CN105296367B - 一种灵芝酸高产工程菌株kmust-VGB-1 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种灵芝酸高产工程菌株kmust‑VGB‑1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.11301，本发明提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P‑gpd表达透明颤菌血红蛋白VGB基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌kmust‑VGB‑1；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，VGB转化子菌株产单体灵芝酸GA‑Me，GA‑T，GA‑Mk，GA‑S分别是WT菌株的3.1，3.2，2.1，3.6倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。

Description

一种灵芝酸高产工程菌株kmust-VGB-1

技术领域

本发明属于基因工程和代谢工程领域的，具体涉及一种通过基因工程在灵芝中表达透明颤菌血红蛋白 vitreoscilla hemoglobin ( VGB )基因的方法，构建了一个灵芝酸的高产工程菌株。

背景技术

灵芝 ( Ganodermalucidum ) 是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技术、药理学作用及临床应用等情况。

灵芝酸是一类分子结构中含有羧基的三萜类物质，从结构来看它属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分离得到灵芝酸以来，目前已有130多种灵芝酸被分离出来。它们多为四环三萜类化合物，含有30个碳原子，结构中一般都有羟基，在IR中有较强的羟基吸收峰。在紫外光谱中也呈现多个波长的特征吸收，多数是在250 nm、237nm、365 nm处有吸收峰。灵芝酸具有许多重要的药理活性如：抗癌，灵芝酸类物质能明显抑制小鼠肝肉瘤 ( HTC ) 细胞的增殖；护肝，灵芝中的灵芝酸提取物能加强其解毒作用；抗HIV；降血压；抗氧化；抑制血小板凝集，抑制组胺释放，镇痛，抑制真核细胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白转移酶活性和促进体液免疫功能等作用。

透明颤菌血红蛋白( vitreoscilla hemoglobin, VGB)是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白，该蛋白质能使透明颤菌在低氧的环境下生存，并保持较高的生长速率。透明颤菌为专性好氧的革兰氏阴性菌, 为贝日阿托氏菌属(Beggiatoa )，能在贫氧条件下合成一种可溶性的血红蛋白以满足其对氧的需求。自从VGB在大肠杆菌中成功地进行表达以来，VGB已在假单胞杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多种生物体内实现克隆，它已越来越多地应用到微生物发酵工业的许多领域, 并取得了显著成果。将表达透明颤菌血红蛋白(vitreoscillahemoglobin, VGB)的基因VGB，转化到灵芝基因组上，实现灵芝细胞内表达透明颤菌血红蛋白，促进灵芝细胞对氧气的利用能力。在限氧条件下，外源表达透明颤菌血红蛋白可以明显促进宿主细胞生长和蛋白的合成，同时VGB的表达可以促进氧的扩散，改善宿主的好氧代谢途径。

灵芝酸合成途径首先是由乙酰辅酶A ( Acetyl CoA ) 在硫解酶 ( AcetoacetylCoA thiolase ) 催化下缩合形成乙酰乙酰辅酶A ( Acetoacetyl CoA )，乙酰乙酰辅酶A经HMG-CoA合成酶 ( HMG-CoA synthase ) 催化与另一分子乙酰CoA缩合生成3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A ( HMG-CoA )，然后HMG-CoA还原酶( HMG-CoA reductase, HMGR )催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸。甲羟戊酸经甲羟戊酸激酶 ( MVK )、甲羟戊酸5-磷酸激酶( PMK )和MDD三步酶促反应转化为IPP。IPP进一步转化成法呢酯焦磷酸FPP。FPP 在鲨烯合酶squalene synthase ( SQS ) 的催化下合成鲨烯SQS后经过鲨烯单加氧酶的作用产生鲨烯2, 3-氧化物，再经过羊毛甾醇合酶 ( LS ) 的作用产生羊毛甾醇。羊毛甾醇又经过一系列氧化还原反应生成灵芝酸，而VGB基因的表达促进灵芝细胞对氧气的利用能力，增强了羊毛甾醇到灵芝酸通路的氧化还原反应，提高了灵芝酸的合成。灵芝酸的合成途径如下所示：

