CN101743310A

CN101743310A - 全局转录机器的改造

Info

Publication number: CN101743310A
Application number: CN200780050968A
Authority: CN
Inventors: 哈尔·S·阿尔珀; 格里戈里·斯特凡诺普洛斯; 杰拉尔德·芬克
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2010-06-16
Also published as: EP2099910A2; WO2008133665A2; AU2007352393A1; JP2010512147A; US20100291648A1; EP2407541A1; WO2008133665A3; KR20090127868A

Abstract

本发明涉及改造全局转录机器以产生具有改进表型的改造细胞。

Description

全局转录机器的改造

政府利益

该工作由能源部在拨款号DE-FG02-97ER14487下提供部分资金。政府在本发明中具有某些权利。

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2006年12月7日提交的美国临时申请序列号60/873,419的权益，其全部公开内容通过参考并入本文中。

技术领域

本发明涉及改造全局转录机器以产生具有改进表型的改造细胞，以及这些细胞在生产方法中的用途。

背景技术

现在公认，许多重要细胞表型(从疾病状态到代谢物过量产生)受到许多基因的影响。然而，由于载体构建和转化效率的实验限制，多数细胞及代谢改造方法几乎完全依赖单基因的缺失或过表达。这些限制排除了同时研究多基因修饰，并将基因修饰研究局限在一次修饰一个基因的限制性顺次方法中。

美国专利5,686,283描述了由rpoS编码的σ因子用于激活在细菌细胞中休眠或低水平表达的其他细菌基因表达的用途。然而，该专利未描述诱变σ因子以全局式地改变基因转录。

美国专利5,200,341提供了鉴定为温度敏感型rpoD基因抑制子的突变rpoH基因，所述鉴定通过选择包含温度敏感性rpoD基因的温度抗性突变体菌株来实现。未进行细菌诱变，也未针对除温度抗性以外的表型对抑制子菌株进行选择。当在经修饰而表达异源蛋白质的其他细菌中加入突变rpoH基因时，该异源蛋白质以更高的水平在该细菌中积累。

美国专利6,156,532描述了通过引入编码热休克蛋白的基因和编码σ因子的基因(rpoH)来进行修饰的微生物，所述σ因子特异性作用于热休克蛋白基因，从而增强细胞中热休克蛋白的表达量。该经修饰的微生物可用于生产发酵产品，如氨基酸。该微生物中使用的σ因子未突变。

已通过改组(shuffling)细菌基因组而对微生物应用定向进化，用于链霉菌的抗生素(泰乐菌素)产生(Zhang等，Nature，415，644-646(2002))以及乳杆菌的耐酸性(Patnaik等，Nature Biotech.20，707-712(2002))。这些方法不靶向任何特定基因的突变，而是使用原生质体融合来非重组地改组具有期望表型的菌株的基因组，然后选择改进了期望表型的菌株。

发明概述

本发明应用全局转录机器(global transcription machinery)改造来产生具有改进表型的改造细胞。特别地，本发明涉及产生在整个基因组水平上具有不同启动子偏好的突变酵母RNA聚合酶II因子例如TATA结合蛋白(SPT15)。通过引入突变的RNA聚合酶II因子得到的细胞具有快速且显著的表型改进，如对有害培养条件的耐受或者提高的代谢物产生。

结合定向进化的方法和概念，将突变体转录机器引入细胞允许人们以高通量方式研究大大扩展的研究领域，这通过评估同时发生的多基因改变从而改进复杂的细胞表型来实现。

通过反复多轮诱变和选择进行的定向进化已成功地扩展了抗体和酶的特性(W.P.Stemmer，Nature 370，389-91(1994))。最近，这些概念已在对启动子活性文库的检索中延伸和应用到DNA的非编码功能区，所述文库跨越以不同方式衡量的宽强度动态范围(H.Alper，C.Fischer，E.Nevoigt，G.Stephanopoulos，Proc Natl Acad Sci USA 102，12678-12683(2005))。然而，还没有基于进化的方法涉及将系统性修饰全局转录机器作为改进细胞表型的手段。然而，详尽的生物化学研究提示，给定启动子序列的转录速率和体外偏好均可通过修饰细菌σ因子上的关键残基来改变(D.A.Siegele，J.C.Hu，W.A.Walter，C.A.Gross，J Mol Biol 206，591-603(1989)；T.Gardella，H.Moyle，M.M.Susskind，J Mol Biol 206，579-590(1989))。这些修饰的转录机器单元提供引入同时发生的全局转录水平变化的独特机会，所述全局转录水平变化可能以非常复杂的方式影响细胞特性。

在本文中就酵母和SPT15描述本发明，但是本发明可广泛适用于其他真核细胞，尤其是真菌，因为其涉及乙醇生产以及这些真核细胞中相关的RNA聚合酶II因子。本文所述的特定突变可在其他细胞中SPT15直系同源物的相应氨基酸位置复制，得到基本相似的结果。同样，可使用其他氨基酸(优选作为突变氨基酸的保守性替换的氨基酸)来代替本文的突变体SPT15基因中所用的特定氨基酸替换，得到基本相似的结果。因此，本发明包括其他真核细胞和这些细胞的相应全局转录机器用于改进表型特征的用途，所述表型特征尤其是对培养基中葡萄糖(和其他糖)和/或乙醇的耐受性，和/或细胞由本领域已知的多种原料来生产乙醇。

根据本发明的一个方面，提供了经遗传修饰的酵母菌株。该菌株包含突变的SPT15基因。任选地，在引入突变的SPT15基因或者突变内源SPT15基因之前，不含有突变SPT15基因的酵母菌株与野生型酵母菌株相比就具有改进的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产。相对于野生型酵母和不含突变SPT15基因的酵母菌株而言，突变的SPT15基因进一步改进乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产。

在一些实施方案中，突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中两个或更多位置上包含突变，优选地在所有三个位置(F177、Y195和K218)上包含突变。在一些优选的实施方案中，突变的SPT15基因包含突变F177S、Y195H和K218R中的两个或更多个或者该突变氨基酸的保守性替换，优选地包含F177S、Y195H和K218R的全部或者该突变氨基酸的保守性替换。

在另一些实施方案中，突变的SPT15基因在经遗传修饰的酵母菌株中重组表达。在一些实施方案中，突变的SPT15基因在质粒上引入酵母细胞中，或引入酵母细胞的基因组DNA中。在另一些实施方案中，突变的SPT15基因是酵母细胞基因组DNA中原位突变的内源基因。

在另一些实施方案中，酵母菌株选自酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Paffia spp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candidaspp.)、Talaromyces spp.、酒香酵母(Brettanomyces spp.)、Pachysolen spp.、德巴利酵母(Debaryomyces spp.)和工业多倍体酵母菌株。优选地，酵母菌株为酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。

在一些实施方案中，不含突变的SPT15基因的酵母菌株是这样的酵母菌株，其经遗传改造、选择而具有用于增强乙醇生产的一种或多种期望的表型，或者已知具有这样的表型。优选地，所述一种或多种期望的表型是乙醇耐受性和/或C5或C6糖发酵提高。C5和C6糖发酵提高的表型优选地是木糖发酵提高。在这些后面的实施方案的某些中，所述经遗传修饰的酵母菌株转化有外源木糖异构酶基因、外源木糖还原酶基因和外源木糖醇脱氢酶基因和/或外源木酮糖激酶基因。在另一些实施方案中，经遗传修饰的酵母菌株包含进一步的遗传修饰，其为非特异性或特异性的醛糖还原酶基因的缺失、木糖醇脱氢酶基因的缺失和/或木酮糖激酶的过表达。

在另一些实施方案中，不含突变的SPT15基因的酵母菌株是呼吸缺陷型的酵母菌株。在一些实施方案中，该酵母菌株显示正常或提高的Spt3表达和/或不是Spt3敲除或无效突变体。

根据本发明的另一方面，提供了前述经遗传修饰的酵母菌株的产生方法。所述方法包括向酵母菌株中引入突变SPT15基因的一个或多个拷贝，和/或在酵母细胞的基因组DNA中原位突变内源基因。

在本发明的又一方面中，提供了生产乙醇的方法。所述方法包括在含有一种或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将前述经遗传修饰的酵母菌株培养至足以产生含有乙醇的发酵产物的时间。在一些实施方案中，所述一种或多种可代谢成乙醇的底物包括C5和/或C6糖。优选地，所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。

根据本发明的另一方面，提供了用于生产乙醇的方法。所述方法包括在含有一种或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将包含突变SPT15基因的经遗传修饰的酵母菌株培养至足以产生含有乙醇的发酵产物的时间，所述突变SPT15基因含有突变F177S、Y195H和K218R。在一些实施方案中，所述一种或多种可代谢成为乙醇的底物包括C5和/或C6糖。优选地，所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。

在本发明的另一方面中，提供了前述方法的发酵产物，其为从发酵产物中分离的乙醇。优选地，所述乙醇通过对发酵产物进行蒸馏而分离的。

根据本发明的另一方面，提供了产生具有改进的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产的酵母菌株的方法。所述方法包括提供包含突变的SPT15基因的酵母菌株，和针对改进的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或改进的乙醇生产进行遗传改造和/或选择。

在一些实施方案中，突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中两个或更多的位置上包含突变，优选地在所有三个位置(F177、Y195和K218)上包含突变。在一些优选的实施方案中，突变的SPT15基因包含突变F177S、Y195H和K218R中的两个或更多个或者该突变氨基酸的保守性替换，优选地包含F177S、Y195H和K218R的全部或者该突变氨基酸的保守性替换。

在另一些实施方案中，在经遗传修饰的酵母菌株中重组表达突变的SPT15基因。在一些实施方案中，突变的SPT15基因在质粒上引入酵母细胞中，或引入酵母细胞的基因组DNA中。在另一些实施方案中，突变的SPT15基因是酵母细胞基因组DNA中原位突变的内源基因。

在另一些实施方案中，酵母菌株选自酵母菌、裂殖酵母、毕赤酵母、法夫酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、Talaromyces spp.、酒香酵母、Pachysolenspp.、德巴利酵母和工业多倍体酵母菌株。优选地，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株。更优选地，所述酵母菌株是Spt15-300。

根据本发明的另一方面，提供了通过前述方法产生的酵母菌株。

本发明的又一方面提供了生产乙醇的方法。所述方法包括在含有一种或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将前述经遗传修饰的酵母菌株培养至足以产生含有乙醇的发酵产物的时间。在一些实施方案中，所述一种或多种可代谢成为乙醇的底物包括C5和/或C6糖；优选地，所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。

在本发明的另一方面中，提供了前述方法的发酵产物，其为从发酵产物中分离的乙醇。优选地，所述乙醇通过对发酵产物进行蒸馏而分离。

根据本发明的另一方面，提供了下述酵母菌株，其过表达至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或所有14个表5中所列基因的任何组合，或具有一种或多种基本相似或冗余的生物/生物化学活性或功能的基因。

根据本发明的又一方面，提供了经遗传修饰的酵母菌株。所述酵母菌株在含有提高的乙醇水平的培养基中培养时，达到至少4倍于在含有提高的乙醇水平的培养基中培养的野生型菌株的细胞密度。在一些实施方案中，该菌株达到野生型菌株4-5倍的细胞密度。在另一些实施方案中，所述提高的乙醇水平为至少约5％或至少约6％。

在前述经遗传修饰的酵母菌株的一些实施方案中，培养基包含一种或多种糖，其浓度为至少约20g/L、优选地至少约60g/L、更优选地至少约100g/L、进一步更优选地至少约120g/L。

参照附图和本发明的详细说明，本发明的这些和另一些方面及其多个实施方案将更为明显。

附图说明

图1描绘了全局转录机器改造的基本方法。通过将改造的全局转录机器引入细胞而改变了转录组(transcriptome)，并以全局方式改变基因表达水平。在本研究中，对细菌的σ因子70(由rpoD编码)进行易错PCR，以产生多种突变体。然后将所述突变体克隆进低拷贝表达载体中，在此期间由于存在近乎完整的内部限制酶位点而使出现截短形式σ因子的概率提高。然后将该载体转化进大肠杆菌中并基于期望的表型进行筛选。然后将分离的突变体进行后续轮次的诱变和选择，以进一步改进表型。

图2显示乙醇耐受性σ因子突变体的分离。分离包含乙醇耐受性提高的突变体σ因子的菌株。图2A：突变体因子的多轮定向进化对表型的总体增强。在乙醇浓度为0、20、40、50、60、70和80g/L时，通过计算与对照相比突变体倍增时间减少倍数的总和来评估总体增强(y轴)。至第三轮时，生长速率的改善似乎增量很小。图2B：相对于先前鉴定的关键功能区，标出σ⁷⁰蛋白上突变的位置。第二轮诱变导致鉴定到了截短的因子，其仅包含该区域中先前两个突变中的一个。图2C：展示了第三轮突变体(红色)和对照(蓝色)菌株的生长曲线。第三轮突变体在所有测试的乙醇浓度下具有显著提高的生长速率。图2D：乙醇耐受性突变体σ因子(天然的，SEQID NO：17；第一轮，SEQ ID NO：18；第二轮，SEQ ID NO：19；第三轮，SEQ ID NO：20)的氨基酸序列比对。

图3显示针对另外表型的σ因子序列分析。图3A：相对于先前鉴定的关键功能区域，标出σ⁷⁰蛋白区域乙酸和pHBA突变体中的突变位置。绝大多数乙酸突变体是全长σ因子。所鉴定的pHBA突变体是截短的因子，预计其作为特定基因转录的抑制剂。图3B：乙酸耐受性突变体σ因子(天然的，SEQ ID NO：17；Ac1，SEQ ID NO：21；Ac2，SEQ ID NO：22；Ac3，SEQ ID NO：23；Ac4，SEQ ID NO：24；Ac5，SEQ ID NO：25)的氨基酸序列比对。图3C：pHBA耐受性突变体σ因子(天然的，SEQ ID NO：17；pHBA1，SEQ ID NO：26)的氨基酸序列比对。

图4描绘了具有己烷耐受性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。图4还显示最佳己烷耐受性突变体Hex-12和Hex-18的序列。

图5显示具有环己烷耐受性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。

图6描绘了在逐渐提高的萘啶酸浓度下，抗生素抗性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。

图7A-7D显示培养所选菌株并测定其在15和24小时时的番茄红素产生的结果，以及来自最优菌株的σ因子突变体的序列。

图8是描绘在发酵期间与对照相比番茄红素产生的最大增加倍数的散点图。圆的大小与增加倍数成比例。

图9举例说明15小时后几种目的菌株的番茄红素含量。该图将通过全局转录机器改造提供的改进与通过依次基因敲除的传统菌株改进方法进行比较。在该实例中，全局转录机器改造法在提高表型方面比一系列多基因敲除更加有效。另外，在预先改造菌株中实现了改进。

图10显示了在葡萄糖基本培养基中选择PHB指数期提高的菌株。图7A展示使用σ因子改造获得的多种菌株(红色和黄色柱代表对照)的结果。图7B展示从使用转座子诱变获得的随机敲除文库中所选菌株的结果。

图11描绘了在逐渐提高的SDS浓度下，SDS耐受性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度，以及来自最优菌株的σ因子突变体的序列。

图12显示酵母中LiCl gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中升高的LiCl水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Spt15的菌株。显示了16小时后突变体和对照菌株的生长量(以OD600来衡量)。在较低浓度LiCl下Taf25突变体优于对照，而所述Spt15突变体在较高浓度下更有效。

图13描绘了酵母中LiCl gTME突变体的序列分析。突变显示在显示每个因子的关键功能组分的示意图上。发现每种突变体仅具有单个氨基酸替换。

图14显示酵母中葡萄糖gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中提高的葡萄糖水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Spt15的菌株。此时，两种蛋白质均在相似的浓度范围内显示出改进，其中SPT15显示出最大的改进。

图15描绘了酵母中葡萄糖gTME突变体的序列分析。突变显示在显示各个因子的关键功能组分的示意图上。发现每种突变体仅具有单个氨基酸替换，然而分离了若干另外的SPT15蛋白，其中一些包含许多突变。

图16显示酵母中乙醇-葡萄糖gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中提高的乙醇和葡萄糖水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Spt15的菌株，并测定20小时时的生长。此时，SPT15蛋白远远超过TAF25突变体的影响。

图17描绘了酵母中乙醇-葡萄糖gTME突变体的序列分析。突变显示在显示各个因子的关键功能组分的示意图上。发现每种突变体在DNA或蛋白质接触的关键区域中包含若干单氨基酸替换。

图18显示对提高的乙醇和葡萄糖浓度具有更高耐受性的酵母gTME突变体。(A)从spt15-300或taf25-300突变体文库分离的最佳克隆的突变，显示在各个因子的关键功能组件的示意图上(补充文本，a部分)。(B)在含有提高水平(按体积计6％)的乙醇和葡萄糖的合成最小培养基上20小时后测定来自(A)的克隆的生长量(growth yield)。在这些条件下，spt15-300突变体远超出taf25-300突变体的性能。将生长量的提高倍数与下述同基因株比较，所述同基因株带有质粒负载的野生型形式的SPT15或者TAF25。

图19展示了评价突变体在乙醇胁迫下的耐受性的细胞生存力曲线。与对照比较的spt 15-300突变体菌株生存力测量为时间(小时)的函数，并表述为菌落形成单位与在按体积计(A)12.5％和(B)15％乙醇存在下在标准培养基中处理和孵育的稳定期细胞的0小时菌落计数相比的相对数量。在测试的所有按体积计高于10％乙醇的浓度下，spt 15-300突变均赋予显著增强的生存力(图23)。误差条表示生物学重复实验之间的标准差。初始细胞计数约为3.5×10⁶个细胞/ml。

图20显示用于查明突变体spt15引发的转录组(transcriptome)水平应答的基因敲除和过表达分析。(A)使用该突变体中十二个最高表达的基因(圆括号中给出log2差异性基因表达)进行表型丧失分析，并选择2个额外的基因用于进一步研究(补充文本，c部分)。通过将质粒上含有spt15-300突变的敲除菌株与含有野生型SPT15的菌株进行比较，分别测试缺失14个基因之一的14种菌株(对5％乙醇，60g/L葡萄糖)的耐受性。除PHM6以外的所有基因敲除均导致表型的轻微或完全丧失。所有这些基因敲除靶标的对照突变体均显示相似的生长量。(B)针对来自微阵列的前3个候选基因(PHO5、PHM6和FMP16)提供了基因过表达研究，并如先前所测定的在按体积计6％乙醇下进行测定(也见图26)。这些基因的过表达未能传递抗性表型。

图21显示阐明和证实部分由SPT3/SAGA复合物介导的机制。(A)通过引入spt15-300突变体并在存在按体积计6％乙醇时进行测定来评价spt3敲除的影响。该突变体不能传递表型，这证明了SPT3作为所提供机制之一部分的必要性。(B)将三种突变(F177S、Y195H和K218R)进行作图到由使用每个这些突变位点(22-24，27，28)进行的先前研究所提出的全局转录机器分子机制上。这三种突变共同导致涉及Spt3p的机制。

图22显示分别从taf25和spt15突变体文库中分离的最佳克隆在含有提高水平(按体积计5％)的乙醇和葡萄糖的合成基本培养基中20小时后测量的生长量。

图23：与对照比较的spt 15-300突变体菌株的生存力测量为时间(小时)的函数，并表述为菌落形成单位与按体积计(A)10％、(B)17％和(C)20％乙醇存在下在标准培养基中处理和孵育的稳定期细胞的0小时菌落计数相比的相对数量。提供了17.5％和20％乙醇的内插图，以更好地显示突变体与带有野生型SPT15形式的对照之间的差异。在测试的所有按体积计高于10％乙醇的浓度下，spt 15-300突变均赋予显著增强的生存力(也见图2A、2B)。误差条表示生物学重复实验之间的标准差。初始细胞计数约为3.5×10⁶个细胞/ml。

