CN104955949A - 通过重组微生物的戊糖发酵 - Google Patents

通过重组微生物的戊糖发酵 Download PDF

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马修·G·米勒
本杰明·N·米杰茨
盖利特·梅舒拉姆-西蒙
罗伯特·麦克丹尼尔
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Abstract

本发明提供了适于在木糖向木酮糖的异构化中使用的方法和组合物，以及适于在木糖向木糖醇和木酮糖的转化中使用的方法和组合物，包括核酸构建体、重组真菌宿主细胞、和相关材料。

Description

通过重组微生物的戊糖发酵
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年11月20日提交的美国临时申请号61/728,398的权益，通过引用将其内容的全部并为了所有的目的并入本文。
对“序列表”、表、或作为ASCII文件提交的计算机程序表附件的引用
通过引用将在文件CX3-125WO1_ST25.TXT中书写的序列表特此并入，所述文件CX3-125WO1_ST25.TXT生成于2013年11月5日，70,459字节，机器格式IBM-PC，MS Windows操作系统。
发明领域
本发明提供了适于在木糖异构化为木酮糖中使用的方法和组合物，以及适于在木糖转化为木糖醇和木酮糖中使用的方法和组合物，所述方法和组合物包括核酸构建体、重组真菌宿主细胞、和相关材料。
背景
乙醇和乙醇混合燃料在巴西和在美国被广泛地用作运输燃料。这些燃料的燃烧被认为产生较少的通过石油的燃烧而产生的有害排气排放物(例如，碳氢化合物、氮氧化物、和挥发性有机化合物(VOC))。因为生物乙醇从其生成的植物生物质利用可再生能源太阳光，所以生物乙醇是乙醇的特别地偏好的形式。在美国，乙醇被用在从5％至85％乙醇的汽油混合燃料中。多达10％乙醇的混合燃料(E10)在美国被批准在所有的汽油车辆中使用，以及多达85％乙醇的混合燃料(E85)可在特别地设计的机动燃料车辆(FFV)中被使用。自2007年以后，巴西政府已强制将乙醇-汽油混合燃料用作车辆燃料，并且强制性的混合燃料为25％乙醇(E25)。
生物乙醇目前通过从碳原料得到的己糖的发酵生成。目前，只有来自甘蔗的糖和来自诸如玉米的原料的淀粉可被经济地转化。但是，有很大的兴趣利用木质纤维素原料，其中植物的纤维素部分被降解为糖并且随后转化为乙醇。木质纤维素生物质由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素和木质纤维素可在糖化过程中被水解为糖，所述糖可随后地经由发酵被转化为乙醇。来自木质纤维素的主要的可发酵的糖为葡萄糖和木糖。为了经济的乙醇产率，能有效地转化存在于纤维素原料中的所有的主要的糖的菌株将是高度地期望的。
发明概述
本发明提供了适于在木糖异构化为木酮糖中使用的方法和组合物，以及适于在木糖转化为木糖醇和木酮糖中使用的方法和组合物，所述方法和组合物包括核酸构建体、重组真菌宿主细胞、和相关材料。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核酸构建体的重组真菌宿主细胞，其中核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真核生物的或原核生物的酶。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真核生物的酶。在又一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真菌酶。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。在一些实施方案中，遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。在一些另外的实施方案中，遗传元件包括原核生物的或真核生物的复制起点和/或着丝粒维持序列。在一些实施方案中，复制起点和/或着丝粒维持序列为真菌序列。在一些另外的实施方案中，真菌复制起点为酵母复制起点。在仍然一些另外的实施方案中，多个多核苷酸序列中的至少一种被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。在又一些实施方案中，启动子序列为真菌启动子序列。在一些实施方案中，真菌启动子序列为酵母启动子序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录终止序列。在一些更多的实施方案中，多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。在又一些实施方案中，至少一种多核苷酸被整合入宿主细胞基因组中。在仍然一些另外的实施方案中，宿主细胞已有一种或更多种天然基因从其基因组缺失。在一些实施方案中，一种或更多种天然基因的缺失导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯(acetate)的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中相对于对应的无所述一种或更多种缺失的宿主细胞进行比较。在又一些实施方案中，宿主细胞被改变以过表达一种或更多种多核苷酸。在一些实施方案中，过表达导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中与对应的未改变的宿主细胞进行比较。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物(complement)杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含含有选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和23；SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:5的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在又一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本发明还提供了包含至少一种核酸构建体的重组真菌宿主细胞，其中核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，木糖异构酶为真核生物的或原核生物的酶，而在一些可选的实施方案中，木糖异构酶为真核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶为密褐褶孔菌(G.trabeum)木糖异构酶、根囊鞭菌属(Orpinomyces)木糖异构酶、从牛瘤胃获得的木糖异构酶、从人类肠获得的木糖异构酶、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)木糖异构酶、致病疫霉(P.infestans)木糖异构酶、或人芽囊原虫(B.hominis)木糖异构酶。在一些另外的实施方案中，至少一种核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。在一些实施方案中，遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。在一些另外的实施方案中，遗传元件包含原核生物的或真核生物的复制起点和/或着丝粒质粒维持序列。在一些实施方案中，复制起点和/或着丝粒质粒维持序列为真菌序列。在一些另外的实施方案中，真菌复制起点为酵母复制起点。在仍然一些另外的实施方案中，多种多核苷酸中的至少一种被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。在又一些实施方案中，启动子序列为真菌启动子序列。在一些实施方案中，真菌启动子序列为酵母启动子序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录终止序列。在一些更多的实施方案中，多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。在又一些实施方案中，至少一种多核苷酸被整合入宿主细胞基因组中。在仍然一些另外的实施方案中，宿主细胞已有一种或更多种天然基因从其基因组缺失。在一些实施方案中，一种或更多种天然基因的缺失导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中相对于对应的无所述一种或更多种缺失的宿主细胞进行比较。在又一些实施方案中，宿主细胞被改变以过表达一种或更多种多核苷酸。在一些实施方案中，过表达导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中与对应的未改变的宿主细胞进行比较。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含含有选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和23；SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:5的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在又一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含含有选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ IDNO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在又一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母。
本发明还提供了包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列。在又一些实施方案中，本发明提供了包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列、和/或编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列、和/或编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列的重组核酸构建体。在又一些实施方案中，本发明提供了包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列、编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列、和/或编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列的重组核酸构建体。在又一些实施方案中，本发明提供了包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列、编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列、和编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，木糖异构酶、和/或木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为真核生物的或原核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为真核生物的或原核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真核生物的或原核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶、和/或木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为真核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为真核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真核生物的酶。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶、和/或木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为真菌酶。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为真菌酶。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真菌酶。在又一些实施方案中，木糖异构酶、和/或木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为酵母酶。在又一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶为酵母酶。在又一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为酵母酶。在一些另外的实施方案中，至少一种核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。在一些实施方案中，遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。在一些另外的实施方案中，遗传元件包括原核生物的或真核生物的复制起点和/或着丝粒质粒维持序列。在一些实施方案中，复制起点和/或着丝粒质粒维持序列为真菌序列。在一些另外的实施方案中，真菌复制起点为酵母复制起点。在仍然一些另外的实施方案中，多核苷酸序列中的至少一种被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。在又一些实施方案中，启动子序列为真菌启动子序列。在一些实施方案中，真菌启动子序列为酵母启动子序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录终止序列。在一些更多的实施方案中，多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。在一些另外的实施方案中，编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，和/或编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，和/或编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，其中所述启动子序列在真菌宿主细胞中是功能性的。在一些另外的实施方案中，编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，和/或编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，其中所述启动子序列在真菌宿主细胞中是功能性的。在一些另外的实施方案中，编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，并且编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，其中所述启动子序列在真菌宿主细胞中是功能性的。在一些实施方案中，一种或更多种启动子序列为真菌启动子序列。在一些实施方案中，真菌启动子序列为酵母启动子序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的至少一种转录终止序列。在又一些实施方案中，多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。在仍然一些另外的实施方案中，构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在仍然一些另外的实施方案中，构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ IDNO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在又一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些其它的实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，至少一种多核苷酸序列编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和23；SEQ IDNO:3；和SEQ ID NO:5的至少一种序列。在一些另外的实施方案中，以上描述的构建体中的任一种还包含编码至少一种木糖还原酶的多核苷酸序列。
本发明还提供了包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，木糖异构酶为真核生物的或原核生物的酶，而在一些可选的实施方案中，木糖异构酶为真核生物的酶。在一些实施方案中，木糖异构酶为密褐褶孔菌木糖异构酶、根囊鞭菌属木糖异构酶、从牛瘤胃获得的木糖异构酶、从人类肠获得的木糖异构酶、博伊丁假丝酵母木糖异构酶、致病疫霉木糖异构酶、或人芽囊原虫木糖异构酶。在一些另外的实施方案中，至少一种核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。一些实施方案中，遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。在一些另外的实施方案中，遗传元件包括原核生物的或真核生物的复制起点和/或着丝粒质粒维持序列。在一些实施方案中，复制起点和/或着丝粒质粒维持序列为真菌序列。在一些另外的实施方案中，真菌复制起点为酵母复制起点。在仍然一些另外的实施方案中，多核苷酸序列中的至少一种被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。在又一些实施方案中，启动子序列为真菌启动子序列。在一些实施方案中，真菌启动子序列为酵母启动子序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录终止序列。在一些更多的实施方案中，多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。在又一些实施方案中，至少一种多核苷酸被整合入宿主细胞基因组中。在仍然一些另外的实施方案中，宿主细胞已有一种或更多种天然基因从其基因组缺失。在一些实施方案中，一种或更多种天然基因的缺失导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中相对于对应的无所述一种或更多种缺失的宿主细胞进行比较。在又一些实施方案中，宿主细胞被改变以过表达一种或更多种多核苷酸。在一些实施方案中，过表达导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中与对应的未改变的宿主细胞进行比较。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含含有选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和23；SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:5的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在又一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含包含选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ IDNO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ IDNO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在又一些实施方案中，核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，至少一种多核苷酸序列编码至少一种木糖异构酶，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21、和23的至少一种序列。在又一些实施方案中，核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、和/或至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和/或至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞为酵母细胞。在又一些实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母。
本发明还提供了包含木糖异构酶多肽、和/或木糖醇脱氢酶多肽、和/或木酮糖激酶多肽的分离的多肽序列。本发明还提供了包含至少一种木糖异构酶多肽、和/或至少一种木糖醇脱氢酶多肽、和/或至少一种木酮糖激酶多肽的分离的多肽序列。本发明还提供了包含至少一种木糖异构酶多肽、至少一种木糖醇脱氢酶多肽、和/或至少一种木酮糖激酶多肽的分离的多肽序列。在一些实施方案中，木糖异构酶多肽含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多肽含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多肽含有与SEQ IDNO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。在又一些实施方案中，木糖异构酶多肽含有与SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多肽含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多肽含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、12、3、15、17、19、21、和/或23具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多肽含有由与SEQ ID NO:5具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在又一些实施方案中，木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多肽含有由与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在仍然一些另外的实施方案中，木糖异构酶多肽由选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23的多核苷酸序列编码；木糖醇脱氢酶多肽由SEQ ID NO:3编码；并且木酮糖激酶由SEQ ID NO:5编码。
本发明还提供了包含木糖异构酶多核苷酸、木糖醇脱氢酶多肽、和木酮糖激酶多肽的分离的多核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸序列包含至少一种木糖异构酶多核苷酸、和/或至少一种木糖醇脱氢酶多肽、和/或至少一种木酮糖激酶多肽。在又一些实施方案中，分离的多核苷酸序列包含至少一种木糖异构酶多核苷酸、至少一种木糖醇脱氢酶多肽、和/或至少一种木酮糖激酶多肽。在一些其它的实施方案中，分离的多核苷酸序列包含至少一种木糖异构酶多核苷酸、至少一种木糖醇脱氢酶多肽、和至少一种木酮糖激酶多肽。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:1、7、9、12、3、15、17、19、21、和/或23具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；和/或木糖醇脱氢酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；和/或木酮糖激酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:5具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性。在又一些的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:1、7、9、12、3、15、17、19、21、和/或23具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；木糖醇脱氢酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；和/或木酮糖激酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:5具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性。在仍然一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:1、7、9、12、3、15、17、19、21、和/或23具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；木糖醇脱氢酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；并且木酮糖激酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:5具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性。在一些实施方案中，木糖异构酶多肽含有由与SEQ IDNO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23具有至少70％、至少约71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和/或木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多肽含有由与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQID NO:3具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多肽含有由与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多肽含有由与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。在又一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列选自SEQID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；和/或木糖醇脱氢酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:3；和/或木酮糖激酶多核苷酸序列为SEQ IDNO:5。在又一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；木糖醇脱氢酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:3；和/或木酮糖激酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:5。在又一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；木糖醇脱氢酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:3；并且木酮糖激酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:5。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；和/或木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ IDNO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ IDNO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。在又一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；和/或木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列。在又一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ IDNO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列。在又一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24的氨基酸序列；和/或木糖醇脱氢酶多核苷酸序列编码在SEQ ID NO:4中展示的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多核苷酸序列编码在SEQ ID NO:6中展示的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多核苷酸序列编码在SEQ ID NO:4中展示的氨基酸序列；和/或木酮糖激酶多核苷酸序列编码在SEQ ID NO:6中展示的氨基酸序列。在一些另外的实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24的氨基酸序列；木糖醇脱氢酶多核苷酸序列编码在SEQ IDNO:4中展示的氨基酸序列；并且木酮糖激酶多核苷酸序列编码在SEQ IDNO:6中展示的氨基酸序列。
