CN101899476A - 利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法 - Google Patents
利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101899476A CN101899476A CN2009101482585A CN200910148258A CN101899476A CN 101899476 A CN101899476 A CN 101899476A CN 2009101482585 A CN2009101482585 A CN 2009101482585A CN 200910148258 A CN200910148258 A CN 200910148258A CN 101899476 A CN101899476 A CN 101899476A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zymomonas mobilis
- steps
- xylose
- reorganization
- liquid medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，步骤为：A)将重组运动发酵单胞菌按1％(v/v)的接种量接种到100mL内含30-50μg·mL-1的卡那霉素或氨苄青霉素的T液体培养液(含：酵母提取物10g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O1g/L、(NH4)2SO41g/L、木糖20g/L)中，20-30℃静置进行培养至OD600＝1.0时，培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取上清液；B)准确量取20ml发酵液加入圆底烧瓶中，在加入20ml水后置于蒸馏装置上收集馏出液20ml，利用气相色谱测定乙醇浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种发酵木糖产燃料乙醇的方法，具体地是一种利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法。
背景技术
木质纤维素是一种非均相聚合糖和木质素的复合物，主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。三者各占的比例随植物的不同部分而有所区别，大概的比例为：纤维素占：40-50％，半纤维素占25-30％，木质素占10-20％(Nancy H，et al，1998)。其中天然半纤维素水解产物的85-90％是木糖，如果植物纤维素中的木糖亦能通过发酵生产乙醇，则能使木质纤维素原料乙醇发酵的产量在原有基础之上增加25％。因此，木糖是否被高效利用是决定木质纤维素资源利用经济性的关键因素。
许多微生物可以木糖为碳源，但仅有少数细菌、酵母菌和真菌可发酵木糖产乙醇。但这些天然菌株也存在一些缺点，例如：乙醇得率较低，对水解物中低浓度抑制物敏感，乙醇耐受性低等。另一方面，高产乙醇的菌株如酿酒酵母、运动发酵单胞菌等，其可利用碳源范围往往有限，一般不能利用木糖。因此，人们试图通过基因工程手段构建新的重组菌，使其高效发酵木质纤维素水解液组分(包括木糖和葡萄糖)产醇。
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)为微好氧菌，可在好氧和厌氧条件下生长，但更喜欢在厌氧条件代谢产醇。运动发酵单胞菌是目前唯一一种通过ED途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，与酵母菌相比，运动发酵单胞菌的优点在于：具有更高的糖吸收量和乙醇产量；生物量产量低；乙醇耐受性高；发酵无需氧气；易于遗传操作等(Jeffries，2005)。但其底物范围窄，只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖，不能利用木糖。独特的代谢途径及其所具有的优点使其成为构建产乙醇工程菌的首选宿主之一。
近年来，通过基因工程手段来改造Z.mobilis使之能代谢木糖的研究已受到越来越多人的关注。Zhang等在1995年首次将与木糖代谢相关的4个基因转化到运动发酵单胞菌中，并且成功表达。获得的重组菌株CP4(pZB5)可在以木糖为唯一碳源的培养基上生长，乙醇产量达到了理论量的30％(Zhang etal，1995)；Mohagheghi等将发酵木糖和阿拉伯糖所需的7个基因整合到运动发酵单胞菌染色体上的特异位点-乳酸脱氢酶基因(ldh)中，获得了一株稳定的重组菌AX101，在赋予新菌株发酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同时，也减少了副产物乳酸的生成(Mohagheghi et al，2002)；2002年，Lawford等对重组Z.mobilis AX101的木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的混合糖发酵进行了分析，结果表明：与乙醇相比，乙酸对生长的抑制作用更大；乙醇会加速乙酸对戊糖利用的抑制；乙酸和乙醇对戊糖的利用具有同样的影响(Lawford and Rousseau，2002)。
上述改造Z.mobilis使之能够发酵木糖的总体思路是：在运动发酵单胞菌中高效表达木糖代谢相关的4个基因：糖异构酶基因(xylA)和木酮糖激酶基因(xylB)负责将木糖转化成磷酸戊糖途径的重要中间物——木酮糖-5-磷酸，转酮醇酶基因(tktA)和转醛醇酶基因(talB)负责将木酮糖-5-磷酸通过磷酸戊糖途径转化成ED途径的中间物再进入ED途径生成丙酮酸，其间转换步骤冗长，牵涉的基因亦很多，进而造成发酵木糖产乙醇的效率不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，以克服背景技术中的不足之处。
