PL176399B1 - Zrekombinowane drożdże do efektywnej fermentacji glukozy i ksylozy - Google Patents

Abstract

1. Zrekombinowane drozdze do efektywnej fermentacji glukozy i ksylozy, zna- mienne tym, ze zawieraja wprowadzone geny kodujace reduktaze ksylozowa, dehydroge- naze ksylitolowa i ksylulokinaze i sa efektywne pod wzgledem przeprowadzania fermen- tacji ksylozy do etanolu. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie rzec biorąc zmodyfikowanych technikami inżynierii genetycznej drożdży, zdolnych do jednoczesnej fermentacji dwóch głównych cukrowych składników biomasy celulozowej, glukozy i ksylozy, do etanolu. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy takich drożdży, które można skonstruować przez sklonowanie genu reduktazy ksylozowej, genu dehydrogenazy ksylitolowej i genu ksylulokinazy w drożdżach zdolnych do fermentowania glukozy do etanolu.

Ostatnie badania dowiodły, że etanol jest idealnym płynnym paliwem dla samochodów. Można go stosować bezpośrednio jako paliwo czyste (100% etanol), lub w postaci mieszanki z benzyną w różnych stężeniach.

Zastosowanie etanolu do wzbogacenia lub zastąpienia benzyny może obniżyć zależność wielu państw od importowanej zagranicznej ropy naftowej, a także zapewnić zamienne paliwo dla transportu. Ponadto wykazano, że etanol jest czystszym paliwem, które uwalnia dużo mniej zanieczyszczeń do środowiska, niż normalna benzyna. Na przykład, wykazano, że stosowanie materiałów natleniających w benzynie może obniżyć emisję tlenku węgla, szkodliwego zanieczyszczenia, do powietrza. Spośród kilku środków natleniających obecnie stosowanych do zwiększenia zawartości tlenu w benzynie, etanol ma najwyższą zawartość tlenu. Agencja Ochrony Środowiska (EPA) Stanów Zjednoczonych Ameryki wykazała, że benzyna zmieszana z 10%o etanolu obniża emisję tlenku węgla o około 25% - 30%.

Jak dotąd, materiałem wyjściowym stosowanym do wytwarzania przemysłowego alkoholu przez fermentację były cukry z trzciny cukrowej lub buraków cukrowych, skrobia z kukurydzy lub innych roślin uprawnych. Jednakże, te rośliny uprawne są zbyt kosztowne do stosowania jako materiał wyjściowy do wytwarzania na dużą skalę etanolu jako paliwa.

Biomasa roślinna jest atrakcyjnym materiałem wyjściowym do wytwarzania paliwa etanolowego przez fermentację, ponieważ jest odnawialna i dostępna przy niskich kosztach i w dużych ilościach. Koncepcja stosowania alkoholu wytwarzanego przez mikrobiologiczną fermentację cukrów z biomasy roślin uprawnych powstała co najmniej dwie dekady temu. Głównymi cukrami, z materiałów celulozowych, nadającymi się do fermentacji są glukoza i ksyloza (w stosunku glukozy do ksylozy wynoszącym 2 lub 3 do 1). Najbardziej pożądane fermentacje materiałów celulozowych powinny, oczywiście, całkowicie przekształcać zarówno glukozę, jak i ksylozę, w etanol. Niestety, nawet obecnie nie znany jest pojedynczy naturalny organizm zdolny do efektywnego fermentowania zarówno glukozy, jak i ksylozy.

Drożdże szczególnie Saccharomyces, tradycyjnie stosowano do fermentowania opartych na glukozie materiałów wyjściowych do etanolu, i są one wciąż najlepszymi mikroorganizmami do przekształcania glukozy w etanol. Jednakże, stwierdzono, że drożdże fermentujące glukozę są nie tylko niezdolne do fermentowania ksylozy, ale także do wykorzystywania cukrów pentozowych do wzrostu. Nie mniej jednak, te fermentujące glukozę drożdże mogą wykorzystywać ksylulozę do wzrostu i fermentacji (figura 1), chociaż ze zróżnicowaną wydajnością Na przykład, S. cerevisiae fermentują ksylulozę bardzo słabo, podczas gdy gatunki Schizosaccharomyces robią to całkiem wydajnie (Chiang i in., 1981; Lastick i in., 1989).

Nawet chociaż drożdże fermentujące glukozę są niezdolne do wykorzystywania ksylozy zarówno do wzrostu, jak i fermentacji, istnieje wiele naturalnych drożdży, które mogą wykorzystywać ksylozę do wzrostu w warunkach tlenowych, ale nie mogą fermentować ksylozy

176 399 do etanolu. Te wykorzystujące/nie fermentujące ksylozy drożdży wykorzystują dwa enzymy reduktazę ksylozową i dehydrogenazę ksylitolową - do przekształcania ksylozy w ksylulozę. Drożdże te różnią się od większości bakterii, które wykorzystują pojedynczy enzym - izomerazę ksylozową - do przekształcania ksylozy bezpośrednio w ksylulozę (figura 1). Te drożdżowe reduktaza ksylozową i dehydrogenaza ksylitolową wymagają do działania kofaktorów: reduktaza ksylozową zależy od NADPH jako kofaktora, a dehydrogenaza ksylitolową zależy od NAD jako kofaktora. W przeciwieństwie, bakteryjna izomeraza ksylozową nie wymaga żadnego kofaktora do bezpośredniego przekształcania ksylozy w ksylulozę (figura 1)

Dwie dekady temu wiele wysiłku poświęcono próbom znalezienia nowych drożdży zdolnych do efektywnego fermentowania zarówno glukozy, jak i ksylozy, do etanolu. Chociaż nie znaleziono takich idealnych drożdży, wysiłki te zaowocowały umiarkowanym sukcesem. Na przykład, stwierdzono, że nieliczne drożdże są zdolne nie tylko do wykorzystywania ksylozy do wzrostu w warunkach tlenowych, ale także do fermentowania ksylozy do etanolu (Toivola i in., 1984; Dupreez i vander Walt, 1983), chociaż żadne z tych fermentujących ksylozę drożdży nie były w pełni efektywne w fermentowaniu ksylozy do etanolu (Jeffries, 1985). Ponadto, drożdże te są niezdolne do efektywnego fermentowania glukozy.

Spośród drożdży fermentujących ksylozę, szeroko scharakteryzowano trzy gatunki, Pachysolen tannophilus (Toivola i in., 1984), Candida shehatae (Dupreez i van der walt, 1983) i Pichia stripitis (Grootjen i in., 1990). P. stipitis i C. shihatae fer^e^t^^ ksylozę lepiej niż inne drożdże fermentujące ksylozę (Grootjen i in., 1990). Nie mniej jednak, nawet najlepsze drożdże fermentujące ksylozę pozbawione są wysokiej skuteczności fermentowania ksylozy, a także są w znacznym stopniu nieefektywne pod względem fermentowania glukozy (Jeffries, 1985).

W ubiegłej dekadzie podjęto wysiłki genetycznego zmodyfikowania tradycyjnych drożdży fermentujących glukozę, szczególnie S. cerevisiae, technikami rekombinacji' DNA. Początkowe wysiłki koncentrowały się na sklonowaniu w drożdżach genu izomerazy -ksylozowej dla nadania im zdolności przekształcania ksylozy bezpośrednio w ksylulozę w sposób niezależny od kofaktorów. Jednakże, wysiłki te nie zakończyły się sukcesem, ponieważ geny kodujące różne bakteryjne izomerazy ksylozowe są niezdolne do kierowania syntezą aktywnego enzymu w S. cerevisiae (Rosenfeld i in., 1984; Ho i in., 1983; Sarthy i in., 1987; Wilhelm i Hollenberg, 1984; Amore i in., 1989).

W ciągu ostatnich kilku lat, wysiłki mające na celu zmodyfikowanie technikami inżynierii genetycznej drożdży, szczególnie S. cerevisiae, w kierunku fermentowania ksylozy, skupiły się na klonowaniu genów kodujących reduktazę ksylozową (Takama i in., 1991; Hallbom i in., 1991; Strasser i in., 1990), dehydrogenazę ksylitolową. Koetter i in., 1990; Hallbom i in., 1990) i ksylulokinazę (Stevis i in., 1987; Chang i Ho, 1988; Ho i Chang, 1989, Deng i Ho, 1990). S. cerevisiae i inne drożdże fermentujące glukozę nie zawierają wykrywalnych aktywności reduktazy ksylozowej i dehydrogenazy ksylitolowej, ale wszystkie wydają się zawierać aktywność ksylulokinazy. A zatem, wszystkie drożdże fermentujące glukozę - mogą fermentować ksylulozę, ale robią to ze zróżnicowaną wydajnością (Deng i Ho, 1990).

Ostatnio, Koetter i in. (1990), Strasser i in. (1990) i Hallbom i in. (1990; 1991) sklonowali w S. cerevisiae zarówno gen reduktazy ksylozowej, jak i dehydrogenazy ksylitolowej. Jednakże, te genetycznie zmodyfikowane drożdże nadal nie mogą efektywnie fermentować ksylozy. Na przykład, drożdże te były niezdolne do fermentowania więcej niż 2% ksylozy. Ponadto, wytwarzały one z ksylozy duże ilości ksylitolu (Hallbom i in., 1990; Koetter i Ciriacy, 1993), który usuwa wartościowy substrat ksylozowy z pożądanego szlaku fermentacyjnego do etanolu.

Szerokie badania podstawowe w tej dziedzinie, jak przedstawione powyżej, wykazj że pomimo natężonych i długotrwałych wysiłków licznych badaczy, nie uzyskano drożdży zdolnych do efektywnego fermentowania zarówno glukozy, jak i ksylozy do etanolu. A- zatem, nadal jest zapotrzebowanie na takie drożdże i metodę ich przygotowywania i stosowania. Na te potrzeby ukierunkowany jest niniejszy wynalazek.

Osobliwość niniejszego wynalazku polega na odkryciu, że nowe szczepy drożdży, zdolne do efektywnego fermentowania ksylozy, samej lub równocześnie z glukozą, można utwo176 399 rzyć stosując techniki rekombinacji DNA i klonowania genów. Szczególnie, techniki te zastosowano do utworzenia nowych, zrekombinowanych drożdży zawierających sklonowane geny reduktazy ksylozowej (XR), dehydrogenazy ksylitolowej (XD) i ksylulokinazy (XK), które poddano fuzji z promotorami nie hamowanymi przez obecność glukozy.