图24提供了与对照相比spt15-300突变体菌株中差异表达基因的直方图，统计学阈值为p值≤0.001。该spt15-300具有造成基因上调超过造成基因下调的偏好。

图25：在大肠杆菌乙醇耐受性σ因子突变体与对提高的乙醇和葡萄糖有耐受性的酵母spt15-300突变体之间比较改变基因的基因分类(geneontology)富集情况。该比较显示，尽管转录机器存在差异，但是二者均能够引发氧化还原酶和电子传递基因发生改变的相似的保守性应答。这些蛋白质功能在这些菌株中的乙醇耐受性中起重要作用。环的大小与功能富集的p值成正比。

图26：针对来自微阵列的前3个候选基因(PHO5、PHM6和FMP16)提供了基因过表达研究，并在按体积计5％乙醇下进行测定(也见图3B)。

图27：对产生三重spt15突变体的单突变和双突变的详尽评价证明，单突变或双突变的组合性能均不如所鉴定的三重突变体好。针对每种修饰在y轴以及轨线(通过颜色)上描绘了累积的相对适应度。补充文本d部分提供了每种突变体的数据和适应度数据的解释。

图28描绘了在5％乙醇和多种葡萄糖浓度存在下孵育20小时后对照菌株的生长。

图29描绘了在6％乙醇和多种葡萄糖浓度存在下孵育20小时后对照菌株的生长。

图30显示含20g/L葡萄糖的低接种物发酵中突变体和对照的葡萄糖、细胞密度和乙醇谱。突变体和对照之间生长速率相似，但是在延长的生长期继续生长(A)。突变体中乙醇产量也更高(B)。

图31显示含100g/L葡萄糖的低接种物发酵中突变体和对照的葡萄糖、细胞密度和乙醇谱。突变体菌株中的葡萄糖利用率和生长超过对照。另外，突变体中乙醇产量更高。

图32：用OD 15(～4g DCW/L)原始细胞密度的高接种在100g/L葡萄糖中以生物学重复培养细胞。上述图谱展示，突变体显示更有活力的生长(更高的生长量)、对葡萄糖的完全利用和更高的乙醇生产力。

发明详述

在所有的细胞系统(原核的和真核的)中，全局转录机器均负责控制转录组。在细菌系统中，σ因子在协调全局转录中发挥关键作用，这通过致力于RNA聚合酶全酶的启动子偏好来实现(R.R.Burgess，L.Anthony，Curr.Opin.Microbiol 4，126-131(2001))。大肠杆菌(Escherichia coli)包含6种可替代的σ因子和一种主要因子σ⁷⁰(由基因rpoD编码)。在蛋白质水平上，已在与启动子位点及全酶接触的残基区进行了分析(J.T.Owens等，PNAS 95，6021-6026(1998))。大肠杆菌和另一些细菌中σ⁷⁰的位点特异性诱变以及晶体结构分析已证明了改变RNA聚合酶全酶的体外启动子偏好的能力，其证据为报告基因转录的提高或降低(A.Malhotra，E.Severinova，S.A.Darst，Cell 87，127-36(1996))。本发明开拓了产生在整个基因组水平上具有不同启动子偏好的突变体σ因子的能力。

传统的菌株改进范例主要依赖于依次产生单个基因修饰，并且常常不能达到全局的最高点。其原因是代谢情况是复杂的(H.Alper，K.Miyaoku，G.Stephanopoulos，Nat Biotechnol 23，612-616(2005)；H.Alper，Y.-S.Jin，J.F.Moxley，G.Stephanopoulos，Metab Eng 7，155-164(2005))，并且增量式或贪婪搜索算法(greedy search algorithm)无法揭示仅在所有突变同时引入时才有益处的合成突变体。另一方面，通过随机诱变和选择增强的抗体亲合力、酶特异性或催化活性，蛋白质工程可迅速地改进适合性(E.T.Boder，K.S.Midelfort，K.D.Wittrup，Proc Natl Acad Sci USA 97，10701-5(2000)；A.Glieder，E.T.Farinas，F.H.Arnold，Nat Biotechnol 20，1135-9(2002)；N.Varadarajan，J.Gam，M.J.Olsen，G.Georgiou，B.L.Iverson，Proc Natl Acad Sci USA 102，6855-60(2005))。这些实例中获得显著增强的重要原因是，这些方法能够通过评估许多同时发生的突变来探测巨大的氨基酸组合空间。使用本发明，我们利用了σ⁷⁰因子的全局调节功能，从而类似地引入多个同时的基因表达改变，并因此通过选择负责改进的细胞表型的突变体来促进全细胞改造。

本发明提供了用于改变细胞表型的方法。该方法包括突变编码全局转录机器蛋白的核酸以及任选的其启动子；在细胞中表达所述核酸，以提供包含突变的全局转录机器蛋白的改造细胞；以及培养所述改造细胞。本文使用的“全局转录机器”是调节多种基因转录的一种或多种分子。所述全局转录机器可以是通过与RNA聚合酶分子相互作用以及调节其活性来影响基因转录的蛋白质。所述全局转录机器还可以是改变细胞基因组转录能力的蛋白质(例如，甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶和脱乙酰基酶)。另外，全局转录机器可以是改变多种基因转录的非蛋白质分子(例如小RNA(micro RNA))。

可用于本发明的全局转录机器包括细菌的σ因子和抗σ因子。编码σ因子的基因的实例包括rpoD(编码σ⁷⁰)、rpoF(编码σ²⁸)、rpoS(编码σ³⁸)、rpoH(编码σ³²)、rpoN(编码σ⁵⁴)、rpoE(编码σ²⁴)和fecI(编码σ¹⁹)。抗σ因子与σ因子结合，并控制其可用性，因此控制转录。在大肠杆菌中，抗σ因子由rsd(针对σ因子70)或flgM等编码。可突变抗σ因子从而控制它们对正常细胞转录的影响。另外，可创造突变体σ因子与突变体抗σ因子的新配对，从而获得细胞中对转录的进一步控制。例如，可使用诱导型启动子表达抗σ因子，所述启动子使得可调节地控制突变体σ因子所传递的表型。

全局转录机器还包括与真核RNA聚合酶(如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III)或者RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子结合并且调节其活性的多肽。这样的真核全局转录机器的实例包括TFIID或其亚基，如TATA结合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)如TAF25，以及延伸因子。来自多种物种的TBP的实例包括：NP_011075.1；AAA35146.1；XP_447540.1；NP_986800.1；XP454405.1；1YTB；1TBP；XP_462043.1；AAA79367.1；XP_501249.1；NP_594566.1；AAA79368.1；AAY23352.1；Q12731；BAE57713.1；XP_001213720.1；XP_364033.1；XP_960219.1；CAJ41964.1；EAT85966.1；XP_754608.1；XP_388603.1；P26354；EAU88086.1；XP_758541.1；XP_662580.1；XP_710759.1；XP_572300.1和BAB92075.1。来自酵母的全局转录机器的其它实例包括GAL11、SIN4、RGR1、HRS1、PAF1、MED2、SNF6、SNF2和SWI1。

全局转录机器还包括改变染色体DNA转录能力的多肽，如核酸甲基转移酶(例如DamMT、DNMT1、Dnmt3a)、组蛋白甲基转移酶(例如Set1、MLL1)、组蛋白乙酰化酶(例如PCAF、GCN5、Sas2p以及其他MYST型组蛋白乙酰化酶、TIP60)和组蛋白脱乙酰基酶(例如HDAC1、HDA1、HDAC2、HDAC3、RPD3、HDAC8、Sir2p)，以及相关因子(例如HDAC家族与mSin3A、Mi-2/NRD、CoREST/kiaa0071、N-CoR和SMRT有关)。

另一些全局转录机器由真核细胞细胞器(如线粒体或叶绿体)的核酸分子编码。

前述全局转录机器的实例仅旨在举例。本领域技术人员应当知道，全局转录机器的许多其他实例是已知的，前述实例的来自其他物种的许多其他实例是已知的。本发明包括所有前述内容的用途。

另外，可根据本发明使用的全局转录机器包括与目的分子具有至少X％同一性的序列。例如，根据本发明考虑使用与酿酒酵母TBP SPT15共有相同序列的分子，即SPT15的同源物。这些同源物具有至少约70％的同一性，优选至少约75％的同一性，更优选至少约80％的同一性，进一步更优选至少约85％的同一性，进一步更优选至少约90％的同一性，进一步更优选至少约95％的同一性，进一步更优选至少约97％的同一性，最优选地至少约99％的同一性。

在许多情况下，对全局转录机器进行突变的过程将包括反复产生多种全局转录机器突变，但这并不是必需的，因为甚至全局转录机器中的单个突变也能导致显著的表型变化，如本文中所述。

尽管本发明的方法通常通过对全局转录机器进行突变以及之后将突变的全局转录机器引入细胞以产生改造细胞来进行，但也有可能突变内源全局转录机器基因，例如通过用突变体全局转录机器进行替换或者对内源全局转录机器进行原位突变来实现。本文使用的“内源”指对细胞而言是天然的；在对全局转录机器进行突变的情况下，“内源”是指细胞中的全局转录机器基因。相反地，更典型的方法包括在细胞外突变全局转录机器基因，然后将该突变基因引入细胞中。

所述全局转录机器基因可以属于与所引入细胞相同的或不同的物种。例如，如本文所示，突变大肠杆菌σ因子70并引入大肠杆菌中，以改变大肠杆菌细胞的表型。也可以以同样的模式应用大肠杆菌的其它全局转录机器。类似地，可以突变特定酵母物种(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或裂殖酵母(S.pombe))的全局转录机器并引入同样的酵母物种中。同样，可以使用标准重组遗传技术以类似于本文所提供具体实施例的方式突变线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))或者哺乳动物(例如小鼠(M.musculus)、褐家鼠(R.norvegicus)或人(H.sapiens))的全局转录机器并引入同样的物种中。

或者，可以使用来自不同物种的全局转录机器，以提供基因转录控制中的其它变化。例如，可以突变链霉菌属(Streptomyces)细菌的全局转录机器并引入大肠杆菌中。不同的全局转录机器还可以来自生物的不同界或门。取决于所使用的突变方法，可以将相同的和不同的全局转录机器组合，以用于本发明的方法，例如通过基因改组来组合。

任选地，可以诱变全局转录机器的转录控制序列，而非编码序列本身。转录控制序列包括启动子和增强子序列。然后，可将与全局转录机器编码序列连接的突变启动子和/或增强子序列引入细胞中。

将突变体全局转录机器引入细胞产生改造细胞后，接着确定/测定改造细胞的表型。这可以通过对改造细胞选择具有(或不具有)特定表型来实现。以下有表型实例的详细描述。还可通过将改造细胞的表型与改造前细胞的表型进行比较来确定表型。

在一些优选的实施方案中，将全局转录机器的突变和突变体全局转录机器的引入重复进行一次或多次，从而得到“第n代”改造细胞，其中“n”是突变和引入全局转录机器的重复次数。例如，重复突变并引入全局转录机器一次(在全局转录机器最初的突变和引入之后)得到第二代改造细胞。再一次的重复得到第三代改造细胞，依此类推。然后，对包含反复突变的全局转录机器的细胞确定表型(或者与包含未突变的全局转录机器或之前重复的突变体全局转录机器的细胞进行比较)，如本文中别处的描述。

反复突变全局转录机器使表型在连续突变步骤后得以改进，每个步骤可引起全局转录机器的多个突变。反复诱变也有可能引起全局转录机器中的特定氨基酸残基突变在反复过程中“出现”或“消失”。在工作实施例中提供了此类突变的实例。

在所述方法的典型用途中，通过突变编码全局转录机器的核酸分子对全局转录机器进行定向进化。突变核酸分子的一个优选方法是对编码序列进行诱变，然后插入载体(例如质粒)中。尽管优选在插入载体之前突变编码序列，但必要时该过程也可颠倒，即首先将核酸分子插入载体中，然后对序列进行诱变。

当重复进行全局转录机器定向进化时(即在本发明的反复过程中)，一种优选的方法包括从改造细胞中分离编码突变体全局转录机器的核酸以及任选地其启动子。然后突变所分离的核酸分子(产生编码第二代突变体全局转录机器的核酸)，随后引入另一细胞中。

在突变时，所述分离的核酸分子形成包含不同突变或突变组的突变核酸分子集合。例如，当核酸分子在随机突变时可包含沿核酸分子长度上一个或多个位置突变的突变组。因此，该组的第一成员可包含核苷酸n1处的一个突变(其中nx表示核酸分子的核苷酸序列号，x是从分子的第一个至最后一个核苷酸的核苷酸位置)。该组的第二成员可包含核苷酸n2处的一个突变。该组的第三成员可包含核苷酸n1和n3处的两个突变。该组的第四成员可包含n4和n5位置上的两个突变。该组的第五成员可包含三个突变：核苷酸n4和n5的两个点突变以及核苷酸n6-n7的缺失。该组的第六成员可包含核苷酸n1、n5和n8的点突变，以及3’端的核苷酸截短。该组的第七成员中核苷酸n9-n10可能与核苷酸n11-n12发生了交换。本领域的普通技术人员可以容易地预期多种其它组合，包括随机和定向突变的组合。

所述核酸分子的集合可以是核酸文库，如插入载体中的许多不同的突变核酸分子。这样的文库可根据分子生物学的标准方法贮存、复制、等分和/或引入细胞以产生改造细胞。

用于定向进化的全局转录机器突变优选是随机的。然而，也可以限制全局转录机器中所引入突变的随机性，以产生全局转录机器的非随机或部分随机突变或者这些突变的某种组合。例如，对于部分随机突变，突变可局限在编码全局转录机器的核酸分子中的某个部分。

可基于期望的突变类型来选择突变方法。例如，对于随机突变，可使用诸如核酸分子的易错PCR扩增的方法。可使用定点诱变在核酸分子的特定核苷酸处引入特定突变。可使用合成核酸分子来引入特定的突变和/或随机突变，后者位于一个或多个特定核苷酸处，或者跨越整个核酸分子的长度。合成核酸的方法在本领域是公知的(例如，Tian等，Nature 432：1050-1053(2004))。

可使用DNA改组(也叫作基因改组)通过交换核酸分子区段来引入其它突变。参见如美国专利6,518,065、相关专利及其引用的参考文献。用作改组源材料的核酸分子可以是编码单一类型的全局转录机器(例如σ⁷⁰)或者多于一种类型的全局转录机器的核酸分子。例如，可以改组编码不同全局转录机器的核酸分子，如单一物种的不同σ因子(例如，大肠杆菌的σ⁷⁰和σ²⁸)，或者来自不同物种的σ因子。同样地，可以改组编码不同类型全局转录机器(例如σ因子70和TFIID)的核酸分子。

突变核酸分子(以随机或非随机的方式)的多种其它方法是本领域普通技术人员公知的。可以组合地使用一种或多种不同方法，以在编码全局转录机器的核酸分子中产生突变。在这方面，“组合地”指不同类型的突变组合在单个核酸分子中，并且分配到核酸分子组中。不同类型的突变包括点突变、核苷酸截短、核苷酸缺失、核苷酸添加、核苷酸替换和核苷酸区段的改组(例如，再分配)。因此，任何单个核酸分子可包含一种或多种类型的突变，并且它们可以随机地或非随机地分配到核酸分子组中。例如，一组核酸分子可以包含该组中每个核酸分子共有的突变，以及不为该组中每个核酸分子共有的数量可变的突变。例如，所述共有突变可以是发现对细胞的期望改造表型有利的突变。

优选地，所述一种或多种截短或缺失不破坏或除去全局转录机器的启动子结合区域。

相对于未突变的全局转录机器，所述突变的全局转录机器可表现出提高或降低的基因转录。另外，相对于未突变的全局转录机器，所述突变的全局转录机器可表现出提高或降低的基因转录抑制。

本文使用的“载体”可以是许多核酸中的任意一种，所述核酸中可通过限制性处理和连接而插入期望序列，用于在不同的遗传环境之间进行运输或者用于在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组成，然而RNA载体也是可用的。载体包括但不限于：质粒、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。

克隆载体是能够自主复制或整合进宿主细胞基因组的载体，并且其特征还在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，该载体可在所述位点处以可确定的方式切割，并且目标DNA序列可连接进所述位点处，从而新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。对于质粒而言，由于质粒在宿主细菌中拷贝数增加，所以目的序列可发生多次复制，或者在每个宿主中仅在宿主通过有丝分裂复制前发生一次。对于噬菌体而言，复制可在溶胞阶段期间主动发生，或者在溶原阶段期间被动发生。

表达载体是这样的载体，其中可通过限制性处理和连接插入期望DNA序列，从而其与调节序列有效连接，并可表达为RNA转录物。载体还可包含一个或多个标记序列，其适于鉴定被或未被该载体转化或转染的细胞。标记包括如编码提高或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码可通过本领域已知的标准测定检测其活性的酶(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因以及以可见方式影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或菌斑的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。优选的载体是能够自主复制和表达结构基因产物的载体，所述结构基因产物存在于与载体有效连接的DNA区段中。

如本文使用的，当以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制之下的方式共价连接时，编码序列和调节序列称为“有效”连接。如果期望编码序列翻译为功能蛋白，那么如果诱导5’调节序列中的启动子导致编码序列转录，并且如果两个DNA序列间连接的性质不会(1)导致引入移码突变、(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力或者(3)干扰相应的RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则两DNA序列称为有效连接。因此，如果启动子区域能够影响DNA序列的转录从而得到的转录物可翻译成期望的蛋白质或多肽，则所述启动子区将是与编码序列有效连接的。

基因表达所需调节序列的确切性质在物种或细胞类型之间可以不同，然而根据需要通常应包括分别参与起始转录和翻译的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这样的5’非转录调节序列将包括启动子区，所述启动子区含有控制有效连接基因转录的启动子序列。如有必要，调节序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。本发明的载体可任选地包括5’前导或信号序列。选择和设计合适的载体在本领域普通技术人员的能力和判断力之内。

包含所有表达必要元件的表达载体是市售的，并为本领域技术人员所公知。参见如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过向细胞中引入编码CT抗原多肽或其片段或变体的异源DNA(RNA)来遗传改造所述细胞。所述异源DNA(RNA)置于转录元件的有效控制下，从而允许该异源DNA在宿主细胞中表达。

用于在哺乳动物细胞中表达mRNA的优选系统为例如pRc/CMV或pcDNA3.1(可从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)，其包含选择标记如G418抗性基因(便于选择稳定转染细胞系)以及人巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列。另外，适于在灵长类或犬类细胞系中表达的载体是包含EB病毒(EBV)复制起点的pCEP4载体(Invitrogen)，其有助于维持质粒作为多拷贝染色体外元件。

当编码突变全局转录机器的核酸分子在细胞中表达时，可使用多种转录控制序列(例如启动子/增强子序列)指导全局转录机器的表达。所述启动子可以是天然启动子，即该全局转录机器的启动子，其提供对全局转录机器表达的正常调节。所述启动子还可以是广泛表达的启动子，如β-肌动蛋白、泛素B、噬菌体的启动子或者巨细胞病毒启动子。本发明有用的启动子还可以是不广泛表达全局转录机器的启动子。例如，可以使用组织特异性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子在细胞中表达全局转录机器。还可使用多种条件启动子，如受分子存在与否控制的启动子，如四环素应答启动子(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl Acad.Sci USA，89，5547-5551(1992))。

