糖的细胞内供应可以通过遗传工程化来改善，即在微生物细胞中过表达一个或多个编码磷酸葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰转移酶、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因及其功能性变体，和/或表达一个或多个编码磷酸葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰转移酶、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因及其功能性变体的一个或多个基因的一个或多个额外拷贝。编码磷酸葡萄糖变位酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的pgm基因(登录号NP_415214)，编码UDP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰转移酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌galU基因(登录号NP_415752)，编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌galE基因(NP_415280)。

本文使用的术语“过表达”或“过表达的”是指酶或多肽表达的水平高于在野生型祖细胞中测量的水平，所述野生型祖细胞即为与遗传工程化的微生物细胞相同物种的细胞，且所述细胞未被遗传工程化。

额外地和/或替代地，细胞内UDP-半乳糖的供应可以通过经由培养所述微生物细胞的培养基向所述微生物细胞供给半乳糖来实现或改善。外源提供的半乳糖被微生物细胞摄取，随后磷酸化为半乳糖-1-磷酸，再转化为UDP-半乳糖。在该GDP-半乳糖生物合成途径中，编码具有所需酶活性的酶的基因在文献(Groissoird et al.,“Characterization,Expression,and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes,Involved inGalactose Utilization via the Leloir Pathway(2003)J.Bacteriol.185(3)870-878)中已知。galP基因(登录号NP_417418)编码半乳糖-质子同向转运体(symporter)。galM基因(登录号NP_415277)编码醛缩酶1-差向异构酶，galK基因(登录号NP_415278)编码半乳糖激酶，galT基因(登录号NP_415279)编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，galE基因编码UDP-半乳糖-4-差向异构酶。

因此，UDP-半乳糖生物合成也可以通过在微生物细胞中表达编码半乳糖-质子同向转运体、半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因来提供，或通过在微生物细胞中过表达编码半乳糖-质子同向转运体、半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因来改善。

在另一个实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有用于细胞内形成GDP-L-岩藻糖(GDP-Fuc)的GDP-岩藻糖生物合成途径。GDP-Fuc是岩藻糖基转移酶的底物，岩藻糖基转移酶的酶活性可导致岩藻糖基化二糖或岩藻糖基化寡糖的形成。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有GDP-L-岩藻糖生物合成途径，所述途径包含甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合酶。

GDP-L-岩藻糖的细胞内供应可以通过遗传工程化来改善，即在微生物细胞中过表达一个或多个编码甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶或GDP-L-岩藻糖合酶的基因，和/或在微生物细胞中表达一个或多个编码甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合酶的基因或其功能性变体的额外拷贝。编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌manA基因(登录号NP_416130)，编码磷酸甘露糖变位酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌manB基因(登录号NP_416552)，编码甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌manC基因(登录号NP_416553)，编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌gmd基因(登录号NP_416557)，编码GDP-L-岩藻糖合酶的基因的实例是在大肠杆菌K-12中发现的大肠杆菌wcaG基因(登录号NP_416556)。

额外地和/或替代地，GDP-L-岩藻糖的供应可以通过经由培养所述微生物细胞的培养基向所述微生物细胞供给L-岩藻糖来实现或改善。外源提供的L-岩藻糖被微生物细胞摄取，并首先被酶岩藻糖激酶磷酸化为岩藻糖-1-磷酸。随后通过酶岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶的酶活性将岩藻糖-1-磷酸转化为GDP-L-岩藻糖。编码具有所需酶活性的酶的基因是本领域技术人员已知的。示例性地，可在遗传工程化的宿主细胞中过表达fkp基因(登录号WP_010993080)，其编码脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的双功能L-岩藻糖激酶/L-岩藻糖1-磷酸鸟苷酸转移酶。

在另一个实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成途径，用于细胞内UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GIcNAc)的形成，这是N-乙酰葡糖胺基转移酶反应导致例如N-乙酰葡糖胺基化二糖或寡糖的形成所需的。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成途径，例如包括L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡糖胺变位酶和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶。

UDP-N-乙酰葡糖胺的细胞内供应可以通过遗传修饰来改善，例如表达或过表达一个或多个编码表现出以下酶活性的多肽的基因或其变体：L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性(例如大肠杆菌K-12glmS基因(登录号NP_418185)))、磷酸葡糖胺变位酶活性(例如大肠杆菌K-12glmM基因(登录号NP_417643))和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶(例如大肠杆菌K-12glmU基因(登录号NP_418186))。

在另一个实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有CMP-N-乙酰神经氨酸/CMP-唾液酸生物合成途径，用于细胞内形成CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，这是唾液酸转移酶反应导致例如唾液酸化二糖或寡糖的形成所需的。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有CMP-N-乙酰神经氨酸生物合成途径，例如包括L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡糖胺变位酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸磷酸酶(优选HAD样糖磷酸酶)、N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶、唾液酸合酶和CMP-唾液酸合酶。

CMP-N-乙酰神经氨酸的细胞内供应可以通过遗传修饰来改善，所述遗传修饰为例如表达或过表达一个或多个编码表现出以下酶活性的多肽的基因或其变体：L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(例如大肠杆菌K-12glmS基因)、磷酸葡糖胺变位酶活性(例如大肠杆菌K-12glmM基因)、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶(例如大肠杆菌K-12glmU基因)、UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)neuC基因(登录号AF305571))、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)gna1基因(登录号NP_116637))、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸磷酸酶(例如大肠杆菌K-12yihX基因(登录号NP_418321))、N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶(例如集胞藻属种(Synechocystis sp.)PCC6803 slr1975基因(登录号BAL35720))、唾液酸合酶(例如空肠弯曲杆菌neuB基因(登录号AF305571))和CMP-唾液酸合酶(例如空肠弯曲杆菌neuA基因(登录号AF305571))。

遗传工程化的微生物细胞还可以包含糖基转移酶。在一个优选的实施方案中，至少一种糖基转移酶是岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、葡糖胺基转移酶或半乳糖基转移酶，更优选地，所述至少一种糖基转移酶表现出β-1,3-半乳糖基转移酶活性、β-1,4-半乳糖基转移酶活性、β-1,6-半乳糖基转移酶活性、β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶活性、α-2,3-唾液酸转移酶活性、α-2,6-唾液酸转移酶活性、α-1,2-岩藻糖基转移酶活性、α-1,3-岩藻糖基转移酶活性、α-1,4-岩藻糖基转移酶活性。技术人员已知或可在文献中找到合适的糖基转移酶。

一般而言，在整个本公开内容中，术语“糖基转移酶活性”或“糖基转移酶”表示并涵盖负责二糖、寡糖和多糖的生物合成的酶，并且它们催化单糖部分从活化的核苷酸单糖/糖(例如UDP-Glc、UDP-Gal、GDP-Fuc、UDP-GlcNAc、CMP-Neu5Ac)转移到糖基受体分子(例如单糖、二糖或寡糖)。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞比野生型细胞合成更多的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞已被遗传工程化以具有增强的PEP生物合成途径。例如，遗传工程化的微生物细胞已被遗传工程化以具有增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性，例如通过过表达大肠杆菌K-12pckA基因(登录号NP_417862)或其功能性变体。优选地，遗传工程化的宿主细胞已被遗传工程化以具有增加的磷酸烯醇丙酮酸合酶活性，例如因为编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的大肠杆菌K-12ppsA基因(登录号NP_416217)被过表达和/或非天然存在的微生物含有至少一个使磷酸烯醇丙酮酸合酶表达的核苷酸序列或其功能性变体的额外拷贝。pckA或ppsA的过表达增强了细胞内的PEP合成，从而获得更多的PEP，例如用于产生唾液酸。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，可以通过降低和/或减少磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶依赖性输入蛋白的活性来改善遗传工程化的宿主细胞的细胞内PEP-可用性，这是将用作碳源和能源的特定糖(例如葡萄糖)从培养基转移到细胞中所需的。因此，为了保持遗传工程化的宿主细胞使用作为碳源和能源的所述某些糖的能力，需要表达或过表达磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性输入蛋白。在一个额外的和/或替代的实施方案中，需要或降低和/或减少能够磷酸化所述某些糖的激酶的表达或过表达，以分别实现所述糖的代谢或其在细胞内以未磷酸化形式的积累。

磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶依赖性输入蛋白或其组分——其表达和/或活性可能在遗传工程化的微生物细胞(例如大肠杆菌K-12)中降低和/或减少——包含选自以下的至少一个：葡萄糖PEP-PTS基因ptsG(登录号NP_415619)、malX(登录号NP_416138)、crr(登录号NP_416912)、bglF(登录号NP_418178)和/或果糖PEP-PTS基因fruA(登录号NP_416672)、fruB(登录号NP_416674)和/或甘露糖PEP-PTS基因manX(登录号NP_416331)、many(登录号NP_416332)、manZ(登录号NP_416333)和/或N-乙酰葡糖胺PEP-PTS基因nagE(登录号NP_415205)。

技术人员已知合适的能够将单糖(葡萄糖和/或果糖和/或半乳糖和/或N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰神经氨酸和/或岩藻糖)转移到微生物细胞中的非PEP-PTS转运蛋白或其变体。编码所述非PEP-PTS转运蛋白的基因的非限制性实例是大肠杆菌K-12的galP(SEQ IDNO.1)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的glf(SEQ ID NO.2)、大肠杆菌W的cscB(SEQID NO.3)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)的fupL(SEQ ID NO.4)、大肠杆菌K-12的lacY(SEQ ID NO.5)、大肠杆菌K-12的fucP(SEQ ID NO.6)、大肠杆菌K-12的nanT(SEQ ID NO.7)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的nagP(SEQ IDNO.8)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NCC2705的glcP(SEQ ID NO.9)、枯草芽孢杆菌的glcP(SEQ ID NO.10)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的sglS(SEQ IDNO.11)、大肠杆菌K-12的xylE(SEQ ID NO.12)、枯草芽孢杆菌168的araE(SEQ ID NO.13)。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的宿主细胞包含并表达至少一个基因，所述基因包含上述基因或其功能性变体的蛋白编码区。

在一个优选的实施方案中，合适的非PEP-PTS-葡萄糖转运蛋白是糖促进扩散蛋白和/或葡萄糖转运通透酶。合适的葡萄糖促进融合蛋白由运动发酵单胞菌的glf基因编码。合适的葡萄糖转运通透酶由大肠杆菌K-12galP基因编码。葡萄糖转运通透酶也被称为半乳糖-质子同向转运体或半乳糖通透酶，但也跨细胞膜输入葡萄糖。

在另一个优选的实施方案中，合适的非PEP-PTS-果糖转运蛋白是糖促进扩散蛋白和/或果糖载体蛋白。合适的果糖促进融合蛋白由运动发酵单胞菌的glf基因编码。合适的果糖载体蛋白由假肠膜明串珠菌fupL基因编码。

一般而言，在整个本公开内容中，术语“增加的磷酸糖的细胞内可用性”或“增加的/提高的磷酸糖的供应”是指与未修饰的微生物细胞相比，遗传修饰的微生物细胞产生提高的所述磷酸糖的细胞内量的能力增强，使得通过所需碳水化合物的生物合成途径的碳通量提高。因此，由所述遗传修饰的微生物细胞产生的所述所需碳水化合物的增加是所述磷酸糖的细胞内量增加的直接量度。此外，靶向细胞内代谢物定量和/或细胞碳通量的方法可以在技术人员已知的文献中找到(例如

and Weckwerth,“Metabolomicsin Practice:Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data”,Wiley-VCH,Weinheim,Germany(2013)。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，可在遗传工程化的宿主细胞内降低和/或减少分别与所需碳水化合物的生物合成竞争的基因和/或蛋白的表达和/或活性。这种抵消多种蛋白质/一种蛋白质活性的非限制性实例包括选自以下的至少一种：β-半乳糖苷酶(例如大肠杆菌K-12LacZ(登录号NP_414878))、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶(例如大肠杆菌K-12WcaJ(登录号NP_416551))、L-岩藻糖异构酶(例如大肠杆菌K-12Fucl)、墨角藻糖激酶(例如大肠杆菌K-12FucK(登录号NP_417282))、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶(例如大肠杆菌K-12NagA(登录号NP_415203))、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(例如大肠杆菌K-12NagB(登录号NP_415204))、N-乙酰甘露糖胺激酶(例如大肠杆菌K-12NanK(登录号NP_417689))、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶(例如大肠杆菌K-12NanE(登录号NP_417690))、N-乙酰神经氨酸醛缩酶(例如大肠杆菌K-12NanA(登录号NP_417692))、唾液酸通透酶(例如大肠杆菌K-12NanT(登录号NP_417691))。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞能够代谢蔗糖，因此，其包含一个或多个编码以下的基因：