Zgodnie z tym, jedno korzystne rozwiązanie wynalazku dostarcza szczep zrekombinowanych drożdży, zawierających wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową, dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę i zdolne do fermentowania ksylozy do etanolu. Szczep zrekombinowanych drożdży jest korzystnie zdolny również do fermentowania glukozy do etanolu, a korzystniej uzyskuje się takie szczepy drożdży, które mogą efektywnie fermentować te dwa cukry równocześnie do etanolu, gdzie geny XR, XD i XK są połączone z promotorami, które nie są hamowane przez obecność glukozy, i które również nie wymagają ksylozy do indukcji.

Inne korzystne rozwiązanie wynalazku dostarcza szczep zrekombinowanych drożdży zawierających geny kodujące reduktazę ksylozową, dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę, w którym rzeczone geny są połączone z promotorami nie hamowanymi przez glukozę i rzeczone drożdże są zdolne do fermentowania ksylozy do etanolu. Szczep zrekombinowanych drożdży jest korzystnie zdolny także do fermentowania glukozy do etanolu.

Inne korzystne rozwiązanie wynalazku dotyczy odczynników użytecznych do wytwarzania zrekombinowanych drożdży według wynalazku. A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza także cząsteczkę zrekombinowanego DNA, zawierającą, geny kodujące reduktazę ksylozową, dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę. Wynalazek dostarcza również wektor zawierający geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową. i ksylulokinazę. W odczynnikach tych, geny korzystnie są połączone z promotorami, których nie hamuje glukoza, i które nie wymagają, ksylozy do indukcji, tak aby stwarzały możliwość dogodnego tworzenia zrekombinowanych drożdży zdolnych do równoczesnego fermentowania glukozy i ksylozy do etanolu.

Inne korzystne rozwiązanie niniejszego wynalazku dostarcza metodę otrzymywania zrekombinowanych drożdży zdolnych do fermentowania ksylozy do etanolu. Metoda ta obejmuje etapy wprowadzania DNA do drożdży, tak aby w rezultacie drożdże miały wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę. Korzystnie, geny te będą połączone z promotorami nie hamowanymi przez glukozę, dla umożliwienia równoczesnej fermentacji glukozy i ksylozy do etanolu. Korzystnie, wszystkie trzy geny można wprowadzić równocześnie, na przykład stosując odczynniki według wynalazku, jak omówione powyżej.

Jeszcze inne korzystne rozwiązanie wynalazku dostarcza metody fermentowania ksylozy lub glukozy do etanolu. Metody według wynalazku obejmują, etap fermentowania podłoża zawierającego ksylozę lub zawierającego glukozę przez szczep zrekombinowanych drożdży zawierających wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę. Pożądane jest, aby trzy wprowadzone geny były połączone z promotorami nie hamowanymi przez glukozę, i aby podłoże zawierało zarówno glukozę, jak i ksylozę, tak aby zapewnić równoczesną fermentację ksylozy i glukozy do etanolu.

Dodatkowe korzystne rozwiązania, cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego opisu.

Figura 1 jest schematycznym diagramem enzymów związanych z wczesnymi etapami metabolizmu ksylozy w bakteriach i drożdżach.

Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową i przewidywaną sekwencję aminokwasową genu ksylulokinazy drożdży, włącznie z jego 5'-końcową i 3'-końcową sekwencjami flankującymi. Kodon inicjacji i kodon stop podkreślono. Możliwe sekwencje kontrolujące w 5'- i 3'-końcowych regionach nie kodujących wskazano strzałkami.

Figura 3 przedstawia geny sklonowane w plazmidzie pLSK15 i jego mapę restrykcyjną.

Figura 4 przedstawia geny sklonowane w plazmidzie pUCKmlO i jego mapę restrykcyjną.

Figura 5 przedstawia geny sklonowane w plazmidzie pLNH21 i jego mapę restrykcyjną.

176 399

Figura 6A przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w wyniku fermentacji ksylozy zrekombinowanymi drożdżami SC (pLNH21) (S. cerevisiae zawierające wprowadzone geny XR XD i XK) w ciągu (I) 2 dni i (II) 4 dni.

Figura 6B przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w wyniku fermentacji ksylozy zrekombinowanymi drożdżami SC (pLNH13-32) (S. cerevisiae zawierające wprowadzone geny XR, XD, ale nie XK) w ciągu (I) 2 dni i (II) 6 dni.

Figura 6C przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w wyniku fermentacji ksylozy drożdżami S. cerevisiae niezmodyfikowanymi technikami inżynierii genetycznej (nie zawierającymi żadnego wprowadzonego genu XR, XD lub XK) w ciągu (I) 2 dni i (II) 7 dni, jak dalej opisano w przykładzie 6.

Figura 7 przedstawia geny sklonowane w plazmidzie pLNH33 i jego mapę restrykcyjną.

Figura 8A przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w wyniku fermentacji podłoża zawierającego glukozę i ksylozę (odpowiednio 10% i 5%) szczepem 1400 drożdży niezmodyfikowanych technikami inżynierii genetycznej (nie zawierających żadnego wprowadzonego genu XR, XD lub XK) w ciągu (I) 0 dni i (TT) 2 dni, jak dalej opisano w przykładzie 8.

Figura 8B przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w wyniku fermentacji podłoża zawierającego glukozę i ksylozę (odpowiednio 10% i 5%) zrekombinowanymi drożdżami 1400 (pLNH33) (drożdże 1400 zawierające wprowadzone geny XR, XD i XK) w ciągu (I) 0 dni i (Π) 2 dni, jak dalej opisano w przykładzie 8.

Figura 9 jest schematycznym diagramem przedstawiającym konstruowanie pBluescript II KS (-) zawierającego sklonowane geny XR, XD i XK; skonstruowano cztery takie plazmidy: pKS(-)-KK-A*-R-KD-1, pKS(-)-KK-A*R-KD-2, pKSS(-)-KK-AR-KD-3 i pKS(-)-KK-ARKD-4, jak dalej opisano w przykładzie 4.

Figura 10 przedstawia bezpośrednią amplifikację genu nienaruszonej dehydrogenazy ksylitolowej i pozbawionej promotora XD z chromosomalnego DNA P. stipitis techniką reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR); od lewej, ścieżka 1: markery masy cząsteczkowej, DNA 1 strawiony BamHI-EcoRI; ścieżka 2: gen dehydrogenazy ksylitolowej Pichia (nienaruszony); ścieżka 3: gen dehydrogenazy ksylitolowej Pichia (pozbawiony promotora); i ścieżka 4: markery masy cząsteczkowej, dNa φΧ strawiony HaeIIL

Figura 11 diagramy strategii wykorzystanych do zsekwencjonowania genu ksylulokinazy drożdży.

Figura 12 jest schematycznym diagramem przedstawiającym konstruowanie plazmidu pLNH21.

Figura 13 przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w wyniku fermentacji mieszaniny glukozy (10%) i ksylozy (5%) za pomocą S. cerevisiae SC (pLNH13-32) (zawierającymi tylko geny xR i xD) w ciągu (I) 0 dni; (II) 2 dni; i (III) 5 dni.

Figura 14 przedstawia chromatogram HPLC brzeczki fermentacyjnej otrzymanej przez sfermentowanie mieszaniny glukozy (10%) i ksylozy (5%) za pomocą niezmodyfikowanych technikami inżynierii genetycznej Pichia stipitis w ciągu (I) 0 dni; (II) 3 dni i (III) 5 dni.

W celu ułatwienia zrozumienia zasad wynalazku, uczynione teraz zostaną odniesienia do pewnych jego rozwiązań, a do ich opisania użyty będzie specyficzny język. Nie mniej jednak, powinno być zrozumiałe, że nie jest ich zamiarem żadne ograniczenia zakresu wynalazku; uważa się, że takie zmiany, dalsze modyfikacje i zastosowania zasad wynalazku, które tu zilustrowano i które mogą przyjść normalnie na myśl specjalistom w tej dziedzinie wchodzą w zakres wynalazku.

Niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowane drożdże, cząsteczki DNA i wektory zawierające geny XR, XD i XK. Dobrze wiadomo, że takie geny występują w wielu różnorodnych mikroorganizmach i, rzeczywiście, jak dyskutowano w niniejszym opisie powyżej, zidentyfikowano i wyizolowano liczne geny XR, XD i XK. Konkretne źródło tych genów nie ma istotnego znaczenia dla szerokich aspektów tego wynalazku; raczej, odpowiednie będą jakiekolwiek DNA kodujące białka (enzymy) posiadające aktywność reduktazy ksylozowej (zdolność do przekształcania D-ksylozy w ksylitol z NADPH lub NADH jako kofaktorem), aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (zdolność do przekształcania ksylitolu

176 399 w D-ksylulozę z NAD+ jako kofaktorem) lub aktywność ksylulokinazy (zdolność do przekształcania D-ksylulozy w D-ksylulozo-5-fosforan). Geny te można otrzymać jako geny występujące naturalnie, lub można je modyfikować, na przykład przez addycję, podstawienie lub delecję zasad do lub z genu występującego naturalnie, tak długo, jak kodowane białko zachowuje aktywność XR, XD lub XK. Podobnie, geny lub ich części można wytwarzać syntetycznie znanymi technikami, tak długo, jak otrzymywany DNA koduje białko wykazujące pożądaną aktywność XR, XD lub XK.

Jako przykłady, odpowiednie źródła genów XR i XD obejmują drożdże wykorzystujące ksylozę, takie jak Candida shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, odpowiednie źródła genów XK obejmują wymienione powyżej -drożdże wykorzystujące ksylozę, jak również drożdże nie wykorzystujące ksylozy, takie jak te z rodzaju Saccharomyces, np. S. cerevisiae, rodzaju Schizosaccharomyces, np. Schizosaccharomyces pombe, i bakterie, takie jak Escherichia coli, gatunki Bacillus, gatunki Streptomyces itp. Geny będące przedmiotem zainteresowania można uzyskać z tych źródeł wykorzystując konwencjonalne metodologie. Na przykład, do tego celu można wykorzystać techniki hybrydyzacji, komplementacji lub PCR.

Konkretny gen zastosowany tu w badaniach autorów zgłoszenia sklonowano z P. stipitis przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (Chen i Ho, ' 1993). Oligonukleotydy wymagane do amplifikacji XR z chromosomalnego DNA przez PCR zsyntetyzowano według opublikowanej sekwencji genu XR P. stipitis (Takamia i in., 1991). Zamplifikowaną XR najpierw sklonowano, i przechowywano, w plazmidzie pUC19. Następnie sklonowaną XR połączono z różnymi promotorami, włącznie z promotorami TRP5 drożdży (Zalkin i Yanofsky, 1982) i genu dehydrogenazy alkoholowej I drożdży (ADCl) (Ammerer, 1983; Bennetzen i Hall, 1982).