可使用本领域的标准方法和技术将编码突变全局转录机器的核酸分子引入细胞或多种细胞中。例如，可通过多种转染方法、转导、电穿孔、粒子轰击、注射(包括细胞的显微注射以及向多细胞生物注射)、脂转染、用于YAC(酵母人工染色体)的酵母原生质球/细胞融合物、用于植物细胞的农杆菌介导的转化等引入核酸分子。

表达编码突变全局转录机器的核酸分子还可通过将该核酸分子整合进基因组或者通过替换编码内源全局转录机器的核酸序列来实现。

通过突变全局转录机器提供了新的组成，包括通过多轮突变产生的编码全局转录机器的核酸分子。多轮突变可包括定向进化，其中每轮突变之后是选择过程，以选择具有期望表型的已突变全局转录机器。突变和选择突变全局转录机器的方法在本文中其他处描述。还提供了利用这些核酸分子得到的全局转录机器。

在某些情况下，已发现突变的全局转录机器是截短形式的未突变全局转录机器。特别地，对于σ因子70来说，已发现仅保留σ⁷⁰蛋白羧基端的σ⁷⁰氨基端截短为所引入的细菌提供了有利的表型。因此，提供了全局转录机器的片段，尤其是保持启动子结合特性的未突变全局转录机器片段，更优选包含区域4的σ⁷⁰片段。还提供了编码截短的全局转录机器的核酸分子，包括包含在载体和/或细胞中的核酸分子。

用于本发明的细胞包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括细菌细胞和古细菌细胞。真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、干细胞和真菌细胞。真核细胞可包含在例如多细胞生物的一部分或整体中。多细胞生物包括哺乳动物、线虫如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、家蚕(Bombyx mori)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、海胆和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。

细菌的实例包括埃希氏菌(Escherichia spp.)、链霉菌(Streptomycesspp.)、发酵单胞菌(Zymonas spp.)、醋杆菌(Acetobacter spp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter spp.)、集胞蓝细菌(Synechocystis spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、棒杆菌(Corynebacteriumspp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、黄单胞菌(Xanthomonas spp.)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)、产碱菌(Alcaligenes spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、固氮菌(Azotobacter spp.)、从毛单胞菌(Comamonas spp.)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌(Gluconobacter spp.)、雷尔氏菌(Ralstoniaspp.)、Acidithiobacillus spp.、小月菌(Microlunatus spp.)、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、节杆菌(Arthrobacter spp.)、黄杆菌(Flavobacteriumspp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)、糖单孢菌(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌(Thermus spp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌(Chromobacterium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌(Saccharopolyspora spp.)、农杆菌(Agrobacterium spp.)和泛菌(Pantoeaspp.)。

古菌(也称为古细菌)的实例包括甲基单胞菌(Methylomonas spp.)、硫化叶菌(Sulfolobus spp.)、甲基杆菌(Methylobacterium spp.)、盐杆菌(Halobacterium spp.)、甲烷杆菌(Methanobacterium spp.)、甲烷球菌(Methanococci spp.)、甲烷嗜热菌(Methanopyri spp.)、古生球菌(Archaeoglobus spp.)、铁球菌(Ferroglobus spp.)、热原体(Thermoplasmata spp.)和热球菌(Thermococci spp.)。

酵母的实例包括酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Paffiaspp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candida spp.)、Talaromyces spp.、酒香酵母、Pachysolen spp.、德巴利酵母和工业多倍体酵母菌株。

真菌的实例包括曲霉(Aspergillus spp.)、青霉菌(Penicillium spp.)、镰刀菌(Fusarium spp.)、根霉(Rhizopus spp.)、顶孢霉(Acremoniumspp.)、脉孢菌(Neurospora spp.)、粪壳菌(Sordaria spp.)、稻瘟菌(Magnaporthe spp.)、异水霉(Allomyces spp.)、黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢菌(Botrytis spp.)和木霉(Trichoderma spp.)。

昆虫细胞的实例包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系如Sf9和Sf21、果蝇细胞系如Kc、Ca、311、DH14、DH15、DH33P1、P2、P4和SCHNEIDER-2(D.Mel-S2)和舞毒蛾(Lymantria dispar)细胞系如652Y。

哺乳动物细胞的实例包括原代细胞如干细胞和树突细胞，以及哺乳动物细胞系如Vero、HEK 293、Sp2/0、P3UI、CHO、COS、HeLa、BAE-1、MRC-5、NIH 3T3、L929、HEPG2、NS0、U937、HL60、YAC1、BHK、ROS、Y79、Neuro2a、NRK、MCF-10、RAW 264.7和TBY-2。

干细胞系包括hESC BG01、hESC BG01V、ES-C57BL/6、ES-D3GL、J1、R1、RW.4、7AC5/EYFP和R1/E。另外的人类干细胞系包括(NIH命名)CH01、CH02、GE01、GE07、GE09、GE13、GE14、GE91、GE92、SA19、MB01、MB02、MB03、NC01、NC02、NC03、RL05、RL07、RL10、RL13、RL15、RL20和RL21。

全局转录机器的定向进化产生改造细胞，其中一些具有改变的表型。因此，本发明还包括选择具有预定表型的改造细胞。可通过在选择条件下培养所述改造细胞来选择预定表型。还可通过高通量测定个体细胞的表型来选择预定表型。例如，可在细胞中对有害条件的耐受性和/或代谢物产生的提高进行选择。耐受性表型包括耐受溶剂如乙醇、有机溶剂如己烷或环己烷；耐受有毒代谢物如乙酸、对羟基苯甲酸(pHBA)、对羟基肉桂酸、羟基丙醛、过表达的蛋白质、有机溶剂和免疫抑制分子；耐受表面活性剂；耐受渗透胁迫；耐受高糖浓度；耐受高温；耐受极端pH条件(高或低)；抗凋亡；耐受有毒底物如有害废物；耐受工业培养基；提高抗生素抗性等。实施例中示例了对乙醇耐受性、有机溶剂耐受性、乙酸盐/酯耐受性、对羟基苯甲酸耐受性、SDS耐受性和抗生素抗性的选择。在其它一些实施例中，示例了对提高的番茄红素和聚羟基丁酸酯产生的选择。在酵母细胞的实施例中，示例了对高糖(葡萄糖)耐受性、渗透胁迫(LiCl)耐受性和对高葡萄糖和乙醇浓度的多重耐受性的选择。

还可以选择多细胞生物所表现另一些表型。可将全局转录机器的突变体引入哺乳动物或其它真核细胞系中，或者甚至引入完整生物中(例如，通过引入生殖细胞系或注射进卵母细胞中)，以允许筛选表型。这些表型可以在生物的单细胞中表现或不表现，并包括：一种或多种生长特征、世代时间、对一种或多种害虫或疾病的抗性、果实或其他植物部分的产生、一种或多种发育变化、一种或多种寿命变化、功能的获得或丧失、健壮性提高等。

涉及包含突变全局转录机器的改造细胞时，本文使用的“耐受性”指与未改造细胞或先前改造的细胞相比，所述改造细胞能够耐受有害程度更高的条件。例如，所述未改造或先前改造的细胞是“子代”改造细胞的“亲本”，或者与被测细胞(第n代)相比，所述未改造或先前改造的细胞是第(n-1)代。“耐受有害条件”指与未改造或先前改造的细胞相比，所述改造细胞具有提高的生长和/或存活。该概念还包括提高产生对细胞有毒的代谢物。

关于对高糖浓度的耐受性，这样的浓度可以是≥100g/L、≥120g/L、≥140g/L、≥160g/L、≥180g/L、≥200g/L、≥250g/L、≥300g/L、≥350g/L、≥400g/L、≥450g/L、≥500g/L等。关于对高盐浓度的耐受性，这样的浓度可以是≥1M、≥2M、≥3M、≥4M、≥5M等。关于对高温的耐受性，所述温度可以是例如对细菌细胞为≥42℃、≥44℃、≥46℃、≥48℃、≥50℃。可根据所使用细胞类型选择其它的温度范围。关于对极端pH的耐受性，示例性pH截止值为例如≥pH10、≥pH11、≥pH12、≥pH13，或者≤pH4.0、≤pH3.0、≤pH2.0、≤pH1.0。关于对表面活性剂的耐受性，示例性表面活性剂浓度为≥5％(重量/体积)、≥6％(重量/体积)、≥7％(重量/体积)、≥8％(重量/体积)、≥9％(重量/体积)、≥10％(重量/体积)、≥12％(重量/体积)、≥15％(重量/体积)等。关于对乙醇的耐受性，示例性乙醇浓度为≥4％(体积/体积)、≥5％(体积/体积)、≥6％(体积/体积)、≥7％(体积/体积)、≥8％(体积/体积)、≥9％(体积/体积)、≥10％(体积/体积)等。关于对渗透胁迫的耐受性，诱导渗透胁迫的示例性浓度(例如LiCl浓度)为≥100mM、≥150mM、≥200mM、≥250mM、≥300mM、≥350mM、≥400mM等。

本发明包括获得细胞中提高的代谢物产生。本文使用的“代谢物”是在或能在细胞中产生的任何分子。代谢物包括代谢中间体或终产物，任何所述产物均能可对细胞具有毒性，在这些情况下提高的产生可涉及对该有毒代谢物的耐受性。因此，代谢物包括小分子、肽、大的蛋白质、脂质、糖等。示例性代谢物包括实施例中展示的代谢物(番茄红素、聚羟基丁酸和乙醇)；治疗性蛋白质(如抗体或抗体片段)。

本发明还提供了对多种表型的选择，如对多种有害条件的耐受性、多种代谢物产生的提高，或者其组合。一个实例是实施例中展示的酵母对高葡萄糖和乙醇浓度的多重耐受性。

使用在引入突变全局转录机器之前预先为预定表型进行优化的细胞可能是有利的。因此，例如在番茄红素的产生中，优选使用产生较多量番茄红素(更优选最佳量的番茄红素)的细胞，而不是从仅产生少量番茄红素的细菌细胞开始。在这些情况下，突变全局转录机器用于进一步改进已有改进的表型。

通过所述突变全局转录机器的作用，所述改造细胞将具有改变的基因表达。在某些方面，本发明的方法可包括鉴定改造细胞中基因表达的变化。可使用多种本领域公知的方法鉴定基因表达的变化。优选地，使用核酸微阵列测定基因表达的变化。

在本发明的一些方面，细胞中通过突变全局转录机器产生的一种或多种基因表达变化可以在另一细胞中再现，从而产生相同的(或相似的)表型。可以如上所述鉴定突变全局转录机器产生的基因表达变化。然后，可通过重组基因表达或其它手段将调控靶向个体基因。例如，突变的全局转录机器可提高基因A、B、C、D和E的表达，并降低基因F、G和H的表达。本发明包括调节一种或多种上述基因的表达，以再现突变全局转录机器所产生的表型。为了再现预定的表型，可提高或降低基因A、B、C、D、E、F、G和H中的一种或多种，所述提高例如通过向细胞中引入包含该基因序列的表达载体来实现；通过提高编码所述一种或多种基因产物的一种或多种内源基因的转录来实现，或者通过突变该一种或多种基因的转录控制(例如，启动子/增强子)序列来实现；所述降低例如通过向第一细胞中引入降低所述一种或多种基因产物表达的核酸分子(如siRNA核酸分子或表达siRNA分子的核酸分子)来实现，或者通过突变编码所述一种或多种基因产物的一种或多种基因或者所述一种或多种基因的转录控制(例如，启动子/增强子)序列来实现。

任选地，包含突变全局转录机器的细胞中的基因表达变化用于构建基因或蛋白质网络的模型，然后使用所述模型选择改变网络中一种或多种基因产物中的一种。可以通过Ideker及其同事的方法(参见，例如Kelley等，Proc Natl Acad Sci USA 100(20)，11394-11399(2003)；Yeang等GenomeBiology 6(7)，Article R62(2005)；Ideker等，Bioinformatics.18 Suppl1：S233-40(2002))或Liao及其同事的方法(参见，例如Liao等，Proc NatlAcad Sci USA 100(26)，15522-15527(2003)；Yang等，BMC Genomics 6，90(2005))产生基因或蛋白质网络的模型。

本发明还包括通过本文所述的任何方法得到的细胞，以及包含所述细胞的多细胞生物。所述细胞可用于多种目的，包括：分子的工业生产(例如，许多耐受性表型和代谢物产生提高的表型)；生物除污(例如，有害废物耐受性表型)；鉴定在癌症病因中有活性的基因(例如，抗凋亡表型)；鉴定细菌及其它原核生物对抗生素的抗性中有活性的基因；鉴定害虫对杀虫剂的抗性中有活性的基因等。

在另一方面，本发明提供用于改变代谢物产生的方法。所述方法包括根据本文别处描述的方法突变全局转录机器以产生改造细胞。所述细胞优选为产生所选代谢物的细胞，并且如上所述，优选对代谢物产生预先进行优化。然后，可分离所选代谢物的产生发生提高或降低的细胞。该方法还可包括培养分离细胞以及从该细胞或细胞培养物中回收代谢物。可使用本领域公知的方法进行培养细胞以及回收代谢物的步骤。本文别处提供了多种优选的细胞类型、全局转录机器和代谢物。

如本文中进一步举例的，本发明包括可用于生产乙醇的经遗传修饰的酵母菌株。可根据本发明修饰多种酵母中的任一种并用于生产乙醇。示例性的酵母在上文中提到，并包括例如酵母菌、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、毕赤酵母、汉逊酵母(Hansenula)、丝孢酵母(Trichosporon)、酒香酵母、Pachysolen和Yamadazyma属的酵母和工业多倍体酵母菌株。在某些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans、C.sonorensis、C.methanosorbosa、C.diddensiae、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、C.naeodendra、C.balnkii、C.entomophila、C.shecatae、P.tannophilus或树干毕赤酵母(P.stipitis)。马克斯克鲁维酵母、C.sonorensis、C.shehatae、Pachysolen tannophilus和树干毕赤酵母是在木糖上生长的酵母细胞的实例。它们具有天然的木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸途径、天然的功能性醛糖和/或木糖还原酶基因、活性木糖醇脱氢酶基因以及将木糖转运穿过细胞壁或膜的天然能力。在本发明的多个实施方案中，所述酵母可以是单倍体、二倍体或多倍体(具有多于两个拷贝的其基因组的部分或全部)。

在本发明的某些实施方案中，酵母经遗传改造以表达或过表达(相对于野生型水平)一种或多种下述蛋白质，所述蛋白质赋予提高的摄取或代谢糖的能力。所述糖可以是例如单糖、二糖或寡糖。该糖可以是通常被酵母大量利用的糖。该糖可以是木糖、阿拉伯糖等。本领域已知针对木糖代谢改造酵母的多种方法。见例如Jeffries等，Curr.Op.Biotechnol.，17：320-326，2006和其中的参考文献，其通过参考整体并入本文。酵母可以被改造为进行戊糖磷酸途径(PPP)——存在于许多生物中的用于木糖代谢的生物化学途径。合适的蛋白质包括但不仅限于木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、磷酸酮酶以及便于底物进入细胞的转运蛋白或通透酶。在某些实施方案中，酵母能够将至少两种糖例如葡萄糖和木糖代谢为乙醇。

在本发明的某些实施方案中，将来自第一微生物(例如酵母)的一种或多种蛋白质在第二微生物中表达。例如，可将来自天然代谢木糖的酵母(例如树干毕赤酵母)的一种或多种基因在不能有效利用木糖或利用木糖效率较低的酵母中表达。在某些实施方案中，过表达编码戊糖磷酸途径中蛋白质的基因。在某些实施方案中，醛糖还原酶基因被缺失、破坏或以其他方式使其无功能。

在某些实施方案中，使用发酵木糖的重组酵母菌株，所述菌株表达木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶，并具有降低的PHO13或PHO13直系同源物表达。见例如美国专利公开号No.2006/0228789。在某些实施方案中，所述酵母是含有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因的重组酵母。见例如美国专利号No.5,789,210。在某些实施方案中，酵母经遗传改造或选择，以降低或消除一种或多种次级代谢产物例如甘油的产生。例如，在一个实施方案中，将编码负责甘油输出之通道的基因(例如酿酒酵母中的FPS1基因)缺失、破坏或以其他方式使其无功能。在某些实施方案中，过表达谷氨酰胺合酶基因，例如酿酒酵母中的GLT1(Kong等，Biotechnol.Lett.，28：2033-2038，2006)。在某些实施方案中，将酵母菌株改造或选择为具有降低的剩余NADH形成和/或提高的ATP消耗。在某些实施方案中，过表达编码谷氨酰胺合成酶的基因(酿酒酵母中的GLN1)。在某些实施方案中，过表达编码谷氨酸合酶的基因(酿酒酵母中的GLT1)。在某些实施方案中，编码NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶的基因(酿酒酵母中的GDH1)被缺失或使其无功能。

可进行任一种或多种前述修饰。例如，在一个实施方案中，谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶基因被过表达，NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶被缺失或使其无功能(Nissen等，Metabolic Engineering，2：69-77，2000)。可使用本领域已知在目的酵母中作用的多种表达控制序列(例如启动子、增强子)中的任何序列来表达蛋白质。启动子可以是组成型或诱导型的。在某些实施方案中，使用强启动子。本领域技术人员将能够针对具体的目的酵母选择适当的启动子。例如，酿酒酵母PGK1启动子可在该启动子有活性的酵母中使用。应当理解，适当时可使用另外的元件例如终止子等。经遗传修饰的细胞可含有外源引入的基因的一个或多个拷贝(例如2-10个)。多拷贝的外源基因可整合在宿主细胞基因组中的单个基因座上(从而其彼此相邻)或若干个基因座上。外源基因可以代替内源基因(例如经修饰的TBP基因可以代替内源基因)。引入的基因可随机整合进基因组中，或者在某些实施方案中保留为附加体。不同的外源基因可处于不同类型启动子和/或终止子的控制下。可通过设计和构建合适的载体并用这些载体转化细胞而在一个或多个步骤中完成细胞的遗传修饰。可以使用电转化和/或化学转化(例如基于氯化钙或醋酸锂)方法。用于转化酵母菌株的方法描述于WO 99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152、WO 03/049525和本文提到和/或是本领域已知的其他参考文献。在某些实施方案中，使用选择标记例如抗生素抗性标记或营养标记来选择转化体。

应当理解，与本文所述蛋白质(例如TBP，参与木糖代谢的酶)显示序列同一性和相似功能的蛋白质存在于多种不同酵母和其他真菌属中。本领域技术人员应当能够通过检索公众可获得的数据库(例如Genbank)和科学文献来鉴定这些蛋白质和编码它们的基因。在本发明的某些实施方案中，该蛋白质具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％的同一性等等。用于测定％同一性的方法是本领域已知的。可使用标准方法从其中尚未鉴定出该蛋白质的酵母中克隆同源蛋白质。这些方法包括基于互补的功能克隆、基于核酸杂交的克隆以及表达克隆。

本发明的酵母菌株可被进一步加工以实现其他期望的特征，或甚至更高的乙醇耐受性和/或乙醇或其他代谢产物产率。例如，对重组酵母菌株的选择可得到具有增强的耐受性和/或发酵速率的改进酵母，所述选择如下实现：将本发明的酵母菌株依次转移至含有适当底物的培养基上，或在选择性条件下连续培养中培养它们。