为实现上述目的，本发明提供的利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，主要步骤为：
A)将重组运动发酵单胞菌接种到卡那霉素或氨苄青霉素的T液体培养液中，于20-30℃下培养至OD600＝1.0时，取上清液；
B)将上清液加入水后收集馏出液，用气相色谱测定乙醇浓度。
步骤A所述T液体培养液为100mL内含30-50μg·mL-1的卡那霉素或氨苄青霉素。
步骤A所述的T液体培养液含有：酵母提取物、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4和木糖。其中，酵母提取物为10g/L、KH2PO4为2g/L、MgSO4·7H2O为1g/L、(NH4)2SO4为1g/L、木糖为20g/L。
所述的接种是按体积比1％的接种量接种到T液体培养液。
步骤A所述的取上清液是将培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟后取上清液。
步骤A所述的重组运动发酵单胞菌，是以不同细菌基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到载体pUC19，pZB21上，转入运动发酵单胞菌中，筛选获得阳性重组质粒，重组质粒在运动发酵单胞菌中表达后，获得重组运动发酵单胞菌。
与公知技术相比，本发明具有以下优点：
本发明在运动发酵单胞菌中重组一种新的木糖代谢途径。该代谢途径只需经过四步催化反应就能将木糖转化为丙酮酸，进而生成乙醇，克服了以往使木糖至丙酮酸需经过PPP及ED冗长途经问题。
具体实施方式
本发明提供了一种新的重组Z.mobilis制备燃料乙醇的方法。本发明在Z.mobilis中重组入新的有效的木糖代谢途径，为Z.mobilis利用木糖产燃料乙醇提供新的方法。
为实现上述目的，本发明提供的重组Z.mobilis发酵木糖产燃料乙醇的方法，步骤为：
A)将重组运动发酵单胞菌按1％(v/v)的接种量接种到100mL内含30-50μg·mL-1的卡那霉素或氨苄青霉素的T液体培养液(酵母提取物10g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO41g/L，木糖20g/L)中，30℃静置进行培养至OD600(optical density，光密度)＝1.0时，培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取上清液；
B)准确量取20ml发酵液加入圆底烧瓶中，在加入20ml水后置于蒸馏装置上收集馏出液20ml，利用气相色谱测定乙醇浓度。
本发明中，步骤A的重组运动发酵单胞菌，是以不同细菌中基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到载体pUC19，pZB21上，转入运动发酵单胞菌中，筛选获得阳性重组质粒，重组质粒在运动发酵单胞菌中表达后，获得重组运动发酵单胞菌。
本发明中，步骤B中的测定乙醇浓度的气相色谱分析条件为：型号为AGILENT6890；色谱柱为HP-INNOWax 0.25mm×30m×0.25μm；进样量为1μl；检测器为热导TCD检测器，180℃；分流比为50∶1；载气为氦气；柱温为50℃，3min，10℃/min，150℃，2min；进样口温度为200℃。
本发明提供的重组发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，克服了木糖至丙酮酸需经过PPP及ED冗长途经问题，提供一种新的木糖代谢途径方式：只经四步反应即可将木糖转化至丙酮酸。本发明通过以下技术方案解决这一技术问题：以其他细菌基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到穿梭载体pUC19，pZB21上，转入运动发酵单胞菌中，筛选获得阳性重组质粒，质粒经纯化、电泳检测鉴定目的基因。重组质粒在运动发酵单胞菌中组成表达后，通过蒸馏发酵液即可获得燃料乙醇。
重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的具体实验步骤如下：
(一)木糖代谢调控基因的克隆及重组载体构建
1.1D-木糖脱氢酶基因的克隆
提取细菌新月柄杆菌(Caulobacter crescentus NA 1000)(ATCC 19089)基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增克隆下列基因：
xylB：xylose dehydrogenase(NCBI：CC0821)；扩增引物序列为：
上游引物：5‘-ATGTCCTCAGCCATCTATCCCA-3’
下游引物：5‘-TCAACGCCAGCCGGCGTCGATC-3’
xylC：xylonolactonase(NCBI：CC0820)；扩增引物序列为：
上游引物：5‘-ATGACCGCTCAAGTCACTTGCGT-3’
下游引物：5‘-TTAGACAAGGCGGACCTCATGC-3’
xylD：xylonate dehydratase(NCBI：CC0819)；扩增引物序列为：
上游引物：5‘-ATGAGGTCCGCCTTGTCTAA-3’
下游引物：5‘-TCAGTGGTTGTGGCGGGGCAGCT-3’
再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
1.22-酮酸醛缩酶基因的克隆
提取大肠杆菌(E.coli DH5a)基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增克隆2-酮酸醛缩酶基因(yagE)(NCBI：AP00478)，再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
yagE引物序列如下：
上游引物：5‘-ATGATTCAGCAAGGAGATCTCAT-3’