。

随着人们生活水平的提高，各种疾病的发生率也逐年递增。于是，人们对健康的关注也越来越来广泛。灵芝作为一种良好的中药对提高人体免疫力，抗氧化等方面具有重要的地位，尤其是在治疗癌症方面表现尤为突出。

由于野生灵芝生长周期长，受环境因素影响大且野生灵芝资源有限，灵芝菌丝培养成为生产活性物质的重要方法。随着对灵芝活性物质需求的不断增加，如何提高灵芝的产量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化生产的重要手段。现在市售的灵芝酸主要是从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中获得。由于野生灵芝液体深层发酵时灵芝酸在灵芝细胞中的含量较低，分离纯化也较难，限制了灵芝酸的活性及作用机理研究及其广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发展，成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造菌株的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高灵芝酸的产量是目前急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝酸较低的问题，提供一种灵芝酸高产菌株，该菌株为高产灵芝酸的灵芝 ( Ganodermalucidum ) 工程菌kmust-VGB-1，已于2015年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.11301。

本发明灵芝酸高产工程菌株的构建方法如下：

以PMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-gpd、终止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因 ( 具有carboxin抗性 ) 是来自灵芝本身的抗性基因，其特点是在蘑菇类担子菌的转化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强。

1、将灵芝启动子P-gpd与终止子T-sdhB与PMD19-T连接，将灵芝cbx抗性基因插入到Pst I酶切位点，从而构建成pJW-EXP载体；其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有灵芝本身的抗性；

其中扩增灵芝强启动子P-gpd的引物序列为：

P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3’，

P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3’；

扩增灵芝sdhB基因终止子的引物序列为：

T-sdhB-F: 5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3’，

T-sdhB-R : 5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3’；

扩增灵芝cbx抗性基因的引物为：

cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’，

cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’；

2、以美国芝加哥IIT中心illinois技术研究所B. C. Stark教授提供的质粒PUC8:16为模板，克隆了透明颤菌血红蛋白的基因(所用的引物为VGB-Nhe-F和VGB-Sma-R )，并插入到pJW-EXP载体中，得到pJW-EXP-tVGB载体；引物序列为：

VGB-Nhe-F：5’-GCTAGCCTAGCTAGCATGTTAGACCAACAAACCGT- 3’

VGB-Sma-R：5’-GGGCCCGATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAAGA- 3’；

3、通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-tVGB转化到野生型灵芝细胞中，以carboxin作为抗性来筛选灵芝转化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上筛选出转化子；

4、将转化子在carboxin抗性的CYM平板中进行传代培养；

5、灵芝细胞的液体培养：

PDA培养基 ( g/L )：葡萄糖10，琼脂20 ，硫酸镁 1.5 ，磷酸二氢钾 3，维生素B10.05和制备好的土豆汁；

土豆汁的制备方法：将200 g去皮新鲜土豆切成小块，加入去离子水1.0 L煮沸30min，用八层纱布过滤，取滤液，用于PDA培养基的配制；

种子培养基( g/L )：葡萄糖35，蛋白胨5，酵母膏2.5，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5和维生素B1 0.05。

发酵培养基( g/L )：蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、维生素B10.05，乳糖35，起始pH 5.5。

CYM培养基( g/L )：葡萄糖 20，麦芽糖10，酵母粉 2，蛋白胨 2，MgSO₄ 0.5，KH₂PO₄4.6，琼脂 10。

斜面培养：接种菌丝于土豆汁-葡萄糖-琼脂 ( PDA ) 斜面中28℃培养5-7天。

一级种子培养：在250 mL摇瓶中添加40 mL培养基和10 mL菌丝体悬液 ( 从一支斜面中获得 ) ，并在30 ℃，120 rpm下培养5天。

二级种子培养：在250 mL摇瓶中加入45 mL培养基和5 mL一级种子培养液 ( 大约500 mg DW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种 ) ，在30℃，120 rpm下培养2天。

