CN101356273A

CN101356273A - 全局转录机器的改造

Info

Publication number: CN101356273A
Application number: CNA2006800442782A
Authority: CN
Inventors: 哈尔·S·阿尔珀; 格里戈里·斯特凡诺普洛斯
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2009-01-28
Also published as: US20140235453A1; US9273307B2; US20070072194A1

Abstract

本发明涉及改造全局转录机器以产生具有改进表型的改造细胞。

Description

全局转录机器的改造

相关申请

本申请是2005年9月28日提交的美国申请序列号11/238096的部分继续申请，并根据35U.S.C.§119(e)要求2005年12月7日提交的美国临时申请序列号60/748315的权益，其全部公开内容通过参考并入本文中。

技术领域

背景技术

现在公认，许多重要细胞表型(从疾病状态到代谢物过量产生)受到许多基因的影响。然而，由于载体构建和转化效率的实验限制，多数细胞及代谢改造方法几乎完全依赖单基因的缺失或过表达。这些限制排除了同时研究多基因修饰，并将基因修饰研究局限在一次修饰一个基因的限制性顺次方法中。

美国专利5,686,283描述了由rpoS编码的σ因子用于激活在细菌细胞中休眠或低水平表达的其他细菌基因表达的用途。然而，该专利未描述诱变σ因子以全局式地改变基因转录。

美国专利5,200,341提供了鉴定为温度敏感型rpoD基因抑制子的突变rpoH基因，所述鉴定通过选择包含温度敏感性rpoD基因的温度抗性突变体菌株来实现。未进行细菌诱变，也未针对除温度抗性以外的表型对抑制子菌株进行选择。当在经修饰而表达异源蛋白质的其他细菌中加入突变体rpoH基因时，该异源蛋白质以更高的水平在该细菌中积累。

美国专利6,156,532描述了通过引入编码热休克蛋白的基因和编码σ因子的基因(rpoH)来进行修饰的微生物，所述σ因子特异性作用于热休克蛋白基因，从而增强细胞中热休克蛋白的表达量。该经修饰的微生物可用于产生发酵产物，如氨基酸。该微生物中使用的σ因子未突变。

已通过改组细菌基因组而对微生物应用定向进化，用于链霉菌的抗生素(泰乐菌素)产生(Zhang等，Nature，415，644-646(2002))以及乳杆菌的酸耐性(Patnaik等，Nature Biotech.20，707-712(2002))。这些方法不靶向任何特定基因的突变，而是使用原生质体融合来非重组地改组具有期望表型的菌株的基因组，然后选择改进了期望表型的菌株。

发明内容

本发明应用全局转录机器(global transcription machinery)改造来产生具有改进表型的改造细胞。特别地，本发明涉及产生在整个基因组水平上具有不同启动子偏好的突变细菌σ因子。通过引入突变σ因子得到的细胞具有快速且显著的表型改进，如对有害培养条件的耐性或者改进的代谢物产生。

结合定向进化的方法和概念，将突变体转录机器引入细胞允许人们以高通量方式研究大大扩展的研究领域，这通过评估同时发生的多基因改变从而改进复杂的细胞表型来实现。

通过反复多轮诱变和选择进行的定向进化已成功地扩展了抗体和酶的特性(W.P.Stemmer，Nature 370，389-91(1994))。最近，这些概念已在对启动子活性文库的检索中延伸和应用到DNA的非编码功能区，所述文库跨越以不同度量衡量的宽强度动力学范围(H.Alper，C.Fischer，E.Nevoigt，G.Stephanopoulos，Proc Natl Acad Sci USA 102，12678-12683(2005))。然而，还没有基于进化的方法涉及将系统性修饰全局转录机器作为改进细胞表型的手段。然而，详尽的生物化学研究提示，给定启动子序列的转录速率和体外偏好均可通过修饰细菌σ因子上的关键残基来改变(D.A.Siegele，J.C.Hu，W.A.Walter，C.A.Gross，J Mol Biol 206，591-603(1989)；T.Gardella，H.Moyle，M.M.Susskind，J Mol Biol 206，579-590(1989))。这些修饰的转录机器单元提供引入同时发生的全局转录水平变化的独特机会，所述全局转录水平变化可能以非常复杂的方式影响细胞特性。

根据本发明的一个方面，提供了用于改变细胞表型的方法。该方法包括突变编码全局转录机器的核酸以及任选的其启动子；在细胞中表达所述核酸以提供包含突变体全局转录机器的改造细胞；以及培养该改造细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括确定改造细胞的表型或者将改造细胞的表型与改造前细胞的表型进行比较。在另外的实施方案中，所述方法还包括重复诱变核酸以产生第n代改造细胞。在另一些实施方案中，该方法还包括确定第n代改造细胞的表型或者将第n代改造细胞的表型与任意先前世代改造细胞的表型或与改造前细胞的表型进行比较。在一些优选的实施方案中，重复诱变全局转录机器的步骤包括从改造细胞中分离编码突变全局转录机器的核酸以及任选的其启动子、突变所述核酸以及将突变核酸引入另一细胞中。

在某些实施方案中，所述细胞是原核细胞，优选细菌细胞或古细菌细胞。在这些实施方案中，所述全局转录机器优选为σ因子或抗σ因子。编码σ因子的核酸分子包括rpoD(σ⁷⁰)基因、rpoF(σ²⁸)基因、rpoS(σ³⁸)基因、rpoH(σ³²)基因、rpoN(σ⁵⁴)基因、rpoE(σ²⁴)基因和fecI(σ¹⁹)基因。所述σ因子或抗σ因子可表达自表达载体。

在另一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。优选的真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、干细胞和真菌细胞。在某些实施方案中，一种或多种真核细胞包含在多细胞生物中或者形成多细胞生物。在一些实施方案中，所述核酸由组织特异性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子在细胞中表达。

在另一些真核实施方案中，所述全局转录机器结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子。优选的全局转录机器包括TFIID或其亚基，如TATA结合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)(如TAF25)。编码全局转录机器的核酸分子包括GAL11基因、SIN4基因、RGR1基因、HRS1基因、PAF1基因、MED2基因、SNF6基因、SNF2基因和SWI1基因。在另一些实施方案中，所述全局转录机器为核酸甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶或组蛋白脱乙酰基酶。在某些实施方案中，所述全局转录机器表达自表达载体。

一些实施方案中的所述核酸是真核细胞的细胞器(优选线粒体或叶绿体)的核酸。所述核酸任选地为表达载体的一部分。

某些实施方案中的所述核酸是核酸集合(例如文库)中的成员。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括将所述集合引入细胞。

在另一些实施方案中，表达所述核酸的步骤包括将所述核酸整合进基因组，或者替换编码内源全局转录机器的核酸。

在某些实施方案中，所述核酸的突变包括核酸的定向进化，如通过易错PCR进行的突变或者通过基因改组进行的突变。在另一些实施方案中，所述核酸的突变包括合成具有一个或多个突变的核酸。

本发明中的核酸突变可包括一种或多种点突变和/或一种或多种截短和/或缺失。

在本发明的一些实施方案中，所述一种或多种截短或缺失不会破坏或除去全局转录机器的启动子结合区。在另一些实施方案中，所述突变全局转录机器表现出相对于未突变的全局转录机器来说提高的基因转录、相对于未突变的全局转录机器来说降低的基因转录、相对于未突变的全局转录机器来说提高的基因转录抑制和/或相对于未突变的全局转录机器来说降低的基因转录抑制。

在另一些实施方案中，所述方法还包括对改造细胞选择预定的表型。优选地，该选择步骤包括在选择条件下培养改造细胞和/或高通量测定个体细胞的表型。

可根据本发明选择多种表型。在一些优选的实施方案中，所述表型为对有害培养条件的耐性提高。这样的表型包括：溶剂耐性或有害废物耐性，例如乙醇、己烷或环己烷；对工业培养基的耐性；对高糖浓度的耐性；对高盐浓度的耐性；对高温的耐性；对极端pH的耐性；对表面活性剂的耐性，对渗透胁迫的耐性以及对多种有害条件的耐性。

在另一些优选的实施方案中，所述表型为代谢物生产的提高。代谢物包括番茄红素、乙醇、聚羟基丁酸酯(PHB)和治疗性蛋白质，如抗体或抗体片段。

在另一些优选的实施方案中，所述表型为对有毒底物、代谢中间体或产物的耐性。有毒代谢物包括有机溶剂、乙酸盐/酯、对羟基苯甲酸(pHBA)和过表达蛋白质。

其他表型包括抗生素抗性和提高的凋亡抗性。

在一些实施方案中，所述细胞包含在多细胞生物中。在这些实施方案中，优选的表型包括一种或多种生长特征、世代时间、对一种或多种害虫或疾病的抗性、植物中果实或其它部分的产生、一种或多种发育变化、一种或多种寿命变化、功能的获得或丧失和/或更为健壮。

所述方法中使用的细胞可在突变全局转录机器前对表型进行优化。

在某些实施方案中，本发明的方法还包括鉴定改造细胞中基因表达的变化。优选使用核酸微阵列来测定基因表达的变化。

根据本发明的另一方面，提供了用于改变细胞表型的方法。所述方法包括改变第一细胞中一种或多种基因产物的表达，所述基因产物是通过在第二细胞中检测基因表达变化而鉴定的，其中第二细胞中基因表达的变化通过突变该第二细胞的全局转录机器而产生。

在某些实施方案中，改变第一细胞中一种或多种基因产物的表达包括提高在第二细胞中提高的一种或多种基因产物的表达。在一些优选的实施方案中，通过向第一细胞引入一种或多种表达载体来提高所述一种或多种基因产物的表达，该表达载体表达所述一种或多种基因产物；或者通过提高一种或多种内源基因的转录来实现所述提高，该内源基因编码所述一种或多种基因产物。在下文实施方案中，提高一种或多种内源基因的转录包括突变该一种或多种基因的转录控制(例如启动子/增强子)序列。

在另一些实施方案中，改变第一细胞中一种或多种基因产物的表达包括降低在改造细胞中降低的一种或多种基因产物的表达。优选地，通过向第一细胞中引入降低一种或多种基因产物表达的核酸分子(如siRNA分子或表达siRNA分子的核酸分子)来降低所述一种或多种基因产物的表达。在另一些实施方案中，通过突变编码所述一种或多种基因产物的一种或多种基因或所述一种或多种基因的转录控制(例如启动子/增强子)序列来降低一种或多种基因产物的表达。

所述第二细胞中基因表达的变化优选使用核酸微阵列进行测定。

在另一些实施方案中，所述第二细胞中基因表达的变化用于构建基因或蛋白质网络的模型，该模型用于选择所述网络中一种或多种基因产物中的哪一种进行改变。

一些实施方案中的全局转录机器包括多于一种核酸和/或多肽，或者由多于一种核酸编码。

本发明还提供通过前述方法产生的细胞。

根据本发明的另一方面，提供了用于改变代谢物产生的方法。该方法包括根据前述任意方法突变产生所选代谢物的细胞中的全局转录机器，从而得到改造细胞，并分离所选代谢物的产量提高或降低的改造细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括培养所述分离的细胞，并从细胞或细胞培养物中回收所述代谢物。优选的代谢物包括番茄红素、乙醇、聚羟基丁酸酯(PHB)和治疗性蛋白质，如重组蛋白、抗体或抗体片段。

在一些实施方案中，所述细胞为原核细胞，包括细菌细胞或古细菌细胞。在另一些实施方案中，所述细胞为真核细胞，包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、干细胞和真菌细胞。下述某些实施方案中的全局转录机器由真核细胞细胞器(优选线粒体或叶绿体)的核酸编码。

根据本发明的另一方面，提供了包含多种不同核酸分子的集合(例如，文库)，其中优选每个核酸分子种类编码包含不同突变的全局转录机器。在一些优选的实施方案中，所述全局转录机器为σ因子或抗σ因子。优选地，编码σ因子的核酸为rpoD(σ⁷⁰)基因、rpoF(σ²⁸)基因、rpoS(σ³⁸)基因、rpoH(σ³²)基因、rpoN(σ⁵⁴)基因、rpoE(σ²⁴)基因或fecI(σ¹⁹)基因。在另一些优选的实施方案中，所述全局转录机器结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子。优选地，所述全局转录机器为TFIID或其亚基，如TATA结合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)，如TAF25。在另一些实施方案中，所述全局转录机器为核酸甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶或组蛋白脱乙酰基酶。

在某些实施方案中，所述核酸分子种类包含在表达载体中，优选由组织特异性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子表达。所述表达载体优选包含多种不同的核酸分子种类，其中每种核酸分子编码不同的全局转录机器。

在另一些实施方案中，所述全局转录机器通过定向进化来进行突变，优选使用易错PCR和/或使用基因改组来进行。全局转录机器中优选的突变为一种或多种点突变和/或一种或多种截短和/或缺失。在一些实施方案中，所述截短不包括全局转录机器的启动子结合区。

在另一些实施方案中，根据前述任意方法对所述细胞全局转录机器进行突变。

在本发明的另一方面中，提供了包含前述核酸分子集合的细胞集合(例如，文库)。在一些实施方案中，所述集合包括多种细胞，所述多种细胞中的每一种包含一种或多种所述核酸分子。所述细胞优选为原核细胞如细菌细胞或古细菌细胞或者真核细胞如酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、干细胞或真菌细胞。在另一些实施方案中，所述核酸分子整合进细胞的基因组，或者替换编码内源全局转录机器的核酸。

根据本发明的另一方面，提供了通过多轮突变产生的编码全局转录机器的核酸。所述多轮突变优选包括定向进化，如通过易错PCR进行的突变和/或通过基因改组进行的突变来实现的定向进化。

在一些实施方案中，所述核酸编码多种不同的全局转录机器种类。所述核酸优选编码相同类型全局转录机器种类的多种不同形式。本发明还提供了由前述核酸编码的全局转录机器。

在本发明的另一方面，提供了包含(羧基端)区域4的截短的σ因子蛋白。

根据本发明的另一方面，提供了用于对选定的废品进行生物除污(bioremediation)的方法。该方法包括根据前述任意方法突变细胞的全局转录机器以得到改造细胞；分离与未改造细胞相比代谢更多量所选废品的改造细胞；培养所分离的细胞；以及使所述改造细胞接触所选废品，从而提供对所选废品的生物除污。

参照附图和本发明的详细说明，本发明的这些和另一些方面及其多个实施方案将更为明显。

附图说明

图1描绘了全局转录机器改造的基本方法。通过将改造的全局转录机器引入细胞而改变了转录组(transcriptome)，并以全局方式改变基因表达水平。在本研究中，对细菌的σ因子70(由rpoD编码)进行易错PCR，以产生多种突变体。然后将所述突变体克隆进低拷贝表达载体中，在此期间由于存在近乎完整的内部限制酶位点而可能出现截短形式的σ因子。然后将该载体转化进大肠杆菌中并基于期望的表型进行筛选。然后将分离的突变体进行后续轮次的诱变和选择，以进一步改进表型。

