MX2012011872A - Levadura industrial capaz de producir etanol a partir de por lo menos una pentosa. - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada con el campo de los métodos para la obtención las cepas de levadura que producen etanol, las levaduras así producidas y con la producción industrial del etanol a partir de dichas levaduras. Más especialmente, la presente invención está relacionada, en el aspecto mayormente general de ella, con un método para preparar las levaduras de Saccharomyces cerevisiae "industriales", con dichas levaduras y con el uso de ellas en la producción industrial del etanol, a partir de un medio industrial conteniendo por lo menos una pentosa.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención está relacionada con el campo de los métodos para la obtención las cepas de levadura que producen etanol, las levaduras así producidas y con la producción industrial del etanol a partir de dichas levaduras. Más especialmente, la presente invención está relacionada, en el aspecto mayormente general de ella, con un método para preparar las levaduras de Saccharomyces cerevisiae "industriales", con dichas levaduras y con el uso de ellas en la producción industrial del etanol, a partir de un medio industrial conteniendo por lo menos una pentosa.

El punto común de los acercamientos del estado actual del arte del campo consta de los métodos objetivados en el mejoramiento de las cepas de "laboratorio", con una herencia genética conocida y/o construida, y en las capacidades de la cual para producir el etanol, son estudiadas en general en el medio y bajo las condiciones de laboratorio estandarizadas y óptimas.

Realmente, la literatura científica y los documentos de patentes analizados por el solicitante, enseña de forma mayormente común los métodos para la obtención de cepas haploides o diploides, las cuales son débilmente tolerantes con respecto a las tensiones. En particular, para las concentraciones fuertes de etanol y/o respecto a las altas temperaturas y/o respecto a los inhibidores de la fermentación. En adición, estos métodos principalmente requieren tener recursos, para estas cepas, para el uso de marcadores auxotróficos y/o marcadores para resistencia respecto a los antibióticos, los cuales pueden prevenir a ellos de usados de forma subsiguiente en un medio industrial por razones obvias de costos, o incluso algunas veces por razones de salud pública.

Las propiedades de crecimiento de estas cepas desarrolladas previamente son generalmente insuficientes, y estas cepas nunca han sido confrontadas con imperativos de producción de biomasa a escala industrial, a saber, solo para citar tres: alta tasa de crecimiento, capacidad para ser secado, estabilidad de almacenamiento.

Mientras los niveles del rendimiento "fermentativo" (capacidad para producir etanol de forma anaerobia) son obtenidos en un medio de "laboratorio" sintético o definido con estas cepas anteriores, ellos no son generalmente traspasables al medio industrial comprendiendo mezclas complejas resultantes, por ejemplo, de residuos para el tratamiento de materiales celulósicos o Hgnocelulósicos, los cuales contienen compuestos tóxicos que pueden inhibir la maquinaria celular de la levadura en varios niveles, en particular furfural, hidroximetilfurfural (HMF), derivados fenólicos y ácido acético. En adición, la capacidad de estos procesos de producción de etanol anteriores para someterse a corrección hacia arriba está raramente documentada.

El solicitante ha notado así que permanece la necesidad por un método para la preparación de una levadura "industrial", la cual toma en cuenta ambos, tanto las restricciones de la producción de la levadura como, al mismo tiempo, aquellas del usuario final en las aplicaciones de ella, en particular, en términos de la producción industrial del etanol a bajo costo y con un alto rendimiento.

La presente invención tiene por objetivo, precisamente, el de encontrar esta necesidad dual.

Por consiguiente, el primer objeto de la presente invención es un método para la preparación de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial, capaz de producir el etanol a partir de un medio conteniendo, por lo menos, una pentosa, y la cual comprende los siguientes pasos que constan de: (i) la selección y la obtención de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae "industrial" capaz de la producción de altas concentraciones del etanol, de al menos 14,5% (v/v) y, preferiblemente, al menos 16%, en un hidrolizado de cereal, bajo las condiciones de la sacarificación y la fermentación simultáneas (SSF) y a una temperatura de 35 °C, (ii) la integración de al menos un cásete de expresión o de supresión en un genoma de la levadura del paso (i), siendo elegido dicho al menos un cásete entre el grupo que consta de: a. la asociación del tipo de marco abierto de lectura (ORF) del gen Pichia stipitis XRm codificando la enzima de reductasa de xilosa imitada, la cual usa NADH;H+ como un cofactor preferencial en lugar de NADPH;H+ / promotor y terminador Saccharomyces cerevisiae, estando dicho cásete limitado aguas arriba y aguas abajo por las regiones recombinogénicas, permitiendo su integración objetivada en el genoma, b. la asociación del tipo de marco abierto de lectura (ORF) del gen Pichia stipitis XDH codificando la enzima de dehidrogenasa de xilitol / promotor y terminador Saccharomyces cerevisiae, estando dicho cásete limitado aguas arriba y aguas abajo por las regiones recombinogénicas, permitiendo su integración objetivada en el genoma, c. la asociación del tipo de marco abierto de lectura (ORF) del gen Saccharomyces cerevisiae XKS1 codificando la enzima de xiluloquinasa / promotor y terminador Saccharomyces cerevisiae, estando dicho cásete limitado aguas arriba y aguas abajo por las regiones recombinogénicas, permitiendo su integración objetivada en el genoma, (iii) la inducción de la expresión de al menos un gen de cada paso de la parte no oxidante del sendero de fosfato de pentosa, colocándolo bajo control de un promotor de un gen de glicolisis, el cual está fuertemente expresado durante la fermentación alcohólica, y (iv) la supresión de al menos dos copias del marco abierto de lectura (ORF) del gen Saccharomyces cerevisiae GRE3 codificando una dehidrogenasa de aldosa.