Gen XD stosowany w badaniach autorów zgłoszenia również sklonowano przez PCR z P. stipitis. Oligonukleotydy wymagane do amplifikacji XD z chromosomalnego DNA Pichia zsyntetyzowano według opublikowanej sekwencji genu XD Pichia (Koetter i in., 1990). Zamplifikowaną XD również najpierw sklonowano i przechowywano w pUC19. Następnie gen połączono z glikolitycznymi promotorami genu kinazy pirogronianowej (PYK) drożdży (Burke i in., 1983) i genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GPD) drożdży (Holland i Holland, 1979).

Autorzy zgłoszenia sklonowali trzy różne geny XK, z S. cerevisiae (Ho i Chang, 1989), P. tannophilus (Stevis i in., 1987) i E. coli, i stwierdzili, że wszystkie trzy geny mogą ulegać efektywnej ekspresji w S. cerevisiae po fuzji z promotorem drożdżowym o wysokiej wydajności. W przykładowych badaniach tu przedstawionych użyto sklonowany gen ksylulokinazy

S. cerevisiae. Aby ułatwić właściwe przeprowadzenie fuzji genu XK drożdży z odpowiednim promotorem, zanalizowano i przedstawiono na figurze 2 całkowitą sekwencję nukleotydową genu XK S. cerevisiae, włącznie z 5'- i 3'-końcowymi sekwencjami nie kodującymi.

Do stosowania w wynalazku odpowiednich będzie szereg różnorodnych promotorów. Dokładniej mówiąc, stosować się będzie kompatybilne z drożdżami promotory zdolne do kontrolowania transkrypcji genów xR, XD lub XK. Promotory takie są dostępne z licznych znanych źródeł, włącznie z drożdżami, bakteriami i innymi źródłami komórkowymi. Korzystnie, promotory stosowane w wynalazku będą wydajnymi promotorami nie hamowanymi przez glukozę, nie wymagającymi ksylozy do indukcji. Pod tym względem, w znaczeniu tu stosowanym, „wydajny” promotor oznacza promotor, który zapewnia wysoki poziom transkrypcji fuzji genowej. Promotory posiadające te właściwości są również szeroko dostępne, a ich użycie w niniejszym wynalazku, biorąc pod uwagę informacje w nim podane, pozostaje w zakresie możliwości specjalistów w tej dziedzinie. Dotyczy to również przeprowadzania fuzji promotorów z genami XR, XD i XK, klonowania produktów fuzji promotor/gen w odpowiednich wektorach i stosowania wektorów do transformacji drożdży. Wszystkie z tych manipulacji można przeprowadzić stosując konwencjonalne techniki inżynierii genetycznej, dobrze znane w nauce i literaturze.

Bardziej szczegółowo opisując tu przykładowe prace autorów zgłoszenia, gen ksylulokinazy drożdży, XK, połączono z promotorami z genu dehydrogenazy alkoholowej (ADCl) drożdży, genu kinazy pirogronianowej (PYK) drożdży, genu TRP5 drożdży itp.

176 399

XK połączoną z promotorem TRP-5 zastosowano do skonstruowania pLNH21 (figura 5), a XK połączoną z promotorem PYK użyto do skonstruowania pLNH33 (figura 7).

Fuzje XR, Xd i XK z nienaruszonymi promotorami z ADCl, PYK, GPD itp. przeprowadzono przez sklonowanie zarówno fragmentu zawierającego specyficzny promotor, jak i gen struktury XR, XD lub XK, w jednym z plazmidów Bluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA), a następnie usunięcie nadmiaru niepożądanych nukleotydów przez ukierunkowaną mutagenezę (Kunkel i in., 1987). Wynalazek dostarcza zatem także kilka pochodnych pBluescript II KS(-) (dalej w niniejszym opisie pKS(-)), zawierający sklonowaną XD (połączoną z promotorem dehydrogenazy pirogronianowej), XR (połączoną z promotorem ADCl) i XK (połączoną z promotorem kinazy pirogronianowej). Te zrekombinowane plazmidy oznaczono jako pKS(-) KD-AR (lub A*R) -KK. Jak przedstawiono na figurze 9, skonstruowano cztery takie plazmidy. Plazmidy te mają podobną, ale nie jednakową strukturę. XR, XD i XK (lub KD-AR (lub A*R) -KK) sklonowane w tych plazmidach można oddzielić od plazmidu macierzystego pKS(-) przez pojedyncze trawienie XhoI.

Geny XR, XD i XK połączone z właściwymi promotorami sklonowano następnie w pLSK15 (figura 3) lub pUCKm10 (figura 4). pLSK15, pochodna pLX10-14 (Stevis i Ho, 1985), jest plazmidem o małej liczbie kopii, wynoszącej w drożdżach (S. cerevisiae) około 10. Zawiera on drożdżowy replikon 2 μ, który umożliwia jego autonomiczną replikację w S.' cerevisiae i · blisko spokrewnionych gatunkach. pLSK15 zawiera również gen oporności na genetycynę (kanamycynę) (KmR i gen oporności na ampicylinę (ApR a także amp^r), które służą jako markery selekcyjne w S. cerevisiae i innych drożdżach. pLSK15 zawiera również gen XK połączony z promotorem TRP-5 drożdży. A zatem, geny XR i XD, połączone z właściwymi 5'-końcowymi sekwencjami nie kodującymi zawierającymi odpowiednie promotory, wstawiono do pLSK15 dla wykazania wpływu otrzymanych plazmidów na 'fermentację ksylozy przez drożdże. Dla porównania wpływu obecności różnych genów na fermentację ksylozy przez drożdże, do transformacji S. cerevisiae użyto także plazmidu zawierającego tylko XR i XD i otrzymane drożdże zastosowano do porównawczych fermentacji. Wyniki fermentacji ksylozy przez niezmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej S. cerevisiae, drożdże zawierające sklonowane geny XR, XD i XK (SC9pLNH21)) i drożdże zawierające sklonowane geny XR i XD, ale nie Xk (SC(pLNH13-32) przedstawiono na figurach 6A, 6B i 6C.

pUCKm10 (figura 4) jest plazmidem o wysokiej liczbie kopii (tj. plazmidem o liczbie kopii około 50 lub wyższej), występującym w S. cerevisiae w liczbie bliskiej 100 kopii. pUCKm10 jest pochodną pUC9, zawierającą identyczny replikon 2μ i geny Kmi Ap^R obecne w pLSK15. Te specyficzne fragmenty DNA służą jako replikon i markery selekcyjne, umożliwiając autonomiczną replikację plazmidu w S. cerevisiae (i zbliżonych drożdżach), a także umożliwiając odróżnienie zawierających plazmid transformantów drożdżowych od niestransformpowanych komórek gospodarza.

Autorzy zgłoszenia skonstruowali oparte na pUCKm10 zrekombinowane plazmidy, które zawierają takie same XR, XD i XK połączone z właściwymi 5'-końcowymi sekwencjami nie kodującymi, zawierającymi odpowiednie promotory. Wektory te zaprojektowano tak, aby były użyteczne do transformatowania wszystkich szczepów S. cerevisiae i szczepów zbliżonych gatunków. Jako szczepy biorców nie są wymagane żadne mutanty. A zatem, plazmidy takie jak pLNH33 (figura 7), jak również pLNH21 (figura 5), można stosować do transformowania przemysłowych S. cerevisiae i innych szczepów.

Transformację drożdży pochodnymi albo pLSK15, albo pUCKm10, przeprowadzono przez elektroporację, na ogół stosując procedurę opisaną przez Beckera i Guarente (1991). Autentyczne transformanty drożdżowe zawierające pochodne albo pLSK15, albo pUCKmtO, wyizolowano w sposób dalej opisany poniżej. KmR obecny w plazmidach służył jako pierwszy marker selekcyjny, który nadaje wszystkim komórkom gospodarza otrzymującym jeden z tych plazmidów oporność na znacznie wyższe stężenie genetycyny obecnej w podłożu. Jednakże, niektóre komórki drożdży mogą ulegać indukcji stając się oporne na ten sam poziom genetycyny, jak transformanty zawierające plazmid. A zatem, nie każda kolonia oporna na genetycynę jest naprawdę stransformowana. Podawano, że ApR może ulegać ekspresji w

176 399

S. cerevisiae, ale te ostatnie są oporne na ampicylinę bez obecności ApR A zatem, Ap^R nie może służyć jako marker transformacji drożdży za pośrednictwem plazmidu: Nie mniej jednak, drożdże zawierające Ap^R o wysokim poziomie ekspresji, będą wytwarzać dostateczna, ilość penicylinazy, umożliwiającą identyfikację kolonii zawierających takie drożdże na specjalnych płytkach z podłożem stałym przez test na penicylinazę (Chevallier i Aigle, 1979). Ten ostatni test zapewnił technikę identyfikacji prawdziwych treansormantów S. cerevisiae i innych drożdży z kolonii opornych na genetycynę.

Fermentację ksylozy (lub ksylozy i glukozy) przez drożdże przeprowadzono stosując zrekombinowane według wynalazku drożdże w warunkach beztlenowych, jak opisano w przykładach od 6 do 9. Zużycie cukrów (ksylozy i glukozy) i tworzenie produktów takich jak ksylitol monitorowano podczas fermentacji przez pobieranie próbek i analizowanie ich techniką HPLC, jak dalej opisano w przykładzie 6.

Na przykład, do transformacji S. cerevisiae zastosowano plazmid pLNH21 (figura 5). Otrzymany transformant zawierający pLNH21 oznaczono SC(pLNH21); jak przedstawiono na figurze 6A, może on przeprowadzać fermentację 5% ksylozy prawie całkowicie do etanolu w ciągu dwóch do czterech dni.

Jako dodatkowy przykład, do transformacji szczepu drożdży 1400, który jest ściśle zbliżony do S. cerevisiae i wykazuje dużą tolerancję wobec alkoholu i temperatury (D’Amore i in., 1989; D’Amore, 1990) wykorzystano pLNH33 (figura 7). Otrzymane zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej drożdże, oznaczone 1400 (pLNH33), mogą przeprowadzać fermentację 10% glukozy i 5% ksylozy całkowicie do etanolu w ciągu dwóch do czterech dni, nie wymagając wysokiej gęstości komórek, jak przedstawiono na figurach 8A i 8B.

pLNH jest bardziej efektywnym plazmidem niż pLNH21 pod względem fermentacji ksylozy, ponieważ jest on plazmidem o wyższej liczbie kopii. Ponadto, XK w pLNH33 jest połączony z bardziej wydajnym promotorem, niż XK w pLNH21. S. cerevisiae stransformowano również pLNH33, oznaczając je SC(pLNH33). Chociaż SC(pLNH33) są bardziej efektywne pod względem fermentowania ksylozy lub mieszanin ksylozy i glukozy, niż SC(pLNH21), stwierdzono, że 1400(pLNH33) są bardziej efektywne pod względem fermentowania mieszanin glukozy i ksylozy, niż SC(pLNH33). A zatem, poszczególne szczepy także wpływają na wydajność fermentacji. Podobnie jak S. cerevisiae, niezmodyfikowany technikami inżynierii genetycznej szczep 1400 nie może wykorzystywać lub fermentować ksylozy (samej lub w mieszaninie glukozy i ksylozy), jak przedstawiono na figurze 8B.