图2显示乙醇耐性σ因子突变体的分离。分离包含突变体σ因子的菌株，所述突变体σ因子对乙醇的耐性提高。图2A：突变体因子的多轮定向进化对表型的总体增强。在乙醇浓度为0、20、40、50、60、70和80g/L时，通过计算与对照相比突变体倍增时间减少倍数的总和来评估总体增强(y轴)。至第三轮时，生长速率的改善似乎增量很小。图2B：相对于先前鉴定的关键功能区，标出σ70蛋白上突变的位置。第二轮诱变导致鉴定到了截短的因子，其仅包含该区域中先前两个突变中的一个。图2C：展示了第三轮突变体(红色)和对照(蓝色)菌株的生长曲线。第三轮突变体在所有测试的乙醇浓度下具有显著提高的生长速率。图2D：乙醇耐性突变体σ因子(天然的，SEQ ID NO：17；第一轮，SEQ ID NO：18；第二轮，SEQ IDNO：19；第三轮，SEQ ID NO：20)的氨基酸序列比对。

图3显示针对另外表型的σ因子序列分析。图3A：相对于先前鉴定的关键功能区域，标出σ70蛋白区域乙酸盐和pHBA突变体中的突变位置。绝大多数乙酸盐突变体是全长σ因子。所鉴定的pHBA突变体是截短的因子，预计其作为特定基因转录的抑制剂。图3B：乙酸盐耐性突变体σ因子(天然的，SEQ ID NO：17；Ac1，SEQ ID NO：21；Ac2，SEQ ID NO：22；Ac3，SEQ ID NO：23；Ac4，SEQ ID NO：24；Ac5，SEQ ID NO：25)的氨基酸序列比对。图3C：pHBA耐性突变体σ因子(天然的，SEQ ID NO：17；pHBA1，SEQ ID NO：26)的氨基酸序列比对。

图4描绘了具有己烷耐性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。图4还显示最佳己烷耐性突变体Hex-12和Hex-18的序列。

图5显示具有环己烷耐性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。

图6描绘了在逐渐提高的萘啶酸浓度下，抗生素抗性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。

图7A-7D显示培养所选菌株并测定其在15和24小时时的番茄红素产生的结果，以及来自最优菌株的σ因子突变体的序列。

图8是描绘在发酵期间与对照相比番茄红素产生的最大增加倍数的点图。圆的大小与增加倍数成比例。

图9举例说明15小时后几种目的菌株的番茄红素含量。该图将通过全局转录机器改造提供的改进与通过依次基因敲除的传统菌株改进方法进行比较。在该实例中，全局转录机器改造法在提高表型方面比一系列多基因敲除更加有效。另外，在预先改造菌株中实现了改进。

图10显示了在葡萄糖基本培养基中选择PHB指数期提高的菌株。图7A展示使用σ因子改造获得的多种菌株(红色和黄色柱代表对照)的结果。图7B展示从使用转座子诱变获得的随机敲除文库中所选菌株的结果。

图11描绘了在逐渐提高的SDS浓度下，SDS耐性σ因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度，以及来自最优菌株的σ因子突变体的序列。

图12显示酵母中LiCl gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中升高的LiCl水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Spt15的菌株。显示了16小时后突变体和对照菌株的生长量(以OD600来衡量)。在较低浓度LiCl下Taf25突变体优于对照，而所述Spt15突变体在较高浓度下更有效。

图13描绘了酵母中LiCl gTME突变体的序列分析。突变显示在显示每个因子的关键功能组分的示意图上。每种突变体仅具有单个氨基酸替换。

图14显示酵母中葡萄糖gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中提高的葡萄糖水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Spt15的菌株。此时，两种蛋白质均在相似的浓度范围内显示出改进，其中SPT15显示出最大的改进。

图15描绘了酵母中葡萄糖gTME突变体的序列分析。突变显示在显示各个因子的关键功能组分的示意图上。每种突变体仅具有单个氨基酸替换，然而分离了若干另外的SPT15蛋白，其中一些包含许多突变。

图16显示酵母中乙醇-葡萄糖gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中提高的乙醇和葡萄糖水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Spt15的菌株，并测定20小时时的生长。此时，SPT15蛋白远远超过TAF25突变体的影响。

图17描绘了酵母中乙醇-葡萄糖gTME突变体的序列分析。突变显示在显示各个因子的关键功能组分的示意图上。发现每种突变体在DNA或蛋白质接触的关键区域中包含若干单氨基酸替换。

发明详述

在所有的细胞系统(原核的和真核的)中，全局转录机器均负责控制转录组。在细菌系统中，σ因子在全局转录的组织中发挥关键作用，这通过致力于RNA聚合酶全酶的启动子偏好来实现(R.R.Burgess，L.Anthony，Curr.Opin.Microbiol 4，126-131(2001))。大肠杆菌(Escherichia coli)包含6种可替代的σ因子和一种主要因子σ70(由基因rpoD编码)。在蛋白质水平上，已在残基区中对与启动子位点及全酶的接触进行了分析(J.T.Owens等，PNAS 95，6021-6026(1998))。晶体结构分析以及大肠杆菌和另一些细菌中σ⁷⁰的位点特异性诱变已证明了改变RNA聚合酶全酶的体外启动子偏好的能力，其证据为报告基因转录的提高或降低(A.Malhotra，E.Severinova，S.A.Darst，Cell 87，127-36(1996))。本发明开拓了产生在整个基因组水平上具有不同启动子偏好的突变体σ因子的能力。

传统的菌株改进范例主要依赖于依次产生单个基因修饰，并且常常不能达到全局的最高点。其原因是代谢情况是复杂的(H.Alper，K.Miyaoku，G.Stephanopoulos，Nat Biotechnol 23，612-616(2005)；H.Alper，Y.-S.Jin，J.F.Moxley，G.Stephanopoulos，Metab Eng 7，155-164(2005))，并且增量式或贪婪搜索算法(greedy search algorithm)无法揭示仅在所有突变同时引入时才有益处的合成突变体。另一方面，通过随机诱变和选择增强的抗体亲合力、酶特异性或催化活性，蛋白质工程可迅速地改进适合性(E.T.Boder，K.S.Midelfort，K.D.Wittrup，Proc Natl Acad Sci USA 91，10701-5(2000)；A.Glieder，E.T.Farinas，F.H.Arnold，Nat Biotechnol 20，1135-9(2002)；N.Varadaraj an，J.Gam，M.J.Olsen，G.Georgiou，B.L.Iverson，Proc Natl Acad Sci USA 102，6855-60(2005))。这些实例中获得显著增强的重要原因是，这些方法能够通过评估许多同时发生的突变来探测巨大的氨基酸组合空间。使用本发明，我们开拓了σ⁷⁰因子的全局调节功能，从而类似地引入多个同时的基因表达改变，并因此通过选择负责改进的细胞表型的突变体来促进全细胞改造。

本发明提供了用于改变细胞表型的方法。该方法包括突变编码全局转录机器蛋白的核酸以及任选的其启动子；在细胞中表达所述核酸，以提供包含突变的全局转录机器蛋白的改造细胞；以及培养所述改造细胞。本文使用的“全局转录机器”是调节多种基因转录的一种或多种分子。所述全局转录机器可以是通过与RNA聚合酶分子相互作用以及调节其活性来影响基因转录的蛋白质。所述全局转录机器还可以是改变细胞基因组转录能力的蛋白质(例如，甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶和脱乙酰基酶)。另外，全局转录机器可以是改变多种基因转录的非蛋白质分子(例如小RNA(micro RNA))。

可用于本发明的全局转录机器包括细菌的σ因子和抗σ因子。编码σ因子的基因的实例包括rpoD(编码σ⁷⁰)、rpoF(编码σ²⁸)、rpoS(编码σ³⁸)、rpoH(编码σ³²)、rpoN(编码σ⁵⁴)、rpoE(编码σ²⁴)和fecI(编码σ¹⁹)。抗σ因子与σ因子结合，并控制其可用性，因此控制转录。在大肠杆菌中，抗σ因子由rsd(针对σ因子70)或flgM等编码。可突变抗σ因子从而控制它们对正常细胞转录的影响。另外，可创造突变体σ因子与突变体抗σ因子新的配对，从而获得细胞中对转录的其他控制。例如，可使用可诱导的启动子表达抗σ因子，所述启动子使得可调节地控制突变体σ因子所传递的表型。

全局转录机器还包括结合真核RNA聚合酶(如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III)或者RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子，并且调节其活性的多肽。这样的真核全局转录机器的实例包括TFIID或其亚基，如TATA结合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)如TAF25，以及延伸因子。来自酵母的其它实例包括GAL11、SIN4、RGR1、HRS1、PAF1、MED2、SNF6、SNF2和SWI1。

全局转录机器还包括改变染色体DNA转录能力的多肽，如核酸甲基转移酶(例如DamMT、DNMT1、Dnmt3a)、组蛋白甲基转移酶(例如Set1、MLL1)、组蛋白乙酰化酶(例如PCAF、GCN5、Sas2p以及其他MYST型组蛋白乙酰化酶、TIP60)和组蛋白脱乙酰基酶(例如HDAC1、HDA1、HDAC2、HDAC3、RPD3、HDAC8、Sir2p)，以及相关因子(例如HDAC家族与mSin3A、Mi-2/NRD、CoREST/kiaa0071、N-CoR和SMRT有关)。

另一些全局转录机器由真核细胞细胞器(如线粒体或叶绿体)的核酸分子编码。

在许多情况下，对全局转录机器进行突变的过程将包括反复产生多种全局转录机器突变，但这并不是必需的，因为甚至全局转录机器中的单个突变也能导致显著的表型变化，如本文中所述。

尽管本发明的方法通常通过对全局转录机器进行突变以及之后将突变的全局转录机器引入细胞以产生改造细胞来进行，但也有可能突变内源全局转录机器基因，例如通过用突变体全局转录机器进行替换或者对内源全局转录机器进行原位突变来实现。本文使用的“内源”指对细胞而言是天然的；在对全局转录机器进行突变的情况下，“内源”是指细胞中的全局转录机器基因。相反地，更典型的方法包括在细胞外突变全局转录机器基因，然后将该突变基因引入细胞中。

所述全局转录机器基因可以属于与所引入细胞相同的或不同的物种。例如，如本文所示，突变大肠杆菌σ因子70并引入大肠杆菌中，以改变大肠杆菌细胞的表型。也可以以同样的模式应用大肠杆菌的其它全局转录机器。类似地，可以突变特定酵母物种(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或裂殖酵母(S.pombe))的全局转录机器并引入同样的酵母物种中。同样，可以使用标准重组遗传技术以类似于本文所提供具体实施例的方式突变线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))或者哺乳动物(例如小鼠(M.musculus)、褐家鼠(R.norvegicus)或人(H.sapiens))的全局转录机器并引入同样的物种中。

或者，可以使用来自不同物种的全局转录机器，以提供基因转录控制中的其它变化。例如，可以突变链霉菌属(Streptomyces)细菌的全局转录机器并引入大肠杆菌中。不同的全局转录机器还可以来自生物的不同界或门。取决于所使用的突变方法，可以将相同的和不同的全局转录机器组合，以用于本发明的方法，例如通过基因改组来组合。

任选地，可以诱变全局转录机器的转录控制序列，而非编码序列本身。转录控制序列包括启动子和增强子序列。然后，可将与全局转录机器编码序列连接的突变启动子和/或增强子序列引入细胞中。

将突变体全局转录机器引入细胞产生改造细胞后，接着确定/测定改造细胞的表型。这可以通过对改造细胞选择具有(或不具有)特定表型来实现。以下有表型实例的详细描述。还可通过将改造细胞的表型与改造前细胞的表型进行比较来确定表型。

在一些优选的实施方案中，将全局转录机器的突变和突变体全局转录机器的引入重复进行一次或多次，从而得到“第n代”改造细胞，其中“n”是突变和引入全局转录机器的重复次数。例如，重复突变并引入全局转录机器一次(在全局转录机器最初的突变和引入之后)得到第二代改造细胞。再一次的重复得到第三代改造细胞，依此类推。然后，对包含反复突变的全局转录机器的细胞确定表型(或者与包含未突变的全局转录机器或之前重复的突变体全局转录机器的细胞进行比较)，如本文中别处的描述。

反复突变全局转录机器使表型在连续突变步骤后得以改进，每个步骤可引起全局转录机器的多个突变。反复诱变也有可能引起全局转录机器中的特定氨基酸残基突变在反复过程中“出现”或“消失”。在工作实施例中提供了此类突变的实例。

在所述方法的典型用途中，通过突变编码全局转录机器的核酸分子对全局转录机器进行定向进化。突变核酸分子的一个优选方法是对编码序列进行诱变，然后插入载体(例如质粒)中。尽管优选在插入载体之前突变编码序列，但必要时该过程也可颠倒，即首先将核酸分子插入载体中，然后对序列进行诱变。

当重复进行全局转录机器定向进化时(即在本发明的反复过程中)，一种优选的方法包括从改造细胞中分离编码突变体全局转录机器的核酸以及任选地其启动子。然后突变所分离的核酸分子(产生编码第二代突变体全局转录机器的核酸)，随后引入另一细胞中。

在突变时，所述分离的核酸分子形成包含不同突变或突变组的突变核酸分子集合。例如，当核酸分子在随机突变时可包含沿核酸分子长度上一个或多个位置突变的突变组。因此，该组的第一成员可包含核苷酸n1处的一个突变(其中nx代表表示核酸分子的核苷酸序列号，x是从分子的第一个至最后一个核苷酸的核苷酸位置)。该组的第二成员可包含核苷酸n2处的一个突变。该组的第三成员可包含核苷酸n1和n3处的两个突变。该组的第四成员可包含n4和n5位置上的两个突变。该组的第五成员可包含三个突变：核苷酸n4和n5的两个点突变以及核苷酸n6-n7的缺失。该组的第六成员可包含核苷酸n1、n5和n8的点突变，以及3’端的核苷酸截短。该组的第七成员中核苷酸n9-n10可能与核苷酸n11-n12发生了交换。本领域的普通技术人员可以容易地预期多种其它组合，包括随机和定向突变的组合。

所述核酸分子的集合可以是核酸文库，如插入载体中的许多不同的突变核酸分子。这样的文库可根据分子生物学的标准方法贮存、复制、等分和/或引入细胞以产生改造细胞。

用于定向进化的全局转录机器突变优选是随机的。然而，也可以限制全局转录机器中所引入突变的随机性，以产生全局转录机器的非随机或部分随机突变或者这些突变的某种组合。例如，对于部分随机突变，突变可局限在编码全局转录机器的核酸分子中的某个部分。

可基于期望的突变类型来选择突变方法。例如，对于随机突变，可使用诸如核酸分子的易错PCR扩增的方法。可使用定点诱变在核酸分子的特定核苷酸处引入特定突变。可使用合成核酸分子来引入特定的突变和/或随机突变，后者位于一个或多个特定核苷酸处，或者跨越整个核酸分子的长度。合成核酸的方法在本领域是公知的(例如，Tian等，Nature 432：1050-1053(2004))。

可使用DNA改组(也叫作基因改组)通过交换核酸分子区段来引入其它突变。参见如美国专利6,518,065、相关专利及其引用的参考文献。用作改组源材料的核酸分子可以是编码单一类型的全局转录机器(例如σ⁷⁰)或者多于一种类型的全局转录机器的核酸分子。例如，可以改组编码不同全局转录机器的核酸分子，如单一物种的不同σ因子(例如，大肠杆菌的σ⁷⁰和σ²⁸)，或者来自不同物种的σ因子。同样地，可以改组编码不同类型全局转录机器(例如σ因子70和TFIID)的核酸分子。

