CN110616239A - 固定化酶催化法合成d-木酮糖 - Google Patents

固定化酶催化法合成d-木酮糖 Download PDF

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Abstract

本发明公开了固定化酶催化法合成D‑木酮糖，该方法从廉价的D‑木糖和D‑木糖醇出发，克隆了代谢途径中相关的系列酶基因，发酵生产系列酶，经过纯化和固定，然后加入相关起始原料，合成D‑木酮糖。本发明采用固定化酶法，以廉价的木糖和木糖醇为原料高收率转化成D‑木酮糖；通过与木酮糖激酶的偶合催化不仅实现了原料的转化完全，并且大大的方便了后期产品纯化，而固定化酶的应用则进一步降低了生产成本并有利于规模化工业生产。

Description

固定化酶催化法合成D-木酮糖
技术领域
本发明涉及固定化酶催化法合成D-木酮糖，具体涉及利用固定化酶多步催化将D-木糖和D-木糖醇转化成D-木酮糖的方法。
背景技术
D-木酮糖(D-Xylulose)是一种五碳酮糖，分子式为C5H10O5，分子量为150；它是自然界广泛存在的木糖(D-xylose)代谢的重要中间产物，通过与相应激酶作用转化成磷酸木糖而后进入通用的磷酸戊糖代谢路径。
D-木酮糖在人体的尿液、血液、脑脊髓液等部位被检测出较高浓度，且发挥着有待探索的未知功能。与此同时，D-木酮糖通过脱水反应能较为方便地转化成糠醛(furfural)，糠醛是当今热门研究的一种可再生的生物能源及生物化工产品的起始原料，具有极大地市场发展前景。
市面上昂贵的价格(￥16000/克,Carbosynth公司)极大地限制了D-木酮糖在研究领域及工业应用领域的进一步发展，因此开发一种利用廉价原料(D-木糖:￥380/公斤；木糖醇:￥555/公斤,aladdin试剂)、简易可放大的制备方法以降低其市场价格显得比较重要。
D-木酮糖常规制备方法有提取法、化学合成法及发酵法。
但由于自然界中D-木酮糖丰度并不高，且极性大、水溶性高并混有很多类似糖分，因此分离提取纯化方法成本高，该方法仅存在于早期D-木酮糖的研究中；后来随着糖化学制备工艺的逐渐成熟,木酮糖也逐渐实现利用廉价的木糖醇选择性氧化合成，然而由于木糖醇上多个羟基的存在，该方法中底物-OH的选择性保护、氧化、脱保护使得整个合成工艺繁琐复杂，生产成本居高不下。
由于无需考虑糖类化合物上的多个手性中心，酶法或发酵法制备该类化合物具有其独特的优势，日本的Ajinomoto公司利用一种葡糖杆菌属(Gluconobacter)的酵母，以阿拉伯糖醇(D-Arabitol)为原料发酵生产D-木酮糖(US 6221634B1)，但是由于产品中混有木糖醇、木糖等其它类似单糖杂质导致最终纯化成本高。
发明内容
为了克服现有技术无法低成本地、便捷地制备高纯度D-木酮糖的缺陷，本发明的目的在于提供固定化酶催化法合成D-木酮糖。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种合成D-木酮糖的方法，包括以下步骤：
(1)PCR扩增木糖异构酶(XI)、木糖醇氧化酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；
所述的PCR扩增，是以大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)菌株gDNA、包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis ATCC 700084)染色体为模板；
所述的质粒优选pET28a；
所述的细胞优选E.coli BL21(DE3)菌株；
步骤(1)中，所述做抗性筛选和扩大培养采用的培养基都是LB液体培养基；做抗性筛选的培养基中还含有50μM卡那霉素；
所述的扩大培养，培养基中含有0.5mM IPTG，37℃诱导表达6小时；
(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP液体酶；
所述的离心，是10000-16000rpm离心10-45min；
所述的纯化，是将蛋白溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，然后在同样的缓冲液中做透析处理，最后经DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，得到纯化的液体酶；
(3)将XI、XK、PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，酶固定在环氧树脂上，固定化酶具有30-70％的初始活力；该步骤中，三种酶的稳定性有差别，XI稳定性很高，并且是平衡反应；为实现转化完全，后面两步酶要分别过量。XI反应易进行，酶稳定性较好，用量最少。XK相对不容易些，要实现其有效转化，PPK再生ATP很关键；通过这种组合能实现后步反应快速拖动前面XI的平衡反应，从而实现产品的快速、流畅转化。
将XDH、XK、PPK、LDH四种酶按活性单位比(1.5-2.5):(1.5-3.0):(3.0-6.0):(1.0-2.0)混合，依上述同样的步骤固定在环氧树脂上，固定化酶具有20-45％的初始活力；和上文类似，几个酶的比例要调节合适才能实现体系的快速转化。和上面不同的是，XDH稳定性比XI要差不少，所以其用量要加大，并且还多了LDH再生NAD+，但是该步反应效率很高，酶稳定性也好，其用量可以适当降低。XK与PPK比例与上述一致即可。
AP依上述同样的步骤单独固定，固定化后保留90％的液体酶活；
所述的缓冲液优选pH值8.0的磷酸钾溶液；
(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶(XI、XK、PPK)，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶(回收活性在50-85％)，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶(回收活性在55-85％)，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
所述的缓冲液优选pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液；
所述的D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化，包括以下步骤：
往过滤液中加入木糖或木糖醇1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍过滤液体积的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分(含D-木酮糖-5-磷酸、AMP、ADP、ATP)，离心收集沉淀并将之溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，再加入草酸钡等当量的无水硫酸钠，离心除去BaSO4沉淀，调节上清液pH值至7.0，用D201阴离子交换树酯除去腺苷杂质(利用0～1N的碳酸氢氨水溶液梯度洗脱)，最后G25尺寸排阻柱脱盐(去离子水做洗脱液)、冻干得到白色固体即为D-木酮糖-5-磷酸钠纯品；
