CN102307987A - 木糖异构酶基因及其在戊糖发酵中的用途 - Google Patents

木糖异构酶基因及其在戊糖发酵中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有将木糖直接异构化为木酮糖的能力的真核细胞。所述细胞通过转化了编码木糖异构酶的核苷酸序列而获得这个能力，所述木糖异构酶具有异构酶典型的一或多个特异性序列元件，具有在酵母中功能性表达的能力，例如可得自梭菌(Clostridium)和梭杆菌(Fusobacterium)属细菌或者玻璃海鞘(Ciona)属的被囊动物(tunicate)的木糖异构酶。所述细胞优选是酵母或者丝状真菌，更优选是能厌氧成醇发酵的酵母。可进一步包含一或多种遗传修饰，其增加戊糖磷酸途径的通量、降低非特异性醛糖还原酶活性、赋予细胞增加特异性木酮糖激酶活性的能力、将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸酯、增加木糖和阿拉伯糖至少之一向宿主细胞中转运、降低分解代谢产物阻抑的敏感性、增加乙醇、摩尔渗透压浓度或者有机酸耐受性；和/或降低副产物的产生。所述细胞优选是具有产生发酵产物的能力的细胞，所述发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素以及头孢菌素类。本发明进一步涉及生产这些发酵产物的方法，其中本发明的细胞用于将木糖发酵成为所述发酵产物。

Description

木糖异构酶基因及其在戊糖发酵中的用途
发明领域
本发明涉及编码木糖异构酶的核酸序列在转化真核微生物宿主细胞用以赋予该宿主细胞将木糖异构化为木酮糖的能力中的用途。经转化的宿主细胞被用于通过含戊糖培养基的发酵来产生乙醇及其它发酵产物的方法。 
发明背景
经济上可行地从植物生物质的半纤维素部分中生产乙醇需要以相对等的速率并且以高产量同时转化戊糖和己糖。酵母，特别是糖酵母(Saccharomyces spp.)，对于这种方法是最合适的候选，因为其可以在己糖上在需氧和厌氧条件下均快速生长。此外，其对于木质纤维素水解产物的毒性环境比(遗传修饰的)细菌更具抗性。 
尽管野生型啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株可缓慢地代谢戊糖木酮糖，但是其不能代谢木糖。在二十世纪八十年代，已有建议用于木糖利用的酵母代谢工程应当基于木糖异构酶(XI，EC 5.3.1.5)的引入，而不是表达异源木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以将木糖转化为木酮糖。遗憾地是，在啤酒糖酵母中引入细菌木糖异构酶的所有尝试除了值得注意的嗜热栖热菌(T.thermophilus)异构酶之外均未能产生功能性表达的木糖异构酶。这种酶在啤酒糖酵母中功能性表达，但是在生长许可温度仅观测到非常低的活性。当厌氧真菌Piromyces Sp.E2中新发现的木糖异构酶被引入啤酒糖酵母中时，这种情况发生了彻底的改变，并且观测到高水平的酶活性使得这个菌株能够厌氧生长并从木糖产生乙醇(WO 03/062340和WO 06/009434)。此种酵母株首次提供了能与商业规模的乙醇生产相容的木糖消耗和乙醇形成的比速率。 
自从发现了Piromyces木糖异构酶在酵母中的功能性表达，出现了其它木糖异构酶在酵母中功能性表达的若干报道，所有这些均与Piromyces酶具有70％以上的氨基酸序列相同性，例如来自拟杆菌(Bacteroides)(WO 04/099381，WO 06/009434，WO 09/109633)的细菌木糖异构酶，以及来自 Cyllamyces(WO 04/099381)和Orpinomyces(Madhavan et al.，2008，DOI 10.1007/s00253-008-1794-6)的真菌木糖异构酶。 
然而，在2008年12月24日之前，对于与Piromyces酶具有低于70％氨基酸序列相同性的木糖异构酶在酵母中功能性表达没有报道。最近，在2009年2月，Brat等(2009，Appl.Environ.Microbiol.75：2304-2311)公开了来自厌氧菌Clostridium phytofermentans的木糖异构酶在酵母啤酒糖酵母中的功能性表达，其与Piromyces酶的氨基酸序列仅具有52％的相同性。 
迄今为止，450余种木糖异构酶序列可公开得自Genbank及其它序列数据库，包括Piromyces、Cyllamyces aberensis、小立碗藓(Physcomitrella patens)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、难辨梭菌(Clostridium difficile)、海栖热袍菌(Thermatoga maritime)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、Burkholderia phytofirmans、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)及死亡梭杆菌(Fusobacterium_mortiferum)的木糖异构酶序列。 
然而，本领域仍需要编码其它木糖异构酶的核苷酸序列，其可被用于转化宿主细胞如啤酒糖酵母以赋予它们将木糖异构化为木酮糖的能力，从而使得如此转化的宿主细胞能被用于通过含戊糖原料的发酵而生产乙醇或者其它发酵产物的方法。 
发明描述
定义
酶“木糖异构酶”(EC 5.3.1.5)在本文被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖以及反之的酶。所述酶也被称作D-木糖酮异构酶(ketoisomerase)。一些木糖异构酶也能催化D-葡萄糖与D-果糖之间的转化，因此有时也被称作葡萄糖异构酶。木糖异构酶需要镁作为辅因子。本发明的木糖异构酶可以由其氨基酸序列来进一步定义，如下文所述。类似地，木糖异构酶可以由编码该酶的核苷酸序列以及由与编码木糖异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义，如下文所述。木糖异构酶活性的单位(U)在本文被定义为在含有50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、10mM木糖和10mM MgCl2的反应混合物中于37℃每分钟产生1nmol木酮糖的酶的量。所形成的木酮糖通过Dische和Borenfreund(1951，J.Biol.Chem.192： 583-587)所述方法或者通过实施例中所述HPLC来确定。 
序列相同性在本文被定义为通过对比序列所确定的两个或更多个氨基酸序列(多肽或蛋白)或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”也是指氨基酸或者核酸序列之间序列相关性的程度，该情况可以通过此种序列串的匹配来确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与另一多肽的序列对比而确定的。“相同性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算。术语“序列相同性”或者“序列相似性”是指，当最佳比对时，优选针对(至少对比中的最短序列的)全长并最大化匹配数及最小化空位(gap)数(如通过程序ClustalW(1.83)、GAP或者BESTFIT以默认参数进行)，则两个(多)肽或者两个核苷酸序列呈现出至少一定百分比的序列相同性(如本文别处所定义的)。GAP使用Needleman和Wunsch整体比对算法以在全长上比对两个序列，使匹配数最大化及使空位数最小化。通常，使用GAP默认参数，空位生成罚分(gap creation penalty)＝50(核苷酸)/8(蛋白质)以及空位延伸罚分(gap extension penalty)＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所使用的默认得分矩阵(default scoring matrix)是nwsgapdna，而对于蛋白质，默认得分矩阵是Blosum62(Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。用于比对本发明蛋白质序列的优选多重比对程序是ClustalW(1.83)，其使用blosum矩阵(blosum matrix)及默认设置(空位开放罚分：10；空位延伸罚分：0.05)。应清楚的是当RNA序列被称作与DNA序列基本相似或者其与DNA序列具有一定程度序列相同性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。百分比序列相同性的序列比对和得分可以使用计算机程序来确定，如可得自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752 USA的GCG Wisconsin软件包，版本10.3，或者用于Windows的开源软件Emboss(当前版本为2.7.1-07)。或者，百分比相似性或百分比相同性可以通过针对数据库如FASTA、BLAST等的检索来确定。 
确定相同性的优选方法，被设计为给出所测序列之间最大匹配。确定相同性和相似性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。确定两个序列之间的相同性和相似性的优选的计算机程序包括例如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol. 215：403-410(1990)。BLAST X程序可公开得自NCBI及其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可以用于确定相同性。 
用于多肽序列对比的优选参数包括如下：算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)；对比矩阵：得自Hentikoff and Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)的BLOSSUM62；空位罚分：12；以及空位长度罚分：4。这些参数可用的程序是可公开获得的“Ogap”程序，得自位于美国威斯康星州麦迪逊市的Genetics Computer Group。前述参数是用于氨基酸对比的默认参数(对于末端空位无罚分)。 
用于核酸对比的优选参数包括如下：算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)；对比矩阵：匹配＝+10，错配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3。可用的是上述得自位于美国威斯康星州麦迪逊市的Genetics Computer Group的Gap程序。上面给出的是用于核酸对比的默认参数。 