发酵培养：在250 mL摇瓶中加入45 mL发酵培养基和5 mL二级种子发酵液 ( 大约500~600 mg DW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种 ) ，在30℃，120 rpm下培养。

6、单体灵芝酸的分离和提取

准确称取干细胞粉末100 mg，加入3 mL 70%（v/v）乙醇浸泡过夜，超声处理3次，每次30 min。10000 rpm离心5 min后获得上清液。在50℃烘箱中烘干。用200μL色谱级甲醇彻底溶解，用0.22μm滤膜过滤。用HPLC检测灵芝酸单体。HPLC检测条件为：HPLC色谱柱为C18柱（Agilent 1200 series，5 μm Agilent Zorbax SB-C18 column，250×4.6 mm）；进样量 20μL；流速 1 mL/min；流动相A为甲醇/乙酸（100:0.5（v/v）），流动相B为超纯水， 0-20 min：A相为80 %-100 %等梯度洗脱；20 min-30 min：A相为100 %洗脱；30 min-35 min：A相为80 %洗脱；紫外检测波长为245 nm；洗脱时间35 min。记录相应的峰面积和出峰时间。按照标准曲线计算出各个灵芝酸单体的浓度和含量。

本发明的优点和技术效果：通过摇瓶发酵实验表明，该灵芝酸高产工程菌株在其发酵性能不受影响的情况下（培养温度、培养基组成、接种量和培养方式相同的条件下），VGB转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分别是WT菌株的3.1、3.2、2.1、3.6倍，在同等情况下，使用本发明构建的工程菌株可以节约劳动力，缩短生产周期，降低成产成本。因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，适用于工业化生产，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明中灵芝基因组；图中：G为灵芝基因组，M为λ-HindШdigest DNAMarker；

图2为本发明中pJW-EXP载体结构示意图；

图3为本发明中扩增VGB基因的电泳图；图中：M为DL2000的核酸标准品 ( Takara ) ；V为VGB基因；

图4为本发明中pJW-EXP-tVGB载体结构示意图；

图5为本发明中验证VGB阳性转化子的电泳图；图中：M为DL2000的核酸标准品 (Takara ) ，V为转VGB基因的阳性转化子，WT为野生型菌株，N为阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：pJW-EXP载体的构建

1、灵芝基因组DNA的提取

称取约0.2 g冻干野生型灵芝 ( CCGMC 5.0616 ) 的菌丝体在液氮中研磨成粉末，将粉末转入1.5 mL经65℃预热的CTAB ( 十六烷基三甲基溴化铵 ) 抽取缓冲液中，65℃保温30 min，然后在 4℃下，10000 g离心20min，取上清液加等体积的氯仿：异戊醇 (24：1 ) 的混合物，轻轻摇匀30 min以上，4℃下、10000 g离心20min；将上清液移入1.5 mL离心管后，加入2/3体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，用玻璃棒捞出DNA后，用75%的乙醇洗涤2-3次，室温凉干后，溶于适量含20 μg/mL RNase的TE，37℃消化RNA 30 min后即可到灵芝基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示：灵芝的基因组为单一条带，且大小在10000bp以上 ( 见图1 ) 。

2、灵芝强启动子的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用P-gpd-F、P-gpd-R作为引物进行PCR扩增，扩增得到灵芝的启动子P-gpd，引物序列如下：

P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3’，

P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3’；

PCR条件如下：95℃ 10min， 95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，72℃ 10min。

3、启动子P-gpd与PMD19-T连接

将克隆后的启动子P-gpd进行胶回收，将回收产物与PMD19-T用T4连接酶在16℃进行连接，得到PMD19-T-P中间载体。

4、灵芝终止子的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用引物

T-sdhB-F：5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3’

T-sdhB-R：5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3’

进行扩增，得到440bp的序列；PCR条件为：95℃ 10min， 95℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，72℃ 10min。

5、终止子T-sdhB与PMD19-T-P连接

将克隆后的终止子T-sdhB胶回收，把PMD19-T-P中间载体用SacI单酶切，PCR回收酶切产物，再用T4聚合酶补平酶切位点，然后再用T4连接酶在16℃进行平末端连接，得到PMD19-T-P-T中间载体。