(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化AP(具有92％初始活性)，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品；
步骤(5)所述的缓冲液优选pH值7.0的Tris.HCl溶液；
所述的纯化是G25尺寸排阻柱脱盐。
本发明方法所涉及的代谢途径如下式所示：
木糖异构酶(XI,EC 5.3.1.5)能将D-木糖转化成D-木酮糖，但由于该平衡反应的不完全，反应液中大量残留的木糖原料极大地妨碍了木酮糖的纯化。D-木酮糖激酶(XK,EC2.7.1.17)能选择性磷酸化D-木酮糖成D-木酮糖-5-磷酸，通过与异构酶的偶合从而可以拖动木糖的完全转化。
糖醇氧化酶(XDH,EC 1.1.1.-)能高效、专一地将木糖醇氧化成D-木酮糖，通过与上述木酮糖激酶偶合则能有效实现木糖醇到D-木酮糖-5-磷酸的高收率转化，再利用非专一性磷酸水解酶(AP,EC 3.6.1.66)水解则可方便实现D-木酮糖的制备。
上述方法里三磷酸腺苷ATP以及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)都是比较昂贵的原料，为了降低成本，通过在反应体系中引入ATP再生酶(PPK,EC2.7.4.1)与多聚磷酸Pi(n)，乳酸脱氢酶(LDH,EC 1.1.1.28)与丙酮酸就能有效实现辅酶的循环再生，从而大大降低其用量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明采用固定化酶法，以廉价的木糖和木糖醇为原料高收率转化成D-木酮糖；通过与木酮糖激酶的偶合催化不仅实现了原料的转化完全，并且大大的方便了后期产品纯化，而固定化酶的应用则进一步降低了生产成本并有利于规模化工业生产。
附图说明
图1是纯化后的蛋白SDS-PAGE凝胶色谱图；其中最左边的泳道是三色预染蛋白质标准(10-180KDa)。
图2是纯化后D-木酮糖-5-磷酸在600M Varian D2O溶液中的1H-NMR谱图。
图3是纯化后D-木酮糖-5-磷酸在600M Varian D2O溶液中的13C-NMR谱图。
图4是纯化后D-木酮糖-5-磷酸在600M Varian D2O溶液中的质谱。
图5是纯化后D-木酮糖在600M Varian D2O溶液中的1H-NMR谱图。
图6是纯化后D-木酮糖在600M Varian D2O溶液中的13C-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
固定化酶催化法合成D-木酮糖，包括以下步骤：
(1)发酵生产木糖异构酶(XI)、木糖醇氧化酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)
以提取的大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)菌株(通用生物)gDNA、ATCC购买的包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis ATCC 700084)染色体为模板，利用引物PCR扩增出XI、XDH、XK、LDH、PPK以及AP基因片段，然后通过NEB公司标准的实验方法进行相应的基因酶切及片段连接到pET28a质粒上(生物风)。
所述引物序列如下：
XI正向引物:5’-gattatggagttccatatgcaagcctattttg-3’(SEQ.ID.NO.1)
XI反向引物:5’-cgatatacatctcgagcgttccttaaaaaaatg-3’(SEQ.ID.NO.2)
XK正向引物:5’-gaaggacggacatatgacgtacctcctgaac-3’(SEQ.ID.NO.3)
XK反向引物:5’-gtcggtcgggcctcgagccgggtgaggtgc-3’(SEQ.ID.NO.4)
XDH正向引物:5’-gtcgaaaggtatttcatatgtccaatcaag-3’(SEQ.ID.NO.5)
XDH反向引物:5’-ctcggctcatcacagaagctttcgctatgc-3’(SEQ.ID.NO.6)
LDH正向引物:5’-catcactggagaaagtcatatgaaactcg-3’(SEQ.ID.NO.7)
LDH反向引物:5’-gaatgcaggggagcctcgagattaaaccag-3’(SEQ.ID.NO.8)
PPK正向引物:5’-gagcgggaggaagcatatggcactcgacg-3’(SEQ.ID.NO.9)
PPK反向引物:5’-ctgatcgtcagctcgagggaatcacctgag-3’(SEQ.ID.NO.10)
AP正向引物:5’-catggagaaaatcatatgaaacaaagcac-3’(SEQ.ID.NO.11)
AP反向引物:5’-aattcactgccgggctcgagtttatttcagc-3’(SEQ.ID.NO.12)；
序列验证(擎科生物)正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株(通用生物)，在37℃、5ml含50uM卡那霉素的LB培养液中进行培养，当细胞增长至对数期(OD 0.5-0.6)加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达3小时，最后进行细胞收集、细胞破碎及高速离心，上清液利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达正确后(图1)，菌体可以逐级接入到5L培养发酵罐里进行37℃生长、诱导(0.5mM IPTG)表达6小时，最终湿细胞有60g。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾，1％磷酸氢二钾，5％的甘油，其余为水。
(2)将以上酶固定化在特定载体上
上述收集的含木糖异构酶(XI)、木糖氧化酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)的湿细胞通过高压破碎(1000Psi)、高速离心(16000rpm,45分钟)，其上清液收集后逐量加入硫酸铵固体至蛋白固体析出(25-55％w/v硫酸铵:缓冲液)，该蛋白固体通过高速离心(10000rpm,10分钟)收集后缓慢溶解到25mM pH值8.0的Tris缓冲液中(缓冲液A)，然后在20倍体积的缓冲液A中透析(两次，每次间隔4小时)，除去溶液里的硫酸氨，最后透析液上样DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱(NaCl在缓冲液梯度洗脱：0-1N NaCl)，得到初纯化的XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP酶液。