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员也可虑及所谓的“保守”氨基酸取代，这是技术人员清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是所公开的序列中至少一个残基已被除去并在其位置插入了不同的残基。优选所述氨基酸改变是保守的。对于每个天然产生的氨基酸的优选保守取代如下：Ala至ser，Arg至lys，Asn至gln或his，Asp至glu，Cys至ser或ala，Gln至asn，Glu至asp，Gly至pro，His至asn或gln，Ile至leu或val，Leu至ile或val，Lys至arg，gln或glu，Met至leu或ile，Phe至met、leu或tyr，Ser至thr，Thr至ser，Trp至tyr，Tyr至trp或phe，以及Val至ile或leu。 
编码本发明木糖异构酶的核苷酸序列也可以通过其在中等或者优选在严格杂交条件下分别与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交的能力来进行定义。严格杂交条件在本文定义为这样的条件，即该条件使得至少大约25个、优选大约50个核苷酸、75或者100及最优选大约200或更多个核苷酸的核酸序列于大约65℃温度、在包含约1M盐、优选6×SSC的溶液或者具有相应离子浓度的任何其它溶液中杂交，并于65℃在包含约0.1M或更低浓度的盐、优选0.2×SSC的溶液或者具有相应离子浓度的任何其它溶液中洗涤。优选所述杂交过夜进行，即至少10小时，并且优选洗涤进行至少1小时且更换至少两次洗涤溶液。这些条件通常允许具有大约90％或者更高序列相同性的序列特异性杂交。 
中等条件在本文定义为这样的条件，即该条件使得至少50个核苷酸、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列于大约45℃温度、在包含约1M盐、优选6×SSC的溶液或者具有相应离子浓度的任何其它溶液中杂交，并于室温在包含约1M的盐、优选6×SSC的溶液或者具有相应离子浓度的任何其它溶液中洗涤。优选所述杂交过夜进行，即至少10小时，并且优选洗涤进行至少1小时且更换至少两次洗涤溶液。这些条件通常允许具有高至50％序列相同性的序列特异性杂交。本领域技术人员能修改这些杂交条件，以特异性地鉴别出相同性在50％-90％之间变化的序列。 
“核酸构建体”或者“核酸载体”在本文被理解为是指使用重组DNA技术所获得的人工核酸分子。术语“核酸构建体”因此不包括天然发生的核酸分子，尽管核酸构建体可以包含(部分的)天然发生的核酸分子。术语“表达载体”或者“表达构建体”是指能影响基因在与这种序列相容的宿主细胞或者宿主生物体中表达的核苷酸序列。这些表达载体通常包括至少合适的转录调节序列，及任选存在的3’转录终止信号。也可存在实现表达所必需的或者有帮助的另外的因子，如表达增强子元件。所述表达载体将被引入到合适的宿主细胞中，并能实现编码序列在该宿主细胞的体外细胞培养物中的表达。所述表达载体将适于在本发明的宿主细胞或者生物体中复制。 
如本文所用，术语“启动子”或者“转录调节序列”是指发挥功能以控制一或多个编码序列转录的核酸片段，并且其位于所述编码序列转录起始位点的转录方向的上游，并且通过DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、 转录起始位点及任何其它DNA序列的存在而在结构上加以鉴别，所述其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑物和激活物蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知直接或者间接地调节来自该启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“可诱导的”启动子是例如通过应用化学诱导剂而进行生理或者发育调节的启动子。 
术语“选择性标记”是本领域技术人员熟知的术语，并在本文用于描述当表达时可被用于挑选含有该选择性标记的细胞的任何遗传实体。术语“报道子”与标记可互换使用，尽管其主要用来指可见的标记，如绿色荧光蛋白(GFP)。选择性标记可以是显性或隐性的或者是双向性的。 
如本文所用，术语“可操纵地连接”是指多核苷酸元件以功能关系的连接。当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系内时，其是“可操纵地连接”的。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则其与所述编码序列是可操纵地连接的。可操纵地连接是指所连接的DNA序列通常是邻接的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时其是邻接的且符合读框的。 
术语“蛋白质”或者“多肽”可互换使用，是指由氨基酸链组成的分子，不考虑特定作用模式、大小、三维结构或者来源。 
“真菌”在本文是指异养真核微生物，其在外部消化其食物，吸收营养分子进入其细胞中。真菌是真核生物的一个单独的界，并且包括酵母、霉菌和蘑菇。本文所用的术语真菌因而清楚地包括酵母以及丝状真菌。 
术语“基因”是指包含一个区域(转录区域)的DNA片段，其在细胞中被转录为RNA分子(例如mRNA)，与合适的调节区(例如启动子)可操纵地连接。基因通常包含若干可操纵地连接的片段，如启动子、5’前导序列、编码区以及包含聚腺苷酸化位点的3’非翻译序列(3’末端)。“基因的表达”是指这样的过程，其中与合适的调节区、特别是启动子可操纵地连接的DNA区被转录成RNA，其是有生物学活性的，即其能被翻译成具有生物学活性的蛋白质或者肽。 
术语“同源”当用于表明给定的(重组)核酸或者多肽分子与给定的宿主生物体或者宿主细胞之间的关系时，被理解为是指在自然中所述核酸或者多肽分子由相同物种、优选相同品种或者株系的宿主细胞或者生物体所产生的。如果与宿主细胞同源，则编码多肽的核酸序列与在其天然环境中相 比通常(但不是必须)与另一(异源)启动子序列可操纵地连接，且如果合适，可以与另一(异源)分泌信号序列和/或终止子序列可操纵地连接。应理解调节序列、信号序列、终止子序列等也可以与该宿主细胞同源。在这种背景下，仅使用“同源”的序列元件使得可以构建“自身克隆的”经遗传修饰的生物体(GMO’s)(自身克隆在本文中如European Directive 98/81/EC Annex II中所定义)。当用于表明两个核酸序列的相关性时，术语“同源”是指一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交的程度可依赖于数个因素包括序列之间相同性的量以及杂交条件如后文所述的温度和盐浓度等。 
术语“异源”当用于核酸(DNA或者RNA)或者蛋白质时，是指这样的核酸或者蛋白质，其不是作为其存在于之中的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的一部分而天然发生，或者其被发现存在于与其天然存在所不同的细胞、或者位置、或者基因组或DNA或RNA序列的位置。异源核酸或者蛋白质对于其所被引入其中的细胞而言不是内源的，而是得自另外的细胞或者经合成或者重组而产生。通常非必须地，这种核酸编码的蛋白质不是由所述DNA在其中转录或表达的细胞所正常产生的。相似地，外源RNA编码的蛋白质在该外源RNA所存在的细胞中不是正常表达的。异源核酸和蛋白质也可以是指外源核酸或者蛋白质。本领域技术人员认为对于表达其的细胞而言是异源或者外源的任何核酸或者蛋白质均涵盖在本文术语异源核酸或者蛋白质的含义内。术语异源也适用于描述核酸或者氨基酸序列的非天然组合，即其中至少两个所组合的序列彼此是外源的组合。 
发明详述
迄今为止，450余种木糖异构酶氨基酸序列可公开得自Genbank或者其它序列数据库。其中已知一些木糖异构酶氨基酸序列具有在酵母中功能性表达的能力，包括例如来自厌氧真菌如Piromyces、Cyllamyces和Orpinomyces的木糖异构酶，以及来自拟杆菌的细菌木糖异构酶，所有这些均呈现出与Piromyces酶具有70％以上的氨基酸序列相同性。本发明人现在令人惊奇地发现与Piromyces酶不相关的木糖异构酶的氨基酸序列，即其与Piromyces酶的氨基酸序列具有低于70％的氨基酸序列相同性，但是其仍然具有在酵母中功能性(即活性)表达的能力。此外，本发明人鉴别出了具 有在酵母中功能性表达能力的所有木糖异构酶中所共有的数个氨基酸序列元件。木糖异构酶在酵母中的功能性表达在本文中被理解为是指，在啤酒糖酵母中木糖异构酶经密码子优化的编码序列在基于2μ-的质粒上从糖分解启动子表达，其使得该酵母以木糖作为唯一碳源可检测地生长，优选在厌氧条件下生长且消耗木糖产生乙醇，更优选在生长速率、生物质和乙醇产量中至少一项是在用密码子优化的Piromyces木糖异构酶编码序列在其它相同条件下所获得的结果的至少10％、20％、50％或者80％。优选的功能性表达是这样的表达，其使得酵母以木糖作为唯一碳源在低于35、33、30或28℃的温度及在高于20、22或25℃的温度下可检测地生长。 
在第一方面，本发明涉及转化的宿主细胞，其具有将木糖异构化为木酮糖的能力。所述将木糖异构化为木酮糖的能力是通过用包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建体转化该宿主细胞而被赋予的。所述转化的宿主细胞将木糖异构化为木酮糖的能力应理解为是指木糖在由木糖异构酶催化的一个单一反应中直接异构化为木酮糖，这与通过木糖还原酶和木糖醇脱氢酶分别催化的经木糖醇中间产物而使木糖转化为木酮糖的两步转化法不同。 
在一个实施方案中，所述编码木糖异构酶的核苷酸序列选自由如下组成的组： 
(a)编码具有木糖异构酶活性多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.1(难辨梭菌)的氨基酸序列具有至少45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98或者99％的序列相同性的氨基酸序列； 
(b)编码具有木糖异构酶活性多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.2(玻璃海鞘Ciona)的氨基酸序列具有至少45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98或者99％的序列相同性的氨基酸序列； 
