CN113025511A - 一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌e4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4，将木糖醇脱氢酶基因XYL2通过基因工程构建重组质粒pTIC‑Ppgk‑XYL2‑Tcyc1，再将pTIC‑Ppgk‑XYL2‑Tcyc1转化到酿酒酵母SF4，构建酿酒酵母工程菌E4；其中，所述木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明公开的酿酒酵母工程菌E4提高了木糖醇脱氢酶XYL2在酿酒酵母核外的表达量，解决酿酒酵母中氧化还原不平衡的问题，进而提高了酿酒酵母工程菌代谢木糖和生产乙醇的能力；同时，经试验验证该菌种可以明显提高小麦、玉米以及芒草秸秆中木糖分解产乙醇的能力，为第二代生物能源的生产提供数据基础。

Description

一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一株高效代谢木糖的转基因酵母工程菌E4及其应用。

背景技术

随着化石能源造成的温室效应日益严峻，第二代生物能源成为未来最具应用可能的新能源之一。若能绿色低成本高产出地生产生物乙醇，不仅具有重要的科学意义，亦具有重大的经济效益和战略价值。野生酿酒酵母的发酵过程中，木糖通常不能被利用，重组酿酒酵母已能代谢木糖并生产乙醇，但其利用速率和效率均有待提高。

氧化还原不平衡通常是造成酿酒酵母发酵能力低下的主效因子，各国科研工作者已有一定研究：Ohgren等(2006)在培养基中添加了外源电子受体后提高了木糖利用能力；Sonderegger等(2004)通过重组PPP途径的磷酸转乙酰化酶或乙醛脱氢酶改善碳通路；Zuo等(2013)改变XR和XDH辅因子的偏好性亦可提高木糖利用率，增加乙醇产率。中国专利CN106701605A公开了一种利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4，通过寡肽链链接木糖还原酶XYL1和木糖醇脱氢酶XYL2，同时表达木酮糖激酶XKS，木糖利用率和乙醇产量显著提高，但其在葡萄糖和木糖共发酵时木糖利用率仅为53.8％，氧化还原不平衡导致木糖利用率较低。因此，有效调节木糖代谢转化过程中的氧化还原平衡，对提高木糖利用效率并增加乙醇产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株高效代谢木糖的转基因酵母工程菌E4及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，提高了木糖醇脱氢酶XYL2在酿酒酵母核外的表达量，解决酿酒酵母中氧化还原不平衡的问题，进而提高了酿酒酵母工程菌代谢木糖和生产乙醇的能力。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌(Saccharomycescerevisiae) E4，将木糖醇脱氢酶基因XYL2通过基因工程构建重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1，再将pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1转化到酿酒酵母SF4，构建酿酒酵母工程菌E4；

其中，所述木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述酿酒酵母工程菌E4于2020年12月04日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2020855。

优选的是，重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1的构建方法包括以下步骤：

a：以热带假丝酵母基因组DNA为模板，采用引物P1和P2，克隆木糖醇脱氢酶基因XYL2，并构建含有启动子PGK、终止子CYC1的表达单元PGK-XYL2-CYC1；

b：将所述表达单元PGK-XYL2-CYC1插入酿酒酵母表达载体pTIC中，构建重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1。

优选的是，P1：5’-ATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’；P2： 5’-CTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’。

优选的是，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SF4，于2016年10月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学；保藏编号为CCTCCNO： M2016563。

本发明提供一种所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4的应用，应用于禾本科植物秸秆水解产物的乙醇发酵中。

优选的是，所述禾本科植物为小麦、玉米或芒草。

本发明提供一种根据所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4的应用，应用于调节木糖转化过程中氧化还原平衡中。

优选的是，应用于调节木糖转化过程中氧化还原平衡，增加乙醇产量。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开一种高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4，通过构建在酿酒酵母中强启动子PGK表达热带假丝酵母木糖醇脱氢酶XYL2基因的载体，在氧化还原不平衡且代谢木糖生产乙醇较弱的重组酿酒酵母平台菌株SF4中表达，经筛选，获得一株能高效代谢木糖生产乙醇的转基因酿酒酵母工程菌E4。本发明所构建的转基因酿酒酵母工程菌E4易培养，并且木糖醇脱氢酶XYL2表达量高，提高了酿酒酵母工程菌代谢木糖和生产乙醇的能力，为通过调节木糖转化过程中氧化还原平衡，高效木糖代谢生产乙醇提供理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是酿酒酵母表达质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1构建的流程图；

图2是酿酒酵母表达质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1中木糖醇脱氢酶XYL2检测的PCR产物电泳图，其中，泳道1是大肠杆菌DH5α/pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1提取质粒的PCR 产物，泳道2是重组质粒pAUR101-Ppgk-XYL2-Tcyc1的PCR产物，M是DNA分子量标准；

图3是酿酒酵母表达质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1中pTIC检测的PCR产物电泳图，其中，泳道1是大肠杆菌DH5α/pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1提取质粒的PCR产物，泳道2 是质粒pTIC的PCR产物，M是DNA分子量标准；