本发明还提供了用于生成发酵产物的方法，包括：提供如本文提供的重组真菌宿主细胞；提供发酵培养基；以及在适于生成发酵产物的条件下使发酵培养基与重组真菌宿主细胞接触。在一些实施方案中，方法还包括回收发酵产物的步骤。在一些另外的实施方案中，在选自厌氧、微好氧或好氧条件的条件下进行发酵步骤。在又一些实施方案中，发酵产物选自以下：醇、脂肪醇、脂肪酸、乳酸、乙酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、和β-内酰胺。在一些仍然另外的实施方案中，发酵产物为选自乙醇和丁醇的醇。在一些实施方案中，发酵产物为乙醇。在一些实施方案中，发酵培养基包含来自糖化过程的产物。在又一些实施方案中，发酵培养基包含半纤维素原料。
本发明还提供了从至少一种纤维素底物生成至少一种终产物的方法，包括：提供至少一种纤维素底物和包含至少一种纤维素酶的至少一种酶组合物；在可发酵的糖藉以在糖化反应中从纤维素底物生成的条件下，使纤维素底物与酶组合物接触；以及在发酵条件下使可发酵的糖与微生物接触，从而生成至少一种终产物。在一些实施方案中，方法包括同步的糖化反应和发酵反应(SSF)，而在一些可选的实施方案中，方法包括在独立的反应中的纤维素底物的糖化以及发酵(SHF)。在又一些实施方案中，酶组合物与糖化反应和发酵同步地生成。在一些实施方案中，方法还在糖化反应中包括至少一种添加剂成分(adjunct composition)。在一些另外的实施方案中，添加剂成分选自至少一种二价金属阳离子、铜、没食子酸、和/或至少一种表面活性剂。在又一些实施方案中，方法在约pH 5.0下执行，而在一些可选的实施方案中，方法在约pH 6.0下执行。在又一些实施方案中，方法还包括回收至少一种终产物。在一些实施方案中，终产物包括至少一种发酵终产物。在一些另外的实施方案中，发酵终产物选自以下：醇、脂肪酸、乳酸、乙酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、脂肪醇、丁二烯、和β-内酰胺。在仍然一些其它的实施方案中，发酵终产物为选自乙醇和丁醇的至少一种醇。在一些实施方案中，醇为乙醇。在一些另外的实施方案中，微生物为酵母。在一些实施方案中，酵母为酵母属(Saccharomyces)。在一些另外的实施方案中，方法还包括回收至少一种发酵终产物。
附图说明
图1阐明了木糖转化途径。在酵母和丝状真菌中，D-木糖最初被NAD(P)H-依赖性木糖还原酶(“XR”)还原为木糖醇。木糖醇随后地被NAD+-依赖性木糖醇脱氢酶(“XDH”或“XD”)氧化为D-木酮糖。木酮糖激酶(“XK”)随后磷酸化D-木酮糖以生成5-磷酸D-木酮糖，然后5-磷酸D-木酮糖通过戊糖磷酸途径(“PPP”)被进一步代谢。在细菌中，D-木糖被木糖异构酶(“XT”)直接地转化成D-木酮糖。
图2A-C阐明了用于将D-木酮糖-5-P转化成乙醇的代谢途径。
图2A阐明了戊糖磷酸途径(PPP)。显示了底物和产物。通过如以下的数字来表示酶：6.5-磷酸核酮糖3-表异构酶；7.转酮醇酶(TKL1)；8.转醛醇酶(TAL1)；9.5-磷酸核糖酮异构酶(RKI1)；10.6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND1)；11.6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(SOL3)；和12.6-磷酸葡萄糖-1-脱氢酶(ZWF)。
图2B阐明了糖酵解的途径。显示了底物和产物。通过如以下的数字来表示酶：13.己糖激酶；14.磷酸葡萄糖异构酶；15.磷酸果糖激酶；16.醛缩酶；17.磷酸丙糖异构酶；18.甘油醛-3-磷酸脱氢酶；19.3-磷酸甘油酸激酶；20.磷酸甘油酸变位酶；21.烯醇酶；和22.丙酮酸激酶。
图2C阐明了用于将丙酮酸转化成乙醇的代谢途径。显示了底物和产物。通过如以下的数字来表示酶：23.丙酮酸脱羧酶；24.醛脱氢酶；和25.醇脱氢酶。
图3提供了显示以不同的组合含有XI、XD和XK基因的菌株的发酵结果的图。在96孔板中在用30g/l木糖补充的YPD培养基中进行发酵。显示了残留的木糖，以及生成的乙醇和木糖醇。框中的数字表示与含有空质粒的对照菌株比较消耗的木糖(n＝7，误差线±SD)。
图4提供了显示在几种发酵条件下由含有XI-XD-XK途径的不同菌株消耗的木糖相对于由只含有XI基因的相同菌株消耗的木糖的倍数提高的图。
图5提供了显示含有空质粒(阴性对照)、XI-XD-XK途径或仅XI基因的单倍体菌株的25-mL发酵的时程分析的图。
图6提供了XIDK整合构建体的图谱。
图7提供了显示如在含有来自多种来源的XI基因的源自NRRL Y1528的单倍体菌株的发酵之后测量的残留的木糖的图。发酵在96孔板中在用30g/l木糖补充的YPD培养基中进行72小时(n＝7，误差线±SD)。
图8提供了质粒PLS0030112的图谱。
图9提供了质粒PLS0044980的图谱。
发明描述
本发明提供了适于在木糖向木酮糖的异构化中使用的方法和组合物，以及适于在木糖向木糖醇和木酮糖的转化中使用的方法和组合物，包括核酸构建体、重组真菌宿主细胞，和相关材料。
本文提及的所有的专利和出版物，包括在此类专利和出版物内公开的所有序列通过引用被明确地并入。除非另有说明，本发明的实施涉及在分子生物学、发酵、微生物学和相关领域中被通常地使用的本领域技术人员所已知的常规技术。除非本文另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与由该发明所属的技术领域中普通技术人员所通常地理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料可被使用于本发明的实践或测试中，但是描述了一些优选的方法和材料。事实上，意图本发明不局限于本文描述的特定的方法、方案、和试剂，由于这些取决于在其中使用方法、方案、和试剂的背景可变化。本文提供的标题不是本发明的多个方面或实施方案的限制。
为了便于本发明的理解，以下限定了很多术语。数值范围包含限定范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意图包含落在此较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，犹如此较窄的数值范围都在本文明确地写出。还意图本文公开的每个最大(或最小)数值限制包含每个较低(或较高)的数值限制，犹如此较低(或较高)的数值限制明确地在本文写出。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”及其同源词以其包含式的意义使用(即，等价于术语“包括(including)”及其相应的同源词)。
如本文以及在所附的权利要求中使用的，单数的“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的指代对象，除非上下文另有清楚地说明。因此，例如，提及“宿主细胞”包括多个此类宿主细胞。
除非另有说明，分别地，核酸从左到右以5’至3’方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基方向书写。本文提供的标题不是本发明的多种方面或实施方案的限制，本发明的多种方面或实施方案可通过参考作为一个整体的说明书而获得。因此，以下限定的术语通过参考作为一个整体的说明书来更加充分地限定。
如本文使用的，术语“分离的”和“纯化的”被用来指从分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其它成分天然地与其相关的至少一种其它的成分移除的分子或其它成分。
如本文使用的，术语“参考酶”指另一种酶(即，“测试酶”)与其比较的酶，以确定正被评价的测试酶中的提高的特性的存在，所述提高的特性包括但不局限于提高的活性、热活性(thermoactivity)、热稳定性、和/或稳定性。在一些实施方案中，参考酶为野生型酶(例如，野生型木糖异构酶、野生型木糖醇脱氢酶、或野生型木酮糖激酶)。在一些实施方案中，参考酶为另一种变体酶(例如，本发明的另一种变体木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、或木酮糖激酶)。
如本文使用的，术语“重组的”指在宿主细胞中非天然存在的多核苷酸或多肽。重组分子可包含以非天然存在的方式连接在一起的两种或更多种天然存在的序列。“重组细胞”包含重组的多核苷酸或多肽。
如本文使用的，术语“过表达”意图包括增加蛋白质的生成(即，表达)至比细胞正常地生成更大的水平。意图该术语包括内源的、以及异源的蛋白质的过表达。
如本文使用的“亲本”指起始的细胞、基因或蛋白质。在一些实施方案中，“亲代菌株”被用作起点以生成另外的菌株(例如，衍生物)。在一些另外的实施方案中，“亲代分子”(例如，“亲代酶”)被用作起点用于演化/修饰以生成变体分子(例如，“变异酶”)。为了清楚，提及特定菌株的细胞指菌株的亲代细胞及其后代和遗传上修饰的衍生物。亲代细胞的遗传上修饰的衍生物包括含有修饰的基因组或给予例如抗生素抗性、提高的发酵能力、利用木糖作为碳源的能力等的附加体质粒的后代细胞。
如本文使用的，在提及特定的序列时，术语“修饰”包括在亲代氨基酸序列中的任何改变，包括但不局限于对序列的任何成分的至少一个取代、缺失、和/或插入，以及任何改变。该术语还包括在亲本核苷酸序列中的任何改变，包括但不局限于至少一个取代、缺失、插入、和/或点突变等，(例如，对序列的任何成分的任何改变)。因此，术语“修饰”包括术语“突变”，其中亲本核苷酸序列和/或肽序列通过任何诱变的方法而被改变。
当核酸构建体、核酸(例如，多核苷酸)、多肽、或宿主细胞为非天然存在的、人工的和/或工程化的时，在本文中被称作“重组的”。
本文中术语“木糖异构酶”和“木糖异构酶多肽”是可互换地使用的，来指能催化将D-木糖直接地异构化成D-木酮糖的酶。催化将D-木糖直接地异构化成D-木酮糖的能力本文被称作“木糖异构酶活性”。
术语“木糖醇脱氢酶”和“木糖醇脱氢酶多肽”在本文中是可互换地使用的，来指能将木糖醇催化成木酮糖的酶。将木糖醇催化成木酮糖的能力本文被称作“木糖醇脱氢酶活性”。同样，如本文使用的，术语“木糖醇脱氢酶多核苷酸”指编码木糖醇脱氢酶多肽的多核苷酸。
术语“木酮糖激酶”指磷酸化D-木酮糖以生成5-磷酸D-木酮糖的酶，然后5-磷酸D-木酮糖通过戊糖磷酸途径而被进一步代谢。
例如，术语“木糖异构酶多核苷酸”指编码木糖异构酶多肽的多核苷酸。术语“木糖醇脱氢酶多核苷酸”指编码木糖醇脱氢酶多肽的多核苷酸。术语“木酮糖激酶多核苷酸”指编码木酮糖激酶多肽的多核苷酸。
术语“木糖还原酶”和“木糖还原酶多肽”在本文中是可互换地使用的，来指能将木糖催化成木糖醇的酶。将木糖催化成木糖醇的能力本文中被称作“木糖还原酶活性”。术语“木糖还原酶多核苷酸”指编码木糖还原酶多肽的多核苷酸。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中是可互换地使用的，来指氨基酸残基的聚合物。如本文使用的，术语“酶变体”和“变体酶”用来指与参考酶特别地是在其功能方面相似，但是在其氨基酸序列中有突变、使其在序列上与野生型或另一种参考酶的不同的酶。酶变体(例如，“木糖还原酶变体”、“木糖醇脱氢酶变体”、和/或“木酮糖激酶变体”)可利用本领域技术人员熟知的任何的很多种不同的诱变技术来制备。另外，诱变试剂盒还是从很多商业的分子生物学供应商可得的。方法是可利用的以进行在限定的氨基酸处(位点定向的)的特定的取代，在基因的定位区域中的特定或随机突变(区特定的)或遍布整个基因的随机诱变(例如，饱和诱变)。本领域技术人员已知很多合适的方法来生成酶变体，包括但不局限于利用PCR的单链DNA或双链DNA的位点定向的诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、重排(shuffling)、和化学饱和诱变，或本领域已知的任何其它合适的方法。变体生成之后，其可针对期望的特性而被筛选(例如，高或增加的、或低或减少的活性，增加的热和/或碱稳定性等)。
如本文使用的，“组合变体”指具有两种或更多种突变(例如，取代)的任何变体。在一些实施方案中，突变的组合导致酶活性的变化(例如，提高的热稳定性、热活性、和/或比活性等)。
如本文使用的，术语“木糖异构酶变体”指已从初始的起始木糖异构酶修饰的木糖异构酶。在一些实施方案中，该术语被用来指相对于野生型木糖异构酶或编码木糖异构酶的野生型多核苷酸包含一种或更多种修饰(诸如在多肽或多核苷酸中分别地一个或更多个氨基酸残基或一个或更多个特定核苷酸或密码子的取代、插入、缺失、和/或截短)的木糖异构酶多肽或编码木糖异构酶多肽的多核苷酸、及其生物活性片段。在一些实施方案中，木糖异构酶变体为木糖异构酶嵌合体。
术语“酶嵌合体”、“嵌合变体”、和“嵌合酶”指包含来自至少两种不同的亲本分子的序列的酶。在一些实施方案中，嵌合体为由已从至少两个基因拼接在一起的核苷酸序列编码的杂合蛋白质。并非意图将本发明限制为任何特定数目的起始(即，“亲代”序列)。在一些实施方案中，术语“嵌合的”指包含来自两种或更多种不同来源的序列的核酸、核苷酸序列和/或其编码的产物。预期任何合适的来源将可用于本发明，包括但不局限于核酸、核苷酸序列、核糖体核酸、RNA、DNA、调节核苷酸序列(例如，启动子、URL、增强子、抑制子等)、编码核酸、基因、核酸接头、核酸标签、氨基酸序列、肽、多肽、蛋白质、染色体、和/或生物体。在一些实施方案中，“嵌合的”分子包括来自任何合适的来源的连续的核苷酸或氨基酸的序列，所述合适的来源包括但不局限于病毒、真核生物、和/或原核生物等。在一些实施方案中，嵌合体通过并列放置相关和/或不相关的核酸序列、核苷酸序列、和/或DNA区段的片段来生成。在一些实施方案中，核酸、核苷酸序列和/或DNA区段为天然的(例如，野生型)序列，而在其它的实施方案中，其为突变和/或工程化的(例如，重组的)序列。并非意图本发明被限制为任何特定的起始元件。在一些实施方案中，嵌合体包含来自一种生物体的序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个序列)和来自至少一种其它的生物体的序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个序列)(例如，作为连续的核苷酸或连续的氨基酸)。在一些实施方案中，生物体为微生物，包括但不局限于细菌、酵母、丝状真菌等。在一些实施方案中，从相同属和/或物种但不同菌株的至少两种生物体获得序列。在一些其它的实施方案中，从相同物种的至少两种生物体获得序列，而在一些其它的实施方案中，从相同属(即，不同物种)的至少两种生物体获得序列。在一些实施方案中，嵌合体包含来自一个细菌物种的酶的部分和来自至少一个另外的细菌物种的酶的至少一个另外的部分。在一些实施方案中，嵌合体包含来自一个真菌物种的酶的部分和来自至少一个另外的真菌物种的酶的至少一个另外的部分。在一些实施方案中，嵌合体包含从多种类型的生物体获得的序列，例如细菌和真菌物种的组合，以及细菌、真菌、病毒、和/或植物物种的组合。本发明的一些实施方案包含来自植物的酶的一部分、来自细菌的酶的另一部分、和来自真菌的酶的另一部分。事实上，意图亲代生物体的任何组合将可用在本发明中。在一些实施方案中，嵌合体通过两种或更多种核苷酸序列的重组生成。用于重组的任何合适的方法可用于生成嵌合体。在一些实施方案中，用来生成嵌合体的片段被并置为单元(例如，来自多种来源的核苷酸序列被头至头的连接并且不散布)。在其中嵌合体包含每种源生物体的连续的核苷酸的一个段(stretch)的一些实施方案中，核苷酸序列组合可被记作DNA源1(1DNA)、DNA源2(2DNA)等(例如，1DNA/2DNA等)，包括其组合。在一些其它的实施方案中，用来生成嵌合体的片段是散布的(例如，1DNA/2DNA/4DNA/3DNA等)。在一些实施方案中，嵌合的核苷酸序列编码比任何的源核苷酸序列高的活性。在一些替代的实施方案中，嵌合的核苷酸序列具有与源核苷酸序列相似或相同的活性，但是活性的量或活性的动力学(例如，增加的或减少的活性)、比活性、和/或活性的方面是被改变的。在一些另外的实施方案中，嵌合的核苷酸序列编码不同的活性并且在一些另外的实施方案中，嵌合的核苷酸序列编码嵌合的活性(例如，两种或更多种活性的组合)。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的木糖异构酶多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％相同、至少约71％相同、至少约72％相同、至少约73％相同、至少约74％相同、至少约75％相同、至少约76％相同、至少约77％相同、至少约78％相同、至少约79％相同、至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同的多核苷酸序列、和/或任何这些序列的片段。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的木糖醇脱氢酶多核苷酸包含与SEQ ID NO:3至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％相同、至少约71％相同、至少约72％相同、至少约73％相同、至少约74％相同、至少约75％相同、至少约76％相同、至少约77％相同、至少约78％相同、至少约79％相同、至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同的多核苷酸序列、和/或任何这些序列的片段。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的核酮糖激酶多核苷酸包含与SEQ ID NO:5至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％相同、至少约71％相同、至少约72％相同、至少约73％相同、至少约74％相同、至少约75％相同、至少约76％相同、至少约77％相同、至少约78％相同、至少约79％相同、至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同的多核苷酸序列、和/或任何这些序列的片段。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的木糖异构酶多肽包含与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约71％相同、至少约72％相同、至少约73％相同、至少约74％相同、至少约75％相同、至少约76％相同、至少约77％相同、至少约78％相同、至少约79％相同、至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同的多肽序列、和/或任何这些序列的片段。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的木糖醇脱氢酶多肽包含与SEQ ID NO:4至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％相同、至少约71％相同、至少约72％相同、至少约73％相同、至少约74％相同、至少约75％相同、至少约76％相同、至少约77％相同、至少约78％相同、至少约79％相同、至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同的多肽序列、和/或任何这些序列的片段。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的木酮糖激酶多肽包含与SEQ ID NO:6至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％相同、至少约71％相同、至少约72％相同、至少约73％相同、至少约74％相同、至少约75％相同、至少约76％相同、至少约77％相同、至少约78％相同、至少约79％相同、至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同的多肽序列、和/或任何这些序列的片段。
在本文中术语“同一性百分比”、“％同一性”、“相同的百分比”、和“％相同的”可互换地用来指通过ClustalW分析(版本W 1.8，从EuropeanBioinformatics Institute,Cambrige,UK可获得)获得的氨基酸或多核苷酸序列同一性百分比，计数比对中相同匹配的数目并将此相同匹配的数目除以参考序列的长度，并且利用以下ClustalW参数来完成慢/准确成对最优比对-DNA/蛋白质空位开放罚分：15/10；DNA/蛋白质空位扩展罚分：6.66/0.1；蛋白权重矩阵：Gonnet系列；DNA权重矩阵：同一性；Toggle慢/快成对比对＝SLOW或FULL比对；K-字节组匹配的DNA/蛋白质数目：2/1；最佳对角线DNA/蛋白质数目：4/5；DNA/蛋白质窗口大小：4/5。
当两种序列利用限定的氨基酸取代矩阵(例如BLOSUM62)、空位存在罚分和空位扩展罚分将两个序列针对相似性得分比对以到达对于该序列对可能的最高得分时，两个序列是“对齐的”。氨基酸取代矩阵及其在定量两个序列之间的相似度中的应用是本领域已知的(参见，例如Dayhoff等人，在Dayhoff[编辑],“Atlas of Protein Sequence and Structure”，卷5，增刊3,Natl.Biomed.Res.Round.,Washington D.C.[1978]，345-352页；和Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919[1992]，通过引用将其两者并入)。BLOSUM62矩阵在诸如Gapped BLAST 2.0的序列比对方案中经常被用作默认评分取代矩阵。空位存在罚分被施加用于在比对的序列之一中引入单氨基酸空位，并且空位扩展罚分被施加用于被插入至已经开放的空位的每个另外的空白氨基酸位置。比对通过每个序列的比对开始和结束处的氨基酸位置限定，并且任选地通过在一个或两者序列中插入空位或多个空位以使得到达最高的可能得分。尽管最佳的比对和得分能手动地来完成，所述过程通过计算机实施的比对算法的应用来促进(例如，空位的BLAST 2.0；参见，Altschul等人，Nucleic Acids Res.,25:3389-3402[1997]，通过引用将其并入本文)，并且在National Center for BiotechnologyInformation Website)使公众可得。包括多重比对的最佳的比对可利用诸如PSI-BLAST(参见，例如Altschul等人，同上)的容易地可得的软件准备。
本发明还提供了包含在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸序列的重组的核酸构建体。编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或的氨基酸序列的多肽的示例性多核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23。
在一些实施方案中，与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸，在高或很高的严格条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的序列的多肽的参考序列的互补物进行此杂交(例如，遍及参考序列的基本上整个长度)。
当核酸通常地在溶液中交联时，核酸“杂交”。有很多提供关于核酸的杂交方法的细节的教科书和其它参考材料(参见，例如，Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,"第1部分，第2章,Elsevier,New York,[1993]，通过引用并入本文)。对于长度至少100个核苷酸的多核苷酸，如以下限定低至很高的严格条件：标准DNA印记过程之后，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精DNA、和对于低严格性25％甲酰胺、对于中和中高严格性35％甲酰胺、或对于高和很高严格性50％甲酰胺中，在42℃下预杂交和杂交。对于长度至少200个核苷酸的多核苷酸，利用2×SSC、0.2％SDS在至少50℃下(低严格性)、在至少55℃下(中严格性)、在至少60℃下(中高严格性)、在至少65℃下(高严格性)、和在至少70℃下(很高严格性)将载体材料最后地洗涤三次，每次15分钟。
当在给出的氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中使用时，术语“对应于”、“关于”、和“相对于”指当给出的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比时指定的参考序列的残基的编号。
当在给出的多肽或多核苷酸序列的编号的上下文中使用时，术语“关于……编号的”或“对应于”指当给出的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比较时指定的参考序列的残基的编号。
氨基酸或核苷酸“位置”由基于其相对于N-末端或5’-末端的位置连续地标识参考序列中的每个氨基酸或核苷酸的数字表示。由于当确定最佳的比对时，必须考虑缺失、插入、截短、融合等，所以一般在由从N-末端或5’末端简单计数来确定的测试序列中的氨基酸残基编号将不必要与其在参考序列中的对应位置的编号相同。例如，在在比对的测试序列中有缺失的情况中，在缺失的位点处将无与参考序列中的位置对应的氨基酸。在在比对的参考序列中有插入时，该插入将不与参考序列中的任何氨基酸位置对应。在截短或融合的情况中，在参考或比对的序列中可有不与参考序列中的任何氨基酸对应的氨基酸的段。如本文使用的，提及变体(例如，有取代、插入、和/或缺失的变体)时，连字号指示序列中的缺失并且星号指示终止密码子中的突变。
如本文使用的，术语“保守取代”指通常地不改变所编码的多肽的比活性的残基对另一种残基的取代。在一些实施方案中，如关于氨基酸使用的“保守取代”，指用化学上相似的氨基酸取代一个氨基酸。示例性保守取代为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)的同一组内的取代。经常保留其中进行取代的多肽的结构和/或功能特性的氨基酸取代被本领域所熟知。通常地不改变比活性的氨基酸取代被本领域所熟知(参见例如Neurath和Hill,The Proteins,Academic Press,New York[1979]，通过引用将其并入本文)。最通常地发生的交换中的一些为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、His/Asn、His/Gln、Lys/Asn、Lys/Gln、Lys/Gln、Tyr/Phe、Tyr/His、Tyr/Tarp、Ala/Pro、Lys/Arg、Gln/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Leu/Met、Ile/Met、Ala/Glu、Glu/Gln、Phe/Leu、Phe/Met、Val/Met和Asp/Gly，以及这些反过来。
以下术语可用于描述参考序列中相对于参考序列或变体多肽或核酸序列的取代：“R-#-V”，其中“#”指在参考序列中的位置，“R”指在参考序列中在该位置处的氨基酸(或碱基)，并且“V”指在变体序列中在该位置处的氨基酸(或碱基)。在一些实施方案中，氨基酸(或碱基)可被称为“X”，通过其意思是任何氨基酸(或碱基)。作为非限制性实例，对于以参考SEQ ID NO:2描述的变体多肽，“E10G”表示在变体多肽中，在参考序列的位置10处的谷氨酸被甘氨酸取代，并且氨基酸位置通过变体序列与SEQ ID NO:2的最佳对齐来确定。相似地，“E10G/D”描述了两种变体：其中参考序列的位置10处的谷氨酸被甘氨酸取代的变体；和其中参考序列的位置10处的谷氨酸被天冬氨酸取代的变体。
如本文使用的，当在氨基酸序列(例如，多肽)的上下文中使用时术语“氨基酸取代组”和“取代组”指一组(即，多个)氨基酸取代。
如本文使用的，当在氨基酸序列(例如，多肽)的上下文中使用时，术语“氨基酸突变组”和“突变组”指一组(即，多个)氨基酸取代、插入、和/或缺失。
如本文使用的，当在核苷酸序列(例如，多核苷酸)的上下文中使用时，术语“核酸取代组”和“取代组”指一组(即，多个)核酸取代。
如本文使用的，当在核苷酸序列(例如，多核苷酸)的上下文中使用时，术语“核酸突变组”和“突变组”指一组(即，多个)核酸取代、插入、和/或缺失。
如本文使用的，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”指对于包含本文提供的DNA的表达载体的合适的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞为已用利用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核生物的或真核生物的细胞。转化的宿主能复制编码感兴趣的至少一种蛋白质的载体和/或表达感兴趣的期望的蛋白质。另外，提及特定菌株的细胞指菌株的亲代细胞以及后代和遗传修饰的衍生物。亲代细胞的遗传修饰的衍生物包括含有给予例如抗生素抗性、改良的发酵等的修饰的基因组或附加型质粒的后代细胞。在一些实施方案中，宿主细胞被遗传修饰成具有提高蛋白质分泌、蛋白质稳定性或蛋白质的表达和/或分泌所需的其它特性的特征。遗传修饰能通过任何合适的遗传工程化技术和/或传统的微生物技术(例如化学或UV诱变和随后的选择)来完成。利用重组技术，能以导致生物体内或培养基中增加的感兴趣的酶的产率的方式引入、缺失、抑制或修饰核酸分子。在一些遗传工程化方法中，同源重组被用来通过体内特异地靶向基因来引起靶基因修饰以抑制所编码的蛋白质的表达。在可选的方法中，siRNA、反义、和/或核酶技术可用于抑制基因表达。
如本文使用的，关于细胞使用术语“转化(transformed)”或“转化(transformation)”意思是细胞具有被整合入其基因组的非天然的核酸序列或具有经多代维持的附加体质粒。
如本文使用的，术语“副产物”指为特定的发酵过程的不期望的产物的有机分子。
如本文使用的，术语“木糖途径”指木糖转化成磷酸木酮糖的步骤，磷酸木酮糖然后通过戊糖磷酸途径代谢。在一些实施方案中，这包括木糖还原为木糖醇、木糖醇氧化为木酮糖以及随后的木酮糖向磷酸木酮糖的转化。在一些其他实施方案中，木糖被直接地转化成木酮糖，然后木酮糖被磷酸化为磷酸木酮糖。
如本文使用的，术语“木糖途径酶”指催化木糖转化成磷酸木酮糖的酶，然后磷酸木酮糖通过戊糖磷酸途径被代谢。在一些实施方案中，这些酶包括木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶。在一些其它的实施方案中，酶包括木糖异构酶和木酮糖激酶。在一些另外的实施方案中，酶包括木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶。