El método de acuerdo con la invención tiene, en particular, las siguientes ventajas: para el productor de la levadura, lo hace posible: de construir una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae prototrófica, aneuploide/poliploide con el fin de permitir la producción de la biomasa en fuentes de carbono simple, nitrógeno y fósforo en un medio poco costoso, tal como los subproductos de la industria azucarera, por ejemplo, las melazas, de tener una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae la cual presenta una tasa de crecimiento máximo (µp???) de entre 0,37 h"1 y 0,5 h"1, de tener una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae la cual, cuando es producida de acuerdo con un método como descrito en el libro de referencia "Yeast Technology" (Tecnología de Levadura) (2nd edition, 1991 , G. Reed and T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8), hace posible de obtener un rendimiento de producción de biomasa de al menos 45 g de materia seca de levadura por 100 g de sacarosa equivalente procesada, de tener una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae resistente al proceso de secado, como descrito en los documentos de patente EP 51 1 108 y US 5 741 695, donde la pérdida de actividad fermentativa después del secado no debe exceder 30%. de producir, bajo condiciones industriales (en particular medio poco caro, buena producción de biomasa, levadura seca lista para usar), una levadura fresca o seca de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae la cual es genéticamente estable, la cual es robusta puesto que su tolerancia particularmente a las altas concentraciones del etanol, y la cual es capaz de la producción, a partir de, por ejemplo, la biomasa hemicelulósica, del etanol al menos de 80 g/L, estando éste a una alta temperatura de aproximadamente desde 30 °C hasta 40 °C.

Además, para el productor del etanol, la ventaja del método de acuerdo con la invención es de tener una levadura activa (fresca - líquida o comprimida - o seca), obtenida de acuerdo con un método de producción como descrito en el manual "Yeast Technology", a partir de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae como definido en el párrafo precedente la cual es: capaz, bajo las condiciones de SSF descritas en el documento de patente WO 2004/046333, de fermentar a 35 °C, un hidrolizado de cereal hasta una concentración del etanol de al menos 14,5% (v/v), - capaz, bajo las condiciones de SSF descritas en el documento de patente WO 2004/046333, de fermentar a 35 °C, un hidrolizado de cereal hasta una concentración del etanol de al menos 16% (v/v).

Los resultados del método de acuerdo con la invención son todos los más notables puesto que ellos fueron obtenidos a partir de una cepa "industrial" prototrófica, aneuploide/poliploide la cual, como un resultado, tiene un material genético el cual es mucho más complejo que aquel de una cepa de "laboratorio", haciendo que las consecuencias de las modificaciones de dicha cepa industrial sean imprevisibles para decir lo último. Este antecedente genético complejo, específico con respecto a las cepas industriales, lo hace todo más dificultoso de obtener cepas genéticamente modificadas, las cuales están libres al final de los marcadores de resistencia antibiótica, en particular, cuando numerosos objetivos genéticos ha de ser modificados. Las cepas libres de de marcadores de resistencia antibiótica son bien obviamente preferibles por razones de salud y del medio ambiente.

El solicitante ha mostrado que las modificaciones genéticas de acuerdo con el método de la invención, aplicado a una cepa industrial con una herencia genética compleja y la cual tiene una capacidad para la producción de altas concentraciones del etanol, no induce a inestabilidad genómica alguna.

Las cepas prototróficas de acuerdo con la invención, tienen la ventaja del crecimiento en fuentes de carbón simple, nitrógeno y fósforo.

Sin embargo, esta característica significa que los vectores de transformación disponibles en la comunidad científica (vectores usando marcadores auxotróficos) son inefectivos.

Por consiguiente, es necesario de tener herramientas/vectores disponibles los cuales usan marcadores de resistencia antibiótica, siendo estas dichas herramientas/vectores ventajosamente construidas así como para permitir finalmente la escisión de estos marcadores. La construcción de estas levaduras de acuerdo con la invención tiene requerido, por ejemplo, el uso de 4 marcadores positivos diferentes (geneticina, fleomicina, higromicina y blasticidina).

Las cepas de acuerdo con la invención son aneuploides/poliploides: esta es una característica experimentada en las levaduras industriales, las cuales son derivadas del entorno natural. El pasado fílogenético de estas cepas es responsable por esta particularidad.