图4是阳性酿酒酵母pTIC检测的PCR产物电泳图，泳道1-5是多个阳性转化子，其中2是转基因酿酒酵母工程菌E4，4是转基因酿酒酵母工程菌E9，M是DNA分子量标准；

图5是四种工程酿酒酵母基因XYL2的表达量水平图；

图6是实施例6工程酿酒酵母以三种能源作物(小麦Q107、玉米花甜糯和芒草148)汽爆残渣酶解液为碳源进行发酵的技术路线图；

图7是工程酵母发酵以不同固液比酶解的三种能源作物汽爆残渣的乙醇产量(％干物质)柱形图；

图8是工程酵母发酵以不同固液比酶解的三种能源作物汽爆残渣的乙醇浓度(g/L)柱形图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1克隆热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2

(1)克隆热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2

根据热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2序列(具体核酸序列如SEQ ID NO.1 所示)设计引物：

上游引物P1：5’-ATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’；

下游引物P2：5’-CTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’。

以热带假丝酵母基因组DNA为模板，采用P1和P2引物，KOD Plus高保真酶 (TOYOBO公司)扩增XYL2基因，Tm＝53℃，延伸1.5min，回收PCR产物得到目的片段，大小为1095bp。PCR扩增体系如表1所示。

表1扩增体系(50μL)

PCR反应参数：95℃变性30秒，53℃退火30秒，68℃延伸90秒(30个循环)。经扩增获得热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2的克隆片段。

(2)构建重组质粒pMD18-T-XYL2

a.TA克隆pMD18-T-XYL2

取pMD18-T载体1μL(50ng)，加入等摩尔数3’端加A碱基后的PCR产物(XYL2 基因片段)。加入含ATP的10×Buffer 1μL，T4 DNA ligase(200U/μL)0.3μL，用ddH₂O 补足至10μL，4℃连接过夜。

b.转化大肠杆菌DH5α感受态

取上述连接产物5μL，与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min后， 42℃水浴90s，迅速转移到冰上冷却2min，加入800μL预热的SOC培养基，在90r/min 的37℃恒温摇床孵育45min。之后，于7000r/min离心1min，弃600μL上清，重悬剩余上清和已转化的感受态细胞，涂布到含X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，溶于800mL单蒸水中，定容至1L，121℃高压灭菌20min)，37℃静置培养过夜。

通过蓝白斑筛选，挑取白色阳性克隆于LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶于800mL单蒸水中，定容至1L，121℃高压灭菌20min)，震荡培养过夜。经菌落PCR鉴定后，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序鉴定，该阳性克隆pMD18-T-XYL2(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)是将热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2的克隆片段插入TA克隆载体pMD18-T Simple Vector的Kpn I酶切位点和Sal I酶切位点之间。

实施例2构建酿酒酵母表达调控单元Ppgk-XYL2-Tcyc1

(1)构建重组质粒pYPGE15-XYL2

用Kpn I内切酶和Sal I内切酶分别对重组质粒pMD18-T-XYL2和酿酒酵母表达质粒pYPGE15进行双酶切，酶切反应体系如表2所示。

表2酶切发反应体系

在37℃水浴酶切反应8h，酶切产物分别经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收1128bp的热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2的克隆片段和6495bp的pYPGE15载体片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应体系如表3所示。

表3连接反应体系

反应条件是16℃连接过夜，然后取5μL连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，在Amp的LB固体培养基上挑选阳性克隆，经过菌液PCR及双酶切(Kpn I和Sal I)鉴定，得到阳性克隆pYPGE15-XYL2(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)。该阳性克隆pYPGE15-XYL2是将热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因XYL2的克隆片段插入酿酒酵母表达质粒pYPGE15的Kpn I酶切位点和Sal I酶切位点之间。

(2)克隆串联核苷酸序列Ppgk-XYL2-Tcyc1

根据重组质粒pYPGE15-XYL2设计引物：

上游引物P3：5’-AAGCTTTGCAAATTAAAGCCTT-3’；

下游引物P4：5’-CGCGAGCTCACTCTTTTCTTCTAACCAAGGGG-3’(其中 GAGCTC为酶切位点Sac I)

以重组质粒pYPGE15-XYL2的DNA为模板，采用P3和P4引物，KOD Plus高保真酶(TOYOBO公司)扩增启动子PGK-木糖醇脱氢酶基因XYL2-终止子CYC1串联核苷酸片段(简写：Ppgk-XYL2-Tcyc1,核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，Tm＝58℃，延伸2min。回收PCR产物得到目的片段，大小为1775bp。

实施例3构建酿酒酵母重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1

(1)构建重组质粒pAUR101-Ppgk-XYL2-Tcyc1

用Sac I内切酶对克隆串联核苷酸序列Ppgk-XYL2-Tcyc1进行单酶切，用Sac I内切酶和Sma I内切酶对酿酒酵母表达载体pAUR101进行双酶切。酶切产物分别经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收1771bp的Ppgk-XYL2-Tcyc1串联片段和6675bp的pAUR101载体片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行菌液PCR和双酶切(Sac I和Sma I)鉴定，得到阳性克隆pAUR101-Ppgk-XYL2-Tcyc1(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)。