(c)编码具有木糖异构酶活性多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.35(死亡梭杆菌F.mortiferum)的氨基酸序列具有至少45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98或者99％的序列相同性的氨基酸序列； 
(d)其互补链与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；以及 
(e)其序列由于遗传密码的简并性而与(d)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。 
在一个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码包含一或多个氨基酸序列元件的氨基酸序列，所述氨基酸序列元件是具有在酵母中功能性表达能力的木糖异构酶中所共有的。在这个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码包含一或多个氨基酸序列元件的氨基酸序列，所述氨基酸序列元件选自由如下组成的组： 
(a)在第91位的甲硫氨酸残基； 
(b)在第134-139位的氨基酸序列TGIKLL； 
(c)在第230位的苯丙氨酸残基； 
(d)分别在第264和265位的氨基酸苯丙氨酸和赖氨酸； 
(e)在第274-278位的氨基酸序列TLAGH； 
(f)在第387-391位的氨基酸序列RYASF； 
(g)在第394位的甘氨酸残基；以及 
(h)在第431位的丙氨酸残基。 
在这个实施方案中，所编码的木糖异构酶可以任何可能的组合包含至少1、2、3、4、5、6、7或者所有8个元件(a)-(h)。因此，在这个实施方案中，所编码的木糖异构酶可包含如下元件或者元件组合：(a)；(b)；(c)；(d)；(e)；(f)；(g)；(h)；(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(a)和(f)；(a)和(g)；(a)和(h)；(b)和(c)；(b)和(d)；(b)和(e)；(b)和(f)；(b)和(g)；(b)和(h)；(c)和(d)；(c)和(e)；(c)和(f)；(c)和(g)；(c)和(h)；(d)和(e)；(d)和(f)；(d)和(g)；(d)和(h)；(e)和(f)；(e)和(g)；(e)和(h)；(f)和(g)；(f)和(h)；(g)和(h)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(b)和(e)；(a)、(b)和(f)；(a)、(b)和(g)；(a)、(b) 和(h)；(a)、(c)和(d)；(a)、(c)和(e)；(a)、(c)和(f)；(a)、(c)和(g)；(a)、(c)和(h)；(a)、(d)和(e)；(a)、(d)和(f)；(a)、(d)和(g)；(a)、(d)和(h)；(a)、(e)和(f)；(a)、(e)和(g)；(a)、(e)和(h)；(a)、(f)和(g)；(a)、(f)和(h)；(a)、(g)和(h)；(b)、(c)和(d)；(b)、(c)和(e)；(b)、(c)和(f)；(b)、(c)和(g)；(b)、(c)和(h)；(b)、(d)和(e)；(b)、(d)和(f)；(b)、(d)和(g)；(b)、(d)和(h)；(b)、(e)和(f)；(b)、(e)和(g)；(b)、(e)和(h)；(b)、(f)和(g)；(b)、(f)和(h)；(b)、(g)和(h)；(c)、(d)和(e)；(c)、(d)和(f)；(c)、(d)和(g)；(c)、(d)和(h)；(c)、(e)和(f)；(c)、(e)和(g)；(c)、(e)和(h)；(c)、(f)和(g)；(c)、(f)和(h)；(c)、(g)和(h)；(d)、(e)和(f)；(d)、(e)和(g)；(d)、(e)和(h)；(d)、(f)和(g)；(d)、(f)和(h)；(d)、(g)和(h)；(e)、(f)和(g)；(e)、(f)和(h)；(e)、(g)和(h)；(f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(c)和(f)；(a)、(b)、(c)和(g)；(a)、(b)、(c)和(h)；(a)、(b)、(d)和(e)；(a)、(b)、(d)和(f)；(a)、(b)、(d)和(g)；(a)、(b)、(d)和(h)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)和(h)；(a)、(b)、(f)和(g)；(a)、(b)、(f)和(h)；(a)、(b)、(g)和(h)；(a)、(c)、(d)和(e)；(a)、(c)、(d)和(f)；(a)、(c)、(d)和(g)；(a)、(c)、(d)和(h)；(a)、(c)、(e)和(f)；(a)、(c)、(e)和(g)；(a)、(c)、(e)和(h)；(a)、(c)、(f)和(g)；(a)、(c)、(f)和(h)；(a)、(c)、(g)和(h)；(a)、(d)、(e)和(f)；(a)、(d)、(e)和(g)；(a)、(d)、(e)和(h)；(a)、(d)、(f)和(g)；(a)、(d)、(f)和(h)；(a)、(d)、(g)和(h)；(a)、(e)、(f)和(g)；(a)、(e)、(f)和(h)；(a)、(e)、(g)和(h)；(a)、(f)、(g)和(h)；(b)、(c)、(d)和(e)；(b)、(c)、(d)和(f)；(b)、(c)、(d)和(g)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(c)、(e)和(f)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(c)、(e)和(h)；(b)、(c)、(f)和(g)；(b)、(c)、(f)和(h)；(b)、(c)、(g)和(h)；(b)、(d)、(e)和(f)；(b)、(d)、(e)和(g)；(b)、(d)、(e)和(h)；(b)、(d)、(f)和(g)；(b)、(d)、(f)和(h)；(b)、(d)、(g)和(h)；(b)、(e)、(f)和(g)；(b)、(e)、(f)和(h)；(b)、(e)、(g)和(h)；(b)、(f)、(g)和(h)；(c)、(d)、(e)和(f)；(c)、(d)、(e)和(g)；(c)、(d)、(e)和(h)；(c)、(d)、(f)和(g)；(c)、(d)、(f)和(h)；(c)、(d)、(g)和(h)；(c)、(e)、(f)和(g)；(c)、(e)、(f)和(h)；(c)、(e)、(g)和(h)；(c)、(f)、(g)和(h)；(d)、(e)、(f)和(g)；(d)、(e)、(f)和(h)；(d)、(e)、(g)和(h)；(d)、(f)、(g)和(h)；(e)、 (f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)和(e)；(a)、(b)、(c)、(d)和(f)；(a)、(b)、(c)、(d)和(g)；(a)、(b)、(c)、(d)和(h)；(a)、(b)、(c)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)、(e)和(g)；(a)、(b)、(c)、(e)和(h)；(a)、(b)、(c)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)、(f)和(h)；(a)、(b)、(c)、(g)和(h)；(a)、(b)、(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(d)、(e)和(g)；(a)、(b)、(d)、(e)和(h)；(a)、(b)、(d)、(f)和(g)；(a)、(b)、(d)、(f)和(h)；(a)、(b)、(d)、(g)和(h)；(a)、(b)、(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)和(h)；(a)、(b)、(e)、(g)和(h)；(a)、(b)、(f)、(g)和(h)；(a)、(c)、(d)、(e)和(f)；(a)、(c)、(d)、(e)和(g)；(a)、(c)、(d)、(e)和(h)；(a)、(c)、(d)、(f)和(g)；(a)、(c)、(d)、(f)和(h)；(a)、(c)、(d)、(g)和(h)；(a)、(c)、(e)、(f)和(g)；(a)、(c)、(e)、(f)和(h)；(a)、(c)、(e)、(g)和(h)；(a)、(c)、(f)、(g)和(h)；(a)、(d)、(e)、(f)和(g)；(a)、(d)、(e)、(f)和(h)；(a)、(d)、(e)、(g)和(h)；(a)、(d)、(f)、(g)和(h)；(a)、(e)、(f)、(g)和(h)；(b)、(c)、(d)、(e)和(f)；(b)、(c)、(d)、(e)和(g)；(b)、(c)、(d)、(e)和(h)；(b)、(c)、(d)、(f)和(g)；(b)、(c)、(d)、(f)和(h)；(b)、(c)、(d)、(g)和(h)；(b)、(c)、(e)、(f)和(g)；(b)、(c)、(e)、(f)和(h)；(b)、(c)、(e)、(g)和(h)；(b)、(c)、(f)、(g)和(h)；(b)、(d)、(e)、(f)和(g)；(b)、(d)、(e)、(f)和(h)；(b)、(d)、(e)、(g)和(h)；(b)、(d)、(f)、(g)和(h)；(b)、(e)、(f)、(g)和(h)；(c)、(d)、(e)、(f)和(g)；(c)、(d)、(e)、(f)和(h)；(c)、(d)、(e)、(g)和(h)；(c)、(d)、(f)、(g)和(h)；(c)、(e)、(f)、(g)和(h)；(d)、(e)、(f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(g)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)、(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)、(e)、(f)和(h)；(a)、(b)、(c)、(e)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)、(f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(d)、(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(d)、(e)、(f)和(h)；(a)、(b)、(d)、(e)、(g)和(h)；(a)、(b)、(d)、(f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)和(h)；(a)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)；(a)、(c)、(d)、(e)、(f)和(h)；(a)、(c)、(d)、(e)、(g)和(h)；(a)、(c)、(d)、(f)、(g)和(h)；(a)、(c)、(e)、(f)、(g)和(h)；(a)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)；(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)；(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(h)；(b)、(c)、(d)、(e)、(g)和(h)；(b)、(c)、(d)、(f)、(g)和(h)；(b)、(c)、(e)、(f)、(g)和(h)；(b)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)；(c)、(d)、(e)、(f)、(g) 