本发明的上述方面可适用于除酵母以外的多种真菌。本发明包括以与针对酵母所述相似的方式修饰真菌的TBP基因。本发明还包括向目的真菌中引入经修饰的酵母TBP基因。合适的真菌包括天然能够生产乙醇或经遗传修饰而能够生产乙醇的任何真菌。例如，在某些实施方案中，所述真菌是脉孢菌属(Neurospora)物种(Colvin等，JBacteriol，116(3)：1322-8，1973)。在另一些实施方案中，所述真菌是曲霉属(Aspergillus)物种(Abouzied等，Appl Environ Microbiol.52(5)：1055-9，1986)。在另一些实施方案中，所述真菌是拟青霉(Paecilomyces sp.)(Wu等，Nature，321(26)：887-888)。本发明还包括含有两种或更多微生物的共同培养物用于生产乙醇的用途。例如，共同培养物可含有酿酒酵母和至少一种其他真菌，例如曲霉属物种。

本发明中可使用标准发酵方法。例如，在含有合适的糖的发酵培养基中培养本发明的细胞。在某些实施方案中，所述糖是含有纤维素或半纤维素之生物物质的水解产物。发酵培养基也可以含有其他糖，值得注意的是己糖例如右旋糖(葡萄糖)，果糖，葡萄糖寡聚物如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖，以及潘糖。在寡聚糖的情况下，可以向发酵液中添加酶，从而将它们消化为相应的单体糖。培养基通常会含有特定细胞所需的营养物，包括氮源(例如氨基酸蛋白质，无机氮源例如氨水或铵盐等等)和多种维生素、矿物质等等。其他发酵条件例如温度、细胞密度、底物选择、营养物选择等可如本领域所已知地选择。在某些实施方案中，各个生长期和生产期期间的温度范围可从高于培养基的冻结温度到约50℃。可根据具体的微生物来选择最适温度。在非限制性的实施方案中，在生产期期间，发酵培养基中细胞的浓度范围可为约1-150(例如3-10)g干燥细胞/升发酵培养基。实施例中描述了使用本发明经修饰的菌株在多种不同底物浓度中达成提高的细胞密度的能力。具有这样密度的酵母培养物是本发明的一个方面。

在本发明的多个实施方案中，发酵可需氧、微需氧或缺氧地进行。该方法可连续进行、以分批的方式进行，或使用它们的组合。

需要时(例如在发酵过程中产生酸时)，可在发酵的生产期期间对培养基进行缓冲，使得pH维持在约5.0到约9.0，例如约5.5到约7.0的范围内。合适的缓冲剂包括碱性矿物质，例如氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨水、氢氧化铵等等。通常，在常规发酵过程中使用的这些缓冲剂也适用于本文。本发明的方法可以连续进行、分批、或以其组合进行。

本发明提供的另一方法是用于对选定的废品进行生物除污的方法。本文使用的“生物除污”是利用微生物(如细菌和其它原核生物)增强环境中有毒化合物的清除。生物除污中的困难之一是基于位点处存在的特定毒素而获得对该位点进行有效除污的细菌菌株或其它微生物。本文所述的用于改变细胞表型的方法提供了得到这样的细菌菌株的理想方法。例如，可通过突变细胞的全局转录机器以产生本发明的改造细胞，并分离与未改造细胞相比代谢更多量的所选废品的改造细胞，从而实现生物除污。然后，可培养所分离的改造细胞，并使其接触所选废品，由此提供对所选废品的生物除污。或者，需要除污的有毒废品位置处的材料样品可作为选择培养基，从而获得特异性针对特定有毒废品处特定毒素混合物的微生物。

本发明还提供核酸分子的集合，使用分子生物学的标准命名法，所述集合在本领域可理解为核酸分子“文库”。这样的集合/文库包括多种不同的核酸分子，其中每种核酸分子编码具有不同突变的全局转录机器，如本文别处所述。

本发明的其它集合/文库是包含含有上述核酸分子集合/文库的细胞的集合/文库。所述集合/文库包含多种细胞，其中每种细胞包含一种或多种所述核酸分子。所述集合中存在的细胞类型在本文别处有所描述，并包括单细胞和包含一种或多种这些细胞的多细胞生物。在所述细胞文库中，所述核酸分子可以以染色体外核酸(例如在质粒上)存在、可以整合到细胞基因组中，并可以替换编码内源全局转录机器的核酸。

可以向使用者提供核酸或细胞的集合/文库用于多种用途。例如，可在细胞集合中筛选使用者期望的表型。同样地，使用者可将核酸分子集合引入细胞中，以产生改造细胞，然后在所述改造细胞中筛选特定的目的表型。例如，为了使用本文所述的表型，寻求番茄红素产生的提高并且拥有产生一定量番茄红素的菌株的使用者可以将突变全局转录因子引入所述菌株，然后针对提高的番茄红素产生进行筛选。随后，还可实施通过突变和再次引入全局转录机器进行的后续轮次的定向进化，从而获得番茄红素产生的进一步提高。

可以将集合/文库贮存在本领域普遍使用的容器中，如管、微孔板等。

实施例

材料和方法

菌株和培养基

如实验方案所述，将大肠杆菌DH5α(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于常规转化以及本实验中的所有表型分析。在37℃下以225 RPM轨道振荡在包含5g/L D-葡萄糖并补充有1mM维生素B₁的LB-Miller培养基或M9-基本培养基中培养菌株(Maniatis，等，Molecular cloning：alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1982)。必要时，向培养基中补充34μg/ml氯霉素用于增殖低拷贝质粒以及68μg/ml氯霉素、20μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素用于维持高拷贝质粒。使用分光光度法在600nm处监测细胞密度。M9低盐培养基从US Biological(Swampscott，MA)处购得，X-gal从American Bioanalytical(Natick，MA)处购得，其它的所有化学品来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。引物从Invitrogen处购得。

构建文库

使用pUC19(Yanisch-Perron，等，Gene 33：103-119，1985)作为宿主背景菌株来构建低拷贝宿主质粒(pHACM)，使用pACYC184中的CAT基因(Chang，等，J Bacteriol 134：1141-1156，1978)和来自pSC101的pSC101复制起点(Bernardi，等，Nucleic Acids Res 12：9415-9426，1984)用氯霉素替换氨苄青霉素抗性。使用以下引物将来自pACYC184的氯霉素基因扩增为具有AatII和AhdI限制酶切位点突出端：CM_有义_AhdI：GTTGCCTGACTCCCCGTCGCCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAAC(SEQID NO：1)和CM_反义_AatII：CAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAACTGCAGT(SEQ ID NO：2)。将该片段与pUC19骨架消化并连接到一起从而形成pUC19-Cm。使用以下引物将来自pSC101的pSC101片段扩增为具有AflIII和NotI限制酶切位点突出端：pSC_有义_AflIII：CCCACATGTCCTAGACCTAGCTGCAGGTCGAGGA(SEQ ID NO：3)和pSC_反义_NotI：AAGGAAAAAAGCGGCCGCACGGGTAAGCCTGTTGATGATACCGCTGCCTTACT(SEQ ID NO：4)。该片段与pUC19-Cm构建体进行消化并连接到一起从而形成pHACM。

使用HindIII和SacI限制性突出端从大肠杆菌基因组DNA中扩增rpoD基因(EcoGene登记号：EG10896；B-编码：b3067；SEQ ID NO：27)，从而靶向pHACM中的lacZ基因以允许进行蓝/白筛选，其中使用引物：rpoD_有义_SacI：AACCTAGGAGCTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAGAGC(SEQID NO：5)和rpoD_反义_HindIII：TGGAAGCTTTAACGCCTGATCCGGCCTACCGATTAAT(SEQ ID NO：6)。使用GenemorphII随机诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)以及多种浓度的初始模板对片段进行诱变，从而获得低、中和高突变率，如产品手册中所述。PCR后，使用Qiagen PCR回收试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)对这些片段进行纯化，用HindIII和SacI消化过夜，过夜连接入经消化的pHACM骨架中，并转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将细胞铺到LB琼脂平板上并刮下，以产生液体文库。白色菌落文库的总规模大约为10⁵～10⁶。

表型选择

将来自液体文库的样品置于攻击环境中从而选择存活的突变体。对乙醇耐受性来说，将菌株置于含有50g/L乙醇的经过滤LB中。在37℃下在30×115mm加盖密闭的离心管中振荡培养。20小时后将菌株铺板，并选择个体菌落进行测试。对于乙酸耐受性来说，在含有浓度逐渐提高的乙酸根(起始浓度为20g/L并增加到30g/L)的M9基本培养基中将菌株连续传代培养两次。然后，将细胞铺在LB平板上，并选择若干菌落用于单菌落测定。对于对羟基苯甲酸(pHBA)耐受性来说，将菌株培养在含有20g/L pHBA的M9基本培养基中，并在20小时后铺板以选择存活的细胞。回收来自所有鉴定为具有改进表型的菌株的质粒，并再次转化进新一批感受态细胞中。从每个平板选择若干菌落进行生物学再现，从而验证表型。

序列分析

使用以下引物组合对突变体σ因子的序列进行测序：

S1：CCATATGCGGTGTGAAATACCGC(SEQ ID NO：7)，

S2：CACAGCTGAAACTTCTTGTCACCC(SEQ ID NO：8)，

S3：TTGTTGACCCGAACGCAGAAGA(SEQ ID NO：9)，

S4：AGAAACCGGCCTGACCATCG(SEQ ID NO：10)，

A1：GCTTCGATCTGACGGATACGTTCG(SEQ ID NO：11)，

A2：CAGGTTGCGTAGGTGGAGAACTTG(SEQ ID NO：12)，

A3：GTGACTGCGACCTTTCGCTTTG(SEQ ID NO：13)，

A4：CATCAGATCATCGGCATCCG(SEQ ID NO：14)，

A5：GCTTCGGCAGCATCTTCGT(SEQ ID NO：15)，和

A6：CGGAAGCGATCACCTATCTGC(SEQ ID NO：16)。

使用Clustal W版本1.82对序列进行比对和比较。

实施例1：

在大肠杆菌中对主要σ因子(σ⁷⁰)进行定向进化，以寻找提高的耐受性表型。选择所述主要σ因子的前提是，突变将改变启动子的偏好和转录速率，因此在全局水平调节转录组。对rpoD基因和天然启动子区进行易错PCR，并克隆入低拷贝表达载体中(图1)。首先构建包含近10⁵～10⁶个活突变体的文库并转化入菌株中。

通过在高乙醇浓度、高乙酸根浓度和高对羟基苯甲酸(pHBA)浓度的极端条件下培养来选择所述文库。之所以选择这些条件是因为它们具有工业相关性：乙酸是大肠杆菌的副产物，其抑制细胞生长，然而预期可通过改造出乙醇耐受性提高的菌株来加强生物乙醇生产，因此可能提高产率(L.O.Ingram等，Biotechnol Bioeng 58，204-14(1998年4月5日))。另外，生产作为电子涂料前体的pHBA具有相当大的工业意义，然而其对细胞毒性极大(T.K.Van Dyk，L.J.Templeton，K.A.Cantera，P.L.Sharpe，F.S.Sariaslani，J Bacteriol 186，7196-204(2004年11月)；J.L.Barker，J.W.Frost，Biotechnol Bioeng 76，376-90(2001年12月))。已通过随机细胞诱变、基因互补和敲除研究以及微阵列分析的传统方法对这些耐受性表型中的每一种进行了研究(R.T.Gill，S.Wildt，Y.T.Yang，S.Ziesman，G.Stephanopoulos，Proc Natl Acad Sci USA 99，7033-8(2002年5月14日))，至今仅取得有限的成功。

乙醇耐受性

首先，基于LB复合培养基中存在高浓度乙醇时的生长能力来选择σ因子突变体文库(L.P.Yomano，S.W.York，L.O.Ingram，J Ind MicrobiolBiotechnol 20，132-8(1998年2月))。对于该选择来说，在50g/L乙醇中将菌株连续过夜传代培养两次，然后涂板以选择耐受性突变体。选择并测定了总共20个生长在不同乙醇浓度中的菌落。在分离并验证改进菌株后，将最优的突变体σ因子进行连续的多轮进化。连续两次反复后，选择浓度提高到70和80g/L乙醇。在这些富集实验中，由于使用强选择压力，细胞在孵育4小时和8小时后涂板。从每轮分离的突变体显示出多种乙醇浓度中整体生长的提高(图2A)。

图2B鉴定了从每轮诱变中分离的最优突变体的序列。图2D提供了乙醇耐受性σ因子的序列对比。令人感兴趣地，第二轮诱变导致形成截短的因子，其明显有利于增加整体的乙醇适应性。该截短来自于限制酶消化的人工产物，并包含所述蛋白质中区域3的一部分和完整的区域4。区域4负责结合启动子区，先前已表明与全长蛋白质相比，截短形式提高结合亲合力(U.K.Sharma，S.Ravishankar，R.K.Shandil，P.V.K.Praveen，T.S.Balganesh，J.Bacteriol.181，5855-5859(1999))。因此，该截短突变体可能通过结合优选的启动子区并阻止转录来作为强特异性转录抑制剂，因为其余的σ因子机器已被去除。在截短形式的第二轮突变体中，第一轮的I511V突变回复成异亮氨酸，仅剩下一个突变。

将所述截短形式进行第三轮诱变和选择，以获得包含另外8种突变的因子。在这最后一轮中，前两轮中发现的R603C突变回复成原始残基，并且发生了许多新的突变，仅剩截短作为第二轮和第三轮之间仅有的可见相似性。这些轮诱变以及所得序列提示与定向进化的蛋白质相比存在差异。在后一种情况中，提高蛋白质功能的突变的性质通常是加和性的。另一方面，改变转录机器的突变不一定是加和性的，因为这些因子发挥转录组中间渠道(conduit)的作用。在这方面，由于存在可导致改进表型的多种基因变化亚组，序列空间中可能存在许多局部最大值(maxima)。

所有包含突变体σ因子的分离菌株均在提高的乙醇浓度下表现出与对照相比提高的生长速率。另外，不存在乙醇时突变菌株的生长表型不受影响(表1)。

表1：乙醇耐受性σ因子的定向进化。对于三轮定向进化，对逐渐增加的乙醇浓度显示了倍增时间减少倍数的改进。第二轮和第三轮中的突变体在高浓度乙醇下显示生长速率显著增加。在所有定向进化轮次中，观察到了可持续细胞生长最高浓度的持续提高。

第二轮中分离的截短突变体在高乙醇浓度下表现出增加的生长速率；然而，与第一轮突变体相比，在低乙醇浓度下其生长速率降低。从第三轮分离的突变体在20～50g/L乙醇中表现出恢复的生长速率，类似于第一轮的生长速率。最重要的是，每一后续轮次均提高了最高乙醇浓度，在该浓度下细胞能够维持生长超过8小时，而不死于乙醇的毒性，也没有伴随细胞密度的下降。通过本方法获得的显著提高的乙醇耐受性通过(图2C)所示的第三轮菌株生长曲线以及野生型对照的生长曲线来举例说明。σ因子改造(sigma factor engineering，SFE)能够提高乙醇耐受性至超过使用更传统方法的先前文献所报道的水平。另外，举例说明了应用反复多轮SFE能够进一步改进细胞表型。

乙酸和pHBA耐受性

作为另一实例，在含有20g/L和其后为30g/L乙酸根的M9-基本培养基中将原始的σ因子突变体文库连续传代培养两次。从该混合物中分离单菌落，再次转化以排除任何基于染色体的生长适应，并测定在不同乙酸根浓度下的生长。所分离的菌株显示在高水平乙酸根存在的耐受性显著提高。另外，在不存在乙酸根时，生长速率仍不受显著影响(表2)。在30g/L乙酸根中，所分离菌株的倍增时间为10.5-12.5小时，约为严重受抑制对照的倍增时间的1/5(56小时倍增时间)。

表2：应用转录机器改造得到其它表型。分离在升高的乙酸根水平或高水平pHBA存在下表现出耐受性增加的突变体。在升高的化学品水平下观察到耐受性的提高，然而，不存在这些化学品时未观察到生长速率或产率的不利影响。

图3A总结了通过按照所分离σ因子中引发细胞乙酸根耐受性提高的区域进行分类的多种突变。图3B提供了乙酸根耐受性σ因子的序列对比。5个分离突变体中仅有一个是截短的。在两个乙酸突变体中出现M567V突变，并且大多数突变似乎分布在σ因子的功能结构域中。很有意思地注意到，即使菌株具有相似的耐受性谱，其内在突变也可能不同，这提示存在影响转录谱的不同分子机制。

作为另一实例，在20g/L pHBA存在下培养突变体文库，以在高pHBA浓度下的生长和生存力方面选择对该化合物耐受性提高的菌株。分离了一个与对照相比在13小时生长量显著提高并且在pHBA不存在时基本不改变生长表型的菌株(表2)。突变体HBA1显示为截短形式的σ因子，其总共具有6个突变(图3A)，其中6个残基中的4个变为缬氨酸。图3C提供了pHBA耐受性σ因子的序列对比。

这些实施例举例说明了σ因子改造用于引入全局转录组改变的潜力，所述改变使生物获得新的细胞表型。最近，我们已成功地将全局转录机器改造的概念超越耐受性表型，而延伸至选择代谢物过度产生速率增加的突变体(见下文)。另外，已使用包含真核转录机器组分的其它宿主系统对这一概念进行了探索。在每一个这些实例中，通过随机突变在转录调节机器的组分中引起的全局变化已显示改进了细胞表型，其改进水平超过了通过推理性改造或通过随机诱变进行的传统菌株改进所得到的水平。

我们第一次证明了应用定向进化来改变全局转录机器。与典型的连续逐个基因策略相反，本策略允许同时定向修饰多个基因的遗传控制。另外，我们发现可以应用定向进化的概念，因为它能够通过深入探测转录因子改造的巨大序列空间而依次进行表型改进。因此，现在有可能解密多基因调节的复杂表型，这是非常不可能通过相对低效的反复搜索策略而实现的。

值得注意的是，所述方法还可以反过来应用于揭示基因型与表型之间复杂的相互作用。在这些应用中，人们将使用许多高通量的细胞和分子测定来评估改造细胞的状态，并最终推导出这些突变体中隐藏在所观察表型下的系统作用机理。本文所述对全局转录机器进行定向进化的应用是用于鉴定遗传靶标、引发期望的表型和实现全细胞改造目标的概念转换(paradigm shifting)方法。

实施例2：

有机溶剂耐受性

全局转录机器改造的应用已延伸至包括另外的耐受性表型。细菌菌株对有机溶剂的耐受性可用于以下几种情况中：(1)有害废物的生物除污，(2)从细菌中生物产生有机溶剂，以及(3)需要两相反应器的生物工艺应用(即提取发酵以连续除去疏水产物的操作)。为了研究在大肠杆菌中提高溶剂耐受性的潜力，培养原始的rpoD(σ⁷⁰)突变体文库，在指数期收获并转移至含有LB培养基和己烷(10％体积/体积)的两相系统中。在己烷存在下培养18小时后分离菌株。将这些个体菌落再次培养至指数期，然后在己烷存在下进行培养。17小时后测量细胞密度。包含己烷的培养物的细胞密度显示于图4。图4所示菌株为在生物学重复中再次转化的菌株。所有所选菌株细胞密度的增加均超过包含未突变rpoD基因的对照菌株。另外，PCR分析表明，突变株Hex-3、Hex-8、Hex-11、Hex-12、Hex-13、Hex-17和Hex-19具有完整形式的σ因子，而菌株Hex-2、Hex-6、Hex-9、Hex-10和Hex-18具有截短的形式。图4还显示两个最佳性能突变体(Hex-12和Hex-18)的序列(突变的位置)。