Sin embargo, es una dificultad adicional experimentada cuando es deseado de interrumpir/inactivar todas las copias de un gen dado. Sin embargo, esta característica aneuploide-poliploide es generalmente responsable por muchas propiedades de interés de las levaduras industriales (tasa de crecimiento, resistencia respecto a varias tensiones, estabilidad fenotípica).

En adición, los presentes inventores, después de una investigación prolongada, han notado con sorpresa que, con el método de acuerdo con la invención, implementado usando la cepa "industrial" que ellos han seleccionado: la introducción de los casetes de expresión y de supresión no inducen a inestabilidad genómica alguna en la levadura modificada, lo cual experimenta un mejoramiento en su herencia genética, no es obligatorio de regular su actividad XK. De hecho existe una controversia en el estado actual del arte con respecto a la sobreexpresión de XKS1 en las cepas de laboratorio, las cuales son por eso mejor definidas, con la sugerencia que la actividad de xiluloquinasa debiera ser finamente regulada (Jin et al AEM 2003, 69,495-503 vs Ho et al 1999, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 65, pp. 163 - 192).

En particular, los inventores han mostrado que, con dicha cepa industrial, es posible de llevar a cabo: la supresión de al menos dos copias del gen S. cerevisiae GRE3 (siendo la enzima Gre3p una reductasa de la aldosa la cual consume NADPH; H+ la cual es producida en una extensión más grande a través de la parte oxidante del sendero de la pentosa) en dicha cepa industrial de acuerdo con la invención, haciendo posible de reducir en consecuencia el consumo de NADPH; H+ mediante dicha enzima, la sobreexpresión de XKS1 naturalmente, eso quiere decir que el paso c) del método de acuerdo con la invención puede ser omitido, dado que XKS1 es un gen de S. cerevisiae endógeno. Esta sobreexpresión puede en particular ser hecha posible después de los cultivos cíclicos, cuando el método comprende un paso de evolución subsiguiente dirigido, como descrito más adelante.

Como una variante preferida de este primer objeto, los casetes a), b) y c) del paso (ii) están todos integrados.

Para sus construcciones, el solicitante primero que todo examinó el efecto del gen XR natural de Pichia stipitis. Después de la remoción de los marcadores y un paso de evolución dirigido, fueron obtenidas las cepas EG4 y EG5 depositadas con la CNCM [French National Collection of Microorganism Cultures] {Colección Nacional Francesa de Cultivos de Microorganismos) bajo los N° CNCM 1-4397 y 1-4398, el 23 de Noviembre de 2010.

Sin embargo, aún cuando las cepas EG4 y EG5 obtenidas son más rápidas que las cepas EG1 y EG2, ellas producen en promedio 50% más de xilitol. El xilitol conduce a la desviación del carbono y reduce significativamente el producto de conversión etanol a azúcar, el cual es muy perjudicial dada la prevista aplicación industrial.

El solicitante subsiguientemente reemplazó el gen XR natural de Pichia stipitis con un gen XRm mutado, y notó que es preferible para el gen XRm de ser un gen el cual tiene la siguiente mutación, K270M, o un gen XR mutado el cual tiene una (de las) diferentes mutaciones tal como 270R descrita por Watanabe et al., Microbiol. 2007, 153, 3044-3054, de manera que esta mutación confiere sobre la enzima codificada el uso de NADH ;H+ como un cofactor preferencial en lugar de NADPH ;H+.

La diferencia entre estas dos reductasas de xilosa es que una porta una metionina en la posición 270 (K270M) en lugar de un residuo de lisina, mientras que la otra porta una arginina (K270R) en lugar de un residuo de lisina.

El solicitante ha notado que la modificación K270R reduce la afinidad de XR para NADPH; H+ e incrementa su capacidad para usar NADH;H+. Además, esta modificación induce a un decrecimiento en la desviación de xilosa a xilitol y hace posible de mejorar la producción de conversión de xilosa a etanol bajo las condiciones de fermentación.

Aún más preferiblemente, en esta variante, la clonación del gen XR (XRm) mutado es llevada a cabo mediante una clonación de copia individual.

También es preferible en esta variante, para dicho al menos un gen de cada paso de la parte no oxidante del sendero de fosfato de pentosa del paso (iii) a ser elegido entre el grupo que consta de RPEJ, RKll, TKL1 y TAL1, y para dicho promotor de un gen de glicólisis el cual está fuertemente expresado durante la fermentación alcohólica para ser elegido entre el grupo que consta de el promotor TDH3 para RPEJ, RKll y TKL1 y el promotor PGK1 para TAL1.