和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)、(d)、(f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)和(h)；(a)、(b)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)；(a)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)；和最后的、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)。此外，在相应于(b)、(d)、(e)和(f)中氨基酸序列的那些位置的氨基酸序列可以优选与(b)、(d)、(e)和(f)的氨基酸序列有不超过1、2或3个氨基酸的差异。优选地，元件(b)至少在第136位由I组成，元件(d)至少在第264位由F组成，元件(f)至少在第391位由F或Y组成。在一个优选的实施方案中，所编码的木糖异构酶包含元件(a)、(f)、(g)和(h)中的至少一个元件。更优选地，所编码的木糖异构酶另外包含元件(b)和(c)中至少一个元件，以及最优选地，所编码的木糖异构酶另外包含元件(d)和(e)中至少一个元件。在一个优选的实施方案中，所编码的木糖异构酶至少包含元件(a)，更优选所述异构酶另外至少包含元件(b)、(c)和/或(g)，更优选所述异构酶另外至少包含元件(d)、(f)和/或(h)，最优选所述异构酶另外包含元件(e)。 
上述序列元件(a)-(h)的氨基酸位置是指参照SEQ ID NO：3的Piromyces木糖异构酶的氨基酸序列的位置。在本发明中SEQ ID NO：3之外的氨基酸序列中，优选序列元件(a)-(h)的氨基酸位置出现在相应于SEQ ID NO：3中序列元件(a)-(h)的位置的氨基酸位置，优选在使用默认设置的ClustalW(1.83)序列比对中。技术人员知道怎样使用上述氨基酸序列比对算法来鉴别SEQ ID NO：3之外的木糖异构酶氨基酸序列中的相应氨基酸位置。这种比对的例子在表4中示出，其显示出来自左侧所标示的生物体的木糖异构酶氨基酸序列的Clustal W(1.83)多重序列比对。表4中Piromyces序列(SEQ ID NO：3)中有阴影的氨基酸标示的是具有在酵母中功能性表达能力的木糖异构酶所共有的氨基酸。 
在一个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码不是SEQ ID NO：3-7之一或多个的氨基酸序列。优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列不具有与选自SEQ ID NO：3-7的至少一个氨基酸序列有超过(或者具有与选自SEQ ID NO：3-7的至少一个氨基酸序列有低于)99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或者70％的序列相同性的氨基酸序列。 
在一个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码不是SEQ ID  NO：35之一或多个的氨基酸序列。优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列不具有与选自SEQ ID NO：35的至少一个氨基酸序列有超过(或者具有与选自SEQ ID NO：35的至少一个氨基酸序列有低于)99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或者70％以上序列相同性的氨基酸序列。 
在一个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码不是选自如下氨基酸序列的氨基酸序列： 
(a)WO 03/062340所公开的Piromyces木糖异构酶； 
(b)WO 04/099381和WO 06/009434所公开的多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)木糖异构酶； 
(c)WO 04/099381所公开的Cyllamyces木糖异构酶；以及 
(d)Madhavan et al.(2008，上述)所公开的Orpinomyces木糖异构酶。 
优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列不具有与选自由如下组成的组的至少一个氨基酸序列有超过(或者具有与选自如下的至少一个氨基酸序列有低于)99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或者70％的序列相同性的氨基酸序列： 
(a)WO 03/062340所公开的Piromyces木糖异构酶； 
(b)WO 04/099381和WO 06/009434所公开的多形拟杆菌木糖异构酶； 
(c)WO 04/099381所公开的Cyllamyces木糖异构酶；以及 
(d)Madhavan et al.(2008，上述)所公开的Orpinomyces木糖异构酶。 
在一个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码不是来自厌氧真菌Neocallimastigaceae科的木糖异构酶氨基酸的氨基酸序列，如选自Anaeromyces、Caecomyces、Cyllamyces、Neocallimastix、Orpinomyces、Piromyces和Ruminomyces属的真菌。 
在一个实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列编码不是来自拟杆菌或副拟杆菌(Parabacteroides)属细菌的木糖异构酶的氨基酸的氨基酸序列。 
本发明的核苷酸序列编码新类别的木糖异构酶，其在本发明下文所述 的真核宿主细胞中被功能性表达。本发明的核苷酸序列优选编码在某些真菌、细菌和被囊动物(tunicate)中天然发生的木糖异构酶。 
本发明优选的核苷酸序列因此编码这样的木糖异构酶，其具有与可得自(或者天然发生于)梭菌(Clostridiaceae)科细菌、优选梭菌(Clostridium)属细菌、最优选难辨梭菌的木糖异构酶相同的氨基酸序列。 
本发明优选的核苷酸序列因此编码这样的木糖异构酶，其具有与可得自(或者天然发生于)梭杆菌(Fusobacteriaceae)科细菌、优选梭杆菌(Fusobacterium)属细菌、最优选死亡梭杆菌的木糖异构酶相同的氨基酸序列。 
本发明优选的核苷酸序列因此编码这样的木糖异构酶，其具有与可得自(或者天然发生于)被囊动物、优选玻璃海鞘(Cionidae)科的被囊动物、更优选玻璃海鞘(Ciona)属的被囊动物、最优选玻璃海鞘(C.intestinales)的木糖异构酶相同的氨基酸序列。 
在另一实施方案中，编码木糖异构酶的核苷酸序列选自由以下组成的组： 
(a)编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.8、9、11或者13中至少之一的氨基酸序列具有至少45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98或者99％的序列相同性的氨基酸序列； 
(b)其互补链与(a)或(b)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；以及 
(c)其序列由于遗传密码的简并性而与(d)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。 
然而应理解编码任何上述木糖异构酶的改造形式的核苷酸序列以及与相应天然发生的木糖异构酶相比包含一或多个氨基酸取代、插入和/或缺失、但是在本文限定的相同性或相似性范围内的核苷酸序列均清楚地涵盖在本发明中。因此，在一个实施方案中，本发明的核苷酸序列编码这样的木糖异构酶氨基酸序列，其包含如Meaden et al.(1994，Gene，141：97-101)所定义的木糖异构酶标签序列：VXW[GP]GREG[YSTA](出现在第187-195位)和[LIVM]EPKPX[EQ]P(出现在第232-239位)，其中“X”可以是任何氨 基酸，而其中括号内的氨基酸表示其中所括起的氨基酸之一可以出现在标签序列中的该位置。本发明的木糖异构酶氨基酸序列进一步优选包含保守的氨基酸残基His-102、Asp-105和Asp-340，其组成直接参与催化的三联体，Lys-235起结构性及功能性的催化作用，以及参与镁的结合的Glu-233(Vangrysperre et al.，1990，Biochem.J.265：699-705；Henrick et al.，J.Mol.Biol.208：129-157；Bhosale et al.，1996 Microbiol.Rev.60：280-300)。上述标签序列和保守残基的氨基酸位置是指参照SEQ ID NO：3的Piromyces木糖异构酶氨基酸序列中的位置。在本发明SEQ ID NO：3之外的氨基酸序列中，优选上述标签序列和保守残基的氨基酸位置出现在相应于SEQ ID NO：3的序列中标签序列和保守残基的位置的氨基酸位置，优选是在使用默认设置的ClustalW(1.83或1.81)序列比对中。技术人员会知道怎样使用上述的氨基酸序列比对算法来鉴别SEQ ID NO：3之外的木糖异构酶氨基酸序列中的相应氨基酸位置。这种对比的一个实例在表4中描述。此外，迄今为止，本领域已知450余种木糖异构酶氨基酸序列，且不断有新成员加入。本发明的SEQ ID NO：3和木糖异构酶序列与这些已知和新的木糖异构酶氨基酸序列的序列比对将标示出进一步的保守区域和氨基酸位置，其保守性对于结构和酶活性非常重要。这些区域和位置将不接受或者仅接受保守氨基酸取代。这些区域和位置之外的氨基酸取代不太可能很明显地影响木糖异构酶活性。 