另外，测试这些菌株在环己烷存在下的生长，已知与己烷相比，环己烷是对微生物毒性更高的有机溶剂。图5显示来自环己烷培养物的细胞密度。从己烷选择中分离的几个菌株也显示了超过对照的细胞密度提高。

实施例3：

抗生素抗性

全局转录机器改造的应用已延伸至包括抗生素抗性。微生物中的抗生素抗性已变为重要的问题，这迫使卫生保健和药物公司寻找对抗感染的替代方法。已知许多抗性菌株包含编码抗性的特定基因。然而，在微生物能够进化出这样的基因之前，它们必须首先获得初步的抗性，以努力在抗生素存在下持续。尽管在基因组中发生随机突变是一种备选方案，但细胞还可以应答于这些抗生素而改变其基因表达。测试了使用全局转录机器改造来鉴定获得抗生素抗性菌株的可能性。该表型最终将受到经改造的转录组表达的控制，所述改变的表达由突变体转录机器来介导。对这些菌株基因表达的分析可鉴定控制菌株抗性的新的基因靶标和酶。然后，这些靶标可导致开发出抑制或增强所鉴定酶活性的小分子药物。通过在250μg/ml萘啶酸、喹诺酮(与环丙沙星为同一药物家族)存在下培养突变体σ因子文库来测试抗生素抗性，所述浓度超过了约为80μg/ml的对照最低抑制浓度。图6显示逐渐提高的萘啶酸浓度下多种分离菌株的细胞密度(OD600)。几种分离菌株表现出高浓度萘啶酸存在下的显著生长。在将质粒转化入新的宿主菌株后测试这些菌株，以进行验证。另外，将这些突变体测序；PCR分析表明突变株NdA-7和NdA-15是全长σ因子，而NdA-10、NdA-11、NdA-12和NdA-13为截短形式。

实施例4：

代谢物过量产生表型

全局转录机器改造的基本意义是产生多重和同时的基因表达改变的能力。该方法先前已成功用于鉴定耐受性表型提高的突变体。在随后的这些实施例中，对主要σ因子(由rpoD编码)突变体文库检查其增强代谢物过量产生表型至超越单遗传修饰所实现水平的能力。

番茄红素产生

我们先前已鉴定了许多单基因及多基因敲除靶标，其在预先改造菌株的背景中表现出番茄红素产生的提高(Alper等，Nat Biotechnol 2005和Alper等，Metab Eng 2005)。在本研究中，我们设法应用全局转录机器改造技术来增强番茄红素的产生。应用若干先前改造的可用菌株背景和亲本菌株，有可能独立地在每个背景中搜寻导致番茄红素产生提高的突变体因子。对于本研究而言，选择了亲本菌株Δhnr以及两个经鉴定的全局最大菌株(global maximum strain)ΔgdhAΔaceEΔfdhF和ΔgdhAΔaceEΔ_PyjiD。然后，将来自四个被测遗传背景中每一个的最优突变体进行交换，以研究将4种菌株与4种已鉴定σ因子混合所产生的情况。

鉴定突变体σ因子

将突变体σ因子文库转化入四种菌株中的每一种，并基于在补充有5g/L葡萄糖的基本培养基平板上的番茄红素产生来进行选择。然后，使用M9培养基培养所选菌株并测定番茄红素在15和24小时时的产量。图7A-7D展示了这些检索的结果以及来自最优菌株的σ因子突变体序列。标出了带有或不带有对照质粒的菌株的番茄红素产生。对于某些背景来说，这种对照质粒导致番茄红素产生大大下降，超过缺乏该质粒的菌株。值得注意的是，所有这些经鉴定的因子都是截短的。另外，来自hnr敲除背景的经鉴定突变体仅简单地为截短形式，不包含突变。由于所推测的该截短物作用模式，有可能该突变体因子显著抑制在rpoD控制下表达的所有正常基因。在hnr突变体中，稳态水平较高的稳定期σ因子(σ^S)可接手其余的转录。另外，在该背景中第二高的突变体得到包含若干突变的全长σ因子。

菌株与所鉴定突变体因子的组合

然后，将具有不同遗传背景的4种菌株与4种独立鉴定的突变体σ因子组合，以检查所得的16种菌株的情况。首先值得注意的是，图7A-7D中对给定遗传背景进行测序的所有已鉴定突变体均不与另一遗传背景中鉴定的突变体重叠。因此，最初推测情况将是对角优势，表明突变体因子引发的影响对遗传背景具有特异性。将这16种菌株以及对照培养在2×M9培养基中并分段添加葡萄糖。测定在15、24、39和48小时时间点的番茄红素水平。图8显示描述在发酵期间实现的番茄红素产生与对照相比的最大提高倍数的散点图。圆的大小与提高倍数成比例。与推测一致，该模式为明显的对角优势，其中突变体因子主要在鉴定它们的菌株背景中发挥作用。

图9举例说明15小时后几个目的菌株的番茄红素含量。在亲本菌株和hnr敲除中均进行的单轮诱变能够得到与预先通过引入3个不同基因敲除而改造的菌株类似的结果。然而，在这些背景中，引入另外的突变体σ因子能够进一步提高番茄红素水平。

这些结果表明，(1)全局转录机器改造(global transcriptionmachinary engineering，gTME)能够引发代谢表型，更重要的是(2)使用gTME进行单轮选择比单个敲除或过表达修饰更有效。另外，所鉴定的突变体通常不能在菌株背景之间转移，这提示在每个菌株中可能存在不同的番茄红素产生方式。作为这些模式的实例，野生型菌株中的最大差异倍数在仅仅15小时后就得以实现，然后与对照菌株在发酵结束之前逐渐接近。反言之，对于逐渐提高的时间点，ΔgdhAΔaceEΔ_PyjiD菌株中突变体因子的番茄红素含量与对照相比逐渐增加。尽管如此，最高的番茄红素产生来自在预先改造菌株背景中使用gTME，这表明如果只进行一轮选择，则从优化菌株开始是比较好的。然而，乙醇耐受性的结果提示，有可能通过应用定向进化来实现连续的适合性改进，表明有可能进一步增加番茄红素的产量。

聚羟基丁酸酯(PHB)的生物生产

全局转录机器改造的应用已延伸至包括代谢物过量生产的其他实例。使用转录机器改造研究了另一代谢表型(除产生番茄红素外)——聚羟基丁酸酯(PHB)的生物生产。PHB从乙酰辅酶A前体分子产生。

材料/方法

在37℃下，在含有20g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中培养转化了经修饰的pJOE7质粒(Lawrence，A.G.，J.Choi，C.Rha，J.Stubbe，和A.J.Sinskey.2005.Biomacromolecules6：2113-2119)的大肠杆菌(XL-1 Blue，Stratagene，La Jolla，Calif.)。经修饰的pJOE7由Anthony Sinskey博士(MIT，Cambridge，MA)惠赠，其包含来自板口线虫(C.necator)的phaAB和来自Allochromatium vinosum的phEC，并编码卡那霉素抗性。作为无PHB的对照，还培养了不含pha基因的同一质粒。使用Ultraspec 2100 pro(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)使用吸光度追踪细胞生长。

染色和流式细胞术

除非另有注明，通过溶解至1mg/mL二甲基亚砜中来配制尼罗红(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)原液。如染色优化中所指出的，将3μL原液加至1mL染色缓冲液中。利用FACScan(Becton Dickinson，MountainView，CA)进行流式细胞术，使用如下设置：集胞蓝细菌(Synechocystis)FSC＝E00，SSC＝411，FL-1＝582，FL-2＝551以及大肠杆菌FSC＝E00，SSC＝411，FL-1＝582，FL-2＝535。用风冷式氩离子激光器(488nm)激发细胞，使用FL-2(585nm)检测尼罗红荧光。使用WinMDI 2.8对50,000个细胞进行流式细胞术分析。

染色效率通过分辨率Rs(Eq.1)来表征，其中M_n是n的荧光分布的几何平均值(n＝1为产生PHB的细胞，n＝2是非PHB对照)。δ_n是荧光分布的标准差。Rs是区分两个群体能力的定量量度。

R_{S} = \frac{2 (M_{1} - M_{2})}{δ_{1} + δ_{2}} . . . (1)

通过最终染色样品中cfu与培养基中细胞的比率来评估细胞生存力。

化学PHB分析

如前所示分析PHB(Taroncher-Oldenburg，G.和G.Stephanopoulos.2000.Applied Microbiology and Biotechnology 54：677-680)。通过离心(10分钟，3,200×g)从培养物中收集＞10mg的细胞。用冷的去离子水洗涤所得沉淀一次，并在80℃干燥过夜。将干燥的沉淀在1ml浓H₂SO₄中煮沸60分钟，用4ml的0.014M H₂SO₄进行稀释。离心样品(15分钟，18,000×g)以除去细胞碎片，使用Aminex HPX-87H离子排阻柱(300×7.8mm；Bio-Rad，Hercules，Calif.)利用HPLC分析液体(Karr，D.B.，J.K.Waters，和D.W.Emerich.1983.Applied and Environmental Microbiology46：1339-1344)。使用与样品进行平行处理的市售PHB(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)作为标准品。

大肠杆菌染色优化

如前述培养包含经修饰pJOE的大肠杆菌XL1-blue和无PHB对照。

刺激(shock)优化：将培养物培养至稳定期。在刺激后测试多种不同透化方法的分辨率和生存力。如前所述(Vazquez-Laslop，N.，H.Lee，R.Hu和A.A.Neyfakh.2001.J.Bacteriol.183：2399-2404)进行蔗糖刺激。将1mL细胞冷却至4℃ 10分钟。然后将细胞离心(3分钟，3000×g，4℃)并在1mL冰冷的TSE缓冲液(10mM Tris-Cl[pH＝7.5]，20％蔗糖，2.5mMNa-EDTA)中重悬。细胞在冰上孵育10分钟，然后用包含3μL尼罗红原液的1mL去离子水重悬(3分钟，3000×g，4℃)。细胞在黑暗中染色30分钟，并利用FACScan进行分析。将异丙醇刺激的细胞离心(3分钟，3000×g)并重悬在70％异丙醇中15分钟。然后，离心细胞(3分钟，3000×g)并重悬于包含3μL尼罗红原液的去离子水中。细胞在黑暗中孵育30分钟并利用FACScan进行分析。通过离心(3分钟，3000×g)1mL细胞培养物进行DMSO刺激。将50μL尼罗红原液直接添加至沉淀。迅速将沉淀涡旋并在孵育30s后稀释在1mL水中。在黑暗中孵育细胞30分钟并利用FACScan进行分析。像感受态细胞制备(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press)中那样进行热激。将1mL细胞冷却10分钟。然后，离心细胞(3分钟，3000×g，4℃)，并重悬在1mL冷的80mM MgCl₂/20mM CaCl₂中。离心细胞(3分钟，3000×g，4℃)并重悬在包含3μL尼罗红原液的1mL 0.1M CaCl₂中。在42℃热激细胞90秒。在黑暗中孵育细胞30分钟然后利用FACScan进行分析。

浓度优化：通过使用3μL不同的尼罗红溶液至终浓度为30-30,000ng/mL进行蔗糖刺激来制备细胞。

蔗糖浓度优化：通过使用具有不同蔗糖浓度(0、5、10、15、20％)的TSE缓冲液的蔗糖刺激来制备细胞。

如上所述，将突变体σ因子文库引入大肠杆菌。在葡萄糖基本培养基中选择指数期PHB增加的菌株。另外，还测试使用转座子诱变产生的随机敲除文库，以比较转录机器改造与传统菌株改进方法的效率。图10A显示使用σ因子改造获得的多种菌株的数据(红色和黄色柱代表对照)。作为比较，图10B显示从随机敲除文库中选择的菌株的结果。使用σ因子改造获得的几个突变体产生了接近25％dcw(dry cell weight，细胞干重)的PHB。在一轮σ因子改造中获得的最优菌株比使用随机敲除获得的最优菌株要优秀得多。如上述在所述最优突变体背景下进行第二轮诱变从而得到进一步改进的PHB表型。

实施例5：

文库的多样性和构建

以一种或多种以下方式提高σ因子文库的大小和宽度。

(1)所述文库不仅包括大肠杆菌的主要σ因子(σ⁷⁰，由rpoD编码)，还包括一种或多种替代形式，例如rpoS、rpoF、rpoH、rpoN、rpoE和/或fecI。

有可能通过同时引入转录机器单元的多种突变体形式来进一步改进表型并寻找最优菌株。使用例如共表达两个或更多这些基因的表达盒来表达突变的σ因子基因(或其它全局转录机器)。所述两个或更多基因可以是两种或更多相同类型的转录机器(例如rpoD的两种形式)，或者可以是两种或更多不同的转录机器(例如rpoD和rpoS)。

同样地，超过一种不同的全局转录机器突变体形式可能对表型的适当优化有利。例如，可共表达多种突变的σ70(rpoD)。

(2)除了通过如上述的易错PCR引入随机突变以外，所述文库包括从C端和N端所有可能的截短及其组合。

(3)另外，所述文库包括多个σ因子区的替代嵌合体，其通过人工融合这些区域得到。例如，使用σ因子70的区域1替换σ因子38的区域1。通过使用DNA改组产生多样性的类似方法是本领域公知的(例如，W.Stemmer等的基因改组专利，转让给Maxygen；参见maxygen.com/science-patents的列表)。

(4)文库中包括来自其它细菌与上文对大肠杆菌σ因子70所述构型(例如随机突变、截短、嵌合体、改组)相同的σ因子。这些因子可具有独特的DNA结合特性并可有助于产生多种转录组改变。

实施例6：

真核细胞中的全局转录机器改造

对酵母和哺乳动物系统(例如CHO、HeLa、Hek细胞系)应用全局转录机器的定向进化，以在诱导条件下增强重组蛋白质生产和产生凋亡抗性。

对编码全局转录机器(例如TFIID)的基因进行易错PCR、截短和/或DNA改组，从而得到全局转录机器突变体的多样性文库。将所述文库引入酵母或哺乳动物细胞中，并在一个实验中检测细胞产生的重组蛋白。这些实验中优选易于测定的蛋白质，如SEAP或荧光蛋白(例如GFP)。对于荧光蛋白的情况，可使用激发荧光细胞分选仪选择细胞，或者如果在多孔平板中培养，则可使用荧光平板读数器测定蛋白质产生的增强。

在另一个实验中，在酵母或哺乳动物细胞中检测抗凋亡表型。

实施例7：

SDS耐受性

将全局转录机器的定向进化应用于细胞对十二烷基硫酸钠(SDS)的耐受性这一问题。

将突变体rpoD文库转化入大肠杆菌DH5α中，然后将其在包含量逐渐增加的SDS(5重量％，然后15重量％SDS)的LB培养基中传代培养。在菌株中对在SDS中耐受性的提高进行选择。选择菌株SDS-2并再次转化以验证其表型。然后在5-20重量％SDS中测试菌株SDS-2。发现该突变体在升高的SDS水平下生长增加，不存在SDS时对生长没有任何不利影响。图11显示在逐渐提高的SDS浓度下，SDS耐受性σ因子突变体分离菌株培养物的细胞密度，以及来自最优菌株的σ因子突变体的序列。

实施例8：

改造出多种表型

将全局转录机器改造用于在大肠杆菌中传递多耐受性表型的问题。为了同时获得乙醇和SDS耐受性，在一个实验中，遵循三种替代策略分离菌株：(i)在用乙醇和SDS中均进行处理/选择后分离突变体，(ii)首先分离具有乙醇耐受性的突变体，然后使用乙醇/SDS混合物进行另一轮诱变和选择，以及(iii)首先分离具有SDS耐受性的突变体，然后使用乙醇/SDS混合物进行另一轮诱变和选择。测试这些菌株在多种乙醇和SDS浓度存在下的生长，从而获得生长曲线并评估这些方案的有效性。使用在上述其它实施例中所述的方案进行实验。

在另一组实验中，从乙醇耐受性菌株中分离突变体σ因子，并与分离自SDS耐受性菌株的突变体σ因子共表达。使用在上述其它实施例中所述的方案进行实验。

实施例9：

将全局转录机器改造(gTME)扩展至酵母系统

在任何类型的细胞系统中，都有一组蛋白质负责协调全局性基因表达。这样，这些蛋白质提供多种转录组修饰的进入点，所述修饰广泛地影响高等生物的表型。本实施例展示将gTME应用于酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))真核模型系统中。与原核系统的转录机器完全不同的是，就与启动子特异性的调节相关的组分和因子数而言，真核转录机器更为复杂。首先，在真核系统中存在具有不同功能的3种RNA聚合酶，而原核生物中仅存在一种。另外，这种复杂性的实例可通过划分为通用转录因子或RNA聚合酶II系统共激活子的近75种组分来示例(Hahn，Nat Struct Mol Biol，11(5)，394-403，2004)。通用因子TFIID的组分包括TATA结合蛋白(Spt15)和14种另外的相关因子(TAF)，并被认为是调节启动子特异性的主要DNA结合蛋白(Hahn，2004)。而且，已显示TATA结合蛋白突变体改变3种聚合酶的偏好性，提示其在协调酵母整体转录中的关键作用(Schultz，Reeder，& Hahn，Cell，69(4)，697-702，1992)。本研究着眼于两种主要的转录蛋白：TATA结合蛋白(Spt15)和TAF(TAF25)。

TATA结合蛋白的晶体结构是已有的，并清楚地显示出与DNA直接结合的蛋白质部分以及与TAF和聚合酶部分发生蛋白质结合的其他部分(Bewley，Gronenborn，& Clore，Annu Rev Biophys Biomol Struct，27，105-131，1998；Chasman等，Proc Natl Acad Sci USA，90(17)，8174-8178，1993；J.L.Kim，Nikolov，& Burley，Nature，365(6446)，520-527，1993)。所述结构由与DNA相互作用的两个重复区和与蛋白质相互作用的两个螺旋组成。测定和突变分析提示，TATA结合蛋白在启动子特异性和全局转录中发挥重要作用。另外，已经提出了DNA接触点和蛋白质相互作用点的重要残基(Arndt等，Mol Cell Biol，12(5)，2372-2382，1992；J.Kim & Iyer，Mol Cell Biol，24(18)，8104-8112，2004；Kou等，MoI Cell Biol，23(9)，3186-3201，2003；Schultz，Reeder，& Hahn，1992；Spencer & Arndt，MolCell Biol，22(24)，8744-8755，2002)。TAF家族蛋白也已得到不同程度的关注。使用序列比对并通过突变分析对本研究的对象TAF25蛋白进行分析，其显示出影响许多基因的转录(Kirchner等，Mol Cell Biol，21(19)，6668-6680，2001)。发现该蛋白质包含一系列对蛋白质相互作用至关重要的螺旋和接头。使用gTME方法研究这些蛋白质已产生3种目的表型：(1)对模拟渗透胁迫的LiCl的耐受性，(2)高葡萄糖耐受性，和(3)对高乙醇和高葡萄糖均具耐受性。

方法

本研究中使用的酿酒酵母菌株BY4741(MATa；his3Δl；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)得自EUROSCARF，Frankfurt，Germany。其在YPD培养基(10g酵母提取物/升，20g Bacto蛋白胨/升以及20g葡萄糖/升)中培养。对于酵母转化，使用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒(ZYMORESEARCH)。为了选择和培养带有以URA3作为选择标记的质粒的酵母转化体，使用包含6.7g酵母氮源(Difco)/升、20g葡萄糖/升和适当的核苷酸和氨基酸混合物(CSM-URA，Qbiogene)的酵母合成完全(YSC)培养基(本文中称为YSC Ura^-)。对于固体培养基，在该培养基中补充1.5％琼脂。