Ogólnie rzec biorąc, wyniki tych testów fermentacyjnych wykazują że aby uczynić drożdże zdolnymi do fermentowania ksylozy tylko do etanolu, a nie do innych produktów, takich jak ksylitol, jest konieczne, by drożdże zawierały trzy wprowadzone geny, XR, XD i XK, które zostały właściwie połączone z odpowiednimi promotorami (korzystnie wydajnymi promotorami glikolitycznymi lub innymi, które nie podlegają hamowaniu przez glukozę i nie wymagają, ksylozy do indukcji), i by zachodziła skoordynowana ekspresja tych genów.

Wyniki wykazują dalej ważność sklonowania genu ksylulokinazy (XK) poza XR i XD w celu uczynienia fermentacji ksylozy przez drożdże wydajną szczególnie fermentacji zarówno glukozy, jak i ksylozy równocześnie, gdy są one obecne w tym samym podłożu, tak jak w hydrolizatach biomasy celulozowej. Podobnie do XR i XD, sklonowaną XK łączy się korzystnie z odpowiednim wydajnym promotorem glikolitycznym lub innym, który nie podlega hamowaniu przez glukozę i który ponadto nie wymaga ksylozy do indukcji.

Autorzy zgłoszenia stwierdzili także, że drożdże zawierające tylko sklonowane XR i XD, mogą fermentować jedynie glukozę, ale ' nie ksylozę, do etanolu, gdy oba te cukry obecne są razem w podłożu hodowlanym (patrz figura 13). Co więcej, wyniki autorów zgłoszenia wykazują że aby jakiekolwiek drożdże, włącznie z tymi fermentującymi ksylozę, takimi jak P. stipitis i C. shihatae, były zdolne do fermentowania zarówno glukozy, jak i ksylozy, gdy oba te cukry są obecne razem w podłożu hodowlanym, konieczne jest, by zawierały XR, xD i XK, połączone z promotorami, które nie są hamowane w obecności glukozy i które nie wymagają również stosowania ksylozy do indukcji. Figura 13 wykazuje, że S. cerevisiae i zbliżone gatunki zawierające tylko sklonowane geny XR i XD, połączone z właściwymi promotorami, mogą jedynie fermentować glukozę, ale nie ksylozę, do etanolu, gdy oba te

176 399 cukry obecne są w podłożu hodowlanym. Podobnie figura 14 wykazuje, że nie poddane zabiegom inżynierii genetycznej P. stipitis, zawierające swoje oryginalne XR, XD i XK, mogą fermentować ksylozę, gdy cukier ten jest jedynym źródłem węgla w podłożu (dane nie przedstawione), ale nie mogą fermentować ksylozy, gdy zarówno glukoza, jak i ksyloza, są źródłami węgla obecnymi w tym samym podłożu.

Powinno być zrozumiałe, że dla tych drożdży, które zawieraj ją niskie poziomy aktywności ksylulokinazy, wprowadzenie genu XK służy dwóm celom. Jednym jest poprawienie poziomu aktywności enzymatycznej. Wysokie poziomy aktywności XK są ważne dla korzystniejszej fermentacji przez drożdże ksylozy do etanolu, zamiast do ksylitolu. Drugim jest umieszczenie genu pod -kontrolą wydajnego promotora, który nie będzie hamowany w obecności glukozy. Dobrze wiadomo, że naturalne mikroorganizmy typu dzikiego, włącznie z drożdżami, nie mogą wykorzystywać innych cukrów do wzrostu i fermentacji, jeśli glukoza jest obecna w podłożu hodowlanym. Glukoza będzie hamować syntezę enzymów wymaganych metabolizowania cząsteczek innych cukrów (tak zwany efekt glukozowy). A zatem, promotory genów do syntezy enzymów metabolizujących cząsteczki cukrów, z wyłączeniem glukozy, nie będą korzystne, ponieważ nie będą zapewniały równoczesnej fermentacji dwóch obecnych w obfitości cukrów. Ponadto, w pracach autorów zgłoszenia stwierdzono, że do indukcji jako warunek wstępny wymagany jest-również wzrost komórek. A zatem, promotory wymagające ksylozy do indukcji nie są korzystne do ekspresji XR, XD lub XK.

W celu ułatwienia dalszego zrozumienia niniejszego wynalazku i jego zalet, podano poniższe przykłady. Powinno być zrozumiałe, że przykłady te mają charakter tylko ilustrujący, a nie ograniczający.

Przykładl . Syntetyzowanie genów XR i XD metodą PCR.

Syntezę nienaruszonej lub pozbawionej promotora XR metodą PCR opisano uprzednio (Chen i Ilo, 1993). Do syntezy XD metodą PCR zsyntetyzowano trzy oligonukleotydy, przedstawione poniżej, zgodnie z sekwencjąnukleotydowąXD (Koetter et al., 1990):

Oligonukleotyd I: pTCTAGACCATAAGTCG

Oligunukleotyd II: pCACACAATTAAAATGA

Oligonukleotyd III: pGGATCCACTATAGTCGAAG

Oligonukleotydów I i II użyto do zsyntetyzowania nienaruszonego genu XD, a oligonukleotydów II i III użyto do zsyntetyzowania XD pozbawionego promotora, jak przedstawiono na figurze 10. Nienaruszony XD i pozbawiony promotora XD sklonowano najpierw w plazmidzie pKS(-). Nienaruszony XR zsubklonowano następnie w pUCKm10 (figura 4), a powstały plazmid pUCKm10-XD użyto do transformacji drożdży S. cerevisiae metodą elektroporacji, jak opisano w przykładzie 5. Transformanty drożdży użyto do oznaczenia aktywności dehydrogenazy ksylitolu, aby wykazać, że klonowany gen jest nienaruszony i może ulegać ekspresji w S. cerevisiae.

Przykład 2.Fuzja genu XD pozbawionego promotora z promotorem genu kinazy pirogronianowej drożdży.

Do zilustrowania dokładnej fuzji genów metabolizmu ksylozy z nienaruszonymi promotorami przez ukierunkowaną mutagenezę wybrano fuzję genu XD z Pp_K. Promotory te są albo promotorami glikolitycznymi, albo promotorami, które nie będą hamowane w obecności glukozy w podłożu hodowlanym, a także nie będą wymagały obecności ksylozy do indukcji.

Fragment promotorowy kinazy pirogronianowej drożdży od -910 do +23 (Burkę et al., 1983) zsyytetyzzwano metooą PCR, jako opisano w przykładzie 1 dla synteey genn PXD Zarówno fragment Ρρκ, jak i pozbawiony promotora XD zaubklonowdoo w plazmidzie pKS(-), a niepożądane oukleotndn między Ρρκ a oinoaruazponm genem strukturalnym XD usunięto przez ukierunkowaną mutagenezę zgodnie z procedurą Kunkera (Kunkel, 1987). Otrzymdon poddany fuzji gen zawiera fragmenty promotora od -910 do -1 z genu kioksy pizoezoniaoowej i nukleotydy +1 do +1963 z genu xD Pichia. Otrzymany plazmid pKS(-), zawierający PpK-XD (lub KD) oznaczono jako pKS (-)-KD or pKD2.

Przykład 3. Analiza sekwencji oukleotzdownj genu ksyluloOindyy drożdży.

O sklonowaniu fragmentu DNA o długości 7,0 kb z drożdży (S. cerevisiae), zawierającego gen kaylulokioksy drożdży, donoszono uprzednio (Ilo i Chang, 1989). Przez zaubklonowdoin

176 399 gen XK umieszczono we fragmencie o długości 2,4 kb. Analizowano sekwencję nukleotydową fragmentu 2,4 kb. 5'-końcowy region nie kodujący zawiera 345 nukleotydów, region ulegający translacji zawiera 2118 nukleotydów, a ksylulokinaza kodowana przez XK posiada 591 aminokwasów, jak przedstawiono na figurze 2. Strategię użytą do sekwencjonowania genu XK przedstawiono na figurze 11.

Przykład 4. Konstruowanie nienaruszonego promotora ADCl.

Plazmid pMA56 (Ammerer, 1983) zawiera promotor drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I (Padc)- Autorzy zgłoszenia zastosowali w swojej pracy ten promotor do zmodyfikowania pewnych genów. Na przykład, połączono P_Adci ^z a otrzymany gen oznaczono Padc^R lub AR. Jednakże, taki Padc nie jest nienaruszony i nie zawiera nukleotydów od -1 do -14 nienaruszonego promotora ADCl (Bennetzen i Hall, 1982). Region genu od -1 do -14 jest zwykle bardzo istotny dla kontroli syntezy białka. Każdy gen połączony z takim promotora musi polegać na swoim oryginalnym sygnale genetycznym do kontrolowania syntezy swojego produktu białkowego.

W celu lepszej kontroli ekspresji genu połączonego z promotorem ADCl, autorzy zgłoszenia zastosowali ukierunkowaną mutagenezę do dodania brakujących nukleotydów (od -1 do -14) do promotora ADCl sklonowanego w pMA56. Nowy nienaruszony promotor ADCl oznaczono P*adci· Tego promotora użyto do modyfikacji XR, a otrzymany gen oznaczono P*adciXR lub A*R.

Przykład 5. Konstruowanie plazmidu pLNH21 (oznaczanego także pLSK15-KD-AR) i transformacja S. cerevisiae i 1400 pLNH21

Konstrukcję pLNH21 przedstawiono na figurze 12. pLNH21 użyto do transformacji

S. cerevisiae i szczepu 1400 metodą elektroporacji w następujących warunkach: 50 ml komórek drożdży, rosnących do wczesnej fazy wzrostu logarytmicznego (130 jednostek Klett (KU)) odwirowano dla usunięcia podłoża, dwukrotnie przemyto zimną wodą, jeden raz zimnym 1 M sorbitolem i ponownie zawieszono w 200 μΐ 1 M sorbitolu. Sześćdziesiąt pl komórek przeniesiono do uprzednio wyjałowionej plastykowej probówki o objętości 4 ml (z zakrętką), do której dodano 0,1 pg do 1 pg plazmidowego DNA. Pięćdziesiąt μΐ otrzymanej mieszaniny komórek i plazmidu odpipetowano do schłodzonej kuwety aparatu do elektroporacji z odstępem pomiędzy elektrodami 0,2 cm, i zawartość kuwety poddano impulsom w aparacie do elektroporacji z kontrolerem impulsów (BioRad) przy 2,0 KV, 25 pF, 200 omów.