所述核苷酸序列编码优选以活性形式在经转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶。因此，所述核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生的木糖异构酶所具有的比活性是，在25℃每mg蛋白质至少10U木糖异构酶活性，优选在25℃每mg至少20、25、30、50、100、200或者300U。在经转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶的比活性在本文定义为宿主细胞的无细胞裂解物(例如酵母无细胞裂解物)的每mg蛋白质的木糖异构酶活性单位的量。木糖异构酶活性、无细胞裂解物的蛋白质和制备物的量如实施例中所述来确定。优选地，所述核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生的木糖异构酶，具有对于木糖的Km低于50、40、30或者25mM，更优选具有对于木糖的Km为大约20mM或更低。 
编码具有木糖异构酶活性的多肽的本发明的核苷酸序列，可使用本领域本身熟知的用于分离核苷酸序列的方法(见例如Sambrook and Russell (2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)，而得自属于上述门、纲或者属的真菌、酵母或者细菌的基因组和/或cDNA。本发明的核苷酸序列例如可得自这样的方法，其中a)将简并的PCR引物(如SEQ ID NO.14和15中那些)用于合适生物体(例如上述真菌、细菌或者被囊动物)的基因组和/或cDNA，以产生包含编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列的一部分的PCR片段；b)在a)中获得的PCR片段被用作探针以筛选该生物体的cDNA和/或基因组文库；以及c)产生包含编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列的cDNA或者基因组DNA。 
为了增加木糖异构酶在本发明的转化的宿主细胞中以足够水平并且以活性形式表达的可能性，优选将编码这些酶以及本发明其他酶(见下文)的核苷酸序列针对所述宿主细胞的密码子选择调适以优化其密码子选择。编码酶的核苷酸序列针对宿主细胞的密码子选择的适应性可以表示为密码子适应指数(CAI)。所述密码子适应指数在本文定义为基因的密码子选择对于在特定宿主细胞或者生物体中高度表达的基因的密码子选择的相对适应性量度。每个密码子的相对适应性(w)是对于相同氨基酸的每个密码子选择与最富集密码子选择的比值。CAI指数被定义为这些相对适应性值的几何平均值。不包括非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)。CAI值的范围从0到1，较高的值表示较高的最富集的密码子比例(见Sharp and Li，1987，Nucleic Acids Research 15：1281-1295；也见Jansen et al.，2003，Nucleic Acids Res.31(8)：2242-51)。经调适的核苷酸序列优选具有至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或者0.9的CAI。最优选的是SEQ ID NO：16、17和38中所列的序列，其已经为了在啤酒糖酵母细胞中表达而进行过密码子优化。 
用包含编码本发明木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建体转化的宿主细胞优选是真核微生物宿主，更优选是真菌宿主细胞，如酵母或者丝状真菌宿主细胞。优选所述宿主细胞是培养的细胞。本发明的宿主细胞，优选是能主动或者被动地将戊糖(木糖以及优选的阿拉伯糖)转运进细胞中的宿主。所述宿主细胞优选含有主动(active)糖酵解。所述宿主细胞可进一步优选含有内源戊糖磷酸途径，并且可含有内源木酮糖激酶活性，从而由木糖所异构化的木酮糖可以被代谢为丙酮酸盐/酯(pyruvate)。所述宿主进一步优选含有这样的酶，其用于将戊糖(优选通过丙酮酸盐/酯)转化为希望的发酵 产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素类。特别优选的宿主细胞是天然能进行醇发酵、优选厌氧醇发酵的宿主细胞。所述宿主细胞进一步优选具有对于乙醇的高耐受性，对于低pH的高耐受性(即能在低于5、4或者3的pH值生长)，和对于有机酸如乳酸、乙酸或者甲酸以及糖降解产物如糠醛和羟基-甲基糠醛的高耐受性，以及对于升高的温度的高耐受性。所述宿主细胞的任何这些特性或者活性均可以是天然存在于该宿主细胞中，或者可以通过遗传修饰引入或者修饰，优选通过自身克隆或者通过下文描述的本发明方法进行。合适的细胞是培养的细胞，可以在发酵过程中如在深层发酵或者固态发酵中培养的细胞。特别合适的细胞是真核微生物，例如真菌，而最适用于本发明的是酵母或者丝状真菌。 
酵母在本文被定义为真核的微生物，并且包括主要以单细胞形式生长真菌(Eumycotina)亚门的所有种(Yeasts：characteristics and identification，J.A.Barnett，R.W.Payne，D.Yarrow，2000，3rd ed.，Cambridge University Press，Cambridge UK；and，The yeasts，a taxonomic study，C.P.Kurtzman and J.W.Fell(eds)1998，4th ed.，Elsevier Science Publ.B.V.，Amsterdam，The Netherlands)。酵母可以通过单细胞菌体的出芽而生长，或者通过生物体的裂体生殖而生长。作为宿主细胞优选的酵母属于糖酵母、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤氏酵母(Pichia)、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)、汉逊氏酵母(Hansenula)、克勒克氏酵母(Kloeckera)、许旺氏酵母(Schwanniomyces)和耶氏酵母(Yarrowia)属。优选地，所述酵母能厌氧发酵，更优选能厌氧成醇发酵。在过去几年有很多建议引入各种生物体用于从谷物糖产生生物乙醇。然而，实际上所有主要的生物乙醇生产方法均持续使用糖酵母属的酵母作为乙醇生产者。这是由于糖酵母菌种对工业生产的许多有吸引力的特征所致，即高酸、乙醇和渗透耐受性，厌氧生长的能力，以及当然的其高成醇发酵能力。作为真菌宿主细胞的优选酵母种包括啤酒糖酵母、微小糖酵母(S.exiguus)、巴扬氏糖酵母(S.bayanus)、乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。 
丝状真菌在本文定义为真核微生物，其包括真菌亚门的所有丝状的形式。这些真菌特征在于由壳多糖、纤维素及其它复合多糖组成的营养菌丝 体。本发明的丝状真菌与酵母在形态学、生理学和遗传学方面不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延长，并且大多数丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。作为宿主细胞的优选的丝状真菌属于曲霉菌(Aspergillus)、木霉菌(Trichoderma)、腐质霉菌(Humicola)、支顶孢(Acremonium)、镰刀菌(Fusarium)和青霉菌(Penicillium)属。 
在本发明的经转化的宿主细胞中，编码上述木糖异构酶的核苷酸序列优选与启动子可操纵地连接，所述启动子引起所述核苷酸序列在细胞中充分表达，以赋予该细胞将木糖转化为木酮糖的能力。更优选所述启动子引起所述核苷酸序列充分表达，以赋予该细胞在木糖作为唯一碳源和/或能量来源、最优选在厌氧条件下生长的能力。用于表达上述核苷酸序列的合适启动子包括对于分解代谢产物(葡萄糖)阻抑不敏感和/或需要木糖以诱导的启动子。具有这些特性的启动子广泛可得并且为本领域技术人员所熟知。这种启动子的合适实例包括例如来自糖酵解基因的启动子，如磷酸果糖激酶(PPK)，磷酸丙糖异构酶(TPI)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或者GAPDH)，丙酮酸激酶(PYK)，磷酸甘油酸激酶(PGK)，葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PGI1)来自酵母或丝状真菌的启动子；关于来自酵母的此类启动子的更详细描述可见WO 93/03159所述。其它有用的启动子是核糖体蛋白编码基因启动子、乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等)、烯醇化酶启动子(ENO)、己糖(葡萄糖)转运蛋白启动子(HXT7)，以及细胞色素c1启动子(CYC1)。其它启动子(组成型和可诱导型的)及增强子或者上游活化序列为本领域技术人员已知。与上述核苷酸序列可操纵地连接的启动子优选与宿主细胞同源。 
本发明经转化的宿主细胞进一步优选包含木酮糖激酶活性，从而由木糖异构化的木酮糖可以被代谢为丙酮酸盐/酯。优选地，所述细胞含有内源的木酮糖激酶活性。更优选地，本发明的细胞包含增加特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰。优选所述遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达。编码木酮糖激酶的基因对于所述细胞可以是内源的，或者可以是与所述细胞异源的木酮糖激酶。可用于在本发明细胞中过表达木酮糖激酶的核苷酸序列是例如来自啤酒糖酵母的木酮糖激酶基因(XKS1)，如Deng and Ho(1990，Appl.Biochem.Biotechnol. 24-25：193-199)所述。另一优选的木酮糖激酶是与来自Piromyces的木酮糖 激酶相关的木糖激酶(xylB；见WO 03/0624430)。这种Piromyces木酮糖激酶实际上与原核细胞激酶更相关(相对于所有已知真核细胞激酶如酵母激酶)。真核细胞木酮糖激酶已被标明为非特异性糖激酶，其具有广泛的底物范围，包括木酮糖。相反，Piromyces激酶与之最密切相关的原核细胞木酮糖激酶已被标明是木酮糖的更特异性的激酶，即具有较窄的底物范围。在本发明的细胞中，过表达的木酮糖激酶与在遗传学上相同的菌株(除了导致过表达的遗传修饰之外)相比过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或者20倍。应理解这些水平的过表达可用于酶活性的稳态水平、酶蛋白质的稳态水平以及编码所述酶的转录物的稳态水平。 
