CN114107257B - 一种糖苷水解酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种糖苷水解酶及其应用。该糖苷水解酶C25GH19B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28‑205位氨基酸序列所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第82‑615位碱基序列所示。本发明的糖苷水解酶C25GH19B具有肽聚糖酶活力，对菜豆萎蔫病菌、丁香假单胞杆菌、茄科雷尔氏菌等植物病原菌具有显著的裂解作用，显示该酶在病原菌的生物防治中具有很大的应用潜力。

Description

一种糖苷水解酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种糖苷水解酶及其应用。
背景技术
丁香假单胞菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌等植物病原细菌是造成全球范围内农作物感染的主要病原细菌，蔓延在世界各大主要作物生产区，已经造成了巨大的经济损失，因而，这些植物病原菌的防治成为国内外该领域的研究热点之一。
粘细菌是具有捕食能力的“高等原核生物”，本课题组前期分离到一株能够捕食植物病原细菌的粘细菌Corallococcus sp.c25j21，其基因组中含有两个GH19家族糖苷水解酶基因。我们对其中一个酶基因进行克隆、表达、纯化及酶学表征，发现该酶可以水解植物病原细菌来源的肽聚糖，并且对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性植物病原细菌具有很好的裂解作用，表明该酶在植物病原细菌的生物防治方面具有很好的应用潜力和研究价值。
发明内容
本发明旨在提供一种粘细菌来源的新型糖苷水解酶C25GH19B及其应用。
本发明所述的新型糖苷水解酶C25GH19B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28-205位氨基酸序列所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第82-615位碱基序列所示。
具体的，所述糖苷水解酶C25GH19B来自于粘细菌Corallococcus sp.c25j21。包括205个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(具体为MPGSGVLLGGAALVGLGAWAMRGGAAAAPLTVDQLCAVMPRLTPSVAASYLGPLLAAMREAEVTTVARVAAFLAQLAHESGELRYWEELATGDAYEGRKDLGNTQPGDGRRYKGRGPIQLTGRANYRAAGAALGLPLEDKPELAALPAHGFRVAGWYWQSRHLNALADVADFVGVTRAINGGTNGLDNRVMYFDRAQRVLKTEAA)，N端27个氨基酸为信号肽，成熟的C25GH19B的理论分子量为19kDa。
进一步的，本发明所述的糖苷水解酶C25GH19B还涵盖在：所使用的蛋白为表现出糖苷水解酶活性的C25GH19B的突变体，包括对该蛋白少量氨基酸的修改、插入或删除。
本发明还公开了一种包含上述糖苷水解酶C25GH19B的编码基因的重组载体，优选，所述的重组载体为pET28a-c25gh19b。
本发明还公开了一种包含上述重组载体的重组工程菌，优选，所述的重组工程菌的宿主菌为大肠杆菌，优选，所述的重组工程菌为大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/c25gh19b。
本发明所述的糖苷水解酶C25GH19B是由重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/c25gh19b发酵培养诱导表达、纯化回收获得。
本发明还提供糖苷水解酶C25GH19B在革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌肽聚糖降解中的应用。
本发明还提供糖苷水解酶C25GH19B在革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌裂解中的应用。
所述的病原菌为植物性病原菌，具体为植物性病原细菌，包括丁香假单胞菌、菜豆萎蔫病菌或茄科雷尔氏菌。
本发明具备的有益效果：
本发明所述的新型糖苷水解酶C25GH19B是肽聚糖水解酶，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌来源的肽聚糖均有很好的降解活力，对菜豆萎蔫病菌、丁香假单胞杆菌、茄科雷尔氏菌等革兰氏阳性和革兰氏阴性植物病原细菌均有很好的裂解作用。
附图说明
图1为纯化后C25GH19B蛋白的SDS-PAGE分析，其中，M，分子量marker；1，纯化的C25GH19B。
图2为C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌来源的肽聚糖的降解活力，其中，白色为阴性对照组，灰色为C25GH19B处理组，P.syringae为丁香假单胞杆菌，C.flaccumfaciens为菜豆萎蔫病菌，R.solanacearum为茄科雷尔氏菌。