发明详述
本发明提供了适于在木糖向木酮糖的异构化中使用的方法和组合物，以及适于在木糖向木糖醇和木酮糖的转化中使用的方法和组合物，包含核酸构建体、重组真菌宿主细胞、和相关材料。
在真菌和细菌中用于木糖利用的起始代谢途径不同。在包括木糖发酵酵母(例如，树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae))的大多数真菌中，D-木糖通过包含辅因子NAD(P)H和NAD(P)+的两种氧化还原酶被转化成D-木酮糖(参见，Matsushika等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,84:37-53[2009])。在这些生物体中，D-木糖最初被NAD(P)H依赖的木糖还原酶(XR)(EC 1.1.1.21)还原为木糖醇。木糖醇随后被NAD+依赖的木糖醇脱氢酶(XDH)(EC 1.1.1.9)氧化成D-木酮糖。木酮糖激酶(XK)(EC 2.7.1.17)随后磷酸化D-木酮糖以生成5-磷酸D-木酮糖(X5P)，然后5-磷酸D-木酮糖通过戊糖磷酸途径(PPP)被进一步代谢。
虽然编码XR、XDH、和XK的基因存在于酿酒酵母的大部分菌株基因组中，但是，其不能利用木糖，由于这些酶的表达水平太低而不允许木糖利用(参见，Matsushika等人，同上)。一些菌株已显示天然地利用木糖但是以很低的速率并且尚未检测到发酵成乙醇(参见Wenger等人,PLoSGenet.,6(5):e1000942[2010])。甚至当内源基因在酿酒酵母中过表达时，只有依赖木糖的慢生长被观察到(参见，Matsushika等人，同上)。
相反，大多数细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)和链霉菌属(Streptomyces))能通过利用木糖异构酶(XI)(EC 5.3.1.5)直接地将D-木糖异构化为D-木酮糖(参见，Matsushika等人，同上)。在细菌中，如同在真菌中，D-木酮糖被XK磷酸化为5-磷酸D-木酮糖，然后5-磷酸D-木酮糖通过戊糖磷酸途径被进一步代谢。
在酿酒酵母中表达功能异源木糖异构酶基因(xylA)并且在木糖上生长酵母的努力已遇到很有限的成功(参见例如Matsushika等人，同上)。已报道来自真菌瘤胃壶菌属(Piromyces)(Kuyper等人FEMS Yeast Res.,4:69-78[2003])和根囊鞭菌属(Madhaven等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,82:1067-1078[2009a])的木糖异构酶基因已在酿酒酵母中功能性地表达，但是依赖木糖的生长很慢。另外，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)木糖异构酶(登录号1BXB)在酿酒酵母中的功能性表达已被报道(参见，Walfridsson等人,Appl.Environ.Microbiol.,62:4648-4651[1996])。通过在酿酒酵母中表达嗜热栖热菌xylA基因来成功生成活性木糖异构酶已归因于两种生物体之间的相关性，由于嗜热栖热菌从真细菌的域分叉并且在很多方面可比真细菌更加接近地与酿酒酵母相关(同上，在4651)。
来自密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)和热硫梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)的木糖异构酶基因在酿酒酵母中的异源表达生成无活性的蛋白质，虽然其信使RNA能被检测到(参见Amore等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,30:351-357[1989])；和Moes等人,Biotech.Lett.,18:269-274[1996]；和Matsushika等人，同上)。其它的研究报道来自大肠杆菌(E.coli)(参见例如，Sarthy等人,Appl.Environ.Microbiol.,53:1996-2000[1987])、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Amore等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,30:351-357[1989])和锈赤霉链霉菌(Streptomycesrubiginosus)(Gárdonyi等人,Enzyme Microb.Technol.,32:252-259[2003])的xylA在酿酒酵母中的异源表达产生基本上不溶的蛋白质，其是催化地无活性的(参见，Matsushika等人,同上)。另外，一些报道表明，意图从用来自枯草芽孢杆菌和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)的xylA基因转化的重组酿酒酵母生成木糖异构酶导致无活性的蛋白质(参见，Walfridsson等人，同上)。
在另外的研究中，已报道了在用来自多种生物体的木糖异构酶基因转化的酿酒酵母中针对木糖异构酶活性的筛选结果(参见例如Brat等人,Appl.Environ.Microbiol.Doi:10.1128/AEM.02522-9[2009年2月13日])。已报道了该木糖异构酶与来自瘤胃壶菌属的木糖异构酶共享从17％至60％的序列同一性。尽管表达来自Clostridium phytofermentans(DSM 18823)的木糖异构酶的转化株可在木糖培养基上生长，用来自以下的生物体的木糖异构酶基因转化的酿酒酵母不能：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(DSM 13)、Burkholderia xenovaorans(DSM 17367)、戊糖乳杆菌(DSM 20314)、赖氏杆菌狗牙根变种(Leifsonia xyli subsp.Cynodontis)(DSM 46306)、Pseudomonassavastanoi pvar.Phaseolicola(DSM 50282)、Robiginitalea biformata(DSM15991)、降解糖噬糖菌(Saccharophagus degradans)(DSM 17024)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)(DSM 20266)、淀粉酶链霉菌淀粉酶亚种(Streptomyces diastaticus subsp.diastaticus)(DSM 40496)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris var.campestris)(DSM 3586)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(71-098L)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(参见Brat等人，同上)。
本发明提供了能在诸如例如真菌宿主细胞的非哺乳类动物、真核生物宿主细胞中赋予木糖利用的特性的序列。这些序列及其变体编码木糖异构酶，其催化D-木糖直接地异构化为D-木酮糖，如在图1中所描绘的。木糖异构酶区别于木糖还原酶(XR)，木糖还原酶(XR)催化木糖转化成木糖醇。木糖异构酶还区别于木糖醇脱氢酶(XD)，木糖醇脱氢酶(XD)催化木糖醇向D-木酮糖的转化(参见，图1)。
由这些宿主细胞的木糖利用导致由宿主细胞代谢地生成的有用的产物。在这些宿主细胞中，D-木酮糖可被天然的或重组的木酮糖激酶磷酸化为木酮糖-5-P，如在图1中描绘的。木酮糖-5-P可被戊糖磷酸途径中的酶进一步代谢以生成诸如葡萄糖-6-P、果糖-6-P、甘油醛-3-P等的产物。在图2A中描绘了戊糖磷酸途径和相关酶和产物。如本文使用的，术语“来自戊糖磷酸途径的酶”和“戊糖磷酸途径酶”是可互换地使用的来指来自参与戊糖磷酸途径的酶的组的酶，(即，6.核酮糖-5-磷酸酮式异构酶(RK11)；7.转酮醇酶(TKL1)；8.转醛醇酶(TAL1)；9.核糖-5-磷酸酮式异构酶(RK11)；10.6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND1)；11.6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(SOL3)；和/或12.6-磷酸葡萄糖-1-脱氢酶(ZWF)；参考数字对应于在图2A中的那些)。
戊糖磷酸途径的产物可通过糖酵解的过程被进一步代谢。在图2B中描绘了糖酵解的代谢过程。如本文使用的，术语“糖酵解酶”指来自参与糖酵解的酶的组的酶(即：13.己糖激酶；14.磷酸葡萄糖异构酶；15.磷酸果糖激酶；16.醛缩酶；17.磷酸丙糖异构酶；18.磷酸甘油醛脱氢酶；19.磷酸甘油酸激酶；20.磷酸甘油酸变位酶；21.烯醇酶；和/或22.丙酮酸激酶；参考数字对应于在图2B中的那些)。
来自糖酵解途径(即糖酵解)的丙酮酸可通过产乙醇的酶如在图2C中显示的被进一步代谢成乙醇。如本文使用的，术语“产乙醇的酶”指参与丙酮酸向乙醇的转化的酶(例如，丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶、和/或醇脱氢酶)。术语“产乙醇的途径”指在图2C中描绘的途径。
本文描述的多核苷酸序列可用于生成重组真菌宿主细胞、特别是酵母宿主细胞，其能直接地将D-木糖异构化为D-木酮糖，其可导致期望的发酵产物的生成。用木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因转化的重组宿主细胞因此能将木糖转化成木糖醇并且然后将木糖醇转化成木酮糖，其能导致期望的发酵产物(例如，醇，诸如乙醇、丁醇等，包括但不局限于脂肪醇[例如C8-C20脂肪醇]；脂肪酸[例如，C8-C20脂肪酸]；乳酸；3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺等)的生成。但是，之前的报道已表明，用来自树干毕赤酵母的野生型木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因转化的细胞无效率地转化木糖并且伴随木糖醇的积累(Matsushika等人,Appl.Environ Microbiol.,81:243-55[2008])。
相反，用如本文描述的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶基因转化的重组宿主细胞能将木糖转化成期望的发酵产物(例如，醇，诸如乙醇、丁醇等，包括但不局限于脂肪醇[例如C8-C20脂肪醇]；脂肪酸[例如，C8-C20脂肪酸]；乳酸；3-羟基丙酸；丙烯酸；乙酸；琥珀酸；柠檬酸；苹果酸；延胡索酸；氨基酸；1,3-丙二醇；乙烯；甘油；β-内酰胺等)。在一些实施方案中，用编码木糖还原酶的基因进一步转化重组宿主细胞。
重组核酸构建体
在一些实施方案中，本发明提供了包含编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和/或含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，一种或更多种多肽包含至少一种取代和/或其它突变。
本发明提供了包含编码含有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的至少一种多肽，含有与SEQ IDNO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，一种或更多种多肽包含至少一种取代和/或其它突变。
在一些实施方案中，本发明提供了包含编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，一种或更多种多肽包含至少一种取代和/或其它突变。
本发明提供了包含编码含有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的重组核酸构建体。在一些实施方案中，一种或更多种多肽包含至少一种取代和/或其它突变。
本发明还提供了包含编码至少一种木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶的多核苷酸的核酸构建体。本发明还提供了包含编码至少一种木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的多核苷酸的核酸构建体。在这些实施方案的一些中，核酸构建体包含SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:5。在一些另外的实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，本发明的重组核酸构建体还包含促进通过同源或非同源重组向真菌宿主细胞基因组中整合的至少一种多核苷酸序列(即，遗传的)元件。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还包含在真菌细胞中为功能性的复制起点(例如，酵母复制起点)。通常地，真菌宿主细胞为酵母或丝状真菌细胞，更通常地，酵母细胞。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含在真菌细胞中为功能性的至少一种转录调控元件。例如，在一些实施方案中，重组核酸构建体包含在真菌细胞中为功能性的至少一种启动子序列和/或转录终止序列以使得木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸被可操作地连接至启动子序列和/或转录终止序列。在一些另外的实施方案中，重组核酸构建体包含在真菌细胞中为功能性的至少一种启动子序列和/或转录终止序列以使得木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸被可操作地连接至启动子序列和/或转录终止序列。
适于在本发明的实践中使用的另外的木糖异构酶、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸包括编码通过诱变、重组、和/或任何其它蛋白质工程化方法生成的变体的那些。在一些实施方案中，利用本领域已知的任何合适的方法来针对木糖利用筛选变体。在一些实施方案中，得到的变体包含一个或更多个取代(保守的或非保守的)、缺失、和/或插入。
用于生成编码修饰的多肽的多核苷酸的变体文库的方法是本领域熟知的。例如，诱变和定向演化方法可容易地应用于编码木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多肽的多核苷酸，以生成利用本领域已知的任何合适的方法可表达、筛选和检验的变体文库。诱变和定向演化方法是本领域熟知的(参见，例如美国专利号5,605,793、5,830,721、6,132,970、6,420,175、6,277,638、6,365,408、6,602,986、7,288,375、6,287,861、6,297,053、6,576,467、6,444,468、5,811238、6,117,679、6,165,793、6,180,406、6,291,242、6,995,017、6,395,547、6,506,602、6,519,065、6,506,603、6,413,774、6,573,098、6,323,030、6,344,356、6,372,497、7,868,138、5,834,252、5,928,905、6,489,146、6,096,548、6,387,702、6,391,552、6,358,742、6,482,647、6,335,160、6,653,072、6,355,484、6,03,344、6,319,713、6,613,514、6,455,253、6,579,678、6,586,182、6,406,855、6,946,296、7,534,564、7,776,598、5,837,458、6,391,640、6,309,883、7,105,297、7,795,030、6,326,204、6,251,674、6,716,631、6,528,311、6,287,862、6,335,198、6,352,859、6,379,964、7,148,054、7,629,170、7,620,500、6,365,377、6,358,740、6,406,910、6,413,745、6,436,675、6,961,664、7,430,477、7,873,499、7,702,464、7,783,428、7,747,391、7,747,393、7,751,986、6,376,246、6,426,224、6,423,542、6,479,652、6,319,714、6,521,453、6,368,861、7,421,347、7,058,515、7,024,312、7,620,502、7,853,410、7,957,912、7,904,249、和所有相关的非美国副本；Ling等人,Anal.Biochem.,254(2):157-78[1997]；Dale等人,Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996]；Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985]；Botstein等人,Science,229:1193-1201[1985]；Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986]；Kramer等人,Cell,38:879-887[1984]；Wells等人,Gene,34:315-323[1985]；Minshull等人,Curr.Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999]；Christians等人,Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999]；Crameri等人,Nature,391:288-291[1998]；Crameri等人,Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997]；Zhang等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997]；Crameri等人,Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996]；Stemmer,Nature,370:389-391[1994]；Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767；和WO 2009/152336，通过引用将其全部并入本文)。
也适于在本发明的实践中使用的是编码截短的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶的多核苷酸或其序列变体。这些截短变体可在羧基(C)末端和/或氨基(N)末端处被截短。通常地，截短为从约1至约50个氨基酸残基。但是，并非意图本发明限于被截短的氨基酸残基的任何特定的数目。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，编码本文描述的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多肽的大量的核苷酸序列存在。表1提供了每种氨基酸的标准三连遗传密码。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU全都编码氨基酸精氨酸。因此，本文所指的核酸中的每个位置处，在精氨酸由密码子指定的情况下，密码子可改变为任何以上描述的相应密码子而不改变编码的多肽。理解在RNA序列中U对应于DNA序列中的T。本发明意图并提供了编码本发明的多肽的核酸序列的每种和每一种可能的变体，所述变体可通过基于可能的密码子选择而选择组合来制备。
在一些实施方案中，DNA序列设计为高的密码子使用偏好(即，在蛋白质编码区域中以比用于编码相同的氨基酸的其它密码子更高的频率使用的密码子)。可关于在单基因、共同功能或起源的一组基因、高表达的基因中的密码子使用，在整个生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率、在相关生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率、或其组合确定优先的密码子。其频率随基因表达的水平增加的密码子通常地是对于表达来讲最佳的密码子。特别是，DNA序列能为了在特定的宿主生物体中表达而优化。对广泛范围的生物体提供参考信息的参考文献是容易地可得的并且是本领域已知的(参见例如在Neidhardt等人[编辑],Escherichia coli and Salmonella,ASM Press,Washington D.C.,[1987]中的Henaut和Danchin,2047-2066页,通过引用将其并入本文)。
已知多种方法用于确定特定生物体中的密码子频率(例如，密码子使用，相对同义密码子使用)和密码子偏好，包括多变量分析，例如，利用聚类分析或对应分析，和在基因中使用的密码子的有效数目(参见，GCGCodonPreference,Genetics Computer Group Wisconsin Package；Peden,Codon W,University of Nottingham；McInerney,Bioinform.,14:372-73[1998]；Stenico等人,Nucl.Acids Res.222437-46[1994]；Wright,Gene87:23-29[1990]；Wada等人,Nucl.Acids Res.,20:2111-2118[1992]；Nakamura等人,Nucl.Acids Res.,28:292[2000]；以及Henaut和Danchin,同上；通过引用将其全部并入本文)。用于获得密码子使用的数据源可依靠能编码蛋白质的任何可得的核苷酸序列。这些数据集包括事实上已知表达蛋白质(例如，完整蛋白编码序列-CDS)的核酸序列、表达的序列标签(EST)、或基因组序列的预测的编码区(参见例如Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis，第8章，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,[2001]；Uberbacher,Methods Enzymol.,266:259-281[1996]；以及Tiwari等人,Comput.Appl.Biosci.13:263-270[1997]；通过引用将其全部并入本文)。并非意图本发明限于任何特定的方法、数据源和/或数据集。
在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶多核苷酸包含为了在真菌细胞、特别地酵母细胞中表达而优化的密码子。在一些实施方案中，还存在沉默突变(即，不影响蛋白质的氨基酸序列的DNA突变)。在一些实施方案中，含有木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸序列已插入其中的载体(例如，质粒、粘粒、噬菌体、病毒、酵母人工染色体(YAC)等)的重组核酸构建体中使用木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸。本文提供的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸应用并入多种载体中的任何一种。合适的载体包括但不局限于染色体的、非染色体的和合成的DNA序列、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、和很多其它的。事实上，将遗传材料转移至细胞的，并且，如果复制是期望的，在相关宿主中可复制且可行的任何合适的载体可用于本发明。
本发明的核酸构建体可用于转化宿主细胞以允许宿主表达一种或多种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多肽。本领域熟知用于真菌中蛋白质的重组表达的方法，并且许多载体是可得的或能利用常规方法构建(参见例如Zhu等人,Plasmid 6:128-33[2009]，通过引用并入本文；和该领域中的很多标准参考文献)。
在一些实施方案中，本发明的重组核酸构建体还包含在真菌细胞中为功能性的转录调控元件。在一些实施方案中，核酸构建体包含可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录调控序列(例如，启动子、转录终止序列等)的一种或多种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶多核苷酸。在真菌宿主细胞中为功能性的启动子的实例包括但不局限于来自酵母和丝状真菌的启动子。适于在本发明的实践中使用的启动子包括内源的或异源的启动子并且包括天然的或经修饰的组成型和诱导型启动子两者。特别地有用的启动子为对分解代谢物(葡萄糖)阻遏敏感的和/或不需要木糖用于诱导的那些。此类启动子被本领域所熟知。在一些实施方案中，利用本领域熟知的常规方法，启动子序列被可操作地连接至木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶编码序列的5’区。
适于在本发明的实践中使用的启动子包括但不局限于酵母来自糖酵解基因的启动子(例如，酵母磷酸果糖激酶(PFK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子等；参见例如WO 93/03159，通过引用并入本文)；葡萄糖转运体的启动子；核糖体蛋白质编码基因启动子；醇脱氢酶启动子(例如ADH1、ADH4等)；和烯醇酶启动子(ENO)。
用于指导酵母宿主细胞中本发明的核酸构建体的转录的示例性启动子包括但不局限于来自酿酒酵母烯醇酶(eno-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1/ADH2/GAP)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母转录延伸因子(TEF)、酿酒酵母果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)的基因的那些。酵母宿主细胞的其它有用的启动子在本领域被熟知(参见例如Romanos等人,Yeast 8:423-488[1992]，通过引用并入本文)。
在本发明的实践中有用的合适的丝状真菌启动子包括但不局限于从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的启动子(参见例如，WO 96/00787，通过引用将其并入本文)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合物(hybrid))、诸如cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1、amy、和glaA的启动子(参见，Nunberg等人,Mol.Cell Biol.,4:2306-2315[1984]；Boel等人,EMBO J.3:1581-85[1984]；和EP0137280A，通过引用将其全部并入本文)、及其突变、截短、和杂合的启动子。与真菌中的几丁质酶生成有关的启动子也可用于一些实施方案中(参见例如Blaiseau和Lafay,Gene 120:243-248[1992][丝状真菌白色扁丝霉(Aphanocladium album)]；和Limon等人,Curr.Genet.,28:478-83[1995][哈茨木霉(Trichoderma harzianum)]；通过引用将其两者并入本文)。
在真菌宿主细胞、特别是酵母宿主细胞中驱动表达的任何其它合适的启动子序列可用于本发明。能利用熟知的方法鉴定合适的启动子序列。在一种方法中，假定的启动子序列被5’连接至编码报道蛋白的序列，构建体被转染至宿主细胞并测量报道子的表达水平。报道子的表达能通过测量，例如，报道序列的mRNA水平、报道蛋白的酶活性、或报道蛋白生成的量来确定。例如，可通过利用绿色荧光蛋白作为编码序列(参见例如，Henriksen等人,Microbiol.,145:729-34[1999]，通过引用将其并入本文)或lacZ报道基因(参见例如，Punt等人,Gene,197:189-93[1997]，通过引用将其并入本文)来确定启动子活性。在一些实施方案中，功能性启动子通过定向演化方法源自天然存在的启动子序列(参见例如，Wright等人,Hum.Gene Ther.,16:881-892[2005]，通过引用将其并入本文)。
在一些实施方案中，异源和/或重组转录终止序列可用于本发明。有多种在真菌宿主细胞中为功能性的示例性转录终止序列(终止子)，包括本领域熟知的来自酵母和丝状真菌的转录终止序列。在一些实施方案中，转录终止序列为酵母序列。示例性酵母转录终止序列包括但不局限于CYC1、ADH1t、ADH2t等。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含用于翻译起始的核糖体结合位点。在一些实施方案中，构建体包含用于增强表达的适当序列(例如，增强子)。此类元件是本领域所熟知的并且任何合适的增强子和/或转录终止序列、和/或核糖体结合位点可用于本发明。