Natychmiast dodano do kuwety 0,50 ml podłoża YEPD (1% ekstrat drożdżowy, 2% pepton i 2°/o glukoza). Zawartość kuwety przeniesiono do nowej wyjałowionej plastykowej probówki o objętości 4 ml i inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 1 godziny. 100 pl komórek wysiewano na płytki agarowe zawierające YEPD i 50 pg/ml G418 (genetycyny). Szybko rosnące kolonie selekcjonowano i replikowano na inną płytkę, zawierającą to samo podłoże. Wybrane kolonie poddawano testowi ampicylinowemu (Chevallier i Aigle, 1979) do zidentyfikowania tych pozytywnych. Opisana powyżej procedura elektroporacji jest oparta na procedurze Beckera i Guarente (1971). Nasza metoda selekcji tranformantów opornych na G418 jest bardzo skuteczna i większość selekcjonowanych kolonii replikowanych na płytkach zawierających YEPD i 50 pg/ml G418 było pozytywnych w teście na penicylinazę.

Transformację szczepu 1400 pLNH21 lub innymi plazmidami przeprowadzono przy zastosowaniu procedury podobnej do opisanej powyżej, z wyjątkiem tego, że komórki hodowano raczej do 140-190 KU, a nie do 130 KU, i że płytki YEPD do wstępnej selekcji transformantów po elektroporacji zawierały raczej 40 pg/ml genetycyny G418, a nie 50. Transformacja szczepu 1400 opisanymi powyżej procedurami nie była taka efektywna, jak transformacja S. cerevisiae.

Przykład 6. Fermentacja ksylozy przez zmodyfikowanie technikami inżynierii genetycznej SC(pLNH21), SC(pLNH 13-32) i niezmodyfikowane macierzyste S. cerevisiae.

Te trzy szczepy drożdży hodowano w bogatym podłożu YEPD w identycznych warunkach tlenowych (SC(pLNH 13-32) skonstruowano przez stransformatowanie S. cerevisiae plazmidem oznaczonym pLNH 13-32, który zawiera tylko kombinacje gen XR i XD/promotor). Te komórki drożdżowe użyto następnie do beztlenowej fermentacji 5% ksylozy w podłożu

176 399

YEP (1% ekstrat drożdżowy, 2% pepton), również w identycznych warunkach. Podczas fermentacji śledzono zużycie ksylozy i powstawanie etanolu i ksylitolu poprzez pobieranie próbek w odpowiednich odstępach czasu i analizowanie ich za pomocą HPLC w poniższych warunkach.

Próbki zawierające brzeczkę fermentacyjną (0,6 ml do 1 ml), pobrane z hodowli trzymano w probówkach Eppendorfa o objętości 1,5 ml. Komórki i inne pozostałości usuwano najpierw przez wirowanie. Następnie supernatant sączono przy użyciu jałowych aerodysków (Gelman Sciences), filtrów strzykawkowych, o średnicy 0,2 lub 0,45 mm. Otrzymany przesącz z każdej próbki analizowano pod względem zawartości etanolu, glukozy, ksylozy i ksylitolu przez wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), przy użyciu układu Hitachi, zgodnie z następującymi warunkami:

°Kolumna: Aminex HPX-87C, 300x78 mm °Faza ruchoma: woda °Szybkość przepływu: 0,8 ml/min °Detekcja: detektor Hitachi L-3350 RI °Temperatura: 80°C °Objętość iniekcji: 20 μΐ

Wyniki przedstawione na figurach 6A, 6B i 6C (piki etanolu na tych i innych figurach są rzeczywiście 2,5 raza niższe, niż być powinny, z powodu czułości instrumentu), wykazują, że tylko zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej drożdże SC(pLNH21), zawierające sklonowane XR, XD i XK, mogą fermentować wysokie stężenia ksylozy (5%) do etanolu, a niezmodyfikowane macierzyste S. cerevisiae, ani także zmodyfikowane SC(pLNH1332), które zawierają tylko sklonowane XD i XR, a nie zawierają XK. SC(pLNH13-32) fermentują ksylozę głównie do ksylitolu.

Przykład 8. Efektywna fermentacji wysokich stężeń zarówno glukozy, jak i ksylozy do etanolu przez 1400(pLNH33)

Mieszaninę glukozy i ksylozy (około 10% glukoza i 5% ksyloza) fermentowano szczepem 1400 i 1400(pLNMH33) w identycznych warunkach. Drożdże te trzymano na płytkach agarowych zawierających odpowiednie podłoża i inokulowano bezpośrednio z płytek agarowych do 50 ml podłoża YEPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton i 2% glukoza) w kolbach Erlenmeyera o objętości 250 ml, wyposażonych w ramię boczne, co pozwala na bezpośrednie monitorowanie wzrostu hodowli drożdży przy użyciu kolorymetru Klett’a. Hodowle inkubowano w warunkach tlenowych w wytrząsarce w temperaturze 30°C przy 200 obrotów na minutę.

Kiedy gęstość komórek osiągnęła środkową fazę wzrostu logarytmicznego (400 KU), do każdej kolby dodano 12,5 ml (40%) glukozy i 6,25 ml (40%) ksylozy. Po dokładnym wymieszaniu pobierano z kolby 1 ml mieszaniny hodowlanej, . służącej jako próba zerowa. Następnie kolbę zamknięto przylegającą membraną Saran, aby umożliwić przeprowadzenie fermentacji w warunkach beztlenowych. Próbki o objętości jednego ml pobierano z brzeczki fermentacyjnej (z pewną ilością komórek) w odpowiednich odstępach czasu (co 24 godziny), służące do pomiarów zawartości cukru i etanolu w brzeczce podczas fermentacji. Zawartość etanolu, glukozy, ksylozy i ksylitolu w próbkach analizowano przez HPLC, jak opisano - w przykładzie 6. Wyniki, przedstawione na figurach 8A i 8B, wykazują, że zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej drożdże 1400(pLNH33) mogą fermentować 10% glukozę i 5% ksylozę równocześnie do etanolu w ciągu czterech dni, nie wymagając wysokiej gęstości komórek. Z drugiej strony, macierzysty szczep 1400 może przekształcać w etanol jedynie glukozę, ale nie ksylozę. Fermentację prowadzono w identycznych normalnych warunkach, bez wymagania specjalnego podłoża, specjalnego pH, a także bez wymagań wzrostu drożdży do wysokiej gęstości komórek. A zatem, genetycznie zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej 1400(p.LNH33), zawierające XR, XD i XK, wszystkie połączone z promotorami glikolitycznymi i sklonowane w plazmidzie o wysokiej liczbie kopii, pUCKm10, mogą w ciągu dwóch do czterech dni fermentować do etanolu wysokie stężenia zarówno glukozy, jak i ksylozy równocześnie, przy bardzo niewielkim wytwarzaniu ksylitolu jako produktu ubocznego.

176 399

Przykład 9. Próba fermentacji ksylozy/glukozy przez zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej SC(pLNH13-032).

Procedurę fermentacji z przykładu 8 powtórzono, z wyjątkiem zastosowania S. cerevisiae SC(pLNH13-32) (zawierających tylko geny XR i XD) jako organizmu fermentującego. Wyniki, przedstawione na figurze 13, wykazuuą że tak zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej drożdże zawierające tylko geny XR i XD mogą fermentować glukozę, ale nie ksylozę, gdy oba te cukry są obecne w fermentowanym podłożu.

Przykład 10. Próba fermentacji ksylozy/glukozy za pomocą niezmodyfikowanych technikami inżynierii genetycznej Pichia stipitis.

Procedurę fermentacji z przykładu 8 powtórzono, z wyjątkiem zastosowania niezmodyfikowanego Pichia stipitis jako organizmu fermentującego. Próbki brzeczki fermentacyjnej analizowano przez HPLC po fermentacji w ciągu (I) 0 dni, (II) 3 dni i (III) 5 dni. Wyniki, przedstawione na figurze 14, wykazują, że P. stipitis mogą fermentować tylko glukozę, ale nie ksylozę, gdy oba te cukry są obecne w fermentowanym podłożu.

Chociaż wynalazek zilustrowano i szczegółowo opisano na rysunkach i w powyższym opisie, to należy rozumieć, że ma to charakter ilustrujący, a nie ograniczający i, że przedstawiono i opisano tylko korzystne rozwiązania, a wszystkie zmiany i modyfikacje, pozostające w duchu wynalazku podlegają ochronie.

SPIS LITERATURY

Następujące pozycje literaturowe, specyficznie włączono poprzez odnośniki literaturowe w zakresie, w którym podają one przykładowe szczegóły proceduralne lub inne, dodatkowe do podanych w niniejszym opisie.

Ammerer, G., „Expression of genes in yeast using the ADCl promoter”, Methods in Enzymol. 101,192-201 (1983).

Amore, R., M. Wilhelm, i C.P. Hollenberg, „The fermentation of xylose: An analysis of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 30(4), 351-357 (1989).

Becker, D., i L. Guarente. „High efficiency transformation of yeast by electroporation”, Methods in Enzymol. 194,182-186 (1991).

Bennetzen, J. L. i B. D. Hall, „The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae gene for alcohol dehydrogenase I”, J. Biol. Chem., 25.7(6), 3018-3025 (1982).

Burke, R. L., P. Tekamp-Olson, i R. Najarian, „The isolation, characterization, and sequence of the pyruvate kinase gene of Saccharomyces cerevisiae”, J. Biol. Chem. 258(4) 2193-2201 (1983).

Chang. S. F. i N. W. Y. Ho, „Cloning the yeast xylulokinase gene for the improvement of xylose fermentation”. Appl. Biochem Biotechnol. 17, 313-318 (1988).

Chen, Zhengdao, i N. W. Y. HO, „Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae”, Appl. Biochem. Biotechnol., 39-40, 135-147 (1993).

Chevallier, M. R. i M. Aigle, „Qualitative detection of penicillinase produced by yeast strains carrying chimeric yeast-coli plasmids”, FEBS Letters, 108(1) 179-184 (1979).