酶XI、XK、PPK利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按活性单位1:(1.5～3):(3～6)以下方法进行一次性混合固定化：2000U纯化混合酶溶解在1L50mM pH值8.0的磷酸钾(缓冲液B)溶液中，随后加入400克LX-1000EP环氧树脂，室温搅拌8小时后过滤出固定化酶，最后用清水及缓冲液B各洗两次后低温保存待用，固定化酶具有30-70％的初始活力。
依上述方法，酶XDH、XK、PPK、LDH四种酶按初始活力比1:(1.5-3):(3-6):(2-4)混合后一次性固定,最后获得的固定化酶具有20-45％的初始活力；
磷酸水解酶AP利用上述方法进行固定化后保留90％的液体酶活。
(3)利用混合固定化酶制备D-木酮糖-5-磷酸
a)利用固定化混合酶XI、XK、PPK，D-木糖为原料制备D-木酮糖-5-磷酸
在1L 100mM pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入22.5克D-木糖(150mM)、2.8克三磷酸腺苷二钠盐ATP(5mM)、20.6克多聚磷酸(Sigma,25聚,200mM单磷酸)、0.94克氯化镁(10mM)、1.5克氯化钾(20mM)；待pH值调节到8.0后，3000U固定化混合酶(XI、XK、PPK)一次性加入混合体系，反应过程中通过添加低浓度的HCl或NaOH水溶液维持体系pH值在6.5-8.5之间，反应液在30℃搅拌5小时过滤回收固定化酶(回收酶具有50-85％的初始活力)，过滤液即为D-木酮糖-5-磷酸水溶液粗品(活性单位U代表30℃每分钟转化1μM底物所需要的酶量)。
b)利用固定化混合酶XDH、XK、PPK、LDH，木糖醇为原料制备D-木酮糖-5-磷酸
同样在1L 100mM pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入11.4克D-木糖醇(75mM)、8.8克丙酮酸钠(80mM)、2.2克三磷酸腺苷二钠盐ATP(4mM)、1.38克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐(2mM)、10.3克多聚磷酸(Sigma,25聚,100mM单磷酸)、0.93克氯化镁(10mM)、0.7克氯化钾(10mM)；待pH值调节到8.0后，3500U固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)一次性加入混合体系，通过酸碱调节维持体系pH值在6.0-9.0之间，反应在30℃搅拌3小时后过滤终止反应，回收的固定化酶具有55-85％的初始活力,D-木酮糖-5-磷酸过滤液直接进行后续纯化。
上述a,b)反应过滤液里直接加入木糖/木糖醇1.1倍当量的草酸钡(a过滤液中加入37.1克，b过滤液中加入18.6克)并与两倍过滤液体积的乙醇充分混合，室温静止1小时，溶液沉淀过滤或者离心收集(含D-木酮糖-5-磷酸以及各种腺苷)。随后将收集的固体溶解在pH值1.0的50mM Tris缓冲溶液中，再加入草酸钡等当量的无水硫酸钠(a中加入23.3克，b中加入11.7克)，离心除去BaSO4沉淀，并利用NaOH溶液调节上清液pH值至7.0，该D-木酮糖磷酸混合液直接利用D201阴离子树酯交换柱(晶祥化工)除去腺苷杂质(利用0～1N的碳酸氢氨水溶液梯度洗脱)，收集到的D-木酮糖-5磷酸钠粗品经G25尺寸排阻柱(去离子水做洗脱液)脱盐、冻干得到白色固体即为D-木酮糖-5磷酸钠纯品(图2-图4)(方法a得到28.3克，收率75％；方法b得到11.5克，收率61％)。
(4)固定化磷酸水解酶AP水解D-木酮糖-5-磷酸为成D-木酮糖
将上述制备的20克D-木酮糖-5-磷酸钠(79mM)、385mg氯化镁(10mM)溶解在1L50mM pH 7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入1000U固定化磷酸水解酶AP启动反应，该混合溶液在30℃搅拌2.5小时后直接过滤终止反应，回收固定化酶(回收酶活为初始酶活的55-75％)。过滤液直接利用D201阴离子树酯交换柱吸附含磷酸化合物，目标产物D-木酮糖直接流出，最后依上法利用G25尺寸排阻柱脱盐得到16.3克纯D-木酮糖白色泡沫(收率90％，图5-图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 固定化酶催化法合成D-木酮糖
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XI正向引物
<400> 1
gattatggag ttccatatgc aagcctattt tg 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XI 反向引物
<400> 2
cgatatacat ctcgagcgtt ccttaaaaaa atg 33
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XK正向引物
<400> 3
gaaggacgga catatgacgt acctcctgaa c 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XK反向引物
<400> 4
gtcggtcggg cctcgagccg ggtgaggtgc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XDH正向引物
<400> 5
gtcgaaaggt atttcatatg tccaatcaag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XDH反向引物
<400> 6
ctcggctcat cacagaagct ttcgctatgc 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDH正向引物
<400> 7
catcactgga gaaagtcata tgaaactcg 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDH反向引物
<400> 8
gaatgcaggg gagcctcgag attaaaccag 30
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PPK正向引物
<400> 9
gagcgggagg aagcatatgg cactcgacg 29
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PPK反向引物
<400> 10
ctgatcgtca gctcgaggga atcacctgag 30
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP正向引物
<400> 11
catggagaaa atcatatgaa acaaagcac 29
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> AP反向引物
<400> 12
aattcactgc cgggctcgag tttatttcag c 31