在一些另外的实施方案中，本发明的核酸构建体包含一种或更多种可选择的标记基因以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。合适的标记基因包括但不局限于编码抗菌素抗性的那些，所述抗菌素诸如氨苄青霉素(ampR)、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素或大观霉素(例如aada基因)；包括但不局限于编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码诺尔丝菌素抗性的诺尔丝菌素乙酰基转移酶(nat1)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因、用于真核生物细胞培养物的编码二氢叶酸脱氢酶、腐草霉素、或新霉素抗性，以及大肠杆菌中的四环素或氨苄霉素抗性的基因，以及本领域熟知的其它标记基因。事实上任何合适的标记基因可用于本发明。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体通常地包含真菌复制起点(例如，丝状真菌或酵母复制起点)。在一些实施方案中，本发明的重组核酸构建体包含酵母复制起点。实例包括但不局限于含有自主复制序列的构建体、含有包含自主复制序列和rep基因的2微米DNA的构建体、含有如CEN6、CEN4、CEN11、CDN3的着丝粒和自主复制序列的构建体、和本领域熟知的其它类似序列。示例性核酸构建体包括适于转化酵母的构建体。这些包括但不局限于基于酵母2μ的附加体构建体或如pYES2/CT、pYES3/CT、pESC/His、pESC/Ura、pESC/Trp、pES/Leu、p427TEF、pRS405、pRS406、pRS413的基于CEN起点的质粒，和本领域已知的其它基于酵母的构建体。事实上，任何合适的复制起点可用于本发明。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含促进通过同源或非同源重组和/或定点和/或随机诱变使一种或更多种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶多核苷酸序列整合入真菌宿主染色体(即，基因组)的元件。在一些实施方案中，核酸构建体包含促进同源整合的元件。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸在一个或更多个位点被整合并且以一个或更多个拷贝存在。在一些实施方案中，核酸构建体包含一种或更多种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸并且无可操作地连接至一种或更多种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸的启动子。该类型的构建体通常地包含遗传元件以促进在天然启动子(即，在宿主染色体中)的下游的位置整合入真菌宿主染色体中。在一些实施方案中，可使用包含启动子和遗传元件的第二核酸以促进在木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸的靶向整合位点的上游位置中整合入真菌宿主染色体中。在一些实施方案中，核酸构建体包含可操作地连接至启动子或启动子序列和终止子序列的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸以使得所有被整合入宿主染色体(基因组)中。预期促进整合的任何合适的元件将可用于本发明中。
促进通过同源重组整合的遗传元件包括与真菌宿主染色体(基因组)中靶向的整合位点具有序列同源性的那些。可用作用于整合的靶的合适的位点包括但不局限于TY1基因座、RDN基因座、ura3基因座、GPD基因座、醛糖还原酶(GRE3)基因座等。本领域普通技术人员将领会，用于整合的另外的位点能容易地利用本领域已知的方法来鉴定，本领域已知的方法包括但不局限于微阵列分析、代谢通量分析、比较基因组杂交分析等。
促进通过非同源重组整合的遗传元件或技术包括但不局限于限制酶介导的整合(REMI)(参见例如Manivasakam等人,Mol.CellBiol.,18(3):1736-1745[1998]，通过引用并入本文)、转座子介导的整合、和本领域熟知的其它元件和方法。事实上，促进同源和/或非同源重组的任何合适的方法可用于本发明。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含能给予真菌宿主细胞、特别是木糖发酵的上下文中期望的表型的至少一种另外的重组多核苷酸。在一些实施方案中，能给予真菌宿主细胞改良的表型的重组多核苷酸为非编码多核苷酸(例如，调控多核苷酸)、编码多核苷酸、或其组合。
示例性另外的期望的表型包括但不局限于增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对有机酸的耐受、减少的副产物的生成、和与增加通过戊糖磷酸途径和糖酵解途径的通量以与相应的野生型宿主细胞相比以更高的水平生成期望的代谢产物/中间体有关的其它相似特性。在一些实施方案中，期望的代谢产物为醇(例如，乙醇)。
在一些实施方案中，包含能给予真菌宿主细胞期望的表型的至少一种另外的多核苷酸的核酸构建体包含编码已知影响期望的表型的蛋白质的多核苷酸，其中多核苷酸为真菌宿主细胞天然或异源的。在一些实施方案中，该多核苷酸被可操作地连接至其天然启动子、或异源启动子(即，在相应的天然基因中不与多核苷酸相关的启动子)。在一些实施方案中，至少一种另外的多核苷酸过表达。在一些另外的实施方案中，核酸构建体包含至少一种多核苷酸的多个拷贝。合适的多核苷酸包括但不局限于促进已知对期望的表型具有影响的蛋白质的过表达的那些。
能给予真菌宿主细胞期望的表型的示例性重组多核苷酸包括但不局限于编码木糖和/或己糖转运体、木糖还原酶、来自戊糖磷酸途径的至少一种酶、至少一种糖酵解酶(即，来自糖酵解代谢途径、至少一种产乙醇的酶、增强这些序列的表达的调控序列、和/或其组合。可用于本发明的另外的重组多核苷酸(野生型或突变的形式)包括但不局限于在本发明的多种实施方案中单独或以组合形式使用的编码参与戊糖磷酸途径、糖酵解途径、和产乙醇途径的另外的蛋白质的那些。
在一些实施方案中，转运蛋白可用于本发明。示例性转运体包括但不局限于分别地来自间型假丝酵母(Candida intermedia)、树干毕赤酵母和拟南芥的GXF1、SUT1和At6g59250(参见例如Runquist等人,Biotechnol.Biofuels,3:5[2010]，通过引用并入本文)，以及HXT4、HXT5、HXT7、GAL2、AGT1、GXF2(参见例如，Matsushika等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,84:37-53[2009]，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，天然酿酒酵母转运体的过表达是期望的，特别是HXT5和HXT7。
在一些实施方案中，可使用另外的重组多核苷酸，包括但不局限于编码以下的那些：木酮糖还原酶(XR)；来自戊糖磷酸途径的酶(例如，核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(RPE1)、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶(RKI1)、转酮醇酶(TKL1)、转醛醇酶(TAL1)等)；糖酵解酶(例如己糖激酶(HXK1/HXK2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、丙酮酸激酶(PVK2)等)；和/或至少一种产乙醇酶(例如，丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等)。
在本发明的一些实施方案中，可使用调控多核苷酸。示例性调控多核苷酸包括启动子、增强子、终止子、和起作用以改进多核苷酸在真菌宿主细胞、特别是酵母宿主细胞中的表达的任何其它合适的调控元件。这些多核苷酸包括但不局限于本文以上描述的调控元件。
本文描述的核酸构建体可用于转化真菌宿主细胞以给予这些细胞木糖利用的特性。
重组真菌宿主细胞
本发明提供了包含本文提供的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸的重组真菌宿主细胞。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞包含编码能催化D-木糖直接地异构化为D-木酮糖的多肽的至少一种多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；SEQ ID NO:3；和/或SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种多肽包含至少一种取代和/或其他突变。在所有这些实施方案中，多肽展示出与其序列有关的活性(即，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、或木酮糖激酶)。
在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞包含编码至少一种多肽的至少一种多核苷酸序列，其中多核苷酸选自：(a)编码含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24；SEQ ID NO:4；和/或SEQ ID NO:6至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％、至少99％、或至少100％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；SEQ ID NO:3；和/或SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种多肽包含至少一种取代和/或其它突变。在所有这些实施方案中，多肽表现出与其序列相关的活性(即，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、或木酮糖激酶)。
在一些实施方案中，本发明提供了含有和/或用本发明的核酸构建体转化的重组真菌宿主细胞。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸被整合入宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸被整合入宿主细胞基因组中。通常地，重组真菌宿主细胞为丝状真菌或酵母宿主细胞。更通常地，重组真菌宿主细胞为酵母宿主细胞。
本发明还提供了用于生成重组真菌宿主细胞的方法，其中方法包括：(a)提供本发明的至少一种核酸构建体，其中核酸构建体包含本文提供的至少一种木糖异构酶多核苷酸、至少一种木糖醇脱氢酶多核苷酸、和/或至少一种木酮糖激酶多核苷酸；和(b)用核酸构建体转化真菌宿主细胞以生成重组真菌宿主细胞。在一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列、木糖醇脱氢酶多核苷酸序列、和/或木酮糖激酶多核苷酸序列被整合入宿主细胞基因组中。
本发明还提供了用于生成重组真菌宿主细胞的方法，其中方法包括：(a)提供本发明的至少一种核酸构建体，其中核酸构建体包含本文提供的至少一种木糖异构酶多核苷酸、至少一种木糖醇脱氢酶多核苷酸、和至少一种木酮糖激酶多核苷酸；和(b)用核酸构建体转化真菌宿主细胞以生成重组真菌宿主细胞。在一些实施方案中，木糖异构酶多核苷酸序列、木糖醇脱氢酶多核苷酸序列、和木酮糖激酶多核苷酸序列被整合入宿主细胞基因组中。
本发明的表达构建体引入宿主细胞能利用任何合适的方法来完成，所述任何合适的方法包括但不局限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电转化、或任何其它合适的技术。事实上，有很多本领域已知的方法并在多种标准参考教科书中描述。
在本发明的一些实施方案中，真菌宿主细胞包括酵母和丝状真菌宿主细胞。在一些另外的实施方案中，真菌宿主细胞为酵母细胞。可用于本发明的示例性酵母宿主细胞包括但不局限于假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)。在本发明的一些实施方案中，酵母细胞为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、酿酒酵母、啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichiakodamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia opuntiae、Pichiathermotolerans、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、栎毕赤酵母(Pichiaquercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。在一些实施方案中，酵母宿主细胞为酵母属物种。在一些另外的实施方案中，酵母宿主细胞为酿酒酵母。但是，并非意图本发明限于酵母细胞的任何特定的属和/或物种。
可用于本发明的酵母菌株包括但不局限于从多个酵母保藏中心可获得的那些，诸如Lallemand(例如Lallemand 6469、Lallemand LYCC 6391、Lallemand LYCC 6939、Lallemand LYCC 6469、Lallemand LYCC 6469；全部来自Lallemand,Inc.,Montreal,Canada)；ARS(NRRL)Collection,U.S.Department of Agriculture(例如，NRRL Y-1528和YB-1952)；以及ATCC(例如，BY4741，其从其它来源也是可得的)。
合适的真菌宿主细胞包括但不局限于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、半知菌门(Deuteromycota)、接合菌门(Zygomycota)、和知菌亚门(Fungi Imperfecti)。本发明的丝状真菌宿主细胞包括但不局限于亚门真菌亚门(Eumycotina)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式。丝状真菌以具有包含几丁质、纤维素和其它复合多糖类的细胞壁的营养菌丝体为特征。在一些实施方案中，本发明的丝状真菌宿主细胞在形态学上区别于酵母。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为以下物种的细胞：绵霉属(Achlya)、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、头孢霉属(Cephalosporium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、色二孢属(Diplodia)、内座壳属(Endothia)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、粘帚霉属(Gliocladium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、柄孢壳菌属(Podospora)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、梨孢菌属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢霉属(Scytalidium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、栓菌属(Trametes)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或有性型、或无性型、以及其同物异名、基原异名、和/或分类学等价物。但是，并非意图本发明限于丝状真菌细胞的任何特定的属和/或物种。
在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为曲霉属物种、拟蜡菌属物种、金孢子菌属物种、棒囊壳属物种、镰刀菌属物种、腐质霉属物种、脉孢菌属物种、青霉菌属物种、弯颈霉属物种、栓菌属物种或木霉属物种的。但是，并非意图本发明限于丝状真菌细胞的任何特定属和/或物种。
另外地，可用于本发明的示例性丝状真菌宿主细胞包括但不局限于木霉属(例如，长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿色木霉(T.viride)[例如，ATCC32098和32086]、里氏木霉(T.reesei)[NRRL 15709、ATTC 13631、56764、56765、56466、56767、和RL-P37及其衍生物；参见例如，Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.,20:46-53[1984]，通过引用并入本文)、康氏木霉(T.koningii)、和哈茨木霉(T.harzianum))、以及红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的丝状真菌宿主细胞。术语“木霉属”指之前被分类为木霉属或目前被分类为木霉属的任何真菌菌株。
在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为曲霉属物种(例如，泡盛曲霉、烟曲霉(A.funigatus)、日本曲霉(A.japonicas)、构巢曲霉、黑曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、臭曲霉(A.foetidus)、米曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、或白曲霉(A.kawachi)(参见例如，Kelly和Hynes,EMBO J.,4:475479[1985]；NRRL 3112，ATCC 11490、22342、44733、和14331；Yelton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1480-1474[1984]；Tilburn等人,Gene 26,205-221[1982]；和Johnston等人,EMBO J.,4:1307-1311[1985]，通过引用将其全部并入本文)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为镰刀菌属物种(例如，拟杆镰刀菌F.bacterioides、F.cerealis、克地镰刀菌(F.crookwellense)、黄色镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰刀菌(F.graminaearum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、玫瑰镰刀菌(F.rosium)、或F.venenatum)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为脉孢菌属物种(例如，粗糙脉孢菌(N.crassa)；参见例如Case等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263[1979]；美国专利号4,486,553；以及Kinsey和Rambosek,Mol.Cell.Biol.,4:117-122[1984]，通过引用将其全部并入本文)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为腐质霉属物种(例如，特异腐质霉(H.insolens)、灰腐质霉(H.grisea)、或柔毛腐质霉(H.lanuginosa))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为毛霉属物种(例如，米黑毛霉(M.miehei)或卷枝毛霉(M.circinelloides))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为根霉属物种(例如米根霉(R.oryzae)或雪白根霉(R.niveus))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为青霉菌属物种(例如，产紫青霉(P.purpurogenum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、或疣孢青霉(P.verruculosum))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为梭孢壳属物种(例如，太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为弯颈霉属物种(例如，T.inflatum或地生弯颈霉(T.geodes))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为栓菌属物种(例如，长绒毛栓菌(T.villosa)或变色栓菌(T.versicolor))。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为金孢子菌属物种，(例如，C.lucknowense、嗜毛金孢(C.keratinophilum)、热带金孢(C.tropicum)、粪金孢(C.merdarium)、C.inops、毛金孢(C.pannicola)、或C.zonatum)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为毁丝霉属物种，例如嗜热毁丝霉(M.thermophila)。
可用于本发明的菌株包括大众从很多培养物保藏中心容易地可得到的那些，所述培养物保藏中心包括但不局限于美国模式培养物保藏中心(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkutlturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、和AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection,Northern Regional ResearchCenter(NRRL)。可用于本发明的菌株包括大众从任何商业来源容易地可得的那些。
本发明的重组真菌宿主细胞能在基于木糖的培养基(即，其中木糖为主要碳源的培养基)中生长。在这些基于木糖的培养基中，碳源包括木糖。在一些基于木糖的培养基中，碳源由木糖组成。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞与相应的野生型真菌宿主细胞相比在基于木糖的培养基中能更快地生长。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞与野生型酿酒酵母相比在基于木糖的培养基中能更快地生长。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞在基于木糖的培养基中能以至少约0.2每小时(h-1)的速率生长，而在一些其它的实施方案中，生长速率为至少约0.3或0.4每小时(h-1)。可利用任何合适的方法来确定生长速率，所述任何合适的方法包括光密度、细胞计数方法等。事实上，有很多熟知的用于确定细胞生长的方法可用于本发明。示例性基于木糖的培养基包括已被配制成包含木糖的培养基(参见，本文实施例)，以及从纤维素糖化过程获得的原料和/或来自半纤维素预处理过程的原料(即，“半纤维素原料”)。
在一些实施方案中，当提供有基于木糖的培养基时，本发明的重组真菌宿主细胞还能发酵木糖。通常地，本文描述的重组真菌宿主细胞与相应的野生型真菌宿主细胞相比能以更快的速率发酵木糖。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞能以至少约0.5g/L/h、至少约1g/L/h、至少约2g/L/h、至少约3g/L/h、至少约4g/L/h、至少约5g/L/h、至少约6g/L/h、至少约7g/L/h、至少约8g/L/h、至少约9g/L/h、或至少约10g/L/h的速率发酵木糖。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞能以至少约0.1g/g CDW/h、至少约0.15g/g CDW/h、至少约2g/g CDW/h、至少约0.25g/g CDW/h、至少约0.3g/g CDW/h、至少约0.4g/g CDW/h、至少约0.5g/g CDW/h、至少约0.6g/gCDW/h、至少约0.7g/g CDW/h、至少约0.75g/g CDW/h、至少约1g/gCDW/h、至少约1.25g/g CDW/h、至少约1.5g/g CDW/h、至少约1.75g/gCDW/h、至少约2g/g CDW/h、至少约2.25g/g CDW/h、至少约2.5g/gCDW/h、至少约2.75g/g CDW/h、或至少约3g/g CDW/h的速率发酵木糖。示例性基于木糖的培养基包括但不局限于已被配制为包含木糖的培养基，以及来自纤维素糖化过程的原料和/或来自半纤维素预处理过程的原料(即，“半纤维素原料”)。
在一些实施方案中，真菌宿主细胞为野生型真菌细胞，而在一些其它的实施方案中，其是野生型真菌细胞的突变或以其他方式改变或工程化的形式(即，重组细胞)。在一些实施方案中，真菌宿主细胞(野生型或以其他方式改变的或工程化的)包含编码木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶、和一种或更多种酶的多核苷酸。在一些实施方案中，另外的酶被用在戊糖磷酸途径、糖酵解途径、和/或产乙醇途径中。在一些实施方案中，真菌宿主细胞包含编码至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶，以及戊糖磷酸、糖酵解、和产乙醇途径中的所有或一些酶的多核苷酸。在一些实施方案中，真菌宿主细胞包含编码与真菌宿主细胞异源(即，对于真菌宿主细胞非天然的)的酶的重组多核苷酸。在一些另外的实施方案中，真菌宿主细胞被工程化为包含利用来自戊糖磷酸途径、糖酵解途径、和/或产乙醇途径的产物/中间物的其它的代谢途径以生成其它期望的产物。例如，在一些实施方案中，真菌宿主细胞被工程化为包含用于脂肪醇或脂肪酸的生物合成的至少一种代谢途径(参见例如WO 2007/136762，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，脂肪醇或脂肪酸为C8-C20脂肪酸或脂肪醇。在一些实施方案中，真菌宿主细胞被改变或工程化为过表达编码这些代谢途径的一种或更多种中的酶的多核苷酸中的任何一种或更多种。
在一些实施方案中，本发明的重组真菌宿主细胞还包含对木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸的遗传修饰。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含能给予真菌宿主细胞另外的期望的表型的至少一种不同的重组多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸和/或其变体，以及编码与木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶或其变体不同的多肽的至少一种重组多核苷酸的重组真菌宿主细胞，其中重组多核苷酸给予真菌宿主细胞期望的表型。意图在一些实施方案中，在与木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸相同的核酸构建体中，能给予真菌宿主细胞期望的表型的重组多核苷酸被引入至真菌宿主细胞，而在一些其它的实施方案中，在与木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸不同的核酸构建体中，能给予真菌宿主细胞期望的表型的重组多核苷酸被引入至真菌宿主细胞。以上描述了本发明包含木糖异构酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶多核苷酸以及能给予真菌宿主细胞期望的表型的至少一种另外的重组多核苷酸的核酸构建体。
在一些实施方案中，能给予真菌宿主细胞期望的表型的重组多核苷酸为非编码多核苷酸(例如，调控多核苷酸)、编码多核苷酸、或其组合。如以上描述的，示例性另外的期望的表型包括但不局限于增加的木糖向宿主细胞的转运、增加的木糖还原酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对有机酸的耐受、减少的副产物的生成、以及与增加通过戊糖磷酸、糖酵解、和/或产乙醇途径的通量以与相应的野生型宿主细胞相比以更高的水平生成期望的代谢产物/中间物有关的其它类似特性。在一些实施方案中，期望的代谢产物为醇(例如，乙醇)。
在一些实施方案中，含有能给予真菌宿主细胞期望的表型的至少一种另外的多核苷酸的重组真菌宿主细胞包含编码已知影响期望的表型的蛋白质的至少一种多核苷酸，其中多核苷酸对于真菌宿主细胞是天然的或异源的。在一些实施方案中，一种或更多种多核苷酸被可操作地连接至一种或更多种天然启动子，而在一些实施方案中，多核苷酸被可操作地连接至异源启动子(即，与相应的天然基因中的多核苷酸不相关的启动子)。在一些实施方案中，多核苷酸是过表达的。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞包含多核苷酸的多个拷贝。合适的多核苷酸包括但不局限于促进已知对期望的表型具有影响的蛋白质的过表达的那些。因此，在一些实施方案中，真菌宿主细胞被改变或工程化为过表达一种或更多种多核苷酸。
在一些实施方案中，能给予可用于本发明的真菌宿主细胞期望的表型的重组多核苷酸包括但不局限于编码木糖或己糖转运体、木糖还原酶、来自戊糖磷酸途径(参见例如图2A)的至少一种酶、至少一种糖酵解酶(即，来自糖酵解的代谢途径；参见例如图2B)、一种或更多种产乙醇酶(参见例如图2C)的重组多核苷酸、与任何这些序列相关的调控序列、及其任何组合。
如以上说明的，可用于本发明的示例性转运体包括但不局限于分别地来自间型假丝酵母、树干毕赤酵母、和拟南芥的GXF1、SUT1和At6g59250(参见例如Runquist等人,84:37-53[2010]，通过引用并入本文)、HXT4、HXT5、HXT7、GAL2、AGT1和GXF2(参见例如,Matsushika等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,84:37-53[2009])。在一些实施方案中，天然酿酒酵母转运体的过表达是期望的，特别是HXT5和HXT7。
如以上说明的，适于在本发明中使用的重组多核苷酸包括但不局限于编码以下的那些：木糖还原酶(XR)；来自戊糖磷酸途径的至少一种酶(例如，核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(RPE1)、核糖-5-磷酸酮醇-异构酶(RKI1)、转酮醇酶(TKL1)、转醛醇酶(TAL1)等)；至少一种糖酵解酶(例如己糖激酶(HXK1/HXK2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、丙酮酸激酶(PVK2)等)；和至少一种产乙醇酶(例如，丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等)。