6、cbx基因的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用引物

cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’

cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’ 进行PCR得到灵芝的sdhB基因；PCR条件为：95℃ 10min， 95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，72℃ 10min；再设计一对定点突变引物：

sdhB-MR：5'-GAAGATCGTGAGGCAGCGGTATAGGC-3' ( 其中A为突变位点 )

sdhB-MF：5'-GCCTATACCGCTGCCTCACGATCTTC-3' ( 其中T为突变位点 )。

第一轮PCR用引物cbx-F和sdhB-MR进行扩增，PCR条件为：95℃ 10min， 95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min20s，72℃ 10min，得到片段sdhB1；第二轮PCR用引物cbx-R和sdhB-MF进行扩增，PCR条件为：95℃ 10min， 95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min20s，72℃ 10min，得到片段sdhB2；获得相应片段后，采用重叠PCR的方法把两个片段连接。第三轮重叠PCR的引物为cbx-F 和cbx-R，扩增条件为：94 ℃变性10 min，66 ℃退火30s，72 ℃延伸4 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。最终获得了3171 bp突变的灵芝sdhB基因序列 ( 定点突变后对carboxin抗生素产生抗性，我们把定点突变后的sdhB基因定义为cbx ) 。经序列测定后确认相应位点已经突变。

7、将突变的cbx基因插入到PMD19-T-P-T的Pst I酶切位点

将PMD19-T-P-T载体用Pst I酶在37℃下，单酶切2h，回收酶切后的片段，用T4聚合酶补平酶切位点，再用T4连接酶在16℃下把cbx基因与回收后的片段进行连接，即得到pJW-EXP载体 ( 见图2 ) 。

实施例2：pJW-EXP-tVGB载体的构建

1、VGB基因的克隆

以美国芝加哥IIT中心illinois技术研究所B. C. Stark教授提供的质粒PUC 8:16，克隆了透明颤菌血红蛋白的基因(所用的引物为VGB-Nhe-F和VGB-Sma-R )，用引物

VGB-Nhe-F：5’-GCTAGCCTAGCTAGCATGTTAGACCAACAAACCGT- 3’

VGB-Sma-R：5’-GGGCCCGATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAAGA- 3’

进行PCR得到VGB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的透明颤菌血红蛋白；PCR条件为：95℃ 10min， 95℃ 30s，60℃ 30s， 72℃30s，72℃10min ( 见图3 ) 。

2、将VGB基因插入到pJW-EXP载体

将pJW-EXP载体用SmaI和NheI双酶切，回收酶切后的片段，用T4连接酶在16℃下，将VGB基因插入到pJW-EXP载体的NheI和SmaI之间即得到pJW-EXP-tVGB载体 ( 见图4 ) 。

实施例3：通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-tVGB转化到野生型灵芝细胞中

1、灵芝原生质体的制备及转化

先用溶壁酶将野生型灵芝菌丝制备成原生质体，然后将灵芝原生质体悬浮在100μL的STC ( 0.55 M的山梨醇，10 mM的CaCl₂，10 mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5 ) 中，再加入1μg的质粒DNA和PTC缓冲液 ( 60%的PEG4000 ( W/V ) ，10 mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，50 mM的CaCl₂ ) ；在冰上培养10min，再加入1mL的PTC缓冲液混合均匀并在室温培养20min；用10mL融化的CYM固体培养基与转化后的原生质体混合倒平板并加入carboxin使carboxin的终浓度为2 mg/L；在30℃下培养10天后可长出若干单菌落。

2、在含有carboxin抗性的平板上传代培养

把单菌落转移到含有2 mg/L的carboxin的CYM平板中，在30℃下传代培养约7天；经过3次在抗性平板上传代可获得稳定的转化子，用CTAB法提取转化后的灵芝基因组，具体操作步骤见实施例1步骤1。分别以转化后的灵芝基因组、野生型 ( WT ) 灵芝基因组、水( 阴性对照 ) 为模板，用