突变核酸分子(以随机或非随机的方式)的多种其它方法是本领域普通技术人员公知的。可以组合地使用一种或多种不同方法，以在编码全局转录机器的核酸分子中产生突变。在这方面，“组合地”指不同类型的突变组合在单个核酸分子中，并且分配到核酸分子组中。不同类型的突变包括点突变、核苷酸截短、核苷酸缺失、核苷酸添加、核苷酸替换和核苷酸区段的改组(例如，再分配)。因此，任何单个核酸分子可包含一种或多种类型的突变，并且它们可以随机地或非随机地分配到核酸分子组中。例如，核酸分子组可以包含该组中每个核酸分子共有的突变，以及不为该组中每个核酸分子共有的数量可变的突变。例如，所述共有的突变可以是发现对细胞的期望改造表型有利的突变。

优选地，所述一种或多种截短或缺失不破坏或除去全局转录机器的启动子结合区域。

相对于未突变的全局转录机器，所述突变的全局转录机器可表现出提高或降低的基因转录。另外，相对于未突变的全局转录机器，所述突变的全局转录机器可表现出提高或降低的基因转录抑制。

本文使用的“载体”可以是许多核酸中的任意一种，所述核酸中可通过限制性处理和连接而插入期望序列，用于在不同的遗传环境之间进行运输或者用于在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组成，然而RNA载体也是可用的。载体包括但不限于：质粒、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。

克隆载体是能够自主复制或整合进宿主细胞基因组的载体，并且其特征还在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，该载体可在所述位点处以可确定的方式切割，并且目标DNA序列可连接进所述位点处，从而新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。对于质粒而言，由于质粒在宿主细菌中拷贝数增加，所以目的序列可发生多次复制，或者在每个宿主中仅在宿主通过有丝分裂复制前发生一次。对于噬菌体而言，复制可在溶胞阶段期间主动发生，或者在溶原阶段期间被动发生。

表达载体是这样的载体，其中可通过限制性处理和连接插入期望DNA序列，从而其与调节序列有效连接，并可表达为RNA转录物。载体还可包含一个或多个标记序列，其适于鉴定被或未被该载体转化或转染的细胞。标记包括如编码提高或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码活性可通过本领域已知的标准测定进行检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因以及以可见方式影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或菌斑的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。优选的载体是能够自主复制和表达结构基因产物的载体，所述结构基因产物存在于与载体有效连接的DNA区段中。

如本文使用的，当以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制之下的方式共价连接时，编码序列和调节序列称为“有效”连接。如果期望编码序列翻译为功能蛋白，那么如果诱导5’调节序列中的启动子导致编码序列转录，并且如果两个DNA序列间连接的性质不会(1)导致引入移码突变、(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力或者(3)干扰相应的RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则两DNA序列称为有效连接。因此，如果启动子区域能够影响DNA序列的转录从而得到的转录物可翻译成期望的蛋白质或多肽，则所述启动子区将是与编码序列有效连接的。

基因表达所需调节序列的确切性质在物种或细胞类型之间可以不同，然而根据需要通常应包括分别参与起始转录和翻译的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这样的5’非转录调节序列将包括启动子区，所述启动子区含有控制有效连接基因转录的启动子序列。如有必要，调节序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。本发明的载体可任选地包括5’前导或信号序列。选择和设计合适的载体在本领域普通技术人员的能力和判断力之内。

包含所有表达必要元件的表达载体是市售的，并为本领域技术人员所公知。参见如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过向细胞中引入编码CT抗原多肽或其片段或变体的异源DNA(RNA)来遗传改造所述细胞。所述异源DNA(RNA)置于转录元件的有效控制下，从而允许该异源DNA在宿主细胞中表达。

用于在哺乳动物细胞中表达mRNA的优选系统为例如pRc/CMV或pcDNA3.1(可从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)，其包含选择标记如G418抗性基因(便于选择稳定转染细胞系)以及人巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列。另外，适于在灵长类或犬类细胞系中表达的载体是包含EB病毒(EBV)复制起点的pCEP4载体(Invitrogen)，其有助于维持质粒作为多拷贝染色体外元件。

当编码突变全局转录机器的核酸分子在细胞中表达时，可使用多种转录控制序列(例如启动子/增强子序列)指导全局转录机器的表达。所述启动子可以是天然启动子，即该全局转录机器的启动子，其提供对全局转录机器表达的正常调节。所述启动子还可以是广泛表达的启动子，如β-肌动蛋白、泛素B、噬菌体的启动子或者巨细胞病毒启动子。本发明有用的启动子还可以是不广泛表达全局转录机器的启动子。例如，可以使用组织特异性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子在细胞中表达全局转录机器。还可使用多种条件启动子，如受分子存在与否控制的启动子，如四环素应答启动子(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl Acad.Sci USA，89，5547-5551(1992))。

可使用本领域标准的方法和技术将编码突变全局转录机器的核酸分子引入细胞或多种细胞中。例如，可通过多种转染方法引入核酸分子：转导、电穿孔、粒子轰击、注射(包括细胞的显微注射以及向多细胞生物注射)、脂转染、用于YAC(酵母人工染色体)的酵母原生质球/细胞融合物、用于植物细胞的农杆菌介导的转化等。

表达编码突变全局转录机器的核酸分子还可通过将该核酸分子整合进基因组或者通过替换编码内源全局转录机器的核酸序列来实现。

通过突变全局转录机器提供了新的组合物，包括通过多轮突变产生的编码全局转录机器的核酸分子。多轮突变可包括定向进化，其中每轮突变之后是选择过程，以选择具有期望表型的突变全局转录机器。突变和选择突变全局转录机器的方法在本文中其他处描述。还提供了利用这些核酸分子得到的全局转录机器。

在某些情况下，已发现突变的全局转录机器是截短形式的未突变全局转录机器。特别地，对于σ因子70来说，已发现仅保留σ⁷⁰蛋白羧基端的σ⁷⁰氨基端截短为所引入的细菌提供了有利的表型。因此，提供了全局转录机器的片段，尤其是保持启动子结合特性的未突变全局转录机器片段，更优选包含区域4的σ70片段。还提供了编码截短的全局转录机器的核酸分子，包括包含在载体和/或细胞中的核酸分子。

用于本发明的细胞包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括细菌细胞和古细菌细胞。真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、干细胞和真菌细胞。真核细胞可包含在例如多细胞生物的一部分或整体中。多细胞生物包括哺乳动物、线虫如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、家蚕(Bombyx mori)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、海胆和果蝇(Drosophilamelanogaster)。

细菌的实例包括埃希氏菌(Escherichia spp.)、链霉菌(Streptomycesspp.)、发酵单胞菌(Zymonas spp.)、醋杆菌(Acetobacter spp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter spp.)、集胞蓝细菌(Synechocystis spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、棒杆菌(Corynebacteriumspp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、黄单胞菌(Xanthomonas spp.)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)、产碱菌(Alcaligenes spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、固氮菌(Azotobacter spp.)、从毛单胞菌(Comamonas spp.)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌(Gluconobacter spp.)、雷尔氏菌(Ralstoniaspp.)、Acidithiobacillus spp.、小月菌(Microlunatus spp.)、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、节杆菌(Arthrobacter spp.)、黄杆菌(Flavobacteriumspp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)、糖单孢菌(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌(Thermus spp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌(Chromobacterium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌(Saccharopolyspora spp.)、农杆菌(Agrobacterium spp.)和泛菌(Pantoeaspp.)。

古菌(也称为古细菌)的实例包括甲基单胞菌(Methylomonas spp.)、硫化叶菌(Sulfolobus spp.)、甲基杆菌(Methylobacterium spp.)、盐杆菌(Halobacterium spp.)、甲烷杆菌(Methanobacterium spp.)、甲烷球菌(Methanococci spp.)、甲烷嗜热菌(Methanopyri spp.)、古生球菌(Archaeoglobus spp.)、铁球菌(Ferroglobus spp.)、热原体(Thermoplasmata spp.)和热球菌(Thermococci spp.)。

酵母的实例包括酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Paffiaspp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candida spp.)、Talaromyces spp.和德巴利酵母(Debaryomyces spp.)。

真菌的实例包括曲霉(Aspergillus spp.)、青霉菌(Penicillium spp.)、镰刀菌(Fusarium spp.)、根霉(Rhizopus spp.)、顶孢霉(Acremoniumspp.)、脉孢菌(Neurospora spp.)、粪壳菌(Sordaria spp.)、稻瘟菌(Magnaporthe spp.)、异水霉(Allomyces spp.)、黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢菌(Botrytis spp.)和木霉(Trichoderma spp.)。

昆虫细胞的实例包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系如Sf9和Sf21、果蝇细胞系如Kc、Ca、311、DH14、DH15、DH33P1、P2、P4和SCHNEIDER-2(D.Mel-S2)和舞毒蛾(Lymantria dispar)细胞系如652Y。

哺乳动物细胞的实例包括原代细胞如干细胞和树突细胞，以及哺乳动物细胞系如Vero、HEK 293、Sp2/0、P3UI、CHO、COS、HeLa、BAE-1、MRC-5、NIH 3T3、L929、HEPG2、NS0、U937、HL60、YAC1、BHK、ROS、Y79、Neur02a、NRK、MCF-10、RAW 264.7和TBY-2。

干细胞系包括hESC BG01、hESC BG01V、ES-C57BL/6、ES-D3GL、J1、R1、RW.4、7AC5/EYFP和R1/E。另外的人类干细胞系包括(NIH命名)CH01、CH02、GE01、GE07、GE09、GE13、GE14、GE91、GE92、SA19、MB01、MB02、MB03、NC01、NC02、NC03、RL05、RL07、RL10、RL13、RL15、RL20和RL21。

全局转录机器的定向进化产生改造细胞，其中一些具有改变的表型。因此，本发明还包括选择具有预定表型的改造细胞。可通过在选择条件下培养所述改造细胞来选择预定表型。还可通过高通量测定个体细胞的表型来选择预定表型。例如，可在细胞中对有害条件的耐性和/或代谢物产生的提高进行选择。耐性表型包括耐受溶剂如乙醇、有机溶剂如己烷或环己烷；耐受有毒代谢物如乙酸盐/酯、对羟基苯甲酸(pHBA)、对羟基肉桂酸、羟基丙醛、过表达的蛋白质、有机溶剂和免疫抑制分子；耐受表面活性剂；耐受渗透胁迫；耐受高糖浓度；耐受高温；耐受极端pH条件(高或低)；抗凋亡；耐受有毒底物如有害废物；耐受工业培养基；提高抗生素抗性等。实施例中示例了对乙醇耐性、有机溶剂耐性、乙酸盐/酯耐性、对羟基苯甲酸耐性、SDS耐性和抗生素抗性的选择。在其它一些实施例中，示例了对提高的番茄红素和聚羟基丁酸酯产生的选择。在酵母细胞的实施例中，示例了对高糖(葡萄糖)耐性、渗透胁迫(LiCl)耐性和对高葡萄糖和乙醇浓度的多重耐性的选择。

还任选择多细胞生物所表现另一些表型。可将全局转录机器的突变体引入哺乳动物或其它真核细胞系中，或者甚至引入完整生物中(例如，通过引入生殖细胞系或注射进卵母细胞中)，以允许筛选表型。这些表型可以在生物的单细胞中表现或不在生物的单细胞中表现，并包括：一种或多种生长特征、世代时间、对一种或多种害虫或疾病的抗性、果实或其他植物部分的产生、一种或多种发育变化、一种或多种寿命变化、功能的获得或丧失、健壮性提高等。

涉及包含突变全局转录机器的改造细胞时，本文使用的“耐性”指与未改造细胞或先前改造的细胞相比，所述改造细胞能够承受有害程度更高的条件。例如，所述未改造或先前改造的细胞是“子代”改造细胞的“亲本”，或者与被测细胞(第n代)相比，所述未改造或先前改造的细胞是第(n-1)代。“承受有害的条件”指与未改造或先前改造的细胞相比，所述改造细胞具有提高的生长和/或存活。该概念还包括对细胞有毒的代谢物产生的提高。

关于对高糖浓度的耐性，这样的浓度可以是≥100g/L、≥120g/L、≥140g/L、≥160g/L、≥180g/L、≥200g/L、≥250g/L、≥300g/L、≥350g/L、≥400g/L、≥450g/L、≥500g/L等。关于对高盐浓度的耐性，这样的浓度可以是≥1M、≥2M、≥3M、≥4M、≥5M等。关于对高温的耐性，所述温度可以是例如对细菌细胞为≥42℃、≥44℃、≥46℃、≥48℃、≥50℃。可根据所使用细胞类型选择其它的温度范围。关于对极端pH的耐性，示例性pH截止值为例如≥pH10、≥pH11、≥pH12、≥pH13，或者≤pH4.0、≤pH3.0、≤pH2.0、≤pH1.0。关于对表面活性剂的耐性，示例性表面活性剂浓度为≥5％(重量/体积)、≥6％(重量/体积)、≥7％(重量/体积)、≥8％(重量/体积)、≥9％(重量/体积)、≥10％(重量/体积)、≥12％(重量/体积)、≥15％(重量/体积)等。关于对乙醇的耐性，示例性乙醇浓度为≥4％(体积/体积)、≥5％(体积/体积)、≥6％(体积/体积)、≥7％(体积/体积)、≥8％(体积/体积)、≥9％(体积/体积)、≥10％(体积/体积)等。关于对渗透胁迫的耐性，诱导渗透胁迫的示例性浓度(例如LiCl浓度)为≥100mM、≥150mM、≥200mM、≥250mM、≥300mM、≥350mM、≥400mM等。

本发明包括获得细胞中提高的代谢物产生。本文使用的“代谢物”是在或能在细胞中产生的任何分子。代谢物包括代谢中间体或终产物，任何所述产物均可对细胞具有毒性，在这些情况下提高的产生可涉及对该有毒代谢物的耐性。因此，代谢物包括小分子、肽、大的蛋白质、脂质、糖等。示例性代谢物包括实施例中展示的代谢物(番茄红素、聚羟基丁酸盐和乙醇)；治疗性蛋白质(如抗体或抗体片段)。

本发明还提供了对多种表型的选择，如对多种有害条件的耐性、多种代谢物产生的提高，或者其组合。一个实例是实施例中展示的酵母对高葡萄糖和乙醇浓度的多重耐性。

使用在引入突变全局转录机器之前预先为预定表型进行优化的细胞可能是有利的。因此，例如在番茄红素的产生中，优选使用产生较多量番茄红素(更优选最佳量的番茄红素)的细胞，而不是从仅产生少量番茄红素的细菌细胞开始。在这些情况下，突变全局转录机器用于进一步改进已有改进的表型。

通过所述突变全局转录机器的作用，所述改造细胞将具有改变的基因表达。在某些方面，本发明的方法可包括鉴定改造细胞中基因表达的变化。可使用多种本领域公知的方法鉴定基因表达的变化。优选地，使用核酸微阵列测定基因表达的变化。