如以上说明的，可用于本发明的示例性调控多核苷酸包括启动子、增强子、终止子、和起作用以改进多核苷酸在真菌宿主细胞特别是酵母宿主细胞中的表达的其它调控元件，如以上描述的。
在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含从其基因组缺失的一种或更多种天然基因。在一些实施方案中，缺失导致本来被真菌宿主细胞表现出的生物活性的移除或减少。在一些实施方案中，一种或多种缺失的累积效应还导致在真菌宿主细胞的表型的改进。用于缺失基因的任何合适的方法可用于本发明。有很多本领域所熟知的方法。例如，在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞具有从宿主基因组缺失的某些天然基因以改进戊糖糖类(例如，木糖)的利用、增加木糖向宿主细胞的转运、增加的木糖还原酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇/乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对有机酸(低pH)的耐受、减少的副产物的生成、以及与增加通过相关途径的通量以以较高水平生成乙醇和其它期望的代谢产物有关的其它类似特性，其中相对于无一种或更多种缺失的相应的宿主细胞进行比较。被靶向用于缺失的基因包括但不局限于编码戊糖磷酸途径中的酶、糖酵解酶、和/或产乙醇的酶的基因，以及任何其它基因，其的缺失提供优势。
在一些实施方案中，被靶向用于缺失的其它基因包括但不局限于编码以下的那些：醛糖还原酶(GRE3)(参见例如Matsushika等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,84:37-53[2009])、山梨醇脱氢酶(SOR1/SOR2)、谷氨酸脱氢酶(GDH1)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)、葡萄糖-5-磷酸脱氢酶(ZWF1)、以及本领域已知其缺失改进戊糖糖类的利用、减少副产物生成、和/或增加真菌宿主细胞的乙醇产率的任何酶。很多真菌中编码这些酶的基因是本领域已知的。本领域普通技术人员领会，编码这些和其它感兴趣的酶的另外的基因能利用多种合适的技术来容易地鉴定，所述多种合适的技术诸如通过微阵列分析(参见例如Sedlak等人,Yeast 21:671-684[2004])、代谢通量分析(参见例如，Sonderegger等人,Appl.Environ.Microbiol.,70:2307-2317[2004])、计算机模拟建模(参见例如，Hjersted等人,Biotechnol.Bioengineer.97:1190-1204[2007])、化学基因组学(chemogenomics)(参见例如，Teixeira等人,Appl.Environ.Microbiol.,75:5761-5772[2009])，和其它熟知的方法。事实上，任何合适的方法可用于本发明。
在一些实施方案中，在本发明的实践中使用的宿主细胞经诱变和/或演化为表现出另外的期望的表型。例如，另外的改良包括但不局限于在戊糖糖类(例如，木糖、阿拉伯糖等)的利用上的改进、增加的木糖向宿主细胞中的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇/乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对有机酸(低pH)的耐受、减少的副产物的生成、以及与增加通过戊糖磷酸和糖酵解途径的通量以以较高水平生成期望的代谢产物/中间物有关的其它类似特性。在一些实施方案中，期望的代谢产物为醇(例如，乙醇)。在一些实施方案中，在用一种或至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多核苷酸转化之前或之后，利用已知方法来诱变和/或演化宿主细胞。在一些实施方案中，在用一种或至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多核苷酸转化之前或之后，利用已知方法来诱变和/或演化宿主细胞。这些方法包括但不局限于传统诱变、全基因组改组、进化工程化方法、使用筛选和/或选择方法的方法、和/或此类熟知的方法的任何组合。
可用于本发明的传统诱变方法包括但不局限于用诸如化学诱变剂的诱变剂或辐射暴露(例如，紫外线或γ-辐射)处理宿主细胞。包括例如在天然基因组DNA序列和/或其变体之间的基因组DNA的重组的全基因组改组方法，能被有性交配、原生质体融合方法和本领域所熟知的也应用的其它方法(参见例如WO 98/31837和WO 2000/04190，通过引用并入本文)促进。在一些实施方案中，这些方法与筛选和/或选择方法结合以鉴定表现出期望的表型的改变的真菌宿主细胞。例如，此类方法可用于改变或工程化真菌宿主细胞以过表达一种或更多种期望的多核苷酸。事实上，任何合适的方法可用于本发明。
在一些实施方案中，通过在期望的条件下通过恒化器、恒浊器和/或分批培养延长培养和选择菌株来完成进化工程化。可在好氧、微好氧或厌氧条件下执行进化工程化方法。可通过改变培养条件来优化选择策略，所述培养条件例如碳源、氮源、通气、pH、温度等。用于进化工程化的方法是本领域已知的(参见例如Wisselink等人,Appl.Environ.Microbiol.,75(4):907-914[2009]；Kuyper等人,FEMS Yeast Res.,5:399-409[2005]；和Sauer,Adv.Biochem.Engineer.Biotechnol.,73:129-169[2001]，通过引用将其全部并入本文)。事实上，任何合适的方法可用于本发明。
在本发明的一些实施方案中，包含木糖异构酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶多核苷酸的重组真菌宿主细胞表现出与相应的无木糖异构酶多核苷酸、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶多肽的真菌宿主细胞相比改良的表型。在一些实施方案中，重组真菌宿主细胞包含所有三种多核苷酸(即，木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶)。在一些实施方案中，改良的表型包括在戊糖糖类(例如，木糖、阿拉伯糖等)的利用上的进一步改良、增加的木糖向宿主细胞中的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇/乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对有机酸(低pH)的耐受、和减少的副产物的生成、和/或其它特性。
酶混合物
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文提供的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多肽的酶混合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文提供的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多肽的酶混合物。在一些实施方案中，酶混合物为无细胞的(即，包含已从细胞分离的酶的酶混合物)，而在一些可选的实施方案中，酶未从分泌至少一种酶混合物成分的宿主细胞分离。能通过本领域已知的多种方法中的任何方法来制备无细胞的酶混合物(例如，过滤和/或离心方法)。在一些实施方案中，酶混合物为部分地无细胞的、基本上无细胞的、或完全地无细胞的。
在一些实施方案中，存在于酶混合物的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶、和任何另外的酶分泌自单一的遗传修饰的细胞(例如，真菌宿主细胞)，而在一些另外的实施方案中，存在于酶混合物的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、和任何另外的酶分泌自联合或分别发酵的不同微生物。相似地，在一些另外的实施方案中，存在于酶混合物中的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、和任何另外的酶被单独地或以亚组地从不同生物体的不同菌株表达并且酶被体外组合以制备酶混合物。还预期，酶混合物中的木糖异构酶和任何另外的酶被单独地或以亚组地从单一生物体的不同菌株表达，并且酶被组合以制备酶混合物。在一些实施方案中，所有的酶从诸如遗传修饰的真菌细胞的单一宿主生物体表达。在一些实施方案中，在WO 2011/041594、WO2011/066457、WO 2011/14363、WO 2011/150318、WO 2012/024698、WO2012/027282、WO 2010/148148、WO 2012/024662、WO 2012/044868、WO2012/061432、美国专利申请公布号2012/0003703、美国专利申请公布号2012/0083019、美国专利申请公布号2012/0077216、美国专利申请公布号2012/0045793、美国专利申请公布号2012/0088271、美国专利申请公布号2012/0107881、和/或美国专利号8,143,050(通过引用将其全部并入本文)中描述的酶可用于本发明。
在一些实施方案中，酶混合物包含选自纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)、和/或β-葡糖苷酶(BGI)纤维素酶的至少一种纤维素酶。纤维素酶混合物的纤维素酶共同起作用从生物质基质解晶并水解纤维素以得到可溶性糖，所述可溶性糖诸如但不局限于葡萄糖(参见例如Brigham等人，于Wyman([编辑],Handbook on Bioethanol,Taylor和Francis,Washington DC[1995]，119–141页，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，纤维二糖水解酶为里氏木霉纤维二糖水解酶II。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶包含源自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶的催化结构域的催化结构域。在一些实施方案中，至少一种纤维素酶为解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、褐色高温双歧菌(Thermobifidafusca)、灰腐质霉、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)和/或金孢子属物种纤维素酶。意图本发明包括包含从任何合适的来源获得的任何合适的纤维素酶的酶混合物。并非意图本发明限于任何特定的纤维素酶和/或纤维素酶来源。
用于有效的酶促水解纤维素的纤维素酶混合物是已知的(参见例如Viikari等人,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.,108:121-45[2007]；和美国专利公布2009/0061484；US 2008/0057541；和US 2009/0209009，通过引用将其每个并入本文)。在一些实施方案中，将纯化的天然存在或重组的酶的混合物与纤维素原料或纤维素水解的产物合并。在一些实施方案中，将各自生成一种或更多种天然存在或重组的纤维素酶的一种或更多种细胞群体与纤维素原料或纤维素水解的产物合并。
在一些实施方案中，本发明的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多肽存在于包含除了降解纤维素、半纤维素、果胶、和/或木质纤维素的纤维素酶以外的至少一种另外的酶的混合物中。在一些实施方案中，酶混合物包含本发明的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多肽、至少一种纤维素酶、和至少一种另外的酶。在一些实施方案中，酶包含至少一种木聚糖酶、木糖苷酶、呋喃苷酶(furanosidase)、葡萄糖醛酸酶、酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酰酯酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、果胶酶、裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、半乳聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、果胶裂解酶、果胶酸酯裂解酶、鼠李糖苷酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、半乳糖醛酸水解酶、阿拉伯糖酶、木质素降解酶、漆酶、过氧化物酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、扩展蛋白(expansin)、扩展蛋白样蛋白质、纤维素整合蛋白、支架蛋白(scaffoldin)、支架蛋白样蛋白质、纤维素诱导蛋白或调节蛋白、和/或感兴趣的任何另外的酶。意图本发明包括任何酶组合和任何酶浓度。事实上，并不意图本发明限于任何特定的酶组合和/或酶浓度，因为本领域技术人员知道随对其特定用途的需要生成有用的酶组合和浓度。
如本文使用的“半纤维素酶”指能催化半纤维素水解成诸如寡糖或单体糖的小的多糖的多肽。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。半纤维素酶包括例如以下：内切木聚糖酶、b-木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖酶、a-D-葡萄糖醛酸酶、阿魏酸酯酶、香豆酰酯酶、a-半乳糖苷酶、b-半乳糖苷酶、b-甘露聚糖酶、b-甘露糖苷酶。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶多肽和一种或更多种半纤维素酶的酶混合物。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种木聚糖内切酶。木聚糖内切酶(EC3.2.1.8)催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。该酶还可被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶。在一些实施方案中，可选的是EC 3.2.1.136，葡萄糖醛酸阿拉伯糖木聚糖木聚糖内切酶，能水解葡萄糖醛酸阿拉伯糖木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种β-木糖苷酶。β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)催化1,4-β-D-木聚糖的水解，以从非还原性末端移除连续的D-木糖残基。该酶还可被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种α-L-阿拉伯呋喃糖酶。α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端的非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、和阿拉伯半乳聚糖。α-L-阿拉伯呋喃糖酶也被称作阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶和α-L-阿拉伯聚糖酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种α-葡萄糖醛酸酶。α-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)催化α-D-葡萄糖苷酸水解成D-葡萄糖醛酸和醇。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种乙酰木聚糖酯酶。乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)催化来自聚合木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、α-萘基乙酸酯、和对硝基苯乙酸酯的乙酰基团的水解。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种阿魏酸酯酶。阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)具有催化4-羟基-3-甲氧肉桂酰(阿魏酸基)基团从酯化的糖水解的4-羟基-3-甲氧肉桂酰-糖水解酶活性(EC 3.1.1.73)以生成阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧肉桂酸酯)，所述酯化的糖通常地为“天然的”底物中的阿拉伯糖。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰酯酶、FAE-II、肉桂酰酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种香豆酰酯酶。香豆酰酯酶(EC3.1.1.73)催化以下形式的反应：香豆酰-糖+H2O＝香豆酸+糖。在一些实施方案中，糖为寡糖或多糖。该酶还可被称作反式-4-香豆酰酯酶、反式-对香豆酰酯酶、对香豆酰酯酶或对香豆酸酯酶。该酶也落在EC 3.1.1.73内，因此也可被称作阿魏酸酯酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种α-半乳糖苷酶。α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)催化α-D-半乳糖苷中的末端、非还原性α-D-半乳糖残基的水解，所述α-D-半乳糖苷包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。该酶还可被称作蜜二糖酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)催化β-D-半乳糖苷中的末端非还原性β-D-半乳糖残基的水解。在一些实施方案中，该多肽还能水解α-L-阿拉伯糖苷。该酶也可被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种β-甘露聚糖酶。β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的随机水解。该酶也可被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种β-甘露糖苷酶。β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)催化β-D-甘露糖苷中的末端、非还原性β-D-甘露糖残基的水解。该酶也可被称作甘露聚糖酶(mannanase)或甘露聚糖酶(mannose)。
在一些实施方案中，降解果胶的一种或更多种酶被包含于含有本发明的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶的酶混合物中。果胶酶催化果胶水解为诸如寡糖或单体糖的更小的单元。在一些实施方案中，酶混合物包含任何果胶酶，所述任何果胶酶例如内切-聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、内切-半乳聚糖酶、果胶乙酰酯酶、内切-果胶裂解酶、果胶酸酯裂解酶、α-鼠李糖苷酶、外切-半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酯裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶和/或木糖基半乳糖醛酸酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种内切-聚半乳糖醛酸酶。内切-聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)催化果胶酸酯和其它聚半乳糖醛酸中的1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解。该酶还可被称作聚半乳糖醛酸酶、果胶解聚酶、果胶酶(pectinase)、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、多聚-α-1,4-半乳糖醛酸聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种果胶甲基酯酶。果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)催化反应：果胶+H2O＝n甲醇+果胶酸酯。该酶还可被称作果胶酯酶、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲酯酶、果胶酯酶、果胶糖酯酶或果胶果胶基水解酶(pectin pectyl hydrolase)。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种内切-半乳聚糖酶。内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)催化阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解。该酶也被称作阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶、内切-1,4-β-半乳聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种果胶乙酰酯酶。果胶乙酰酯酶在果胶的GaIUA残基的羟基处催化乙酰基的脱乙酰作用。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种内切-果胶裂解酶。内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)催化(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸甲酯的消除裂解以生成在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-enuronosyl基团的寡糖。该酶也被称为果胶裂解酶、果胶反式-消除酶；内切-果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、果胶裂解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种果胶酸酯裂解酶。果胶酸酯裂解酶(EC 4.2.2.2)催化(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸的消除裂解以生成在其非还原末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-enuronosyl基团的寡糖。该酶也可被称作聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸反式消除酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、内切果胶甲基反式消除酶、果胶酸酯反式消除酶、内切半乳糖醛酸酯反式消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PP酶-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种α-鼠李糖苷酶。α-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)催化α-L-鼠李糖苷中或可选地鼠李半乳糖醛酸聚糖中的末端非还原性α-L-鼠李糖残基的水解。该酶还可被称作α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种外切-半乳糖醛酸酶。外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)从非还原末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸酯。该酶也被称作外切-聚-α-半乳糖苷酶、外切聚半乳糖苷酶或外切聚半乳糖苷酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种外切-半乳糖醛酸酶。外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)催化以下类型的反应：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-i+D-半乳糖醛酸酯。该酶也被称作半乳糖醛酸1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)、外切聚半乳糖醛酸酶、聚(半乳糖醛酸酯)水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切聚-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种外切聚半乳糖醛酸酯裂解酶。外切聚半乳糖醛酸酯裂解酶(EC 4.2.2.9)催化4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-enuronosyl)-D-半乳糖醛酸酯从果胶酸酯(即，去酯化的果胶)的还原性末端的消除性裂解。该酶也被称作果胶酸酯二糖裂解酶、果胶酸酯外切裂解酶、外切果胶酸反式消除酶、外切果胶酸酯裂解酶、外切聚半乳糖醛酸-反式-消除酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸还原末端二糖裂解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种鼠李糖半乳糖醛酸酶。鼠李糖半乳糖醛酸酶以内切的模式水解严格地交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构中半乳糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间的键，所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸)]组成。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶通过β-消除以内切模式裂解鼠李糖半乳糖醛酸聚糖中的α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯催化鼠李糖半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基的骨架的脱乙酰作用。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种鼠李糖半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶以外切的模式从严格地交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸。该酶也被称为木糖半乳糖醛酸聚糖水解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶。木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种内切阿拉伯糖酶。内切阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)催化1,5-阿拉伯聚糖中的1,5-α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷键的内切水解。该酶也被称作内切-阿拉伯糖酶、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖-1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了酶混合物中的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、和参与木质素降解的至少一种酶。酶促木质素解聚作用能通过往往协同作用的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和纤维二糖脱氢酶(CDH)来完成。这些细胞外酶往往被称作“木质素改性酶”或“LME”。这些酶中的三种包含两种糖基化的含亚铁血红素的过氧化物酶，即木质素过氧化物酶(LIP)、Mn-依赖性过氧化物酶(MNP)、和含铜的酚氧化酶漆酶(LCC)。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种漆酶。漆酶为在很多植物、真菌和微生物中发现的含铜的氧化酶。漆酶对酚类和相似的分子有酶促活性并进行单电子氧化。漆酶可以是聚合的并且酶促地活性形式可以是二聚体或三聚体。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种Mn依赖性过氧化物酶。Mn依赖性过氧化物酶(MnP)的酶促活性依赖于Mn2+。不被理论束缚，已暗示该酶的主要作用是将Mn2+氧化为Mn3+(参见例如Glenn等人,Arch.Biochem.Biophys.,251:688-696[1986])。随后地，酚类底物被生成的Mn3+氧化。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种木质素过氧化物酶。木质素过氧化物酶为体外催化聚合的木质素的稀释溶液的氧化解聚的细胞外亚铁血红素。LiP的底物中的一些，最显著地3,4-二甲氧基苄基醇(藜芦基醇，VA)，为已显示作为氧化还原介质起作用的活性氧化还原化合物。VA为通过黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)的木质素降解培养物与LiP同时生成的次生代谢物，并且不被理论束缚，已提出在木质素的体内LiP催化的氧化反应中作为生理上的氧化还原介质起作用(参见例如Harvey等人,FEBS Lett.,195:242–246[1986])。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及参与纤维素降解的至少一种蛋白酶和/或脂肪酶。