本发明的细胞进一步优选包含增加戊糖磷酸途径通量的遗传修饰，如WO 06/009434所述。具体而言，所述遗传修饰引起非氧化部分戊糖磷酸途径的通量增加。引起非氧化部分戊糖磷酸途径的通量增加的遗传修饰在本文被理解为是指这样的修饰，其使所述通量与遗传学上相同的菌株(除了导致通量增加的遗传修饰之外)所致通量相比增加至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或者20倍。非氧化部分戊糖磷酸途径的通量可以如WO 06/009434所述来测量。 
增加戊糖磷酸途径通量的遗传修饰可以通过各种方式而引入本发明的细胞中。这些方式包括例如实现木酮糖激酶和/或非氧化部分戊糖磷酸途径的一或多种酶的较高的稳态活性水平，和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变的实现可以通过挑选突变体(自发突变或者通过化学物或者辐射诱导)和/或通过重组DNA技术，例如通过编码所述酶的基因或者调节这些基因的因子的分别过表达或者失活而进行。 
在本发明优选的细胞中，所述遗传修饰包含(非氧化部分)戊糖磷酸途径的至少一种酶的过表达。优选所述酶选自编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶的酶。(非氧化部分)戊糖磷酸途径的酶的各种组合可以被过表达。例如被过表达的酶可以至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和转酮醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶和转酮醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶和转醛醇酶；或者至少是转酮醇酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷 酸异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶和转醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶和转酮醇酶。在本发明的一个实施方案中，核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶每个在本发明的细胞中均过表达。优选的是其中所述遗传修饰包含至少转醛醇酶过表达的细胞。更优选的是其中所述遗传修饰包含至少转酮醇酶和转醛醇酶均过表达的细胞，因为这种宿主细胞已经能够在木糖上厌氧生长。事实上，在一些条件下，我们发现仅过表达转酮醇酶和转醛醇酶的细胞在木糖上与过表达所述所有四种酶的细胞具有相同的厌氧生长速度，所述四种酶即核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶。此外，本发明过表达核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的细胞与仅过表达所述异构酶或者仅过表达所述3-差向异构酶的细胞相比是优选的，因为仅过表达这些酶之一可产生代谢失衡。 
本领域有各种可利用的方式用于在本发明细胞中过表达酶。具体而言，可以通过增加细胞中编码所述酶的基因的拷贝数而过表达所述酶，例如通过将额外的该基因的拷贝整合至细胞基因组中、通过从游离型多拷贝表达载体中表达所述基因，或者通过引入包含所述基因多个拷贝的游离型表达载体。用于所述酶的过表达的编码序列优选与本发明宿主细胞同源。然而，也同样可以使用与本发明的宿主细胞异源的编码序列。 
或者，在本发明细胞中酶的过表达可以通过使用启动子实现，所述启动子对于编码要过表达的酶的序列而言不是天然的，即对于与其可操纵地连接的编码序列是异源的启动子。尽管所述启动子优选与其可操纵地连接的编码序列是异源的，但是也优选所述启动子是同源的，即对于本发明的细胞是内源的。优选地，所述异源启动子与所述编码序列天然的启动子相比，优选在木糖或者木糖与葡萄糖可用作碳源、更优选用作主要碳源(即超过50％的可利用的碳源由木糖或者由木糖与葡萄糖组成)、最优选用作唯一碳源的条件下，能产生较高的稳态水平的包含所述编码序列的转录物(或者能够在单位时间产生更多转录分子，即mRNA分子)。在这种情况中合适的启动子包括上述启动子用于表达编码上述木糖异构酶的核苷酸序列。 
进一步优选的本发明细胞包含降低该细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰。优选地，在宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性是通过降低 编码非特异性醛糖还原酶的基因表达或使其失活的一或多个遗传修饰而降低的。优选地，所述遗传修饰降低细胞基因组中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每个内源拷贝的表达或者使其失活，所述醛糖还原酶能还原戊醛糖，包括木糖、木酮糖和阿拉伯糖。给定的细胞由于是二倍体、多倍体或者非整倍体而可以包含多个拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因，和/或细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶，其氨基酸序列不同且每个均由不同基因编码。在这种情况中，也优选使编码非特异性醛糖还原酶的每个基因的表达降低或者失活。优选地，所述基因通过所述基因至少一部分的缺失或者通过所述基因的断裂而失活，由此在这种情况中术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，其(部分)缺失或者失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。编码其活性要在本发明细胞中被降低的醛糖还原酶的核苷酸序列以及这种醛糖还原酶的氨基酸序列在WO 06/009434中有描述，并且包括例如啤酒糖酵母GRE3基因的(非特异性)醛糖还原酶基因( 
Figure BPA00001391204200211
et al.，2001，Appl.Environm.Microbiol. 67：5668-5674)及其在其它物种中的直系同源物。 
在进一步优选的实施方案中，具有如上所述的将木糖异构化为木酮糖能力的本发明经转化的细胞另外具有将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力，如例如Wisselink et al.(2007，AEM Accepts，published online ahead of print on 1 June 2007；Appl.Environ.Microbiol.doi:10.1128/AEM.00177-07)及EP 1 499 708中所述。将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力优选是通过用包含核苷酸序列的核酸构建体转化而赋予所述细胞，所述核苷酸序列编码a)阿拉伯糖异构酶；b)核酮糖激酶，优选L-核酮糖激酶木糖异构酶；以及c)核酮糖-5-P-4-差向异构酶，优选L-核酮糖-5-P-4-差向异构酶。优选地，在本发明细胞中，将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力是通过下列的反应将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸(酯)的能力，所述下列反应为：1)阿拉伯糖异构化成核酮糖；2)核酮糖磷酸化成核酮糖5-磷酸(酯)；以及3)核酮糖5-磷酸(酯)差向异构化为D-木酮糖5-磷酸(酯)。编码阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和核酮糖-5-P-4-差向异构酶的合适的核苷酸序列可得自枯草杆菌(Bacillus subtilis)，大肠杆菌(Escherichia coli)(见例如EP 1 499 708)，乳杆菌(Lactobacilli)、例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(见例如Wisselink et  al.上述)，或者棍状杆菌(Clavibacter)，节杆菌(Arthrobacter)和革兰菌(Gramella)种，优选密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和Gramella forsetii。 
进一步优选的本发明经转化的宿主细胞可包含进一步的遗传修饰，其引起选自由如下组成的组的一或多种特性：(a)增加木糖和/或阿拉伯糖向所述细胞中转运；(b)降低对分解代谢产物阻抑的敏感性；(c)提高对乙醇、摩尔渗透压浓度(osmolarity)或者有机酸的耐受性；以及(d)减少副产物的产生。副产物被理解为是指除了希望的发酵产物之外的含碳分子，包括例如木糖醇、阿拉伯糖醇、甘油和/或乙酸。本文所述的任何遗传修饰的引入可以通过传统的诱变和筛选和/或选择希望的突变体，或者简单地通过筛选和/或选择具有希望特性的自发突变体。或者，所述遗传修饰可由内源基因的过表达和/或内源基因的失活所组成。增加阿拉伯糖和/或木糖转向细胞中转运所需要过表达的基因优选选自编码己糖或者戊糖转运蛋白的基因。在啤酒糖酵母及其它酵母中，这些基因包括HXT1、HXT2、HXT4、HXT5、HXT7和GAL2，其中最优选HXT7、HXT5和GAL2(见Sedlack and Ho，Yeast 2004；21：671-684)。用于在酵母中表达的另一优选转运蛋白是由树干毕赤酵母(P.stipitis)SUT1基因编码的葡萄糖转运蛋白(Katahira et al.，2008，Enzyme Microb.Technol.43：115-119)。这些转运蛋白基因在其它物种中的直系同源物可类似地被过表达。可以在本发明细胞中过表达的其它基因包括编码糖酵解酶和/或产醇(ethanologenic)酶如醇脱氢酶的基因。用于失活的优选内源基因包括己糖激酶基因，例如啤酒糖酵母HXK2基因(见Diderich et al.，2001，Appl.Environ.Microbiol.67：1587-1593)；啤酒糖酵母MIG1或者MIG2基因；编码参与甘油代谢的酶的基因，如啤酒糖酵母磷酸甘油脱氢酶1和/或2基因；或者这些基因在其它物种中的(杂交)直系同源物。用于木糖发酵的宿主细胞的其它优选的进一步修饰在Maris et al.(2006，Antonie van Leeuwenhoek 90：391-418)、WO2006/009434、WO2005/023998、WO2005/111214和WO2005/091733中有描述。如本文所述的本发明细胞的任何遗传修饰尽可能地优选通过自身克隆遗传修饰来引入或者修饰。 