在本发明的一些方面，细胞中通过突变全局转录机器产生的一种或多种基因表达变化可以在另一细胞中再现，从而产生相同的(或相似的)表型。可以如上所述鉴定突变全局转录机器产生的基因表达变化。然后，可通过重组基因表达或其它手段将调控靶向个体基因。例如，突变的全局转录机器可提高基因A、B、C、D和E的表达，并降低基因F、G和H的表达。本发明包括调节一种或多种上述基因的表达，以再现突变全局转录机器所产生的表型。为了再现预定的表型，可提高或降低基因A、B、C、D、E、F、G和H中的一种或多种，所述提高例如通过向细胞中引入包含该基因序列的表达载体来实现；通过提高编码所述一种或多种基因产物的一种或多种内源基因的转录来实现，或者通过突变该一种或多种基因的转录控制(例如，启动子/增强子)序列来实现；所述降低例如通过向第一细胞中引入降低所述一种或多种基因产物表达的核酸分子(如siRNA核酸分子或表达siRNA分子的核酸分子)来实现，或者通过突变编码所述一种或多种基因产物的一种或多种基因或者所述一种或多种基因的转录控制(例如，启动子/增强子)序列来实现。

任选地，包含突变全局转录机器的细胞中的基因表达变化用于构建基因或蛋白质网络的模型，然后使用所述模型选择改变网络中一种或多种基因产物中的哪一种。可以通过Ideker及其同事的方法(参见，例如Kelley等，Proc Natl Acad Sci USA 100(20)，11394-11399(2003)；Yeang等GenomeBiology 6(7)，Article R62(2005)；Ideker等，Bioinformatics.18Suppl1：S233-40(2002))或Liao及其同事的方法(参见，例如Liao等，Proc NatlAcad Sci USA 100(26)，15522-15527(2003)；Yang等，BMC Genomics 6，90(2005))产生基因或蛋白质网络的模型。

本发明还包括通过本文所述的任何方法得到的细胞，以及包含所述细胞的多细胞生物。所述细胞可用于多种目的，包括：分子的工业生产(例如，许多耐性表型和代谢物产生提高的表型)；生物除污(例如，有害废物耐性表型)；鉴定在癌症病因中有活性的基因(例如，抗凋亡表型)；鉴定细菌及其它原核生物对抗生素的抗性中有活性的基因；鉴定害虫对杀虫剂的抗性中有活性的基因等。

在另一方面，本发明提供用于改变代谢物产生的方法。所述方法包括根据本文别处描述的方法突变全局转录机器以产生改造细胞。所述细胞优选为产生所选代谢物的细胞，并且如上所述，优选对代谢物产生预先进行优化。然后，可分离所选代谢物的产生提高或降低的细胞。该方法还可包括培养分离细胞以及从该细胞或细胞培养物中回收代谢物。可使用本领域公知的方法进行培养细胞以及回收代谢物的步骤。本文别处提供了多种优选的细胞类型、全局转录机器和代谢物。

本发明提供的另一方法是用于对选定的废品进行生物除污的方法。本文使用的“生物除污”是利用微生物(如细菌和其它原核生物)增强环境中有毒化合物的清除。生物除污中的困难之一是基于位点处存在的特定毒素而获得对该位点进行有效除污的细菌菌株或其它微生物。本文所述的用于改变细胞表型的方法提供了得到这样的细菌菌株的理想方法。例如，可通过突变细胞的全局转录机器以产生本发明的改造细胞，并分离与未改造细胞相比代谢更多量的所选废品的改造细胞，从而实现生物除污。然后，可培养所分离的改造细胞，并使其接触所选废品，由此提供对所选废品的生物除污。或者，需要除污的有毒废品位置处的材料样品可作为选择培养基，从而获得特异性针对特定有毒废品处特定毒素混合物的微生物。

本发明还提供核酸分子的集合，使用分子生物学的标准命名法，所述集合在本领域可理解为核酸分子“文库”。这样的集合/文库包括多种不同的核酸分子，其中每种核酸分子编码具有不同突变的全局转录机器，如本文别处所述。

本发明的其它集合/文库是包含含有上述核酸分子集合/文库的细胞的集合/文库。所述集合/文库包含多种细胞，其中每种细胞包含一种或多种所述核酸分子。所述集合中存在的细胞类型在本文别处有所描述，并包括单细胞和包含一种或多种这些细胞的多细胞生物。在所述细胞文库中，所述核酸分子可以以染色体外核酸(例如在质粒上)存在、可以整合到细胞基因组中，并可以替换编码内源全局转录机器的核酸。

可以向使用者提供核酸或细胞的集合/文库用于多种用途。例如，可在细胞集合中筛选使用者期望的表型。同样地，使用者可将核酸分子集合引入细胞中，以产生改造细胞，然后在所述改造细胞中筛选特定的目的表型。例如，为了使用本文所述的表型，寻求番茄红素产生的提高并且拥有产生一定量番茄红素的菌株的使用者可以将突变全局转录因子引入所述菌株，然后筛选提高的番茄红素产生。随后，还可实施通过突变和再次引入全局转录机器进行的后续轮次的定向进化，从而获得番茄红素产生的进一步提高。

可以将集合/文库贮存在本领域普遍使用的容器中，如管、微孔板等。

实施例

材料和方法

菌株和培养基

如实验方案所述，将大肠杆菌DH5α(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于常规转化以及本实验中的所有表型分析。在37℃下以225RPM轨道振荡在包含5g/L D-葡萄糖并补充有1mM维生素B₁的LB-Miller培养基或M9-基本培养基中培养菌株(Maniatis，等，Molecular cloning：alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1982)。必要时，向培养基中补充34μg/ml氯霉素用于增殖低拷贝质粒以及68μg/ml氯霉素、20μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素用于维持高拷贝质粒。使用分光光度法在600nm处监测细胞密度。M9低盐培养基从US Biological(Swampscott，MA)处购得，X-gal从American Bioanalytical(Natick，MA)处购得，其它的所有化学品来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。引物从Invitrogen处购得。

构建文库

使用pUC19(Yanisch-Perron，等，Gene 33：103-119，1985)作为宿主背景菌株来构建低拷贝宿主质粒(pHACM)，使用pACYC184中的CAT基因(Chang，等，J Bacteriol 134：1141-1156，1978)和来自pSC101的pSC101复制起点(Bernardi，等，Nucleic Acids Res 12：9415-9426，1984)用氯霉素替换氨苄青霉素抗性。使用以下引物将来自pACYC184的氯霉素基因扩增为具有AatII和AhdI限制酶切位点突出端：CM_有义_AhdI：GTTGCCTGACTCCCCGTCGCCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAAC(SEQ IDNO：1)和CM_反义_AatII：CAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAACTGCAGT(SEQID NO：2)。将该片段与pUC19骨架消化并连接到一起从而形成pUC19-Cm。使用以下引物将来自pSC101的pSC101片段扩增为具有AfIIII和NotI限制酶切位点突出端：pSC_有义_AflIII：CCCACATGTCCTAGACCTAGCTGCAGGTCGAGGA(SEQ ID NO：3)和pSC_反义_NotI：AAGGAAAAAAGCGGCCGCACGGGTAAGCCTGTTGATGATACCGCTGCCTTACT(SEQ ID NO：4)。该片段与pUC19-Cm构建体进行消化并连接到一起从而形成pHACM。

使用HindIII和SacI限制性突出端从大肠杆菌基因组DNA中扩增rpoD基因(EcoGene登记号：EG10896；B-编码：b3067；SEQ ID NO：27)，从而靶向pHACM中的lacZ基因以允许进行蓝/白筛选，其中使用引物：rpoD_有义_SacI：AACCTAGGAGCTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAGAGC(SEQ ID NO：5)和rpoD_反义_HindIII：TGGAAGCTTTAACGCCTGATCCGGCCTACCGATTAAT(SEQ ID NO：6)。使用GenemorphII随机诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)以及多种浓度的初始模板对进行片段诱变，从而获得低、中和高突变率，如产品方案中所述。PCR后，使用Qiagen PCR回收试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)对这些片段进行纯化，用HindIII和SacI消化过夜，过夜连接入经消化的pHACM骨架中，并转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将细胞铺到LB琼脂平板上并刮下，以产生液体文库。白色菌落文库的总规模大约为10⁵～10⁶。

表型选择

将来自液体文库的样品置于攻击环境中从而选择存活的突变体。对乙醇耐性来说，将菌株置于含有50g/L乙醇的经过滤LB中。在37℃下在30×115mm加盖密闭的离心管中振荡培养。20小时后将菌株铺板，并选择个体菌落进行测试。对于乙酸盐/酯耐性来说，在含有浓度逐渐提高的乙酸盐/酯(起始浓度为20g/L并增加到30g/L)的M9基本培养基中将菌株连续传代培养两次。然后，将细胞铺在LB平板上，并选择若干菌落用于单菌落测定。对于对羟基苯甲酸(pHBA)耐性来说，将菌株培养在含有20g/LpHBA的M9基本培养基中，并在20小时后铺板以选择存活的细胞。回收来自所有鉴定为具有改进表型的菌株的质粒，并再次转化进新一批感受态细胞中。从每个平板选择若干菌落进行生物学再现，从而验证表型。序列分析

使用以下引物组合对突变体σ因子的序列进行测序：

S1：CCATATGCGGTGTGAAATACCGC(SEQ ID NO：7)，

S2：CACAGCTGAAACTTCTTGTCACCC(SEQ ID NO：8)，

S3：TTGTTGACCCGAACGCAGAAGA(SEQ ID NO：9)，

S4：AGAAACCGGCCTGACCATCG(SEQ ID NO：10)，

A1：GCTTCGATCTGACGGATACGTTCG(SEQ ID NO：11)，

A2：CAGGTTGCGTAGGTGGAGAACTTG(SEQ ID NO：12)，

A3：GTGACTGCGACCTTTCGCTTTG(SEQ ID NO：13)，

A4：CATCAGATCATCGGCATCCG(SEQ ID NO：14)，

A5：GCTTCGGCAGCATCTTCGT(SEQ ID NO：15)和

A6：CGGAAGCGATCACCTATCTGC(SEQ ID NO：16)。

使用Clustal W版本1.82对序列进行比对和比较。

实施例1：

在大肠杆菌中对主要σ因子(σ⁷⁰)进行定向进化，以寻找提高的耐性表型。选择所述主要σ因子的前提是，突变将改变启动子的偏好和转录速率，因此在全局水平调节转录组。对rpoD基因和天然启动子区进行易错PCR，并克隆入低拷贝表达载体中(图1)。首先构建包含近10⁵～10⁶个活力突变体的文库并转化入菌株中。

通过在高乙醇浓度、高乙酸盐/酯浓度和高对羟基苯甲酸(pHBA)浓度的极端条件下培养来选择所述文库。之所以选择这些条件是因为它们具有工业相关性：乙酸盐是大肠杆菌的副产物，其抑制细胞生长，然而预期可通过改造出乙醇耐性提高的菌株来加强生物乙醇生产，因此可能提高产率(L.O.Ingram等，BiotechnolBioeng 58，204-14(1998年4月5日))。另外，生产作为电涂层前体的pHBA具有相当大的工业意义，然而其对细胞毒性极大(T.K.Van Dyk，L.J.Templeton，K.A.Cantera，P.L.Sharpe，F.S.Sariaslani，J Bacteriol 186，7196-204(2004年11月)；J.L.Barker，J.W.Frost，Biotechnol Bioeng 76，376-90(2001年12月))。已通过随机细胞诱变、基因互补和敲除研究以及微阵列分析的传统方法对这些耐性表型中的每一种进行了研究(R.T.Gill，S.Wildt，Y.T.Yang，S.Ziesman，GStephanopoulos，Proc Natl Acad Sci USA 99，7033-8(2002年5月14日))，至今仅取得有限的成功。

乙醇耐性

首先，基于LB复合培养基中存在高浓度乙醇时的生长能力来选择σ因子突变体文库(L.P.Yomano，S.W.York，L.O.Ingram，J Ind MicrobiolBiotechnol 20，132-8(1998年2月))。对于该选择来说，在50g/L乙醇中将菌株连续过夜传代培养两次，然后涂板以选择耐性突变体。选择并测定了总共20个生长在不同乙醇浓度中的菌落。在分离并验证改进菌株后，将最优的突变体σ因子进行连续的多轮进化。连续两次反复后，选择浓度提高到70和80g/L乙醇。在这些富集实验中，由于使用强选择压力，细胞在孵育4小时和8小时后涂板。从每轮分离的突变体显示出多种乙醇浓度中整体生长的提高(图2A)。

图2B鉴定了从每轮诱变中分离的最优突变体的序列。图2D提供了乙醇耐性σ因子的序列对比。令人感兴趣地，第二轮诱变导致形成截短的因子，其明显有利于增加整体的乙醇适应性。该截短来自于限制酶消化的人工产物，并包含所述蛋白质中区域3的一部分和完整的区域4。区域4负责结合启动子区，先前已表明与全长蛋白质相比，截短形式提高结合亲合力(U.K.Sharma，S.Ravishankar，R.K.Shandil，P.V.K.Praveen，T.S.Balganesh，J.Bacteriol.181，5855-5859(1999))。因此，该截短突变体可能通过结合优选的启动子区并阻止转录来作为特异性强转录抑制剂，因为其余的σ因子机器已被去除。在截短形式的第二轮突变体中，第一轮的I511V突变回复成异亮氨酸，仅剩下一个突变。

将所述截短形式进行第三轮诱变和选择，以获得包含另外8种突变的因子。在这最后一轮中，前两轮中发现的R603C突变回复成原始残基，并且发生了许多新的突变，仅剩截短作为第二轮和第三轮之间仅有的可见相似性。这些轮诱变以及所得序列提示与定向进化的蛋白质相比存在差异。在后一种情况中，提高蛋白质功能的突变在自然界通常是加成的。另一方面，改变转录机器的突变没有必要是加成的，因为这些因子发挥转录组中间渠道(conduit)的作用。在这方面，由于存在可导致改进表型的多种基因变化亚组，序列空间中可能存在许多局部最大值(maxima)。

所有包含突变体σ因子的分离菌株均在提高的乙醇浓度下表现出与对照相比提高的生长速率。另外，不存在乙醇时突变菌株的生长表型不受影响(表1)。

表1：乙醇耐性σ因子的定向进化。对于三轮定向进化，对逐渐增加的乙醇浓度显示了倍增时间减少倍数的改进。第二轮和第三轮中的突变体在高浓度乙醇下显示生长速率显著增加。在所有定向进化轮次中，观察到了可持续细胞最高浓度的持续提高。

第二轮中分离的截短突变体在高乙醇浓度下表现出增加的生长速率；然而，与第一轮突变体相比，在低乙醇浓度下其生长速率降低。从第三轮分离的突变体在20～50g/L乙醇中表现出恢复的生长速率，类似于第一轮的生长速率。最重要的是，每一后续轮次均提高了最高乙醇浓度，在该浓度下细胞能够维持生长超过8小时，而不死于乙醇的毒性，也没有伴随细胞密度的下降。通过本方法获得的显著提高的乙醇耐性通过(图2C)所示的第三轮菌株生长曲线以及野生型对照的生长曲线来举例说明。σ因子改造(sigma factor engineering，SFE)能够提高乙醇耐性至超过使用更传统方法的先前文献所报道的水平。另外，举例说明了应用反复多轮SFE能够进一步改进细胞表型。