(i)异源PTS依赖性蔗糖利用转运系统(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)scrYAB基因(SEQ ID NO.14)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)scrYAB基因(SEQ ID NO.15))，其由蔗糖孔蛋白(scrY)、PTS蔗糖特异性转运蛋白亚基II(scrA)和蔗糖-6-磷酸水解酶(scrB)组成，和/或(ii)异源PTS依赖性蔗糖转运系统(例如肺炎克雷伯氏菌scrYA基因或鼠伤寒沙门氏菌scrYA基因)结合蔗磷酸糖合酶基因(例如鱼腥藻属种(Anabaena sp.)PCC7120 spsA基因)(登录号AJ302071))，和/或(iii)异源PTS非依赖性蔗糖利用系统(例如大肠杆菌W cscBKA基因(SEQ ID NO.16))，其由果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)和蔗糖通透酶(cscB)组成，和/或(iv)异源蔗糖利用系统，其由蔗糖通透酶基因(例如大肠杆菌W cscB)结合蔗糖磷酸化酶基因(例如青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)basP基因(登录号WP_011742626))或蔗糖合酶基因(例如鱼腥藻属种susA基因(登录号CAA09297))组成。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，微生物细胞包含从细胞输出目的碳水化合物的输出蛋白或通透酶，优选糖外排转运蛋白。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，宿主细胞是微生物细胞，优选选自以下细菌属的细菌细胞：埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和梭菌属(Clostidium)，优选选自以下细菌种的细菌细胞：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、解纤维素梭菌(Clotridium cellulolyticum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。在另一个实施方案中，微生物细胞为大肠杆菌。本领域技术人员在阅读本公开内容时将认识到其他细菌菌株。

根据第二方面，本发明提供了如本文所述的遗传工程化的宿主细胞用于生产所需碳水化合物的用途，其中所述宿主细胞是在由葡萄糖以及果糖和半乳糖的至少一种第二单糖组成的单糖混合物存在下培养的。所述细胞经遗传工程化以显示增加的与所需碳水化合物的产生相关的至少一种磷酸糖的细胞内可用性。所述磷酸糖可选自磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、磷酸二羟丙酮、果糖-6-磷酸、果糖-1-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸、甘露糖-1-磷酸、甘露糖-6-磷酸、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、CMP-N-乙酰神经氨酸、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖和UDP-N-乙酰葡糖胺。

根据第三方面，本发明提供了一种发酵生产所需碳水化合物的方法，其包括以下步骤:

a)提供能够产生所需碳水化合物的遗传工程化的微生物，其中由于降低的和/或减少的至少一种导致消耗所述工程化的微生物内所述细胞内磷酸糖的蛋白质的表达和/或活性，所述微生物表现出增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性；

b)在允许产生所述所需碳水化合物的培养基中培养所述遗传工程化的微生物，其中所述主要碳源是由葡萄糖以及果糖和半乳糖的至少一种第二单糖组成的单糖混合物；

c)从培养液中回收所述所需糖。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，目的碳水化合物是人乳寡糖或其组成部分(building block)。表1中公开了可通过使用本文所述的遗传修饰的微生物细胞和/或方法产生的目的碳水化合物的列表。优选地，所需碳水合物选自2’-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖，2’,3-二岩藻糖基乳糖，3’-唾液酸乳糖，6’-唾液酸乳糖，3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳-N-岩藻戊糖I，乳-N-岩藻戊糖II，乳-N-岩藻戊糖III，乳-N-岩藻戊糖V，乳-N-二岩藻糖基己糖I，乳-N-二岩藻糖基己糖II，乳-N-唾液酸戊糖LSTa、LSTb、LSTc。

优选地，葡萄糖和至少一种其他单糖的混合物是葡萄糖和果糖的混合原料，优选通过水解蔗糖获得。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，蔗糖水解是不完全的，使得大量的蔗糖保留在原料中。因此，水解和/或热灭菌原料中的蔗糖量大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或大于80％。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，在没有外源供应受体底物，例如N-乙酰葡糖胺或乳糖的情况下培养微生物细胞，特别是当培养微生物细胞用于产生目的寡糖时。

将用具体实施方案和附图来描述本发明，但本发明不限于此，而仅通过权利要求来限定。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二等用于区分相似要素，而并不必然用于在时间上、空间上、以排序方式或以任何其他方式描述顺序。应该理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或举例说明的顺序的其他顺序操作。

应当注意的是，权利要求中使用的术语“包括”不应被解释为限于其后列出的方式；它不排除其他要素或步骤。因此，它被解释为指明所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或组分，或其群组。因此，表述“包括装置A和B的设备”的范围不应限于仅由组件A和B组成的设备。这意味着，就本发明而言，该装置仅有的相关组件是A和B。

在本说明书通篇中，提及“一个(one)实施方案”或“一个(an)实施方案”是指在本发明的至少一个实施方案中包括就实施方案描述的特定的特性、结构或特征。因此，在本说明书通篇中各处出现的短语“在一个(one)实施方案中”或“在一个(an)实施方案中”并不必然都是指同一实施方案，而是可能是指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何适当的方式组合特定的特性、结构或特征，基于本公开内容，这对于本领域术人员的来说是显而易见的。

类似地，应当意识到，在本发明的示例性实施方案的描述中，为了简化本公开内容并有助于理解本发明的一个或多个方面，本发明的各种特征有时在单个实施方案、其图或描述中被分组在一起。然而，这种公开方法不应被解释为反映了所要求保护的发明需要比在每个权利要求中明确记载的特征更多的特征的意图。相反，正如以下权利要求所反映的，本发明的方面在于少于单个前述公开实施方案的所有特征。因此，在具体的说明书之后的权利要求被明确地纳入所述具体的说明书中，每一项权利要求本身作为本发明的单独的实施方案。

此外，虽然本文描述的一些实施方案包括其他实施方案中包括的一些特征但不包括其他特征，但不同实施方案的特征的组合在本发明的范围内，并形成不同的实施方案，正如本领域技术人员所理解的那样。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方案都可以以任何组合使用。

此外，本文将一些实施方案描述为可以由计算机系统的处理器或通过执行该功能的其他手段来实现的方法或方法要素的组合。因此，具有执行这种方法或方法要素的必要指令的处理器构成用于执行所述方法或方法要素的手段。此外，本文描述的装置实施方案的元件是为了实施本发明，用于执行由所述元件行使的功能的手段的实例。

在本文提供的说明书和附图中，列出了许多具体的细节。然而应理解，本发明的实施方案可以在没有这些具体细节的情况下实施。在其他情况下，公知的方法、结构和技术未被详细地示出，以避免混淆对本说明书的理解。

表1：可通过使用本文所述的遗传修饰的微生物细胞和/或方法产生的目的碳水化合物的非限制性列表。

现在将通过对本发明的几个实施方案的具体说明来描述本发明。显然，在不偏离本发明的真正主旨或技术教导的情况下，可以根据本领域技术人员的知识来设置本发明的其他实施方案，本发明仅受所附的权利要求的术语限制。

在一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源，将具有基因型nagABE^-、manXYZ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的有效生产者。因此，异源表达编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的基因是必要的，该基因能够将乙酸根从乙酰CoA转移到葡糖胺-6-磷酸，从而产生N-乙酰葡糖胺-6-磷酸。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢但增加前体供应(果糖-6-磷酸)用于N-乙酰葡糖胺生产。在一个额外的实施方案中，表达/过表达编码谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(例如大肠杆菌GlmS)的基因和/或编码能够将N-乙酰葡糖胺-6-磷酸去磷酸化为N-乙酰葡糖胺的HAD样糖磷酸酶(例如大肠杆菌YihX、大肠杆菌YqaB)的基因，以促进GlcNAc的合成。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要的碳源和能源以及乳糖作为受体底物，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、fuclK^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为L-岩藻糖的有效生产者。因此，过表达大肠杆菌基因manA、manC、manB、gmd和wcaG中的至少一个，以及表达异源α-1,2-岩藻糖基转移酶(能够将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至乳糖，从而产生2’-岩藻糖基乳糖)和α-1,2-岩藻糖苷酶(能够从2’-岩藻糖基乳糖释放游离L-岩藻糖)是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的表达，进一步工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(果糖-6-磷酸)用于L-岩藻糖生产。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要的碳源和能源，将具有基因型nanKETA^-、nagAB^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的有效生产者。因此，过表达至少一个编码(i)葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶和N-乙酰葡糖胺-2差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶，或(ii)UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶的基因是必要的。由于N-乙酰神经氨酸的合成是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依赖性方法，因此优选避免导致PEP消耗的竞争性反应。因此，在一个优选的实施方案中，通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶依赖性机制通过降低和/或减少所述碳源和能源的输入进一步工程化该生产菌株，例如通过降低和/或减少葡萄糖PEP通透酶基因ptsG和/或果糖PEP通透酶基因fruA和/或甘露糖PEP通透酶基因manXYZ的表达。随着表达/过表达至少一个编码磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白(使单糖能够转移到工程化细胞中)，以及果糖激酶(如大肠杆菌W cscK基因)和葡萄糖激酶(如大肠杆菌K-12glk基因)(能够分别将果糖活化为果糖-6-磷酸和将葡萄糖活化为葡萄糖-6-磷酸)的基因，该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢但增加前体供应(果糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸)用于N-乙酰神经氨酸生产。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要的碳源和能源，以及GlcNAc作为受体底物，将具有基因型nagABE^-、manXYZ^-、lacZ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为N-乙酰乳糖胺(LacNAc)的有效生产者。因此，表达/过表达编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶、磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性转运蛋白(能够将N-乙酰葡糖胺转移到细胞中)和β-1,4-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-Gal转移到游离N-乙酰葡糖胺，从而产生N-乙酰乳糖胺)的基因是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(葡萄糖-6-磷酸)用于N-乙酰乳糖胺生产。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因pgm、galU和galE中的至少一个以促进UDP-Gal的合成。

在另一个实施方案中，通过使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源的全发酵，将具有基因型nagAB^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为乳-N-二糖(LNB)的有效生产者。因此，表达/过表达编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(能够将乙酸根从乙酰-CoA转移到葡糖胺-6-磷酸，从而产生N-乙酰葡糖胺-6-磷酸)、HAD样糖磷酸酶(能够去磷酸化N-乙酰葡糖胺-6-磷酸，从而产生N-乙酰葡糖胺)和β-1,3-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-Gal转移到游离N-乙酰葡糖胺，从而产生乳-N-二糖)的基因是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要的碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸)用于乳-N-二糖生产。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因glmS、pgm、galU、galE中的至少一个以促进GlcNAc和/或UDP-Gal的合成。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源以及乳糖作为受体底物，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、nanKETA^-、nagAB^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为3’-唾液酸乳糖的有效生产者。因此，通过表达异源CMP-N-乙酰神经氨酸合酶、N-乙酰神经氨酸合酶和α-2,3-唾液酸转移酶(能够将N-乙酰神经氨酸从CMP-Neu5Ac转移至乳糖，从而产生3’-唾液酸乳糖)，对所述N-乙酰神经氨酸生产菌株遗传工程化。至于N-乙酰神经氨酸的合成，3’-SL的产生是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依赖性方法。因此，在一个优选的实施方案中，通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶依赖性机制通过降低和/或减少所述碳源和能源的输入进一步工程化所述3’-SL生产菌株，例如通过降低和/或减少葡萄糖PEP通透酶基因ptsG和/或果糖PEP通透酶基因fruA和/或甘露糖PEP通透酶基因manXYZ的表达。随着表达/过表达至少一个编码磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白(使得单糖能够转移到工程化细胞中)以及果糖激酶(例如大肠杆菌W cscK基因)和葡萄糖激酶(例如大肠杆菌K-12glk基因)(能够分别活化果糖为果糖-6-磷酸和活化葡萄糖为葡萄糖-6-磷酸)的基因，该进一步的遗传修饰允许在作为主要的碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(果糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸)用于3’-唾液酸乳糖生产。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源以及乳糖作为受体底物，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、fuclK^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为3-岩藻糖基乳糖的有效生产者。因此，过表达大肠杆菌基因manA、manC、manB、gmd和wcaG中的至少一个，以及表达异源α-1,3-岩藻糖基转移酶(能够将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到乳糖，从而产生3-岩藻糖基乳糖)是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要的碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢但增加前体供应(果糖-6-磷酸)用于3-岩藻糖基乳糖生产。