下游引物：5‘-TCAGCAAAGCTTGAGCTGTTGCA-3’
1.3运动发酵单胞菌启动子的克隆
提取运动发酵单胞菌(Z.mobilis CP4)(购自中国工业微生物菌种保藏中心)基因组DNA，根据GenBank序列(eno：M99380；gap：M18802)设计引物，PCR扩增克隆启动子Peno(烯醇化酶启动子)及Pgap(3-磷酸甘油醛启动子)。
eno基因扩增引物序列：
上游引物：5‘-ATGACAGCTATTGTCAGTATCCA-3’
下游引物：5‘-TTATTTGGCTTTTCTAAGAA-3’
gap基因扩增引物序列：
上游引物：5‘-ATGGCGGTTAAAGTTGCGATTA-3’
下游引物：5‘-CTAGAGCGTTTTAGCCATCTG-3’
1.4pZB-Peno-xylB/xylC-Pgap-xylD/yagE重组载体的构建酶
1.4.1pUC-Peno-xylB载体的构建
将克隆的Peno启动子与载体pUC19(华美生物工程公司)用相同的酶(EcoRI)进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pUC-Peno。
再将克隆xylB基因与pUC-Peno载体用相同的酶(BglII)进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pUC-Peno-xylB。
1.4.2pUC-Peno-xylB/xylC载体的构建
将克隆xylC基因与pUC-Peno-xylB重组质粒用相同的酶(BglII)进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pUC-Peno-xylB/xylC。
1.4.3pZB-Pgap-xylD载体的构建
将克隆的Pgap启动子与载体pZB(以Z.mobilis ATCC 10988(美国ATCC菌种保藏中心)中内源质粒pZM2和质粒pBR322(购自上海生物工程有限公司)为出发质粒。首先制备含pZM2的复制区的DNA片段，用相同的酶(NdeI和SalI)酶切pZM2的复制区的DNA片段和pBR322质粒，将pZM2的复制区插入到pBR322的四环素抗性基因中，构建出重组质粒pZB(Apr，Cmr，pZM2复制区)。用相同的酶(EcoRI)进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pZB-Pgap。再将克隆xylD基因与pZB-Pgap载体用相同的酶(SalI)进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pZB-Pgap-xylD。
1.4.4pZB-Pgap-xylD/yagE载体的构建
将克隆yagE基因与pZB-Pgap-xylD重组质粒用相同的酶(SalI)进行酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pZB-Pgap-xylD/yagE。
1.4.5pZB-Peno-xylB/xylC-Pgap-xylD/yagE重组载体的构建
用限制性酶(EcoRI和HindIII)酶切重组载体pUC-Peno-xylB/xylC获得Peno-xylB/xylC片段，再用相同的酶(EcoRI和HindIII)酶切pZB-Pgap-xylD/yagE载体，载体与外源片段按摩尔比1∶3-10的比例，16℃连接过夜，获得重组载体pZB-Peno-xylB/xylC-Pgap-xylD/yagE。
(二)重组运动发酵单胞菌的获得
将构建好的重组载体电击转化到运动发酵单胞菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌，即获得了含有木糖代谢途径的重组运动发酵单胞菌；-80℃保存该菌株。
(三)燃料乙醇的合成
将重组运动发酵单胞菌按1％(v/v)的接种量接种到400-500mL内含30-50μg·mL-1的卡那霉素或氨苄青霉素的T液体培养液(酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO41g/L，木糖20g/L)中，30℃静置进行培养至OD600＝1.0时，培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟，取含燃料乙醇的发酵液保存；
(四)燃料乙醇的测定
准确量取20ml离心后的发酵液加入圆底烧瓶中，在加入20ml水后置于蒸馏装置上收集馏出液20ml，利用气相色谱测定乙醇浓度。测定乙醇浓度的气相色谱分析条件为：型号为AGILENT6890色谱柱为HP-INNOWax 0.25mm×30m×0.25μm；进样量为1μl；检测器为热导TCD检测器，180℃；分流比为50∶1；载气为氦气；柱温为50℃，3min，10℃/min，150℃，2min；进样口温度为200℃。
Claims (7)
1.一种利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法，主要步骤为：
A)将重组运动发酵单胞菌接种到卡那霉素或氨苄青霉素的T液体培养液中，于20-30℃下培养至OD600＝1.0时，取上清液；
B)将上清液加入水后收集馏出液，用气相色谱测定乙醇浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤A所述T液体培养液为100mL内含30-50μg·mL-1的卡那霉素或氨苄青霉素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤A所述的T液体培养液含有：酵母提取物、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4和木糖。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述酵母提取物为10g/L、KH2PO4为2g/L、MgSO4·7H2O为1g/L、(NH4)2SO4为1g/L、木糖为20g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤A所述的接种是按体积比1％的接种量接种到T液体培养液。