Chiang, L-C, H-Y. Hsiao, P. P. Ueng. L-F. Chem, i G. T. Tsao. „Ethanol production from xylose by enzymic isomerization and yeast fermentation”, Biotechnol. Bioeng., 11, 263274(1981).

D’Amore, C.G., I. Russell, i G. G. Stewart, „Selection and optimization of yeast suitable for ethanol production at 40°C”, Enz. Microbiol. Technol., 11, 411 (1989).

D’Amore, T., C. J. Panchal, I. Russell, i G.G. Stewart, „A study ' of ethanol tolerance in yeast: Critical Reviews”, Biotechnol., 9, 287 (1990).

Deng, X. X. i N. W. Y. Ho, „Xylulokinase activity in various yeasts including Saccharomyces cerevisiae containing the cloned xylulokinase gene”, Appl. Biochem. Biotechnol., 24-25, 193 (1990).

DuPreez, J. C. i J. P. van der Walt, „Fermentation of D-xylose to ethanol by a strain by Candida shehatae”, Biotechnol. Lett., 5, 357-362 (1983).

176 399

Grootjen, D. R. J., R. G. J. M. van der lans, i K. Ch. A. M. Luyben. „Effects of the aeration rate on the fermentation of glucose and xylose by Pichia stipitis CBS 5773, Enzyme Microb. Technol., 12, 20-23 (1990).

Hallbom, J., M. Walfridsson, U. Airaksinen, H. Ojamo, B. Hahn-Hagerdal, M. Penttila, i S. Keranen, „Xylitol production by recombinant Saccharomyces cerevisiae”, Bio/Technol., 9, 1090(1991).

Ho, N. W. Y., i S-F. Chang, „Cloning of yeast xylulokinase gene by complementation of E. coli and yeast and yeast mutations”, Enzyme Microb. Technol., 11, 417 (1989).

Ho, N. W. Y., P. Stevis, S, Rosenfeld, J. J. Huang, i G. T. Tsao, „Expression of E. coli xylose isomerase gene by a yeast promoter”, Biotechnology and Bioenginering Symposium, No. 13,245-250(1983).

Holland, J. P. i M. J. Holland, „The primary structure of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene from Saccharomyces cerevisiae”, J. Biol. Chem. 253(19) 9839-9845 (1979).

Jeffries, T. W., „Emerging technology for fermenting D-xylose: Trends in biotechnology 3(8), 208-212 (1985).

Jeffries, T. W., „Utilization of xylose by bacteria, yeasts, and fungi”, Adv. in Biochem. Engr. Biotechnol. 27, 1-32 (1983).

Koetter. P., R. Amore, C. P. Hollenberg, i M. Ciriacy, „Isolation and characterization of the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene, XYL2, and construcion of a xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae transformant”, Curr. Genet., 18,493-500 (1990).

Kotter. P. i M. Ciriacy, „Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 38,776-783 (1993).

Kunkel. T. A., J. P. Roberts, i R. a. Zakour, „Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”, Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987).

Lastick, S., M. Y. Tucker, J. R. Beyett, G. R. Noll, i K. Grohmann. „Simultaneous fermentation and isomerization of xylose to ethanol”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 574-579 (1989).

Rosenfeld, S., P. Stevis, i N. W. Y. Ho, „Cloning and characterization of the xyl genes from E. coli”, Mol. Gen. Genetics, 194, 410-415 (1984).

Sarthy, A. V., i in., „Expression of the E. coli xylose isomerase gene in S. cerevisiae, Appl. Environ. Microb., 53, 1996-2000 (1987).

Stevis. P. A., J. J. Huang, N. W. Y. Ho, „Cloning of the pachysolen tannophilus xylulokinase gene by complementation in Escherichia coli”. Appl. Environ. Micro. (53) 1, 29752977(1987).

Stevis. P. A. i N. W. Y. Ho, „Overproduction of D-xylose isomerase in E. coli by Cloning the D-xylose Isomerase gene”, Enzyme Microb. Technol., Vol. 7, pp. 592-596 (1985).

Strasser, A. W. M., C. P. Hollenberg, M. Ciriacy, P. Koetter, R. Amore, M. Piontek, i J. Hagedorn, „Cloning of yeast xylose reductase and xylitol dehydrogenase genes and their use”, German patent application (1990).

Takuma, S., N. Nakashima, M. Tantirungkij, S. Kinoshita, H. Okada, T. Seki, i ' T. Yoshida, „Isolation of xylose reductase gene of Pichia stipitis and its expression in Saccharomyces cerevisiae”, Appl. Biochem. Biotechnol., 27-28, 327 (1991).

Toivola, A., D. Yarrow, E. van den Bosch, J. P. van Dijken, i W. A. Scheffers. „Alcoholic fermentation of D-xylose by yeasts”, Appl. Environ. Microbiol., 47(6), 1221-1223 (1984).

Wilhelm, M., i C. P. Hollenberg, „Selective cloning of Bacillus subtilis xylose isomerase and xylulokinase in E. coli genes by IS5-mediated expression”, the EMBO Journal, 3, 2555-2560 (1984).

Zalkin, H. i C. Yanofsky, J. Biol. Chem. 257, 1491-1500 (1982).

176 399 (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Nancy Ho i George T. Tsao (ii) TYTUŁ. WYNALAZKU: Zrekombinowane drożdże do efektywnej fermentacji glukozy i ksylozy (iii) LICZBA SEKWENCJI: 1 (iv) ADRES DO KORESONNENNCJI:

(A) ADRESAT: Thomas Q. Henry (b) ULICA: Bank One Tower. Suitę 3700. 111

Monument Circle (C) MIEJSCOWOŚĆ: Indianapolis (N) STAN: Indiana (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) ZIP: 46204 (iv) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka; 3,5 cala; 1,4 Mb (B) KOMPUTER: COMPAQ (c) SYSTEM OPERACYJNY: MS-NOS (N) OPROGRAMOWANIE: ASCII (vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOZENIA: brak (viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU:

(A) NAZWISKO: Thomas Q. Henry (B) NUMER REJESTRACYJNY: 28 309 (c) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE: PUR17/18 (ix) IIFOOMMCNJ. TELEKKMUMUKCNJJA:

(A) TELEFON: (317) 634-3456 (B) TELEFAX: (317) 637-7561 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) NłUGOŚĆ: 2467 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (c) ILOŚĆ NICI: dwie (N) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RONZAJ CZĄSTECZKI: NNA genomowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

JNEFTJFJKCNJCFJM 1:

OG^NC^GA CCATTATTCC ATCAGAATGG A:^:^:^:^:^(3^^'nr ACCCGATNCN 5 0

GGAGATTTTG TTCTTCTGAG CTTCTGCTGT CCTTG9AAAAC AAATTATTCC 10 0

GCTGGCCGCN CCAAACANAAA ACCAACCCCGA TTTJAAr/A^CA TTGTNACAGT 150

A^^GA^TT TTCTTTTTAC AAAATTACCAT TTCCAGCTTA CTACTTCCTA 200

TA^TCNTC^ TCTTCAGCAA GCGACGCAGG GAATAGCCGC TGAGGTGCAT 250

TTTCAATTCG GCCAATGCCAA TCTCAGGCGG CCGCCTCCGG 300

GGGCCCTCTC GAG/GAKAACA GAGATTAGTA CTTTA ATG TTG 3 51

Met Leu 1

176 399

TGT Cys

TCA Ser

GTA VaU 5

ATT Iie

CAG Gic

AGA Arg

CAG Gin

ACA Thr 10

AGA Arg

GĄG Giu

GTT Vai

TCC Ser

AAC Asn 15

AAA Thr

393

ATG

TCT

TTA

GAC

TCA

TAC

TAT

CTT

Gm

TTT

GAT

CTT

TCG

ACC

435

Met

Ser

Leu

Asp 20

Ser

Tyr

Tyr

Leu

Gly 25

Phe

Asp

Leu

Ser

Thr 30

CAA

CAA

CTG

AAA

TGT

CTC

GCC

ATT

AAC

CAG

GAC

CTA

/GA

ATT

477

Gin

Gln

Leu

Lys

Cys 35

Leu

Aia

Iie

^sil

Gln 40

Asp

Leu

Ly s

I le

GTC

CAT

TCA

GAA

ACA

GTG

GH

TTT

GAA

AAG

GAT

CTT

CCG

CAT

559

Vai 45

His

Ser

Giu

Thr

Val 50

Giu

Phe

Giu

Lys

Asp 55

Leu

Pro

His

TAT

CAC

ACA

/GG

AAG

GGT

GTC

TAT

ATA

CAC

GGC

GAC

ACT

ATC

5(51

Tyr

His 60

Thr

Lys

Lys

Gly

Vai 5 5

Tyr

Ile

His

Gly

Asp 70

Thr

Iie

GAA

TGT

CCC

GTA

GCC

ATG

TGG

TTA

GGG

GCT

CTA

GAT

CTG

GTT

600

Giu

Cys

Pro 75

Vai

Aia

Met

Trp

Leu 80

Gly

Aia

Leu

Asp

1 .eu 85

Vai

CTC

TCG

AAA

TAT

CCC

GAG

GCT

AAA

TTT

CCA

TTG

AAC

AAA

GTT

644

Leu

Ser

Lys

Tyr 90

Arg

Giu

Aia

Lys

Phe 95

Pro

Leu

Asn

Lys

VaU 110

ATG

GCC

GTC

TCA

GGG

TC.C

TGC

CAG

CAG

CAC

GGG

TCT

GTC

TAC

807

Met

Ala

Vai

Ser

Gly 105

Ser

Cys

Gin

Gin

His 110

Gly

S^ r

Val

tt r

TGG

TCC

TCT

CAA

GCC

GAA

TCT

CTG

TTA

GAG

CAA

TTG

ΑΛΤ

AAG

709

Tip 115

Ser

Ser

Gin

Aia

Giu 112

Ser

Leu

Leu

Giu

Gin 115

Leu

Asn

Lys

AAA

CCG

G/G

HG

GAT

TTA

TTG

CAC

TAC

GTG

AGC

TCT

GTA

Gt^A

771

Lys

Pro 130

Giu

Lys

Aa p

Leu

Leu 155

His

Tyr

Val

Ser

Se r 140

Val

AAa

TTT

GCA

AGG

ACC

GCC

CCC

AAT

TGG

CAA

GAC

CAC

AGT

ACT

881

Phe

Ala

Arg 145

Gin

Thr

Aia

Pro

Asn 150

Trp

Gln

Asp

His

S^ir 115

Tlir

GCA

AAG

CAA

TGT

CCA

GAG

TTT

GAA

GAG

TGC

ATA

GGT

GGG

CCT

885

Ala

Lys

Gln

Cys 160

AGn

GGu

Phe

Giu

Giu 165

Cys

He

Gly

Gly

Pro 110

GAA

AAA

ATG

GCT

CCA

TTA

ACA

GGG

TCC

AGA

GCC

CAT

rrr

AGA

893

Glu

Lys

Met;