在一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源以及乳糖作为受体底物，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、nagB^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化，以有效地生产乳-N-三糖II(LNT-II)。因此，表达异源β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶(能够将N-乙酰葡糖胺从UDP-GlcNAc转移至乳糖，从而生成乳-N-三糖II)是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要的碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(果糖-6-磷酸)用于乳-N-三糖II生产。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因glmS、glmU和glmM中的至少一个以促进UDP-GlcNAc合成。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源以及乳糖作为受体底物，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、nagB^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为乳-N-四糖(LNT)的有效生产者。因此，表达异源β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶(能够将N-乙酰葡糖胺从UDP-GlcNAc转移至乳糖)和β-1,3-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-半乳糖转移至乳-N-三糖II，从而生成乳-N-四糖)是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸)用于乳-N-四糖生产。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因glmS、glmU、glmM、pgm、galU和galE中的至少一个，以促进UDP-GlcNAc和/或UDP-Gal的合成。

在另一个实施方案中，通过使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源的全发酵，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、nagB^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化，以有效地生产乳-N-新四糖(LNnT)。因此，通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶依赖性机制通过降低和/或减少葡萄糖的输入遗传工程化该LNnT生产菌株，例如通过降低和/或减少葡萄糖PEP通透酶基因ptsG的表达，同时表达至少一个编码磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白，使葡萄糖能够转移到工程化细胞中的基因。此外，降低和/或消除葡萄糖激酶基因glk和/或葡萄糖脱氢酶基因gcd的表达。本质上，异源表达β-1,4-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-半乳糖转移到葡萄糖上，从而产生乳糖)、β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶(能够将N-乙酰葡糖胺从UDP-GlcNAc转移到乳糖，从而产生乳-N-三糖II)以及β-1,4-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-半乳糖转移到乳-N-三糖II，从而产生乳-N-新四糖)是必要的。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的表达来进一步工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(葡萄糖和果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸)以通过全发酵生产乳-N-新四糖。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因glmS、glmU、glmM、pgm、galU和galE中的至少一个以促进UDP-GlcNAc和/或UDP-Gal的合成。

在另一个实施方案中，通过使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要的碳源和能源的全发酵，将具有基因型lacY^-、lacZ^-、fuclK^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化，以有效地生产2'-岩藻糖基乳糖。因此，降低和/或消除葡萄糖激酶基因glk和/或葡萄糖脱氢酶基因gcd的表达以及磷酸烯醇丙酮酸:葡萄糖磷酸转移酶依赖机制的活性。此外，在所述大肠杆菌菌株中表达或过表达磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白基因。此外，表达/过表达大肠杆菌基因manA、manC、manB、gmd、wcaG、pgm、galU和galE中的至少一个以及异源β-1,4-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-半乳糖转移到葡萄糖上，从而产生乳糖)和α-1,2-岩藻糖基转移酶(能够将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到乳糖上，从而产生2’-岩藻糖乳糖)。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的表达来进一步工程化该生产菌株。该进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍该菌株的代谢，但增加前体供应(葡萄糖和果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸)，用于通过全发酵生产2’-岩藻糖基乳糖。

在另一个实施方案中，使用混合单糖原料(例如水解蔗糖)作为主要碳源和能源以及乳糖作为受体底物，将具有基因型lacY⁺、lacZ^-、fuclK^-、wcaJ^-、manA^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为2’3-二岩藻糖基乳糖的有效生产者。因此，降低和/或消除表现出果糖激酶活性的基因(例如大肠杆菌K-12mak基因)的表达和磷酸烯醇丙酮酸:果糖磷酸转移酶依赖性机制的活性。通过表达/过表达至少一个编码磷酸烯醇丙酮酸:果糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白(能够将果糖转移到工程化细胞中)、甘露糖异构酶(能够将果糖转化为甘露糖)(例如大肠杆菌BL21 yihS、放射性土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)M-1manI)、甘露糖激酶(例如布氏普雷沃氏菌(Prevotella bryantii)B₁4 manK、节杆菌属种(Arthrobacter sp.)菌株KM manK)(能够将甘露糖活化为甘露糖-6-磷酸)，以及至少一种表现出α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的异源岩藻糖基转移酶(能够将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至乳糖和/或2’-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖，从而产生2’3-二岩藻糖基乳糖)的基因进一步遗传工程化该细胞。这些进一步的遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(甘露糖/甘露糖-6-磷酸)用于2’3-二岩藻糖基乳糖生产。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因manC、manB、gmd和wcaG中的至少一个，以促进GDP-Fuc的合成。

表现出甘露糖异构酶(ManI)活性或甘露糖激酶(ManK)活性的合适蛋白质的非限制性实例可在文献中找到(Hirose et al.,Biosci Biotechnol Biochem.2001Mar；65(3):658-61.；Hirose et al.,Biotechnol Lett.2003Feb；25(4):349-52.；Patel et al.,ApplEnviron Microbiol.2011May；77(10):3343-50.；Hu et al.,Int J BiolMacromol.2016Aug；89:328-35.；Huang et al.,Appl Microbiol Biotechnol.2018Mar；102(5):2051-2062.；Mukai et al.,Appl Environ Microbiol.2003Jul；69(7):3849-57.；Fields and Russel,Microbiology.2001Apr；147(Pt 4):1035-43.；Kroschewski et al.,Mol Biochem Parasitol.2000Jan 5；105(1):71-80.)。

在另一个实施方案中，通过使用混合单糖原料(例如水解蔗糖和水解乳糖的混合物)作为主要碳源和能源的全发酵，将具有基因型nagAB^-、fuclK^-、wcaJ^-的大肠杆菌菌株代谢工程化为H抗原I型(HA-T I)的有效生产者。因此，通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶通过依赖性机制降低和/或减少葡萄糖的输入，同时表达/过表达至少一个编码非PEP-PTS转运蛋白以及单糖激酶(使葡萄糖和/或半乳糖能够转移到工程化细胞中以及分别将这些单糖活化成磷酸化形式)的基因遗传工程化该生产菌株。此外，表达/过表达至少一个编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(能够将乙酸根从乙酰CoA转移至葡糖胺-6-磷酸，从而产生N-乙酰葡糖胺-6-磷酸)、HAD样糖磷酸酶(能够将N-乙酰葡糖胺-6-磷酸去磷酸化，从而产生N-乙酰葡糖胺)、异源β-1,3-半乳糖基转移酶(能够将半乳糖从UDP-半乳糖转移至N-乙酰葡糖胺上，从而产生乳-N-二糖)和α-1,2-岩藻糖基转移酶(能够将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至乳-N-二糖，从而产生H抗原I型)的基因。在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB的表达，进一步遗传工程化该生产菌株。这些遗传修饰允许在作为主要碳源和能源的混合单糖原料(如水解蔗糖和水解乳糖的混合物)上培养工程化的生产菌株，同时防止妨碍菌株的代谢，但增加前体供应(N-乙酰葡糖胺、果糖-6-磷酸和半乳糖-1-磷酸)用于H抗原I型生产。在一个额外的实施方案中，过表达大肠杆菌基因glmS、galT、galE、manC、manB、gmd和wcaG中的至少一个，以促进GlcNAc和/或UDP-Gal和/或GDP-Fuc的合成。

参照图1，示意性地示出了示例性天然微生物细胞。所述微生物细胞能够消耗由葡萄糖和果糖组成的混合原料，生成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的微小细胞内池。微生物细胞表达编码用于将葡萄糖和果糖输入细胞的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)的多核苷酸。反应产物主要进入糖酵解。

图2示意性地示出了本发明的示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够高度供应葡萄糖-6-磷酸。由于已通过缺失、功能性失活或沉默pgi和/或zwf基因降低或减少葡萄糖-6-磷酸异构酶Pgi和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf的表达，因此微生物细胞可利用通过将葡萄糖输入细胞而产生的任何葡萄糖-6-磷酸来产生UDP-Glc和/或UDP-Gal。在微生物细胞的变体中(图3)，细胞的用于果糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被禁用，例如通过缺失fruA基因。相反，果糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白进入细胞，被果糖激酶(例如大肠杆菌WCscK)活化为果糖-6-磷酸。在微生物细胞的变体中(图4)，细胞的用于葡萄糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统也已被禁用，例如通过缺失ptsG基因。相反，葡萄糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白进入细胞，被葡萄糖激酶(如大肠杆菌K-12Glk)活化为葡萄糖-6-磷酸。

图5示意性地示出了本发明的示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够以更高程度供应葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。细胞的用于果糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被禁用，例如通过缺失fruA基因。相反，果糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白进入细胞，被果糖激酶(如大肠杆菌W CscK)活化为果糖-6-磷酸。在微生物细胞的变体中(图6)，已通过缺失、功能性失活或沉默pfkA和/或pfkB和/或zwf基因降低或减少磷酸果糖激酶Pfk和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf的表达，从而增加了葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的可用性，其可被微生物细胞利用产生UDP-Gal和/或GDP-Fuc和/或UDP-GlcNAc和/或CMP-Neu5Ac。在微生物细胞的变体中(图7)，细胞表达用于将葡萄糖和果糖输入细胞的编码磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)的多核苷酸。已通过缺失、功能性失活或沉默pfkA和/或pfkB和/或zwf基因降低或减少磷酸果糖激酶Pfk和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf的表达，从而增加了葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的可用性。

图8示意性地示出了本发明的示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够以更高程度供应葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。细胞表达编码用于将葡萄糖和果糖输入细胞的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)的多核苷酸。已通过缺失、功能性失活或沉默pfkA和/或pfkB和/或pgi和/或zwf基因降低或减少磷酸果糖激酶Pfk和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶Pgi和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf的表达。随着果糖-1,6-二磷酸酶(如glpX、fbp)的过表达，产生了增加的葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的可用性，并可被微生物细胞利用以产生UDP-Gal和/或GDP-Fuc和/或UDP-GlcNAc和/或CMP-Neu5Ac。

图9示意性地示出了本发明的示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够产生高的葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸以及磷酸烯醇丙酮酸的可用性。细胞的用于葡萄糖和果糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被禁用，例如通过分别缺失ptsG和fruA基因。相反，果糖和葡萄糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白进入细胞，被果糖激酶(如大肠杆菌W CscK)和葡萄糖激酶(如大肠杆菌K-12Glk)活化，分别形成果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸。此外，避免磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统的PEP消耗。随着通过缺失、功能性失活或沉默pfkA和/或pfkB和/或zwf基因实现的磷酸果糖激酶Pfk和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf表达的降低和/或减少，实现了增加的葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸以及磷烯醇丙酮酸的可用性。这可被微生物细胞利用以产生UDP-Gal和/或GDP-Fuc和/或UDP-GlcNAc和/或CMP-Neu5Ac。

图10示意性地示出了本发明的另一个示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够产生增加的游离葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的可用性。细胞的用于葡萄糖和果糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被禁用，例如通过分别缺失ptsG和fruA基因。相反，果糖和葡萄糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白进入细胞。随着glk基因的缺失，对微生物细胞进行遗传工程化，使细胞中的游离葡萄糖单体变得可用。相反，果糖被果糖激酶(如大肠杆菌W CscK)活化为果糖-6-磷酸。通过缺失、功能性失活或沉默pfkA和/或pfkB和/或zwf基因降低或减少磷酸果糖激酶Pfk和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf的表达。总体而言，这产生了改善的游离葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸以及果糖-6-磷酸的细胞内供应。葡萄糖可用作各种糖基化反应的底物，而葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸可被微生物细胞利用以产生UDP-Gal和/或GDP-Fuc和/或UDP-GlcNAc和/或CMP-Neu5Ac。此外，避免磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统的PEP消耗。

图11示意性地示出了本发明的另一个示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够实现增加的游离甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸的细胞内可用性。细胞的用于果糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被禁用，例如通过缺失fruA基因和/或manXYZ基因。相反，果糖通过糖通透酶和/或通道进入细胞。随着缺失表现出果糖激酶活性(如mak)和/或甘露糖-6-磷酸异构酶活性(如manA)的基因以及表达/过表达合适的甘露糖异构酶(ManI)和甘露糖激酶(ManK)，对微生物细胞进行遗传工程化，使细胞中的甘露糖-6-磷酸变得可用。这可被微生物细胞利用以产生GDP-Man和/或GDP-Fuc。

图12示意性地示出了本发明的另一个示例性微生物细胞，当在由葡萄糖和果糖以及半乳糖组成的混合原料上培养时，所述微生物细胞能够产生更高的游离果糖-6-磷酸和/或半乳糖-1-磷酸的细胞内可用性。细胞的用于葡萄糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被禁用，例如通过缺失ptsG基因。相反，葡萄糖通过磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶非依赖性(非PEP-PTS)转运蛋白进入细胞。已通过缺失、功能性失活或沉默pfkA和/或pfkB基因降低或减少磷酸果糖激酶Pfk的表达。随着合适的非PEP-PTS转运蛋白以及单糖激酶的表达/过表达，使得半乳糖能够分别转移到工程化细胞中及其活化为半乳糖-1-磷酸，微生物细胞已被遗传工程化，使得细胞中的果糖-6-磷酸和半乳糖-1-磷酸变得可用。这些可被微生物细胞利用以产生GlcNAc和/或GDP-Fuc和/或UDP-Gal和/或CMP-Neu5Ac。