De acuerdo con las características suplementarias o alternativas, en el método para la preparación de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial de acuerdo con la invención: el promotor en el paso (ii) es elegido entre el grupo que consta de ADH1, ADH2, PGK1, TDH3, PDC2 y GAL1/10, preferiblemente, ADH1, y el terminador consta de CYC1 ó el terminador propio del gen modificado, por ejemplo, el terminador TAL1 para el gen TAL1 ; - un paso de evolución subsiguiente dirigido está provisto para, el cual comprende los siguientes pasos sucesivos consistiendo en el sometimiento de la levadura obtenida a (i) una mutagénesis, (ii) crecimiento en cultivos cíclicos bajo 02 limitado en un medio conteniendo dicha al menos una pentosa, y (iii) una selección por crecimiento aerobio en un medio sólido conteniendo glicerol como la única fuente de carbón, así como para obtener imitantes deficientes no respiratorios de dicha levadura, la cual presenta un crecimiento aerobio en la presencia de un medio conteniendo dicha al menos una pentosa.

Preferiblemente en esta variante, la mutagénesis del paso (i) es llevada a cabo bajo condiciones moderadas, principalmente mutagénesis moderada con desde 100 J/cm2 hasta 500 J/cm2, y más preferiblemente, 300 J/cm2 de radiación ultravioleta en 254 nm. Estas condiciones causan solamente una mortalidad de 10% de la población sometida a la radiación ultravioleta.

Los inventores han mostrado así, sorpresivamente, que con tal una mortalidad baja controlada, es posible de reducir en un factor de 10 la duración del paso de la evolución dirigida, a través de cultivos cíclicos, la cual es necesaria para la obtención de mutantes capaces de la fermentación de dicha al menos una pentosa. La tasa de supervivencia es determinada sacando fuera, sobre platillos de agar conteniendo un medio nutritivo, un volumen idéntico de la suspensión celular antes y después de la mutagénesis. El número de colonias es determinado después de 48 horas de crecimiento.

Preferiblemente, la limitación de 02 en el paso (ii) de esta variante es llevada a cabo en virtud de una sobreexpresión parcial en el equipamiento usado (por ejemplo, frascos o fermentadores) debido al C02 producido.

Los cultivos cíclicos de acuerdo con esta variante, bajo las condiciones de fermentación de dicha al menos una pentosa, hace posible de enriquecer la población en mutantes capaces de la fermentación de dicha pentosa, en un tiempo desde 4 hasta 8 semanas y, preferiblemente, 6 semanas, lo cual es relativamente corto y muy ventajoso comparado con lo que podría ser obtenido mediante quimiostato como descrito por Kuyper et al. (2004) 4, 655-664.

Aunque, el "pequeño" fenotipo de deficiencia respiratoria puede estar en acuerdo con el criterio para la fermentación de dicha al menos una pentosa, en esta variante, los presentes inventores han llevado a cabo un paso de remoción de las levaduras "pequeñas" puesto que este fenotipo es incompatible con los métodos para la producción de las levaduras industriales dentro del significado de la invención.

El objetivo de la presente invención también es la cepa EG3 de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial obtenida directamente por el método, de acuerdo con la invención, antes del paso de evolución dirigido y el cual consta de la cepa de levadura depositada el 14 de Abril de 2010, con la CNCM (National Collection of Microorganism Cultures of the Institut Pasteur) bajo el N° 1-4295 bajo las condiciones del tratado de Budapest.

El objetivo de la presente invención también es la cepa EG2 de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial obtenida directamente por medio del método, de acuerdo con la invención, después del paso de evolución dirigido y el cual consta de la cepa de levadura depositada el 14 de Abril de 2010, con la CNCM (National Collection of Microorganism Cultures of the Instituí Pasteur) bajo el N° 1-4294 bajo las condiciones del tratado de Budapest.

El objetivo de la presente invención también es la cepa EG1 de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial obtenida directamente por medio del método, de acuerdo con la invención, después del paso de evolución dirigido y el cual consta de una variante, la cual es incapaz de la esporulación, de la cepa de levadura EG2, la cual fue depositada el 14 de Abril de 2010, con la CNCM (National Collection of Microorganism Cultures of the Institut Pasteur) bajo el N° 1-4293 bajo las condiciones del tratado de Budapest.

Una cepa incapaz de la esporulación tiene una ventaja en términos de protección del entorno, puesto que elimina el riesgo de diseminación de los transgenes mediante la conjugación con otras levaduras en un entorno circundante. Esta característica es toda lo más importante cuando los microorganismos genéticamente modificados son usados a una escala muy grande.

El objetivo de la presente invención también es la cepa EG9 de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial obtenida directamente por medio del método, de acuerdo con la invención, después del paso de evolución dirigido y el cual consta de la cepa de levadura depositada el 1 de Marzo de 2011, con la CNCM (National Collection of Microorganism Cultures of the Instituí Pasteur) bajo el N° 1-4450 bajo las condiciones del tratado de Budapest.

Más preferiblemente, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial obtenida está práctica o totalmente libre de marcadores, en particular, marcadores de resistencia antibiótica.

Las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae preparadas de acuerdo con la presente invención, de acuerdo con los criterios definidos anteriormente, retenida, después de la introducción de las modificaciones genéticas y otras mutaciones generadas durante el paso de evolución dirigido, sus características genotípicas y fenotípicas después de un proceso de producción industrial completo. En particular, las levaduras producidas presentan cinéticas de producción de alcohol, cinéticas de consumo de xilosa y una cantidad máxima de alcohol producido, el cual es rigurosamente idéntico a la cepa de levadura antes de la aplicación de un proceso industrial completo.