在优选的本发明经转化的宿主细胞中，所述核酸构建体赋予宿主细胞以木糖作为碳源/能量源、优选作为唯一碳源/能量源以及优选在厌氧条件下生长的能力，即如下文用于厌氧发酵方法的条件。优选地，当以木糖作为 碳源/能量源生长时，所述经转化的宿主基本上不产生木糖醇，例如所产生的木糖醇低于检测极限，或者例如低于在摩尔基础上消耗的碳的5％、2％、1％、0.5％或者0.3％。优选地，如果碳源/能量源也包括阿拉伯糖，则所述细胞基本上不产生阿拉伯糖醇，例如所产生的阿拉伯糖醇低于检测极限，或者例如低于在摩尔基础上消耗的碳的5％、2％、1％、0.5％或者0.3％。 
本发明转化的宿主细胞以木糖作为唯一碳源/能量源具有在需氧条件下以至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25或者0.3h-1的速率生长的能力、或者更优选地具有在厌氧条件下以至少0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15或者0.2h-1的速率生长的能力。本发明的细胞优选以葡萄糖与木糖的混合物(1∶1重量比)作为唯一碳源/能量源具有在需氧条件下以至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25或者0.3h-1的速率生长的能力、或者更优选地具有在厌氧条件下以至少0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15或者0.2h-1的速率生长的能力。因此，在优选的本发明经转化的宿主细胞中，所述核酸构建体赋予宿主细胞厌氧发酵木糖作为唯一碳源的的能力，其中在该过程中最后丙酮酸盐/酯被用作电子(及氢受体)并被还原成发酵产物，如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素以及头孢菌素类。 
优选地，本发明的细胞具有至少200、300、400、600、700、800、900或者1000mg h-1(g干重)-1的木糖消耗比速率。优选地，本发明的细胞在木糖上的发酵产物(如乙醇)产量是在葡萄糖上发酵产物(如乙醇)产量的至少20％、40％、50％、60、80、90、95或者98％。更优选地，经修饰的宿主细胞在木糖上的发酵产物(如乙醇)产量等于该宿主细胞在葡萄糖上的发酵产物产量。同样地，经修饰的宿主细胞在木糖上的生物质优选为宿主细胞在葡萄糖上生物质的至少55、60、70、80、85、90、95或者98％。更优选地，经修饰的宿主细胞在木糖上的生物质产量等于该宿主细胞在葡萄糖上的生物质产量。应理解在葡萄糖和木糖上的产量对比中，均在需氧条件下或者均在厌氧条件下进行对比。 
另一方面，本发明涉及用于产生发酵产物的方法，所述发酵产物选自由以下组成的组：乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素类。所述方法优选包括如下步骤：a)将含有木糖及任选存在的阿拉伯糖来源的 培养基与上文所述的细胞发酵，其中所述细胞将木糖及任选存在的阿拉伯糖发酵成所述发酵产物，及任选地b)回收所述发酵产物。 
在木糖来源之外，所述发酵培养基中的碳源也可以包含葡萄糖来源。技术人员会进一步了解到所述发酵培养基也可进一步包含其它类型碳水化合物，如例如特别是阿拉伯糖来源。所述木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的来源可以是木糖、葡萄糖和阿拉伯糖(即单体糖)，或者其可以是包含木糖、葡萄糖和/或阿拉伯糖单位的任何碳水化合物寡聚体或者多聚体形式，如例如木质纤维素、阿拉伯多糖、木聚糖、纤维素、淀粉等。为了从这种碳水化合物中释放木糖、葡萄糖和/或阿拉伯糖单位，可以在发酵培养基中加入合适的糖酶(如阿拉伯糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶等)，或者这些糖酶可以由经修饰的宿主细胞产生。在后者的情况中，经修饰的宿主细胞可以经遗传改造以产生及分泌此类糖酶。使用寡聚体或者多聚体来源的葡萄糖的另一优势是其使得可以在发酵期间维持较低浓度的游离葡萄糖，例如优选在发酵期间使用限速量的糖酶。这将随之防止用于非葡萄糖糖如木糖和阿拉伯糖的代谢和转运所需的系统的阻抑。在优选的方法中，经修饰的宿主细胞发酵木糖和葡萄糖及任选存在的阿拉伯糖，优选同时发酵，在这种情况中优选使用对于葡萄糖阻抑不敏感的修饰的宿主细胞，以防止双峰生长。在木糖(和葡萄糖)来源作为碳源之外，所述发酵培养基将进一步包含用于经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于真核微生物如酵母和丝状真菌生长的发酵培养基的成分为本领域熟知。 
所述发酵方法可以是需氧或者厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文定义为这样的发酵方法，所述方法在没有氧或者其中基本上没有氧被消耗的条件下运行，优选消耗的氧低于5、2.5或者1mmol/L/h，更优选0mmol/L/h(即氧消耗不可检测)，且其中有机分子作为电子供体和电子受体。在没有氧的条件下，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能通过氧化磷酸化作用而被氧化。为了解决这个问题，许多微生物使用丙酮酸盐/酯或者其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。因此，在优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐/酯被用作电子(和氢受体)，并被还原成发酵产物如乙醇，以及非乙醇发酵产物如乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁酸、己酸盐/酯(caproate)、丁醇、乙醛酸(glyoxylate)、β-内酰胺抗生素以及头孢菌素类。本发明的厌氧方法相对 于需氧方法是优选的，因为厌氧方法不需要用于通气的投入(investments)和能量，并且此外厌氧方法产生比需氧方法更高的产物产量。或者，本发明的发酵方法可以在需氧的限氧条件下进行。优选地，在限氧条件下的需氧方法中，氧消耗速率为至少5.5、更优选至少6、甚至更优选至少7mmol/L/h。 
所述发酵方法优选在对于本发明经修饰的细胞最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母或者真菌细胞而言，所述发酵方法在低于42℃的温度进行，优选低于38℃。对于酵母或者丝状真菌细胞，所述发酵方法优选在低于35、33、30或28℃并高于20、22或25℃的温度进行。 
优选地，在本发明的发酵方法中，所述细胞稳定保持着赋予细胞将木糖异构化为木酮糖、及任选地将阿拉伯糖异构化为D-木酮糖5-磷酸酯能力的所述核酸构建体。优选地，在所述方法中，至少10、20、50或者75％的细胞(优选在工业化发酵条件下)生长50世代之后保持将木糖异构化为木酮糖及任选地将阿拉伯糖异构化为D-木酮糖5-磷酸酯的能力。 
优选的本发明发酵方法是用于产生乙醇的方法，其中所述包括如下步骤：a)将含有木糖及任选存在的阿拉伯糖来源的培养基与如上所述细胞发酵，其中所述细胞将木糖及任选存在的阿拉伯糖发酵成为乙醇，及任选地b)回收所述乙醇。所述发酵培养基可如上所述进一步进行。在所述方法中，乙醇体积产率优选为每升每小时至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或者10.0g乙醇。在所述方法中，在木糖和/或葡萄糖和/或阿拉伯糖上的乙醇产量为至少50、60、70、80、90、95或者98％。乙醇产量在本文定义为理论最大产量的百分比，对于木糖、葡萄糖和阿拉伯糖为每g木糖、葡萄糖或阿拉伯糖0.51g乙醇。 
进一步优选的本发明发酵方法是这样的方法，其包括发酵含有木糖来源和阿拉伯糖来源的培养基，然而其中使用两种单独的菌株的细胞，第一种菌株细胞如上文所定义，除了该第一种菌株细胞不具有将阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸酯的能力，该第一种菌株细胞将木糖发酵为发酵产物；第二种菌株细胞如上文定义，除了该第二种菌株细胞不具有将木糖(直接)异构化为木酮糖的能力，该第二种菌株细胞将阿拉伯糖发酵为发酵产物。所述方法任选包括回收发酵产物的步骤。所述第一种和第二种细胞其它方面进一步如上文所述。 
在本说明书及其权利要求书中，动词“包含”及其变化以其非限制性含义应用，是指在该动词后面的项目被包括在内，但是不除外未特别提及的项目。此外，在以不定冠词“一个(a)”提及元件时，并不排除存在一个以上该元件，除非明确要求一个(one)及只是这些元件之一的情况。不定冠词“一个”因此通常是指“至少一个”。 
本说明书中引用的所有专利和文献均以其全部内容援引加入本文。 
提供如下实施例只是举例说明本发明，不以任何方式限制本发明的范围。 
附图描述
图1：经测试在酵母中表达的木糖异构酶的系统树。 
实施例
1.本发明的木糖异构酶在酵母中的功能性表达
1.1宿主生物体
宿主酵母株是RN1000。这个酵母株是酵母株RWB 218的衍生物(Kuyper et al.，FEMS Yeast Research 5，2005，399-409)。编码Piromyces XylA的质粒pAKX002在RN1000中丢失。所述宿主株的基因型是.：MatA，ura3-52，leu2-112，gre3::hphMX，loxP-Ptpi::TAL1，loxP-Ptpi::RKI1，pUGPtpi-TKL1，pUGPtpi-RPE1，{p415 Padh1XKS1Tcyc1-LEU2}。 
1.2具有合成的XI基因的表达构建体
将合成的密码子优化的(针对啤酒糖酵母)XI基因用XbaI(在所述合成的基因的5’末端)和BamHI(在所述合成的基因的3’末端)限制位点克隆进pRS306的衍生物(Sikorski R.S.，Hieter P.，1989，″A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae″Genetics 122：19-27)中，所述衍生物包含啤酒糖酵母的TPI1启动子(899bp)和CYC1终止子(288bp)序列，。在ATG之前的头三个核苷酸被修饰为AAA，以优化表达。表1提供了经测试的XI序列的列表以及表示所述合成的序列的相应SEQ ID NO.。基因由GenScript公司(zie www.genscript.com)合成并克隆于pUC57中运送： 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝2440162. 