该阳性克隆pAUR101-Ppgk-XYL2-Tcyc1是将酿酒酵母表达单元Ppgk-XYL2-Tcyc1插入酿酒酵母表达质粒pAUR101的Sac I酶切位点和Sma I酶切位点之间。

(2)构建重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1

用Sac I内切酶和Apa I内切酶分别对重组质粒pAUR101-Ppgk-XYL2-Tcyc1和酿酒酵母表达质粒pTIC进行双酶切。酶切产物分别经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收3287bp包括酿酒酵母表达单元Ppgk-XYL2-Tcyc1的酶切片段和3537bp的pTIC载体片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行菌液PCR和双酶切(Sac I和Apa I)鉴定，得到阳性克隆 pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)。

该阳性克隆pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1是将酿酒酵母表达单元Ppgk-XYL2-Tcyc1插入酿酒酵母表达质粒pTIC的Sac I酶切位点和Apa I酶切位点之间。

实施例4转基因酿酒酵母工程菌转化与鉴定

(1)pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1鉴定

根据重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1的核酸序列，具体如SEQ ID NO.6所示。设计酿酒酵母表达单元Ppgk-XYL2-Tcyc1鉴定引物P5和P6：

上游引物P5：5’-TGGTGCCGGTCCAGTT-3’；

下游引物P6：5’-TTACGGATACGGTTGG-3’。

设计酿酒酵母表达载体pTIC鉴定引物P7和P8：

上游引物P7：5’-TCGAGCCCACACACCATAG-3’；

下游引物P8：5’-CGTCCTCCACGAAGTCCC-3’。

为鉴定质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1中酿酒酵母表达单元Ppgk-XYL2-Tcyc1，以重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1为模板，采用P5和P6引物，Easy Taq DNA Polymerase 扩增检测，PCR体系如表4所示：

表4 PCR体系(20μL)

PCR反应参数：Tm＝55℃，延伸2min，回收PCR产物得到目的片段，大小为1702 bp。

如图2所示，质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1中酿酒酵母表达单元Ppgk-XYL2-Tcyc1(图2中泳道1)的PCR产物条带大小，同质粒pAUR101-Ppgk-XYL2-Tcyc1中扩增的PCR产物：启动子PGK-木糖醇脱氢酶基因XYL2-终止子CYC1串联核苷酸(图2中泳道2)的条带大小，且两条带大小正确。

为鉴定质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1中酿酒酵母表达载体pTIC的博来霉素(ZEO)抗性基因，以重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1为模板，采用P7和P8引物，Easy Taq DNAPolymerase扩增检测。PCR反应参数：Tm＝58℃，延伸45s，回收PCR产物得到目的片段，大小为595bp。

如图3所示，质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1中启动子TEF-抗性基因ZEO(图3中泳道1)的PCR产物条带大小，同质粒pTIC中扩增TEF-ZEO的PCR产物(图3中泳道2)条带大小，且两条带大小正确。

(2)酿酒酵母感受态制备及转化

a.制备酿酒酵母感受态：

将酿酒酵母SF4在YPD固体培养基(胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，溶于800mL单蒸水中，定容至1L，121℃高压灭菌20min)平板上划线培养，挑取单菌落，在20mL YPD液体培养基(胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖 20g，溶于800mL单蒸水中，定容至1L，121℃高压灭菌20min)，在200r/min的30℃恒温摇床中摇培至OD₆₀₀为1.5。

接种2mL活化的酿酒酵母至100mL YPD液体培养基中(OD₆₀₀约为0.2)，在 200r/min的30℃恒温下摇培至OD₆₀₀为0.6。室温1000r/min离心5min，弃上清。重悬菌体至30mL 1×TE缓冲液，室温1000r/min离心5min，重复一次。重悬菌体至3mL 1.1×LiAc/TE缓冲液，分装到两个1.5mL离心管中，室温12000r/min离心15s。弃上清，重悬菌体至600μL1.1×LiAc/TE缓冲液。

b.转化酿酒酵母感受态：

在2.0mL离心管中加入如表5试剂：

表5酿酒酵母转化体系

加入500μL PEG/LiAc缓冲液，混匀后30℃恒温培养30min，每10min轻柔混匀一次。加入70μL DMSO，混匀后42℃水浴培养15min，每5min轻柔混匀一次。冰浴 min。室温7000r/min离心1min，重悬菌体至0.5mL 1×TE缓冲液。将菌液涂布在含有博来霉素(Zeocin)的YPD固体培养基平板上，将平板倒置于30℃培养箱中培养3天。 (3)阳性酿酒酵母E4和E9鉴定

a.提取酿酒酵母质粒

挑取阳性菌斑至20mL YPD液体培养基，在200r/min的30℃恒温摇床中摇培24 小时，室温4000r/min离心5min，富集4mL菌液。使用Omega公司酵母质粒提取试剂盒提取酿酒酵母质粒。

b.筛选阳性酿酒酵母

使用上述提取的酿酒酵母质粒为模板，采用P7和P8引物，Easy Taq DNAPolymerase扩增检测。PCR反应参数：Tm＝58℃，延伸45s，回收PCR产物得到目的片段，大小为595bp。

