CN104673737A - 一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株耐乙醇运动发酵单胞菌，该耐乙醇单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N；所述耐乙醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；所述耐乙醇运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas mobilis (ZM4-mropD)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.10617，保藏时间为2015年3月12日。本发明还提供了制备该菌株的方法，其包括：突变rpoD基因的制备、重组质粒pBmrpoD的构建、质粒转化以及利用不同梯度乙醇进行筛选。本发明菌株能耐受初始浓度至少为9%的乙醇，制备方法易操作。本发明还公布该菌株在生产乙醇的应用。

Description

一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用。
技术背景
随着能源危机的不断高涨以及环境问题日益突出，利用再生资源制备生物燃料领域越发受人瞩目，其重要性也不断凸显。在过去几十年中，生物乙醇的生产一直受人关注。其中，利用运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）制备生物乙醇的研究已进行多年。运动发酵单胞菌作为唯一一种通过Entner-Doudoroff(ED)代谢途径发酵葡萄糖的微生物，具有较高的乙醇发酵力和乙醇耐受性等优势，在生物乙醇生产中具有重要地位。
然而，在纤维素等生物质乙醇发酵过程中，许多环境压力因素抑制着菌体的生长及其乙醇发酵的能力。高乙醇浓度、渗透压以及有氧胁迫等是抑制运动发酵单胞菌的生长和乙醇发酵的主要因素。如何获得高耐受性菌株，是研究者多年来的愿望。
然而，在现有技术中，可耐乙醇的运动发酵单胞菌少之又少，且耐受能力普遍较低。其原因在于，一般的诱变育种方法所需时间长、效率低且随机性巨大。随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造细菌并获得耐乙醇的运动发酵单胞菌可能成为解决这一问题的方法。然而，在如何对运动发酵单胞菌进行基因改造使之耐受乙醇方面上，目前的研究还很少，且尚未获得确切认识。
因此，亟待找到一种可以获得耐乙醇运动发酵单胞菌的基因工程改造方法。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一株耐乙醇运动发酵单胞菌，该耐乙醇运动发酵单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N；所述耐乙醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；所述耐乙醇运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas mobilis ZM4-mropD，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所 邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.10617，保藏时间为2015年3月12日。
一般而言，Q57残基负责调控DNA连接和启动子连接，以获得正确的启动，因此，突变Q57L有可能影响了DNA和启动子对RNA聚合酶的连接。突变I448N的作用，有可能是以一种未知而精妙的方式影响着转录。虽然该菌株耐乙醇的机理还有待研究，但该菌株的耐乙醇性能是十分优良的。如本发明的一个实施例所示，本发明的菌株可以耐受初始浓度至少为9%的乙醇，在乙醇初始浓度为10%时仍可以较为良好的生长。在含有乙醇初始浓度为9%的RM培养基中，本发明菌株ZM4-mrpoD在培养48h后，菌体浓度便达到了OD600=1.5，而对照菌株ZM4-rpoD（RpoD未受突变）的菌体浓度仅为OD600=0.8。
需要指出的是，本发明得到的菌株含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N，任何在本发明的基础上，再对其它无关的位置进行突变而得的菌株，均实质上与本发明相同，仍属本发明的保护范围。
本发明的第二个目的在于提供耐乙醇运动发酵单胞菌的制备方法，该方法包括如下步骤：
1）突变rpoD基因的制备：利用GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis Kit对rpoD的PCR产物进行易错聚合酶链式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q57L、G426C和I448N的突变rpoD基因；
2）重组质粒pBmrpoD的构建：将步骤1）所得物进行纯化后，用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理，再连接到与质粒pBBR1MCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒pBmrpoD，所述pBBR1MCS-tet含有丙酮酸脱羧化酶的启动子和终止子；
3）将重组质粒pBmrpoD转化入运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4中，并在培养基中进行培养；
4）将步骤3）的培养物接种到含有乙醇的培养基中，乙醇初始浓度为7-9%，经三轮筛选后，将细菌置于含有9%乙醇和5 μg/ml四环素的固体培养基上培养，随机挑选单克隆，提取质粒后，进行DNA测序。