图3为平板透明圈实验检测C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌的裂解活力，其中，A为丁香假单胞杆菌阴性对照组，B为丁香假单胞杆菌C25GH19B处理组，C为菜豆萎蔫病菌阴性对照组，D为菜豆萎蔫病菌C25GH19B处理组，E为茄科雷尔氏菌阴性对照组，F为茄科雷尔氏菌C25GH19B处理组。
图4为菌落计数检测C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌的裂解活力，其中，A为丁香假单胞杆菌阴性对照组，B为丁香假单胞杆菌C25GH19B处理组，C为菜豆萎蔫病菌阴性对照组，D为菜豆萎蔫病菌C25GH19B处理组，E为茄科雷尔氏菌阴性对照组，F为茄科雷尔氏菌C25GH19B处理组。
图5为透射电镜观察C25GH19B对丁香假单胞杆菌、菜豆萎蔫病菌、茄科雷尔氏菌的裂解作用，其中，A为丁香假单胞杆菌阴性对照组，B为丁香假单胞杆菌C25GH19B处理组，C为菜豆萎蔫病菌阴性对照组，D为菜豆萎蔫病菌C25GH19B处理组，E为茄科雷尔氏菌阴性对照组，F为茄科雷尔氏菌C25GH19B处理组。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：重组载体pET28a-c25gh19b的构建
首先根据糖苷水解酶C25GH19B原始核苷酸序列(SEQ ID NO.2的第82-615位)，以大肠杆菌表达宿主进行密码子优化，由金唯智公司合成经优化后的糖苷水解酶C25GH19B的编码基因，优化后的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将优化后的编码基因克隆至pET28a载体的NcoI和XhoI位点之间，得到重组载体pET28a-c25gh19b，将重组载体pET28a-c25gh19b转化至克隆宿主E.coli DH5，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID NO.3相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组质粒pET28a-c25gh19b。
实施例2：大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/c25gh19b的构建
从E.coli DH5提取质粒pET28a-c25gh19b，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养物离心后涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落进行测序验证，测序验证正确的(与核苷酸序列SEQ ID NO.3相同)为含有糖苷水解酶C25GH19B的基因工程菌BL21(DE3)/c25gh19b。
实施例3：糖苷水解酶C25GH19B蛋白的制备
将基因工程菌BL21(DE3)/c25gh19b接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于22℃震荡培养20h。8000g离心10min收集菌体，用50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体3次，重悬菌体并超声破碎，于4℃，12000g离心去除沉淀，上清即为粗酶液。粗酶液用孔径0.22m水系膜过滤后，用Ni2+亲和层析柱进行蛋白纯化，用咪唑梯度洗脱，收集洗脱液，然后用10kDa的超滤管置换为50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液，并进行浓缩。利用SDS-PAGE检验蛋白的纯度，利用Bradford试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE结果如图1所示，得到的蛋白为糖苷水解酶C25GH19B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28-205位氨基酸序列所示。
实施例4：糖苷水解酶C25GH19B在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌肽聚糖降解中的应用
丁香假单胞杆菌P.syringae GIM 1.330，菜豆萎蔫病菌C.flaccumfaciens GIM1.343，茄科雷尔氏菌R.solanacearum GDMCC 1.1561分别在NB培养基中，30℃，180rpm震荡培养16h，8000rpm离心收集菌体，蒸馏水洗涤一次，并用蒸馏水重悬菌体，于100℃加热10min，4℃，11000rpm离心8min收集沉淀。预热的5％(W/V)SDS缓冲液重悬菌体，煮沸25min，20℃，11000rpm离心8min收集沉淀，预热的4％(W/V)SDS缓冲液重悬菌体，煮沸15min，11000rpm离心8min收集沉淀。蒸馏水洗涤去除SDS，超声破碎细胞。4000rpm离心10min，收集上清，11000rpm离心10min收集沉淀，并洗涤1-2次。将沉淀重悬于20mM的PBS缓冲液(pH7.6)。加入终浓度分别为0.5mg/mL的DNA酶和RNA酶，37℃孵育2-3h。加入终浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶，37℃孵育2-3h。加入终浓度为2mg/mL的链霉蛋白酶，37℃孵育2h，水洗数次。加入HF，4℃孵育24h，水洗至中性，沉淀即为细胞壁肽聚糖。