乙酸盐/酯和pHBA耐性

作为另一实例，在含有20g/L和其后为30g/L乙酸盐的M9-基本培养基中将原始的σ因子突变体文库连续传代培养两次。从该混合物中分离单菌落，再次转化以排除任何基于染色体的生长适应，并测定在不同乙酸盐浓度下的生长。所分离的菌株显示在高水平乙酸盐存在的耐性显著提高。另外，在不存在乙酸盐时，生长速率仍不受显著影响(表2)。在30g/L乙酸盐中，所分离菌株的倍增时间为10.5-12.5小时，约为严重受抑制对照的倍增时间的1/5(56小时倍增时间)。

表2：应用转录机器改造得到其它表型。分离在升高的乙酸盐水平或高水平pHBA存在下表现出耐性增加的突变体。在升高的化学品水平下观察到耐性的提高，然而，不存在这些化学品时未观察到生长速率或产率的不利影响。

图3总结了通过按照所分离σ因子中引发细胞乙酸盐耐性提高的区域进行分类的多种突变。图3B提供了乙酸盐耐性σ因子的序列对比。5个分离突变体中仅有一个是截短的。在两个乙酸盐突变体中出现M567V突变，并且大多数突变似乎分布在σ因子的功能结构域中。很有意思地注意到，即使菌株具有相似的耐性谱，其内在突变也可能不同，这提示存在影响转录谱的不同分子机制。

作为另一实例，在20g/L pHBA存在下培养突变体文库，以在高pHBA浓度下的生长和生存力方面选择对该化合物耐性提高的菌株。分离了一个与对照相比在13小时生长量显著提高并且在pHBA不存在时基本不改变生长表型的菌株(表2)。突变体HBA1显示为截短形式的σ因子，其总共具有6个突变(图3A)，其中6个残基中的4个变为缬氨酸。图3C提供了pHBA耐性σ因子的序列对比。

这些实施例举例说明了σ因子改造用于引入全局转录组改变的潜力，所述改变使生物获得新的细胞表型。最近，我们已成功地将全局转录机器改造的概念超越耐性表型，而延伸至选择代谢物过度产生速率增加的突变体(见下文)。另外，已使用包含真核转录机器组分的其它宿主系统对这一概念进行了探索。在每一个这些实例中，通过随机突变在转录调节机器的组分中引起的全局变化已显示改进了细胞表型，其改进水平超过了通过推理性改造或通过随机诱变进行的传统菌株改进所得到的水平。

我们第一次证明了应用定向进化来改变全局转录机器。与典型的连续逐个基因策略相反，本策略允许同时定向修饰多个基因的遗传控制。另外，我们发现定向进化的范例是可以应用的，因为它能够通过深入探测转录因子改造的巨大序列空间而依次进行表型改进。因此，现在有可能解密多基因调节的复杂表型，这是非常不可能通过相对低效的反复搜索策略而实现的。

值得注意的是，所述方法还可以反过来应用于揭示基因型与表型之间复杂的相互作用。在这些应用中，人们将使用许多高通量的细胞和分子测定来评估改造细胞的状态，并最终推导出这些突变体中隐藏在所观察表型下的系统作用机理。本文所述对全局转录机器进行定向进化的应用是用于鉴定遗传靶标、引发期望的表型和实现全细胞改造目标的范式转换(paradigm shifting)方法。

实施例2：

有机溶剂耐性

全局转录机器改造的应用已延伸至包括另外的耐性表型。细菌菌株对有机溶剂的耐性可用于以下几种情况中：(1)有害废物的生物除污，(2)从细菌中生物产生有机溶剂，以及(3)需要两相反应器的生物处理应用(即提取发酵物以连续除去疏水产物的操作)。为了研究在大肠杆菌中提高溶剂耐性的潜力，培养原始的rpoD(σ⁷⁰)突变体文库，在指数期收获并转移至含有LB培养基和己烷(10％体积/体积)的两相系统中。在己烷存在下培养18小时后分离菌株。将这些个体菌落再次培养至指数期，然后在己烷存在下进行培养。17小时后测量细胞密度。包含己烷的培养物的细胞密度显示于图4。图4所示菌株为在生物学副本中再次转化的菌株。所有所选菌株细胞密度的增加均超过包含未突变rpoD基因的对照菌株。另外，PCR分析表明，突变株Hex-3、Hex-8、Hex-11、Hex-12、Hex-13、Hex-17和Hex-19具有完整形式的σ因子，而菌株Hex-2、Hex-6、Hex-9、Hex-10和Hex-18具有截短的形式。图4还显示两个最佳性能突变体(Hex-12和Hex-18)的序列(突变的位置)。

另外，测试这些菌株在环己烷存在下的生长，已知与己烷相比，环己烷是对微生物毒性更高的有机溶剂。图5显示来自环己烷培养物的细胞密度。从己烷选择中分离的几个菌株也显示了超过对照的细胞密度提高。

实施例3：

抗生素抗性

全局转录机器改造的应用已延伸至包括抗生素抗性。微生物中的抗生素抗性已变为重要的问题，这迫使卫生保健和药物公司寻找对抗感染的替代方法。已知许多抗性菌株包含编码抗性的特定基因。然而，在微生物能够进化出这样的基因之前，它们必须首先获得最初的抗性，以努力在于抗生素存在下持续。尽管在基因组中发生随机突变是一种备选方案，但细胞还可以应答于这些抗生素而改变其基因表达。测试了全局转录机器改造用于鉴定获得抗生素抗性菌株可能性的用途。该表型最终将受到经改造的转录组表达的控制，所述改变的表达由突变体转录机器来介导。对这些菌株基因表达的分析可鉴定控制菌株抗性的新的基因靶标和酶。然后，这些靶标可导致开发出抑制或增强所鉴定酶活性的小分子药物。通过在250μg/ml萘啶酸、喹诺酮(与环丙沙星为同一药物家族)存在下培养突变体σ因子文库来测试抗生素抗性，所述浓度超过了约为80μg/ml的对照最低抑制浓度。图6显示逐渐提高的萘啶酸浓度下多种分离菌株的细胞密度(OD600)。几种分离菌株表现出高浓度萘啶酸存在下的显著生长。在将质粒转化入新的宿主菌株后测试这些菌株，以进行验证。另外，将这些突变体测序；PCR分析表明突变株NdA-7和NdA-15是全长σ因子，而NdA-10、NdA-11、NdA-12和NdA-13为截短形式。

实施例4：

代谢物过量产生的表型

全局转录机器改造的基本意义是产生多重和同时的基因表达改变的能力。该方法先前已成功用于鉴定耐性表型提高的突变体。在随后的这些实施例中，对主要σ因子(由rpoD编码)突变体文库检查其增强代谢物过量产生表型至超越单遗传修饰所实现水平的能力。

番茄红素的产生

我们先前已鉴定了许多单基因及多基因敲除靶标，其在预先改造菌株的背景中表现出番茄红素产生的提高(Alper等，Nat Biotechnol 2005和Alper等，Metab Eng 2005)。在本研究中，我们设法应用全局转录机器改造技术来增强番茄红素的产生。应用若干先前改造的可用菌株背景和亲本菌株，有可能独立地在每个背景中搜寻导致番茄红素产生提高的突变体因子。对于本研究而言，选择了亲本菌株Δhnr以及两个经鉴定的全局最大菌株(global maximum strain)ΔgdhAΔaceEΔfdhF和ΔgdhAΔaceEΔpyjiD。然后，将来自四个被测遗传背景中每一个的最优突变体进行交换，以研究将4种菌株与4种已鉴定σ因子混合所产生的情况。

鉴定突变体σ因子

将突变体σ因子文库转化入四种菌株中的每一种，并基于在补充有5g/L葡萄糖的基本培养基平板上的番茄红素产生来进行选择。然后，使用M9培养基培养所选菌株并测定番茄红素在15和24小时时的产量。图7A-7D展示了这些搜索的结果以及来自最优菌株的σ因子突变体序列。标出了带有或不带有对照质粒的菌株的番茄红素产生。对于某些背景来说，这种对照质粒导致番茄红素产生大大下降，超过缺乏该质粒的菌株。值得注意的是，所有这些经鉴定的因子都是截短的。另外，来自hnr敲除背景的经鉴定突变体仅简单地为截短形式，不包含突变。由于所推测的该截短物作用模式，有可能该突变体因子显著抑制在rpoD控制下表达的所有正常基因。在hnr突变体中，稳态水平较高的稳定期σ因子(σ^S)可接手其余的转录。另外，在该背景中第二高的突变体得到包含若干突变的全长σ因子。

菌株与所鉴定突变体因子的组合

然后，将具有不同遗传背景的4种菌株与4种独立鉴定的突变体σ因子组合，以检查所得的16种菌株的情况。首先值得注意的是，图7A-7D中对给定遗传背景进行测序的所有已鉴定突变体均不与另一遗传背景中鉴定的突变体重叠。因此，最初推测情况将是对角优势，表明突变体因子引发的影响对遗传背景具有特异性。将这16种菌株以及对照培养在2×M9培养基中并分段添加葡萄糖。测定在15、24、39和48小时时间点的番茄红素水平。图8显示描述在发酵期间实现的番茄红素产生与对照相比的最大提高倍数的点图。圆的大小与提高倍数成比例。与推测一致，该模式为明显的对角优势，其中突变体因子主要在鉴定它们的菌株背景中发挥作用。

图9举例说明15小时后几个目的菌株的番茄红素含量。在亲本菌株和hnr敲除中均进行的单轮诱变能够得到与预先通过引入3个不同基因敲除而改造的菌株类似的结果。然而，在这些背景中，引入另外的突变体σ因子能够进一步提高番茄红素水平。

这些结果表明，(1)全局转录机器改造(global transcriptionmachinary engineering，gTME)能够引发代谢表型，更重要的是(2)使用gTME进行单轮选择比单个敲除或过表达修饰更有效。另外，所鉴定的突变体通常不会在菌株背景之间转移，这提示在每个菌株中可能存在不同的番茄红素产生方式。作为这些模式的实例，野生型菌株中的最大差异倍数在仅仅15小时后就得以实现，然后与对照菌株在发酵结束之前逐渐接近。反言之，对于逐渐提高的时间点，ΔgdhAΔaceEΔPyjiD菌株中突变体因子的番茄红素含量与对照相比逐渐增加。尽管如此，最高的番茄红素产生来自在预先改造菌株背景中使用gTME，这表明如果只进行一轮选择，则从优化菌株开始是比较好的。然而，乙醇耐性的结果提示，有可能通过应用定向进化来实现连续的适合性改进，表明有可能进一步增加番茄红素的产量。

聚羟基丁酸酯(PHB)的生物生产

全局转录机器改造的应用已延伸至包括代谢物过量生产的其他实例。使用转录机器改造研究了另一代谢表型(除产生番茄红素外)——聚羟基丁酸酯(PHB)的生物生产。PHB从乙酰辅酶A前体分子产生。

材料/方法

在37℃下，在含有20g/L葡萄糖和25μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中培养转化了经修饰的pJOE7质粒(Lawrence，A.G，J.Choi，C.Rha，J.Stubbe，和A.J.Sinskey.2005.Biomacromolecules6：2113-2119)的大肠杆菌(XL-1 Blue，Stratagene，La Jolla，Calif.)。经修饰的pJOE7由Anthony Sinskey博士(MIT，Cambridge，MA)惠赠，其包含来自板口线虫(C.necator)的phaAB和来自Allochromatium vinosum的phEC，并编码卡那霉素抗性。作为无PHB的对照，还培养了不含pha基因的同一质粒。使用Ultraspec 2100 pro(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)使用吸光度追踪细胞生长。

染色和流式细胞术

除非另有注明，通过溶解至1mg/mL二甲基亚砜中来配制尼罗红(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)原液。如染色优化中所指出的，将3μL母液加至1mL染色缓冲液中。利用FACScan(Becton Dickinson，MountainView，CA)进行流式细胞术，使用如下设置：集胞蓝细菌(Synechocystis)FSC＝E00，SSC＝411，FL-1＝582，FL-2＝551以及大肠杆菌FSC＝E00，SSC＝411，FL-1＝582，FL-2＝535。用风冷式氩离子激光器(488nm)激发细胞，使用FL-2(585nm)检测尼罗红荧光。使用WinMDI 2.8对50,000个细胞进行流式细胞术分析。

染色效率通过分辨率Rs(Eq.1)来表征，其中M_n是n的荧光分布的几何平均值(n＝1为产生PHB的细胞，n＝2是非PHB对照)。δ_n是荧光分布的标准差。Rs是区分两个种群能力的定量量度。

R_{S} = \frac{2 (M_{1} - M_{2})}{δ_{1} + δ_{2}} . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)

通过最终染色样品中cfu与培养基中细胞的比率来评估细胞生存力。

化学PHB分析

如前所示分析PHB(Taroncher-Oldenburg，G.和G.Stephanopoulos.2000.Applied Microbiology and Biotechnology 54：677-680)。通过离心(10分钟，3,200×g)从培养物中收集＞10mg的细胞。用冷的去离子水洗涤所得沉淀一次，并在80℃干燥过夜。将干燥的沉淀在1ml浓H₂SO₄中煮沸60分钟，用4ml的0.014M H₂SO₄进行稀释。离心样品(15分钟，18,000×g)以除去细胞碎片，使用Aminex HPX-87H离子排斥柱(300×7.8mm；Bio-Rad，Hercules，Calif.)利用HPLC分析液体(Karr，D.B.，J.K.Waters，和D.W.Emerich.1983.Applied and Environmental Microbiology46：1339-1344)。使用与样品进行平行处理的市售PHB(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)作为标准品。

大肠杆菌染色优化

如前述培养包含经修饰的pJOE的大肠杆菌XL1-blue和无PHB对照。

刺激(shock)优化：将培养物培养至稳定期。在刺激后测试多种不同透化方法的分辨率和生存力。如前所述(Vazquez-Laslop，N.，H.Lee，R.Hu和A.A.Neyfakh.2001.J.Bacteriol.183.2399-2404)进行蔗糖刺激。将1mL细胞冷却至4℃10分钟。然后将细胞离心(3分钟，3000×g，4℃)并在1mL冰冷的TSE缓冲液(10mM Tris-Cl[pH＝7.5]，20％蔗糖，2.5mMNa-EDTA)中重悬。细胞在冰上孵育10分钟，然后用包含3μL尼罗红原液的1mL去离子水重悬(3分钟，3000×g，4℃)。细胞在黑暗中染色30分钟，并利用FACScan进行分析。将异丙醇刺激的细胞离心(3分钟，3000×g)并重悬在70％异丙醇中15分钟。然后，离心细胞(3分钟，3000×g)并重悬于包含3μL尼罗红原液的去离子水中。细胞在黑暗中孵育30分钟并利用FACScan进行分析。通过离心(3分钟，3000×g)1mL细胞培养物进行DMSO刺激。将50μL尼罗红原液直接添加至沉淀。迅速将沉淀涡旋并在孵育30s后稀释在1mL水中。在黑暗中孵育细胞30分钟并利用FACScan进行分析。像感受态细胞制备(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press)中那样进行热激。将1mL细胞冷却10分钟。然后，离心细胞(3分钟，3000×g，4℃)，并重悬在1mL冷的80mM MgCl₂/20mM CaCl₂中。离心细胞(3分钟，3000×g，4℃)并重悬在包含3μL尼罗红原液的1mL 0.1M CaCl₂中。在42℃热激细胞90秒。在黑暗中孵育细胞30分钟然后利用FACScan进行分析。

