ES2238072T3 - Levaduras recombinantes para la fermentacion efectiva de la glucosa y de la xilosa. - Google Patents
Levaduras recombinantes para la fermentacion efectiva de la glucosa y de la xilosa.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN LEVADURAS RECOMBINANTES QUE CONTIENEN GENES QUE CODIFICAN LA REDUCTASA DE LA XILOSA, LA DESHIDROGENASA DEL XILITOL Y LA XILULOCINASA, Y MOLECULAS DE ADN, VECTORES Y METODOS UTILES PARA LA PRODUCCION DE TALES LEVADURAS. LAS LEVADURAS RECOMBINANTES FERMENTAN DE FORMA EFECTIVA LA XILOSA EN ETANOL Y LAS LEVADURAS PREFERENTES SON CAPACES DE FERMENTAR SIMULTANEAMENTE LA GLUCOSA Y LA XILOSA EN ETANOL CON LO QUE SE PUEDE SACAR BUEN PROVECHO DE ESTAS DOS FUENTES DE AZUCAR SEGUN SE ENCUENTRAN EN LA BIOMASA AGRICOLA.
Description
Levaduras recombinantes para la fermentación
efectiva de la glucosa y de la xilosa.
La presente invención se refiere de forma general
a levaduras obtenidas por ingeniería genética capaces de fermentar
de forma simultánea los dos principales constituyentes de naturaleza
de azúcar de la biomasa celulósica, la glucosa y la xilosa, a
etanol. De forma más particular la presente invención se refiere a
dichas levaduras que pueden ser construidas por clonación de un gen
de la reductasa de la xilosa, un gen de la dehidrogenasa del
xilitol, y un gen de la xiluloquinasa en levaduras capaces de
fermentar la glucosa a etanol.
Recientes estudios han demostrado que el etanol
es un combustible líquido ideal para automóviles. Puede ser
utilizado directamente como un combustible limpio (100% etanol) o
como una mezcla con gasolina a varias concentraciones.
El uso de etanol para suplementar o sustituir la
gasolina puede reducir la dependencia de muchas naciones del
petróleo importado del extranjero y también proporciona un
combustible renovable para el transporte. Además, el etanol ha
demostrado ser un combustible más limpio que libera muchos menos
contaminantes en el ambiente que la gasolina normal. Por ejemplo, se
ha demostrado que el uso de materiales oxigenados en la gasolina
puede reducir la emisión de monóxido de carbono, un contaminante
dañino, en el aire. Entre los diferentes materiales oxigenados
actualmente utilizados para elevar el contenido de oxigeno de la
gasolina, el etanol tiene el contenido en oxígeno más elevado. La
Agencia para la protección del medio Ambiente de Estados Unidos
(EPA) ha demostrado que la gasolina mezclada con etanol al 10%
reduce la emisiones de monóxido de carbono en aproximadamente entre
el 25%-30%.
Hasta ahora, las reservas alimenticias utilizadas
para la producción de alcohol industrial por fermentación han sido
azúcares obtenidos de la caña de azúcar o las remolachas, almidón
del maíz o de otras cosechas de alimentos. Sin embargo, estas
cosechas de la agricultura son demasiado caras para ser utilizadas
como reservas alimenticias para la producción a gran escala de
etanol.
La biomasa de las plantas es una reserva
alimenticia atractiva para la producción de combustible a partir de
etanol por fermentación debido a que es renovable, y asequible a
bajo coste y en grandes cantidades. El concepto de utilización del
alcohol producido por fermentación microbiana de azúcares a partir
de la biomasa de la agricultura tiene su origen al menos desde hace
dos décadas. Los azúcares fermentables a partir de materiales
celulósicos son la glucosa y la xilosa (siendo la relación de
glucosa a xilosa de aproximadamente 2 o 3 a 1). Las fermentaciones
más deseables de materiales celulósicos convertirían, naturalmente,
completamente tanto la glucosa como la xilosa a etanol.
Desafortunadamente, incluso ahora no hay un único microorganismo
natural conocido capaz de fermentar tanto la glucosa como la xilosa
de forma efectiva.
Las levaduras, de forma particular las del género
Saccharomyces, han sido utilizadas de forma tradicional para
fermentar las reservas alimenticias con una base de glucosa a
etanol, y son todavía los mejores microorganismos para la conversión
de glucosa a etanol. Sin embargo, se ha encontrado que estas
levaduras que fermentan la glucosa no son sólo incapaces de
fermentar la xilosa sino que también son incapaces de utilizar el
azúcar de la pentosa para el crecimiento. De cualquier modo, estas
levaduras que fermentan la glucosa pueden utilizar xilulosa para el
crecimiento y la fermentación (Figura 1), aunque con eficacia
variable. Por ejemplo, la S. cerevisiae fermenta la xilulosa
de forma muy deficiente mientras que especies de
Schizosaccharomyces lo hacen de forma bastante efectiva
(Chiang y col., 1981; Lastick y col., 1989).
Aunque, las levaduras que fermentan la glucosa
son incapaces de utilizar xilosa tanto para el crecimiento como para
la fermentación, hay muchas levaduras naturales que pueden utilizar
xilosa para el crecimiento aeróbico pero que no fermentan la xilosa
a etanol. Estas levaduras no fermentadoras/que utilizan xilosa
dependen de dos enzimas - la reductasa de la xilosa y la
dehidrogenasa del xilitol - para convertir la xilosa en xilulosa.
Estas levaduras son diferentes de la mayoría de las bacterias que
dependen de una única enzima - la isomerasa de la xilosa - para
convertir la xilosa directamente en xilulosa (Figura 1). La levadura
reductasa de la xilosa y la dehidrogenasa del xilitol también
requieren cofactores para sus acciones; la reductasa de la xilosa
depende del NADPH como su cofactor y la dehidrogenasa de xilitol
depende del NAD como su cofactor. Por el contrario, la isomerasa de
la xilosa bacteriana no requiere ningún cofactor para la conversión
directa de xilosa a xilulosa (Figura 1).
Hace dos décadas, se dedicó mucho esfuerzo en un
intento de encontrar nuevas levaduras capaces de fermentar de forma
efectiva tanto la glucosa como la xilosa a etanol. Aunque no se ha
encontrado una levadura ideal, estos esfuerzos tuvieron un éxito
limitado. Por ejemplo, se encontraron pocas levaduras que fueran
capaces no sólo de utilizar la xilosa para el crecimiento aeróbico,
sino también para fermentar la xilosa a etanol (Toivola y col.,
1984; Dupreez y van der Walt, 1983), aunque ninguna de estas
levaduras que fermentan la xilosa fue totalmente efectiva en la
fermentación de la xilosa a etanol (Jeffries, 1985). Además, estas
levaduras fueron incapaces de fermentar la glucosa de forma
efecti-
va.
va.