产生文库并将其克隆至TEF-mut2启动子之后，所述TEF-mut2启动子先前作为酵母启动子文库的一部分产生(Alper等，Proc Natl Acad SciUSA，102(36)，12678-12683，2005)。使用以下引物从基因组DNA中克隆Taf25基因：TAF25_有义：TCGAGTGCTAGCAAAATGGATTTTGAGGAAGATTACGAT(SEQID NO：28)和TAF25_反义：CTAGCGGTCGACCTAACGATAAAAGTCTGGGCGACCT(SEQID NO：29)。使用以下引物从基因组DNA中克隆Spt15基因：SPT15_有义：TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG(SEQ IDNO：30)和SPT15反义：

CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA(SEQ IDNO：31)。使用GeneMorph II诱变试剂盒突变基因，并使用NheI和SalI消化产物并连接到用XbaI和SalI消化的质粒骨架中。将质粒转化入大肠杆菌DH5α中，使用质粒MiniPrep Spin试剂盒分离并转化入酵母中。使用以下引物对质粒进行测序：Seq_正向：

TCACTCAGTAGAACGGGAGC(SEQ ID NO：32)和Seq_反向：

AATAGGGACCTAGACTTCAG(SEQ ID NO：33)。

通过在200至400mM LiCl、200至300g/L葡萄糖以及适当时5％乙醇/100g/L葡萄糖至6％乙醇/120g/L葡萄糖中连续传代培养来分离菌株。通过涂在选择培养基平板上来分离细胞并测定性能。分离质粒并再次转化，以在生物学重复中验证表型。

LiCl耐受性

渗透胁迫应答和耐受性是细胞中复杂的多效应答。对于酵母来说，已经显示提高的LiCl浓度(浓度约为100mM)可诱导渗透胁迫(Haro，Garciadeblas，& Rodriguez-Navarro，FEBS Lett，291(2)，189-191，1991；Lee，Van Montagu，& Verbruggen，Proc Natl Acad Sci USA，96(10)，5873-5877，1999；Park等，Nat Biotechnol，21(10)，1208-1214，2003)。将携带突变体形式TBP或TAF25的酵母细胞文库在200～400mM LiCl中连续传代培养。分离菌株并再次转化，以验证表型是突变体因子的结果。令人感兴趣的是，来自每个文库的最优菌株显示针对LiCl的不同改进。在较低LiCl浓度时TAF25优于各自的TAF25未突变对照，而在浓度高于约200mM时没有效果。相反，在150～400mM的升高水平下，SPT15突变体能够优于对照。在每种情况下，无LiCl时的生长表型均不受突变体因子存在的影响。图12提供了生长量改善的总结。序列分析(图13)表明，LiCl耐受性的改进受每个蛋白质中单个突变的控制，SPT15突变发生在非保守区。

高葡萄糖耐受性

已经研究了高葡萄糖深度发酵，用于从酵母批量培养物中提高乙醇产生。然而，这些“极高重力发酵(very high gravity fermentation)”常对细胞生长具有相当的抑制作用，并通常通过改变培养基组成来处理，而非改变细胞(Bafrncová等，Biotechnology Letters，21(4)，337-341，1999；Bai等，J Biotechnol，110(3)，287-293，2004；Thatipamala，Rohani，& Hill，Biotechnology and Bioengineering，40(2)，289-297，1992)。为了使用gTME研究这一问题，将携带突变体形式TBP或TAF25的酵母细胞文库在200至400g/L葡萄糖中连续传代培养。分离菌株并再次转化，以验证所述表型是突变体因子的结果。菌株在培养16小时之后显示细胞密度提高2至2.5倍。与LiCl的情形不同，TAF25和SPT15蛋白均对升高的葡萄糖显示类似的应答，超过对照的最大改进发生在150至250g/L之间。然而，SPT15突变体表现出超过TAF25的更大改进。图14显示这些突变体的生长改进，图15显示其序列。在该情形中，两种蛋白质均仅具有单个突变，然而分离了几种SPT15蛋白的次优突变体，其中一些具有多达7个突变。本文显示的两个突变均位于已知的蛋白质接触区，尤其是TAF25蛋白中的I143残基(Schultz，Reeder，& Hahn，1992)。

乙醇和葡萄糖多重耐受性

成功的酵母生物乙醇发酵需要对高葡萄糖和乙醇浓度均有耐受性。为此，通过用升高的乙醇和葡萄糖水平(5％和100g/L)同时处理两种突变体文库来测试多重耐受性表型。将分离的菌株再次转化，并在5和6％乙醇存在下在一系列葡萄糖浓度中进行测定。令人感兴趣的是，SPT15突变体在所有测试浓度下均优于对照，在一些浓度下改进高达13倍。这一改进大大地超过不能在6％乙醇存在下生长的TAF25突变体的整体改进。图16突出显示这些最优菌株的生长分析，图17提供其序列。通过引入突变体转录机器实现的改进大大地超过通过其它改进细胞表型的方法所获得的改进。另外，这些结果提高了使用酵母作为使用高重力发酵进行高乙醇生产的活来源的潜力。

实施例10：

全局转录机器改造(gTME)是用于对基因转录重新编程从而引发对科技应用而言具有重要性的细胞表型的一种方法。此处我们显示对酿酒酵母的应用gTME，用于提高的葡萄糖/乙醇耐受性，这是许多生物燃料计划的关键性状。对转录因子Spt15p的诱变和选择导致显性突变，所述显性突变赋予对乙醇提高的耐受性和更有效地将葡萄糖转化成乙醇。期望的表型得自于SPT15基因中三个独立突变(F177S、Y195H、K218R)的组合效应。因此，gTME可提供通向无法通过传统方法容易地获得的复杂表型的途径。

从微生物生产期望的化合物通常可需要对其固有代谢进行完全的重新编程。这类复杂性状的进化需要同时修饰许多基因的表达水平，这是不能通过依次修饰多基因来实现的。另外，对需要干扰的基因进行的鉴定在很大程度上可能是常规途径分析所无法预料的。称作“全局转录机器改造”(gTME)的细胞改造方法(通过易错PCR诱变)改造调节全局转录组(transcriptome)的关键蛋白质，并通过它们在转录水平上产生新的多样性类型。

该方法已通过在原核细胞中改造σ因子证明(1)，但是真核转录机器复杂性的提高提出了是否可使用gTME在更复杂的生物中改进性状这一问题。例如，真核体系更加特化——具有独立功能的三种RNA聚合酶，而原核生物中仅存在一种。另外，存在近75种被归类为通用转录因子或RNA Pol II系统共激活子的组分(2)，并且这些组分中许多功能的丧失是致死性的。通用因子TFIID的组分包括TATA结合蛋白(SPT15)和14种其他相关因子(TAF)，它们一起被认为是调节酵母中启动子特异性的主要DNA结合蛋白(2-5)。TATA结合蛋白中的突变已显示改变三种聚合酶的偏好性，并在启动子特异性中起重要作用(6)。

使用酵母生产乙醇的成功发酵需要对高葡萄糖和乙醇浓度二者均具有耐受性。这些细胞特征是重要的，因为乙醇工业中常见的极高重力(very high gravity，VHG)发酵在批次开始时产生高糖浓度(和由此产生的高渗透压)，在批次结束时产生高乙醇浓度(7，8)。就大肠杆菌中的乙醇耐受性而言，对乙醇和葡萄糖混合物的耐受性似乎不是单基因性状(9)。因此，菌株改进的传统方法在鉴定培养基补充剂和多种化学保护剂之外的成功十分有限(10-14)。

为了在真核系统中评价gTME方法，由(SPT15)或TATA结合蛋白相关因子(TAF25)之一产生两个gTME突变体文库(15)。在含有SPT15和TAF25的内源未突变染色体拷贝的标准单倍体酿酒酵母菌株BY4741的背景中进行酵母筛选和选择。同样，该遗传筛选使用既表达野生型又表达突变形式蛋白质的菌株，并因此允许鉴定能够在未改变的染色体基因存在下提供新功能的显性突变。将这些文库转化进酵母中，并在提高的乙醇和葡萄糖水平存在下进行选择。spt15突变体文库在5％乙醇和100g/L葡萄糖存在下显示中度的生长，因此在后续的连续传代培养中将胁迫提高至6％乙醇和120g/L葡萄糖。在传代培养后，从平板上分离菌株，分离含有突变基因的质粒并再转化进新的背景中，并测试它们在提高的葡萄糖和乙醇水平存在下的生长能力。对从这两种文库中每一种获得的最佳突变体进一步详细测定并测序。

图18A中展示了赋予最佳特性的这些已改变基因的序列特征(一个Spt15p，一个Taf25p)。这些突变的基因中每一个含有3个突变，其中spt15的突变定位于形成一组β片层的第二重复元件(5，16)。taf25和spt15突变体基因中这些特定的三重突变在本文中被称作taf25-300和spt15-300突变。

spt15-300突变体在测试的所有浓度下都比对照表现好，带有突变体蛋白质的菌株在一些葡萄糖浓度下提供了13倍的生长量提高(图18B和图22)。taf25-300突变体在存在6％乙醇时不能生长，与富集/选择期的观察一致。尽管有这些耐受性提高，但是在没有乙醇和葡萄糖胁迫时这些突变体的基础生长率与对照相似。另外，spt15-300突变体和taf25-300突变体之间行为的差异提示，编码真核生物转录机器不同成员的基因中的突变可能引发不同(和出乎意料)的表型应答。

本研究的其余部分着眼于spt15-300突变体，因为该三重突变组(F177S、Y195H、K218R)提供了在提高的乙醇和葡萄糖方面最期望的表型。在高于10％的乙醇浓度下，spt15-300突变体显示超出对照的统计学显著改进的细胞生存力(在30个小时培养的过程中)，即便是在按体积计高达20％的乙醇浓度下也是如此(图19A、19B和图23)。

转录模式分析揭示，相对于表达野生型SPT15的细胞而言，突变体spt15-300在未受胁迫的条件(0％乙醇和20g/L葡萄糖)下显示数百基因(针对假发现(false-discovery)进行对照(17))的差异表达(18)。该分析主要利用未受胁迫的条件而不是胁迫条件(5％乙醇和60g/L葡萄糖)，因为由于生长率相似，所以在该条件下表达比更为可靠，这样使得基因表达模式更具可比性(补充文本，c部分和表6)。注意到乙醇/葡萄糖胁迫的影响对许多基因具有不同的作用，并且通常胁迫不进一步影响许多使用非胁迫条件所选择的基因(补充文本，c部分)。尽管转录中的这种广泛改变与在具有改变的σ因子的大肠杆菌中观察到的相似，但是与用大肠杆菌观察到的平衡分布不同，具有表达改变的大部分基因被上调(补充文本，b部分和图24)。spt15-300突变体中的转录重新编程是相当广泛的，但是显示某些功能组例如氧化还原酶活性、胞质蛋白、氨基酸代谢和电子传递的富集(补种文本，b部分和图25)。还发现未分类的基因和功能未知的基因具有更高的表达水平。对启动子结合位点的分析以及使用Cytoscape(19)框架对活性基因亚网络(subnetwork)进行的检索未对主要负责观察到的遗传重新编程的特定途径或遗传网络提供任何重要线索(15)。

为了确定这些上调的基因是独立作用还是作为总体发挥作用，以提供提高的乙醇/葡萄糖耐受性，我们检查了个体基因敲除对表型的影响。选择了在0％乙醇和20g/L葡萄糖的非胁迫的条件下12个在突变体中最高表达的基因和两个额外的基因(补充文本，c部分和表5、6)。图20A概述了表型丧失实验的结果。结果显示，大部分过表达基因靶标的缺失导致突变体spt 15-300因子丧失传递提高的乙醇/葡萄糖耐受性的能力。所有测试的不含突变的spt 15-300的敲除菌株对乙醇和葡萄糖胁迫均显示正常耐受，从而表明这些基因个体不足以构成对乙醇的正常耐受。在测定的14个基因靶标中，仅PHM6的缺失不降低新表型。因此，我们推测每个基因编码相互联系的网络的一个必要组分，尽管可能存在一定的功能冗余(补充文本，c部分)。

在功能获得实验中，作为对照菌株中的过表达靶标研究了spt15-300突变体中显示最高的表达水平提高倍数的三个基因。在TEF启动子的控制下独立和组成地过表达PHO5、PHM6和FMP16，并测定转化体赋予乙醇和葡萄糖耐受性表型的能力。图20B展示了来自微阵列分析的共有、最佳(top)候选基因中没有一个单个基因的过表达能够产生与突变体spt 15-300相似的表型获得。

我们接下来用在三重突变体中鉴定的位点构建了所有可能的单突变和双突变组合(15)。单突变体或双突变体甚至均不能接近达到与分离的spt 15-300三重突变体相似的表型(补充文本，d部分和图27-29)。人们不能通过“贪心算法(greedy algorithm)”检索方法预测这三种突变的作用，或通过传统选择来选择引起渐进的突变，因为许多这些分离的突变在表型适合度(phenotype fitness)中是独立地相对中性的。因此，只有通过下述技术才可能达成这样的多重突变体，所述技术专门着眼于SPT15基因的体外诱变，随后进行需求选择。

我们的spt15突变体优先改变先前已证实其表达依赖于SPT3的基因(20，21)，如微阵列数据中所展示的，Bonferroni校正的p值为1×10^-12。另外，spt15-300突变体中10个最高表达基因中的7个是SPT3依赖型基因。在spt3突变体中下调的基因在spt15-300突变体中相对上调。由于Y195H突变(22)导致不存在负辅因子2元件(NC2)，这可导致上调基因的过量表现(over-representation)，因为部分Spt15p的负调节可能不再发生。这些数据与先前的工作一致，所述先前的工作显示spt15-21突变(F177L和F177R改变)阻抑Spt15p和Spt3p(SAGA复合物的一部分)之间相互作用改变引起的spt3突变(21，23，24)。为了进一步测试Spt3p之间的联系，发现spt15-300突变体基因不能够将其乙醇和葡萄糖耐受性表型传递给spt3敲除菌株(图21A)。

从图21B中展示的定点诱变结果和机制可以想像，对NC2复合物的扰动也会影响spt15-300突变体发挥功能的能力；然而，其中一个基因在该异源二聚体中的必需性阻止了这样的跟踪实验。尽管如此，这些结果进一步强调了所有三种突变协同作用从而产生由Spt3p/SAGA复合物相互作用介导的复合表型的重要性。因此，我们断定其作用模式基本是独特的蛋白质-蛋白质-DNA相互作用(SPT15突变体-SPT3-DNA)，其导致这种大量基因的转录重新编程。

在20或100g/L葡萄糖的初始浓度下，在低细胞密度和高细胞密度下的简单批次摇瓶实验中测定了不同条件下spt15-300突变体利用葡萄糖并将其发酵为乙醇的能力(补充文本，e部分和图30-32)。在这些情况的每种情况中，突变体均具有优于对照的生长特征，其延长的指数生长期允许更高、更有活力的生物量生产和更高的乙醇产率。特别地，在初始OD600为15的高细胞密度发酵中，突变体远超过对照的表现，其具有相对于对照菌株更迅速的葡萄糖利用、提高的生物量产率和更高的体积乙醇生产力(每小时2g/L乙醇)(表3)。另外，糖以超出对照的产率被迅速和完全地利用，该产率接近了考虑到细胞生长所消耗的葡萄糖量的理论值。

这些结果证明了全局转录机器改造用于改变真核细胞表型的适用性。阳性突变的分离允许修饰重要功能用于新的任务，而未修饰的等位基因完成生存必需的功能。通过全局转录机器改造检查其它转录因子的进一步修饰可额外地具有可观地改进乙醇发酵和改进乙醇生产前景的潜能。对所分析的突变体而言，改变的发酵条件和其他途径改造很可能进一步提高乙醇生产(25，26)。另外，该研究中使用的菌株是标准的实验室酵母菌株，并且可在天然显示更高原始乙醇耐受性的工业或分离酵母中探索该方法。最后，我们注意到在该研究中被修饰的转录因子与更复杂的真核生物系统中的转录因子(包括哺乳动物细胞的转录因子)相似，这也提出了使用该工具在这些系统中引发有生物技术医学价值的复杂表型的可能性。

参考文献和注释

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15.Materials and methods are available as supporting online material in Science Online.

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18.For each gene，a p-value for differential expression between the two conditions wascalculated using a t-test.To simultaneously test multiple hypotheses，p-values werecorrected in a false discovery rate analysis(17).False discovery rates are a commonmethod used for the analysis of large date sets(such as microarrays)which limitsfalse positives，akin to a Bonferroni correction.In this case，366 genes were found tobe significantly differentially expressed，at a false discovery rate of 1％.