Ala

dn 175

Leu

Thr

Giy

Ser

Arg 100

Ala

Ηί s

Pili

Ary

176 399

TAT Tyr

GAC Asp 570

TCT Ser

AAT Asn

AAA Lys

ATT lle

GCA Ala 575

GTT Va 1

CCT Ppo

TTT Fhe

GAT AAP

AAA Lys 580

TTT hhe

CTG Leu

2031

AAT

GAC

AAA

PTT

CCA

TGG

CAT

GTA

ATG

GAA

AGC

ATA

TCC

GAT

2073

Asn

Asp

Asn 585

Phe

hro

Trp

His

Val 590

Mer

Glu

Ser

1 1 e

Ser 595

Asp

GTG

GAT

AAA

GAA

AAT

TGG

ATC

GGT

AA’T

ATT

CCA

AGA

TTG

TCC

2115

Val

Asp

Asn

Glu 600

Asn

Trp

Ile

Ala

Ile 605

Ile

hro

Arg

Leu

Ser 610

CCT TAAGCGAACT GGAAAAGACT CTCATCTAAA ATATGTTTGA ATAATTTATC 2168 Pro

ATGCCCTGAC AAGTACACAC AAACACAGAC ACATAATATA CATACATATA 2218 TATATATCAC CGTTATTATG CGTGCACATG ACAATGCCCT TGTATGTTTC 2268 GTATACTGTA GCAAGTAGTC ATCATTTTGT TCCCCGTTCG GAAAATGACA 2318 AAAAGTAAAA TCAATAAATG AAGAGTAAAA AACAATTTAT GAAAGGGTGA 2368 GCGACCAGCA ACGAGAGAGA CAAATCAAAT TAGCGCTTTC CAGTGAGAAT 2418 ATAAGAGAGC ATTGAAAGAG CTAGGTTATT GTTAAATCAT CTCGAGCTC 2467

176 399

TTT Phe 185

ACT Thr

GGT Gly

CCT Pro

CAA Gln

ATT 1le 190

CTG Leu

AAA Lys

ATT 1 le

GCA Ala

CAA Gln 200

TTA Leu

GAA Glu

CCA Pro

939

GAA

GCT

TAC

GAA

AAA

ACA

AAG

ACC

ATT

TCT

TTA

GTG

TCT

AAT

981

Glu

Ala 205

Tyr

Glu

Lys

Thr

Lys 210

Thr

1le

Ser

Leu

Val 215

Ser

Asn

TTT

TTG

ACT

TCT

ATC

TTA

GTG

GGC

CAT

CTT

GTT

GAA

TTA

GAG

1023

Phe

Leu

Thr 220

Ser

1le

Leu

Val

Gly 222

His

Leu

Val

Glu

Leu 23 0

Glu

GAG

GCA

GAT

GCC

TGT

GGT

ATG

AAC

CTT

TAT

GAT

ATA

CGT

GAA

1005

Glu

Ala

Asp

Ala 235

Cys

Gly

Met

Asn

Leu 225

Tyr

Asp

1le

Arg

Glu 24 55

AGA

AAA

TTC

ATG

TAT

GAG

CTA

CTA

CAT

CTA

ATT

GAT

AGT

TCT

1107

Arg

Lys

Phe

Met

Tyr 250

Glu

Leu

Leu

His

Leu 2955

1le

Asp

Ser

Ser

TCT

AAG

GAT

AAA

ACT

ATC

AGA

CAA

AAA

TTA

ATG

AGA

GCA

CCC

1159

Se r 260

Lys

Asp

Lys-

Thr

1le 265

Arg

Gln

Lys

Leu

Met 270

Arg

Ala

Pro

ATG

AAA

AAT

TTG

ATA

GCG

GGT

ACCA TCTGTAAA

TA T

TTT

ATT

9191

Me t

Lys 275

Asn

Leu

1le

Ala

Gly 220

Thr

1le

Cys

Lys

Tyr 225

Phe

1le

GAG

AAG

TAC

GGT

TTC

AAT·

ACA

AAC

TGC

AAG

GTC

TCT

CCC

ATG

1233

Glu

Lys

Tyr 290

Gly

Phe

Asn

Thr

Asn 330

Cys

Lys

Val

Ser

Pro 3395

Met

ACT

GGG

GAT

ATT

TTA

GCC

ACT

ATA

TGT

TCT

TTA

CCC

CTG

CGG

1275

Thr

Gly

Asp

Asn 310

Leu

Ala

Thr

1le

Cys 332

Ser

Leu

Pro

Leu

Arg 332

AA Ge

AAT

GAC

GTT

CTC

GTT

TCC

CTA

GGA

ACA

AGT

ACT

ACA

GTT

1317

Lys

Asn

Asp

Val

Leu 330

Val

Ser

Leu

Gly

Thr 335

Ser

Th r

Thr

Val

CTT

CTG

GTC

ACC

GAT

AAG

TAT

CAC

CCC

TCT

CCG

AAC

TAT

CAT

13 9 9

Leu 340

Leu

Val

Thr

Asp

Lys 345

Tyr

His

Pro

Ser

Pro 330

Asn

Tyr

His

CTT

TTC

ATT

CAT

CCA

ACT

CTG

CCA

AAC

CAT

TAT

ATG

GGT

ATG

1501

Leu

Phe 355

Ile

His

Pro '

Thr

Leu 330

Pro

Asn

His

Tyr

Met 3 3 5

Gly

Met

ATT

TGT

TAT

TGT

AAT

GGT

TCT

TTG

GCA

AGG

GAG

AGG

ATA

AGA

1553

1 le

Cys

Tyr 370

Cys

Asn ·

Gly

Ser

Leu 337

Ala

Arg

Glu

Arg

1J e 338

Arg

176 399

GAC Asp

GAG Glu

TTA Leu

AAC Asn 385

AAA Lys

GAA Glu

CGG Arg

GAA Glu

AAT Asn 330

AAT Asn

TAT Tyr

GAG Glu

AAG Lys

ACT Thr 400

14 85

AAC

GAT

TGG

ACT

CTT

TTT

AAT

CAA

GCT

GTG

CTA

GAT

GAC

TCA

1527

Asn

Asp

Trp

Thr

Leu 005

Phe

Asn

Gln

Ala

Val 400

Leu

Asp

Asp

Ser

GAA

AGT

AGT

GAA

AAT

GAA

TTA

GGT

GTA

TAT

ttt

CCT

CTG

GGG

1055

Glu 015

Ser

Ser

Glu

Asn

Glu 420

Leu

Gly

Val

Tyr

Phe 425

Pro

Leu

Gly

GAG

ATC

GTT

CCT

AGC

GTA

AAA

GCC

ATA

AAC

AAA

AGG

GTT

ATC

1011

Glu

Ile 430

Val

Pro

Ser

Val

Lys 433

Ala

Ile

Asn

Lys

Arg 440

Val

lle

TTC

AAT

CCA

AAA

ACG

GGT

ATG

ATT

GAA

AGA

GAG

GTG

GCC

AAG

1053

Phe

Asn

Pro 005

Lys

Thr

Gly

Met

Ile 450

Glu

Arg

Glu

Val

Ala 455

Lys

TTC

AAA

GAC

AAG

AGG

CAC

GAT

GCC

AAA

AAT

ATT

GTA

GAA

TCA

105 05

Phe

Lys

Asp

Lys 060

Arg

His

Asp

Ala

Lys 405

Asn

Ile

Val

Glu

Ser 407

CAG

GCT

TTA

AGT

TGC

AGG

GTA

AGA

ATA

TCT

CCC

CTG

CTT

TCG

1073

Gln

Ala

Leu

Ser

Cys 075

Arg

Val

Arg

I le

Ser 408

Pro

Leu

Leu

Ser

GAT

TCA

AAC

GCA

AGC

TCA

CAA

CAG

AGA

CTG

AAC

GAA

GAT

ACA

1077

Asp 0 83

Se r

Asn

Ala

Ser

Ser 490

Gln

Gln

Arg

Leu

Asn 495

Glu

Asp

Thr

ATC

GTG

AAG

TTT

GAT

TAC

GAT

GAA

TCT

CCG

CTG

CGG

GAC

TAC

1081

Ile

Val 500

Lys

Phe

Asp

Tyr

Asp 550

Glu

Ser

Pro

Leu

Arg 550

Asp

Tyr

CTA

AAT

AAA

AGG

CCA

GAA

AGG

ACT

TTT

TTT

GTA

GGT

GGG

GCT

1085

Leu

Asn

Lys 515

Arg

Pro

Glu

Arg

Thr 520

Phe

Phe

Val

Gly

Gly 5 5 Si

Ala

TCT

AAA

AAC

GAT

GCT

ATT

GTG

AAG

AAG

TTT

GCT

CAA

GTC

ATT

1005

Ser

Lys

Asn

Asp

Ala

Ile

Val

Lys

Lys

Phe

Ala

Gln

Val

I le

530 535 540

GGT

GCT

ACA

AAG

GGT AAT

TTT

AGG

CTA

GAA ACA

CCA

AAC

TCA

19447

G ly

Ala

Thr

Lys

Gly Asn

Fhe

Ary

Leu

Glu ,Thr

Pro

Asn

Ser

505

555

TGT

GCC

CTT

GGT

GGT.TGT

TAT

AAG

GCC

ATG TGG

TCA

TTG

TTA

1908

Cys

Ala

Leu

Gly

Gly Cys

Tyr

Lys .