浓度优化：通过使用3μL不同的尼罗红溶液至终浓度为30-30,000ng/mL进行蔗糖刺激来制备细胞。

蔗糖浓度优化：通过使用具有不同蔗糖浓度(0、5、10、15、20％)的TSE缓冲液的蔗糖刺激来制备细胞。

如上所述，将突变体σ因子文库引入大肠杆菌。在葡萄糖基本培养基中选择指数期PHB增加的菌株。另外，还测试使用转座子诱变产生的随机敲除文库，以比较转录机器改造与传统菌株改进方法的效率。图10A显示使用σ因子改造获得的多种菌株的数据(红色和黄色柱代表对照)。作为比较，图10B显示从随机敲除文库中选择的菌株的结果。使用σ因子改造获得的几个突变体产生了接近25％dcw(dry cell weight，细胞干重)的PHB。在一轮σ因子改造中获得的最优菌株比使用随机敲除获得的最优菌株要优秀得多。如上述在所述最优突变体背景下进行第二轮诱变从而得到进一步改进的PHB表型。

实施例5：

文库的多样性和构建

以一种或多种以下方式提高σ因子文库的大小和宽度。

(1)所述文库不仅包括大肠杆菌的主要σ因子(σ⁷⁰，由rpoD编码)，还包括一种或多种替代形式，例如rpoS、rpoF、rpoH、rpoN、rpoE和/或fecI。

有可能通过同时引入转录机器单元的多种突变体形式来进一步改进表型并寻找最优菌株。使用例如共表达两个或更多这些基因的表达盒来表达突变的σ因子基因(或其它全局转录机器)。所述两个或更多基因可以是两种或更多相同类型的转录机器(例如rpoD的两种形式)，或者可以是两种或更多不同的转录机器(例如rpoD和rpoS)。

同样地，超过一种不同的全局转录机器突变体形式可能对表型的适当优化有利。例如，可共表达多种突变的σ70(rpoD)。

(2)除了通过如上述的易错PCR引入随机突变以外，所述文库包括从C端和N端所有可能的截短及其组合。

(3)另外，所述文库包括多个σ因子区的替代嵌合体，其通过人工融合这些区域得到。例如，使用σ因子70的区域1替换σ因子38的区域1。通过使用DNA改组产生多样性的类似方法是本领域公知的(例如，W.Stemmer等的基因改组专利，转让给Maxygen；参见maxygen.com/science-patents的列表)。

(4)文库中包括来自其它细菌与上文对大肠杆菌σ因子70所述构型(例如随机突变、截短、嵌合体、改组)相同的σ因子。这些因子可具有独特的DNA结合特性并可有助于产生多种转录组改变。

实施例6：

真核细胞中的全局转录机器改造

对酵母和哺乳动物系统(例如CHO、HeLa、Hek细胞系)应用全局转录机器的定向进化，以在诱导条件下增强重组蛋白质的产生和产生凋亡抗性。

对编码全局转录机器(例如TFIID)的基因进行易错PCR、截短和/或DNA改组，从而得到全局转录机器突变体的多样性文库。将所述文库引入酵母或哺乳动物细胞中，并在一个实验中检测细胞产生的重组蛋白。这些实验中优选易于测定的蛋白质，如SEAP或荧光蛋白(例如GFP)。对于荧光蛋白的情况，可使用激发荧光细胞分选仪选择细胞，或者如果在多孔平板中培养，则可使用荧光平板读数器测定蛋白质产生的增强。

在另一个实验中，在酵母或哺乳动物细胞中检测抗凋亡表型。

实施例7：

SDS耐性

将全局转录机器的定向进化应用于细胞对十二烷基硫酸钠(SDS)的耐性这一问题。

将突变体rpoD文库转化入大肠杆菌DH5α中，然后将其在包含量逐渐增加的SDS(5重量％，然后15重量％SDS)的LB培养基中传代培养。在菌株中对在SDS中耐性的提高进行选择。选择菌株SDS-2并再次转化以验证其表型。然后在5-20重量％SDS中测试菌株SDS-2。发现该突变体在升高的SDS水平下生长增加，不存在SDS时对生长没有任何不利影响。图11显示在逐渐提高的SDS浓度下，SDS耐性σ因子突变体分离菌株培养物的细胞密度，以及来自最优菌株的σ因子突变体的序列。

实施例8：

改造出多种表型

将全局转录机器改造用于在大肠杆菌中传递多耐性表型的问题。为了同时获得乙醇和SDS耐性，在一个实验中，遵循三种替代策略分离菌株：(i)在用乙醇和SDS中均进行处理/选择后分离突变体，(ii)首先分离具有乙醇耐性的突变体，然后使用乙醇/SDS混合物进行另一轮诱变和选择，以及(iii)首先分离具有SDS耐性的突变体，然后使用乙醇/SDS混合物进行另一轮诱变和选择。测试这些菌株在多种乙醇和SDS浓度存在下的生长，从而获得生长曲线并评估这些方案的有效性。使用在上述其它实施例中所述的方案进行实验。

在另一组实验中，从乙醇耐性菌株中分离突变体σ因子，并与分离自SDS耐性菌株的突变体σ因子共表达。使用在上述其它实施例中所述的方案进行实验。

实施例9：

将全局转录机器改造(gTME)扩展至酵母系统

在任何类型的细胞系统中，一组蛋白质负责协调全局的基因表达。这样，这些蛋白质提供多种转录组修饰的进入点，所述修饰广泛地影响高等生物的表型。本实施例展示将gTME应用于酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))真核模型系统中。与原核系统的转录机器完全不同的是，就与启动子特异性的调节相关的组分和因子数而言，真核转录机器更为复杂。首先，在真核系统中存在具有不同功能的3种RNA聚合酶，而原核生物中仅存在一种。另外，这种复杂性的实例可通过划分为通用转录因子或RNA聚合酶II系统共激活子的近75种组分来示例(Hahn，Nat Struct Mol Biol，11(5)，394-403，2004)。通用因子TFIID的组分包括TATA结合蛋白(Spt15)和14种另外的相关因子(TAF)，并被认为是调节启动子特异性的主要DNA结合蛋白(Hahn，2004)。而且，已显示TATA结合蛋白突变体改变3种聚合酶的偏好性，提示其在组织酵母整体转录中的关键作用(Schultz，Reeder，& Hahn，Cell，69(4)，697-702，1992)。本研究着眼于两种主要的转录蛋白：TATA结合蛋白(Spt15)和TAF(TAF25)。

TATA结合蛋白的晶体结构是已有的，并清楚地显示出与DNA直接结合的蛋白质部分以及与TAF和聚合酶部分发生蛋白质结合的其他部分(Bewley，Gronenborn，& Clore，Annu Rev Biophys Biomol Struct，27，105-131，1998；Chasman等，Proc Natl Acad Sci USA，90(17)，8174-8178，1993；J.L.Kim，Nikolov，& Burley，Nature，365(6446)，520-527，1993)。所述结构由与DNA相互作用的两个重复区和与蛋白质相互作用的两个螺旋组成。测定和突变分析提示，TATA结合蛋白在启动子特异性和全局转录中发挥重要作用。另外，已经提出了DNA接触点和蛋白质相互作用点的重要残基(Arndt等，Mol Cell Biol，12(5)，2372-2382，1992；J.Kim & Iyer，Mol Cell Biol，24(18)，8104-8112，2004；Kou等，MoI Cell Biol，23(9)，3186-3201，2003；Schultz，Reeder，&Hahn，1992；Spencer & Arndt，MolCell Biol，22(24)，8744-8755，2002)。TAF家族蛋白也已得到不同程度的关注。使用序列对比并通过突变分析对本研究的对象TAF25蛋白进行分析，其显示出影响许多基因的转录(Kirchner等，Mol Cell Biol，21(19)，6668-6680，2001)。发现该蛋白质包含一系列对蛋白质相互作用至关重要的螺旋和接头。使用gTME方法研究这些蛋白质已产生3种目的表型：(1)对模型渗透胁迫的LiCl耐性，(2)高葡萄糖耐性，和(3)对高乙醇和高葡萄糖均具耐性。

方法

本研究中使用的酿酒酵母菌株BY4741(MATa；his3Δl；leu2Δ0；metl5Δ0；ura3Δ0)得自EUROSCARF，Frankfurt，Germany。其在YPD培养基(10g酵母提取物/升，20g Bacto蛋白胨/升以及20g葡萄糖/升)中培养。对于酵母转化，使用Frozen-EZ酵母转化II(ZYMORESEARCH)。为了选择和培养带有以URA3作为选择标记的质粒的酵母转化体，使用包含6.7g酵母氮源(Difco)/升、20g葡萄糖/升和适当的核苷酸和氨基酸混合物(CSM-URA，Qbiogene)的酵母合成完全(YSC)培养基(本文中称为YSC Ura^-)。对于固体培养基，在该培养基中补充1.5％琼脂。

产生文库并将其克隆至TEF-mut2启动子之后，所述TEF-mut2启动子先前作为酵母启动子文库的一部分产生(Alper等，Proc NatlAcadSciUSA，102(36)，12678-12683，2005)。使用以下引物从基因组DNA中克隆Taf25基因：TAF25_有义：TCGAGTGCTAGCAAAATGGATTTTGAGGAAGATTACGAT(SEQID NO：28)和TAF25_反义：CTAGCGGTCGACCTAACGATAAAAGTCTGGGCGACCT(SEQID：29)。使用以下引物从基因组DNA中克隆Spt15基因：SPT15_有义：TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG(SEQ ID NO：30)和SPT15_反义：CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA(SEQ ID NO：31)。使用GeneMorph II诱变试剂盒突变基因，并使用NheI和SalI消化产物并连接到用XbaI和SalI消化的质粒骨架中。将质粒转化入大肠杆菌DH5α中，使用质粒MiniPrep Spin试剂盒分离并转化入酵母中。使用以下引物对质粒进行测序：Seq_正向：TCACTCAGTAGAACGGGAGC(SEQ ID NO：32)和Seq_反向：AATAGGGACCTAGACTTCAG(SEQ ID NO：33)。

通过在200至400mM LiCl、200至300g/L葡萄糖以及适当时5％乙醇/100g/L葡萄糖至6％乙醇/120g/L葡萄糖中连续传代培养来分离菌株。通过涂在选择培养基平板上来分离细胞并测定性能。分离质粒并再次转化，以验证生物学复本的表型。

LiCl耐性

渗透胁迫应答和耐性是细胞中复杂的多效应答。对于酵母来说，已经显示提高的LiCl浓度(浓度约为100mM)可诱导渗透胁迫(Haro，Garciadeblas，& Rodriguez-Navarro，FEBS Lett，291(2)，189-191，1991；Lee，Van Montagu，& Verbruggen，Proc Natl Acad Sci USA，96(10)，5873-5877，1999；Park等，Nat Biotechnol，21(10)，1208-1214，2003)。将携带突变体形式TBP或TAF25的酵母细胞文库在200～400mM LiCl中连续传代培养。分离菌株并再次转化，以验证表型是突变体因子的结果。令人感兴趣的是，来自每个文库的最优菌株显示针对LiCl的不同改进。在较低LiCl浓度时TAF25优于各自的TAF25未突变对照，而在浓度高于约200mM时没有效果。相反，在150～400mM升高水平下，SPT15突变体能够优于对照。在每种情况下，无LiCl时的生长表型均不受突变体因子存在的影响。图12提供了生长量改善的总结。序列分析(图13)表明，LiCl耐性的改进受每个蛋白质中单个突变的控制，SPT15突变发生在非保守区。

高葡萄糖耐性

已经研究了高葡萄糖浓度发酵，用于从酵母批量培养物中提高乙醇产生。然而，这些“极高重力发酵”常对细胞生长具有相当的抑制作用，并通常通过改变培养基组成来处理，而非改变细胞(Bafrncová等，Biotechnology Letters，21(4)，337-341，1999；Bai等，J Biotechnol，110(3)，287-293，2004；Thatipamala，Rohani，& Hill，Biotechnology andBioengineering，40(2)，289-297，1992)。为了使用gTME研究这一问题，将携带突变体形式TBP或TAF25的酵母细胞文库在200至400g/L葡萄糖中连续传代培养。分离菌株并再次转化，以验证所述表型是突变体因子的结果。菌株在培养16小时之后显示细胞密度提高2至2.5倍。与LiCl的情形不同，TAF25和SPT15蛋白均对升高的葡萄糖显示类似的应答，超过对照的最大改进发生在150至250g/L之间。然而，SPT15突变体表现出超过TAF25的更大改进。图14显示这些突变体的生长改进，图15显示其序列。在该情形中，两种蛋白质均仅具有单个突变，然而分离了几种SPT15蛋白的次优突变体，其中一些具有多达7个突变。本文显示的两个突变均位于已知的蛋白质接触区，尤其是TAF25蛋白中的I143残基(Schultz，Reeder，& Hahn，1992)。

乙醇和葡萄糖多重耐性

成功的酵母生物乙醇发酵需要对高葡萄糖和乙醇浓度均有耐性。为此，通过用升高的乙醇和葡萄糖水平(5％和100g/L)同时处理两种突变体文库来测试多重耐性表型。将分离的菌株再次转化，并在5和6％乙醇存在下在一系列葡萄糖浓度中进行测定。令人感兴趣的是，SPT15突变体在所有测试浓度下均优于对照，在一些浓度下改进高达13倍。这一改进大大地超过不能在6％乙醇存在下生长的TAF25突变体的整体改进。图16突出显示这些最优菌株的生长分析，图17提供其序列。通过引入突变体转录机器实现的改进大大地超过通过其它改进细胞表型的方法所获得的改进。另外，这些结果提高了使用酵母作为使用高重力发酵进行高乙醇产生的活来源的潜力。

本领域的技术人员仅使用常规实验就会认识到或者能够确定本发明具体实施方案的许多等价方案。这样的等价方案旨在包括于以下权利要求中。

本文公开的所有参考文献均通过参考整体引入本文。

序列表

<110>麻省理工学院

哈尔·S·阿尔珀

格里戈里·斯特凡诺普洛斯

<120>全局转录机器的改造

<130>M0656.70120WO00

<150>US 60/748315

<151>2005-12-07

<150>US 11/238096

<151>2005-09-28

<160>33

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物CM_有义_AgdI

<400>1

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<210>2

<211>32

<212>DNA

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<220>

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<400>2

cagaagccac tggagcacct caaaactgca gt 32

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<210>4

<211>53

<212>DNA

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<220>

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<400>4

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<210>5

<211>41

<212>DNA

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<220>

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aacctaggag ctctgattta acggcttaag tgccgaagag c 41