如图4所示，5个阳性转化子中，泳道1和5未出现条带；泳道2、3和4有明显的条带，其中将泳道2对应的转基因酿酒酵母工程菌编号为E4，4对应的编号为E9，且泳道2-4基因表达由强到弱为泳道2＞泳道4＞泳道3。

实施例5Real-time定量分析XYL2基因在E4中的表达。

用Trizol试剂(TransGen Biotech)提取总RNA，使用EasyScript一步法去除gDNA，再用SuperMiX(TransGen Biotech)反转录为cDNA。PCR条件包括：95℃2min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸25s，共45个循环。肌动蛋白的基因ACT1用作内部对照。所有测定均三个重复。其中，引物如下：

ACT1-RT-F：5’-GGTATTGCCGAAAGAATGCA-3’；

ACT1-RT-R：5’-CTTGTGGTGAACGATAGATGGA-3’；

XYL1-RT-F：5’-TGAACATCACCCATACTTGC-3’；

XYL1-RT-R：5’-TTTCTTTGAGTAGCCCATCT-3’；

XYL2-RT-F：5’-TACGGTGACTACCAAACTTC-3’；

XYL2-RT-R：5’-TTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’；

XKS1-RT-F：5’-GTTCAAAGACAAGAGGCACG-3’；

XKS1-RT-R：5’-GCACCAATGACTTGAGCAAA-3’；

如图5所示，野生型酿酒酵母SF7和空载(SF7-EV)均无XYL2表达，SF4表达有较高强度的XYL2，E4由于进一步转化有强启动子TEF1启动的基因XYL2，该菌株的XYL2基因表达量最高。

实施例6高表达XYL2的E4可进一步提高汽爆残渣的糖醇转化

由于XYL2基因在生产生物乙醇过程中的木糖消耗起重要作用，酿酒酵母工程菌E4在SF4基础上高表达XYL2。为鉴定酿酒酵母工程菌E4对木糖的利用能力，本发明应用了三种能源作物(小麦、玉米和芒草)的木质纤维素汽爆残渣(如表6所示)，进行了酶解产糖作为工程酿酒酵母的发酵底物(具体工发酵的技术路线如图6所示)。使用了不同的固液比(1:5；1:10和1:20)，从木质纤维素酶解得到的可溶性糖中木糖占戊糖总量的94％-97％(如表7所示)。

表6小麦、玉米和芒草汽爆残渣的细胞壁组成(干物质％)

表7三种能源作物汽爆残渣不同固液比酶解的阿拉伯糖和木糖比例(％总戊糖)

测试E4在37℃高温条件下的发酵能力，该菌株比对照菌株具有更高的戊糖利用率，在1:5固液比的芒草发酵液中E4比对照戊糖利用率提高4倍(如表8所示)。值得注意的是，在大多数水解物中，酿酒酵母工程菌E4的戊糖利用率比SF4高得多，这说明 XYL2的高表达可以增强酵母细胞的木糖消耗能力。

表8工程酵母发酵以不同固液比酶解的三种能源作物汽爆残渣的戊糖利用

由于工程菌E4对上述三种能源作物的汽爆木质纤维素残渣酶解液的木糖有较强的利用能力，进一步检测其乙醇产量(％干物重)(如图7所示)和乙醇浓度(g/L)(如图8所示)。

酿酒酵母工程菌E4在成分浓度差异较大的酶解液中发酵，尽管在不同固液比的酶解液中乙醇产量和乙醇浓度差异较大，但其发酵能力显著高于原菌株SF7，乙醇产率和乙醇浓度提高11％-42％。进一步的，酿酒酵母工程菌E4的发酵能力较初步改良菌株 SF4，在8种不用生物质酶解液中，发酵能力均有显著提升(除在固液比为1:20的小麦汽爆酶解液发酵时)。

与此同时，检测了工程酵母对三种能源作物9种酶解液样品的己糖利用能力(如表9所示)，三种酵母菌株的己糖利用率相似，其中工程菌E4的己糖利用能力略高。

表9工程酵母发酵以不同固液比酶解的三种能源作物汽爆残渣的己糖利用

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactgcaa acccatcctt agttcttaac aaagttgacg atatttcctt tgaagaatac 60