Entre las levaduras que fermentan la xilosa, se
han caracterizado de forma extensiva tres especies, Pachysolen
tannophilus (Toivola y col., 1984), Candida shehatae
(Dupreez y van der Walt, 1983), y Pichia stipitis (Grootjen y
col., 1990). P. stipitis y C. shihatae fermentan la
xilosa mejor que otras levaduras que fermentan la xilosa (Grootjen y
col., 1990). Sin embargo, incluso las mejores levaduras que
fermentan la xilosa carecen de una alta eficiencia en la
fermentación de la xilosa, y también son muy inefectivas fermentando
la glucosa (Jeffries, 1985)
En la última década, también se realizaron
esfuerzos para modificar genéticamente levaduras tradicionales que
fermentan la glucosa, en particular la S. cerevisiae,
mediante técnicas de recombinación de ADN. Inicialmente estos
esfuerzos se concentraron en la clonación del gen isomerasa de la
xilosa de la levadura para volverla capaz de convertir la xilosa en
silulosa directamente sin depender de otros factores. Sin embargo,
estos esfuerzos no han tenido éxito debido a que los genes que
codifican varias isomerasas de la xilosa de bacterias son incapaces
de dirigir la síntesis de un enzima activo en S. cerevisiae
(Rosenfeld y col., 1984; Ho y col., 1983; Sarthy y col., 1987;
Wilheim y Hollenberg, 1984; Amore y col., 1989)).
En los últimos pocos años, se han focalizado los
esfuerzos hacia las levaduras de ingeniería genética,
particularmente la S. cerevisiae, para fermentar la xilosa,
en la clonación de genes que codifiquen la reductasa de la xilosa
(Takama y col., 1991; Hallborn y col., 1991; Strasser y col., 1990),
la dehidrogenasa del xilitol (Köetter y col., 1990; Hallborn y col.,
1990), y la xiluloquinasa (Stevis y col., 1987); Chang y Ho, 1988;
Ho y Chang, 1989; Deng y Ho, 1990). La S. cerevisiae y otras
levaduras que fermentan la glucosa no contienen ninguna actividad
detectable de la reductasa de la xilosa o de la dehidrogenasa del
xilitol, pero todas parecen contener la actividad de la
xiluloquinasa. De este modo, las levaduras que fermentan la glucosa
pueden todas ellas fermentar la xilulosa, pero lo hacen con eficacia
variada (Deng y Ho, 1990).
Recientemente, Köetter y col., (1990), Strasser y
col. (1990), y Hallborn y col. (1990; 19991), han clonado tanto el
gen de la reductasa de la xilosa como de la dehidrogenasa del
xilitol en la S. cerevisiae. Sin embargo, estas levaduras de
ingeniería genética no pueden fermentar la xilosa de forma efectiva.
Por ejemplo, estas levaduras han sido incapaces de fermentar más del
2% de xilosa. Además, producen grandes cantidades de xilitol a
partir de la xilosa (Hallborn y col., 1990; Köetter y Ciriacy,
1993), que desvían el valioso sustrato de la xilosa del proceso
fermentativo deseado a etanol.
Los extensos antecedentes en este campo, tal como
se ha señalado anteriormente, demuestran que a pesar de los
esfuerzos concertados y prolongados de numerosos investigadores, no
se han conseguido levaduras capaces de fermentar de forma efectiva
tanto la glucosa como la xilosa a etanol. De acuerdo con ello,
todavía hay una necesidad de dichas levaduras y de métodos de su
preparación y uso. Es hacia estas necesidades a las que se dirige la
presente invención.
Una característica de esta invención reside en el
descubrimiento de que pueden crearse nuevas cepas de levaduras
capaces de fermentar de forma efectiva la xilosa sola o
simultáneamente con glucosa utilizando técnicas de DNA recombinante
y técnicas de clonación de genes. De forma particular, estas
técnicas han sido utilizadas para crear nuevas levaduras
recombinantes que contienen genes de la reductasa de la xilosa
clonada (XR), de la dehidrogenasa del xilitol (XD), y de la
xiluloquinasa (XK) que están fusionados a promotores no inhibidos
por la presencia de glucosa.
De acuerdo con ello, una realización preferida de
la invención proporciona una cepa de levadura recombinante que
contiene genes introducidos que codifican la reductasa de la xilosa,
la dehidrogenasa del xilitol y la xiluloquinasa y que son capaces de
fermentar la xilosa a etanol. Preferiblemente la cepa de la levadura
recombinante es también capaz de fermentar la glucosa a etanol, y
más preferiblemente se consiguen dichas cepas de levaduras que
pueden fermentar de forma efectiva estos dos azucares de forma
simultánea al etanol cuando los genes de XR, XD y XK son fusionados
a promotores que no son inhibidos por la presencia de glucosa y
también no requieren la xilosa para induc-
ción.
ción.
Otra realización preferida de la invención
proporciona una cepa de levadura recombinante que contiene genes que
codifican la reductasa de la xilosa, la dehidrogenasa del xilitol y
la xiluloquinasa, en donde dichos genes están fusionados a los
promotores no inhibidos por la glucosa y en donde dicha levadura es
capaz de fermentar la xilosa a etanol. La cepa de levadura
recombinante es también preferiblemente capaz de fermentar la
glucosa a etanol.
Otras realizaciones preferidas de la invención se
refieren a reactivos útiles para la producción de las levaduras
recombinantes de la invención. De este modo, la presente invención
también proporciona una molécula de DNA recombinante que comprende
genes que codifican la reductasa de la xilosa, la dehidrogenasa del
xilitol, y la xiluloquinasa. Así mismo, la invención proporciona un
vector que comprende genes que codifican la reductasa de la xilosa,
la dehidrogenasa del xilitol y la xiluloquinasa. En estos reactivos,
los genes están fusionados preferiblemente a promotores que no están
inhibidos por la glucosa y que también no requieren de la xilosa
para la inducción, de modo que se permita la producción expediente
de levaduras recombinantes capaces de fermentar de forma simultánea
la glucosa y la xilosa a eta-
nol.
nol.
Otra realización preferida de la presente
invención proporciona un método para la obtención de levaduras
recombinantes capaces de fermentar la xilosa a etanol. Este método
incluye la etapa de introducción del DNA en una levadura de modo que
provoque que la levadura tenga genes introducidos que codifican la
reductasa de la xilosa, la dehidrogenasa del xilitol y la
xiluloquinasa. De forma preferible, estos genes estarán fusionados a
los promotores no inhibidos por la glucosa para permitir de forma
simultánea la fermentación de la glucosa y de la xilosa a etanol. De
forma ventajosa, los tres genes pueden ser introducidos de forma
simultánea, por ejemplo utilizando reactivos de la invención tal
como se ha discutido anteriormente.