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物rpoD_反义_HindIII

<400>6

tggaagcttt aacgcctgat ccggcctacc gattaat 37

<210>7

<211>23

<212>DNA

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<220>

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<400>7

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<210>8

<211>24

<212>DNA

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<220>

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cacagctgaa acttcttgtc accc 24

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>测序引物S3

<400>9

ttgttgaccc gaacgcagaa ga 22

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>10

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<210>11

<211>24

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<400>11

gcttcgatct gacggatacg ttcg 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>测序引物A2

<400>12

caggttgcgt aggtggagaa cttg 24

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>测序引物A3

<400>13

gtgactgcga cctttcgctt tg 22

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>测序引物A4

<400>14

catcagatca tcggcatccg 20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>测序引物A5

<400>15

gcttcggcag catcttcgt 19

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>16

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<210>17

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<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>17

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Leu Met Leu Ala Glu Asn Thr Ala Asp Glu Asp Ala Ala Glu Ala Ala

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Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Asp Asp Asp Ser Ala Asp Asp

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Ser His Ala Thr Ala Gln Glu Glu Ile Leu Lys Leu Ser Glu Val Phe

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Ala Met Asn Lys Pro Trp Ser Glu Lys Leu His Asp Val Ser Glu Glu

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Arg Ile Ser Arg Gln Met Leu Gln Glu Met Gly Arg Glu Pro Thr Pro

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His Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg Glu Ala Lys Val Leu Arg

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<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>18

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Glu Gln Tyr Asp Arg Val Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Ser Asp Leu

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Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Asn Ala Glu Glu Asp Leu Ala Pro Thr

165 170 175

Ala Thr His Val Gly Ser Glu Leu Ser Gln Glu Asp Leu Asp Asp Asp

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Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Asp Asp Gly Ser Ala Asp Asp Asp

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Asn Ser Ile Asp Pro Glu Leu Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg

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Arg Val Met Met Asp Arg Val Arg Thr Gln Glu Arg Leu Val Met Lys

275 280 285

Leu Cys Val Glu Gln Cys Lys Met Pro Lys Lys Asn Phe Ile Thr Leu

290 295 300

Phe Thr Gly Asn Glu Thr Ser Asp Thr Trp Phe Asn Ala Ala Ile Ala

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Met Asn Lys Pro Trp Ser Glu Lys Leu His Asp Val Ser Glu Glu Val

325 330 335

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Thr Ile Glu Gln Val Lys Asp Ile Asn Arg Arg Met Ser Ile Gly Glu

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Ala Lys Ala Arg Arg Ala Lys Lys Glu Met Val Glu Ala Asn Leu Arg

370 375 380

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Glu Leu Ala Glu Arg Met Leu Met Pro Glu Asp Lys Ile Arg Lys Val

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Leu Lys Ile Ala Lys Glu Pro Ile Ser Met Glu Thr Pro Val Gly Asp

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530 535 540

Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg Glu Ala Lys Val Leu Arg Met

545 550 555 560

Arg Phe Gly Ile Asp Met Asn Thr Asp Tyr Thr Leu Glu Glu Val Gly

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Lys Gln Phe Asp Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ala Lys

580 585 590

Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser Cys Ser Glu Val Leu Arg Ser

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Phe Leu Asp Asp

610

<210>19

<211>107

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>19

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Ser Leu Arg Ala Ala Thr His Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg

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Ile Arg Gln Ile Glu Ala Lys Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser

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<210>20

<211>107

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>20

Met Glu Thr Pro Ile Gly Asp Asp Glu Asp Ser Leu Leu Gly Asp Phe

1 5 10 15

Ile Glu Asp Thr Thr Leu Glu Leu Pro Leu Asp Ser Ala Thr Thr Val

20 25 30

Ser Leu Arg Val Ala Thr His Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg

35 40 45

Val Ala Lys Val Leu Arg Met Arg Phe Gly Ile Asn Met Asn Thr Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Ile Arg Gln Ile Glu Ala Lys Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser

85 90 95

Arg Ser Gly Val Gln Arg Ser Phe Leu Asp Asp

100 105

<210>21

<211>107

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>21

Met Glu Thr Pro Ile Gly Asp Asp Glu Asp Ser His Leu Gly Asp Tyr

1 5 10 15

Ile Glu Asp Thr Thr Leu Glu Leu Pro Leu Asp Ser Ala Thr Thr Glu

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Ser Leu Arg Ala Ala Thr His Asp Val Leu Ala Gly Met Thr Ala Arg

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Glu Ala Lys Val Leu Arg Met Arg Phe Gly Ile Asp Val Asn Thr Asp

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Tyr Thr Leu Glu Glu Val Gly Lys Gln Phe Asp Val Thr Arg Glu Arg

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Ile Ser Gln Ile Glu Ala Lys Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser

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Arg Ser Glu Val Leu Arg Ser Phe Leu Asp Asp

100 105

<210>22

<211>612

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>22

Met Glu Gln Asn Pro Gln Ser Gln Leu Lys Leu Leu Val Thr Arg Gly

1 5 10 15

Lys Glu Gly Tyr Leu Thr Tyr Ala Glu Val Asn Asp His Leu Pro Glu

20 25 30

Asp Ile Val Asp Ser Asp Gln Ile Glu Asp Ile Ile Gln Met Ile Asn

35 40 45

Asp Met Gly Ile Gln Val Met Glu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Asp Leu

50 55 60

Met Leu Ala Glu Asn Thr Ala Asp Glu Asp Ala Ala Glu Ala Ala Ala

65 70 75 80

Gln Val Leu Ser Ser Val Glu Ser Gly Val Gly Arg Thr Thr Asp Pro

85 90 95

Val Arg Met Tyr Met Arg Glu Met Gly Thr Val Glu Leu Leu Thr Arg

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Glu Gly Glu Ile Asp Ile Ala Lys Arg Ile Glu Asp Gly Asn Asn Gln

115 120 125

Val Gln Cys Ser Val Ala Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Tyr Leu Leu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asp Arg Ala Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Ser Asp Met

145 150 155 160

Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Asn Ala Glu Glu Asp Leu Ala Pro Thr

165 170 175

Ala Thr His Val Gly Ser Glu Leu Ser Gln Glu Asp Leu Asp Asp Asp

180 185 190

Glu Asp Glu Asp Glu Val Asp Gly Asp Asp Asp Ser Ala Asp Asp Asp

195 200 205

Asn Ser Ile Asp Pro Glu Leu Ala Arg Glu Lys Phe Ala Glu Leu Arg

210 215 220

Ala Gln Tyr Val Val Thr Arg Asp Thr Ile Lys Ala Lys Gly Arg Ser

225 230 235 240

His Ala Thr Ala Gln Glu Glu Ile Leu Lys Leu Ser Glu Val Phe Lys

245 250 255

Gln Phe Arg Leu Val Pro Lys Gln Phe Asp Tyr Leu Val Asn Ser Met

260 265 270

Arg Val Met Met Asp His Val Arg Thr Gln Glu Arg Leu Ile Met Lys

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Leu Cys Val Glu Gln Cys Lys Met Pro Lys Lys Asn Phe Ile Thr Leu

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Met Asn Arg Pro Trp Ser Glu Lys Leu His Asp Val Ser Glu Glu Val

325 330 335

His Arg Ala Leu Gln Lys Leu Gln Gln Ile Glu Glu Glu Thr Gly Leu

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Thr Ile Glu Gln Val Lys Asp Ile Asn Arg Arg Met Ser Ile Gly Glu

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Ala Lys Ala Arg Arg Ala Lys Lys Glu Met Val Glu Ala Asn Leu Arg

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Leu Val Ile Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Thr Asn Arg Gly Leu Gln Phe

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Leu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Ile Gly Leu Met Lys Ala Val Asp

405 410 415

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Trp Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ser Ile Ala Asp Gln Ala Arg Thr

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Ile Arg Ile Pro Val His Met Ile Glu Thr Ile Asn Lys Leu Asn Arg

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Ile Ser Arg Gln Met Leu Gln Glu Met Gly Arg Glu Pro Thr Pro Glu

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Glu Leu Ala Glu Arg Met Leu Met Pro Glu Asp Lys Ile Arg Lys Val

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Leu Lys Ile Ala Lys Glu Pro Ile Ser Met Glu Thr Pro Ile Gly Asp

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Asp Glu Asp Ser His Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Thr Thr Leu Glu

515 520 525

Leu Pro Leu Asp Ser Ala Thr Thr Glu Ser Leu Arg Ala Ala Thr His

530 535 540

Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg Glu Ala Lys Val Leu Arg Met

545 550 555 560

Arg Phe Gly Ile Asp Met Asn Thr Asp Tyr Thr Leu Glu Glu Val Gly

565 570 575

Lys Gln Phe Asp Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ala Lys

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Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Glu Val Leu Arg Ser

595 600 605

Phe Leu Asp Asp

610

<210>23

<211>613

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>23

Met Asp Gln Asn Pro Gln Ser Gln Leu Lys Leu Leu Val Thr Arg Gly

1 5 10 15

Lys Glu Gln Gly Tyr Leu Thr Tyr Ala Glu Val Asn Asp His Leu Pro

20 25 30

Glu Asp Ile Val Asp Ser Asp Gln Ile Glu Asp Ile Ile Gln Met Ile

35 40 45

Asn Asp Met Gly Ile Gln Val Met Glu Glu Ala Pro Asp Ala Asp Asp

50 55 60

Leu Met Leu Ala Glu Asn Thr Ala Asp Glu Asp Ala Ala Glu Ala Val

65 70 75 80

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85 90 95

Pro Val Arg Met Tyr Met Arg Glu Met Gly Thr Val Glu Leu Leu Thr

100 105 110

Arg Glu Gly Glu Ile Asp Ile Ala Lys Arg Ile Glu Asp Gly Ile Asn

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Gln Val Gln Cys Ser Val Ala Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Tyr Leu

130 135 140

Leu Glu Gln Tyr Asp Arg Val Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Ser Asp

145 150 155 160

Leu Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Asn Ala Glu Glu Asp Leu Ala Pro

165 170 175

Thr Ala Thr His Val Gly Ser Glu Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asp Asp

180 185 190

Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Asp Asp Asp Ser Ala Asp Asp

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Arg Ala Gln Tyr Val Val Thr Arg Asp Thr Ile Lys Ala Lys Gly Arg

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Met Arg Val Met Met Asp Arg Val Arg Thr Gln Glu Arg Leu Ile Met

275 280 285

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Leu Phe Thr Gly Asn Glu Thr Ser Asp Thr Trp Phe Asn Ala Ala Ile

305 310 315 320

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405 410 415

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<210>24

<211>611

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>24

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Gln Phe Arg Leu Val Pro Lys Gln Phe Asp Tyr Leu Val Asn Ser Met

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Met Asn Lys Pro Trp Ser Glu Lys Leu His Asp Val Ser Glu Glu Val

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565 570 575

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Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Pro Glu Val Leu Arg Ser Phe

595 600 605

Leu Asp Asp

610

<210>25

<211>613

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>25

Met Glu Gln Asn Pro Gln Ser Gln Leu Lys Leu Leu Val Thr Arg Gly

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Leu Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Asn Ala Glu Glu Asp Leu Ala Pro

165 170 175

Thr Ala Thr His Val Gly Ser Glu Leu Ser Gln Glu Asp Leu Asp Asp

180 185 190

Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Asp Asp Asp Ser Ala Asp Asp

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Ser His Ala Thr Ala Gln Glu Glu Ile Leu Lys Leu Ser Glu Val Phe

245 250 255

Lys Gln Phe Arg Leu Val Pro Lys Gln Phe Asp Tyr Leu Val Asn Ser

260 265 270

Met Arg Val Met Met Asp Arg Val Arg Thr Gln Glu Arg Leu Ile Met

275 280 285

Lys Leu Cys Val Glu Gln Cys Lys Met Pro Lys Lys Asn Phe Ile Thr

290 295 300

Leu Phe Thr Gly Asn Glu Thr Ser Asp Thr Trp Phe Asn Ala Ala Ile

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610

<210>26

<211>107

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>26

Met Glu Thr Pro Ile Gly Asp Asp Glu Asp Pro His Leu Gly Asp Phe

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Ile Glu Asp Thr Thr Leu Glu Leu Pro Leu Val Ser Ala Thr Thr Val

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<210>27

<211>2062

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>27

tgatttaacg gcttaagtgc cgaagagcga tcgggaagcc cccgacagcc gcactgagag 60

gcagcggcaa atatataagt acgccctcgt aattatcgtt ggcggtaaac aaccgttgga 120

tttcagcgtt aacggctgaa ggacatcggg tcaatcgccc aacaccaacc tcatgaaata 180

agtgtggata ccgtcttatg gagcaaaacc cgcagtcaca gctgaaactt cttgtcaccc 240

gtggtaagga gcaaggctat ctgacctatg ccgaggtcaa tgaccatctg ccggaagata 300

tcgtcgattc agatcagatc gaagacatca tccaaatgat caacgacatg ggcattcagg 360

tgatggaaga agcaccggat gccgatgatc tgatgctggc tgaaaacacc gcggacgaag 420

atgctgccga agccgccgcg caggtgcttt ccagcgtgga atctgaaatc gggcgcacga 480

ctgacccggt acgcatgtac atgcgtgaaa tgggcaccgt tgaactgttg acccgcgaag 540

gcgaaattga catcgctaag cgtattgaag acgggatcaa ccaggttcaa tgctccgttg 600

ctgaatatcc ggaagcgatc acctatctgc tggaacagta cgatcgtgtt gaagcagaag 660

aagcgcgtct gtccgatctg atcaccggct ttgttgaccc gaacgcagaa gaagatctgg 720

cacctaccgc cactcacgtc ggttctgagc tttcccagga agatctggac gatgacgaag 780

atgaagacga agaagatggc gatgacgaca gcgccgatga tgacaacagc atcgacccgg 840

aactggctcg cgaaaaattt gcggaactac gcgctcagta cgttgtaacg cgtgacacca 900

tcaaagcgaa aggtcgcagt cacgctaccg ctcaggaaga gatcctgaaa ctgtctgaag 960

tattcaaaca gttccgcctg gtgccgaagc agtttgacta cctggtcaac agcatgcgcg 1020

tcatgatgga ccgcgttcgt acgcaagaac gtctgatcat gaagctctgc gttgagcagt 1080

gcaaaatgcc gaagaaaaac ttcattaccc tgtttaccgg caacgaaacc agcgatacct 1140

ggttcaacgc ggcaattgcg atgaacaagc cgtggtcgga aaaactgcac gatgtctctg 1200

aagaagtgca tcgcgccctg caaaaactgc agcagattga agaagaaacc ggcctgacca 1260

tcgagcaggt taaagatatc aaccgtcgta tgtccatcgg tgaagcgaaa gcccgccgtg 1320

cgaagaaaga gatggttgaa gcgaacttac gtctggttat ttctatcgct aagaaataca 1380

ccaaccgtgg cttgcagttc cttgacctga ttcaggaagg caacatcggt ctgatgaaag 1440

cggttgataa attcgaatac cgccgtggtt acaagttctc cacctacgca acctggtgga 1500

tccgtcaggc gatcacccgc tctatcgcgg atcaggcgcg caccatccgt attccggtgc 1560

atatgattga gaccatcaac aagctcaacc gtatttctcg ccagatgctg caagagatgg 1620

gccgtgaacc gacgccggaa gaactggctg aacgtatgct gatgccggaa gacaagatcc 1680

gcaaagtgct gaagatcgcc aaagagccaa tctccatgga aacgccgatc ggtgatgatg 1740

aagattcgca tctgggggat ttcatcgagg ataccaccct cgagctgccg ctggattctg 1800

cgaccaccga aagcctgcgt gcggcaacgc acgacgtgct ggctggcctg accgcgcgtg 1860

aagcaaaagt tctgcgtatg cgtttcggta tcgatatgaa caccgactac acgctggaag 1920

aagtgggtaa acagttcgac gttacccgcg aacgtatccg tcagatcgaa gcgaaggcgc 1980

tgcgcaaact gcgtcacccg agccgttctg aagtgctgcg tagcttcctg gacgattaat 2040

cggtaggccg gatcaggcgt ta 2062

<210>28

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物TAF25_有义

<400>28

tcgagtgcta gcaaaatgga ttttgaggaa gattacgat 39

<210>29

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物TAF25_反义

<400>29

ctagcggtcg acctaacgat aaaagtctgg gcgacct 37

<210>30

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物SPT15_有义

<400>30

tcgagtgcta gcaaaatggc cgatgaggaa cgtttaaagg 40

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物SPT15_反义

<400>31

ctagcggtcg actcacattt ttctaaattc acttagcaca 40

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物Seq_正向

<400>32

tcactcagta gaacgggagc 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物Seq_反向