根据第四方面，本发明提供了所需碳水化合物在药物和/或营养组合物中的用途，其中目的碳水化合物优选通过根据本发明的方法或遗传工程化的宿主细胞产生。

实施例

实施例1-混合单糖原料的制备

通过将500g蔗糖溶于水中，制备50％(w/v)蔗糖溶液。溶液最终体积为1升。在30℃到35℃的温度下，通过用96％(v/v)硫酸调节pH。然后，将溶液在垂直高压釜(Systec VX-65,Linden,Germany)中在121℃下杀菌45分钟。在热灭菌前后取样，并在进行高效液相色谱(HPLC)分析前保持冷冻。采用连接到Shimadzu HPLC系统的RID-10A折射率检测器(Shimadzu,Germany)和Waters XBridge Amide柱3.5μm(250x4.6mm)(Eschborn,Germany)进行HPLC。用30％溶剂A(50％(v/v)乙腈溶于双蒸馏水中，0.1％(v/v)NH4OH)和70％溶剂B(80％(v/v)乙腈溶于双蒸馏水中，0.1％(v/v)NH4OH)在35℃下进行等度洗脱，流速为1.4mLmin^-1。在离子交换基质(Strata ABW,Phenomenex)上通过固相萃取清除样品。将10微升样品(1:5稀释)应用于柱上。最后，测定检测到的糖的相对量。如表2所示，在热处理前，蔗糖向单糖葡萄糖和果糖的转化随着溶液pH值的降低而增加。当用硫酸进行酸化时，在pH值≤3.50处，可观察到完全的蔗糖裂解。

表2：在热灭菌前后经pH调节的50％(w/v)蔗糖溶液中检测到的糖的相对量。用96％(v/v)硫酸进行pH调节。描述了HPLC检测到的糖的百分比量(曲线下面积；AUC)。

实施例2-各种基因缺失菌株的原料依赖性生长

比较了大肠杆菌BL21(DE3)菌株(野生型)以及突变菌株大肠杆菌pfkA^-(△pfkA)、大肠杆菌pfkB^-(△pfkB)、大肠杆菌pfkA^-pfkB^-(△pfkA△pfkA)的生长行为。根据Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))的方法进行基因组缺失。所有菌株均在30℃下，于含有20mL矿物盐培养基的100mL摇瓶中培养，所述培养基含有7g·L^- ¹NH₄H₂PO₄、7g·L^-1K₂HPO₄、2g·L^-1KOH、0.3g·L^-1柠檬酸、2g·L^-1MgSO₄×7·H₂O和0.015g·L^-1CaCl₂×6·H₂O，补充1mL·L^-1微量元素溶液(54.4g·L^-1柠檬酸铁铵、9.8g·L^-1MnCl₂×4·H₂O、1.6g·L^-1CoCl₂×6·H₂O、1g·L^-1CuCl₂×2·H₂O、1.9g·L^-1H₃BO₃、9g·L^-1ZnSO₄×7·H₂O、1.1g·L^-1Na₂MoO₄×2·H₂O、1.5g·L^-1Na₂SeO₃、1.5g·L^-1NiSO₄×6·H₂O)，并含有2％(m/v)葡萄糖(A)或1％(w/v)葡萄糖/1％(w/v)果糖(B)作为碳源。接种培养物至OD 0.1，并通过OD₆₀₀测量监测生长发育超过26小时。如图2所示，当提供葡萄糖作为唯一的碳源和能源时，大肠杆菌pfkA^-pfkB^-几乎没有显示出生长，而当混合单糖原料可用时，其生长与野生型菌株以及单一缺失突变体难以区别。

实施例3-通过工程化大肠杆菌菌株生产2’-岩藻糖基乳糖

通过过表达用于从头合成GDP-岩藻糖(ManB、ManC、Gmd、WcaG)的酶，来自大肠杆菌:O126的2’-岩藻糖基转移酶基因wbgL、来自波可望耶尔森菌(Yersinia bercovieri)ATCC 43970的糖外排转运蛋白yberc0001_9420和大肠杆菌W的csc基因簇(登录号CP002185.1)(包含用于蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶的基因以及转录阻遏物(分别为基因cscB、cscK、cscA和cscR))，进一步遗传工程化显示出基因型lacY⁺、lacZ^-、fuclK^-、wcaJ^-、pfkA^-的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，使菌株能够在作为唯一碳源的蔗糖上生长。根据Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000))的方法进行基因组缺失。通过转座进行异源基因的基因组整合。使用EZ-Tn5TM转座酶(Epicentre,USA)整合线性DNA片段或将水手转座酶Himar1的超活性C9-突变体(Proc.Natl.Acad.Sci.1999,USA 96:11428-11433)用于转座。对这些基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并由GenScript公司以合成方法制备。得到的菌株均在30℃下，于含有20mL矿物盐培养基的100mL摇瓶中培养，所述培养基含有3g/L KH₂PO₄、12g/LK₂HPO₄、5g/L(NH₄)₂SO₄、0.3g/L柠檬酸、2g/L MgSO₄×7H₂O、0.1g/LNaCl和0.015g/L CaCl₂×6H₂O，含有1mL/L微量元素溶液(54.4g/L柠檬酸铁铵、9.8g/L MnCl₂×4H₂O、1.6g/L CoCl₂×6H₂O、1g/L CuCl₂×2H₂O、1.9g/L H₃BO₃、9g/L ZnSO₄×7H₂O、1.1g/L Na₂MoO₄ 2H₂O、1.5g/L Na₂SeO₃、1.5g/L NiSO₄×6H₂O)，并含有2％(v/v)甘油、2％(m/v)无菌过滤蔗糖或2％蔗糖水解产物作为碳源。此外，添加15mM乳糖，产生作为2’-岩藻糖基乳糖生产的受体底物。接种培养物至OD 0.1，26小时后停止培养。为了定量培养液中的2’-FL，采用连接到HPLC系统(Shimadzu,Germany)的折射率检测器(RID-10A)(Shimadzu,Germany)和Waters XBridge Amide柱3.5μm(250x4.6mm)(Eschborn,Germany)进行HPLC分析。用30％A：50％(v/v)ACN溶于ddH₂O中，0.1％(v/v)NH₄OH和70％B：80％(v/v)ACN溶于ddH₂O中，0.1％(v/v)NH₄OH作为洗脱液在35℃下进行等度洗脱，流速为1.4ml·min^-1。将培养上清液进行无菌过滤(0.22μm孔径)，并在离子交换基质(Strata ABW,Phenomenex)上通过固相萃取清除。将10μl样品上样于柱上，并根据标准曲线计算2’-岩藻糖基乳糖浓度。将工程化菌株在甘油上生长过程中的生产率设定为100％。如表3所示，当提供蔗糖水解产物作为碳源和能源时，2’-FL产量最高。

	甘油	蔗糖	蔗糖水解产物
				相对2’-FL产量	100％	199％	482％

表3：在甘油、蔗糖或蔗糖水解产物作为碳源和能源的培养过程中，实施例3中所述的大肠杆菌菌株的相对2’-FL产量。将在甘油上的生产率设定为100％。

实施例4-通过工程化大肠杆菌菌株在混合单糖原料上生长过程中进行的2’-岩藻糖基乳糖的全发酵

通过过表达用于从头合成GDP-岩藻糖(ManB、ManC、Gmd、WcaG)的酶，来自大肠杆菌：O126的2’-岩藻糖基转移酶基因wbgL、来自波可望耶尔森菌ATCC 43970的糖外排转运蛋白基因yberc0001_9420、来自运动发酵单胞菌的葡萄糖促进因子基因glf、来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的β-1，4-半乳糖基转移酶基因galTpm1141(GenBank：AEC04686)以及分别编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶和磷酸葡萄糖变位酶的大肠杆菌基因galE和pgm，进一步遗传工程化显示出基因型pfkA^-、lacZ、fuclK^-、wcaJ^-、glk^-、gcd^-、pstG^-的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据Datsenko and Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：6640-6645(2000))的方法进行基因组缺失。通过转座进行异源基因的基因组整合。使用EZ-Tn5TM转座酶(Epicentre，USA)整合线性DNA片段或将水手转座酶Himar1的超活性C9-突变体(Proc.Natl.Acad.Sci.1999，USA 96：11428-11433)用于转座。对这些基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并由GenScript公司以合成方法制备。

在30℃下，在3L发酵罐(New Brunswick，Edison，USA)中培养得到的大肠杆菌菌株，以1000mL矿物盐培养基开始，所述培养基含有7g·L^-1NH₄H₂PO₄、7g·L^-1K₂HPO₄、2g·L^- ¹KOH、0.3g·L^-1柠檬酸、2g·L^-1MgSO₄×7·H₂O和0.015g·L^-1CaCl₂×6·H₂O，补充1mL.L^-1微量元素溶液(54.4g·L^-1柠檬酸铁铵、9.8g·L^-1MnCl₂×4·H₂O、1.6g·L^-1CoCl₂×6·H₂O、1g·L^-1CuCl₂×2·H₂O、1.9g·L^-1H₃BO₃、9g·L^-1ZnSO₄×7·H₂O、1.1g·L^-1Na₂MoO₄×2·H₂O、1.5g·L^-1Na₂SeO₃、1.5g·L^-1NiSO₄×6·H₂O)，并含有2％(m/v)水解蔗糖作为碳源。通过加入来自在相同培养基中生长的预培养物的2.5％(v/v)接种物开始培养。分批期(batchphase)结束的特征是溶解氧水平上升。在离开分批期后立即施用由完全水解的蔗糖组成的碳进料，补充2g·L^-1MgSO₄×7·H₂O、0.015g·L^-1CaCl₂×6·H₂O和1mL·L^-1微量元素溶液。进料速率为12.0-15.0mL·L^-1·h^-1，参照起始体积。充气保持在3L·min^-1。通过控制搅拌速率，使溶解氧保持在20-30％的饱和度。通过加入25％氨溶液使pH保持在6.7。培养持续86小时，并在培养上清液中产生大量2’-FL。