Todavía otra realización preferida de la
invención proporciona métodos para la fermentación de la xilosa o de
la glucosa a etanol. Estos métodos inventivos incluyen la etapa de
fermentación de un medio conteniendo xilosa o conteniendo glucosa
con una cepa de una levadura recombinante que contiene genes
introducidos que codifican la reductasa de la xilosa, la
dehidrogenasa del xilitol y la xiluloquinasa. Es deseable que los
tres genes introducidos estén fusionados a los promotores no
inhibidos por la glucosa, y que el medio contenga tanto glucosa como
xilosa, de modo que proporcione la fermentación concurrente de
xilosa y glucosa a etanol.
Otras realizaciones adicionales preferidas,
características y ventajas de la invención se harán aparentes a
partir de la siguiente descripción.
La Figura 1 es un diagrama esquemático de las
enzimas asociadas con las primeras etapas del metabolismo de la
xilosa en bacterias y levaduras.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos y
la secuencia de amino ácidos deducida del gen de la xiluloquinasa de
la levadura incluyendo sus secuencias de flanqueo de 5' y 3'. El
codón de iniciación y el codón de parada están subrayados. Las
posibles secuencias de control en las regiones no codificantes 5' y
3' se indica por flechas.
La Figura 3 muestra los genes clonados y el mapa
de restricción del plásmido pLSK15.
La Figura 4 muestra los genes clonados y el mapa
de restricción del plásmido pUCKm10.
La Figura 5 muestra los genes clonados y el mapa
de restricción del plásmido pLNH21.
La Figura 6A muestra un cromatograma de HPLC de
un caldo de fermentación obtenido por fermentación de la xilosa con
levadura SC recombinante (pLNH21) (S. cerevisiae conteniendo
genes XR, XD y XK introducidos) para 2 días (I); y 4 días (II).
La Figura 6B muestra un cromatograma de HPLC de
un caldo de fermentación obtenido por fermentación de la xilosa con
levadura SC recombinante (pLNH13-32) (S.
cerevisiae conteniendo genes introducidos XR y XD pero no XK)
durante 2 días (I); y 6 días (II).
La Figura 6C muestra un cromatograma de HPLC de
un caldo de fermentación obtenido por fermentación de la xilosa con
una levadura S. cerevisiae no de ingeniería genética (no
conteniendo ningún gen introducido XR, XD o XK) para 2 días (I); y 7
días (II), tal como se describe de forma adicional en el Ejemplo
6.
La Figura 7 muestra los genes clonados y el mapa
de restricción del plásmido pLNH33.
La Figura 8A muestra un cromatograma de HPLC de
un caldo de fermentación obtenido por fermentación de un medio
conteniendo una glucosa y xilosa (10% y 5% respectivamente) con una
cepa de levadura 1400 no de ingeniería genética (no conteniendo
genes introducidos XR, XD o XK) durante 0 días (I); y 2 días (II),
tal como se describe de forma adicional en el ejemplo 8.
La Figura 8B muestra un cromatograma de HPLC de
un caldo de fermentación obtenido por fermentación de un medio
conteniendo una glucosa y xilosa (10% y 5% respectivamente) con una
cepa de levadura 1400 recombinante (conteniendo la lavadura 1400
genes introducidos XR, XD o XK) durante 0 días (I); y 2 días (II),
tal como se describe de forma adicional en el ejemplo 8.
La Figura 9 es un de diagrama esquemático
trazando la construcción de pBluescript II KS(-) conteniendo los
genes clonados XR, XD, y XK: se construyeron cuatro de estos
plásmidos:
pKS(-)-KK-A*R-KD-1;
pKS(-)-KK-A*R-KD-2;
pKS(-)-KK-AR-KD-3;
y
pKS(-)-KK-AR-KD-4,
tal como se describe de forma adicional en el Ejemplo 4.
La Figura 10 muestra la amplificación directa del
gen de la dehidrogenasa del xilitol intacta y el XD sin promotor a
partir del DNA de cromosoma de P. stipitis por la técnica de
la reacción de la cadena de polimerasa (PCR); desde la izquierda,
Línea 1: DNA 1 digerido de los marcadores moleculares
BamHI-EcoRI; Línea 2: gen de la dehidrogenasa de
xilitol de Pichia; Línea 3: gen de la dehidrogenasa del
xilitol de Pichia (sin promotor); y Línea 4: Marcadores
moleculares, DNA \varphiX digerido de HaeIII.
Figura 11 muestra en diagrama las estrategias
utilizadas para secuenciar el gen de la xiluloquinasa de la
levadura.
La Figura 12 es un diagrama esquemático trazando
la construcción del plásmido pLNH21.
La Figura 13 muestra un cromatograma de HPLC de
un caldo de fermentación obtenido por fermentación de una mezcla de
glucosa (10%) y xilosa (5%) con S. cerevesiae SC
(pLNH13-32) (conteniendo sólo los genes XR y XD)
para 0 días (I); 2 días (II); y 5 días (III).
La Figura 14 muestra un cromatograma de HPLC del
caldo de fermentación obtenido por fermentación de una mezcla de
glucosa (10%) y xilosa (5%) con Pichia stipitis no de
ingeniería genética durante 0 días (I); 3 días (II); y 5 días
(III)
Para los objetivos de favorecer la comprensión de
los principios de la invención, ahora se hará referencia a ciertas
realizaciones de la misma y se utilizará un lenguaje específico para
describirla. Sin embargo, se entenderá que con ello no se pretende
limitar el alcance de la invención específico, de modo que
alteraciones, modificaciones adicionales y aplicaciones de los
principios de la invención tal como se ilustran en la misma estén
contempladas tal como normalmente haría un experto en la materia al
que perteneciera la invención.
La presente invención proporciona levaduras
recombinantes, moléculas de DNA y vectores que comprenden genes XR,
XD y XK. Dichos genes son bien conocidos por estar presentes en una
amplia variedad de microorganismos y, de hecho, tal como se ha
discutido anteriormente en la presente invención, numerosos genes
XR, XD y XK han sido identificados y aislados. La fuente particular
de estos genes no es crítica para los amplios aspectos de esta
invención; sino que será adecuada cualquier proteína que codifique
los DNAs (enzimas) que tenga la actividad de la reductasa de la
xilosa (la capacidad de convertir la D-xilosa en
xilitol con el NADPH o el NADH como cofactor), la actividad de la
dehidrogenasa del xilitol (la capacidad de convertir el xilitol en
D-xilulosa con el NAD^{+} como cofactor), la
actividad de la dehidrogenasa del xilitol (la capacidad para
convertir el xilitol en D-xilulosa con el NAD^{+}
como cofactor), o la actividad de la xiluloquinasa (la capacidad de
convertir la D-xilulosa en
D-xilulosa-5-fosfato).