Además, las características industriales de la cepa elegida antes de la manipulación, como previamente descrito (tasa de crecimiento, rendimiento de producción, capacidad de secado) permanece sin cambio.

El objetivo de la presente invención también es un método para la producción del etanol, a partir de un medio conteniendo al menos una pentosa, mediante la fermentación usando una levadura de acuerdo con la invención, mencionada anteriormente, o como obtenido por medio de un método, de acuerdo con la invención, o como ha sido descrito recién.

Preferiblemente, el método para la producción del etanol tiene las siguientes características alternativas y/o suplementarias: - comprende un paso de la sacarificación y la fermentación simultánea (SSF) en la presencia de los polímeros de las hexosas, consistiendo predominantemente de glucosa, y de la menos una enzima capaz de hidrolizarlas, dicha al menos una pentosa es xilosa, dicho medio es elegido entre el grupo que consta de hidrolizados de lignina, hidrolizados de celulosa, hidrolizados de hemicelulosa e hidrolizados de dextrina, las tasas promedio de liberación de las hexosas, predominantemente de la glucosa, son aproximadamente desde 2,8 hasta 5,6 g/L/h con una concentración extracelular cero de hexosa, predominantemente de glucosa.

Los presentes inventores implementaron el método para la producción del etanol, de acuerdo con la invención bajo las condiciones reales de SSF (sacarificación y fermentación simultáneas), como llevado a cabo en la industria para la producción del etanol, en particular en los EE.UU. de Norte América.

Las concentraciones de azúcar usadas (70 g/kg de xilosa y 130 g/kg de glucosa equivalente) son, con respecto al conocimiento del solicitante, las concentraciones máximas que pueden ser experimentadas en la práctica. Todos los ensayos publicados con referencia a la fermentación de la xilosa fueron llevados a cabo con concentraciones de azúcar total mucho más bajas.

Otras características y ventajas de la invención emergerán incluso más claramente cuando se lea la descripción detallada como sigue, comprendiendo las puestas en práctica ejemplares con los resultados, las tablas las cuales están entregando puramente por la vía de la ilustración sin limitación, y para el entendimiento de cuya referencia será hecha con los dibujos anexados en los cuales: la figura 1 ilustra un vector para la sobre expresión de Pichia stipitis XDH, la figura 2 es un gráfico mostrando la glucosa liberada mediante la hidrólisis enzimática, como una función del tiempo de acuerdo con tres condiciones de liberación iniciales (A): 2,8 g/L/h, (B): 3,9 g/L/h y (C): 5,6 g/L/h, las figuras 3 hasta 5 muestran, para una cepa de acuerdo con la invención EG3, el cambio en las concentraciones de la glucosa, xilosa, etanol, xilitol y glicerol en función del tiempo; la figura 3 corresponde a la dosis de la enzima A, la figura 4 a la dosis de la enzima B y la figura 5 a la dosis de la enzima C, las figuras 6 hasta 8 muestran, para aún otra cepa de acuerdo con la invención EG1 , el cambio en las concentración de la glucosa, xilosa, etanol, xilitol y glicerol en función del tiempo; la figura 6 corresponde a la dosis de la enzima A, la figura 7 a la dosis de la enzima B y la figura 8 a la dosis de la enzima C, la figura 9 muestra el cambio en el movimiento de los promedios de las tasas de consumo de xilosa por cada una de las dos cepas EG1 y EG3 durante el curso de los tres ensayos llevados a cabo, como una función del movimiento promedio de las concentraciones de glucosa en el medio durante el mismo período de tiempo, la figura 10 es un gráfico ilustrando la tasa específica de la producción de xilitol (g/L/h) como una función de la tasa específica de consumo de xilosa en el medio (g/L h) para las dos cepas EG1 y EG3, la figura 11 es un gráfico ilustrando la pérdida de masa como una función de el tiempo de fermentación en la presencia de xilosa (70 g/L) por los 2 evoluatos EG3 y EG2 (la cepa Etanol Red™ es la cepa inicial), - la figura 12 ilustra el cambio en la pérdida de masa observada durante la fermentación de la xilosa por las cepas EG5 y EG9. Las células fueron inoculadas en una cantidad de 1 g/kg de materia seca en un medio conteniendo 70 g/kg de xilosa. La fermentación fue llevada a cabo en 32 °C.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 La selección de la cepa industrial es como descrito en la descripción anterior.

Todas las secuencias de ADN las cuales fueron usadas para las varias transformaciones de objetivo de la sobreexpresion de un gen ftieron obtenidas de un vector estándar conocido (E. coli tipo pUC) en la cual estuvo disponible lo siguiente: los objetivos de integración; los promotores/terminadores elegidos para un gen de interés, y los marcadores de resistencia que serán subsiguientemente eliminados (véase más adelante).

Un ejemplo de un vector usado para la sobreexpresion de Pichia stipitis XDH está ilustrado en la figura 1.