如本文使用的，“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和诸如糖的其它部分之间的键的酶(糖肽酶)。很多蛋白酶在EC 3.4下表征并且适于在本发明中使用。蛋白酶的一些特定类型包括包含胃蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶、包含胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶的木瓜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
如本文使用的，“脂肪酶”包括水解脂类、脂肪酸类、和酰基甘油酯类的酶，所述脂类、脂肪酸类、和酰基甘油酯类包括甘油磷脂、脂蛋白、甘油二酯等。在植物中，脂类被用作结构成分以限制水分丢失和病原体侵染。这些脂类包括源自脂肪酸的蜡状物、以及角质和木栓质。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白，所述扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白诸如膨胀素(swollenin)(参见例如Salheimo等人,Eur.J.Biochem.,269:4202-4211[2002])或膨胀素样蛋白。扩展蛋白涉及在植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键而不具有水解活性。以这种方式，其被认为允许纤维素纤维的滑动以及细胞壁的扩展。扩展蛋白样蛋白膨胀素含有N末端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C-末端扩展蛋白样结构域。在一些实施方案中，扩展蛋白样蛋白或膨胀素样蛋白包含此类结构域中的一种或两者和/或破坏细胞壁的结构(诸如破坏纤维素结构)，任选地不生成可检测的量的还原糖。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及纤维素整合蛋白、支架蛋白或支架蛋白样蛋白的至少一种多肽产物，所述纤维素整合蛋白、支架蛋白或支架蛋白样蛋白例如分别地来自热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)或解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)的CipA或CipC。支架蛋白和纤维素整合蛋白为多功能整合亚基，其可将分解纤维素的亚基组装成多酶复合体。这通过两种互补类的结构域(即支架蛋白上的粘合结构域(cohesion domain)和每个酶促单位上的锚定结构域)的相互作用来完成。支架蛋白亚基还具有介导纤维体(cellulosome)附接至其底物的纤维素结合模块。为了本发明的目的的支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一种或两者。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及至少一种纤维素诱导的蛋白或调节蛋白，例如如由cip1或cip2基因或来自里氏木霉(参见例如，Foreman等人,J.Biol.Chem.,278:31988-31997[2003])、嗜热毁丝霉、和/或任何其它合适的生物体的相似基因编码的。
在一些另外的实施方案中，本发明提供了至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶、以及以上描述的多肽的类型中的每一种的至少一个成员、一种多肽类型的若干成员、或这些多肽类型的任何组合以提供适于多种用途的酶混合物。
木糖异构酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶组合物的其它成分
在一些实施方案中，本发明的木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多肽在与诸如至少一种缓冲剂、表面活性剂、和/或精练剂的其它任选成分的组合中使用。在一些实施方案中，至少一种缓冲剂与本发明的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶多肽(任选地与其它酶组合)一起使用以保持其中利用木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶的溶液内期望的pH。使用的缓冲剂的确切浓度将取决于技术人员能确定的若干因素。合适的缓冲剂是本领域所熟知的并且任何合适的缓冲剂可用于本发明。
在一些实施方案中，至少一种表面活性剂与本发明的至少一种木糖异构酶、木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶一起使用。合适的表面活性剂包括与一种或更多种木糖异构酶、一种或更多种木糖醇脱氢酶、和一种或更多种木酮糖激酶、以及存在于混合物中的任何其它酶相容的任何表面活性剂。示例性表面活性剂包括但不局限于阴离子、非离子、和两性表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不局限于线性或分支的烷基苯磺酸盐；具有线性或分支的烷基或烯基的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；链烷磺酸盐等。用于阴离子表面活性剂的合适的反离子包括但不局限于诸如钠和钾的碱性金属离子；诸如钙和镁的碱土金属离子；铵离子；和具有碳原子数2或3的从1至3个烷醇基团的烷醇胺。适于在本发明的实践中使用的两性表面活性剂包括但不局限于诸如季铵盐磺酸盐、甜菜碱型两性表面活性剂等的表面活性剂。合适的非离子表面活性剂包括但不局限于聚氧化烯醚，以及较高的脂肪酸烷醇酰胺或其烯化氧加合物、脂肪酸甘油单酯等。表面活性剂的混合物也可用于本发明，如本领域已知的。事实上，表面活性剂的任何合适的混合物可用于本发明。
发酵
本发明提供了用于生成发酵产物的方法，其中方法包括：(a)提供本发明的重组真菌细胞；(b)提供包含木糖的发酵培养基；(c)在适于生成发酵产物的条件下使发酵培养基与重组真菌细胞接触；以及任选地(d)回收发酵产物。在一些实施方案中，发酵产物为醇(例如乙醇、丁醇等)、脂肪醇(例如C8-C20脂肪醇)、脂肪酸(例如C8-C20脂肪酸)、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油和/或β-内酰胺(例如头孢菌素)。但是，预期利用本发明的方法将生成其它的发酵产物。
在一些实施方案中，发酵培养基为来自纤维素糖化过程的原料和/或来自半纤维素预处理过程的原料。此类原料包括但不局限于碳水化合物(例如，木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等)、其它糖类(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等)、和其它成分。适于酵母和丝状真菌的生长的发酵培养基的成分是本领域所熟知的并且有提供这些培养基的配方的多种参考教科书。任何合适的培养基可用于本发明。
适于生成期望的发酵产物的发酵条件是本领域所熟知的并且任何合适的方法可用于本发明。在一些实施方案中，发酵过程在好氧或微好氧(即，其中氧气的浓度比空气中的小)、或厌氧条件下进行。在一些实施方案中，发酵在厌氧条件(即，无可检测到的氧气)、或小于约5mmol/L/h、约2.5mmol/L/h、或约1mmol/L/h氧气下进行。在氧气不存在的条件下，糖酵解中生成的NADH不能被氧化磷酸化作用氧化。在厌氧条件下，丙酮酸或其衍生物可被宿主细胞作为电子和氢接受体利用以生成NAD+。在本发明的一些实施方案中，当发酵过程在厌氧条件下进行时，丙酮酸被还原成诸如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、和/或β-内酰胺(例如头孢菌素)的发酵产物。
在一些实施方案中，发酵过程在对重组真菌细胞最佳的温度下运行。例如，在一些实施方案中，发酵过程在从约20℃至约42℃的范围内的温度下进行。在一些实施方案中，该过程在小于约38℃、小于约35℃、小于约33℃、或小于约38℃，但至少约20℃、22℃、或25℃的温度下进行。但是，在一些实施方案中，温度高的多(例如高达100℃或更大)。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞在分批或连续的发酵条件下生长。传统的分批发酵为密闭系统，其中培养基的成分在发酵的开始被设定并且在发酵期间不经受人工改变。分批系统的变化形式为补料分批发酵，其也可用于本发明。在该变化形式中，随着发酵进展，底物以增量被添加。当分解代谢物阻遏有可能抑制细胞的代谢和/或在期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。分批和补料分批发酵是本领域常用且熟知的。连续发酵为开放系统，其中限定的发酵通常地保持培养物在恒定的高密度，细胞主要地在对数生长期。连续发酵系统力图保持稳定状态生长条件。用于调节用于连续发酵过程的营养物和生长因子的方法，以及用于调节用于连续发酵过程的营养物和生长因子的技术以及用于使产物形成的速率最大化的技术在工业微生物领域是被熟知的。意图任何合适的发酵方法将可用于本发明。
本发明的前述和其它的方面可联系以下非限制性实施例来更好的理解。
实验
在以下实施例中详细地描述了本发明，以下实施例绝非意图限制如所要求的本发明的范围。
在以下的实验性公开内容中，以下缩写适用：wrt(关于)；pm(百万分之)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)、uM和μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um和μm(微米)；sec.(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(转每分钟)；℃(摄氏度)；DNA(脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；CDW(细胞干重)；HPLC(高压液相色谱)；HMF(羟甲基糠醛)；ARS(ARS Culture Collection或NRRLCulture Collection,Peoria,IL)；Lallemand(Lallemand Ethanol Technology,Milwaukee,WI)；Dualsystems(Dualsystems Biotech AG,Basel,Switzerland)；Megazyme(Megazyme International Ireland,Ltd.,Wicklow,Ireland)；Dasgip(Dasgip Biotools,LLC,Shrewsbury,MA)；Difco(Difco Laboratories,BDDiagnostic Systems,Detroit,MI)；PCRdiagnostics(PCRdiagnostics，E coliSRO,Slovak Republic)；Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)；和Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。
以下培养基在于以下的实施例中描述的工作中使用。
YPD：
●10g/L酵母提取物
●20g/L蛋白胨
●20g/L右旋糖
YP[5.5％]G(有5.5％葡萄糖的YPD)
●10g/L酵母提取物(BD Difco目录号212750)
●20g/L蛋白胨(BD Difco目录号211677)
●55g/L葡萄糖
YP[5.5％]G[3.0％]X(有5.5％葡萄糖和3％木糖的YPD)：
●10g/L酵母提取物(BD Difco目录号212750)
●20g/L蛋白胨(BD Difco目录号211677)
●55g/L葡萄糖
●30g/L木糖
SD基本培养基(也被称作“合成培养基”、“基本培养基”和“限定(defined)基本培养基”)：
●6.7g/L酵母基础氮源，无氨基酸，有硫酸铵(Sigma Y0626)
●2g/L合成的限定混合物(Synthetic Defined Mix)(SD Complete，USBiological目录号D9515)
●3.06g/L磷酸二氢钠(Sigma S8282)
●0.804g/L磷酸氢二钠(Sigma S7907)
痕量元素溶液：
●1.5g/L EDTA
●450μg/L硫酸锌(Sigma 221376)
●100μg/L二氯化锰(Sigma M3634)
●30μg/L氯化钴(II)(Sigma 202185)
●30μg/L硫酸铜(II)(Sigma C7631)
●40μg/L钼酸钠(Sigma M1003)
●450μg/L氯化钙(Sigma C3881)
●300μg/L硫酸铁(II)(Sigma F8048)
●100μg/L硼酸(Sigma B0394)
●10μg/L碘化钾(US Bio P5000)
以下序列可用于本发明。SEQ ID NO：2对应于源自多种来源的合成的嵌合木糖异构酶多肽序列(“嵌合体1”)并且SEQ ID NO：1为编码SEQ IDNO：2的多核苷酸序列。SEQ ID NO：7、8、9和10来自密褐褶孔菌，SEQ IDNO：11和12来自根囊鞭菌属，SEQ ID NO：13和14对应于从牛的瘤胃分离的木糖异构酶，SEQ ID NO：15和16对应于从人类肠分离的木糖异构酶，SEQ ID NO：17、18、19和20对应于来自博伊丁假丝酵母的木糖异构酶，SEQ ID NO：21和22对应于来自致病疫霉的木糖异构酶，以及SEQ IDNO：23和24来自人芽囊原虫；SEQ ID NO：4对应于来自树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶(XD)，由SEQ ID NO：3编码。SEQ ID NO：6对应于来自酿酒酵母的木酮糖激酶(XK)，由SEQ ID NO：5编码。
嵌合体1：
ATGAAGAACTATTTCCCCAACGTCCCAGAAATTAAATACGAAGGTCCAAACTCCACAAATCCTTTCGCTTTTAAATATTATGATGCTAATAAAGTAGTCGCCGGTAAGACCATGAAGGAGCATTTGAGATTCGCTCTATCCTGGTGGCACACTTTGTGTGCCGGTGGTGCTGATCCATTCGGAGTAACTACTATGGACAGGACCTACGGTAACATTACCGACCCAATGGAACTAGCTAAGGCCAAAGTTGATGCTGGTTTCGAACTGATGACTAAGCTGGGCATCGAGTTCTTCTGCTTCCATGATGCCGACATTGCTCCAGAAGGTGACACCTTCGAAGAGTCCAAGAAAAATCTGTTCGAGATTGTTGATTACATCAAGGAGAAGATGGACCAAACCGGCATCAAGTTGTTATGGGGCACTGCTAACAACTTTAGTCACCCCAGGTTCATGCACGGTGCAGGAACTTCTCCTAGTGCCGATGTTTTCGCTTATGCTGCTGCGAAAATAAAGAACGCTTTAGATGCGACCATCAAGTTGGGCGGTAGAGGTTATGTCTTTTGGGGTGGTAGAGAAGGTTACGAGACCCTGCTGAATACTAACATGGGCTTAGAACTGGACAACATGGCTAGGTTGATGAAGATGGCCGTTGAGTATGGTAGGTCTATTGGATTCAAAGGTGACTTCTACATCGAGCCTAAACCCAAGGAACCTATGAAGCACCAGTACGACTTCGACACTGCTACCGTATTAGGTTTTTTAAGGCAGTACGGGTTGGATAAAGACTTCAAATTGAACATCGAAGCCAATCACGCCACACTAGCAGGACACTCATTCCAGCATGAGTTACGTATTGCTAGTATTAACGGTATGTTGGGTTCTGTTGATGCTAACCAAGGTGACGTATTGTTAGGATGGGACACGGATCAATTCCCCACAAACATTTATGATACTACTATGTGTATGTATGAGGTCATTAAAGCCGGTGGTTTCACAAATGGCGGCCTGAACTTTGATGCTAAAGCTAGAAGAGGTTCATTCACGCCTGAAGATATTTTCTATTCTTACATTGCTGGTATGGATGCTTTCGCGTTAGGGTTTAGAGCAGCTCTTAAATTGATTGAAGACGGTAGAATTGACAAGTTTGTGGCTGACAGGTATGCCTCTTGGAATACCGGTATTGGTGCAGATATTATTGCCGGAAAAGCCGATTTTGCATCATTGGAAAAATATGCTTTGGAGAAAGGAGAGGTTACCGCGTCATTGTCTTCTGGTAGACAAGAGATGCTGGAATCTATTGTCAACAACGTATTGTTTAGTTTGTAA(SEQ ID NO：1)
MKNYFPNVPEIKYEGPNSTNPFAFKYYDANKVVAGKTMKEHLRFALSWWHTLCAGGADPFGVTTMDRTYGNITDPMELAKAKVDAGFELMTKLGIEFFCFHDADIAPEGDTFEESKKNLFEIVDYIKEKMDQTGIKLLWGTANNFSHPRFMHGAGTSPSADVFAYAAAKIKNALDATIKLGGRGYVFWGGREGYETLLNTNMGLELDNMARLMKMAVEYGRSIGFKGDFYIEPKPKEPMKHQYDFDTATVLGFLRQYGLDKDFKLNIEANHATLAGHSFQHELRIASINGMLGSVDANQGDVLLGWDTDQFPTNIYDTTMCMYEVIKAGGFTNGGLNFDAKARRGSFTPEDIFYSYIAGMDAFALGFRAALKLIEDGRIDKFVADRYASWNTGIGADIIAGKADFASLEKYALEKGEVTASLSSGRQEMLESIVNNVLFSL(SEQ ID NO：2)
树干毕赤酵母XD：
ATGACCGCTAATCCCTCTCTTGTTTTGAATAAGATTGACGACATTTCTTTTGAAACTTACGATGCTCCCGAAATTAGCGAACCCACAGACGTTTTAGTTCAAGTTAAAAAAACTGGTATCTGCGGTTCTGACATCCACTTCTACGCTCATGGAAGGATCGGCAACTTCGTCTTAACAAAGCCAATGGTTCTGGGTCATGAAAGCGCGGGTACTGTTGTTCAAGTCGGTAAAGGTGTTACTTCACTGAAGGTTGGTGATAACGTCGCAATCGAGCCCGGTATTCCATCTAGGTTCAGTGATGAGTACAAATCTGGTCACTACAACCTGTGTCCACACATGGCATTTGCTGCTACTCCCAATTCTAAAGAGGGTGAACCAAACCCACCAGGAACTCTATGTAAGTACTTCAAATCTCCAGAAGACTTCCTGGTTAAGTTACCCGATCATGTTTCTTTGGAGTTGGGTGCTTTGGTCGAGCCACTATCTGTTGGGGTCCATGCTAGTAAATTAGGCTCCGTTGCATTTGGCGATTACGTTGCTGTTTTTGGTGCTGGTCCAGTAGGATTACTGGCTGCCGCTGTCGCTAAGACATTTGGTGCCAAGGGTGTGATTGTCGTTGATATATTTGACAACAAGCTGAAGATGGCCAAAGACATAGGTGCCGCTACACATACCTTCAACTCCAAGACGGGAGGTAGTGAAGAATTGATCAAAGCCTTCGGTGGTAATGTACCAAATGTTGTCTTGGAATGTACTGGGGCTGAACCATGTATTAAGCTAGGTGTTGATGCCATCGCACCAGGTGGTAGATTCGTGCAAGTTGGTAATGCTGCTGGTCCCGTGTCCTTTCCCATAACAGTGTTCGCTATGAAAGAACTTACTTTGTTTGGTTCATTTCGTTATGGTTTCAACGACTATAAGACAGCCGTGGGTATCTTTGATACTAACTACCAGAACGGTAGAGAGAATGCTCCCATTGACTTTGAACAGCTTATCACGCACAGATACAAATTCAAAGACGCCATTGAAGCCTACGACCTAGTAAGAGCAGGTAAAGGGGCTGTCAAGTGTTTGATTGATGGTCCAGAATAA(SEQ ID NO：3)
MTANPSLVLNKIDDISFETYDAPEISEPTDVLVQVKKTGICGSDIHFYAHGRIGNFVLTKPMVLGHESAGTVVQVGKGVTSLKVGDNVAIEPGIPSRFSDEYKSGHYNLCPHMAFAATPNSKEGEPNPPGTLCKYFKSPEDFLVKLPDHVSLELGALVEPLSVGVHASKLGSVAFGDYVAVFGAGPVGLLAAAVAKTFGAKGVIVVDIFDNKLKMAKDIGAATHTFNSKTGGSEELIKAFGGNVPNVVLECTGAEPCIKLGVDAIAPGGRFVQVGNAAGPVSFPITVFAMKELTLFGSFRYGFNDYKTAVGIFDTNYQNGRENAPIDFEQLITHRYKFKDAIEAYDLVRAGKGAVKCLIDGPE(SEQ ID NO：4)
酿酒酵母木酮糖激酶：
ATGCTGTGCTCCGTTATACAAAGGCAAACAAGAGAAGTATCCAACACTATGTCTTTAGATAGTTATTATCTAGGATTCGATTTAAGTACACAACAATTGAAATGTCTTGCTATAAACCAGGATCTAAAGATCGTCCATTCCGAAACTGTCGAGTTCGAGAAGGACTTACCACATTATCACACCAAGAAAGGCGTCTACATTCATGGTGACACCATCGAATGCCCAGTTGCTATGTGGTTAGAAGCCCTGGATCTTGTCCTGTCCAAATATAGGGAGGCAAAGTTCCCACTGAACAAGGTCATGGCTGTTTCCGGTTCTTGTCAGCAGCATGGCTCCGTCTACTGGTCATCACAGGCTGAATCTCTGTTAGAACAACTGAACAAGAAGCCAGAGAAGGACCTGTTACACTACGTCTCCTCTGTTGCATTTGCCAGACAAACTGCTCCTAATTGGCAAGACCATTCCACTGCTAAACAATGTCAGGAGTTCGAAGAGTGTATTGGTGGACCAGAGAAAATGGCCCAGTTAACTGGTTCCCGTGCTCATTTCAGGTTCACAGGCCCACAAATCCTGAAGATTGCTCAGTTAGAACCAGAGGCTTATGAAAAGACTAAGACCATCTCTTTGGTCTCTAATTTCTTAACTTCCATTCTGGTTGGTCACTTGGTCGAACTGGAAGAAGCTGATGCGTGTGGTATGAACCTGTACGACATCCGTGAGAGGAAGTTCTCTGACGAACTGCTGCATCTTATCGACTCCTCCTCTAAGGACAAGACCATCAGGCAGAAACTGATGAGGGCACCAATGAAGAACCTGATTGCCGGTACTATTTGCAAGTACTTCATCGAAAAGTATGGCTTCAACACCAACTGCAAAGTCTCCCCTATGACTGGCGATAACCTAGCCACCATTTGTAGCTTGCCCTTAAGAAAAAACGATGTTCTTGTGTCTTTGGGTACTTCCACAACCGTCTTGTTGGTTACCGACAAATATCACCCTTCACCAAACTACCACCTGTTCATCCACCCGACGTTGCCTAACCACTACATGGGCATGATCTGCTACTGCAATGGCAGTTTAGCAAGGGAAAGGATAAGGGACGAGTTGAACAAGGAGAGGGAGAACAACTACGAGAAGACCAACGATTGGACCCTGTTCAACCAAGCTGTCCTGGATGATAGCGAATCCTCCGAGAATGAACTGGGCGTTTACTTTCCACTAGGCGAGATCGTTCCATCTGTCAAGGCCATCAACAAGAGAGTAATCTTCAACCCCAAGACTGGCATGATCGAAAGGGAAGTCGCCAAGTTCAAGGACAAGAGACATGACGCCAAGAACATCGTTGAATCTCAAGCCTTATCTTGCCGTGTTAGGATTTCTCCCCTACTAAGCGACTCCAATGCTTCTTCCCAGCAACGTTTGAACGAGGATACGATTGTTAAATTCGACTACGACGAGAGTCCATTGAGAGACTACTTGAACAAACGTCCTGAGAGGACATTCTTTGTTGGTGGCGCATCCAAGAACGATGCTATTGTTAAGAAGTTTGCTCAGGTCATAGGAGCAACCAAAGGTAACTTTCGTTTAGAAACTCCAAACTCATGCGCTTTAGGTGGTTGCTACAAGGCTATGTGGTCTTTGTTGTATGATAGCAATAAAATCGCTGTTCCTTTCGACAAGTTCCTAAACGATAACTTCCCTTGGCACGTCATGGAATCCATCAGCGATGTAGACAACGAGAATTGGGATAGATACAATTCTAAAATAGTTCCCTTGTCTGAGTTAGAGAAGACCTTGATTTAA(SEQ ID NO：5)
MLCSVIQRQTREVSNTMSLDSYYLGFDLSTQQLKCLAINQDLKIVHSETVEFEKDLPHYHTKKGVYIHGDTIECPVAMWLEALDLVLSKYREAKFPLNKVMAVSGSCQQHGSVYWSSQAESLLEQLNKKPEKDLLHYVSSVAFARQTAPNWQDHSTAKQCQEEEECIGGPEKMAQLTGSRAHFRFTGPQILKIAQLEPEAYEKTKTISLVSNFLTSILVGHLVELEEADACGMNLYDIRERKFSDELLHLIDSSSKDKTIRQKLMRAPMKNLIAGTICKYFIEKYGFNTNCKVSPMTGDNLATICSLPLRKNDVLVSLGTSTTVLLVTDKYHPSPNYHLFIHPTLPNHYMGMICYCNGSLARERIRDELNKERENNYEKTNDWTLFNQAVLDDSESSENELGVYFPLGEIVPSVKAINKRVIFNPKTGMIEREVAKFKDKRHDAKNIVESQALSCRVRISPLLSDSNASSQQRLNEDTIVKFDYDESPLRDYLNKRPERTFFVGGASKNDAIVKKFAQVIGATKGNFRLETPNSCALGGCYKAMWSLLYDSNKIAVPFDKFLNDNFPWHVMESISDVDNENWDRYNSKIVPLSELEKTLI(SEQ ID NO：6)
真核生物XI基因的序列：
真核生物1.XI：
ATGGATGGCGACTTAGATCCTAAAGAATATTTTCCTGAAATTCCTAAAATAAAGTATGAAGGACCCGAATCTAAAAATCCAATGGCGTTTCATTATTATGATGCAGAAAAGGTGGTGATGGGTAAAAAGATGAAAGATTGGTTAAGGTTCGCAATGTGTTGGTGGCACACACTATGTGCAGATGGCGCCGACCAATTTGGTGCTGGCACTAAGACATTCCCATGGAATGAAGGCTCAGATCCAATCGCGATAGCTAAACAAAAAGTAGACGCTGGTTTTGAAATAATGCAAAAGCTGGGGATTGAATACTACTGCTTCCACGATGTGGATCTAGTGTCTGAAGGGAATAGCGTTGAAGAGTATGAGGCTAACTTAAAGCAGGTAGTTGCCTACTTGAAAGAAAAGCAACAACAAACGGGTATTAAACTGTTGTGGTCTACCGCGAATGTCTTCGGTAATAAGAGATACATGAATGGTGCTTCTACAAACCCGGATTTCGATGTTGTCGCTAGAGCAATAGTGCAAATAAAAAATGCTATGGATGCAGGGATTGAATTGGGAGCAGAAAATTATGTCTTCTGGGGAGGAAGAGAAGGATATATGTCTTTATTGAATACTGACCAGAAGAGAGAAAAAGAACACATGGCTAGAATGCTTACTATGGCCAGAGATTACGCTAGAAGCAAGGGTTTTAAAGGTACGTTCTTAATCGAACCCAAACCCTGCGAGCCCTCTAAGCATCAGTATGATGTAGATACGGAAACTGTAATAGGCTTCCTGAGGGCTCACAATCTAGACAAAGATTTCAAGGTAAATATCGAAGTCAACCACGCGACCCTTGCTGGACATACTTTTGAACACGAACTTGCGTGTGCAGTAGATGCGGGTATGTTAGGTAGCATAGACGCAAATAGAGGTGATTATCAGAATGGATGGGATACCGATCAGTTCCCTATTGACCAATACGAATTAGTACAAGCTTGGATGGAAATTATCAGGGGTGGCGGCTTTACAACGGGCGGGACAAACTTTGATGCTAAAACCAGACGTAATTCTACTGACTTAGAGGATATTTTTATCGCTCATATAAGTGGTATGGACGCTATGGCACGTGCTTTGGAGAATGCCGCAAAGTTACTGGAGGAATCTCCAATCCCCAAGATGAAGAAGGAAAGATACGCTTCATTCGATTCTGGAATGGGTAAAGATTTCGAGGATGGTAAGTTAACGCTAGAGCAGGTTTATGAGTACGGGAAGAAGAATGGTGAACCGAAGGATACTTCTGGAAAACAAGAACTTTACGAGGCCATAGTAGCAATGTACGCTTAG(SEQ ID NO：7)