Estos genes pueden ser obtenidos como genes que se producen de forma
natural, o pueden ser modificados, por ejemplo, por la adición,
sustitución o eliminación de bases a o de los genes de origen
natural, de modo que la proteína codificada todavía tenga actividad
XT, XD o XK. De forma similar, los genes o porciones de los mismos
pueden ser producidos de forma sintética por técnicas conocidas, de
nuevo de modo que el DNA resultante codifique una proteína que
muestre la actividad XR, XD o XK deseada.
Como ejemplos, fuentes adecuadas de genes XR y XD
incluyen levaduras que utilizan xilosa tales como Candida
shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus,
fuentes adecuadas de genes XK incluyen las levaduras anteriormente
señaladas que utilizan xilosa, así como las levaduras que no
utilizan xilosa tales como las del género Saccharomyces, por
ej., S. cerevisiae, del género Schizosaccharomyces,
por ej., Schizosaccharomyces pombe, y bacterias tales como
Escherichia coli, especies de Bacilos, especies de
Streptomyces, etc. Pueden recuperarse genes de interés de
estas fuentes utilizando metodologías convencionales. Por ejemplo,
para este objetivo pueden utilizarse técnicas de hibridación,
complementación o de PCR.
El gen XR particular utilizado en los estudios de
los solicitantes de la presente invención se clonó a partir de P.
stipitis por Reacción de la Cadena de Polimerasa (PCR) (Chen y
Ho, 1993). Los oligonucleótidos requeridos para la amplificación de
XR a partir del DNA de cromosomas por la PCR fueron sintetizados de
acuerdo con la secuencia publicada de los genes XR de P.
stipitis (Takama y col., 1991). El XR amplificado fue primero
clonado y almacenado en el plásmido pUC19. El XR clonado fue a
continuación fusionado a diferentes promotores incluyendo los
promotores del gen del plásmido TRP5 (Zalkin y Yanofsky, 1982) y el
gen de la deshidrogenasa I del alcohol de la levadura (ADC1)
(Ammerer, 1983; Bennetzen y Hall, 1982).
El gen XD utilizado en los estudios de los
solicitantes fue también clonado a partir de P. stipitis por
la PCR. Se sintetizaron los oligonucleótidos requeridos para la
amplificación de XD a partir del DNA cromosómico de Pichia de
acuerdo con la secuencia publicada del gen XD de Pichia
(Köetter y col., 1990). El XD amplificado fue también clonado en
primer lugar y almacenado en pUC19. A continuación el gen fue
subsecuentemente fusionado a promotores glicolíticos de genes de
piruvato quinasa de levaduras (PYK) (Burke y col., 1983) y genes de
gliceraldehído 3 fosfodehidrogenasa de levaduras (GPD) (Holland y
Holland, 1979).
Los solicitantes han clonado tres genes XK
diferentes, los de S. cerevisiae (Ho y Chang, 1989), de P.
tannophilus (Stevis y col., 1987) y de E. coli y han
encontrado que los tres genes pueden ser expresados de forma
efectiva en S. cerevisiae después de la fusión a un promotor
de levadura altamente eficiente. El gen de la xiluloquinasa del
S. cerevisiae fue utilizado en el trabajo ilustrativo que se
establece en la presente invención. Para ayudar a la fusión adecuada
del gen XK de la levadura a un promotor adecuado, se ha analizado la
secuencia completa de nucleótidos del gen XK de la S.
cerevisiae incluyendo su secuencia 5' y 3' no codificante y se
muestra en la Figura 2.
Una amplia variedad de promotores serán adecuados
para uso en la invención. Hablando en términos generales, se
utilizarán promotores compatibles con levaduras capaces de controlar
la transcripción de los genes de XR, XD o XK. Dichos promotores son
asequibles a partir de numerosas fuentes conocidas, incluyendo
levaduras, bacterias, y otras fuentes de células. De forma
preferible, los promotores utilizados en la invención serán
promotores eficientes, no inhibidos por la glucosa, que no requieren
xilosa para la inducción. En este respecto, un promotor
"eficiente" tal como se utiliza en la presente invención se
refiere a un promotor que proporciona un nivel elevado de
transcripción de los genes fusionados. Los promotores que tienen
estas características son también ampliamente asequibles, y su uso
en la presente invención, dadas las enseñanzas de la misma, se
encontrarán dentro del conocimiento del experto en la materia
ordinario, así como la fusión de los promotores de los genes de XR,
XD y XK, la clonación de los productos de fusión del promotor/gen en
los vectores apropiados y el uso de los vectores para transformar
levaduras. Todas estas manipulaciones pueden ser llevadas a cabo
utilizando técnicas de ingeniería genética convencionales bien
conocidas en el estado de la técnica y en la literatura.
De forma más particular, describiendo el trabajo
ilustrativo del solicitante de la presente invención, se ha
fusionado el gen de la xiluloquinasa de la levadura, XK, a los
promotores a partir del gen de la dehidrogenasa del alcohol de la
levadura (ADC1), el gen del piruvato quinasa de la levadura (PYK),
el gen TRP5 de la levadura, etc. Se utilizó el XK fusionado al
promotor TRP-5 para construir el pLNH21 (Figura 5) y
se fusionó el XK al promotor PYK para construir el pLNH33 (figura
7).
La fusión de XR, XD, y XK a promotores intactos a
partir de ADC1, PYK, GPD, etc., se llevó a cabo por clonación tanto
del fragmento que contiene el promotor específico como el gen
estructural de XR, XD, o XK en uno de los plásmidos Bluescript KS
(Stratagene, La Jolla, CA), seguido por la eliminación de los
nucleótidos no buscados de forma extra por mutagénesis específica
del sitio (Kunkel y col., 1987). De este modo la invención también
proporciona varios derivados de pBluescript II KS(-) (de aquí en
adelante nombrados como pKS(-)), conteniendo el XD clonado
(fusionado al promotor del ADC1), y XK (fusionado al promotor de la
piruvato quinasa). Estos plásmidos recombinantes son designados como
pKS(-) KD-AR (o A*R) -KK. Se construyeron cuatro de
dichos plásmidos tal como se ha señalado en la Figura 9. Estos
plásmidos tienen estructuras similares pero no idénticas. Los XR,
XD, y XK (o KD-AR (o A*R -KK) clonados de estos
plásmidos pueden ser separados del plásmido modelo pKS(-) por una
simple digestión de restricción de XhoI.