Claims (10)

1.一种合成D-木酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)PCR扩增木糖异构酶、木糖醇氧化酶、木酮糖激酶、ATP再生酶、乳酸脱氢酶以及磷酸水解酶的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；
(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP液体酶；
(3)将XI、XK、PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上；
将XDH、XK、PPK、LDH四种酶按活性单位比(1.5-2.5):(1.5-3.0):(3.0-6.0):(1.0-2.0)混合，依上述同样的步骤固定在环氧树脂上；
AP依上述同样的步骤单独固定；
(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶(XI、XK、PPK)，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化AP，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的缓冲液是pH值8.0的磷酸钾溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的缓冲液是pH值8.0的Tris.HCl溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述的缓冲液是pH值7.0的Tris.HCl溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化，包括以下步骤：
往过滤液中加入木糖或木糖醇1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍过滤液体积的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分，离心收集沉淀并将之溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，再加入草酸钡等当量的无水硫酸钠，离心除去BaSO4沉淀，调节上清液pH值至7.0，用D201阴离子交换树酯除去腺苷杂质，最后G25尺寸排阻柱脱盐、冻干得到白色固体即为D-木酮糖-5-磷酸钠纯品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的PCR扩增，是以大肠杆菌菌株gDNA、包皮垢分支杆菌染色体为模板。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的纯化，是将蛋白溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，然后在同样的缓冲液中做透析处理，最后经DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，得到纯化的液体酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述做抗性筛选和扩大培养采用的培养基都是LB液体培养基。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述做抗性筛选的培养基中还含有50μM卡那霉素。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的扩大培养，培养基中含有0.5mMIPTG，37℃诱导表达6小时。
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