序列表

<110> 詹尼温生物技术有限责任公司

<120> 通过利用混合原料的微生物细胞进行的碳水化合物的发酵生产

<130> CP1210732P

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1395

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 1

atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc 60

cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg 120

ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc 180

atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg 240

cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg 300

gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt 360

gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc 420

agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct 480

gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg 540

gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc 600

aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa 660

gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag tggctgggcg 720

ctgtttaaag agaacagcaa cttccgccgc gcggtgttcc ttggcgtact gttgcaggta 780

atgcagcaat tcaccgggat gaacgtcatc atgtattacg cgccgaaaat cttcgaactg 840

gcgggttata ccaacactac cgagcaaatg tgggggaccg tgattgtcgg cctgaccaac 900

gtacttgcca cctttatcgc aatcggcctt gttgaccgct ggggacgtaa accaacgcta 960

acgctgggct tcctggtgat ggctgctggc atgggcgtac tcggtacaat gatgcatatc 1020

ggtattcact ctccgtcggc gcagtatttc gccatcgcca tgctgctgat gtttattgtc 1080

ggttttgcca tgagtgccgg tccgctgatt tgggtactgt gctccgaaat tcagccgctg 1140

aaaggccgcg attttggcat cacctgctcc actgccacca actggattgc caacatgatc 1200

gttggcgcaa cgttcctgac catgctcaac acgctgggta acgccaacac cttctgggtg 1260

tatgcggctc tgaacgtact gtttatcctg ctgacattgt ggctggtacc ggaaaccaaa 1320

cacgtttcgc tggaacatat tgaacgtaat ctgatgaaag gtcgtaaact gcgcgaaata 1380

ggcgctcacg attaa 1395

<210> 2

<211> 1422

<212> DNA

<213> 运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）

<400> 2

atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc 60

ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc 120

cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc 180

gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt 240

cgcttcggtc gtcgcggcgg attgttgatg agttccattt gtttcgtcgc cgccggtttt 300

ggtgctgcgt taaccgaaaa attatttgga accggtggtt cggctttaca aattttttgc 360

tttttccggt ttcttgccgg tttaggtatc ggtgtcgttt caaccttgac cccaacctat 420

attgctgaaa ttcgtccgcc agacaaacgt ggtcagatgg tttctggtca gcagatggcc 480

attgtgacgg gtgctttaac cggttatatc tttacctggt tactggctca tttcggttct 540

atcgattggg ttaatgccag tggttggtgc tggtctccgg cttcagaagg cctgatcggt 600

attgccttct tattgctgct gttaaccgca ccggatacgc cgcattggtt ggtgatgaag 660

ggacgtcatt ccgaggctag caaaatcctt gctcgtctgg aaccgcaagc cgatcctaat 720

ctgacgattc aaaagattaa agctggcttt gataaagcca tggacaaaag cagcgcaggt 780

ttgtttgctt ttggtatcac cgttgttttt gccggtgtat ccgttgctgc cttccagcag 840

ttagtcggta ttaacgccgt gctgtattat gcaccgcaga tgttccagaa tttaggtttt 900

ggagctgata cggcattatt gcagaccatc tctatcggtg ttgtgaactt catcttcacc 960

atgattgctt cccgtgttgt tgaccgcttc ggccgtaaac ctctgcttat ttggggtgct 1020

ctcggtatgg ctgcaatgat ggctgtttta ggctgctgtt tctggttcaa agtcggtggt 1080

gttttgcctt tggcttctgt gcttctttat attgcagtct ttggtatgtc atggggccct 1140

gtctgctggg ttgttctgtc agaaatgttc ccgagttcca tcaagggcgc agctatgcct 1200

atcgctgtta ccggacaatg gttagctaat atcttggtta acttcctgtt taaggttgcc 1260

gatggttctc cagcattgaa tcagactttc aaccacggtt tctcctatct cgttttcgca 1320

gcattaagta tcttaggtgg cttgattgtt gctcgcttcg tgccggaaac caaaggtcgg 1380

agcctggatg aaatcgagga gatgtggcgc tcccagaagt ag 1422

<210> 3

<211> 1248

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 3

atggcactga atattccatt cagaaatgcg tactatcgtt ttgcatccag ttactcattt 60

ctctttttta tttcctggtc gctgtggtgg tcgttatacg ctatttggct gaaaggacat 120

ctagggttga cagggacgga attaggtaca ctttattcgg tcaaccagtt taccagcatt 180

ctatttatga tgttctacgg catcgttcag gataaactcg gtctgaagaa accgctcatc 240

tggtgtatga gtttcatcct ggtcttgacc ggaccgttta tgatttacgt ttatgaaccg 300

ttactgcaaa gcaatttttc tgtaggtcta attctggggg cgctattttt tggcttgggg 360

tatctggcgg gatgcggttt gcttgatagc ttcaccgaaa aaatggcgcg aaattttcat 420

ttcgaatatg gaacagcgcg cgcctgggga tcttttggct atgctattgg cgcgttcttt 480

gccggcatat tttttagtat cagtccccat atcaacttct ggttggtctc gctatttggc 540

gctgtattta tgatgatcaa catgcgtttt aaagataagg atcaccagtg cgtagcggca 600

gatgcgggag gggtaaaaaa agaggatttt atcgcagttt tcaaggatcg aaacttctgg 660

gttttcgtca tatttattgt ggggacgtgg tctttctata acatttttga tcaacaactt 720

tttcctgtct tttattcagg tttattcgaa tcacacgatg taggaacgcg cctgtatggt 780

tatctcaact cattccaggt ggtactcgaa gcgctgtgca tggcgattat tcctttcttt 840

gtgaatcggg tagggccaaa aaatgcatta cttatcggag ttgtgattat ggcgttgcgt 900

atcctttcct gcgcgctgtt cgttaacccc tggattattt cattagtgaa gttgttacat 960

gccattgagg ttccactttg tgtcatatcc gtcttcaaat acagcgtggc aaactttgat 1020

aagcgcctgt cgtcgacgat ctttctgatt ggttttcaaa ttgccagttc gcttgggatt 1080

gtgctgcttt caacgccgac tgggatactc tttgaccacg caggctacca gacagttttc 1140

ttcgcaattt cgggtattgt ctgcctgatg ttgctatttg gcattttctt cttgagtaaa 1200

aaacgcgagc aaatagttat ggaaacgcct gtaccttcag caatatag 1248

<210> 4

<211> 735

<212> DNA

<213> 假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）

<400> 4

atggcacaaa acgcgcaaca tcataatccg cgaagcattt caatgagcaa atcacttatg 60

ttttttgcca tctcattgat tttaaatgcg atgggaaatg ttttgacgct cgtcacagct 120

tcacatataa aacccgcttt tttgggatca gcttattgga ctgctgcaga ggctaatcta 180

ggtcaagctt tattaggaaa taattcactt gtcttgtttt gggcattttt agttcttggc 240

atgcttattt cattcctgaa tgcgttatta atgaaaaagt tagattggca tcgtatcatt 300

ggtaatttct tgtttatgtt accattttca atttttattc aatggttttc aaatattttc 360

aatcaaatta tgccaaatgc taattcagtg gcagcaactg tgttatatac agtaattaat 420

tttattggtg ttggcttgat cgccgttgct atttcgattt atcaacgtgt gaatttagtg 480

ttacaccctg ccgatgattt gatgcaaatt ttacgtttca aatattttca cgggtcggct 540

ttcaaggcta tgtgggcgtc ctatattccg ccaacgattt ttgcaattat tgcctttgtg 600

atcactttcc ctaatttgta taatttcggg ttaggaatta tttttgcatt cttattccag 660

ggtggcatca caggaatcgc ggacaagtac gtctttaaga atttaaagca tcaggcaata 720

gatgttggta attaa 735

<210> 5

<211> 1254

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 5

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254

<210> 6

<211> 1317

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 6

atgggaaaca catcaataca aacgcagagt taccgtgcgg tagataaaga tgcagggcaa 60

agcagaagtt acattattcc attcgcgctg ctgtgctcac tgttttttct ttgggcggta 120

gccaataacc ttaacgacat tttattacct caattccagc aggcttttac gctgacaaat 180

ttccaggctg gcctgatcca atcggccttt tactttggtt atttcattat cccaatccct 240

gctgggatat tgatgaaaaa actcagttat aaagcaggga ttattaccgg gttattttta 300

tatgccttgg gtgctgcatt attctggccc gccgcagaaa taatgaacta caccttgttt 360

ttagttggcc tatttattat tgcagccgga ttaggttgtc tggaaactgc cgcaaaccct 420

tttgttacgg tattagggcc ggaaagtagt ggtcacttcc gcttaaatct tgcgcaaaca 480

tttaactcgt ttggcgcaat tatcgcggtt gtctttgggc aaagtcttat tttgtctaac 540

gtgccacatc aatcgcaaga cgttctcgat aaaatgtctc cagagcaatt gagtgcgtat 600

aaacacagcc tggtattatc ggtacagaca ccttatatga tcatcgtggc tatcgtgtta 660

ctggtcgccc tgctgatcat gctgacgaaa ttcccggcat tgcagagtga taatcacagt 720

gacgccaaac aaggatcgtt ctccgcatcg ctttctcgcc tggcgcgtat tcgccactgg 780

cgctgggcgg tattagcgca attctgctat gtcggcgcac aaacggcctg ctggagctat 840

ttgattcgct acgctgtaga agaaattcca ggtatgactg caggctttgc cgctaactat 900

ttaaccggaa ccatggtgtg cttctttatt ggtcgtttca ccggtacctg gctcatcagt 960

cgcttcgcac cacacaaagt cctggccgcc tacgcattaa tcgctatggc actgtgcctg 1020

atctcagcct tcgctggcgg tcatgtgggc ttaatagccc tgactttatg cagcgccttt 1080

atgtcgattc agtacccaac aatcttctcg ctgggcatta agaatctcgg ccaggacacc 1140

aaatatggtt cgtccttcat cgttatgacc attattggcg gcggtattgt cactccggtc 1200

atgggttttg tcagtgacgc ggcgggcaac atccccactg ctgaactgat ccccgcactc 1260

tgcttcgcgg tcatctttat ctttgcccgt ttccgttctc aaacggcaac taactga 1317

<210> 7

<211> 1491

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 7

atgagtacta caacccagaa tatcccgtgg tatcgccatc tcaaccgtgc acaatggcgc 60

gcattttccg ctgcctggtt gggatatctg cttgacggtt ttgatttcgt tttaatcgcc 120

ctggtactca ccgaagtaca aggtgaattc gggctgacga cggtgcaggc ggcaagtctg 180

atctctgcag cctttatctc tcgctggttc ggcggcctga tgctcggcgc tatgggtgac 240

cgctacgggc gtcgtctggc aatggtcacc agcatcgttc tcttctcggc cgggacgctg 300

gcctgcggct ttgcgccagg ctacatcacc atgtttatcg ctcgtctggt catcggcatg 360

gggatggcgg gtgaatacgg ttccagcgcc acctatgtca ttgaaagctg gccaaaacat 420

ctgcgtaaca aagccagtgg ttttttgatt tcaggcttct ctgtgggggc cgtcgttgcc 480

gctcaggtct atagcctggt ggttccggtc tggggctggc gtgcgctgtt ctttatcggc 540

attttgccaa tcatctttgc tctctggctg cgtaaaaaca tcccggaagc ggaagactgg 600

aaagagaaac acgcaggtaa agcaccagta cgcacaatgg tggatattct ctaccgtggt 660

gaacatcgca ttgccaatat cgtaatgaca ctggcggcgg ctactgcgct gtggttctgc 720

ttcgccggta acctgcaaaa tgccgcgatc gtcgctgttc ttgggctgtt atgcgccgca 780

atctttatca gctttatggt gcagagtgca ggcaaacgct ggccaacggg cgtaatgctg 840

atggtggtcg tgttgtttgc tttcctctac tcatggccga ttcaggcgct gctgccaacg 900

tatctgaaaa ccgatctggc ttataacccg catactgtag ccaatgtgct gttctttagt 960

ggctttggcg cggcggtggg atgctgcgta ggtggcttcc tcggtgactg gctgggaacc 1020

cgcaaagcgt acgtttgtag cctgctggcc tcgcagctgc tgattattcc ggtatttgcg 1080

attggcggcg caaacgtctg ggtgctcggt ctgttactgt tcttccagca aatgcttgga 1140

caagggatcg ccgggatctt accaaaactg attggcggtt atttcgatac cgaccagcgt 1200

gcagcgggcc tgggctttac ctacaacgtt ggcgcattgg gcggtgcact ggccccaatc 1260

atcggcgcgt tgatcgctca acgtctggat ctgggtactg cgctggcatc gctctcgttc 1320

agtctgacgt tcgtggtgat cctgctgatt gggctggata tgccttctcg cgttcagcgt 1380

tggttgcgcc cggaagcgtt gcgtactcat gacgctatcg acggtaaacc attcagcggt 1440

gccgtgccgt ttggcagcgc caaaaacgat ttagtcaaaa ccaaaagtta a 1491

<210> 8

<211> 1278

<212> DNA

<213> 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）

<400> 8

atgactaccg ccaggcccgc aaatcccgtt gtctcgatcg ccatcgtcgg cgtgctgttt 60