Para la disrupción de las copias del gen GRE3 de la cepa industrial seleccionada, los inventores usaron material amplificado PCR de un plásmido de tipo pUG6 (Güldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer, J, Hegemann JH, Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1 ; 24(13):2519-2524).

El paso de transformación de la levadura fue llevada a cabo de acuerdo con Gietz, R.D. y R.A. Woods. (2002) Transformation of yeast by the Liac/SS Carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymmology 350: 87-96.

Las cepas de levadura de acuerdo con la invención, EG1 , EG2 y EG3, respectivamente, fueron depositadas con la CNCM el 14 de Abril de 2010, y los números 1-4294 y 1-4295, respectivamente, fueron asignados a ellas.

Las levaduras de acuerdo con la invención tienen, de acuerdo con un modo preferencial, el siguiente genotipo: Etanol Red'M, BUD5 ADHlp-PsXRm (K270M)-CYClt; HO: .ADHlp-PsXDH-CYClt; BUD5: :ADHlp-XKSl-CYClt; RPE1: :TDH3p-RPEl-CYClt; RKI1: :TDH3p-RKll-CYClt; TKL1: :TDH3p-TKLl-CYClt; TAL1: :PGKlp-TALl-CYClt; AGRE 3 EJEMPLO 2 La mutagénesis de las cepas obtenidas en el ejemplo previo, fue llevada a cabo moderadamente, a saber, desde 100 hasta 500 J/cm2 y preferiblemente, a 300 J/cm2 de radiación ultravioleta en 254 nra.

Después de una semana de cultivo a 32 °C en un medio del tipo YE (Extracto de Levadura 0,5%) conteniendo 7% de xilosa, bajo agitación, sin aireación - estando la limitación de 02 realizada por virtud de una sobreexpresion parcial en los frascos, debido al C02 producido durante la fermentación - un mi del cultivo es usado para re-inocular el mismo medio. Esta operación es repetida 6 veces. Las células son finalmente puestas en placa fuera de un medio de agar YE conteniendo glucosa a 20 g/L. Las colonias aisladas son removidas y después cultivadas sucesivamente en: - Glicerol YE a 20 g/L y bajo condiciones aerobias con el fin de eliminar los mutantes "pequeños", por ejemplo, mutantes de deficiencia respiratoria; Glucosa YE con el fin de verificar su tasa de crecimiento; Xilosa YE con el fin de identificar los clones más ventajosos.

EJEMPLO 3 El inventor primero de todo ensayó, en un cultivo de lote anaerobio, las cepas genéticamente modificadas así como para ser capaz de convertir la xilosa en etanol, como obtenido en el Ejemplo 2.

Ellos fueron capaces de medir el Km aparente para la xilosa mediante la medición de la tasa de producción de C02 como una función de la concentración de xilosa, durante la fermentación de la xilosa como única fuente de carbono: es 6,16 M.

Entre las cepas ensayadas, tres son seleccionadas bajo las condiciones SSF con el fin de evaluar su capacidad para la metabolización de la xilosa al mismo tiempo como la glucosa. Los ensayos de SSF fueron llevados a cabo con dosis bajas de enzimas, la actividad de las cuales está entre 4,3 y 8,6 µ?-at, con el fin para que la tasa de liberación de la glucosa a ser bajada y para la concentración de la glucosa residual durante la fermentación para ser cero.

Las cepas ensayadas fueron la cepa EG3 y la cepa EG1 , respectivamente, obtenidas antes y después del paso de evolución dirigida. Las células de la cepa EG1 son incapaces de la esporulación. La capacidad de estas células de esporular está determinada mediante observación microscópica tétradas o asci obtenidos mediante el cultivo de células durante 48 horas sobre un medio pobre del tipo SAA (0,8% de acetato de sodio, 1 ,5% de agar).

Condiciones de Ensayo Los ensayos fueron llevados a cabo a 32 °C, pH = 5. La inoculación fue de 0,5 g de materia seca de levadura por kg de mosto inicial. La liberación enzimática gradual de la glucosa fue obtenida a través del uso de las dextnnas y la adición de la glucoamilasa. Las dosis de glucoamilasa usadas fueron bajas (entre 4,3 µkat y 8,6 µkat) con el fin de simular las cinéticas de la hidrólisis de la celulosa mediante las celulasas manteniendo lugar en 72 horas. Las tasas de la liberación de la glucosa inicial que fueron ensayadas fueron, respectivamente, (A); 2,8 g/L/h, (B): 3,9 g/L/h y (C): 5,6 g L/h.

Como observado generalmente, las cinéticas de la hidrólisis decrecieron cuando el 60% hasta el 70% de las dextnnas habían sido hidrolizadas, y las tasas promedio de la liberación de glucosa eran subsiguientemente, aproximadamente de 0,4 g/L/h hasta 0,45 g/L/h para las tres condiciones con una tasa levemente más ligera con la condición A (figura 2).