gaagctccaa aactcgaatc accaagagat gtcattgttg aagttaagaa agctggtatc 120

tgtggatcag atatccatta ctatgcccat ggttcaattg gtccatttat tttaagaaaa 180

ccaatggttt taggtcacga atcagcaggt gttgtttctg ctgtcggaag tgaagttacc 240

aacttgaagg ttggtgatag agttgccatt gaacctggtg taccttcaag atttagtgat 300

gagaccaaat ctggtcatta tcatttgtgc ccacatatgt cttttgccgc caccccacca 360

gttaacccag atgaaccaaa tcctcaaggt actttatgta aatactacag agtcccatgt 420

gactttttat tcaaattacc agatcatgtt tctttggagt tgggtgctat ggttgaacca 480

ttaactgttg gtgtccacgg ttgtaaattg gctgatttga aatttggtga agacgttgtt 540

gtttttggtg ccggtccagt tggtttgttg accgctgccg ttgctagaac aattggtgct 600

aaaagagtca tggttgttga tatttttgac aacaaattga agatggcaaa agatatgggt 660

gctgccactc atattttcaa ctcaaaaacc ggtggtgatt atcaagattt gatcaagagt 720

tttgatggtg ttcaaccttc agttgttttg gaatgtagtg gtgctcaacc atgtatctat 780

atgggtgtta aaatcttgaa agctggtggt agatttgttc aaattggtaa tgccggtggt 840

gatgtcaatt tcccaattgc tgatttctca accagagaat tggcattata tggttctttc 900

agatatggtt acggtgacta ccaaacttca attgatattt tagacagaaa ctacgtcaat 960

ggtaaagaca aagcaccaat taatttcgaa ttgttgatta ctcacagatt caagtttaaa 1020

gatgccatca aagcctatga tttggtcaga gcaggaaatg gtgctgtcaa atgtttgatt 1080

gacggtccag aatag 1095

<210> 2

<211> 3789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

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catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt tgtaaagttc ttcttccaga ttgtgcgcaa actcttgcga 2280