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30.以登记号GSE5185保存于GEO数据库的微阵列数据。

材料和方法

菌株和培养基

该研究中使用的酿酒酵母菌株BY4741(MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)得自EUROSCARF(Frankfurt，德国)。将其培养在YPD培养基(10g酵母提取物/升，20g细菌用蛋白胨/升和20g葡萄糖/升)中。使用Frozen-EZ酵母转化II(ZYMO RESEARCH)用于酵母转化。为了选择和培养载有带URA3选择标记的质粒的酵母转化体，使用含6.7g酵母氮源(Difco)/升、20g葡萄糖/升和适当核苷酸和氨基酸混合物(CSM-URA，Qbiogene)的酵母合成完全(YSC)培养基，在本文中称作YSC-Ura。对固体培养基而言，在培养基中补充1.5％琼脂。使用600g/L葡萄糖的储存溶液、5×CSM-URA和10×YNB溶液来制备培养基。将菌株在30℃下以225RPM在轨道摇床上培养。基因敲除菌株得自Invitrogen敲除菌株保藏库，并且均来自BY4741遗传背景。根据制造商的说明使用大肠杆菌DH5α最高效感受态细胞(Invitrogen)进行常规转化，并且常规地在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养。大肠杆菌菌株常规地在37℃下培养。在600nm下用分光光度计监测细胞密度。所有其余的化学品来自Sigma-Aldrich。引物购自Invitrogen。

文库构建

创建文库，并克隆在p416质粒中先前作为酵母启动子文库(1)的一部分产生的TEF-mut2启动子之后(2)。从基因组DNA中克隆TAF25和SPT15基因，所述基因组使用Promega Wizard基因组DNA试剂盒从BY4741酵母中分离。使用Taq聚合酶(NEB)进行扩增，使用引物：TAF25_Sense：TCGAGTGCTAGCAAAATGGATTTTGAGGAAGATTACGAT(SEQ IDNO：28)和TAF25_Anti：CTAGCGGTCGACCTAACGATAAAAGTCTGGGCGACCT(SEQ ID NO：29)。Spt15基因使用引物SPT15_Sense：TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG(SEQ IDNO：30)和SPT15_Anti：CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA(SEQ IDNO：31)从基因组DNA中克隆。使用GenemorphII随机诱变试剂盒(Stratagene)进行片段诱变，如产品手册中所述使用多种浓度的初始模板获得低(0-4.5个突变/kb)、中(4.5-9个突变/kb)和高(9-16个突变/kb)突变率。在PCR后，使用Qiagen PCR净化试剂盒纯化这些片段，并使用NheI和SalI在37℃下消化过夜，并在16℃下与用XbaI和SalI消化的质粒骨架过夜连接。将质粒文库转化进大肠杆菌DH5α中并在含100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上涂板。总文库大小约为10⁵。将大肠杆菌菌落从平板上刮下，使用质粒小量制备离心试剂盒分离质粒，并转化进酵母中。在含有内源的未突变SPT15和TAF25染色体拷贝的标准单倍体酿酒酵母菌株BY4741的背景中进行酵母筛选和选择。对两个文库(一个是taf25，一个是spt15)中的每一个而言，将酵母转化混合物在总计48个150×10mm的培养皿中涂板。将这些转化体从平板上刮下并放置进液体悬浮液中进行表型选择。使用Zymoprep酵母质粒小量制备试剂盒(ZYMO research)分离经分离的菌株并转化回大肠杆菌中。使用引物Seq_Forward：TCACTCAGTAGAACGGGAGC(SEQ IDNO：32)和Seq_Reverse：AATAGGGACCTAGACTTCAG(SEQ IDNO：33)对质粒测序。使用Clustal W 1.82版对序列进行比对和比较。

将所有的突变体菌株与对照菌株进行比较，所述对照菌株带有克隆进相同启动子和质粒构建体(如上所述含有TEF-mut2启动子的p416质粒)的未突变形式的SPT15或TAF25蛋白。因此，通过使用对照中和了质粒的影响以及两种质粒与转录机器染色体拷贝之间的干扰。由于相似的启动子和质粒构建体，过量的野生型蛋白质以与突变体蛋白质相同的水平表达。另外，在多种乙醇/葡萄糖浓度存在下在空白质粒(不表达SPT15或TAF25的质粒)和表达野生型蛋白质的质粒(SPT15或TAF25)之间进行的比较揭示了相似了生长速率。因此，野生型蛋白质的过表达不影响对照的选择或表型。表4总结了带有空白质粒、含野生型SPT15的质粒和含spt15-300突变体的质粒之间的比较。

表型选择

将来自合并的液体文库的样品置于攻击性环境中，以选择存活的突变体。对乙醇/葡萄糖耐受性表型而言，首先将文库置于按体积计含100g/L葡萄糖和5％乙醇的YSC-URA中。这些培养在30×115mm顶部闭合的离心管中进行，所述离心管含有30ml培养体积并在30℃下垂直置于摇动的轨道培养箱中。最初以0.05的OD600开始培养。在这些条件下将taf25和spt15文库均传代培养2次。因为spt15文库在初始条件下生长，所以在下2次传代培养中将胁迫提高至120g/L葡萄糖和6％乙醇。在taf25文库的下2次传代培养中使用100g/L葡萄糖和5％乙醇的恒定水平。在该选择阶段后，通过划线溶液将这些混合物涂布在含20g/L葡萄糖的YSC-URA平板上，以确保单菌落分离而不需要稀释样品。从平板上生长的大量菌落中随机分离约20个菌落。然后将这些选择的菌株在过夜培养物中培养，并在含60g/L葡萄糖和5％乙醇的培养基中测定其生长。对根据OD测量显示生长性能提高的细胞而言，分离质粒并将其在若干浓度下于生物学重复中再转化以重新确定表型。如下文所述进行这些表型验证。

生长量测定

将生物学重复在14ml Falcon培养管中的5ml培养物体积中培养过夜。将培养基以5ml等分试样分配进15ml带盖的锥形离心管中，所述培养基含有8种以下条件：5％乙醇与20、60、100或120g/L葡萄糖，和6％乙醇与20、60、100或120g/葡萄糖。将细胞以0.01的初始OD接种。通过将管垂直置于30℃以225RPM轨道摇动的培养箱中来培养菌株。20小时后，将管振荡并通过在600nm下获取吸光度来测量细胞密度。

存活力曲线测定

将培养物在250ml烧瓶中的50ml YSC-URA培养基中于30℃下培养2天。将约1ml(重悬于10ml中时产生0.5的OD600的精确量)置于15ml锥形离心管中并在500×g下离心15分钟。然后用10ml 0.9％NaCl洗涤细胞并再离心。然后将细胞沉淀物重悬于含20g/L葡萄糖和适当量乙醇(10％和20％之间)的YSC-URA中。然后将该管在30℃下以225RPM在轨道摇床上孵育。每3小时(包括零时间点)取出100μl样品(振荡后，以确保均匀)，适当稀释并涂布在YSC-URA平板上。然后将平板孵育2天以允许菌落形成和菌落形成单位计数。突变体和对照菌株均以生物学重复培养。

定点诱变

使用Stratagene Quickchange试剂盒进行定点诱变，从而向SPT15基因中引入单突变和双突变。诱变按照试剂盒的方案进行，并使用与上述相同的测序引物进行测序验证。使用以下的引物组：

构建体：F177S，模板：SPT15野生型

HA350-F177S_sen(SEQ ID NO：34)，

CGTCTAGAAGGGTTAGCATCCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGC

HA351-F177S_ant(SEQ ID NO：35)，

GCTCATAGGAGGAGAAAGTACCATGACTGGATGCTAACCCTTCTAGACG

构建体：Y195H，模板：SPT15野生型

HA352-Y195H_sen(SEQ ID NO：36，

CCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCCATAGAATGGTGAAGCC

HA353-Y195H_ant(SEQ ID NO：37)，

GGCTTCACCATTCTATGGATCAAACCAGGAAACAATTCTGG

构建体：K218R，模板：SPT15野生型

HA354-K218R_sen(SEQ ID NO：38)，

GGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAGGCAAAGGGAAGAAATTTACC

HA355-K218R_ant(SEQ ID NO：39)，

GGTAAATTTCTTCCCTTTGCCTTGCACCAGTAAGAACAATCTTTCC

构建体：Y195H和K218R，模板：突变体spt15

HA356-F177-Revert_sen(SEQ ID NO：40)，

CGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGC

HA357-F177-Revert_ant(SEQ ID NO：41)，

GCTCATAGGAGGAGAAAGTACCATGACTGAATGCTAACCCTTCTAGACG

构建体：F177S和K218R，模板：突变体spt15

HA358-Y195H-revert_sen(SEQ ID NO：42)，

CCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCC

HA359-Y195H-revert_ant(SEQ ID NO：43)，

GGCTTCACCATTCTATAGATCAAACCAGGAAACAATTCTGG

构建体：F177S和Y195H，模板：突变体spt15

HA360-K218R-revert_sen(SEQ ID NO：44)，

GGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACC

HA361-K218R-revert_ant(SEQ ID NO：45)，

GGTAAATTTCTTCCCTTTGCTTTGCACCAGTAAGAACAATCTTTCC

基因过表达构建体

使用p416-TEF质粒产生过表达构建体。使用引物PHO5_sen-XhoI：

CCGCTCGAGCAAAACTATTGTCTCAATAGACTGGCGTTG(SEQ IDNO：46)和PHO5_anti-XbaI：GCTCTAGACCAATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATT(SEQ ID NO：47)从BY4741基因组DNA扩增PHO5(YBR093C)。然后将该片段克隆进用XhoI和XbaI消化的载体中。使用引物PHM6_sen-SalI：ACGCGTCGACATTATTAAAACAAAAACTTCGTCATCGTCA(SEQ IDNO：48)和PHM6_anti-XbaI：GCTCTAGACCAAGATGGAAGATACCTCGAGGTGCATCG(SEQ IDNO：49)从BY4741基因组DNA扩增PHM6(YDR281C)。然后将该片段克隆进用SalI和XbaI消化的载体中。使用引物FMP16_sen-XhoI：CCGCTCGAGGTGCTTCTTAATAAACACCGTCATCTGGCC(SEQ IDNO：50)和FMP16_anti-XbaI：GCTCTAGAATAATGTTGAGAACCACTTTTTTGCGCACT(SEQ IDNO：51)从BY4741基因组DNA扩增FMP16(YDR070C)。然后将该片段克隆进用XhoI和XbaI消化的载体中。

发酵

使用含20或100g/L葡萄糖的50ml培养基中OD600为0.01的酵母过夜培养物开始低接种物培养。每3小时取样测量OD600并进行上清液分析以测量乙醇和葡萄糖浓度。如下产生高接种物培养：在1000ml烧瓶中将250ml酵母培养1.5天，然后通过在500×g下离心25分钟进行收集。然后将细胞沉淀物重悬于3ml不含葡萄糖的YSC-URA中。然后将该溶液适当接种进250ml烧瓶中40ml含100g/L的YSC-URA中，获得约15的OD600。通过酶测定试剂盒(R-Biopharm，SouthMarshall，Michigan)测定乙醇浓度，使用YSI 2300葡萄糖分析仪测量葡萄糖浓度。以生物学重复进行30小时的发酵，每3小时取样。

微阵列分析

将酵母菌株(spt15突变体和对照，在标准YSC-URA培养基和含5％乙醇与60g/L葡萄糖的培养基中培养)培养至OD约为0.4-0.5，并使用Ambion RiboPure酵母RNA提取试剂盒提取RNA。微阵列设备由Ambion，Inc.提供，使用Affymetrix酵母2.0阵列。阵列以生物学重复一式三份进行，以实现差异基因表达的统计学致信度。微阵列数据以及涉及MIAME顺应性的数据已保存于GEO数据库，登记号为GSE5185。

使用Cytoscape 2.1中的BiNGO应用完成功能富集、基因分类和网络分析(3)。另外，使用Cytoscape 2.1，针对在YPD、饥饿和氧化胁迫条件下测定的蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA网络，检索有活性的子网络。

补充文本

酿酒酵母SPT15(TBP)具有GeneID：856891，蛋白质登录号NP_011075.1，(SEQ ID NO：52)

madeerlkefkeankivfdpntrqvwenqnrdgtkpattfqseedikraapesekdtsat

sgivptlqnivatvtlgcrldlktvalharnaeynpkrfaavimrirepkttalifasgk

mvvtgakseddsklasrkyariiqkigfaakftdfkiqnivgscdvkfpirleglafshg

tfssyepelfpgliyrmvkpkivllifvsgkivltgakqreeiyqafeaiypvlsefrkm

a)spt15-300和taf250-300突变体的序列分析

spt15-300突变体的序列比对，比较Wild-type_Spt15(SEQ IDNO：53)和EtOH-Glc_SPT15_Mutant(SEQ ID NO：54)：

Wild-type_Spt15 ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGT 50

EtOH-Glc_SPT15_Mutant ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGT 50

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Wild-type_Spt15 GTTTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTA 100

EtOH-Glc_SPT15_Mutant GTTTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTA 100

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Wild-type_Spt15 CAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCC 150

EtOH-Glc_SPT15_Mutant CAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCC 150

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Wild-type_Spt15 CCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACT 200

EtOH-Glc_SPT15_Mutant CCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACT 200

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Wild-type_Spt15 ACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAA 250

EtOH-Glc_SPT15_Mutant ACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAA 250

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Wild-type_Spt15 CAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCT 300

EtOH-Glc_SPT15_Mutant CAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCT 300

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Wild-type_Spt15 GCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGC 350

EtOH-Glc_SPT15_Mutant GCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGC 350

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Wild-type_Spt15 CTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAAAAAGTGAGGATGACTCAAAGC 400

EtOH-Glc_SPT15_Mutant CTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAAAAAGTGAGGATGACTCAAAGC 400

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Wild-type_Spt15 TGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCT 450

EtOH-Glc_SPT15_Mutant TGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCT 450

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Wild-type_Spt15 AAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAA 500

EtOH-Glc_SPT15_Mutant AAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAA 500

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Wild-type_Spt15 ATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCT 550

EtOH-Glc_SPT15_Mutant ATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATCCAGTCATGGTACTTTCTCCT 550

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Wild-type_Spt15 CCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCG 600

EtOH-Glc_SPT15_Mutant CCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCCATAGAATGGTGAAGCCG 600

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Wild-type_Spt15 AAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGC 650

EtOH-Glc_SPT15_Mutant AAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGC 650

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Wild-type_Spt15 AAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGC 700

EtOH-Glc_SPT15_Mutant AAGGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGC 700

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Wild-type_Spt15 TAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA 723

EtOH-Glc_SPT15_Mutant TAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA 723

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taf25-300突变体的序列比对，比较Wild-type_Taf25(SEQ IDNO：55)和EtOH-Glc_TAF25_Mutant(SEQ ID NO：56)

Wild-type_Taf25 ATGGATTTTGAGGAAGATTACGATGCGGAGTTTGATGATAATCAAGAAGG 50

EtOH-Glc_TAF25_Mutant ATGGATTTTGAGGAAGATTACGATGCGGAGTTTGATGATAATCAAGAAGG 50

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Wild-type_Taf25 ACAATTAGAAACACCTTTTCCATCGGTTGCGGGAGCCGATGATGGGGACA 100

EtOH-Glc_TAF25_Mutant ACAATTAGAAACACCTTTTCCATCGGTTGCGGGAGCCGATGGTGGGGACA 100

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Wild-type_Taf25 ATGATAATGATGACTCTGTCGCAGAAAACATGAAGAAGAAGCAAAAGAGA 150

EtOH-Glc_TAF25_Mutant ATGATAATGATGACTCTGTCGCAGAAAACATGAAGAAGAAGCAAAAGAGA 150

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Wild-type_Taf25 GAGGCTGTAGTGGATGATGGGAGTGAAAATGCATTTGGTATACCCGAATT 200

EtOH-Glc_TAF25_Mutant GAGGCTGTAGAGGATGATGGGAGTGAAAATGCATTTGGTATACCCGAATT 200

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Wild-type_Taf25 TACAAGAAAAGATAAGACTCTGGAGGAGATTCTAGAGATGATGGACAGTA 250

EtOH-Glc_TAF25_Mutant TACAAGAAAAGATAAGACTCTGGAGGAGATTCTAGAGATGATGGACAGTA 250

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Wild-type_Taf25 CTCCTCCTATCATTCCCGATGCAGTAATAGACTACTATTTAACCAAAAAC 300

EtOH-Glc_TAF25_Mutant CTCCTCCTATCATTCCCGATGCAGTAATAGACTACTATTTAACCAAAAAC 300

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Wild-type_Taf25 GGGTTTAACGTAGCAGATGTACGAGTGAAACGACTTTTAGCACTTGCTAC 350

EtOH-Glc_TAF25_Mutant GGGTTTAACGTAGCAGATGTACGAGTGAAACGACTTTTAGCACTTGCTAC 350

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Wild-type_Taf25 TCAGAAATTTGTTAGTGATATAGCTAAGGATGCCTACGAATATTCCAGGA 400

EtOH-Glc_TAF25_Mutant TCAGAAATTTGTTAGTGATATAGCTAAGGATGCCTACGAATATTCCAGGA 400

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Wild-type_Taf25 TCAGGTCTTCCGTAGCGGTATCTAATGCTAACAACAGTCAGGCGAGAGCT 450

EtOH-Glc_TAF25_Mutant TCAGGTCTTTCCGTAGCGGTATCTAATGCTAACAACAGTCAGGCGAGAGCT 450

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Wild-type_Taf25 AGGCAGCTATTGCAAGGACAGCAACAGCCTGGCGTGCAGCAGATTTCACA 500

EtOH-Glc_TAF25_Mutant AGGCAGCTATTGCAAGGACAGCAACAGCCTGGCGTGCAGCAGATTTCACA 500

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Wild-type_Taf25 ACAACAACATCAACAGAATGAGAAGACTACAGCAAGCAAAGTTGTTCTGA 550

EtOH-Glc_TAF25_Mutant ACAACAACATCAACAGAATGAGAAGACTACAGCAAGCAGAGTTGTTCTGA 550

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Wild-type_Taf25 CGGTGAACGATCTCAGTAGCGCTGTTGCTGAATACGGGCTCAATATAGGT 600

EtOH-Glc_TAF25_Mutant CGGTGAACGATCTCAGTAGCGCTGTTGCTGAATACGGGCTCAATATAGGT 600

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Wild-type_Taf25 CGCCCAGACTTTTATCGTTAG 621

EtOH-Glc_TAF25_Mutant CGCCCAGACTTTTATCGTTAG 621

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b)扰动的微阵列分析

i.差异表达基因的直方图

将在少于或等于0.001的p值下具有差异表达的基因绘制在直方图上，以评价非胁迫条件(0％乙醇和20g/L葡萄糖)下spt 15-300突变体的广度和影响。图24展示了spt15-300突变体具有上调基因的偏好。具体地，在p值≤0.001的统计学阈值和≥0.3的log2倍数比之下，111个基因上调。这与p值≤0.001的相同阈值和≤-0.3的log2倍数比之下仅21个基因下调相反。

ii.基因分类分析

基因分类(gene ontology，GO)分析允许在选定的基因亚组中鉴定多种细胞功能的功能富集，并且可以帮助鉴定与增强的表型强烈相关的基因功能种类。具体地，针对非胁迫条件下spt15-300突变体菌株对在0.005的p值阈值下差异表达的基因进行GO分析。该GO分析揭示了在spt15-300突变体菌株中以下分类基因簇在差异表达的基因中过量表现：氧化还原酶活性(p值：4.5×10^-8)，细胞质蛋白质和酶(p值：5.3×10^-4)，氨基酸和衍生物代谢(p值：5.7×10^-4)，维生素代谢(p值：4.9×10^-3)，和电子传递(p值：4.5×10^-2)

先前我们已鉴定和分析了具有增强的乙醇耐受性的大肠杆菌菌株(4)。这些结果可在比较转录组方法中用于补充这些酵母微阵列，以分析乙醇耐受性的保守性机制。图25比较了大肠杆菌和酵母突变体菌株之间的基因分类结果。有趣的是，尽管这些蛋白质和转录机器中存在差异，但是其在氧化还原酶活性(GO：0016491)和电子传递(GO：0006118)中均引发了相似的应答。这种改变基因的集中提示，乙醇胁迫引起氧化胁迫，或者要求细胞具有更高的还原水平。该应答与提出的乙醇在肝中的作用模式相似。另外，最近在果蝇中的研究已经鉴定了宿醉(hangover)基因，所述宿醉基因被敲除时降低乙醇耐受性(5)。有趣的是，该基因敲除也使得苍蝇对百草枯的氧化胁迫更加易感，这也可提示氧化还原酶活性在更高等生物的乙醇耐受性中的重要性和相关性。在氧化还原酶途径以外，大肠杆菌和酵母突变体还均具有若干戊糖磷酸途径基因和甘氨酸代谢的转录物水平的提高。然而，跟踪实验(包括表型丧失和过表达)的结果表明，没有一个单个基因严格地负责这些突变体菌株中展示的表型，而是依赖于大量基因的协同表达谱。

c)选择用于表型丧失分析的基因靶标

使用微阵列进行转录测量，以尝试阐明对照菌株与带有突变体spt15-300基因的菌株之间的表型差异(乙醇/葡萄糖耐受)。为了测试表型的分散式遗传控制假说，我们选择了高表达基因的小子集用于表型丧失分析。使用以下标准总计选择了共14个基因用于该目的，如表5中所示：

·首先，根据非胁迫条件下的过表达比例对基因排序，并选择最高的19个基因(这一取舍值是主观确定的)。在这19个基因中，由于不能从敲除组合中获得BY4717遗传背景的敲除菌株，因此排除YBR117C(TKL2，log2＝1.243)、YDR034W(log2＝1.017)、YIL160C(POT1，log2＝0.680)、YIL169C(log2＝0.625)和YOL052C(log2＝0.622)。另外，排除具有重叠功能的基因如PHM8(log2＝1.727)和PHO11(log2＝1.410)。这余下了基于非胁迫条件下的过表达比例选择的12个基因。

·其次，将基因排序以选择在胁迫和非胁迫条件下均处于前1％的基因。这得到了6个基因，其中只有两个(YKL086W和YIL099W)仅在胁迫条件下过表达。换言之，其他4个基因在胁迫条件以及非胁迫条件下均过表达。