ttcatcatcg gctttttcac ctggatcaac gggccgctga tcaccttcgt gcggctggcg 120

ttcgacctca acgaggtcaa tgcgttcctg gtgctgatgg tgttctacct gtcgtacttc 180

ttcctggcgc tgccctcgtc atggatcctc aagcgcaccg gcatgaaaaa aggcctggcg 240

ctgagtctgg tggtgatggc gctgggcgcc gcagcattcg ggcaattcgc tacgcaacgc 300

tggtatccgg gcgcactggc cggcatgttc gtgatcggta gcggcctggc gttgttgcag 360

accgcgatca acccatacat cagtattctc gggccaatcg aaagtgcggc gcggcgcatc 420

gcgctgatgg gcatctgtaa caagattgcc ggcatcctgg cgccgatcct gatcggctcg 480

ctggtgctgc atggcatcgg cgatctctcc acgcaggtgg ccgcggccga tgcggcgacc 540

aagcagcaac tgctcaacgc gtttgccgcc aagatccatg caccatatct ggtgatgtcc 600

ggcgtgttgc tggtgctggc ggtgggcgtg ttgttctcgc cgctgcccga actcaaggcc 660

tccgaagcca atgccacgcc gggcagcggt ggcgcggcgc agaagtccag catcttccag 720

ttcccgcatc tgtggctggg cgtgttgtgc ctgttcgtgt atgtcggtgt ggaagtgatg 780

gccggcgatg ccatcggcac ttacggacac ggcttcaatt tgccgctgga cagcaccaag 840

ctgttcacct cctacacgct gggcgcaatg ttgctgggct atatcgccgg cctggtgctg 900

attccgcggg tgatttcgca ggcgcgctac ctgagcgtgt ctgcgctgct gggcgtgctg 960

ttctcgctgg gggcgctgtt cacccacggc tatgtgtcgg tggggttcgt ggccgcgctc 1020

ggttttgcca acgccatgat gtggccggcg atctttccgc tggccatccg cggcctgggc 1080

cggttcaccg agatcggttc ggcgttgctg gtgatgggca ttgccggcgg cgcgatcatt 1140

ccgcagctgt tcgccattct gaaacagcat tacgacttcc aggtggtgtt cgccgcgctg 1200

atggtgccgt gctacctgta catcctgttc tattcgctgc gcggccaccg tgtggggctg 1260

ccggctcaac cgaaatga 1278

<210> 9

<211> 1554

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<400> 9

atgacgacga caacggcatc acccgtatcg aaacagacgg catccgcggc gcaggaaacc 60

agcgcaaccg gtgcggcggc caccgcaatc gaaaccatcg aaaccggcgt ggccggagtg 120

gcgggcgcgg ccacaaacgc ggcagccaac gcaatcgagg acctcgaagc cgccgaatcg 180

cacggcttct ccacgcgctt cccgctcaac agcgcattca tcttcacctt cggcgcgctc 240

ggcggcatgc tgttcggttt cgacaccggc atcatctccg gcgcctcccc gcttatcgaa 300

tcggacttcg gcctgagcgt ctctcagacc ggcttcatca cctcctcggt gctgatcggc 360

tcgtgcgcag gcgcgctgtc gatcggcgca ctgtctgacc ggttcggccg caagaagctg 420

ctcatcgtct ccgcgctgct gttcctgctc ggctcaggcc tgtgcgcctc ctccaccgga 480

ttcgcgatga tggtgtgcgc ccgcatcatc ctgggtctcg ccgtcggcgc ggcctccgcc 540

ctgaccccgg cgtacttggc cgaactggcg ccgaaggagc gtcgcggctc actgtccacg 600

ctgttccagc tcatggtcac cttcggcatt ctgctggcct acgcctccaa cctcggattc 660

ctgaaccaca acctcttcgg catccgcgac tggcgctgga tgctcggttc ggcgctggtg 720

ccggccgcct tgttgctgct cggcggcctg ttgctgcccg aatccccgcg ttatctggtg 780

aacaagggcg acacccgcaa cgccttcaaa gtgcttacgc tgattcgcaa ggacgtggat 840

cagacccagg tgcagattga gctggacgaa atcaaggccg tggccgcaca ggacaccaag 900

ggtggtgtgc gcgaactgtt ccgtatcgct cgtccggcgc tggtggccgc catcggtatc 960

atgctgttcc agcagctcgt gggcatcaac tcggtgatct acttcctgcc gcaggtgttc 1020

atcaagggct tcggcttccc tgaaggcgac gcgatctggg tgtcggtggg catcggcgtg 1080

gtgaacttcg tgagcaccat cgtggccacg cttatcatgg atcgtttccc gcgcaagggc 1140

atgctgatct tcggttccat cgtgatgacc gtttcgctcg cggtgctcgc cgtgatgaac 1200

ttcgtgggcg acgtggccgt gctggcagtg ccgacgatga ttctcatcgc tttctatatc 1260

ctcggctttg cggtctcgtg gggcccgatc gcctgggtgc ttatcggcga gatcttcccg 1320

ctgagcgtgc gcggcatcgg ctcatccttc ggctcggcgg cgaactggct gggcaacttc 1380

atcgtctccc agttcttcct cgtgctgctc gatgcgttcg gcaacaatgt gggcggcccg 1440

ttcgcgattt tcggcgtgtt ctcggccctg tccatcccgt tcgtgctgcg cttggtgccc 1500

gagaccaagg gcaagtcgct ggaggaaatc gagaaggaaa tgaccaagcg ctag 1554

<210> 10

<211> 1206

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 10

atgttaagag ggacatattt atttggatat gctttctttt ttacagtagg tattatccat 60

atatcaacag ggagtttgac accattttta ttagaggctt ttaacaagac aacagatgat 120

atttcggtca taatcttctt ccagtttacc ggatttctaa gcggagtatt aatcgcacct 180

ttaatgatta agaaatacag tcattttagg acacttactt tagctttgac aataatgctt 240

gtagcgttaa gtatcttttt tctaaccaag gattggtatt atattattgt aatggctttt 300

ctcttaggat atggagcagg cacattagaa acgacagttg gttcatttgt tattgctaat 360

ttcgaaagta atgcagaaaa aatgagtaag ctggaagttc tctttggatt aggcgcttta 420

tctttcccat tattaattaa ttccttcata gatatcaata actggttttt accatattac 480

tgtatattca cctttttatt cgtcctattc gtagggtggt taattttctt gtctaagaac 540

cgagagtacg ctaagaatgc taaccaacaa gtgacctttc cagatggagg agcatttcaa 600

tactttatag gagatagaaa aaaatcaaag caattaggct tttttgtatt tttcgctttc 660

ctatatgctg gaattgaaac aaattttgcc aactttttac cttcaatcat gataaaccaa 720

gacaatgaac aaattagtct tataagtgtc tcctttttct gggtagggat catcatagga 780

agaatattga ttggtttcgt aagtagaagg cttgattttt ccaaatacct tctttttagc 840

tgtagttgtt taattgtttt gttgattgcc ttctcttata taagtaaccc aatacttcaa 900

ttgagtggta catttttgat tggcctaagt atagcgggga tatttcccat tgctttaaca 960

ctagcatcaa tcattattca gaagtacgtt gacgaagtta caagtttatt tattgcctcg 1020

gcaagtttcg gaggagcgat catctctttc ttaattggat ggagtttaaa ccaggatacg 1080

atcttattaa ccatgggaat atttacaact atggcggtca ttctagtagg tatttctgta 1140

aagattagga gaactaaaac agaagaccct atttcacttg aaaacaaagc atcaaaaaca 1200

cagtag 1206

<210> 11

<211> 1593

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）

<400> 11

atggtcttcg ccatttatgt cgcaattatc attggggtcg gactttgggt atctcgtgat 60

aaaaaaggca ctcagaaaag tacggaagat tatttcttgg cgggaaaatc tttgccttgg 120

tgggctgtcg gtgcttcgct aattgctgca aatatttctg cggaacaatt tataggaatg 180

tctggttcag gctattcaat tggcttggct atcgcatctt atgaatggat gtcggcaata 240

acattgatta ttgttggtaa gtactttcta cctattttca ttgaaaaagg aatctatacc 300

attcctgaat ttgttgaaaa acgcttcaat aaaaaactaa aaacaatttt ggccgttttt 360

tggatttcct tgtacatttt tgtaaaccta acttcagtac tgtatttagg tggtttggct 420

ctcgaaacca ttttgggtat tccgttgatg tactcaattc taggtcttgc gctgtttgcg 480

ttggtgtact caatttatgg tggtttatcg gcagtagtat ggaccgatgt catccaagtg 540

ttcttcttag ttttgggtgg ttttatgact acctacatgg cagtgagctt tattggtggt 600

acggacggtt ggttcgctgg ggtgtctaaa atggtcgatg cagctcctgg ccactttgag 660

atgatcttgg atcaaagtaa tccacaatac atgaaccttc ctggtattgc cgtattaatt 720

ggtggtcttt gggtagcaaa cttatattac tggggcttta accagtacat tattcaaaga 780

acgcttgctg caaaatcagt atcggaagct cagaaaggta ttgtttttgc agcgtttttg 840

aaacttatcg ttccgtttct cgtggtattg ccaggtattg ccgcttacgt tattacttcg 900

gacccacaac taatggcaag ccttggtgat attgcagcaa caaaccttcc aagtgctgct 960

aatgcggata aagcataccc ttggctaact cagttcttgc ctgttggtgt taaaggtgtt 1020

gtttttgcgg ctcttgctgc tgcaattgtt tcttcactag catcaatgct taactcaaca 1080

gccactatct tcactatgga tatttacaaa gagtatatct ctcctgactc aggtgaccac 1140

aagttggtga atgttgggcg tactgcagct gtggtggcac taattattgc ttgcctaatt 1200

gccccaatgt taggtggtat tggccaagca ttccaataca tccaagaata tacaggttta 1260

gttagccctg gtattttggc tgtattctta cttggcttat tctggaagaa aacaaccagt 1320

aaaggggcta ttattggtgt agtagcatca ataccatttg ccttgttctt gaaatttatg 1380

ccactttcca tgccatttat ggatcaaatg ctatacacat tattgtttac aatggttgtt 1440

atcgcattta caagtttgag cacatcaatt aatgatgatg atcctaaagg tattagtgtt 1500

acatcatcga tgtttgtaac agatcgaagc tttaatatcg ctgcttacgg cataatgatt 1560

gttttggcag tgttatatac attgttctgg taa 1593

<210> 12

<211> 1476

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 12

atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt 60

ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc 120

gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc 180

gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac 240

cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta 300

ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt 360

tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt 420

ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc 480

gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc 540

gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt 600

tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg 660

ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg 720

cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg 780

gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc 840

ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg 900

ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt 960

gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt 1020

cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt 1080

accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt 1140

gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg 1200

aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac 1260

ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac 1320

aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg 1380

aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg 1440

gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa 1476

<210> 13

<211> 1395

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 13

atgaagaata ctccaactca attagaacca aatgttcctg taacaagaag ccattcaatg 60

ggatttgtca ttttgatctc atgtgcggcg gggcttggcg gcttattgta tggctatgac 120

acggcagtga tttctggcgc catcggtttt ctgaaagatt tatacagcct gagtccgttt 180

atggagggac ttgtcatttc aagcattatg attggaggag ttgtgggcgt cgggatatcc 240

ggatttttaa gtgacagatt cggccggaga aaaattttaa tgacagccgc tttgttattt 300

gcgatatcag caatcgtttc agcgctttct caagacgtgt ccaccttaat cattgcaagg 360

attatcgggg ggctgggaat cgggatgggc tcatcgctct ctgttacgta tattacagaa 420

gcggcaccgc ccgctatacg cggaagttta tcttcgttat atcagctctt tacgatactg 480

ggtatttccg caacatactt tattaatcta gctgtgcagc ggtccggaac atacgaatgg 540

ggcgtgcaca ccggctggag atggatgctt gcttatggaa tggtgccatc cgtcattttt 600

ttccttgtcc tgctcgtcgt cccggaaagt ccgagatggc tggcgaaagc gggcaaaaca 660

aatgaagctt taaagatcct gacacgtatt aatggagaaa ctgttgcaaa agaagaatta 720

aagaacattg agaactcttt aaaaatagaa caaatggggt cgctctccca gctgtttaag 780

ccgggtctca gaaaggcgct tgtcattgga atcctgctgg cgctgtttaa ccaagtcatc 840

ggcatgaacg cgattactta ctacgggccg gaaatcttta aaatgatggg attcgggcaa 900

aacgccggat ttgtgacgac ttgtatcgtc ggggttgtag aagttatttt taccgttatt 960

gcggtgttgc tgattgataa agtcggacga aaaaaactga tgtccatcgg ttctgctttt 1020

atggctattt ttatgatttt aatcgggacg tcgttttatt ttgagttaac aagcgggatc 1080