以酵母基因组DNA作为模板，在使用如下引物进行的PCR中获得TPI启动子： 
正向引物： 
AAACCGGTTTCTTCTTCAGATTCCCTC 
反向引物： 
TTAGATCTCTAGATTTATGTATGTGTTTTTTGTAGT 
以酵母基因组DNA作为模板，在使用如下引物进行的PCR中获得CYC1终止子： 
正向引物： 
AAGAATTCGGATCCCCTTTTCCTTTGTCGA 
反向引物： 
AACTCGAGCCTAGGAAGCCTTCGAGCGTC 
1.3宿主生物体的转化及转化体的选择
使用“Gietz方法”(Gietz et al.，1992，Nucleic Acids Res.1992 Mar 25；20(6)：1425.)，用质粒转化RN1000。在矿物质培养基(YNB+2％葡萄糖)上经尿嘧啶互补初步选择转化体。 
1.4酶测定
木糖异构酶活性在37℃于反应混合物中测定，所述反应混合物含有50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、10mM木糖、10mM MgCl2及适量无细胞提取物。一单位的活性定义为在测定条件下每分钟产生1nmol木酮糖的所述酶的量。所形成的木酮糖通过Dische和Borenfreund(Dische and Borenfreund，1951，J.Biol.Chem.192：583-587)所述的方法来确定，或者通过HPLC确定(使用在80℃运行的Biorad HPX-87N柱，并使用0.01M Na2HPO4作为洗脱液以0.6ml/min洗脱)。木糖和木酮糖通过反射指数检测器(Refractive Index detector)在60℃的内部温度检测。 
比活性以“活性单位每mg蛋白质”表示。使用Bio-Rad蛋白质试剂(Bio-RadLaboratories，Richmond，CA，USA)确定蛋白质，用牛γ-球蛋白作为标准。 
1.5经转化的细胞的生理特性
将经转化的细胞在葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上进行若干次菌落纯化。随后，使经过菌落纯化的转化细胞在摇瓶中在存在氧的条件下于具有2％(w/v)木糖作为碳源/能量源的合成培养基上生长。结果在表2中示出，其中“+”表示细胞显示出显著的生长。符号“-”表示未出现显著的生长。 
随后测试消耗木糖而生长的菌株在木糖消耗伴随乙醇形成条件下的厌氧生长的能力。用Cyllamyces aberensis、玻璃海鞘、难辨梭菌、脆弱梭杆菌和死亡梭杆菌的木糖异构酶转化的菌株能在木糖上厌氧生长，且具有比得上现有技术中Piromyces酶转化的菌株的生长速度、生物质和乙醇产量，例如比得上先前Kuyper et al.(2005，FEMS Yeast Res.5：925-934)所描述的RWB218。而用难辨梭菌XI转化的细胞在木糖发酵中在生长速度方面示出最佳性能。 
类似地，本发明经转化的细胞也能利用混合底物。当经转化的细胞在葡萄糖与木糖的混合物(每种糖均为20g/l)中生长时，这两种糖均被完全消耗，但是葡萄糖是优选的底物。木糖消耗仅在大约80％葡萄糖被消耗之后才开始。所产生的乙醇解释了在用Cyllamyces aberensis、玻璃海鞘、难辨梭菌、脆弱梭杆菌和死亡梭杆菌的木糖异构酶转化的菌株的每种情况中葡萄糖和木糖的总消耗。 
表1 
表2 
Figure DEST_PATH_GSB00000652143600011
Figure BPA00001391204200301
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Claims (15)

1.一种包含核苷酸序列的真核微生物细胞，所述核苷酸序列的表达在细胞中赋予了或者增加了直接将木糖异构化为木酮糖的能力，其中所述核苷酸序列编码具有木糖异构酶活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列含有选自由如下组成的组的一或多个氨基酸序列元件：
(a)在第91位的甲硫氨酸残基，
(b)在第134-139位的氨基酸序列TGIKLL，
(c)在第230位的苯丙氨酸残基，
(d)分别在第264和265位的氨基酸苯丙氨酸和赖氨酸，
(e)在第274-278位的氨基酸序列TLAGH，
(f)在第387-391位的氨基酸序列RYASF，
(g)在第394位的甘氨酸残基，以及
(h)在第431位的丙氨酸残基，
其中所述多肽不包含与SEQ ID NO：3-7之一具有95％以上序列相同性的氨基酸序列。
2.权利要求1的真核微生物细胞，其中编码木糖异构酶的核苷酸序列选自由如下组成的组：
(a)编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有至少45％序列相同性的氨基酸序列，
(b)编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少45％序列相同性的氨基酸序列，
(c)编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO.35的氨基酸序列具有至少45％序列相同性的氨基酸序列，
(d)核苷酸序列，其互补链与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列杂交，以及
(e)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(d)的核苷酸序列的序列不同。
3.权利要求2的细胞，其中所述核苷酸序列编码可得自梭菌(Clostridium)和梭杆菌(Fusobacterium)菌属的细菌或者玻璃海鞘(Conia)属的被囊动物的氨基酸序列。
4.前述任一项权利要求的细胞，其中所述细胞是选自由如下组成的组的属的酵母或者丝状真菌：糖酵母(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤氏酵母(Pichia)、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)、汉逊氏酵母(Hansenula)、克勒克氏酵母(Kloeckera)、许旺氏酵母(Schwanniomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、曲霉菌(Aspergillus)、木霉菌(Trichoderma)、腐质霉菌(Humicola)、支顶孢(Acremonium)、镰刀菌(Fusarium)以及青霉菌(Penicillium)。
5.权利要求4的细胞，其中所述细胞是能够厌氧成醇发酵的酵母。
6.权利要求5的细胞，其中所述酵母属于选自由以下组成的组的种：啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、微小糖酵母(S.exiguus)、巴扬氏糖酵母(S.bayanus)、乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
7.前述任一项权利要求的细胞，其中编码具有木糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列与启动子可操纵地连接，所述启动子引起所述核苷酸序列在细胞中的充分表达以赋予该细胞将木糖异构化为木酮糖的能力。
8.前述任一项权利要求的细胞，其中所述细胞进一步包含增加特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰。
9.前述任一项权利要求的细胞，其中所述细胞包含增加戊糖磷酸途径通量的遗传修饰。
10.前述任一项权利要求的细胞，其中所述宿主细胞包含降低细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰。
11.前述任一项权利要求的细胞，其中所述细胞展现出将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸酯的能力。
12.前述任一项权利要求的细胞，其中所述细胞包含至少一种进一步的遗传修饰，其导致选自由以下组成的组的特性：
(a)增加木糖和阿拉伯糖中至少一种向宿主细胞中的转运，
(b)降低对分解代谢产物阻抑的敏感性，
(c)提高对乙醇、摩尔渗透压浓度或者有机酸的耐受性，和
(d)减少副产物的产生。
13.前述任一项权利要求的细胞，其中所述细胞具有产生至少一种选自由以下组成的组的发酵产物的能力：乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁酸、己酸盐/酯、丁醇、乙醛酸、β-内酰胺抗生素和头孢菌素类。
14.产生选自由如下组成的组的发酵产物的方法：乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁酸、己酸盐/酯、丁醇、乙醛酸、β-内酰胺抗生素和头孢菌素类，其中所述方法包括如下步骤；
(a)将含有木糖来源及任选存在的阿拉伯糖来源的培养基与权利要求1-13任一项的细胞发酵，其中细胞将木糖发酵成所述发酵产物，及任选地
(b)回收所述发酵产物。
15.权利要求14的方法，其中所述培养基还含有葡萄糖来源。
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