MDGDLDPKEYFPEIPKIKYEGPESKNPMAFHYYDAEKVVMGKKMKDWLRFAMCWWHTLCADGADQFGAGTKTFPWNEGSDPIAIAKQKVDAGFEIMQKLGIEYYCFHDVDLVSEGNSVEEYEANLKQVVAYLKEKQQQTGIKLLWSTANVFGNKRYMNGASTNPDFDVVARAIVQIKNAMDAGIELGAENYVFWGGREGYMSLLNTDQKREKEHMARMLTMARDYARSKGFKGTFLIEPKPCEPSKHQYDVDTETVIGFLRAHNLDKDFKVNIEVNHATLAGHTFEHELACAVDAGMLGSIDANRGDYQNGWDTDQFPIDQYELVQAWMEIIRGGGFTTGGTNFDAKTRRNSTDLEDIFIAHISGMDAMARALENAAKLLEESPIPKMKKERYASFDSGMGKDFEDGKLTLEQVYEYGKKNGEPKDTSGKQELYEAIVAMYA(SEQ ID NO：8)
真核生物2.XI：
ATGGATGGTGATTTAGATCCAAAAGAATATTTTCCAGAAATTCCTAAGATTAAATATGAAGGTCCTGAATCCAAAAATCCAATGGCTTTTCATTATTATGATGCAGAAAAAGTTGTGATGGGTAAAAAAATGAAAGATTGGTTAAGATTCGCAATGTGTTGGTGGCACACATTATGTGCAGATGGTGCAGACCAATTTGGTGCTGGTACTAAGACTTTTCCATGGAATGAAGGTTCTGATCCAATCGCTATCGCTAAACAAAAAGTTGATGCTGGTTTTGAAATTATGCAAAAGCTTGGGATTGAATACTACTGTTTCCACGATGTCGATTTAGTCTCTGAAGGCAATTCCGTTGAAGAATATGAAGCTAACTTGAAGCAGGTTGTTGCATACTTGAAAGAAAAGCAACAACAAACCGGTATTAAACTTTTGTGGTCTACAGCCAATGTATTCGGTAATAAGAGATACATGAATGGTGCTTCTACAAACCCTGATTTTGATGTTGTTGCTAGAGCTATTGTCCAAATTAAAAATGCTATGGATGCTGGCATTGAATTGGGTGCTGAAAATTATGTATTTTGGGGTGGAAGAGAAGGTTATATGTCTTTGTTGAATACTGATCAAAAGAGAGAAAAAGAACACATGGCTAGAATGCTAACTATGGCAAGAGATTACGCTAGATCCAAGGGTTTTAAAGGTACTTTTTTGATAGAACCTAAACCTTGCGAGCCTTCTAAACATCAGTATGATGTTGATACCGAAACTGTTATTGGTTTTTTAGCTGGTCATACTTTTGAACACGAATTAGCCTGTGCTGTTGATGCCGGTATGTTGGGTTCCATAGATGCTAATAGAGGTGATTATCAAAATGGTTGGGATACAGATCAATTCCCAATTGACCAATATGAATTGGTTCAAGCTTGGATGGAAATTATCAGAGGTGGAGGTTTTACAACGGGTGGGACAAACTTTGATGCTAAAACAAGGAGAAATTCTACTGACTTAGAAGATATTTTTATCGCTCATATTTCAGGTATGGATGCTATGGCTAGGGCTTTGGAGAATGCCGCAAAATTACTGGAAGAATCTCCAATACCTAAGATGAAGAAGGAAAGATACGCTTCTTTTGATTCTGGTATGGGTAAAGATTTCGAAGATGGTAAGTTGACCTTAGAACAAGTTTATGAATACGGCAAAAAAAATGGTGAACCTAAGGATACTTCTGGTAAACAAGAATTATACGAAGCAATTGTTGCTATGTACGCTTAG(SEQ ID NO：9)
MDGDLDPKEYFPEIPKIKYEGPESKNPMAFHYYDAEKVVMGKKMKDWLRFAMCWWHTLCADGADQFGAGTKTFPWNEGSDPIAIAKQKVDAGFEIMQKLGIEYYCFHDVDLVSEGNSVEEYEANLKQVVAYLKEKQQQTGIKLLWSTANVFGNKRYMNGASTNPDFDVVARAIVQIKNAMDAGIELGAENYVFWGGREGYMSLLNTDQKREKEHMARMLTMARDYARSKGFKGTFLIEPKPCEPSKHQYDVDTETVIGFLRAHNLDKDFKVNIEVNHATLAGHTFEHELACAVDAGMLGSIDANRGDYQNGWDTDQFPIDQYELVQAWMEIIRGGGFTTGGTNFDAKTRRNSTDLEDIFIAHISGMDAMARALENAAKLLEESPIPKMKKERYASFDSGMGKDFEDGKLTLEQVYEYGKKNGEPKDTSGKQELYEAIVAMYA(SEQ ID NO：10)
真核生物3.XT：
ATGACCAAAGAATACTTCCCAACTATAGGTAAAATTAGATTTGAAGGTAAAGATAGCAAGAATCCAATGGCATTTCACTACTACGATGCAGAAAAAGAAGTTATGGGCAAAAAGATGAAAGATTGGCTGAGGTTCGCAATGGCTTGGTGGCACACACTTTGCGCAGATGGTGCAGATCAATTTGGCGTCGGTACTAAATCATTCCCATGGAACGAAGGTACAGATCCTATTGCTATCGCGAAACAGAAGGTTGATGCAGGATTCGAAATTATGACTAAATTGGGGATAGAGCATTACTGCTTTCATGATGTGGATCTTGTCTCCGAAGGGAACTCTATTGAAGAATATGAATCAAACTTGAAGCAAGTAGTTGCCTACTTGAAACAAAAGCAACAAGAAACGGGTATTAAACTGTTGTGGTCTACCGCGAATGTCTTCGGTAATCCAAGATACATGAATGGTGCAAGCACTAACCCTGACTTCGATGTGGTTGCACGTGCCATAGTTCAAATTAAGAACGCAATGGATGCAGGCATTGAGCTAGGTGCTGAAAATTATGTCTTCTGGGGAGGAAGAGAAGGATATATGTCTTTATTGAATACTGACCAGAAGAGAGAAAAAGAACACATGGCTACTATGCTTACTATGGCCAGAGATTACGCTAGAAGCAAGGGTTTTAAAGGTACGTTCTTAATCGAACCCAAACCCATGGAGCCCACGAAACATCAGTATGACGTTGATACAGAAACGGTCATTGGATTCCTGCGTGCCCACAACTTAGATAAAGATTTCAAAGTCAACATTGAAGTTAATCATGCGACCCTTGCTGGACATACTTTTGAACACGAACTTGCGTGTGCAGTAGATGCGGGTATGTTAGGTAGCATAGACGCAAATAGAGGTGATTATCAGAATGGATGGGATACCGATCAGTTCCCTATTGACCAATACGAATTAGTACAAGCTTGGATGGAAATTATCAGGGGTGGCGGCTTTGTAACGGGCGGGACAAACTTTGATGCTAAAACCAGACGTAATTCTACTGACTTAGAGGATATTATTATCGCTCATATAAGTGGTATGGACGCTATGGCACGTGCTTTGGAGAATGCCGCAAAGTTATTGCAAGAATCTCCATACTGTAATATGAAGAAGGAGAGATACGCTTCATTCGATTCTGGAATCGGTAAAGATTTCGAGGATGGTAAGTTAACGCTAGAGCAGGTTTATGAGTACGGGAAGAAGAATGGTGAACCGAAGGTCACTTCTGGAAAACAAGAACTTTACGAGGCCATAGTAGCAATGTACCAATAA(SEQ ID NO：11)
MTKEYFPTIGKIRFEGKDSKNPMAFHYYDAEKEVMGKKMKDWLRFAMAWWHTLCADGADQFGVGTKSFPWNEGTDPIAIAKQKVDAGFEIMTKLGIEHYCFHDVDLVSEGNSIEEYESNLKQVVAYLKQKQQETGIKLLWSTANVFGNPRYMNGASTNPDFDVVARAIVQIKNAMDAGIELGAENYVFWGGREGYMSLLNTDQKREKEHMATMLTMARDYARSKGFKGTFLIEPKPMEPTKHQYDVDTETVIGFLRAHNLDKDFKVNIEVNHATLAGHTFEHELACAVDAGMLGSIDANRGDYQNGWDTDQFPIDQYELVQAWMEIIRGGGFVTGGTNFDAKTRRNSTDLEDIIIAHISGMDAMARALENAAKLLQESPYCNMKKERYASFDSGIGKDFEDGKLTLEQVYEYGKKNGEPKVTSGKQELYEAIVAMYQ (SEQ ID NO：12)
真核生物4.XI：
ATGGCAAAAGAATATTTCCCGTTTACAGGTAAAATCCCATTCGAAGGTAAGGATTCAAAAAATGTCATGGCTTTTCACTACTACGAGCCGGAAAAAGTGGTCATGGGCAAAAAAATGAAAGATTGGTTGAAATTCGCAATGGCATGGTGGCACACTCTGGGAGGAGCAAGTGCAGATCAATTTGGCGGTCAAACCAGATCATACGAATGGGATAAGGCTGAATGTCCTGTTCAAAGAGCGAAAGACAAGATGGACGCTGGATTCGAAATTATGGACAAGTTGGGTATTGAATATTTTTGCTTTCATGACGTGGATCTTGTCGAGGAAGCGCCAACTATAGCTGAATACGAAGAAAGAATGAAGGCTATTACTGATTATGCTDAAGAAAAGATGAAACAATTTCCGAATATTAAATTGCTGTGGGGTACTGCTAATGTGTTTGGCAACAAAAGATACGCTAACGGCGCTTCTACTAACCCTGACTTTGATGTCGTTGCCAGAGCGATTGTACAAATAAAAAATAGCATFGATGCAACAATAAAGCTTGGCGGTACAAATTATGTCTTTTGGGGCGGAAGGGAAGGTTATATGTCTTTATTGAATACTGACCAGAAGAGAGAAAAAGAACACATGGCTACTATGCTTGGTATGGCCAGAGATTACGCTAGAGCCAAAGGTTTTAAAGGTACGTTCTTAATCGAACCCAAACCCATGGAGCCCTCTAAGCATCAGTATGATGTAGATACGGAAACTGTAATAGGCTTCCTGAAAGCTCATGGTCTGGATAAGGACTTTAAAGTTAATATCGAGGTGAATCACGCAACTCTTGCTGGTCATACATTCGAGCATGAACTTGCGTGTGCAGTAGATGCGGGTATGTTAGGTAGCATAGACGCAAATAGAGGTGATGCGCAGAATGGATGGGATACCGATCAGTTCCCTATTGACAATTTCGAATTAACACAAGCTATGTTAGAGATCATAAGGAATGGCGGCTTGGGAAATGGGGGCACGAACTTTGACGCTAAAATTAGACGTAATTCTACTGACTTAGAGGATTTATTTATCGCTCATATAAGTGGTATGGACGCTATGGCACGTGCTTTGATGAACGCCGCAGACATCTTGGAAAACAGTGAATTGCCAGCCATGAAGAAGGCTAGATACGCTAGTTTTGATTCCGGTATCGGCAAGGATTTCGAGGATGGTAAACTAACTTTTGAGCAGGTGTACGAATATGGTAAAAAAGTCGAAGAACCAAAACAAACCTCTGGAAAGCAGGAGAAGTATGAAACAATTGTTGCTCTACACTGTAAGTAG(SEQ ID NO：13)
MAKEYFPFTGKIPFEGKDSKNVMAFHYYEPEKVVMGKKMKDWLKFAMAWWHTLGGASADQFGGQTRSYEWDKAECPVQRAKDKMDAGFEIMDKLGIEYFCFHDVDLVEEAPTIAEYEERMKAITDYAQEKMKQFPNIKLLWGTANVFGNKRYANGASTNPDFDVVARAIVQIKNSIDATIKLGGTNYVFWGGREGYMSLLNTDQKREKEHMATMLGMARDYARAKGFKGTFLIEPKPMEPSKHQYDVDTETVIGFLKAHGLDKDFKVNIEVNHATLAGHTFEHELACAVDAOMLGSIDANRGDAQNGWDTDQFP1DNFELTQAMLEIIRNGGLGNGGTNFDAKIRRNSTDLEDLFIAHISGMDAMARALMNAADILENSELPAMKKARYASFDSGIGKDFEDGKLTFEQVYEYGKKVEEPKQTSGKQEKYETWALHCK(SEQ ID NO：14)
真核生物5.XI：
ATGGCGACTAAAGAGTACTTTCCAGGAATAGGAAAAATTAAATTCGAAGGTAAAGAGTCCAAGAATCCAATGGCTTTCAGATATTACGATGCGGAAAAGGTAATAATGGGTAAAAAAATGAAGGATTGGCTGAAATTCTCCATGGCATGGTGGCACACTCTGTGTGCAGAAGGTGGAGATCAATTTGGCGGCGGTACTAAACATTTCCCATGGAACGGTGATGCTGACAAGTTACAAGCTGCGAAAAACAAGATGGACGCTGGATTCGAATTTATGCAGAAGATGGGTATTGAATATTATTGTTTCCATGATGTGGATTTATGTGACGAAGCGGACACTATTGAAGAATATGAAGCTAACTTGAAGGCTATTGTTGCCTACGCTAAACAAAAGCAAGAAGAAACGGGTATTAAACTGTTGTGGGGCACTGCCAACGTGTTTGGCCACGCTAGATACATGAATGGCGCCGCAACTAACCCTGACTTTGATGTCGTTGCCAGAGCGGCTGTACAAATAAAAAATGCAATTGATGCAACAATAGAGCTTGGCGGTTCCAATTATGTCTTTTGGGGCGGAAGGGAAGGTTATATGTCTTTATTGAATACTGACCAGAAGAGAGAAAAAGAACATTTGGCTCAAATGTTGACCATTGCTAGAGACTATGCCCGTGCTAGAGGATTTAAGGGGACCTTCTTAATCGAACCCAAACCCATGGAGCCCACGAAACATCAGTATGACGTTGATACAGAAACGGTCGTTGGATTCCTGAAAGCACATGGTCTGGATAAAGACTTTAAGGTCAACATTGAAGTTAATCATGCGACCCTTGCTGGACATACTTTTGAACACGAACTTGCGGTCGCAGTAGATAACGGGATGTTGGGCTCAATTGATGCGAACAGAGGTGACTACCAGAATGGTTGGGATACCGATCAGTTTCCTATTGACAATTATGAGCTTACACAGGCCATGATGCAAATTATCAGAAACGGAGGTTTTGGTGACGGGGGTACAAATTTTGATGCTAAAACGAGGAGAAATTCAACCGACTTGGAAGATATTTTCATTGCCCATATAGCAGGTATGGATGTTATGGCCAGGGCTTTGGAATCCGCAGCTAAATTGTTAGAGGAATCTCCATATAAGAAAATGTTGGCTGACAGATACGCTTCATTCGATTCTGGAAAGGGTAAAGAATTTGAGGAAGGTAAGTTAACGCTAGAGGACGTTGTTGCGTACGCTAAGGCTAATGGGGAGCCCAAACAAACTAGCGGCAAACAAGAATTGTATGAAGCTATTGTAAACATGTATTGCTAG(SEQ ID NO：15)
MATKEYFPGIGKIKFEGKESKNPMAFRYYDAEKVIMGKKMKDWLKFSMAWWHTLCAEGGDQFGGGTKHFPWNGDADKLQAAKNKMDAGFEFMQKMGIEYYCFHDVDLCDEADTIEEYEANLKAIVAYAKQKQEETGIKLLWGTANVFGHARYMNGAATNPDFDVVARAAVQIKNAIDATIELGGSNYVFWGGREGYMSLLNTDQKREKEHLAMMLTIARDYARARGFKGTFLIEPKPMEPTKHQYDVDTETVVGFLKAHGLDKDFKVNIEVNHATLAGHTFEHELAVAVDNGMLGSIDANRGDYQNGWDTDQFPIDNYELTQAMMQIIRNGGFGDGGTNFDAKTRRNSTDLEDIFIAHIAGMDVMARALESAAKLLEESPYKKMLADRYASFDSGKGKEFEEGKLTLEDVVAYAKANGEPKQTSGKQELYEAIVNMYC(SEQ ID NO：16)
真核生物6.XI：
ATGCCAGCCTACTTTGACCAATTAGATAGAGTTAGATTCGAAGGTACACAAAGCACAAATCCATTGGCCTTTAGACATTACAACCCCGATGAAATAGTTCTAGGAAAAAGAATGGAAGACCACTTGAGATTTGCAGCCTGTTATTGGCATACCTTTTGTTGGAATGGTGCTGACATGTTGGTATGGGTGCTTTCGACAGACCATGGCAACAACCCGGTGAAGCACTGGCTTTAGCAAAACGTAAGGCGGATGTCGCGTTTGAATTTTTCCATAAGTTGAATGTGCCATATTACTGTTTCCACGATGTTGACGTTTCCCCAGAAGGAGCTAGCCTAAAAGAATATAAAAATAATTTCGCACAAATGGTCGATGTCTTAGCCGCTAAACAGGAACAGTCTGGTGTTAAGCTTCTGTGGGGACTGCTAATTGTTTTACCAATCCTCGTTATGGTGCAGGTGCGGCAACCAACCCAGACCCTGAAGTTTTTAGCTGGGCAGCTACTCAAGTGGTTACTGCCATGGACGCTACTCATAAGTTGGGTGGAGAAAATTACGTTTTATGGGGAGGTAGAGAAGGTTACGAAACCCTGTTGAATACGATTTAAGGCAGGAAAGAGAGCAAATTGGAAGGTTCATGCAGCTGGTTGTAGAGCATAAACACAAGATAGGCTTCCAGGGTACACTACTGATCGAACCTAAACCACAAGAACCGACCAAGCATCAATATGATTACGACGCTGCGACAGTCTATGGATTCTTAAAGCAATTTGGTTTGGAGAAGGAAATAAAGTTAAACATTGAAGCGAACTATGCAACCTTAGCAGGCCATTCTTTTCACCATGGCATAGCAACAGCCATAGCATTAGGATTATTTGGTAGTGTTGATGCCAATAGGGGGGACGCCCAGCTTGGTTGGGATACTGATCAGTTTCCAAATTCTGTTGAGGAAAACGCCTTAGTCATGTACGAGATTCTAAAGGCTGGCGGATTTACTACAGGAGGTTTGAACTTTGACGCTAAGGTTAGGAGACAATCTACTGACAAATATGACTTGTTCTACGGTCATATCGGTGCTATGGATACAATGGCATTGTCTTTAAAAATAGCAGCTAGAATGATAGAGGCTGGAGGTTTAGATCAAAGAGTCGCCAAAAGATATGCCGGTTGGAATGGTGAGTTGGGACAACAAATATTAAAAGGGCAGATGACGTTAACTGAAATAGCGCAGTACGCAGAACAACATAACCTTGCCCCAGTTCATCAAAGCGGTCACCAGGAATTACTAGAGAATCTTGTTAATCATTACTTATTTGATAAGTGA(SEQ ID NO：17)
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真核生物7.XI：
ATGCCCTATTTCCCAGGTGTTGAAAAAGTTAGATTCGAAGGCCCTGCAAGTACATCTGCACTAGCATTTAGACATTACGATGCGAATAAACTGATACTTGGAAAGCCAATGCGTGAACACTTGAGAATGGCAGCATGTTATTGGCATACCTTTGTTTGGCCCGGTGCTGACATGTTTGGTATGGGTACTTTCAAGAGACCATGGCAAAGAAGTGGAGAGCCAATGGAAGTAGCTATAGGGAAGGCAGAAGCGGCTTTTGAGTTCTTCTCCAAACTAGGGATTGATTATTATAGCTTTCATGATACCGACGTTGCTCCTGAAGGATCTAGCCTAAAAGAATATAGGAATCATTTCGCACAAATGGTCGATCATTTAGAAAGACATCAGGAACAGACCGGTATTAAGTTGCTTTGGGGGACAGCTAACTGCTTTTCTAATCCAAGGTTTGCCGCAGGCGCAGCTTCAAATCCTGATCCTGAAGTTTTCGCATTTGCAGCTGCGCAAGTCTTCAGCGCAATGAATGCTACATTGAGATTGAAAGGTGCTAATTATGTTTTGTGGGGTGGAAGAGAAGGTTATGAGACTTTGCTGAACACTGATTTAAAGAGAGAAAGGGAGCAATTGGGTCGTTTTATGCGTATGGTTGTAGAGCATAAACACAAGATAGGCTTCACTGGTGATTTGCTGATCGAACCTAAACCACAAGAACCGACCAAGCATCAATATGATTACGACTCAGCGACAGTCTTTGGATTCTTACACGAATATGGTTTGGAGCACGAAATAAAGGTTAACGTTGAAGCGAACCATGCAACCTTAGCAGGCCATTCTTTTCACCATGAAATAGCAACAGCCGTATCACTAGGTATATTTGGGAGTATTGATGCCAATAGGGGGGACCCCCAGAATGGGTGGGACACAGACCAATTTCCAAATTCTGTAGAAGAGATGACTTTAGCCACATACGAAATTCTAAAGGCTGGCGGATTTAAGAATGGAGGATACAACTTTGATTCTAAGGTTAGGAGACAATCTTTAGACGAAGTGGACTTGTTCCACGGTCATGTTGCAGCTATGGATGTACTAGCCTTGGCTCTAGAGAGAGCTGCGGCTATGGTTCAAGATGACAGATTGCAACAATTTAAAGATCAGAGATATGCAGGTTGGAGTCAGCCTTTAGGGCAGGCGGTATTAGCGGGCGAGTTCTCCTTAGAAAGTCTTGCCGAACATGCTTTTGCCAACGCATTAGACCCTCAAGCTGTATCTGGGCGTCAAGAAATGCTFGAGGGTGTTGTTAACCGTTTTATTTAA(SEQ ID NO：19)
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真核生物8.XI：
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真核生物9.XI：
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MEYFPGISNIKYEGSASMNDLSFKWYNAEQVVLGKKMKDHLRFAVCYWHTFCYQGNDQFGGPTLNRPWCGDADPMVEAKKKCDAAFEFFTKLGVEYYCFHDRDIVAEGETLEETNRRLDEISDYMLEKQKQTGVKLLWGTANMFGDRVFMNGASTNPDAHVFALAAAQVKKAMDITKKLGGENYVFWGGREGYQSILNSLPGKELDHMGQFMRMAVEYKKKIGATFQLLIEPKPREPTKHQYDYDAQTVIGFLRKYGLEKDFKLNIEPNHTTLAGHDYEHDIVFACNEGMLGSVDANTGDTLLGWDTDQFPMDVKKAVIVMYHIIRAGGLHSGGLNFDAHVRRESTDMEDRFIAHIGAMDTFARALLIVEKIMNDKIYQEMVDKRYESYTTGIGARIENGEATFEECEKYILENGKPEPQSAKQEKFEMLLNHYV(SEQ ID NO：24)
实施例1
克隆XI-XD-XK途径
利用限制性酶(BamHI和NdeI用于XI，SpeI和AatII用于XD，NotI和XhoI用于XK)将三种基因XI、XD和XK克隆进质粒PLS0030112(参见，图8)并连接。每种基因被克隆在不同启动子(分别地，TEF1、ADH1、和G3PD)下，产生质粒PLS0044980(参见，图9)。该质粒被用来转化三种酵母菌株：酵母(Lallemand)、源于的单倍体后代、和源于NRRL Y1528的单倍体后代。基于Sigma-Aldrich酵母转化试剂盒说明书进行转化并且基于抗生素抗性选择菌落，如通过在含200ug/mlG418的YPD平板上生长来观察。在平行实验中，也用含有以下基因组合的对照质粒转化这些菌株：只有XI、XI+XD、XI+XK、XD+XK；和阴性对照(即，空载体)。
实施例2
含XI-XD-XK途径的菌株的表征
在生长48小时后在5个重复中将在含有200ug/ml G418的YPD上生长的菌落挑入装有400ul接种培养基(用200ug/ml G418、1mM MgSO4和如以上提供的痕量元素溶液修改的YPD)的96孔板中并且在30℃和85％相对湿度下在2”推动(throw)且250RPM的转速的震荡孵育箱中生长24小时。孵育后，使用80ul培养物来接种装有补充有200ug/ml G418、1mMMgSO4和以上提供的痕量元素溶液的320ul YP[5.5％]G的96深孔平板的每个孔。菌株在相同的条件下生长另外24小时。在繁殖步骤结束时，使平板旋转下降(4000RPM 10分钟)，并且细胞被用来接种用200ug/mlG418、1mM MgSO4和如以上提供的痕量元素溶液修改的400ulYP[5.5％]G[3.0％]X。在30℃和85％相对湿度下，在2”推动和100RPM的转速的震荡孵育箱中，在帽垫密封的96孔平板中进行发酵过程。在96小时结束时，使平板旋转下降(4000RPM 10分钟)并过滤上清液并通过HPLC利用本领域已知的标准方法分析代谢产物。在一些实验中，利用根据制造商的说明书进行的分光光度测定(例如，Megazyme木糖测定；目录号K-XYLOSE)来测量上清液中残留的木糖。基于与只用抗生素标志物转化的对照菌株的表现的比较来计算在木糖利用表现上的改进。
图3提供了显示发酵结果的图。发酵分析指示对于包含XI-XD-XK途径的所有三种菌株与只含有XI基因的对照菌株相比在木糖消耗和乙醇生成上的显著提高。虽然包含XI与单独的XD或XK组合的菌株不导致木糖利用的提高，但是具有组合的XI-XD-XK途径的菌株达到比相应的只含XI的亲本菌株高2-3×倍的木糖消耗。而且，这些菌株证实较低的木糖醇(XOH)生成，可能由于XD和XK基因的组合活性导致增加的通向戊糖磷酸途径的通量(并非意图本发明限于任何特定的机制和/或理论)。
图4提供了显示在若干发酵条件下由受测的不同菌株的木糖消耗的倍数提高的图。将含有XI-XD-XK途径的菌株的木糖消耗与只含有XI基因的那些比较。对从含有空质粒的参考菌株测量的消耗计算木糖消耗。在该图中，“YPD5.5X3”指YP[5.5％]G[3.0％]X培养基，“YPD5.5X5.5”为具有5.5％木糖的YP[5.5％]G培养基，并且“SD5.5X3”为具有5.5％葡萄糖和3.0％木糖的SD基本培养基。变异系数在2-6％之间。如在图4中显示的，有XI-XD-XK途径的菌株保持提高的表现，如通过在很多条件下较高的木糖消耗和相应的乙醇生成所观察到的，所述很多条件诸如72小时的发酵时间而不是96小时，5.5％的木糖浓度而不是3％，和基于基本SD的培养基而不是基于YPD的培养基。当放大规模到25ml时也观察到相对提高。
图5提供了含有空质粒(即，阴性对照)、XI-XD-XK途径、或只XI基因的单倍体菌株的25ml发酵的时程分析。在25ml闪烁管中在YPD5.5X3(含有5.5％葡萄糖和3％木糖的YPD培养基)中进行发酵。自动样品分析表明了含有XI-XD-XK途径的菌株与只含有XI基因的菌株相比，较高的木糖消耗率、较高的乙醇(EtOH)生成、和较低的木糖醇(XOH)生成。
实施例3
在木糖基本培养基中XI-XD-XK菌株的生长速率评价
菌株NRRL-Y1528和含有XI-XD-XK途径的源自的单倍体酵母菌株和只含有XI基因的对照菌株在限定的基本木糖培养基中生长以比较其在木糖上的比生长速率。收取样品以测量生物质的水平并从而计算生长的比速率。
将含有NRRL-Y1528的甘油贮存物以及在实施例1中制备的源自的单倍体酵母菌株接种入含有2％葡萄糖的5ml SD基本培养基中。使细胞在30℃、250rpm震荡的孵育箱中生长24小时。孵育后，然后将0.5ml该培养物稀释入250ml摇瓶中的含有2％木糖作为唯一碳源的50ml SD基本培养基中。允许培养物在30℃下伴随160rpm震荡生长。移出来自培养物的样品用于每天一次或两次在600nm处的光密度测量。一旦培养物的光密度达到大于5的值，用含2％木糖作为唯一碳源的基本培养基将其稀释10倍。该过程持续150小时。在这段时间期间，只有XI的菌株不显著地生长，而XI-XD-XK菌株以0.08至0.09hr-1的生长速率生长。
为了计算比生长速率，生物质浓度的自然对数与时间的图被用来生成线性相关性。该相关性的斜率得到菌株在指定的条件下的比生长速率。
实施例4
在rDNA基因座处的XI-XD-XK整合
在rDNA基因座处整合编码XI-XD-XK途径的基因允许酵母中途径组成部分的稳定共表达而无质粒的连续筛选。利用标准酵母重组克隆技术通过亚克隆来自RDN1基因座的5’和3’同源序列来构建质粒PLS0047984。通过用SmaI和PstI消化使PLS0047984线性化以生成适于靶菌株的整合转化的线性片段。长出之后，在含有200ug/ml G418的YPD选择平板上进行频繁重组事件的选择。对出现的菌落进行PCR以验证转化后XI基因的存在。