tatcgatata acgtctttcc catcaggaag ctcataaagt tttgcctcaa ttgtttcggg 2340

aacgatgaat ttgctaaata aggtagagaa cattttttct gcattatacc tcagtttgtg 2400

ttctttttcg ctttcaaaat ctttcctagt aggcatttcg ttttcggcag tatcagactt 2460

ggcggcatca atgcttttat tccttttttt tgacccattg gatttcttca cctgtttgga 2520

tttgatatga attcctttgg cactatcggg gctccttttt cgtttcctag ggctttcctc 2580

atcaagaaag acatctgcat cattgtcatc atggtcattt acgggcttgt aaacatcatc 2640

atggtaatct tcatcctctg aaacctctgc ctcctttgac gtttccaaat gtgcatacaa 2700

tgatgggtcg cacaattcac agtagtactt agaatcttca ctcattagcc catctatggt 2760

gtctttacca tcagtcatac atttaatatg ctgccaagtg tcacagccat cgcactgtac 2820

catgtcgcca tgcgaatatt ctgcagcatc gtagttttca ttgttcgccc cacacagaca 2880

tctaacatag ccctcatccg cttcgtctac ttcgtctgtt cttacatttt cagtatcttt 2940

ccttggctcc tgagaagaat cagacttctt attcttctct atggctgaat caactttctt 3000

tttagttctt tttttctttg gtgcttcagt ctcctcctgt aacaaatact caatatattt 3060

attctgaccc ttattagatc ttgaagaagt acggacagac ataataaatt taaactaaat 3120

aaaagctaaa agtaaaagag aacctaggat aatcgatagc tccctgtgta tagaacaagt 3180

caaaatacta agatctcgtc aacctatcct ctttcattgc aagccttttg gccaaactgc 3240

agtctgggca tccctttgca tgtcttgtga aatagtatcc atctctcccc agctcccaga 3300

aatgatatga aaagttattc gtgaagagtg atcctaaaac tgaaaaaagg aaaaaacaaa 3360

aatgagctaa aaaaaccaca acaaaagaat atcaacttca ttgcttggcg ggtcatcgct 3420

tttttatttc tttctgtcaa agaataataa agtgcccatc agtgttcata tttgttacaa 3480

agtggttttc tgatttggta ctactgcaga ggcgtatttt ttgcttcagt taccatagcg 3540

taagaacact agcgactttt gttcgtgaac caacagagta ggatttctac tgctacatct 3600

cttaggtagt tggttagtcc gatcgctcac ttttggttgt tgttaagtac ttcataagtt 3660

tatccttttc ctttttcaca ctgagctact ttgggtatag cttttggccc aaggatcttt 3720

gaattttctc caaaagtact ttattttata tcctacaggt tgcggttttc atattttaaa 3780

aagcttttaa tcattccttt gcgtatggca aacccttttt cgagatggtt tctatcagag 3840

agacctccaa actgccatgt agccgattta gaaacaagtt tagatcccca tcaaacgttg 3900

ttgaaggtgc aaaaatacaa acccgcttta agcgactggg tgcattacat cttcttggga 3960

tccatcatgc tgtttgtgtt cattactaat cccgcacctt ggatcttcaa gatccttttt 4020

tattgtttct tgggcacttt attcatcatt ccagctacgt cacagttttt cttcaatgcc 4080

ttgcccatcc taacatgggt ggcgctgtat ttcacttcat cgtactttcc agatgaccgc 4140

aggcctccta ttactgtcaa agtgttacca gcggtggaaa caattttata cggcgacaat 4200

ttaagtgata ttcttgcaac atcgacgaat tcctttttgg acattttagc atggttaccg 4260

tacggactat ttcattatgg ggccccattt gtcgttgctg ccatcttatt cgtatttggt 4320

ccaccaactg ttttgcaagg ttatgctttt gcatttggtt atatgaacct gtttggtgtt 4380

atcatgcaaa atgtctttcc agccgctccc ccatggtata aaattctcta tggattgcaa 4440

tcagccaact atgatatgca tggctcgcct ggtggattag ctagaattga taagctactc 4500

ggtattaata tgtatactac atgtttttca aattcctccg tcattttcgg tgcttttcct 4560

tcactgcatt ccgggtgtgc tactatggaa gccctgtttt tctgttattg ttttccaaaa 4620

ttgaagccct tgtttattgc ttatgtttgc tggttatggt ggtcaactat gtatctgaca 4680

caccattatt ttgtagacct tatggcaggt tctgtgctgt catacgttat tttccagtac 4740

acaaagtaca cacatttacc aattgtagat acatctcttt tttgcagatg gtcatacact 4800

tcaattgaga aatacgatat atcaaagagt gatccattgg ctgcagattc aaacgatatc 4860

gaaagtgtcc ctttgtccaa cttggaactt gactttgatc ttaatatgac tgatgaaccc 4920

agtgtaagcc cttcgttatt tgatggatct acttctgttt ctcgttcgtc cgccacgtct 4980

ataacgtcac taggtgtaaa gagggcttaa tgagtatttt atctgcaatt acggatacgg 5040

ttggtcttat gtagatacat ataaatatat atctttttct ttctttttct tagtcaggat 5100

tgtcgtttag cataatatac atgtagttta tttaatcaca taccactgat tatctttaga 5160

attttataaa tttttgaaat aaatgggtgg cttttaatgg tgtctatgtt aagtgaggct 5220

tttagaatgc tcttcctgct ttgtttatta tatgtgtatg aaagatatgt atgtatttac 5280

atgtgtttgt agcgtcccca gtcaaaacct gtgcgctata cctaaatgga ttgataatct 5340

tcattcacta attctaaaat agacttcttc cccaaagaac ggtgtaacga tgaggctcta 5400

tccagctgct tatctaaatc aactttaacg atggatgatc ttatgacacg gggatctttc 5460

tttaaagttc ttagaatttc agactgtacc gcagctgatg aatcaaacag cattaaaaag 5520

tgatatgctc gaaaatgttt ttcctggtct ttcttcatta ttttaggaag ataccttatg 5580

cccatgggta caatgtccct caccacacct ctgttttgaa taatcagttt cccgattgtg 5640

gaagacaatt cttttgcttc caactttggc gcattggagt tggttatgcg aacaagtccg 5700

atcagctcat aaagcatctt agtgaaaagg gtggttttgc gttattcttt cctctgttga 5760

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccaag ctttgcaaat taaagccttc 5820