6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤A所述r的取上清液是将培养液在8000-1000rpm条件下，离心5-10分钟后取上清液。
7.如权利要求1所述的方法，其中，步骤A所述的重组运动发酵单胞菌，是以不同细菌基因组DNA为模版，PCR扩增获得目的基因，酶切后，连接到载体pUC19，pZB21上，转入运动发酵单胞菌中，筛选获得阳性重组质粒，重组质粒在运动发酵单胞菌中表达后，获得重组运动发酵单胞菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009101482585A CN101899476A (zh) | 2009-06-19 | 2009-06-19 | 利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009101482585A CN101899476A (zh) | 2009-06-19 | 2009-06-19 | 利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101899476A true CN101899476A (zh) | 2010-12-01 |
Family
ID=43225395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009101482585A Pending CN101899476A (zh) | 2009-06-19 | 2009-06-19 | 利用重组运动发酵单胞菌发酵木糖产燃料乙醇的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101899476A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102604850A (zh) * | 2012-03-29 | 2012-07-25 | 山东大学 | 一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株 |
| CN102807998A (zh) * | 2012-08-29 | 2012-12-05 | 太仓同济化工原料厂 | 一种利用运动发酵单胞菌制取乙醇的方法 |
| CN114480232A (zh) * | 2020-10-26 | 2022-05-13 | 北京化工大学 | 生产丙二酸的工程菌及其构建方法和应用 |
-
2009
- 2009-06-19 CN CN2009101482585A patent/CN101899476A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102604850A (zh) * | 2012-03-29 | 2012-07-25 | 山东大学 | 一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株 |
| CN102604850B (zh) * | 2012-03-29 | 2013-03-06 | 山东大学 | 一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株 |
| CN102807998A (zh) * | 2012-08-29 | 2012-12-05 | 太仓同济化工原料厂 | 一种利用运动发酵单胞菌制取乙醇的方法 |
| CN114480232A (zh) * | 2020-10-26 | 2022-05-13 | 北京化工大学 | 生产丙二酸的工程菌及其构建方法和应用 |
| CN114480232B (zh) * | 2020-10-26 | 2024-02-02 | 北京化工大学 | 生产丙二酸的工程菌及其构建方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lin et al. | Factors affecting ethanol fermentation using Saccharomyces cerevisiae BY4742 | |
| Hou | Anaerobic xylose fermentation by Spathaspora passalidarum | |
| Cheng et al. | Engineering Clostridium for improved solvent production: recent progress and perspective | |
| Mohagheghi et al. | Cofermentation of glucose, xylose, and arabinose by genomic DNA-lntegrated xylose/arabinose fermenting strain of zymomonas mobilis ax101 | |
| Gottumukkala et al. | Trends and advances in conversion of lignocellulosic biomass to biobutanol: microbes, bioprocesses and industrial viability | |
| Öhgren et al. | Simultaneous saccharification and co-fermentation of glucose and xylose in steam-pretreated corn stover at high fiber content with Saccharomyces cerevisiae TMB3400 | |