Ala

Met Trp

Ser

Leu

Leu

353

555

565

176 399

D-ksylulozo-5- fosforan

Szlak pentozofosforanowy

Szlaki metabolizmu ksylozy w mikroorganizmach Drożdże nie wykorzystujące ksylozy (Saccharomyces ¹ cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,itp)

- Drożdże wykorzystujące ksylozę (Candida shehatae,

Pichia stipitis, Pachysolen tennophilus, itp)

------ Bakterie (E.coli, gatunki Bacillus, gatunki Strepto myces, itp)

Fig·-1176 399

GGATCCAACACCATTAYYCCAYCAGAAYGGAAJIAAACYYYTIAAAGATCACGGAGAYYYYGTYCYTCYCACCYYCYGCTGTCCTIG.IAIACAAAYYATYCCGCYCGCCCCCCCAAACAAAA

71 ACAACCCCGAYYYAAYAACAYYGYCACAGYAYYACAAAYYYYCYYYYYACAAAYYACCAYYYCCAGCYYACYACYYCCYAYAAYCCYCAATCYYCAGCAACCGACGCACCGAAYACCCCC

11 TCACCYCCAYAACYGYCACYYYYCAAYYCGGCCAAYGCAAYCYCAGGCGCACGAAYAAGGCCCCCCYCYCCAGAAAAACAAAACCAGGAYCAGAYYAGYACTYYAilGYYCYGYYCAGYA

H L C S V

161 ATTCACACACAGACAACAGAGCTTTCCAACACAATCTCTTTAGACTCATACTATCTTGGGTTTCATCTTTCGACCCAACAACTCAAATGTCTCCCCATTAACCAGCACCJAAAAATTCTC

IORO7REVSH7HSLDSYYLCrDLS7O<łLXCLAIHODLKIV

I ? (, CArTCACAAACACYGGAAYnCAAAACGAYCYYCCGCAYYAYCACACAAACAAGGCYCYCYAYAYACACCGCGACACYAYCGAjlYCYCCCGYAGCCAYGYGCYYAGCCCCYCYAGAYCTC

IISEYVErEKDLPHYItYXKGVYIIICDYIECPVAHIłLGALOL

Ml

GYrCYCYCC.AAAYAYCGCGACGCYAAAYYYCCAYYCAACAAAGYYAYGGC^GYCYCAGCGYCCYGCCACCACCACGGGYCYGYCYACYGGYCCrCCCAAGCCCAAYCYCYGYYACACCAA ι/i. sxyreaxfp'lnkvhavsgscoohgsvyhssoaeslleo

I7 1 TTGAA YAACAAACCCGAAAAAGAYTYATYCCACYACGYGAGCYCYCYAGCATYYGCAAGGCAAACCCCCCCCAATYCGCAACACCACAGYACTCCAAACCAAYGYCAAGACYYYCAACAC

LHXXPEXnLLIIYVSSVArARQYAPII’.;QDIISYAXOCOErEE

Ml TGCZ.YACCYCCCGCYCAAAAAAYCCCYCAAYYAACAGGGYCCACACCCCAYYYYAGAYYYACYCCYCCYGAAAYYCYCAAAAYYCCACAAYYAGAACCACAACCYYACGAAAAAACAAAC

CICCPEKHAOI. TCSRAlirRrTCPOJI. KJAOLEPE ΛΥΕΚΤΚ

IGI ACCA7T7CT77ACrC7CTAA7T7TT7GAC77C7ATCT7AC7GGGCCA7CT7G77CAA77AGAGCAGCCACA7CCC7C7CGTA7CAACCTT7A7CATA7ACC7CAAAGAAAA77CA7C7A7

I S L VSMrLYSILVGIILVELEEAOACCMHLYBIRERXrMY

GAI CAGC7AC7ACATC7AAT7GATACTTCTTC7AACGA7AAAAC7A7CACACAAAAAT7AA7GACAGCACCCATGAAAAAT77GA7AGCCCC7ACCAYCTC7AAA7A77T7ATTCACAAC7AC

CI. LIII. I0SSSK0X7IR0XLHRAPHXHLIACYICXYFIEKT • 70 I GGT rTCAArACAAACTCCAACCTC7C7CCCA7CAC7GGCCA7AA7T7ACCCAC7A7A7C77CTr7ACCCC7GCCGAACAATGACCT7C7CGT77CCC7AGCAACAAC7AC7ACACT7CT7

C^rHTHCXVSPII7G0Hl. ATICSI. PLRKI<DVLVSLC7S77VL •171 CTGGrCACCCATAAGTATCACCCCTCTCCGAACTATCATCTTTTCATTCATCCAACTCTGCCAAACCATTATATGGGTATGATTTCTTATTCTAATCGTTCTrTGGCAAGOGAGACCATA llATOKYHPSPHYlILflllPTLPIłllTHCHlCYCHCSLARERI

III ayagaogacttaaacaaacaaccgcaaaayaattaycacaacacyaacgayycgacycytyyyaaycatigcygyccyacatgacycacaaagyacygaaaaygaayyaggygyayattyy

ROSI. IIKE REHHrEKTHDHTLrilOAVLOOSESSEMELGVrr '551 CCYG7CGCCGAGATCC7TCC7AGCC7AAAAGCCA7AAACAAAAGCCT7A7C77CAA7CCAAAAACGCG7ATCA7TGAAACACACG7CCCCAAC77CAAAGACAAGACCCACCATCCCAAA

P I. GEIVPSVKAIHXRV[rilPKTCHIEREVAXrKOKRIIDAK

611 ΛΛΤΛΓ 7C7AGAA7CAG\CCCTT7AAGT7GCACGG7AACAATA7C7CCCC7CC7T7CGGAT7CAAACGCAACC7CACAACACACAC7GAACGA71GA7ACAA7CG7GAAGT7TCAT7ACCA7 ll|VESOALSCRVRXSPLLSOSH AJSOQRI. ΙΙΕΒΤίνκΓΒΥΒ

ROI CM7C7CCCC7CCCCCAC7ACC7AAA7AAAACCCCACAAAGGAC7TT7T77GTACC7CCGCCTTC7AAAĄACGATCC7A77C7CAACAAC777GC7CAAC7CAT7GC7GC7ACAAAGGC7

ESPLRDYLIIKRPER7rrvcGASKŃ0AIVKKrAQVIGA7KC ?2I AATYYYACGCYAGAAACACCAAACYCAYGYCCCCYYGGYCGYYGYYAYAAGCCCAYGYCCYCATYCYTATAYCACYCYAAYAAAATYGCAGTYCCTTYYGAYAAATTTCYGAAYCACAAY

NrRLE7PNSCALGCCYXAHWSLLYDSHKIAVPrOXrLHDH

ΓΙ1 nTCCArCCCAYCTAAYCCAAACCAYAYCCGAYCYCCAYAAYCJlAAAYYCCAYCCCYAYAAYYCCAACAYYCYCCCCYlińCCCAACYCCAAAACACYCYCAYCYAAAAYAYCYYYCAAY rrWHVHESISDVDNEHWIAI IPRLSP

101 AATTTATCATCCCCYCACAAGYACACACAAACACAGACACAYAAYAYACAYACAYAYAYAYAYAYCACCCYTAYYAYCCGYr.CACAYCACAAYCCCCYYCYAYGTYYCCYAYACTGYACC ;t I AAG7AC7CA7CATTT7CTTCCCCG77CCGAAAA7CACAAAAAC7AAAA7CAA7AAA7CAACAG7AAAAAACAA7T7A7CAAAGGC7GACCGACCAGCAACGACACAGACAAA7CAAAT7A

->

101 CCCCTYYCCAGYCACAAYAYAAGACACCAYYCAAACACCYACCYYAYYCYYATlAYCAYCYCCACCrC

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   I. Zrekombinowane drożdże do efektywnej fermentacji glukozy i ksylozy, znamienne tym, że zawierają wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę i są efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji ksylozy do etanolu.
2. 2. Zrekombinowane drożdże według zastrz. 1, znamienne tym, że są również efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji glukozy do etanolu.
3. 3. Zrekombinowane drożdże według zastrz. 2, znamienne tym, że rzeczone drożdże należą do rodzaju Saccharomyces.
4. 4. Zrekombinowane drożdże według zastrz. 3, znamienne tym, że rzeczone geny tworzą fuzję z promotorami nie hamowanymi glukozą i tym, że drożdże są efektywne pod względem przeprowadzania jednoczesnej fermentacji glukozy i ksylozy do etanolu.
5. 5. Zrekombinowana cząsteczka DNA, znamienna tym, że zawiera geny kodujące reduktazę ksylozową, dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę.
6. 6. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że rzeczone geny tworzą fuzję z promotorami nie hamowanymi glukozą.
7. 7. Wektor, znamienny tym, że jest efektywny pod względem transformowania drożdży i zawiera geny kodujące reduktazę ksylozową, dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę.
8. 8. Wektor według zastrz. 7, znamienny tym, że rzeczone geny tworzą fuzję z promotorami nie hamowanymi glukozą.
9. 9. Metoda otrzymywania zrekombinowanych drożdży efektywnych pod względem przeprowadzania fermentacji ksylozy do etanolu, znamienna tym, że obejmuje, wprowadzanie DNA do drożdży, tak aby drożdże posiadały wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę.
10. 10. Metoda według zastrz. 9, znamienna tym, że rzeczony wprowadzany DNA zawiera geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę.

    II. Metoda według zastrz. 9, znamienna tym, że rzeczone drożdże należą do rodzaju Saccharomyces.
11. 12. Metoda przeprowadzania fermentacji ksylozy do etanolu, znamienna tym, że obejmuje przeprowadzanie fermentacji podłoża zawierającego ksylozę przez zrekombinowane drożdże posiadające wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę i efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji ksylozy do etanolu.
12. 13. Metoda według zastrz. 10, znamienna tym, że podłoże zawiera także glukozę i drożdże są również efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji glukozy do etanolu.
13. 14. Metoda według zastrz. 13, znamienna tym, że drożdże należą do rodzaju Saccharomyces.
14. 15. Metoda według zastrz. 14, znamienna tym, że rzeczone geny tworzą fuzję z promotorami nie hamowanymi glukozą i tym, że drożdże są efektywne pod względem przeprowadzania jednoczesnej fermentacji glukozy i ksylozy do etanolu.
15. 16. Metoda przeprowadzania fermentacji glukozy do etanolu, znamienna tym, że obejmuje przeprowadzanie fermentacji podłoża zawierającego glukozę przez zrekombinowane drożdże posiadające wprowadzone geny kodujące reduktazę ksylozową dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę i efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji ksylozy i glukozy do etanolu.
16. 17. Metoda według zastrz. 16, znamienna tym, że rzeczone podłoże zawiera także ksylozę.

    176 399
17. 18. Metoda według zastrz. 17, znamienna tym, że rzeczone drożdże należą do rodzaju Saccharomyces.
18. 19. Zrekombinowane drożdże zawierające geny kodujące reduktazę ksylozową, dehydrogenazę ksylitolową i ksylulokinazę, znamienne tym, że rzeczone geny tworzą, fuzję z promotorami nie hamowanymi glukozą i tym, że rzeczone drożdże są efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji ksylozy do etanolu.
19. 20. Zrekombinowane drożdże według zastrz. 19, znamienne tym, że rzeczone drożdże są również efektywne pod względem przeprowadzania fermentacji glukozy do etanolu.