atgatgatcg tccttatatt aggttttgtc gctgctttct gtgtctcggt cggaccgatc 1140

acatggatta tgatttctga aatcttcccg aaccatctgc gtgcgcgggc cgcgggcatt 1200

gcgaccatct ttttatgggg agcaaactgg gcgatcggac agtttgtgcc aatgatgatc 1260

gattctttcg ggctcgccta tacattttgg atctttgcgg tgattaacat cctttgtttc 1320

ctgtttgtcg ttacgatctg tccagaaacg aagaacaaat cgctcgagga aattgaaaag 1380

ctttggataa aatga 1395

<210> 14

<211> 4393

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）

<400> 14

atgtataaaa aacggaagtt agccattctt attgctttgc taaccggcac cgccgccgcc 60

catgggcaga cagacctgaa cagcattgaa gcgcgtctcg ccgccctgga aaaacgcctg 120

caggacgccg agacccgcgc cagcactgcc gaaagccgcg ccgcctcagc ggagcagaaa 180

gttcagcagt taacccagca gcagcagcaa acccaggcca ccacccagca ggtggccagg 240

cgcaccactc aactggaaga aaaagccgaa cggcccggcg gctttgagtt ccatggctat 300

gcgcgttccg gggtgatcat gaacgactcg gccgccagta ccaaatccgg cgcttatatg 360

acccccgccg gggagaccgg cggcgccatt ggtcgcctgg gcaaccaggc cgacacctat 420

gtggaaatga acctcgaaca taaacagacc ctggacaacg gggcgaccac ccgtttcaaa 480

gtgatggtgg ccgacggaca gaccacctat aacgactgga cggcaagcag cagcgacctg 540

aacgtacgcc aggcgttcgt cgagctgggc aatctgccga ccttcgaagg cccgttcaaa 600

ggctcgaccc tgtgggccgg gaaacgcttt gaccgcgaca acttcgacat ccactggatt 660

gactcggatg tggtgttcct cgccgggacc ggcggcggga tctacgacgt gaaatggaac 720

gacagcctgc gcagcaactt ctcgttatac ggccgcaact ttggcgatat cgccgacagc 780

agcaacagcg tgcagaacta tatcgtcagc atgaataact ttgccggccc ggtgcagatg 840

atggtcagcg ggatgcgggc gaaagataat gacgaccgcc aggacgcgaa cggcaatctg 900

gtgaaaggcg atgccgctaa caccggggtt catgccctgc tgggcctgca caatgagagc 960

ttctatggcc tgcgcgacgg gaccagcaaa acggccctgc tgtacggcca cgggctgggc 1020

gccgaggtta aaggcatcgg ctccgacggc gcgctgcgcc cgggggccaa tacctggcgc 1080

ttcgccagct atggcactac gccgctgagc gatcgctggt ttattgcccc ggccgtgctg 1140

gcgcagagca gtaaagatcg ttatgtcgat ggcgacagct atcagtgggc caccctcaac 1200

ctgcgtctga ttcaggaagt gacgcagaac ttcgccctcg cctgggaggg cagctatcag 1260

tacatggatc tgcagcctga aggctacaac gatcgccatg cggtcaatgg cagcttctac 1320

aagctgacct tcgccccgac cttcaaggtg ggcagcatcg gcgacttctt ctcgcggccg 1380

gagatccgct tctatacatc gtggatggac tggagcaaaa aactggacaa ctacgccaac 1440

gatgacgcgt taggcagcaa cggattcaaa tcgggcggcg aatggtcgtt cggtatgcaa 1500

atggagacct ggttctgacg gccaccgggg cgacagggta aataacacat aaatataagg 1560

ttcgcggcgc ctgccacggc tggcgccgcc cacgccatat catcatgcat ttagagggta 1620

ctatggattt tgaacagatt tcccgctcac tgcttcccct gctgggcggc aaggaaaata 1680

tcgccagcgc cgcgcactgc gccacccgcc tgcggctggt gctggtcgac gacgcgctcg 1740

ccgatcagca ggcgattggc aaaatcgacg gggtgaaagg ctgctttcgc aatgccggac 1800

agatgcagat catcttcggc accggggtgg tcaataaagt ctatgccgcc tttatccagg 1860

ccgcaggcat cagcgaatcg agcaaatccg aagccgccga cctggcggcg aaaaagctga 1920

acccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctgt ccaacatctt cgtgccgatt attccggcca 1980

tcgtcgcctc cggcctgctg atgggcctgc tggggatggt gaaaacctac ggttgggtcg 2040

acccgagcaa cgctctctat atcatgctgg atatgtgcag ttcggcggcg tttatcattc 2100

tgccgatcct gatcggcttt accgccgccc gcgaatttgg cggtaacccc tatctgggcg 2160

cgaccctcgg cgggatcctc acccacccgg cgctgaccaa cgcctggggc gtcgccgccg 2220

gcttccacac catgaatttc ttcggcatcg aagtggcgat gatcggctac cagggcaccg 2280

tcttcccggt gctgctggcg gtgtggttta tgagcatggt cgagaagcgg ctgcgccgcg 2340

tgatccctga cgcgctggac ctgatcctca ctccgttcct gacggtgatt atctccggct 2400

ttatcgccct gctgctgatc ggcccggccg gtcgcgcgct cggcgacggc atttcgttta 2460

tcctcagcac gcttatcagc catgccggct ggctggcggg cctgctgttc ggcggcctct 2520

attcggtgat cgtcattacc ggtatccatc acagcttcca tgccatcgag gccggactgc 2580

tgggcaaccc atcgattggc gtcaacttcc tgctgccgat ctgggcgatg gccaacgtcg 2640

cccagggcgg cgcctgcttt gcggtgtggt ttaaaaccaa agatgccaaa ataaaagcca 2700

tcaccctgcc gtcggcgttt tcggcgatgc tggggatcac cgaggcggca atcttcggga 2760

ttaacctgcg ctttgtgaaa ccgtttatcg ccgcgctggt gggcggtgcc gccggcggcg 2820

cctgggtggt gtcgatgcac gtctacatga ccgcggtggg cctgacggcg atcccgggaa 2880

tggctatcgt gcaggccagc tcgctgctga actacattat cggaatggcg atcgccttcg 2940

ccgtggcctt cgcgctctct ctgacgctga aatacaaaac ggacgctgaa taatgtcatt 3000

accgtcacgt ctgcctgcga tcctgcaggc cgttatgcag ggccagccgc aggcgctggc 3060

cgacagccat tatccgcaat ggcatctggc gccggtcaac ggactgctga acgatcctaa 3120

cggcttttgc caggtcgccg ggcgttacca cctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg 3180

cgaccatacc tataagtgct ggggacactg gagctctgcc gatctgctgc actggcggca 3240

cgaacctatc gccctgatgc cggatgaaga gtatgaccgc aacggctgct actctggcag 3300

cgcggtcgag ttcgagggtg ccctgactct gtgctacacc ggcaacgtga aattccccga 3360

cggcgggcgc accgcctggc aatgtctggc gaccgagaat gccgatggca ccttccgcaa 3420

gctggggccg gtgctgccgc tgccagaagg ctataccggc catgtgcgcg accctaaagt 3480

gtggcggcag gacgggcgct ggtacatggt tcttggggcg caggatgtgc aacagcgcgg 3540

caaagtgctg ctgtttaccg ccagcgacct gcgggagtgg cgcctggtgg gcgagatcgc 3600

cgggcacgac gtgaacggcc tggcgaacgc cggctacatg tgggagtgcc cggatctctt 3660

tccgctggcg gacacccacc tgctgatctg ctgcccgcag gggctggccc gcgaagcgca 3720

gcgctttctc aatacctatc cggcggtgtg gatggcaggc cgcttcgacg ccgaacgcgg 3780

gatcttcgac cacggcccgc tgcacgagct ggacagcgga tttgagttct acgcgccgca 3840

gaccatgcag gccgacgatg gccgccgcct gctggtcggc tggatgggcg tccccgacgg 3900

ggacgagatg catcagccca cccgcgcgca gggctggatc catcagatga cctgcgtgcg 3960

tgagctggag tggcaggctg gcactctgta tcagcgtccg ctgcgcgagc tggtcgccct 4020

gcgcggggaa gcccagggct ggtgcggaca gaccctgccc ctcgccccga tggagctggc 4080

ctttgacctt tcccccgaca gcacgctggg gctggacttt gccggcgccc tgcagctcac 4140

cgtcaatcgc gacggcctac gtctgtcgcg ccgcggcctg cagacggcag agatgcatca 4200

ccgctactgg cgcggcgagg cgcgacgcct gcggatcttt atcgaccgct ccagcgtgga 4260

gattttcatc aacgatggcg agggggtgat gagcagccgc ttctttccgg gctatccggg 4320

gcagctcatc ttcagcggtg cgacgccggt ggcattctgc cgctggctgc tgcggccatg 4380

catggtagaa taa 4393

<210> 15

<211> 4423

<212> DNA

<213> 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）

<400> 15

atgtacagaa aaagcacact tgcgatgctt atcgctttgc taaccagcgc tgcctcagcc 60

catgcgcaaa cggatataag caccattgaa gcccgactca acgcgctgga aaaacgcctg 120

caggaggcag aaaacagggc gcaaacggcg gaaaaccgcg ccggggcggc ggagaaaaaa 180

gttcagcaac tcaccgcgca gcagcaaaaa aaccagaact cgactcagga agtggctcag 240

cgtaccgcca gacttgagaa aaaagccgat gacaaaagcg gatttgagtt tcacggttac 300

gcccgctccg gcgtgataat gaatgattcc ggcgccagca ccaaatccgg agcctacata 360

acgccggcag gtgaaaccgg cggagctatc ggccgtctgg gaaaccaggc cgatacctat 420

gttgaaatga atcttgaaca taagcagacc ctggataatg gggccacgac ccgctttaag 480

gtgatggtcg ccgacgggca aacctcttat aacgactgga ctgcaagcac cagcgatctg 540

aacgttcgtc aggcctttgt cgaattgggt aacctgccga cgttcgctgg gccatttaag 600

ggctccaccc tgtgggccgg gaaacgtttc gaccgcgaca atttcgatat tcactggatt 660

gactctgatg tcgtgttcct cgccggtacc ggtggtggta tctatgacgt gaagtggaac 720

gacggcctgc ggagtaattt ctccctgtac gggcgtaact tcggcgacat tgatgattcc 780

agcaacagcg tgcagaacta tatcctcacc atgaatcact tcgcaggtcc gctgcagatg 840

atggtcagcg gtctgcgggc gaaggataac gacgagcgta aagatagcaa cggcaatctg 900

gcaaaaggcg atgcggcaaa caccggcgtg catgcgctgc tcggcctgca taacgacagt 960

ttctacggcc tgcgcgacgg tagcagtaaa accgctctgc tttatggtca tggtctgggc 1020

gcagaggtta aaggtatcgg atctgatggc gcacttcgtc cgggagccga cacatggcgc 1080

attgccagtt acggcaccac gccgctcagc gaaaactggt ctgttgcccc ggcaatgctg 1140

gcgcaacgca gtaaagaccg ctatgccgat ggcgacagct atcagtgggc aacattcaac 1200

ctgcgtctga ttcaggcaat caatcagaat ttcgctctcg cctacgaagg cagctaccag 1260

tacatggatc ttaaacccga aggttataac gatcgtcagg cggtgaacgg tagcttctac 1320

aagctcacct tcgccccgac atttaaggtc ggcagtatcg gtgatttctt cagtcgcccg 1380

gagattcgtt tctatacctc ctggatggac tggagcaaaa aactgaataa ttacgccagc 1440

gacgacgccc tgggcagtga cggttttaac tcgggcggcg aatggtcttt cggtgtgcag 1500

atggaaacct ggttctgacg cttacgcctg atgacaggaa tagccggggg tcagagcatc 1560

tttgtcaccc cggactcaac taagacgcag aaaaagcgct cccgtgaacg cgggacgaca 1620

acataaaaat gtttaagcct taagagggta ctatggattt tgaacagatt tcctgctcgc 1680

tgcttccgct tcttggaggc aaagaaaata tcgccagcgc cgcgcactgc gccacgcgcc 1740

tgcgcctggt gctggtcgat gattcgctgg ccgaccagca ggccatcggc aaagttgaag 1800

gggtgaaggg ctgttttcgt aatgccggac agatgcagat tattttcggc accggggtgg 1860

taaataaggt ctacgctgcc tttactcagg cggcgggtat tagcgaatcc agcaaatcgg 1920

aagccgccga catcgcggca aaaaagctca atccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctat 1980

caaacatctt cgtgccgata atccctgcca tcgtcgcctc tggtctgctg atgggcctgc 2040

tgggaatggt caaaacatac ggctgggttg acccgggcaa cgccatctac atcatgctgg 2100

atatgtgcag ctcggcggca tttatcattc tgccgattct gattggcttt accgccgccc 2160

gcgaattcgg cggtaatcct tatctcggcg cgacgcttgg cggcattctg actcatccag 2220

cgctgactaa cgcctggggc gtggccgcgg gtttccacac catgaacttt ttcggcttcg 2280

aaattgccat gatcggctat cagggtacgg tgttcccggt actgctggca gtatggttta 2340

tgagcatcgt tgagaagcag ttgcgtcgcg caatccccga tgccctggat ttgatcctga 2400

cgccgttcct gacggtgatt atatccggtt ttatcgccct gttgattatc ggcccggccg 2460

gtcgcgcact gggcgacggt atctcgtttg tcctcagcac cctgattagc cacgccggct 2520

ggctcgccgg gttactgttt ggcggtctct attcagttat cgtcattacc ggtattcatc 2580

acagcttcca tgcggttgaa gccgggttgc tgggcaatcc ctccatcggc gtcaacttcc 2640

tgctgccgat ttgggcgatg gccaacgtcg ctcagggcgg agcctgtctg gcggtgtggt 2700

tcaaaaccaa agatgcaaaa attaaagcca ttactctgcc ctcggcgttt tccgccatgc 2760

tgggcatcac cgaggcggcg atttttggta ttaacctgcg ctttgtgaag ccatttattg 2820

cggcgctgat tggtggtgcg gcgggcggcg catgggtggt atctgtacac gtctacatga 2880

ccgcggtcgg cttgacagcg atccccggca tggccatcgt gcaggccagt tcgctgttga 2940

actacattat cgggatggtt atcgcctttg gcgtcgcctt tacggtctcc ctggttttga 3000

aatacaaaac ggacgctgaa taatgtctct tccatcacga ctgcctgcga ttttgcaggc 3060

cgtaatgcag ggccagccgc gcgcgctggc cgatagccac tatccgcgct ggcaccatgc 3120

gccggtcacc gggctgatga acgaccccaa cggctttatc gaatttgccg gacgctatca 3180

tctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg cgatcatacg tttaagtgct gggcgcactg 3240