gagcgtccca aaaccttctc aagcaaggtt ttcagtataa tgttacatgc gtacacgcgt 5880

ctgtacagaa aaaaaagaaa aatttgaaat ataaataacg ttcttaatac taacataact 5940

ataaaaaaat aaatagggac ctagacttca ggttgtctaa ctccttcctt ttcggttaga 6000

gcggatgtgg ggggagggcg tgaatgtaag cgtgacataa ctaattacat gatatcgaca 6060

aaggaaaagg ggcctgttta ctcacaggct tttttcaagt aggtaattaa gtcgtttctg 6120

tctttttcct tcttcaaccc accaaaggcc atcttggtac ccggggatcc tctagagatt 6180

ctattctgga ccgtcaatca aacatttgac agcaccattt cctgctctga ccaaatcata 6240

ggctttgatg gcatctttaa acttgaatct gtgagtaatc aacaattcga aattaattgg 6300

tgctttgtct ttaccattga cgtagtttct gtctaaaata tcaattgaag tttggtagtc 6360

accgtaacca tatctgaaag aaccatataa tgccaattct ctggttgaga aatcagcaat 6420

tgggaaattg acatcaccac cggcattacc aatttgaaca aatctaccac cagctttcaa 6480

gattttaaca cccatataga tacatggttg agcaccacta cattccaaaa caactgaagg 6540

ttgaacacca tcaaaactct tgatcaaatc ttgataatca ccaccggttt ttgagttgaa 6600

aatatgagtg gcagcaccca tatcttttgc catcttcaat ttgttgtcaa aaatatcaac 6660

aaccatgact cttttagcac caattgttct agcaacggca gcggtcaaca aaccaactgg 6720

accggcacca aaaacaacaa cgtcttcacc aaatttcaaa tcagccaatt tacaaccgtg 6780

gacaccaaca gttaatggtt caaccatagc acccaactcc aaagaaacat gatctggtaa 6840

tttgaataaa aagtcacatg ggactctgta gtatttacat aaagtacctt gaggatttgg 6900

ttcatctggg ttaactggtg gggtggcggc aaaagacata tgtgggcaca aatgataatg 6960

accagatttg gtctcatcac taaatcttga aggtacacca ggttcaatgg caactctatc 7020

accaaccttc aagttggtaa cttcacttcc gacagcagaa acaacacctg ctgattcgtg 7080

acctaaaacc attggttttc ttaaaataaa tggaccaatt gaaccatggg catagtaatg 7140

gatatctgat ccacagatac cagctttctt aacttcaaca atgacatctc ttggtgattc 7200

gagttttgga gcttcgtatt cttcaaagga aatatcgtca actttgttaa gaactaagga 7260

tgggtttgca gtcataatcg tcgacggtat cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc 7320

cgggggatcc tctagagtcg agatcttgtt ttatatttgt tgtaaaaagt agataattac 7380

ttccttgatg atctgtaaaa aagagaaaaa gaaagcatct aagaacttga aaaactacga 7440

attagaaaag accaaatatg tatttcttgc attgaccaat ttatgcaagt ttatatatat 7500

gtaaatgtaa gtttcacgag gttctactaa actaaaccac ccccttggtt agaagaaaag 7560

agtgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 7620

tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 7680

ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat 7740

gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca 7800

tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 7860

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 7920

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 7980

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt 8040

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 8100

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat 8160

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 8220

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 8280

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 8340

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 8400

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcga 8446

<210> 6

<211> 6817

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg tgtgctgggc cccatttgtc gttgctgcca tcttattcgt 1920

atttggtcca ccaactgttt tgcaaggtta tgcttttgca tttggttata tgaacctgtt 1980

tggtgttatc atgcaaaatg tctttccagc cgctccccca tggtataaaa ttctctatgg 2040

attgcaatca gccaactatg atatgcatgg ctcgcctggt ggattagcta gaattgataa 2100

gctactcggt attaatatgt atactacatg tttttcaaat tcctccgtca ttttcggtgc 2160

ttttccttca ctgcattccg ggtgtgctac tatggaagcc ctgtttttct gttattgttt 2220

tccaaaattg aagcccttgt ttattgctta tgtttgctgg ttatggtggt caactatgta 2280

tctgacacac cattattttg tagaccttat ggcaggttct gtgctgtcat acgttatttt 2340

ccagtacaca aagtacacac atttaccaat tgtagataca tctctttttt gcagatggtc 2400

atacacttca attgagaaat acgatatatc aaagagtgat ccattggctg cagattcaaa 2460

cgatatcgaa agtgtccctt tgtccaactt ggaacttgac tttgatctta atatgactga 2520

tgaacccagt gtaagccctt cgttatttga tggatctact tctgtttctc gttcgtccgc 2580

cacgtctata acgtcactag gtgtaaagag ggcttaatga gtattttatc tgcaattacg 2640

gatacggttg gtcttatgta gatacatata aatatatatc tttttctttc tttttcttag 2700

tcaggattgt cgtttagcat aatatacatg tagtttattt aatcacatac cactgattat 2760

ctttagaatt ttataaattt ttgaaataaa tgggtggctt ttaatggtgt ctatgttaag 2820

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ataatcttca ttcactaatt ctaaaataga cttcttcccc aaagaacggt gtaacgatga 3000

ggctctatcc agctgcttat ctaaatcaac tttaacgatg gatgatctta tgacacgggg 3060

atctttcttt aaagttctta gaatttcaga ctgtaccgca gctgatgaat caaacagcat 3120

taaaaagtga tatgctcgaa aatgtttttc ctggtctttc ttcattattt taggaagata 3180

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aagtccgatc agctcataaa gcatcttagt gaaaagggtg gttttgcgtt attctttcct 3360

ctgttgaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccaagctt tgcaaattaa 3420

agccttcgag cgtcccaaaa ccttctcaag caaggttttc agtataatgt tacatgcgta 3480

cacgcgtctg tacagaaaaa aaagaaaaat ttgaaatata aataacgttc ttaatactaa 3540

cataactata aaaaaataaa tagggaccta gacttcaggt tgtctaactc cttccttttc 3600

ggttagagcg gatgtggggg gagggcgtga atgtaagcgt gacataacta attacatgat 3660

atcgacaaag gaaaaggggc ctgtttactc acaggctttt ttcaagtagg taattaagtc 3720

gtttctgtct ttttccttct tcaacccacc aaaggccatc ttggtacccg gggatcctct 3780

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aatcataggc tttgatggca tctttaaact tgaatctgtg agtaatcaac aattcgaaat 3900