大部分所选基因来自在非胁迫条件下显示过表达的组。原因是双重的：(a)在胁迫条件下突变体中过表达的基因数相对于对照显著减少(见下文的进一步讨论)；(b)因为生长速率相似且没有时间效应，因此在非胁迫条件下表达比例更具可比性。然而，14个所选基因中有6个在胁迫条件下过表达。其余8个基因在胁迫条件(60g/L葡萄糖和5％乙醇)下生长的培养物中看来并未过表达。该选择在表6中以数值表述。无论所选微阵列组为何，均观察到基因靶标的显著重合。在我们进行的相似实验中也观察到完全相同的现象，所述实验目的在于通过改造突变的σ因子在大肠杆菌中引发乙醇耐受性。

为了解释这种现象，观察到在正常条件下相对于野生型而言，其余8个目的基因中的7个在带有突变转录因子的细胞中过表达。存在乙醇(胁迫条件)时，突变体中这些基因的进一步过表达显著低于同一基因在野生型中实现的过表达水平。结果是在胁迫条件下，这些基因在突变体和野生型中以大致相似的水平表达。因此，这7个基因看起来不在突变体中过表达，但这是相对于对照(即在胁迫条件下生长的野生型细胞)而言的。如果我们用印迹双通道微阵列进行转录分析的话就不可能验证上述假说。幸好Affymetrix微阵列报告了绝对表达水平。针对这14个基因的这些数据(绝对荧光值)显示于表7中。可清楚地看出，尽管在非胁迫条件下大部分基因相对于野生型事实上被过表达，但是在胁迫条件下只有6个相对于野生型进入最高的1％。这并不令人惊讶，因为基因过表达的程度存在上限，这14个基因中的许多看来应答于突变体转录因子已达到了这一上限。表达数据指出，在正常条件下，转录因子突变体产生了以若干基因的过表达为例的“引发效应”。作为该“引发”的结果，细胞在胁迫条件下发生了显著减少的基因表达改变。就乙醇耐受性(选择突变体的条件)而言这明显产生了有益的总体效应。

下述事实指出每个基因编码互联网络的一个必需组件，即对测试的大部分基因靶标而言，功能的丧失导致乙醇/葡萄糖耐性表型的丧失。对该组基因的鉴定未产生简单的模型，因为它们的功能之间不存在明显的联系。尽管如此，重要的是注意到所有测试的不含突变体spt15-300的敲除菌株均显示对乙醇和葡萄糖胁迫的正常耐受性，从而表明这些基因个体不足以构成对乙醇的正常耐受性。这些结果证实了下述结论，即突变体spt15-300所传递的复杂表型不仅是多效的，而且要求多个基因的协调表达。

显然，该基因选择既不是穷举性的也不是独特的。通过单个敲除突变体中大部分这些基因所显示的表型丧失支持了来自该微阵列研究的假说；即，乙醇耐受性表型依赖于大量基因转录水平的特异性重新编程，而不是单个特定基因或局部途径。

d)定点诱变所产生突变体的表型分析

我们用在三重突变体中鉴定的位点构建了所有可能的单突变和双突变组合。这些组合通过定点诱变产生，并在与原始测定相似的条件下测定。将突变体表型(在5％和6％乙醇中20、60、100和120g/L葡萄糖下评价)与spt15-300三重突变体所赋予的累积表型进行比较，标度是野生型SPT15的值为零，分离的三重突变体的值为1.0。多种突变体的相对累积适合度如下计算：

在该情况下，将适合度标准化使得野生型SPT15的适合度为0.0，而已鉴定的spt15-300突变体的适合度为1.0。如图27中所示，单突变或双突变均甚至无法接近达到与分离的spt15-300突变体相似的表型。每一这些条件下对照菌株的绝对细胞密度描述于图28和29中(分别针对5％和6％乙醇)。表8和9列出了在这8种条件中每一种条件下细胞产量(OD600)的提高倍数。

e)突变体的发酵评价

用100g/L葡萄糖的初始浓度，在低细胞密度和高细胞密度的单批次摇瓶实验中测定了不同条件下spt15-300突变体利用葡萄糖并将其发酵为乙醇的能力。另外，用20g/L的初始葡萄糖浓度进行低细胞密度接种物实验。这三种条件允许评价突变体spt15的性能。将这些结果与也在相同条件下于50ml发酵中培养的对照比较。使用0.1的初始OD600进行低细胞密度实验，使用15的初始OD600进行高细胞密度发酵。突变体最初以与对照相似的生长速率生长，但是能够以延长的生长期继续，达到更高的最终生物量产量。与对照相比，突变体在30小时内达到葡萄糖利用的后续提高。另外，与对照相比，突变体菌株中乙醇生产在速率和产量两方面都更为显著。图30-32提供了包括细胞生长、葡萄糖利用和乙醇生产的发酵细节。表3总结了来自100g/L葡萄糖中高细胞密度发酵的结果。

表3：评价spt15突变体乙醇生产潜能的发酵结果。用初始细胞密度为OD15(～4g DCW/L)的高接种物，将细胞在100g/L葡萄糖中以生物学重复培养。提供了高细胞密度发酵的发酵谱，并展示了该突变体以理论产率生产更高乙醇生产力的能力，其优于对照的功能。来自葡萄糖的生物量产率来自报告值(29)。结果代表了生物学重复实验之间的均值(补充文本，e部分和图30-32)。

OD600，20小时

乙醇(％)	葡萄糖(g/L)	空白质粒	SPT15	spt15-300
乙醇(％)	葡萄糖(g/L)	空白质粒	SPT15	spt15-300	5	20	0.144	0.1375	0.68
5	60	0.066	0.106	0.53	5	20	0.144	0.1375	0.68
5	60	0.066	0.106	0.53	5	100	0.044	0.073	0.316
5	120	0.058	0.0695	0.3015	5	100	0.044	0.073	0.316
5	120	0.058	0.0695	0.3015	6	20	0.03	0.0285	0.2175
6	60	0.02	0.0265	0.241	6	20	0.03	0.0285	0.2175
6	60	0.02	0.0265	0.241	6	100	0.012	0.0135	0.1785
6	120	0.016	0.018	0.067	6	100	0.012	0.0135	0.1785

表4：空白质粒、表达野生型SPT15的质粒和表达突变体spt15-300基因的质粒之间在乙醇/葡萄糖胁迫下行为的比较。相对于仅具有空白质粒的细胞的耐受性而言，野生型SPT15的过表达对乙醇耐受性没有影响。

基因	基因名	log2(突变体/野生型)	p值	功能
基因	基因名	log2(突变体/野生型)	p值	功能	YBR093C	PHO5	2.492	1.09E-06	可抑制的酸性磷酸酶
YML123C	PHO84	2.176	3.78E-06	高亲和力无机Pi转运蛋白和低亲和力锰转运蛋白	YBR093C	PHO5	2.492	1.09E-06	可抑制的酸性磷酸酶
YML123C	PHO84	2.176	3.78E-06	高亲和力无机Pi转运蛋白和低亲和力锰转运蛋白	YDR281C	PHM6	1.843	3.05E-04	未知功能蛋白，表达受Pi水平调节
YDR070C	FMP16	1.742	1.49E-03	未表征，可能为线粒体蛋白	YDR281C	PHM6	1.843	3.05E-04	未知功能蛋白，表达受Pi水平调节
YDR070C	FMP16	1.742	1.49E-03	未表征，可能为线粒体蛋白	YGR043C	YGR043C	1.584	2.33E-04	未知功能蛋白
YIL099W	SGA1	1.168	7.20E-04	参与糖原降解的孢子形成特异性葡萄糖淀粉酶	YGR043C	YGR043C	1.584	2.33E-04	未知功能蛋白
YIL099W	SGA1	1.168	7.20E-04	参与糖原降解的孢子形成特异性葡萄糖淀粉酶	YPL019C	VTC3	1.139	1.77E-06	液泡H+-ATP酶活性
YDR019C	GCV1	1.026	2.44E-05	线粒体甘氨酸脱羧酶复合体	YPL019C	VTC3	1.139	1.77E-06	液泡H+-ATP酶活性
YDR019C	GCV1	1.026	2.44E-05	线粒体甘氨酸脱羧酶复合体	YGL263W	COS12	0.991	8.01E-04	未知功能蛋白
YPR192W	AQY1	0.971	2.25E-04	孢子特异性水通道	YGL263W	COS12	0.991	8.01E-04	未知功能蛋白
YPR192W	AQY1	0.971	2.25E-04	孢子特异性水通道	YHR140W	YHR140W	0.926	8.99E-04	假想蛋白
YAL061W	YAL061W	0.924	3.71E-03	推定的多元醇脱氢酶	YHR140W	YHR140W	0.926	8.99E-04	假想蛋白
YAL061W	YAL061W	0.924	3.71E-03	推定的多元醇脱氢酶	YBR072W	HSP26	0.902	1.79E-03	具有蛋白伴侣活性的小热休克蛋白
YKL086W	SRX1	0.873	4.70E-04	硫氧还蛋白	YBR072W	HSP26	0.902	1.79E-03	具有蛋白伴侣活性的小热休克蛋白

表5：根据使用非胁迫(20g/L葡萄糖和0％乙醇)条件的p值和表达比对从微阵列分析中选择用于表型丧失分析的基因进行列表。

表6：使用来自非胁迫条件(0％乙醇和20g/L葡萄糖)或胁迫条件(5％乙醇和60g/L葡萄糖)的微阵列产生的基因集合的重叠。通过选择来自给定条件的表达差异为前1、5或10％的基因来产生基因集合。然后将这些基因与来自另一微阵列条件下以给定阈值(1、5或10％)获得的基因集合进行比较。例如，比较来自两个集合的前1％基因时，57个基因中有27个是相同的。因此，选择一个条件会提供额外30个占前1％的基因的独特集合。无论选择使用的微阵列条件为何，均观察到基因靶标的显著重叠。通常，在该研究中使用非胁迫的微阵列用于分析。这些基因的综合列表可从保藏的微阵列数据中容易地获得，所述微阵列数据以登记号GSE5185置于GEO数据库中。

表7：在胁迫和非胁迫条件下均具有绝对表达水平的所选基因，用于证明基因表达引发在突变体菌株中的影响。

葡萄糖浓度	20g/L	60g/L	100g/L	120g/L
葡萄糖浓度	20g/L	60g/L	100g/L	120g/L	F177S	0.87	1.13	0.90	1.19
Y195H	1.04	1.21	1.40	1.72	F177S	0.87	1.13	0.90	1.19
Y195H	1.04	1.21	1.40	1.72	K218R	0.88	1.03	1.21	1.35
F177S K218R	1.57	1.67	1.41	1.17	K218R	0.88	1.03	1.21	1.35
F177S K218R	1.57	1.67	1.41	1.17	F177S Y195H	1.70	2.05	1.91	1.62
Y195H K218R	1.52	1.55	1.33	1.00	F177S Y195H	1.70	2.05	1.91	1.62
Y195H K218R	1.52	1.55	1.33	1.00
F177S Y195H K218R	4.95	5.00	4.33	4.34

表8：在存在5％乙醇和多种葡萄糖浓度下孵育20小时后，与对照菌株相比突变体(单突变、双突变和分离的三突变spt15)的提高倍数。

葡萄糖浓度	20g/L	60g/L	100g/L	120g/L
葡萄糖浓度	20g/L	60g/L	100g/L	120g/L	F177S	1.47	1.09	0.86	0.97
Y195H	1.94	1.19	1.61	1.41	F177S	1.47	1.09	0.86	0.97
Y195H	1.94	1.19	1.61	1.41	K218R	1.29	1.06	1.25	0.97
F177S K218R	1.60	3.27	1.30	1.43	K218R	1.29	1.06	1.25	0.97
F177S K218R	1.60	3.27	1.30	1.43	F177S Y195H	1.84	3.48	3.16	1.67
Y195H K218R	1.62	2.76	1.45	1.27	F177S Y195H	1.84	3.48	3.16	1.67
Y195H K218R	1.62	2.76	1.45	1.27
F177S Y195H K218R	7.63	9.09	13.22	3.72

表9：在存在6％乙醇和多种葡萄糖浓度下孵育20小时后，与对照菌株相比突变体(单突变、双突变和分离的三突变spt15)的改进倍数。

补充信息的参考文献

1.H.Alper，C.Fischer，E.Nevoigt，G.Stephanopoulos，Proc Natl Acad Sci U S A 102，12678-83(Sep 6，2005).

2.D.Mumberg，R.Muller，M.Funk，Gene 156，119-22(Apr 14，1995).

3.P.Shannon et al.，Genome Res 13，2498-504(Nov，2003).

4.H.Alper，G.Stephanopoulos，Submitted，Awaiting Citation Information(2006).

5.H.Scholz，M.Franz，U.Heberlein，Nature 436，845-7(Aug 11，2005).

工业多倍体酵母菌株

使用与上文所述的相同方法，已在工业多倍体酵母菌株的环境中评价了上述突变。获得的结果显示也可以通过本发明的方法类似地改进这类菌株。

本领域的技术人员仅使用常规实验就会认识到或者能够确定本发明具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在包括于以下权利要求中。

本文公开的所有参考文献均通过参考整体引入本文。

Claims

1.包含突变的SPT15基因的经遗传修饰的酵母菌株，任选地，其中在引入所述突变SPT15基因或突变内源SPT15基因之前，不含该突变SPT15基因的该酵母菌株与野生型酵母菌株相比具有提高的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产性，并且其中相对于野生型酵母和不含该突变SPT15基因的酵母菌株而言，所述突变的SPT15基因进一步提高乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产性。

2.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中两个或更多位置上包含突变。

3.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中所有三个位置上包含突变。

4.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因包含突变F177S、Y195H和K218R中的两个或更多个或者该突变体氨基酸的保守性替换。

5.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因包含突变F177S、Y195H和K218R或者所述突变体氨基酸的保守性替换。

6.权利要求1-5中任一项的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因是重组表达的。

7.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因在质粒上引入酵母细胞中。

8.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因引入酵母细胞的基因组DNA中。

9.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述突变的SPT15基因是酵母细胞基因组DNA中被原位突变的内源基因。

10.权利要求1-9中任一项的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomycesspp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Paffia spp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candida spp.)、Talaromyces spp.、酒香酵母(Brettanomyces spp.)、Pachysolen spp.、德巴利酵母(Debaryomycesspp.)和工业多倍体酵母菌株。

11.权利要求10的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述酵母菌株是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。

12.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述不含该突变的SPT15基因的酵母菌株是这样的酵母菌株，其经遗传改造、选择而具有用于增强乙醇生产的一种或多种期望的表型，或者已知具有这样的表型。

13.权利要求12的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述一种或多种期望的表型是乙醇耐受性和/或提高的C5和C6糖发酵。

14.权利要求13的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述提高的C5和C6糖发酵的表型是提高的木糖发酵。

15.权利要求14的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述经遗传修饰的酵母菌株转化有外源木糖异构酶基因、外源木糖还原酶基因和外源木糖醇脱氢酶基因和/或外源木酮糖激酶基因。

16.权利要求14的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述经遗传修饰的酵母菌株包含进一步的遗传修饰，其为非特异性或特异性的醛糖还原酶基因的缺失、木糖醇脱氢酶基因的缺失和/或木酮糖激酶的过表达。

17.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述不含该突变SPT15基因的酵母菌株是呼吸缺陷型的酵母菌株。

18.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述酵母菌株显示Spt3的正常表达或提高表达。

19.权利要求1的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述酵母菌株不是Spt3敲除或无效突变体。

20.用于产生权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的酵母菌株的方法，包括向酵母菌株中引入所述突变SPT15基因的一个或多个拷贝，和/或在酵母细胞的基因组DNA中原位突变内源基因。

21.用于生产乙醇的方法，包括在含有一种或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的酵母菌株培养足以产生含有乙醇的发酵产物的时间。

22.权利要求21的方法，其中所述一种或多种可代谢成乙醇的底物包括C5和/或C6糖。

23.权利要求22的方法，其中所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。

24.用于生产乙醇的方法，包括在含有一种或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将包含突变SPT15基因的经遗传修饰的酵母菌株培养足以产生含有乙醇的发酵产物的时间，所述突变SPT15基因含有突变F177S、Y195H和K218R。

25.权利要求24的方法，其中所述一种或多种可代谢成乙醇的底物包括C5和/或C6糖。

26.权利要求25的方法，其中所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。

27.权利要求21-26中任一项的方法的发酵产物。

28.从权利要求27的发酵产物分离的乙醇。

29.权利要求28的乙醇，其中所述乙醇通过对该发酵产物进行蒸馏而分离。

30.用于产生具有提高的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产性的酵母菌株的方法，包括

提供包含突变SPT15基因的酵母菌株，和

针对提高的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或提高的乙醇生产进行遗传改造和/或选择。

31.权利要求30的方法，其中所述突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中两个或更多位置上包含突变。

32.权利要求30的方法，其中所述突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中所有三个位置上包含突变。

33.权利要求30的方法，其中所述突变的SPT15基因包含突变F177S、Y195H和K218R中的两个或更多个或这些突变的保守性替换。

34.权利要求30的方法，其中所述突变的SPT15基因包含突变F177S、Y195H和K218R或这些突变的保守性替换。

35.权利要求30-34中任一项的方法，其中所述突变的SPT15基因是重组表达的。

36.权利要求30-35中任一项的方法，其中所述突变的SPT15基因在质粒上引入酵母细胞中。

37.权利要求30-35中任一项的方法，其中所述突变的SPT15基因引入酵母细胞的基因组DNA中。

38.权利要求30-35中任一项的方法，其中所述突变的SPT15基因是酵母细胞基因组DNA中被原位突变的内源基因。

39.权利要求30-38中任一项的方法，其中所述酵母菌株选自酵母菌、裂殖酵母、毕赤酵母、法夫酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、Talaromycesspp.、酒香酵母、Pachysolen spp.、德巴利酵母和工业多倍体酵母菌株。

40.权利要求39的方法，其中所述酵母菌株是酿酒酵母菌株。

41.权利要求39的方法，其中所述酵母菌株是Spt15-300。

42.权利要求30-41中任一项的方法产生的酵母菌株。

43.用于生产乙醇的方法，包括在含有一种或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将权利要求42的酵母菌株培养足以产生含有乙醇的发酵产物的时间。

44.权利要求43的方法，其中所述一种或多种可代谢成乙醇的底物包括C5和/或C6糖。

45.权利要求44的方法，其中所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。

46.权利要求43-45中任一项的方法的发酵产物。

47.从权利要求46的发酵产物分离的乙醇。

48.权利要求47的乙醇，其中所述乙醇通过对该发酵产物进行蒸馏而分离。

49.酵母菌株，其过表达表5中所列至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或所有14个基因的任何组合或者具有一种或多种基本相似或冗余的生物/生物化学活性或功能的基因。

50.经遗传修饰的酵母菌株，其在含有提高的乙醇水平的培养基中培养时，达到至少4倍于在含有提高的乙醇水平的培养基中培养的野生型菌株的细胞密度。

51.权利要求50的经遗传修饰的酵母菌株，其中该菌株达到野生型菌株4-5倍的细胞密度。

52.权利要求50的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述提高的乙醇水平为至少约5％。

53.权利要求50的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述提高的乙醇水平为至少约6％。

54.权利要求50-53中任一项的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述培养基包含一种或多种糖，其浓度为至少约20g/L。

55.权利要求54的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述一种或多种糖以至少约60g/L的浓度存在。

56.权利要求55的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述一种或多种糖以至少约100g/L的浓度存在。

57.权利要求56的经遗传修饰的酵母菌株，其中所述一种或多种糖以至少约120g/L的浓度存在。