实施例5
XI基因多样性的评价
来自真核起源的XI基因的9种不同的拷贝从cDNA序列重建或在DNA序列翻译的BLAT(参见例如，Kent,Genome Res.12:656-664[2002])或BLAST检索中找到。收获序列，密码子优化(在一种情况下，相同的基因经受两种交替的密码子优化)，合成带有用其起始密码子上游的BamHI和Kozak序列以及其终止密码子下游的NdeI序列。将序列亚克隆入PLS030112的BamHI和NdeI位点，受酿酒酵母TEF1启动子的控制。将这些质粒转化入不编码用于木糖利用的任何其它外源基因的酵母表达菌株中。
生长48小时后，在5个重复中将在具有200ug/ml G418的YPD上生长的菌落挑入装有400ul(含200ug/ml G418、1mM MgSO4和以上提供的痕量元素溶液的YPD)的96孔板中并且在30℃和85％相对湿度下、在2”推动和250RPM的转速的震荡孵育箱中生长24小时。孵育后，使用80ul培养物来接种装有320ul用200ug/ml G418、1mM MgSO4和痕量元素溶液修改的YP[5.5％]G的96深孔平板。菌株在相同的条件下生长另外24小时。在繁殖步骤结束时，使平板旋转下降(4000RPM 10分钟)，并且细胞被用来接种400ul发酵培养基(用200ug/ml G418、1mM MgSO4和痕量元素溶液修改的YP[5.5％]G[3.0％]X)。在30℃和85％相对湿度下，在2”推动和100RPM的转速的震荡孵育箱中，在帽垫密封的96孔平板中进行发酵过程。在72小时结束时，使平板旋转下降(4000RPM 10分钟)并且通过利用根据制造商的说明书进行的分光光度测定(例如，Megazyme木糖测定；目录号K-XYLOSE)针对上清液中的残留木糖分析上清液。通过将XI转化的菌株的表现与只用抗生素标志物转化的对照菌株和只含有原始的XI基因的背景菌株的表现比较来确定在木糖利用上的改进。
9种菌株(即，含有新的XI序列中的一种)中的4种消耗比阴性对照显著地更多的木糖。最佳的菌株为真核生物3(根囊鞭菌属XI)、真核生物4(从牛瘤胃获得的XI)、真核生物5(从人类肠获得的XI)、和真核生物9(人芽囊原虫XI)。图7提供了显示如在对照和在实施例1中描述的转化的源自NRRL Y1528的单倍体菌株的发酵之后测量的残留的木糖的图。
虽然已说明并描述了本发明的特定实施方案，但是对本领域技术人员将是明显的是，可进行多种其它的改变和修改而不背离本发明的精神和范围。因此，意图本发明包括本发明的范围内的所有此类改变和修改。
本文已广泛且一般性地描述了本发明。落入本一般性公开内容内的较窄的种类和亚属组群中的每一种也形成本发明的部分。本文描述的发明合适地可在本文未特别地公开的任何一种元素或更多种元素、一种限制或更多种限制的存在下实践。已使用的术语和表述被用作描述性且非限制性的术语。没有意图在此类术语和表述的使用中，排除描述和/或显示的特征的任何等价物或其部分，但是认识到多种修改在所要求的发明的范围内是可能的。因此，应理解尽管本发明已通过一些优选的实施方案和最佳的特征来特别地公开，但是本文公开的概念的修改和变形可被本领域技术人员利用，并且认为此类修改和变形在本发明的范围内。

Claims (119)

1.一种重组真菌宿主细胞，所述重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸、和/或编码木酮糖激酶的至少一种多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的重组真菌宿主细胞，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和所述木酮糖激酶为真核生物的或原核生物的酶。
3.根据权利要求2所述的重组真菌宿主细胞，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和所述木酮糖激酶为真核生物的酶。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和木酮糖激酶为真菌的酶。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。
6.根据权利要求5所述的重组真菌宿主细胞，其中所述遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。
7.根据权利要求5和/或6所述的重组真菌宿主细胞，其中所述遗传元件包括真菌复制起点。
8.根据权利要求7所述的重组真菌宿主细胞，其中所述真菌复制起点为酵母复制起点。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列中的至少一种被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。
10.根据权利要求9所述的重组真菌宿主细胞，其中所述启动子序列为真菌启动子序列。
11.根据权利要求9和/或10所述的重组真菌宿主细胞，其中所述真菌启动子序列为酵母启动子序列。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录终止序列。
13.根据权利要求1-11中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述至少一种多核苷酸被整合入所述宿主细胞基因组中。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞已有一种或更多种天然基因从其基因组中缺失。
16.根据权利要求15所述的重组真菌宿主细胞，其中所述一种或更多种天然基因的所述缺失导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向所述宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中相对于对应的无所述一种或更多种缺失的宿主细胞进行比较。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞被改变以过表达一种或更多种多核苷酸。
18.根据权利要求17所述的重组真菌宿主细胞，其中所述过表达导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向所述宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中与对应的未改变的宿主细胞进行比较。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的重组宿主细胞，其中所述核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽；和包含与SEQ IDNO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
20.根据权利要求1-19中的任一项所述的重组宿主细胞，其中所述核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
21.根据权利要求1-20中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述核酸构建体包含含有选自以下的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列：SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21；和SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:5。
22.根据权利要求1-21中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞。
23.根据权利要求22所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
24.一种重组真菌宿主细胞，所述重组真菌宿主细胞包含至少一种核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码木糖异构酶的至少一种多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的重组真菌宿主细胞，其中所述木糖异构酶为真核生物的或原核生物的酶。
26.根据权利要求24和/或25所述的重组真菌宿主细胞，其中所述木糖异构酶为真核生物的酶。
27.根据权利要求24-26中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述木糖异构酶为密褐褶孔菌(G.trabeum)木糖异构酶、根囊鞭菌属(Orpinomyces)木糖异构酶、从牛瘤胃获得的木糖异构酶、从人类肠获得的木糖异构酶、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)木糖异构酶、致病疫霉(P.infestans)木糖异构酶、或人芽囊原虫(B.hominis)木糖异构酶。
28.根据权利要求24-27中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。
29.根据权利要求28所述的重组真菌宿主细胞，其中所述遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。
30.根据权利要求28和/或29所述的重组真菌宿主细胞，其中所述遗传元件包括真菌复制起点。
31.根据权利要求30所述的重组真菌宿主细胞，其中所述真菌复制起点为酵母复制起点。
32.根据权利要求24-31中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列中的至少一种被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。
33.根据权利要求32所述的重组真菌宿主细胞，其中所述启动子序列为真菌启动子序列。
34.根据权利要求32和/或33所述的重组真菌宿主细胞，其中所述真菌启动子序列为酵母启动子序列。
35.根据权利要求24-34中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的转录终止序列。
36.根据权利要求24-35中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。
37.根据权利要求24-36中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述至少一种多核苷酸被整合入所述宿主细胞基因组中。
38.根据权利要求24-37中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞已有一种或更多种天然基因从其基因组中缺失。
39.根据权利要求38所述的重组真菌宿主细胞，其中所述一种或更多种天然基因的所述缺失导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向所述宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中相对于对应的无所述一种或更多种缺失的宿主细胞进行比较。
40.根据权利要求24-39中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞被改变以过表达一种或更多种多核苷酸。
41.根据权利要求40所述的重组真菌宿主细胞，其中所述过表达导致选自以下的一种或更多种表型：增加的木糖向所述宿主细胞的转运、增加的木酮糖激酶活性、增加的木糖醇脱氢酶活性、增加的木糖异构酶活性、增加的木糖还原酶活性、增加的通过戊糖磷酸途径的通量、减少的对分解代谢物阻遏的敏感性、增加的对乙醇的耐受、增加的对乙酸盐/酯的耐受、增加的对增加的渗透度的耐受、增加的对低pH的耐受、以及减少的副产物的生成，其中与对应的未改变的宿主细胞进行比较。
42.根据权利要求24-41中的任一项所述的重组宿主细胞，其中所述核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
43.根据权利要求24-42中的任一项所述的重组宿主细胞，其中所述核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
44.根据权利要求24-43中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述核酸构建体包含含有选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23的至少一种序列的至少一种多核苷酸序列。
45.根据权利要求24-44中的任一项所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞。
46.根据权利要求45所述的重组真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞为酿酒酵母。
47.一种重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列。
48.一种重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列、编码至少一种木糖醇脱氢酶的至少一种多核苷酸序列、以及编码至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列。
49.根据权利要求47和/或48所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和所述木酮糖激酶为真核生物的或原核生物的酶。
50.根据权利要求47-49中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和所述木酮糖激酶为真核生物的酶。
51.根据权利要求47-50中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和所述木酮糖激酶为真菌酶。
52.根据权利要求51所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶、所述木糖醇脱氢酶、和所述木酮糖激酶为酵母酶。
53.根据权利要求47-52中的任一项所述的重组核酸构建体，所述重组核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。
54.根据权利要求53所述的重组核酸构建体，其中所述遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。
55.根据权利要求53和/或54所述的重组核酸构建体，其中所述遗传元件包括原核生物的复制起点或真核生物的复制起点和/或着丝粒质粒维持序列。
56.根据权利要求55所述的重组核酸构建体，其中所述真菌复制起点为酵母复制起点。
57.根据权利要求47-56中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的启动子序列。
58.根据权利要求47-57中的任一项所述的重组核酸构建体，其中编码至少一种木糖异构酶的所述至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，编码至少一种木糖醇脱氢酶的所述至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至启动子序列，并且编码至少一种木酮糖激酶的所述至少一种多核苷酸被可操作地连接至启动子序列，其中所述启动子序列在真菌宿主细胞中是功能性的。
59.根据权利要求57和/或58所述的重组核酸构建体，其中所述启动子序列为真菌启动子序列。
60.根据权利要求59所述的重组核酸构建体，其中所述真菌启动子序列为酵母启动子序列。
61.根据权利要求47-60中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的至少一种转录终止序列。
62.根据权利要求47-61中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。
63.根据权利要求47-62中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽；和包含与SEQ IDNO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
64.根据权利要求47-63中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
65.根据权利要求47-64中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述至少一种多核苷酸序列编码至少一种木糖异构酶、至少一种木糖醇脱氢酶、和至少一种木酮糖激酶，其中所述多核苷酸含有选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21和23；SEQ ID NO:3；以及SEQ ID NO:5的至少一种序列。
66.根据权利要求47-65中的任一项所述的重组核酸构建体，所述重组核酸构建体还包含编码至少一种木糖还原酶的多核苷酸序列。
67.一种重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列。
68.根据权利要求67所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶为真核生物的或原核生物的酶。
69.根据权利要求67和/或68所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶为真核生物的酶。
70.根据权利要求67-69中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述木糖异构酶为真菌酶。
71.根据权利要求67-70中的任一种所述的重组核酸构建体，所述重组核酸构建体还包含促进稳定的整合入真菌宿主基因组中的至少一种遗传元件。
72.根据权利要求71所述的重组核酸构建体，其中所述遗传元件促进通过同源重组整合入真菌宿主基因组中。
73.根据权利要求71和/或72所述的重组核酸构建体，其中所述遗传元件包括真菌复制起点。
74.根据权利要求73所述的重组核酸构建体，其中所述真菌复制起点为酵母复制起点。
75.根据权利要求67-74中的任一项所述的重组核酸构建体，其中编码至少一种木糖异构酶的所述至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌宿主细胞中为功能性的启动子序列。
76.根据权利要求75所述的重组核酸构建体，其中所述启动子序列为真菌启动子序列。
77.根据权利要求76所述的重组核酸构建体，其中所述真菌启动子序列为酵母启动子序列。
78.根据权利要求67-77中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述至少一种多核苷酸序列被可操作地连接至在真菌细胞中为功能性的至少一种转录终止序列。
79.根据权利要求67-78中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述多核苷酸序列包含为了在酵母细胞中表达而优化的密码子。
80.根据权利要求67-79中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
81.根据权利要求67-80中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码至少一种木糖异构酶的至少一种多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列选自：(a)编码包含与SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(b)在严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22和/或24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸。
82.根据权利要求67-81中的任一项所述的重组核酸构建体，其中所述至少一种多核苷酸序列编码至少一种木糖异构酶，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19、21和23的至少一种序列。
83.一种分离的多肽序列，所述分离的多肽序列包含木糖异构酶多肽、木糖醇脱氢酶多肽、和木酮糖激酶多肽。
84.根据权利要求83所述的分离的多肽序列，其中所述木糖异构酶多肽含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多肽含有与SEQ ID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多肽含有与SEQ ID NO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。
85.根据权利要求83和/或84所述的分离的多肽序列，其中所述木糖异构酶多肽含有与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多肽含有与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多肽含有与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列。
86.根据权利要求83-85中的任一项所述的分离的多肽序列，其中所述木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、12、3、15、17、19、21、和/或23具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多肽含有与SEQ ID NO:5具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。
87.根据权利要求83-86中的任一项所述的分离的多肽序列，其中所述木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多肽含有与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。
88.根据权利要求83-87中的任一项所述的分离的多肽序列，其中所述木糖异构酶多肽由选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21和/或23的多核苷酸序列编码；所述木糖醇脱氢酶多肽由SEQ ID NO:3编码；并且所述木酮糖激酶由SEQ ID NO:5编码。
89.一种分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列包含木糖异构酶多核苷酸、木糖醇脱氢酶多肽、和木酮糖激酶多肽。
90.根据权利要求89所述的分离的多核苷酸序列，其中所述木糖异构酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:1、7、9、12、3、15、17、19、21、和/或23具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；所述木糖醇脱氢酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性；并且所述木酮糖激酶多核苷酸序列与SEQ ID NO:5具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的同一性。
91.根据权利要求89和/或90所述的分离的多核苷酸序列，其中所述木糖异构酶多肽含有由与SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多肽含有由与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多肽含有与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。
92.根据权利要求89-91中的任一项所述的分离的多核苷酸序列，其中所述木糖异构酶多核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、和/或23；所述木糖醇脱氢酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:3；并且所述木酮糖激酶多核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
93.根据权利要求89-92中的任一项所述的分离的多核苷酸序列，其中所述木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQID NO:4具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多核苷酸序列编码与SEQ IDNO:6具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％同一性的氨基酸序列。
94.根据权利要求89-93中的任一项所述的分离的多核苷酸序列，其中所述木糖异构酶多核苷酸序列编码与SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22和/或24具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多核苷酸编码与SEQ ID NO:6具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％同一性的氨基酸序列。
95.根据权利要求89-94中的任一项所述的分离的多核苷酸序列，其中所述木糖异构酶多核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、和/或24的氨基酸序列；所述木糖醇脱氢酶多核苷酸序列编码在SEQ ID NO:4中展示的氨基酸序列；并且所述木酮糖激酶多核苷酸序列编码在SEQ ID NO:6中展示的氨基酸序列。
96.一种用于生成发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)提供权利要求1至46中的任一项所述的重组真菌宿主细胞；
(b)提供发酵培养基；以及
(c)在适于生成所述发酵产物的条件下使所述发酵培养基与所述重组真菌宿主细胞接触。
97.根据权利要求96所述的方法，所述方法还包括(d)回收所述发酵产物。
98.根据权利要求96和/或97所述的方法，其中所述发酵步骤在选自厌氧条件、微好氧条件或好氧条件的条件下进行。
99.根据权利要求96-98中的任一项所述的方法，其中所述发酵产物选自醇、脂肪醇、脂肪酸、乳酸、乙酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油和β-内酰胺。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述发酵产物为选自乙醇和丁醇的醇。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述发酵产物为乙醇。
102.根据权利要求96-101中的任一项所述的方法，其中所述发酵培养基包含来自糖化过程的产物。
103.根据权利要求96-102中的任一项所述的方法，其中所述发酵培养基包含半纤维素原料。
104.一种从至少一种纤维素底物生成至少一种终产物的方法，所述方法包括：a)提供至少一种纤维素底物和包括至少一种纤维素酶的至少一种酶组合物；b)在可发酵的糖藉以在糖化反应中从纤维素底物生成的条件下，使所述纤维素底物与所述酶组合物接触；以及c)在发酵条件下使所述可发酵的糖与微生物接触，以使得生成至少一种终产物。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述方法包括同步的糖化反应和发酵反应(SSF)。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述纤维素底物的糖化和所述发酵在独立的反应中(SHF)。
107.根据权利要求104和/或105所述的方法，其中所述酶组合物与所述糖化反应和所述发酵同时地生成。
108.根据权利要求104-107中的任一项所述的方法，所述方法还在所述糖化反应中包含至少一种添加剂成分。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述添加剂成分选自至少一种二价金属阳离子、铜、没食子酸、和/或至少一种表面活性剂。
110.根据权利要求96至109中的任一项所述的方法，其中所述方法在约pH 5.0下进行。
111.根据权利要求96至109中的任一项所述的方法，其中所述方法在约pH 6.0下进行。
112.根据权利要求96至111中的任一项所述的方法，所述方法还包括回收至少一种终产物。
113.根据权利要求96至112中的任一项所述的方法，其中所述终产物包括至少一种发酵终产物。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述发酵终产物选自醇、脂肪酸、乳酸、乙酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、脂肪醇、丁二烯、和β-内酰胺。
115.根据权利要求113和/或114所述的方法，其中所述发酵终产物为选自乙醇和丁醇的至少一种醇。
116.根据权利要求114和/或115所述的方法，其中所述醇为乙醇。
117.根据权利要求96至116中的任一项所述的方法，其中所述微生物为酵母。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述酵母为酵母菌属(Saccharomyces)。
119.根据权利要求96至118中的任一项所述的方法，所述方法还包括回收至少一种发酵终产物。
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