taattggtgc tttgtcttta ccattgacgt agtttctgtc taaaatatca attgaagttt 3960

ggtagtcacc gtaaccatat ctgaaagaac catataatgc caattctctg gttgagaaat 4020

cagcaattgg gaaattgaca tcaccaccgg cattaccaat ttgaacaaat ctaccaccag 4080

ctttcaagat tttaacaccc atatagatac atggttgagc accactacat tccaaaacaa 4140

ctgaaggttg aacaccatca aaactcttga tcaaatcttg ataatcacca ccggtttttg 4200

agttgaaaat atgagtggca gcacccatat cttttgccat cttcaatttg ttgtcaaaaa 4260

tatcaacaac catgactctt ttagcaccaa ttgttctagc aacggcagcg gtcaacaaac 4320

caactggacc ggcaccaaaa acaacaacgt cttcaccaaa tttcaaatca gccaatttac 4380

aaccgtggac accaacagtt aatggttcaa ccatagcacc caactccaaa gaaacatgat 4440

ctggtaattt gaataaaaag tcacatggga ctctgtagta tttacataaa gtaccttgag 4500

gatttggttc atctgggtta actggtgggg tggcggcaaa agacatatgt gggcacaaat 4560

gataatgacc agatttggtc tcatcactaa atcttgaagg tacaccaggt tcaatggcaa 4620

ctctatcacc aaccttcaag ttggtaactt cacttccgac agcagaaaca acacctgctg 4680

attcgtgacc taaaaccatt ggttttctta aaataaatgg accaattgaa ccatgggcat 4740

agtaatggat atctgatcca cagataccag ctttcttaac ttcaacaatg acatctcttg 4800

gtgattcgag ttttggagct tcgtattctt caaaggaaat atcgtcaact ttgttaagaa 4860

ctaaggatgg gtttgcagtc ataatcgtcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcc 4920

tgcagcccgg gggatcctct agagtcgaga tcttgtttta tatttgttgt aaaaagtaga 4980

taattacttc cttgatgatc tgtaaaaaag agaaaaagaa agcatctaag aacttgaaaa 5040

actacgaatt agaaaagacc aaatatgtat ttcttgcatt gaccaattta tgcaagttta 5100

tatatatgta aatgtaagtt tcacgaggtt ctactaaact aaaccacccc cttggttaga 5160

agaaaagagt gagctcgcgg ccgcgatatc gctcgagccc acacaccata gcttcaaaat 5220

gtttctactc cttttttact cttccagatt ttctcggact ccgcgcatcg ccgtaccact 5280

tcaaaacacc caagcacagc atactaaatt tcccctcttt cttcctctag ggtgtcgtta 5340

attacccgta ctaaaggttt ggaaaagaaa aaagagaccg cctcgtttct ttttcttcgt 5400

cgaaaaaggc aataaaaatt tttatcacgt ttctttttct tgaaaatttt tttttttgat 5460

ttttttctct ttcgatgacc tcccattgat atttaagtta ataaacggtc ttcaatttct 5520

caagtttcag tttcattttt cttgttctat tacaactttt tttacttctt gctcattaga 5580

aagaaagcat agcaatctaa tctaagggcg gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata 5640

tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg 5700

ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg 5760

ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc 5820

tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg 5880

tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg 5940

acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc 6000

tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtcc 6060

gacggcggcc cacgggtccc aggcctcgga gatccgtccc ccttttcctt tgtcgatatc 6120

atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa 6180

aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta 6240

gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac 6300

gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta 6360

atttgcaagc tgaattcccg gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc 6420

actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 6480

ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 6540

cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct 6600

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 6660

gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 6720

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 6780

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Claims (8)

1.一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4，其特征在于，将木糖醇脱氢酶基因XYL2通过基因工程构建重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1，再将pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1转化到酿酒酵母SF4，构建酿酒酵母工程菌E4；

其中，所述木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述酿酒酵母工程菌E4于2020年12月04日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2020855。

2.根据权利要求1所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4，其特征在于，重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1的构建方法包括以下步骤：

a：以热带假丝酵母基因组DNA为模板，采用引物P1和P2，克隆木糖醇脱氢酶基因XYL2，并构建含有启动子PGK、终止子CYC1的表达单元PGK-XYL2-CYC1；

b：将所述表达单元PGK-XYL2-CYC1插入酿酒酵母表达载体pTIC中，构建重组质粒pTIC-Ppgk-XYL2-Tcyc1。

3.根据权利要求2所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4，其特征在于，P1：5’-ATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’；P2：5’-CTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’。

4.根据权利要求1所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4，其特征在于，所述酿酒酵母SF4保藏编号为CCTCCNO：M2016563。

5.根据权利要求1所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4的应用，其特征在于，应用于禾本科植物秸秆水解产物的乙醇发酵中。

6.根据权利要求5所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4的应用，其特征在于，所述禾本科植物为小麦、玉米或芒草。

7.根据权利要求1所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4的应用，其特征在于，应用于调节木糖转化过程中氧化还原平衡中。

8.根据权利要求7所述的一株高效代谢木糖的转基因酿酒酵母工程菌E4的应用，其特征在于，应用于调节木糖转化过程中氧化还原平衡，增加乙醇产量。

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