| Sedlak et al. | Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineered Saccharomyces yeast capable of cofermenting glucose and xylose | |
| Rudolf et al. | Simultaneous saccharification and fermentation of steam‐pretreated bagasse using Saccharomyces cerevisiae TMB3400 and Pichia stipitis CBS6054 | |
| Yu et al. | WITHDRAWN: Ethanol fermentation of acid-hydrolyzed cellulosic pyrolysate with Saccharomyces cerevisiae | |
| Heer et al. | Identification of furfural as a key toxin in lignocellulosic hydrolysates and evolution of a tolerant yeast strain | |
| Wang et al. | Engineering clostridia for butanol production from biorenewable resources: from cells to process integration | |
| Erdei et al. | Separate hydrolysis and co-fermentation for improved xylose utilization in integrated ethanol production from wheat meal and wheat straw | |
| Li et al. | Bioethanol production from rice straw by a sequential use of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis with heat inactivation of Saccharomyces cerevisiae cells prior to xylose fermentation | |
| US10724056B2 (en) | Method of producing alcohol with a Pichia stipitis strain | |
| Chu et al. | Simultaneous saccharification and ethanol fermentation of corn stover at high temperature and high solids loading by a thermotolerant strain Saccharomyces cerevisiae DQ1 | |
| Bellido et al. | Influence of aeration on bioethanol production from ozonized wheat straw hydrolysates using Pichia stipitis | |
| Flores et al. | Simultaneous saccharification and fermentation of Agave tequilana fructans by Kluyveromyces marxianus yeasts for bioethanol and tequila production | |
| Tomás-Pejó et al. | Effect of different cellulase dosages on cell viability and ethanol production by Kluyveromyces marxianus in SSF processes | |
| Yu et al. | Ethanol fermentation of acid-hydrolyzed cellulosic pyrolysate with Saccharomyces cerevisiae | |
| Zhao et al. | Influence of various glucose/xylose mixtures on ethanol production by Pachysolen tannophilus | |
| Cubas-Cano et al. | Towards sequential bioethanol and l-lactic acid co-generation: Improving xylose conversion to l-lactic acid in presence of lignocellulosic ethanol with an evolved Bacillus coagulans | |
| CN102220254B (zh) | 一种重组酿酒酵母工程菌株及其应用 | |
| Qi et al. | CaCO 3 supplementation alleviates the inhibition of formic acid on acetone/butanol/ethanol fermentation by Clostridium acetobutylicum | |
| Safari et al. | Integrated ethanol and biogas production from pinewood | |
| TWI540208B (zh) | 用於培養酵母菌細胞的種菌培養基及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101201 |