<400>33

aatagggacc tagacttcag 20

Claims

1.用于改变细胞表型的方法，该方法包括：

突变编码全局转录机器的核酸并任选地突变其启动子，

在细胞中表达所述核酸，以提供包含突变的全局转录机器的改造细胞，以及

培养所述改造细胞。

2.权利要求1的方法，其还包括确定所述改造细胞的表型。

3.权利要求1的方法，其还包括重复突变所述核酸，以产生第n代改造细胞。

4.权利要求1的方法，其还包括确定所述第n代改造细胞的表型。

5.权利要求3的方法，其中所述重复突变全局转录机器的步骤包括从所述改造细胞中分离编码突变全局转录机器的核酸以及任选地其启动子、突变所述核酸以及将所述突变核酸引入另一细胞。

6.权利要求1的方法，其中所述细胞为原核细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述原核细胞是细菌细胞或古细菌细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述全局转录机器为σ因子或抗σ因子。

9.权利要求8的方法，其中编码σ因子的核酸为rpoD(σ⁷⁰)基因、rpoF(σ²⁸)基因、rpoS(σ³⁸)基因、rpoH(σ³²)基因、rpoN(σ⁵⁴)基因、rpoE(σ²⁴)基因和fecI(σ¹⁹)基因。

10.权利要求8的方法，其中所述σ因子或抗σ因子从表达载体中表达。

11.权利要求1的方法，其中所述细胞为真核细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞。

13.权利要求11的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。

14.权利要求11的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。

15.权利要求11的方法，其中所述真核细胞为昆虫细胞。

16.权利要求11的方法，其中所述真核细胞为干细胞。

17.权利要求11的方法，其中所述真核细胞为真菌细胞。

18.权利要求11-17中任一项的方法，其中所述真核细胞包含于多细胞生物中。

19.权利要求11的方法，其中所述核酸在细胞中由组织特异性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子表达。

20.权利要求11的方法，其中所述全局转录机器结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子。

21.权利要求20的方法，其中所述全局转录机器为TFIID或其亚基。

22.权利要求21的方法，其中所述亚基为TATA结合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)，如TAF25。

23.权利要求20的方法，其中编码所述全局转录机器的核酸为GAL11基因、SIN4基因、RGR1基因、HRS1基因、PAF1基因、MED2基因、SNF6基因、SNF2基因或SWI1基因。

24.权利要求20的方法，其中所述全局转录机器为核酸甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶或组蛋白脱乙酰基酶。

25.权利要求20或权利要求24的方法，其中所述全局转录机器从表达载体中表达。

26.权利要求11的方法，其中所述核酸为真核细胞细胞器的核酸。

27.权利要求26的方法，其中所述细胞器为线粒体或叶绿体。

28.权利要求1的方法，其中所述核酸为表达载体的一部分。

29.权利要求1的方法，其中所述核酸是核酸集合的成员。

30.权利要求29的方法，还包括将所述集合引入细胞中。

31.权利要求1的方法，其中表达所述核酸的步骤包括将所述核酸整合进基因组，或者替换编码内源全局转录机器的核酸。

32.权利要求1的方法，其中所述核酸的突变包括所述核酸的定向进化。

33.权利要求32的方法，其中所述定向进化包括通过易错PCR进行的突变。

34.权利要求32的方法，其中所述定向进化包括通过基因改组进行的突变。

35.权利要求1的方法，其中所述核酸的突变包括合成具有一个或多个突变的核酸。

36.权利要求1的方法，其中所述核酸突变是一种或多种点突变。

37.权利要求1的方法，其中所述核酸突变是一种或多种截短或缺失。

38.权利要求37的方法，其中所述一种或多种截短或缺失不破坏或除去所述全局转录机器的启动子结合区。

39.权利要求1的方法，其中所述突变的全局转录机器与未突变的全局转录机器相比表现出基因转录的提高。

40.权利要求1的方法，其中所述突变的全局转录机器与未突变的全局转录机器相比表现出基因转录的降低。

41.权利要求1的方法，其中所述突变的全局转录机器与未突变的全局转录机器相比表现出基因转录抑制的提高。

42.权利要求1的方法，其中所述突变的全局转录机器与未突变的全局转录机器相比表现出基因转录抑制的降低。

43.权利要求1的方法，其还包括对所述改造细胞选择预定的表型。

44.权利要求43的方法，其中所述选择步骤包括在选择条件下培养所述改造细胞。

45.权利要求43的方法，其中所述选择步骤包括高通量测定个体细胞的表型。

46.权利要求43的方法，其中所述表型为对有害培养条件的耐性提高。

47.权利要求46的方法，其中所述表型为溶剂耐性或有害废物耐性。

48.权利要求47的方法，其中所述溶剂为乙醇、己烷或环己烷。

49.权利要求46的方法，其中所述表型为对工业培养基的耐性。

50.权利要求46的方法，其中所述表型为对高糖浓度的耐性。

51.权利要求46的方法，其中所述表型为对高盐浓度或渗透胁迫的耐性。

52.权利要求46的方法，其中所述表型为对高温的耐性。

53.权利要求46的方法，其中所述表型为对极端pH的耐性。

54.权利要求46的方法，其中所述表型为对表面活性剂的耐性。

55.权利要求46的方法，其中所述表型为对多种有害条件的耐性，如对高糖及乙醇浓度的耐性。

56.权利要求43的方法，其中所述表型为代谢物产生的提高。

57.权利要求56的方法，其中所述代谢物为番茄红素或乙醇。

58.权利要求56的方法，其中所述代谢物为聚羟基丁酸酯(PHB)。

59.权利要求56的方法，其中所述代谢物为治疗性蛋白质。

60.权利要求59的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗体或抗体片段。

61.权利要求43的方法，其中所述表型为对有毒底物、代谢中间体或产物的耐性。

62.权利要求61的方法，其中所述有毒代谢物为有机溶剂。

63.权利要求62的方法，其中所述有毒代谢物为乙酸盐/酯或对羟基苯甲酸(pHBA)。

64.权利要求62的方法，其中所述有毒代谢物为过表达的蛋白质。

65.权利要求43的方法，其中所述表型为抗生素抗性。

66.权利要求43的方法，其中所述表型为对凋亡的抗性提高。

67.权利要求43-45中任一项的方法，其中所述细胞包含在多细胞生物中。

68.权利要求67的方法，其中所述表型为一种或多种生长特征、世代时间、对一种或多种害虫或疾病的抗性、果实或植物其它部分的产生、一种或多种发育变化、一种或多种寿命变化、功能的获得或丧失和/或健壮性的提高。

69.权利要求1的方法，其中该方法中使用的细胞在突变全局转录机器之前对表型进行优化。

70.权利要求1的方法，还包括鉴定所述改造细胞中基因表达的变化。

71.权利要求70的方法，其中所述基因表达的变化使用核酸微阵列来测定。

72.用于改变细胞表型的方法，该方法包括：

改变第一细胞中一种或多种基因产物的表达，所述基因产物通过在第二细胞中检测基因表达变化来鉴定，其中所述第二细胞中基因表达的变化通过诱变该第二细胞的全局转录机器而得到。

73.权利要求72的方法，其中改变第一细胞中一种或多种基因产物的表达包括提高一种或多种在第二细胞中提高的基因产物的表达。

74.权利要求73的方法，其中通过向第一细胞中引入表达所述一种或多种基因产物的一种或多种表达载体来提高所述一种或多种基因产物的表达。

75.权利要求73的方法，其中通过提高编码所述一种或多种基因产物的一种或多种内源基因的转录来提高所述一种或多种基因产物的表达。

76.权利要求75的方法，其中提高所述一种或多种内源基因的转录包括诱变所述一种或多种基因的转录控制序列。

77.权利要求72的方法，其中在第一细胞中改变所述一种或多种基因产物的表达包括降低在所述改造细胞中降低的一种或多种基因产物的表达。

78.权利要求77的方法，其中通过向第一细胞中引入降低所述一种或多种基因产物的表达的核酸分子来降低所述一种或多种基因产物的表达。

79.权利要求78的方法，其中所述核酸分子是siRNA分子，或者表达siRNA分子。

80.权利要求77的方法，其中通过突变编码所述一种或多种基因产物的一种或多种基因或者所述一种或多种基因的转录控制序列来降低所述一种或多种基因产物的表达。

81.权利要求72的方法，其中所述第二细胞中的基因表达的变化使用核酸微阵列来测定。

82.权利要求72的方法，其中所述第二细胞中基因表达的变化用于构建基因或蛋白质网络的模型，并且其中该模型用于选择改变所述网络中一种或多种基因产物中的哪一种。

83.权利要求1-82中任一项的方法，其中所述全局转录机器包含多于一种核酸和/或多肽，或者由多于一种核酸编码。

84.通过权利要求1-83中任一项的方法产生的细胞。

85.用于改变代谢物产生的方法，该方法包括：

根据权利要求1-83中的任一项突变产生选定代谢物的细胞的全局转录机器，以得到改造细胞，以及

分离所选代谢物产生量提高或降低的改造细胞。

86.权利要求85的方法，其中所述方法还包括

培养所述分离的细胞，以及

从细胞或细胞培养物中回收所述代谢物。

87.权利要求85的方法，其中所述代谢物为番茄红素或乙醇。

88.权利要求85的方法，其中所述代谢物为聚羟基丁酸酯(PHB)。

89.权利要求85的方法，其中所述代谢物为治疗性蛋白质。

90.权利要求85的方法，其中所述治疗性蛋白质为重组蛋白。

91.权利要求89的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗体或抗体片段。

92.权利要求85的方法，其中所述细胞为原核细胞。

93.权利要求92的方法，其中所述原核细胞为细菌细胞或古细菌细胞。

94.权利要求85的方法，其中所述细胞为真核细胞。

95.权利要求85的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞。

96.权利要求94的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。

97.权利要求94的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。

98.权利要求94的方法，其中所述真核细胞为昆虫细胞。

99.权利要求94的方法，其中所述真核细胞为干细胞。

100.权利要求94的方法，其中所述真核细胞为真菌细胞。

101.权利要求85的方法，其中所述全局转录机器由真核细胞细胞器的核酸编码。

102.权利要求101的方法，其中所述细胞器为线粒体或叶绿体。

103.包含多种不同核酸分子种类的集合，其中每种核酸分子种类编码包含不同突变的全局转录机器。

104.权利要求103的集合，其中所述全局转录机器为σ因子或抗σ因子。

105.权利要求104的集合，其中编码σ因子的核酸是rpoD(σ⁷⁰)基因、rpoF(σ²⁸)基因、rpoS(σ³⁸)基因、rpoH(σ³²)基因、rpoN(σ⁵⁴)基因、rpoE(σ²⁴)基因或fecI(σ¹⁹)基因。

106.权利要求C1的集合，其中所述全局转录机器结合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子。

107.权利要求106的集合，其中所述全局转录机器为TFIID或其亚基。

108.权利要求107的集合，其中所述亚基为TATA结合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)，如TAF25。

109.权利要求103的集合，其中所述全局转录机器为核酸甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶或组蛋白脱乙酰基酶。

110.权利要求103的集合，其中所述核酸分子种类包含在表达载体中。

111.权利要求110的集合，其中所述核酸由组织特异性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子表达。

112.权利要求110的集合，其中所述表达载体包含多种不同的核酸分子种类，其中每种核酸分子种类编码不同的全局转录机器。

113.权利要求103的集合，其中所述全局转录机器通过定向进化进行突变。

114.权利要求113的集合，其中所述定向进化使用易错PCR来进行。

115.权利要求113的集合，其中定向进化使用基因改组来进行。

116.权利要求103的集合，其中所述全局转录机器中的突变为一个或多个点突变。

117.权利要求103的集合，其中所述全局转录机器中的突变为一种或多种截短或缺失。

118.权利要求117的集合，其中所述截短不包括所述全局转录机器的启动子结合区。

119.权利要求103的集合，其中根据权利要求1-83中任一项来突变细胞的全局转录机器。

120.包含权利要求103-119中任一项的核酸分子集合的细胞集合。

121.权利要求120的集合，其包含多种细胞，其中每种细胞包含一种或多种所述核酸分子。

122.权利要求120的集合，其中所述细胞为原核细胞。

123.权利要求122的集合，其中所述原核细胞为细菌细胞或古细菌细胞。

124.权利要求120的集合，其中所述细胞为真核细胞。

125.权利要求124的集合，其中所述真核细胞为酵母细胞。

126.权利要求124的集合，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。

127.权利要求124的集合，其中所述真核细胞为植物细胞。

128.权利要求124的集合，其中所述真核细胞为昆虫细胞。

129.权利要求124的集合，其中所述真核细胞为干细胞。

130.权利要求124的集合，其中所述真核细胞为真菌细胞。

131.权利要求120的集合，其中所述核酸分子整合进细胞的基因组，或者替换编码内源全局转录机器的核酸。

132.编码由多轮突变产生的全局转录机器的核酸。

133.权利要求132的核酸，其中所述多轮突变包括定向进化。

134.权利要求133的核酸，其中所述定向进化包括通过易错PCR进行的突变。

135.权利要求133的核酸，其中所述定向进化包括通过基因改组进行的突变。

136.权利要求132的核酸，其中所述核酸编码多种不同的全局转录机器种类。

137.权利要求132的核酸，其中所述核酸编码多种不同形式的同一类型全局转录机器种类。

138.权利要求132-136中任一项的核酸所编码的全局转录机器。

139.包含(羧基端)区域4的截短的σ因子蛋白。

140.用于对所选废品进行生物除污的方法，该方法包括：

根据权利要求1-83中任一项突变细胞的全局转录机器，以产生改造细胞，

分离与未改造细胞相比代谢所选废品的量提高的改造细胞，

培养所述分离的细胞，以及

使所述改造细胞接触所选废品，从而提供对所选废品的生物除污。