VGB-F：5’-CTAGCTAGCATGTTAGACCAACAAACCGTAGACACC- 3’

VGB-R：5’-GATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAACCCGGGGGA- 3’

作为验证引物进行PCR，PCR条件为：95℃ 10min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，72℃ 10min ( 见图5 )。以VGB-F 和VGB-R 为引物和基因组DNA为模板进行PCR，能够扩增出约441bp条带的菌株即可认为是导入了VGB基因的转基因灵芝。如图5所示，从转基因菌株上能够扩增出约441bp的条带，而野生型中没有出现此条带，只出现了一些非特异性条带。结果表明：VGB基因确实整合到了灵芝基因组上。

3、斜面培养

将阳性转化子转移到固体PDA培养基中 ( 含有2 mg/L的carboxin ) ，在28℃下培养5-7天。

4、一级种子培养

在250 mL摇瓶中添加40 mL种子培养基和10 mL菌丝体悬液 ( 从一支斜面中获得)，并在28℃，120 rpm下培养5天。

5、二级种子培养

在250 mL摇瓶中加入45 mL种子培养基和5 mL一级种子培养液 ( 大约500 mgDW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种 ) ，在28℃，120 rpm下培养2天。

6、发酵培养

在250 mL摇瓶中加入45 mL发酵培养基和5 mL二级种子发酵液 ( 大约500~600mg DW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种 ) ，在28℃，120 rpm下培养。

7、单体灵芝酸的分离和提取

准确称取干细胞粉末100 mg，加入3 mL 70%（v/v）乙醇浸泡过夜，超声处理3次，每次30 min。10000 rpm离心5 min后获得上清液。在50℃烘箱中烘干。用200μL色谱级甲醇彻底溶解，用0.22μm滤膜过滤。用HPLC检测灵芝酸单体。HPLC检测条件为：HPLC色谱柱为C18柱（Agilent 1200 series，5 μm Agilent Zorbax SB-C18 column，250×4.6 mm）；进样量 20μL；流速 1 mL/min；流动相A为甲醇/乙酸（100:0.5（v/v）），流动相B为超纯水， 0-20 min：A相为80 %-100 %等梯度洗脱；20 min-30 min：A相为100 %洗脱；30 min-35 min：A相为80 %洗脱；紫外检测波长为245 nm；洗脱时间35 min。记录相应的峰面积和出峰时间。

通过野生型和VGB菌株灵芝酸的含量的测定，结果表明：通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其发酵性能不受影响的情况下，VGB转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分别是WT菌株的3.1，3.2，2.1，3.6倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种灵芝多糖高产工程菌株Kmust-VGB-1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 质粒PUC 8:16

<400> 1

atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240

attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 300

gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 360

gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 420

tacgctcaag cggttgaata a 441

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 质粒PUC 8:16

<400> 2

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro

10

Val Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys

20 30

Asn Leu Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met

40

Gly Arg Gln Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr

50 60

Val Leu Ala Ala Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu

70

Pro Ala Val Lys Lys Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val

80 90

Ala Ala Ala His Tyr Pro Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala

100

Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp

110 120

Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln

130

Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala Val Glu

140 146

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccaaagccg ctctcatggc atggcac 27

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>4

gctagcgttg agagggggat gaagagtgag taagaag 37

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>5

atgagcgggt cagagagt 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgctctatgt cttgccttgt 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctgctcttc ccgattgctg catttgt 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctatgtcttg ccttgtctcg cgtcaacc 28

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagatcgtg aggcagcggt ataggc 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400>10

gcctataccg ctgcctcacg atcttc 26

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

gctagcctag ctagcatgtt agaccaacaa accgt 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

gggcccgatt tgtacgctca agacgctgaa taaga 35

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

ctagctagca tgttagacca acaaaccgta gacacc 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

gatttgtacg ctcaagacgc tgaataaccc ggggga 36

Claims (1)

1.一种灵芝酸高产工程菌株kmust-VGB-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.11301。