En la práctica, el medio usado es un medio sintético conteniendo extracto de levadura (5 g kg), urea (2,5 g kg), fosfato de dipotasio (1 g/kg), un tampón de citrato de 12 mM y también los minerales y las vitaminas.

Resultados obtenidos Cepa EG3 Las Figuras 3 hasta 5 entregan el cambio en las concentraciones de la glucosa, xilosa, etanol, xilitol y glicerol en función del tiempo. Estas figuras muestran que, en 72 horas: la cepa EG3 consumió entre 30 g y 33 g de xilosa de acuerdo con los ensayos, mientras que no había consumido virtualmente nada en el modo de lote de xilosa; 17 g hasta 20 g de xilitol fueron producidos fuera de los 30 g a 33 g de xilosa consumida, por ejemplo, una relación de 0,5 g/g para la condición A y una relación de 0,6 g/g para las condiciones B y C: - las cantidades de glicerol producidas fueron bajas, más bajas que las cantidades esperadas en este tipo de ensayo.

En general, los tres ensayos entregaron resultados equivalentes.

TABLA 1 : Moléculas producidas y consumidas por la cepa EG3 (en g por kg de medio inicial en 72 horas) Cepa EGl Las figuras 4 hasta 6 entregan el cambio en las concentraciones de la glucosa, xilosa, etanol, xilitol y glicerol en función del tiempo. Estas figuras muestran que, en 72 horas: la cepa EGl consumió entre 45 g y 60 g de xilosa de acuerdo con los ensayos, por ejemplo, virtualmente dos veces tanto más que la cepa EG3; 10 g hasta 13 g de xilitol fueron producidos fuera de los 45 g a 60 g de xilosa consumida, por ejemplo, una relación de 0,2 g/g para los tres ensayos; las cantidades de glicerol producidas fueron bajas, pero más altas que las con la cepa EG3.

Generalmente, los ensayos entregaron resultados equivalentes.

TABLA 2: Las moléculas producidas y consumidas por la cepa EGl (en g por kg de medio inicial en 72 horas) Las observaciones hipótesis considerando los resultados obtenidos, en particular en relación con respecto a la concentración de la glucosa permitiendo tomando de la xilosa.

Los resultados obtenidos en el lote glucosa-xilosa mostraron una ruptura en la inclinación de pérdida de masa, lo cual aparece indicar que la glucosa fue primero consumida y después la xilosa fue consumida subsiguientemente a una tasa mucho más baja.

El ensayo de SSF como llevado a cabo en el ejemplo, hace posible de evaluar si la toma de la xilosa podía ser más grande con un flujo de glucosa entrante no cero pero cero concentración de glucosa.

La figura 9 muestra el cambio en el movimiento promedio de las tasas del consumo de xilosas con cada una de las dos cepas durante el curso de los tres ensayos llevados a cabo, como una función del movimiento promedio de las concentraciones de la glucosa en el medio durante el mismo período de tiempo.

Los resultados hacen posible de notar: que hay un consumo de xilosa por las cepas ensayadas de aproximadamente 5 g kg de glucosa en solución, que la tasa de consumo de xilosa observada con la cepa EG3 es la mitad de aquella observada con la cepa EG1.

En una variante preferida del método para la producción del etanol de acuerdo con la invención, como presentado en el ejemplo, la liberación lenta y controlada de la glucosa permite que las células no sean sometidas a variación fuerte de la presión osmótica y de evitar el atoramiento en los senderos fermentativos (glicólisis, fosfatos de pentosa y transportadores de azúcar) que podrían limitar el uso de la xilosa.

De forma sorprendente y notablemente, con el método de acuerdo con la invención, las células son capaces de la metabolización de 62 g/L de xilosa en 50 horas en un medio muy rico en fuentes de carbono desde aproximadamente 200 g/L (ejemplo llevado a cabo con 130 g/L de glucosa equivalente y 70 g/L de xilosa). Tales condiciones drásticas como estas no han sido jamás descritas, según nuestro conocimiento.