Los genes XR, XD, y XK fusionados a los
promotores adecuados fueron clonados a continuación en pLSK15
(Figura 3) o pUCKm10 (Figura 4). El pLSK15, un derivado del
pLX10-14 (Stevis y Ho, 1985), es un plásmido de bajo
número de copia con un número de copia de aproximadamente 10 en
levadura (S. cerevisiae). Contiene el replicon de 2 \mu de
la levadura que permite que el plásmido se replique de forma
autónoma en S. cerevisiae y especies íntimamente
relacionadas. El pLSK15 también contiene el gen de resistencia a la
geneticina (kanamicina) (Km^{R}) y el gen de resistencia a la
ampicilina (A_{p}^{R} y también amp^{r}) que sirven como
marcadores de selección en S. cerevisiae y otras levaduras.
El pLSK15 también contiene el gen xK fusionado al promotor de la
levadura TRP-5. De este modo, se insertaron los
genes XR y XD fusionados a secuencias no codificantes 5' conteniendo
promotores adecuados en pLSK15 para demostrar el efecto de los
plásmidos resultantes en la fermentación de la xilosa de la
levadura. Para comparar el efecto de la presencia de diferentes
genes en la fermentación de la xilosa de la levadura, también se
utilizó un plásmido conteniendo sólo XR y XD para transformar el
S. cerevisiae y la levadura resultante utilizada en las
fermentaciones comparativas. Los resultados de la fermentación de la
xilosa por S. cerevisiae no de ingeniería genética, levadura
conteniendo los genes XR, XD y XK clonados (SC(pLNH21)), y
levadura conteniendo los genes XR y XD clonados pero no el XK
(SC(pLNH13-32)) se muestran en la Figura 6A,
6B, y 6C.
El pUCKm10 (Figura 4) es un plásmido de número de
copia elevado (es decir, plásmido con un número de copia de
aproximadamente 50 o más) con un número de copia próximo a 100 en
S. cerevisiae. El pUCKm10 es un derivado de pUC9 conteniendo
el replicon 2 \mu idéntico, y los genes Km^{R}, y Ap^{R}
presentes en pLSK15. Estos fragmentos de DNA específicos sirven como
el replicon y marcadores de selección que permitan que el plásmido
se replique de forma autónoma en S. cerevisiae (y en
levaduras relacionadas) y también permiten que los transformantes de
la levadura que contiene el plásmido sean distinguibles de las
células huésped no transformadas.
Los solicitantes han construido el pUCKm10 en
base a los plásmidos recombinantes que contienen los mismos genes
XR, XD, y XK fusionados a las secuencias no codificantes adecuadas
5' conteniendo promotores adecuados. Estos vectores son diseñados
para ser útiles a todas las cepas de S. cerevisiae
transformadas y cepas de especies relacionadas. No se requieren
mutantes especiales para actuar como las cepas recipientes. De este
modo los plásmidos tales como el pLNH33 (Figura 7), así como del
pLNH21 (Figura 5), pueden ser utilizados para transformar el S.
cerevisiae industrial y otras cepas.
Se llevó a cabo la transformación de levaduras
con derivados tanto de pLSK15 o como de pUCKm10 por electroporación
utilizando de forma general el procedimiento descrito por Becker y
Guarente (1991). Se aislaron transformantes de levaduras auténticas
conteniendo derivados tanto de pLSK15 como de pUCKm10 tal como se
describe a continuación de forma adicional. El Km^{R} presente en
los plásmidos sirvió como el marcador de selección primario que
rinde cualquier célula huésped obteniendo uno de estos plásmidos
resistentes a una concentración mucho mayor de geneticina presente
en el medio. Sin embargo, algunas células de levaduras pueden ser
inducidas a hacerse resistentes al mismo nivel de geneticina de los
transformantes que contienen el plásmido. De este modo, no cada
colonia resistente a la geneticina es un verdadero transformante. Se
ha descrito que la Ap^{R} puede ser expresada en S.
cerevisiae pero el último es resistente a la ampicilina sin la
presencia de Ap^{R}. De este modo, el Ap^{R} no puede servir
como un marcador de selección para transformación de levadura
mediada por plásmido. Sin embargo, las levaduras que contienen el
Ap^{R} altamente expresado producirán suficiente penicilinasa y
harán posible identificar colonias que contienen dichas levaduras
sobre placas sólidas especiales por el ensayo de penicilinasa
(Chevallier y Aigle, 1979). Este último ensayo ha proporcionado una
técnica para identificar los verdaderos transformantes de S.
cerevisiae y otras levaduras a partir de las colonias
resistentes a la geneticina.
\newpage
Se llevó a cabo la fermentación de la xilosa de
la levadura (o xilosa y glucosa) utilizando las levaduras
recombinantes inventivas bajo condiciones anaeróbicas tal como se ha
descrito en los Ejemplos 6 a 9. Se siguió el consumo de azúcares
(xilosa y glucosa) y la formación de etanol y de otros productos
tales como xilitol durante la fermentación tomando muestras y
analizándolas por HPLC tal como se ha descrito de forma adicional en
el Ejemplo 6.
Por ejemplo, se utilizó el pLNH21 (Figura 5) para
transformar el S. cerevisiae. El transformante resultante
conteniendo pLNH21 se designó como SC (pLNH21, y puede fermentar la
xilosa al 5% casi totalmente a etanol en dos a cuatro días tal como
se demuestra en la Figura 6A.
Como un ejemplo adicional, se utilizó el pLNH33
(Figura 7) para transformar cepa de levadura 1400 que está
íntimamente relacionada con el S. cerevisiae y que tiene una
elevada tolerancia al alcohol y la temperatura (D'Amore y col.,
1989; D'Amore, 1990). La levadura resultante de la ingeniería
genética, designada como 1400 (pLNH33), puede fermentar la glucosa
al 10% y la xilosa al 5% totalmente a etanol en dos a cuatro días,
sin precisar densidades de células elevadas, tal como se muestra en
las Figuras 8A y 8B.
El pLNH33 es un plásmido más efectivo que el
pLNH21 para la fermentación de la xilosa debido a que es un plásmido
de número de copia elevado. Además, el XK en el pLNH33 está
fusionado a un promotor más eficiente que el XK en el pLNH21. El
género de S. cerevisiae también ha sido transformado con
pLNH33, designado SC(pLNH33). Aunque el SC(pLNH33) es
mucho más efectivo en la fermentación de la xilosa o mezclas de
xilosa y de glucosa que el SC(pLNH21), se encontró que el
1400(pLNH33) era más efectivo en fermentar mezclas de glucosa
y de xilosa que el SC(pLNH33). De este modo, las cepas
individuales también afectan la eficiencia de la fermentación. De
forma similar al S. cerevisiae, la cepa 1400 no de ingeniería
genética no puede utilizar o fermentar la xilosa (sola o en una
mezcla de glucosa y xilosa) tal como se muestra en la Figura 8B.