gagttccatc gatctgctgc actggcagca tgagcccatt gcgctgatgc cggacgaaga 3300

gtatgaccgt aacggctgct actccggcag cgcggtggat aacaacggta cgcttaccct 3360

gtgctatacc ggcaacgtga agtttgccga gggagggcga accgcctggc aatgcctggc 3420

aacggaaaac gctgacggca ccttccgcaa aatcggtccg gtcctgccgc tgccggaggg 3480

ctacaccggc cacgtgcgcg acccaaaagt ctggcgacac gaagacctgt ggtacatggt 3540

gctgggcgcg caggatcggc aaaagcgcgg caaggtgctg ctgttcagct ctgcggatct 3600

ccatcagtgg acgagtatgg gtgaaatcgc cggccacggc atcaatggcc tcgacgacgt 3660

cggctatatg tgggagtgcc cggatctttt tccactcggc gaccagcata ttctaatctg 3720

ctgtccgcag gggattgccc gtgaggaaga gtgctacctg aacacctacc cggcagtatg 3780

gatggcgggc gagtttgatt acgctgctgg cgctttcaga cacggcgaac tgcacgaact 3840

ggacgccggg tttgagttct acgccccgca aaccatgctt accagtgatg gccgtcgtct 3900

gctggtcggc tggatgggcg tgccggaggg cgaagagatg cttcagccga ccctgaacaa 3960

cggctggatc catcagatga cctgcctgcg tgagctggag tttatcaacg gtcagctcta 4020

tcagcgtccg ctacgggaac tgagcgccct gcgcggtgaa gcgaacggct ggtcggggaa 4080

cgccctgccg ctggcaccga tggaaatcga tttgcaaacc cgcgggggcg atatgttgag 4140

cctcgatttt ggcggcgtat taacccttga gtgcgatgcc agcggactcc gcctggcccg 4200

acgcagtctc gccagtgacg agatgcatta tcgttactgg cgcggaaacg tccgctcgct 4260

gcgtgttttc atcgaccagt cgagcgtgga gattttcata aacggcggtg aaggggtgat 4320

gagcagccgc tacttcccgg cctgctccgg tcagctaaca ttctccggca tcacgccgga 4380

cgcattctgc tactggccgc tgcgaacttg catggtagaa taa 4423

<210> 16

<211> 3883

<212> DNA

<213> 东方马脑脊髓炎病毒（Eastern equine encephalomyelitis virus）

<400> 16

ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc tcgcgttttt tactcaagaa 60

gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa attgcgaaga aaactgtctg 120

gtagcctgcg tggtcaaaga gtatcccagt cggcgttgaa agcagcacaa tcccaagcga 180

actggcaatt tgaaaaccaa tcagaaagat cgtcgacgac aggcgcttat caaagtttgc 240

cacgctgtat ttgaagacgg atatgacaca aagtggaacc tcaatggcat gtaacaactt 300

cactaatgaa ataatccagg ggttaacgaa cagcgcgcag gaaaggatac gcaacgccat 360

aatcacaact ccgataagta atgcattttt tggccctacc cgattcacaa agaaaggaat 420

aatcgccatg cacagcgctt cgagtaccac ctggaatgag ttgagataac catacaggcg 480

cgttcctaca tcgtgtgatt cgaataaacc tgaataaaag acaggaaaaa gttgttgatc 540

aaaaatgtta tagaaagacc acgtccccac aataaatatg acgaaaaccc agaagtttcg 600

atccttgaaa actgcgataa aatcctcttt ttttacccct cccgcatctg ccgctacgca 660

ctggtgatcc ttatctttaa aacgcatgtt gatcatcata aatacagcgc caaatagcga 720

gaccaaccag aagttgatat ggggactgat actaaaaaat atgccggcaa agaacgcgcc 780

aatagcatag ccaaaagatc cccaggcgcg cgctgttcca tattcgaaat gaaaatttcg 840

cgccattttt tcggtgaagc tatcaagcaa accgcatccc gccagatacc ccaagccaaa 900

aaatagcgcc cccagaatta gacctacaga aaaattgctt tgcagtaacg gttcataaac 960

gtaaatcata aacggtccgg tcaagaccag gatgaaactc atacaccaga tgagcggttt 1020

cttcagaccg agtttatcct gaacgatgcc gtagaacatc ataaatagaa tgctggtaaa 1080

ctggttgacc gaataaagtg tacctaattc cgtccctgtc aaccctagat gtcctttcag 1140

ccaaatagcg tataacgacc accacagcga ccaggaaata aaaaagagaa atgagtaact 1200

ggatgcaaaa cgatagtacg catttctgaa tggaatattc agtgccataa ttacctgcct 1260

gtcgttaaaa aattcacgtc ctatttagag ataagagcga cttcgccgtt tacttctcac 1320

tattccagtt cttgtcgaca tggcagcgct gtcattgccc ctttcgccgt tactgcaagc 1380

gctccgcaac gttgagcgag atcgataatt cgtcgcattt ctctctcatc tgtagataat 1440

cccgtagagg acagacctgt gagtaacccg gcaacgaacg catctcccgc ccccgtgcta 1500

tcgacacaat tcacagacat tccagcaaaa tggtgaactt gtcctcgata acagaccacc 1560

accccttctg cacctttagt caccaacagc atggcgatct catactcttt tgccagggcg 1620

catatatcct gatcgttctg tgtttttcca ctgataagtc gccattcttc ttccgagagc 1680

ttgacgacat ccgccagttg tagcgcctgc cgcaaacaca agcggagcaa atgctcgtct 1740

tgccatagat cttcacgaat attaggatcg aagctgacaa aacctccggc atgccggatc 1800

gccgtcatcg cagtaaatgc gctggtacgc gaaggctcgg cagacaacgc aattgaacag 1860

agatgtaacc attcgccatg tcgccagcag ggcaagtctg tcgtctctaa aaaaagatcg 1920

gcactggggc ggaccataaa cgtaaatgaa cgttcccctt gatcgttcag atcgacaagc 1980

accgtggatg tccggtgcca ttcatcttgc ttcagatacg tgatatcgac tccctcagtt 2040

agcagcgttc tttgcattaa cgcaccaaaa ggatcatccc ccacccgacc tataaaccca 2100

cttgttccgc ctaatctggc gattcccacc gcaacgttag ctggcgcgcc gccaggacaa 2160

ggcagtaggc gcccgtctga ttctggcaag agatctacga ccgcatcccc taaaacccat 2220

actttggctg acattttttt cccttaaatt catctgagtt acgcatagtg ataaacctct 2280

ttttcgcaaa atcgtcatgg atttactaaa acatgcatat tcgatcacaa aacgtcatag 2340

ttaacgttaa catttgtgat attcatcgca tttatgaaag taagggactt tatttttata 2400

aaagttaacg ttaacaattc accaaatttg cttaaccagg atgattaaaa tgacgcaatc 2460

tcgattgcat gcggcgcaaa acgccctagc aaaacttcat gagcaccggg gtaacacttt 2520

ctatccccat tttcacctcg cgcctcctgc cgggtggatg aacgatccaa acggcctgat 2580

ctggtttaac gatcgttatc acgcgtttta tcaacatcat ccgatgagcg aacactgggg 2640

gccaatgcac tggggacatg ccaccagcga cgatatgatc cactggcagc atgagcctat 2700

tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa agacgggtgt ttttcaggta gtgctgtcga 2760

tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac cggacacgtc tggctcgatg gtgcaggtaa 2820

tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct ggctaccagt cgggatggta ttcatttcga 2880

gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga aggaatcatg cacttccgcg atcctaaagt 2940

gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt agtcggggcg aaagatccag gcaacacggg 3000

gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt gcgtgaatgg accttcgatc gcgtactggc 3060

ccacgctgat gcgggtgaaa gctatatgtg ggaatgtccg gactttttca gccttggcga 3120

tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg aatgaatgcc gagggataca gttaccgaaa 3180

tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat gtggtcgcca ggacgacttt ttgcacaatc 3240

cgggcatttt actgaacttg ataacgggca tgacttttat gcaccacaaa gctttttagc 3300

gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg gatggatatg tgggaatcgc caatgccctc 3360

aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac gctggcgcgc gagctatcag agagcaatgg 3420

caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc tgagtcgtta cgccagcagc atcaatctgt 3480

ctctccccgc acaatcagca ataaatatgt tttgcaggaa aacgcgcaag cagttgagat 3540

tcagttgcag tgggcgctga agaacagtga tgccgaacat tacggattac agctcggcac 3600

tggaatgcgg ctgtatattg ataaccaatc tgagcgactt gttttgtggc ggtattaccc 3660

acacgagaat ttagacggct accgtagtat tcccctcccg cagcgtgaca cgctcgccct 3720

aaggatattt atcgatacat catccgtgga agtatttatt aacgacgggg aagcggtgat 3780

gagtagtcga atctatccgc agccagaaga acgggaactg tcgctttatg cctcccacgg 3840

agtggctgtg ctgcaacatg gagcactctg gctactgggt taa 3883

Claims

1.一种用于生产目的碳水化合物的遗传工程化的微生物细胞，其中与野生型细胞相比，所述微生物细胞具有增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性，并且当在包含混合单糖原料作为主要碳源和能源的培养基中培养时产生目的碳水化合物，其中所述混合单糖原料由葡萄糖和至少一种选自果糖和半乳糖的额外单糖组成。

2.根据权利要求1所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含用于细胞内形成UDP-半乳糖的UDP-半乳糖生物合成途径。

3.根据权利要求1或2所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含用于细胞内形成GDP-L-岩藻糖的GDP-岩藻糖生物合成途径。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成途径，用于细胞内形成UDP-N-乙酰葡糖胺。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含CMP-N-乙酰神经氨酸/CMP-唾液酸生物合成途径，用于细胞内形成CMP-N-乙酰神经氨酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含至少一种糖基转移酶。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含增强的磷酸烯醇丙酮酸的合成。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含至少一种单糖转运蛋白，用于将单糖从培养基转运到微生物细胞的细胞质中。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含降低的或减少的至少一个编码与所需碳水化合物的生物合成竞争的蛋白质的基因的表达和/或降低的或减少的至少一种与目的碳水化合物的生物合成竞争的蛋白质的活性。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中在所述工程化的微生物内导致消耗所述细胞内磷酸糖的蛋白质选自磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统的组分。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述遗传工程化的微生物细胞还包含至少一种从细胞输出目的碳水化合物的输出蛋白或通透酶。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞用于生产目的碳水化合物的用途。

13.一种用于发酵生产目的碳水化合物的方法，所述方法包括：

a)提供能够产生所需碳水化合物的遗传工程化的微生物，其中由于降低的和/或减少的至少一种导致消耗所述工程化的微生物内的所述细胞内磷酸糖的蛋白质的表达和/或活性，所述微生物表现出增加的至少一种磷酸糖的细胞内可用性；

b)在允许产生所述所需碳水化合物的培养基中培养所述遗传工程化的微生物，其中所述主要碳源是由葡萄糖以及果糖和半乳糖的至少一种第二单糖组成的单糖混合物；和

c)回收所述目的碳水化合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述目的碳水化合物选自甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神经氨酸、乳-N-二糖、N-乙酰乳糖胺、2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、血型H抗原I型、血型H抗原II型、血型抗原Lewis^a、血型抗原Lewis^b、血型抗原Lewis^x、血型抗原Lewis^y、血型抗原Sialyl-Lewis^x、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-新岩藻戊糖I、乳-N-岩藻戊糖II、乳-N-岩藻戊糖III、乳-N-岩藻戊糖V、乳-N-新岩藻戊糖V、乳-N-二岩藻己糖I、乳-N-二岩藻己糖II、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-N-己糖、乳-N-新己糖、对-乳-N-己糖、对-乳-N-新己糖、二岩藻糖基-乳-N-新己糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、3’-唾液酸-N-乙酰乳糖胺、6’-唾液酸-N-乙酰乳糖胺、乳-N-唾液酸戊糖a、乳-N-唾液酸戊糖b、乳-N-唾液酸戊糖c、岩藻糖基-乳-N-唾液酸戊糖a、岩藻糖基-乳-N-唾液酸戊糖b、岩藻糖基-乳-N-唾液酸戊糖c、二唾液酸-乳-N-四糖、二唾液酸-乳-N-岩藻戊糖、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、3-岩藻糖基-6’-唾液酸乳糖、乳-N-新二岩藻己糖I。

15.由根据权利要求1至11中任一项所述的微生物细胞和/或根据权利要求13至14中任一项所述的方法产生的目的碳水化合物在制备药物和/或营养组合物中的用途。