De acuerdo con los ensayos de SSF llevados a cabo: la tasa específica de la cepa EG1 es de 0,5 g xilosa g DM levadura/h; - 12,74 g de xilitol fueron formados para 60,61 g de xilosa consumida, por ejemplo, una relación de 21 g/100 g.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la preparación de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae industrial, capaz de producir el etanol a partir de un medio conteniendo, por lo menos, una pentosa, CARACTERIZADO porque comprende los siguientes pasos consistiendo en: (v) la selección y la obtención de una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae "industrial" capaz de la producción de altas concentraciones del etanol, de al menos 14,5% (v/v) y, preferiblemente, al menos 16%, en un hidrolizado de cereal, bajo las condiciones de la sacarificación y la fermentación simultáneas (SSF) y a una temperatura de 35 °C, (vi) la integración de al menos un cásete de expresión o de supresión en un genoma de la levadura del paso (i), siendo elegido dicho al menos un cásete entre el grupo que consta de: d. la asociación del tipo de marco abierto de lectura (ORF) del gen Pichia stipitis XRw codificando la enzima de reductasa de xilosa mutada, la cual usa NADH;H+ como un cofactor preferencial en lugar de NADPH;H+ / promotor y terminador Saccharomyces cerevisiae, estando dicho cásete limitado aguas arriba y aguas abajo por las regiones recombinogénicas, permitiendo su integración objetivada en el genoma, e. la asociación del tipo de marco abierto de lectura (ORF) del gen Pichia stipitis XDH codificando la enzima de dehidrogenasa de xilitol / promotor y terminador Saccharomyces cerevisiae, estando dicho cásete limitado aguas arriba y aguas abajo por las regiones recombinogénicas, permitiendo su integración objetivada en el genoma, f. la asociación del tipo de marco abierto de lectura (ORF) del gen Saccharomyces cerevisiae XKS1 codificando la enzima de xiluloquinasa / promotor y terminador Saccharomyces cerevisiae, estando dicho cásete limitado aguas arriba y aguas abajo por las regiones recombinogénicas, permitiendo su integración objetivada en el genoma, (vii) la inducción de la expresión de al menos un gen de cada paso de la parte no oxidante del sendero de fosfato de pentosa, colocándolo bajo control de un promotor de un gen de glicolisis, el cual está fuertemente expresado durante la fermentación alcohólica, y (viii) la supresión de al menos dos copias del marco abierto de lectura (ORF) del gen Saccharomyces cerevisiae GRE3 codificando una dehidrogenasa de aldosa.

2. El método como reivindicado en la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque dicho XRm es un gen codificando el K270M XRm.

3. El método como reivindicado en la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque dicho XRm es un gen codificando el 270R XRm.

4. El método como reivindicado en una de las la reivindicaciones de la 1 a la 3, CARACTERIZADO porque el promotor Saccharomyces cerevisiae es elegido entre el grupo que consta de ADHl , ADH2, PGK1, TDH3, PDC2 y GAL1/10, preferiblemente ADHl, y que el terminador Saccharomyces cerevisiae consta de CYCl ó el terminador propio del gen modificado.

5. El método como reivindicado en cualquiera una de las la reivindicaciones de la 1 a la 4, CARACTERIZADO porque comprende un paso de evolución dirigida subsiguiente, el cual comprende los siguientes pasos sucesivos consistiendo en el sometimiento la levadura obtenida a (i) una mutagénesis, (ii) crecimiento en cultivos cíclicos bajo 02 limitado en un medio conteniendo dicha al menos una pentosa, y (iii) una selección por crecimiento aerobio en un medio sólido conteniendo glicerol como sola fuente de carbono, así como para obtener los mutantes con deficiencia no respiratoria de dicha levadura, la cual presenta un crecimiento aerobio en la presencia de un medio conteniendo dicha al menos una pentosa.

6. La cepa EG3 de levadura Saccharomyces cerevisiae, CARACTERIZADA porque está depositada bajo el N° 1-4295 de la CNCM.

7. La cepa EG2 de levadura Saccharomyces cerevisiae, CARACTERIZADA porque está depositada bajo el N° 1-4294 con la CNCM, resultando dicha cepa de la evolución directa de la cepa EG3.

8. La cepa EGl de levadura Saccharomyces cerevisiae, CARACTERIZADA porque está depositada bajo el N° 1-4293 con la CNCM, resultando dicha cepa de la evolución directa de la cepa EG3.

9. La cepa EG9 de levadura Saccharomyces cerevisiae, CARACTERIZADA porque está depositada bajo el N° 1-44450 con la CNCM.

10. Una cepa de levadura como obtenida por medio de un método como reivindicado en cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 5, CARACTERIZADA porque está libre de marcadores de resistencia antibiótica.

1 1. Un método, CARACTERIZADO porque se usa en la producción del etanol, a partir de un medio conteniendo al menos una pentosa, por fermentación de una levadura como reivindicado en cualquiera una de las reivindicaciones de la 7 a la 10, o como obtenido por medio de un método como reivindicado en cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 9.

12. El método como reivindicado en la reivindicación precedente, CARACTERIZADO porque comprende un paso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en la presencia de polímeros de hexosas, consistiendo predominantemente de glucosa, y al menos una enzima capaz de hidrolizarlos.

13. El método como reivindicado en cualquiera una de las reivindicaciones 11 y 12, CARACTERIZADO porque dicha al menos una pentosa es xilosa.

14. El método como reivindicado en cualquiera una de las reivindicaciones 10 y 13, CARACTERIZADO porque dicho medio es elegido entre el grupo que consta de hidrolizados de lignina, hidrolizados de celulosa, hidrolizados de hemicelulosa e hidrolizados de dextrina.

15. El método como reivindicado en la reivindicación precedente, tomado en combinación con la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque las tasas promedio de liberación de las hexosas, predominantemente de la glucosa, era de aproximadamente 2,8 g/L/h hasta 5,6 g/L/h con una concentración extracelular de cero de hexosa, predominantemente de glucosa. LEVADURA INDUSTRIAL CAPAZ DE PRODUCIR ETANOL A PARTIR DE POR LO MENOS UNA PENTOSA