De forma general, los resultados de estos ensayos
fermentativos demuestran que es necesario que la levadura contenga
tres genes introducidos, los XR, XD y XK que han sido fusionados de
forma adecuada a promotores adecuados (preferiblemente glicolíticos
eficientes u otros promotores que no están sujetos a la inhibición
de la glucosa, y que no requieren xilosa para la inducción) y para
expresar de forma coordinada estos genes para hacer que la levadura
sea capaz de fermentar la xilosa a sólo a etanol, y no a otros
sub-productos tales como xilitol.
Los resultados demuestran además la importancia
de la clonación de un gen de xiluloquinasa (XK) en la adición al XR
y XD con el fin de hacer que las levaduras fermenten la xilosa de
forma efectiva, particularmente para fermentar tanto la glucosa como
la xilosa de forma simultánea cuando están presentes en el mismo
medio, tal como en los hidrolizados de biomasa celulósica. De forma
similar al XR y XD, el XK clonado es fusionado de forma preferible a
un glicolítico eficiente adecuado u otro promotor que no esté sujeto
a la inhibición de la glucosa, y que además no requiera la xilosa
para inducción.
También, los solicitantes han encontrado que la
levadura conteniendo sólo los XR y XD clonados sólo puede fermentar
la glucosa pero no la xilosa a etanol cuando estos dos azúcares
están presentes en el medio de cultivo juntos (ver Figura 13).
Además, los resultados de los solicitantes demuestran que es
necesario para cualquier levadura, incluyendo las levaduras que
fermentan la xilosa tales como P. stipitis y C.
shihatae contener XR, XD y XK, fusionados a promotores que no
están inhibidos por la presencia de glucosa y que también no
requieren el uso de xilosa para la inducción con el fin de ser
capaces de fermentar tanto la glucosa como la xilosa a etanol cuando
estos dos azúcares están presentes juntos en el medio de cultivo. La
Figura 13 demuestra que el S. cerevisiae y las especies
relacionadas que contienen sólo los genes XR y XD clonados,
fusionados a promotores adecuados, pueden fermentar sólo la glucosa
pero no la xilosa a etanol cuando estos dos azúcares están presentes
en el medio de cultivo. De forma similar, la Figura 14 demuestra que
el P. stipitis no de ingeniería genética conteniendo sus
genes originales XR, XD, y XK puede fermentar la xilosa cuando el
último azúcar es la única fuente de carbono del medio (los
resultados no se muestran) pero no puede fermentar la xilosa cuando
tanto la glucosa como la xilosa son las fuentes de carbono presentes
en el mismo medio.
Será bien entendido que para aquellas levaduras
que contienen niveles bajos de actividad de la xiluloquinasa, la
introducción del gen XK sirve para dos objetivos. Uno es el mejorar
el nivel de la actividad de la enzima. Niveles elevados de actividad
XK son importantes para la fermentación de levaduras de forma más
ventajosa de xilosa a etanol como opuesto al xilitol. El otro
objetivo es situar el gen bajo el control de un promotor eficiente
que no sea inhibido por la presencia de glucosa. Es bien conocido
que los microorganismos de tipo salvaje en su estado natural
incluyendo las levaduras no pueden usar otros azúcares para
crecimiento y fermentación si la glucosa está presente en el medio
de cultivo. La glucosa inhibirá la síntesis de las enzimas
requeridas para metabolizar otras moléculas de azúcar (el llamado
efecto "glucosa"). De este modo no serán preferidos los
promotores de genes para la síntesis de enzimas que metabolizan las
moléculas de azúcar excluyendo la glucosa ya que éstas no
proporcionan fermentación simultánea de los dos azúcares abundantes.
Además, se ha encontrado en el trabajo de los solicitantes que el
crecimiento de las células es también un prerrequisito para la
inducción. De este modo, los promotores que requieren la xilosa para
la inducción no son preferidos para la expresión de XR, XD o XK.
Para el objetivo de favorecer una mayor
comprensión de la presente invención y de sus ventajas, se
proporcionan los siguientes Ejemplos. Se deberá entender que estos
Ejemplos son ilustrativos, y no limitativos, en su naturaleza.
Se ha descrito previamente la síntesis de XR sin
promotor o intacto por la PCR previamente descrita (Chen y HO,
1993). Para la síntesis de XD por la PCR, se sintetizaron tres
oligonucleótidos de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de XD
(Köetter y col., 1990) y se listan a continuación:
Oligonucleótido I: pTCTAGACCACCCTAAGTCG
Oligonucleótido II: pCACACAATTAAAATGA
Oligonucleótido III: pGGATCCACTATAGTCGAAG
Los Oligonucleótidos I y II se utilizaron para
sintetizar el gen XD intacto y los oligonucleótidos II y III se
utilizaron para sintetizar el XD sin promotor tal como se muestra en
la Figura 10. El XD intacto y el XD sin promotor se clonaron en
primer lugar en el plásmido pKS(-). El XR intacto fue subclonado a
continuación en el pUCKm10 (Figura 4) y el plásmido resultante el
pUCKm10-XD, se utilizó para transformar el S.
cerevisiae por electroporación tal como se ha descrito en el
Ejemplo 5. Los transformantes de levaduras se utilizaron para
valorar la actividad de la deshidrogenasa del xilitol para demostrar
que el gen clonado está intacto y puede ser expresado en el S.
cerevisiae.
Se seleccionó la fusión del gen XD al P_{PK}
para ilustrar la fusión precisa de los genes que metabolizan la
xilosa a promotores intactos por mutagénesis dirigida al sitio.
Estos promotores son tanto promotores glicolíticos como promotores
que no serán inhibidos por la presencia de glucosa en el medio de
cultivo y tampoco requerirán la presencia de xilosa para la
inducción.
Se sintetizó el fragmento de promotor del
piruvato quinasa de la levadura de entre -910 y +23 (Burke y col.,
1983) por la PCR tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 para la
síntesis del gen XD. Tanto el fragmento P_{PK} como el XD sin
promotor fueron subclonados en el plásmido de pKS(-) y los
nucleótidos indeseados entre el P_{PK} y el gen estructural XD
intacto fueron eliminados por mutagénesis específica del sitio de
acuerdo con el procedimiento de Kunkel (Kunkel, 1987). El gen
fusionado resultante contiene entre -910 y -1 fragmentos del
promotor a partir del gen piruvato quinasa y entre +1 y +1963
nucleótidos a partir del gen XD de Pichia. El plásmido pKS(-)
resultante conteniendo P_{pk}-XD (o KD) es
designado como pKS(-)-KD o pKD2.