利用比浊法测定糖苷水解酶C25GH19B对三种细菌细胞壁肽聚糖的酶活力。反应体系包含50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)，糖苷水解酶C25GH19B的终浓度为0.2mg/mL，调整肽聚糖的量使体系初始的A450为0.8，利用多功能酶标仪监测A450的变化，以每分钟A450的变化速率表示酶活力，对照组中以50mM醋酸缓冲液(pH5.0)代替糖苷水解酶C25GH19B，每个实验重复三次。
结果如图2所示，糖苷水解酶C25GH19B对三种细菌来源的细胞壁肽聚糖具有明显的水解作用。
实施例5：糖苷水解酶C25GH19B在三种植物病原细菌裂解中的应用
(1)平板透明圈实验
将直径6mm的无菌滤纸片置于分别含有丁香假单胞杆菌P.syringae GIM 1.330、菜豆萎蔫病菌C.flaccumfaciens GIM 1.343、茄科雷尔氏菌R.solanacearum GDMCC1.1561的NA固体培养基平板上，向滤纸片上滴加20μL已过滤除菌的糖苷水解酶C25GH19B溶液(1.3mg/mL)，对照组以50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)代替糖苷水解酶C25GH19B溶液，28℃孵育48h，观察平板上的水解透明圈。实验重复三次。
结果如图3所示，糖苷水解酶C25GH19B对三种植物病原细菌具有明显的裂解作用。
(2)菌落计数实验及透射电镜观察
分别离心收集对数生长期的丁香假单胞杆菌P.syringae GIM 1.330、菜豆萎蔫病菌C.flaccumfaciens GIM 1.343、茄科雷尔氏菌R.solanacearum GDMCC 1.1561菌体1mL，并用500μL过滤除菌的糖苷水解酶C25GH19B溶液(1.3mg/mL)重悬菌体，对照组以50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)代替糖苷水解酶C25GH19B溶液，于30℃，1000rpm震荡孵育2h，反应结束后，一部分菌悬液用于透射电镜观察，另一部分菌悬液稀释106倍后涂布于NA固体培养基平板，30℃培养16h后对菌落计数。实验重复三次。
菌落计数结果如图4所示，与对照组相比，糖苷水解酶C25GH19B处理后使病原细菌的菌落数明显减少，说明糖苷水解酶C25GH19B对病原细菌具有很好的抑菌作用。
透射电镜观察结果如图5所示，糖苷水解酶C25GH19B对三种病原细菌的细胞壁具有明显的裂解作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种糖苷水解酶及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 205
<212> PRT
<213> 粘细菌c25j21 (Corallococcus sp. c25j21)
<400> 1
Met Pro Gly Ser Gly Val Leu Leu Gly Gly Ala Ala Leu Val Gly Leu
1 5 10 15
Gly Ala Trp Ala Met Arg Gly Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Thr Val
20 25 30
Asp Gln Leu Cys Ala Val Met Pro Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Ala
35 40 45
Ser Tyr Leu Gly Pro Leu Leu Ala Ala Met Arg Glu Ala Glu Val Thr
50 55 60
Thr Val Ala Arg Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Leu Ala His Glu Ser
65 70 75 80
Gly Glu Leu Arg Tyr Trp Glu Glu Leu Ala Thr Gly Asp Ala Tyr Glu
85 90 95
Gly Arg Lys Asp Leu Gly Asn Thr Gln Pro Gly Asp Gly Arg Arg Tyr
100 105 110
Lys Gly Arg Gly Pro Ile Gln Leu Thr Gly Arg Ala Asn Tyr Arg Ala
115 120 125
Ala Gly Ala Ala Leu Gly Leu Pro Leu Glu Asp Lys Pro Glu Leu Ala
130 135 140
Ala Leu Pro Ala His Gly Phe Arg Val Ala Gly Trp Tyr Trp Gln Ser
145 150 155 160