La clonación de un fragmento de DNA de la
levadura de 7,0 kb (S. cerevisiae) que contiene el gen
xiluloquinasa de la levadura ha sido descrito previamente (Ho y
Chang, 1989). Mediante subclonación, el gen XK ha sido localizado en
un fragmento de 2,4 kb. Se ha analizado la secuencia de nucleótidos
del fragmento de 2,4 kb. La región no codificante 5' contiene 345
nucleótidos, la región traducida contienen 2118 nucleótidos, y la
xiluloquinasa codificada por el XK tiene 591 aminoácidos tal como se
muestra en la Figura 2. La estrategia utilizada para secuenciar el
gen XK se muestra en la Figura 11.
El plásmido pMA56 (Ammerer, 1983) contiene el
promotor de la alcohol deshidrogenasa I de la levadura (P_{ADC1}).
Los solicitantes han utilizado este promotor para modificar algunos
de los genes en su trabajo. Por ejemplo, se ha fusionado el
P_{ADC1} al XR, y el gen resultante se ha designado
P_{ADC1}-XR o AR. Sin embargo, este P_{ADC1} no
está intacto y no contiene los nucleótidos -1 a -14 del promotor
ADC1 intacto (Bennetzen y may, 1982). La región -1 a -14 de un gen
normalmente es muy significativa para controlar la síntesis de
proteínas. Cualquier gen fusionado a dicho promotor tiene que
depender de su señal genética original para controlar la síntesis de
su producto proteína.
Con el fin de controlar mejor la expresión del
gen fusionado al promotor de ADC1, los solicitantes utilizaron
mutagénesis específica del sitio para añadir los nucleótidos que
faltan (-1 a -14) al promotor de ADC1 clonado en pMA56. El nuevo
promotor de ADc1 intacto es designado P*_{ADC1}. Este promotor ha
sido utilizado para modificar el XR y el gen resultante es designado
como P*_{ADC1}-XR o A*R.
La construcción del pLNH21 es representada en la
Figura 12. Se utilizó el pLNH21 para transformar el S.
cerevisiae y la cepa 1400 por electroporación bajo las
siguientes condiciones. Se centrifugaron quince ml de células de
levaduras, crecidas hasta casi la fase log (Klett Unit (KU) 130),
para eliminar el medio, se lavaron dos veces con agua fría, una vez
con sorbitol 1 M frío, y se suspendieron de nuevo en 200 \mul de
sorbitol 1 M. Se transfirieron sesenta \mul de las células en un
tubo de plástico preesterilizado de 4 ml (con tapón) y al que se
añadieron entre 0,l \mug y 1 \mug de DNA del plásmido. Se
pipetearon cincuenta \mul de las células resultantes y de la
mezcla del plásmido en una cubeta pulsador de genes preenfriados con
un tapón de electrodo de 0,2 cm y el contenido en la cubeta se
sujetó al pulso por el pulsador de genes con un controlador de
pulsos (BioRad) a 2,0 KV, 25 \muF, 200 ohms.
Inmediatamente, se añadieron a la cubeta ,50 ml
de YEPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al
2%). El contenido de la cubeta se transfirió s un nuevo tubo de
plástico esterilizado de 4 ml y se incubó a 30ºC durante 1 hora. Se
introdujeron 100 \mul de las células en placas de agar conteniendo
YEPD y 50 \mug/ml de G418 (geneticina). Se seleccionaron las
colonias de crecimiento rápido y se replicaron en otra placa
conteniendo el mismo medio. Las colonias seleccionadas se sometieron
al ensayo de ampicilina (Chevallier y Aigle, 1979) hasta que se
identificó una positiva. El procedimiento de electroporación
descrito anteriormente está basado en el descrito por Becker y
Guarente (1971). Nuestro método para la selección de los
transformantes resistentes a G418 es muy efectivo y la mayor parte
de las colonias seleccionadas que se replicaron en placas
conteniendo YEPD más 50 \mug/ml de G418 fueron positivas para el
ensayo de penicillinasa.
La transformación de la cepa 1400 con pLNH21 u
otros plásmidos fue llevada a cabo utilizando un procedimiento
similar al descrito anteriormente, excepto que las células se
hicieron crecer a 140-190 KU más que a 130 KU y las
placas YEPD para la selección inicial de transformantes después de
la electroporación contuvo 40 \mug/ml de geneticina G418 más que
50. La transformación de la cepa 1400 por los procedimientos
descritos anteriormente no fue tan efectiva como la transformación
de S. cerevisiae.
Estas tres levaduras se cultivaron aeróbicamente
en un medio YEPD rico bajo idénticas condiciones. El
(SC(pLNH13-32) fue construido por
transformación del S. cerevisiae con un plásmido, designado
como pLNH13-32, que contenía sólo las combinaciones
promotor/gen del XR y el XD. A continuación estas células de
levaduras fueron utilizadas para fermentar xilosa al 5% en un medio
YEP (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%) aeróbicamente
también bajo condiciones idénticas. Se siguió el consumo de xilosa y
la formación de etanol y de xilitol durante la fermentación tomando
muestras a intervalos adecuados y analizándolas por HPLC bajo las
siguientes condiciones.
Las muestras conteniendo el caldo de fermentación
(0,6 ml a 1,0 ml) tomadas de los cultivos se mantuvieron en tubos
Eppendorf de 1,5 ml. En primer lugar se eliminaron las células y
otros residuos por centrifugación. A continuación se filtró el
sobrenadante utilizando un aerodisco estéril (Gelman Sciences), con
filtros de jeringa de 0,2 o 0,45 mm. Se analizó el filtrado
resultante de cada muestra para determinar sus contenidos de etanol,
glucosa, xilosa, y xilitol por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), utilizando un sistema Hitachi de acuerdo con las
siguientes condiciones.
ºColumna: Aminex HPX-87C, 300 X
7,8 mm
ºFase móvil: agua
ºVelocidad de flujo: 0,8 ml/min
ºDetección: detector Hitachi
L-3350 RI
ºTemperatura: 80ºC
ºVolumen de inyección: 20 \mul
Los resultados, mostrados en las Figuras 6A, 6B,
y 6C (los picos de etanol en estas y otras Figuras son actualmente 2
½ veces menores que lo que deberían ser debido a la sensibilidad del
instrumento), demuestran que sólo la levadura de ingeniería
SC(pLNH21) conteniendo los genes XR, XD y XK clonados puede
fermentar altas concentraciones de xilosa (5%) a etanol, no la S.
cerevisiae de origen sin ingeniería genética, y tampoco no la
SC(pLNH13-32) de ingeniería que sólo contiene
los genes XD y XR clonados pero no el XK. La
SC(pLNH13-32) fermenta la xilosa
principalmente a xilitol.
Se fermentó una mezcla de glucosa y xilosa (de
aproximadamente el 10% de glucosa y el 5% de xilosa) por las cepas
1400 y 1400(pLNH33) bajo condiciones idénticas. Estas
levaduras se mantuvieron en placas de agar conteniendo el medio
adecuado y se inocularon directamente a partir de placas de agar en
50 ml de medio YEPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y
glucosa al 2%) en un frasco Erlenmeyer de 250 ml equipado con un
brazo lateral que permite la monitorización directa del crecimiento
de los cultivos de levadura por el colorímetro Klett. Los cultivos
se incubaron en un agitador a 30ºC y a 200 rpm de forma
aeróbica.
Cuando la densidad de la célula alcanzó la fase
mid-log (400 unidades Klett), se añadieron a cada
frasco 12,5 ml de glucosa (40%) y 6,25 ml de xilosa (40%). Después
de de mezcla vigorosa, se eliminó 1 ml de la mezcla del cultivo de
cada frasco para servir como muestra cero. A continuación se cerró
el frasco con una envoltura Saran para permitir que la fermentación
se llevara a cabo de forma anaeróbica. Se separaron muestras de un
ml del caldo de fermentación (con algunas células) a intervalos
adecuados (cada 24 horas) para servir como muestras para medir los
contenidos de azúcar y de etanol del caldo durante la fermentación.
Se analizaron los contenidos de etanol, glucosa, xilosa, y xilitol
de las muestras por HPLC tal como se ha descrito en el Ejemplo 6.
Los resultados, que se muestran en las Figuras 8ª y 8B, demuestran
que la levadura 1400 (pLNH33) de ingeniería genética puede fermentar
glucosa del 10% y xilosa del 5% a etanol de forma simultánea en un
tiempo de entre dos y cuatro días sin requerir una alta densidad de
célula. Por otra parte, la cepa 1400 de referencia sólo puede
convertir la glucosa a etanol pero no la xilosa. Se llevó a cabo la
fermentación bajo condiciones normales, sin que se requiriera un
medio especial, un pH especial, y también sin que se requiriera el
crecimiento de la levadura a una alta densidad de célula. De este
modo la cepa 1400(pLNH33) de ingeniería genética conteniendo
los genes XR, XD, y XK, todos fusionados a los promotores
glicolíticos y clonados en un plásmido de número de copia elevado
pUCKm10, puede fermentar altas concentraciones tanto de glucosa como
de xilosa de forma simultánea a etanol, en un tiempo de entre dos y
cuatro días con muy poco xilitol producido como un
sub-producto.
Se repitió el procedimiento de fermentación del
Ejemplo 8 excepto que se utilizó S. cerevisiae SC
(pLNH13-32) (conteniendo sólo los genes XR y XD)
como el organismo de fermentación. Los resultados, mostrados en la
Figura 13, demuestran que dicha levadura no de ingeniería genética
conteniendo sólo los genes XR y XD puede fermentar la glucosa pero
no la xilosa cuando ambos azúcares están presentes en el medio
fermentado.
Se repitió el procedimiento de fermentación del
Ejemplo 8, excepto que se utilizó Pichia stipitis como el
organismo de fermentación. Se analizaron las muestras del caldo de
fermentación por HPLC después de la fermentación durante 0 días (I);
3 días (II); y 5 días (III). Los resultados, que se muestran en la
Figura 14, demuestran que el P. stipitis sólo puede fermentar
la glucosa, pero no la xilosa cuando ambos azúcares están presentes
en el mismo medio.
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(1) General Information:
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- Applicant: Nancy Ho and George T. Tsao
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- Title of Invention: Recombinant Yeasts for Effective Fermentation of Glucose and Xylose
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- Number of Sequences: 1
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- (A)
- Addressee: Thomas Q. Henry
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- Street: Bank One Tower, Suite 3700, 111 Monument Circle
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- City: Indianapolis
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- State: Indiana
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- Computer: COMPAQ
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- Filing Date: November 8, 1993
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- Prior Application Data: None
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- Attorney Information:
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- Telephone: (317) 634-3456
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- (i)
- Sequence Characteristics
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- (A)
- Lenght: 2467 base pairs
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- Type: Nucleotide Amino Acid
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- Topology: Linear
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- Molecule Type: Genomic DNA
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- (xi)
- Sequence Description: SEQ ID NO:1:
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Claims (16)
1. Una levadura recombinante que contiene genes
introducidos que codifican la reductasa de la xilosa, la
dehidrogenasa del xilitol y la xiluloquinasa y efectiva para la
fermentación de la xilosa a etanol.
2. La levadura recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la levadura también es efectiva para la
fermentación de la glucosa a etanol.
3. La levadura recombinante de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que la levadura es del género
Saccharomyces.
4. La levadura recombinante de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que dichos genes están fusionados a
promotores no inhibidos por la glucosa y la levadura es efectiva
para la fermentación simultánea de la glucosa y la xilosa a
etanol.
5. Molécula de ADN recombinante que comprende
genes que codifican la reductasa de la xilosa, la dehidrogenasa del
xilitol y la xiluloquinasa.
6. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que la molécula de ADN recombinante está
presente en un vector efectivo para la transformación de la
levadura.
7. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la
reivindicación 5 o 6, en la que dichos genes están fusionados a
promotores no inhibidos por la glucosa.
8. Un método para la obtención de una levadura
recombinante efectiva para la fermentación de xilosa a etanol, que
comprende la introducción de DNA en una levadura de modo que haga
que la levadura tenga introducidos los genes que codifican la
reductasa de la xilosa, la dehidrogenasa del xilitol y la
xiluloquinasa.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que dicho DNA introducido comprenda genes que codifiquen la
reductasa de la xilosa, la dehidrogenasa del xilitol y la
xiluloquinasa.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que dicha levadura es del género Saccharomyces.
11. El método para la fermentación de xilosa o
glucosa a etanol, que comprende la fermentación de un medio que
contiene xilosa o glucosa con una levadura recombinante que contiene
los genes introducidos que codifican la reductasa de la xilosa, la
dehidrogenasa del xilitol y la xiluloquinasa y que es efectivo para
la fermentación de la xilosa o glucosa a etanol.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el medio contiene tanto xilosa como glucosa y la
levadura es efectiva para la fermentación tanto de la xilosa como de
la glucosa a etanol.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que la levadura es del género Saccharomyces.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dichos genes están fusionados a promotores no
inhibidos por la glucosa y la levadura es efectiva para la
fermentación simultánea de glucosa y de la xilosa a etanol.
15. La levadura recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dichos genes están fusionados a
promotores no inhibidos por la glucosa y en donde dicha levadura es
efectiva para la fermentación de la xilosa a etanol.
16. La levadura recombinante de acuerdo con la
reivindicación 15, en la que dicha levadura también es efectiva para
la fermentación de glucosa a etanol.
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