Arg His Leu Asn Ala Leu Ala Asp Val Ala Asp Phe Val Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ala Ile Asn Gly Gly Thr Asn Gly Leu Asp Asn Arg Val Met Tyr
180 185 190
Phe Asp Arg Ala Gln Arg Val Leu Lys Thr Glu Ala Ala
195 200 205
<210> 2
<211> 618
<212> DNA
<213> 粘细菌c25j21 (Corallococcus sp. c25j21)
<400> 2
atgccgggta gcggggtgct gctgggtggt gccgcgctgg tgggcctggg cgcgtgggcg 60
atgcgcggcg gcgctgcggc ggcgccgctc accgtggacc agctctgcgc cgtcatgccg 120
cgcctgacgc cctcggtggc ggcgtcgtac ctggggccgc tgctggcggc catgcgcgag 180
gcggaggtga cgacggtggc gcgcgtcgcg gcgttcctgg cccagctcgc gcatgagagc 240
ggagagctgc ggtactggga ggagctggcg acgggcgatg cctacgaggg gcggaaggac 300
ctgggcaaca cgcagccggg cgacgggcgc cgctacaagg ggcgcggccc catccagctc 360
accggccgcg cgaactaccg cgccgctggc gccgcgttgg ggctgccgct ggaggacaag 420
ccggagctgg cggcgctgcc cgcgcacggc ttccgcgtcg cgggttggta ctggcagtca 480
cgccacctga acgcgctggc ggacgtggcg gatttcgtcg gggtgacacg cgccatcaac 540
ggcgggacga acgggttgga caacagggtg atgtacttcg accgcgcgca gcgcgtgctc 600
aagacggagg cggcgtga 618
<210> 3
<211> 534
<212> DNA
<213> 粘细菌c25j21 (Corallococcus sp. c25j21)
<400> 3
gcgccgctga cggtggatca actatgcgcg gtgatgcccc gcctgacacc aagcgtggcg 60
gcgagctatc tgggcccgct gttagcggcg atgcgtgagg cggaagtgac aaccgtggcg 120
cgggtggcgg cgtttctggc gcagctggcg catgaaagcg gcgaactgcg ctattgggaa 180
gaactggcga ccggcgatgc gtatgaaggc cgcaaagatc tgggcaacac gcagccgggc 240
gatggccgcc gctataaagg ccgcggtccc attcagctga ctggtcgcgc aaactatcgc 300
gcggcgggcg cggcgctggg cctgccgctg gaagataaac cggaactggc ggcgctgccg 360
gcgcatggct ttcgcgtggc gggctggtat tggcagagcc gccatctgaa cgcgctggcg 420
gatgtggcgg attttgtggg cgtgacccgc gcgattaacg gcggcaccaa cggcctggat 480
aaccgcgtga tgtattttga tcgcgcgcag cgcgtgctga aaaccgaagc ggcg 534

Claims (4)

1.糖苷水解酶C25GH19B在肽聚糖降解中的应用；所述的糖苷水解酶C25GH19B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28-205位氨基酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖苷水解酶C25GH19B的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第82-615位碱基序列所示。
3.糖苷水解酶C25GH19B在植物病原菌裂解中的应用；所述的糖苷水解酶C25GH19B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第28-205位氨基酸序列所示；所述的植物病原细菌为丁香假单胞菌、菜豆萎蔫病菌或茄科雷尔氏菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的糖苷水解酶C25GH19B的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第82-615位碱基序列所示。
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