所述纯化是利用E.Z.N.A®Gel Extraction Kit，并严格按照产品说明书操作说明进行的。
步骤3）和步骤4）中，所述培养基为RM培养基。
步骤3中，所述转化为电转化。
步骤3中，在所述培养时，培养方式为：先于RM固体培养基进行培养，再于RM液体培养基中在30℃下静置过夜培养。
本发明的第三个目的在于提供所得的耐乙醇运动发酵单胞菌在乙醇生产上的应用。如本发明的一个实施例所示，在含有乙醇初始浓度为9%的培养基中培养24h之后，本发明菌株ZM4-mE4消耗了近78%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-rpoD仅仅消耗了35%左右的葡萄糖；培养56h之后，本发明菌株ZM4-mrpoD消耗了近93%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-rpoD仅消耗了70%左右的葡萄糖。这证明本发明菌株ZM4-mE4在生产乙醇时，能耐受较高浓度的乙醇，可以更高效的利用葡萄糖进行繁殖生长，实现乙醇的高效生产。
本发明的有益效果：
1、本发明所得菌株具有优良的耐受乙醇的能力，能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；
2、本发明的制备方法工艺要求不苛刻，易于操作；
3、本发明菌株ZM4-mrpoD在乙醇生产上具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为不同乙醇浓度对本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD生长的影响，图中，ZM4-mrpoD为本发明菌株ZM4-mrpoD，ZM4-rpoD为对照菌株ZM4-rpoD，ethanol意为乙醇；
图2为本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD在不同乙醇浓度下的生长曲线；a为在乙醇浓度为0%的生长曲线，b为在乙醇浓度为6%的生长曲线，c为在乙醇浓度为8%的生长曲线，d为在乙醇浓度为10%的生长曲线；
图3为本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD在乙醇浓度为9%时对葡萄糖的消耗情况，其中，Glucose concentration of ZM4-rpoD意为“培养对照菌株ZM4-rpoD后，培养基所剩葡萄糖的浓度”，Glucose concentration of ZM4-mrpoD意为“培养本发明菌株ZM4-mrpoD后，培养基所剩葡萄糖的浓度”，Growth of ZM4-rpoD意为“对照菌株ZM4-rpoD的生长情况”，Growth of ZM4-mrpoD意为“本发明菌株ZM4-mrpoD的生长情况”，Glucose意为“葡萄糖”，Cell growth意为“细菌生长”；
图4为在含有乙醇情况下本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD的粗提物中的丙酮酸脱羧酶（PDC）和乙醇脱氢酶（ADH）的活性表征图；
图5为本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD在不同乙醇浓度下，adhB和pdc的表达的倍数情况，A为在乙醇浓度为0%的情况，B为乙醇浓度为9%的情况；
图6为本发明菌株ZM4-mrpoD的重组质粒pBmrpoD和对照菌株ZM4-rpoD的重组质粒pBmrpoD的示意图，Ppdc和Tpdc分别代表丙酮酸脱羧酶的启动子和终止子。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所需的引物序列如表1所示。
实施例1
重组质粒pBmrpoD的构建：
利用GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis Kit对RpoD的PCR产物进行易错聚合酶链式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q57L、G426C和I448N的突变rpoD基因；将反应产物利用E.Z.N.A®Gel Extraction Kit进行纯化后，用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理，再连接到与质粒pBBR1MCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒pBmrpoD，所述pBBR1MCS-tet含有丙酮酸脱羧化酶的启动子和终止子。
重组质粒pBrpoD的构建：
将rpoD的PCR产物利用E.Z.N.A®Gel Extraction Kit进行纯化后，用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理，再连接到与质粒pBBR1MCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒pBrpoD，所述pBBR1MCS-tet含有丙酮酸脱羧化酶的启动子和终止子。
实施例2
耐乙醇运动发酵单胞菌的制备：
将实施例1中所得的重组质粒pBmrpoD通过电转化的方式，转化入Z.mobilis ZM4中，将经质粒转化后的细菌铺于含有5μg/ml四环素的RM琼脂固体平板培养基上，刮取单克隆置于RM液体培养基中，在30℃下静置培养过夜。
对组菌株的制备：
将实施例1中所得的重组质粒pBrpoD通过电转化的方式，转化入Z.mobilis ZM4中，将经质粒转化后的细菌铺于含有5μg/ml四环素的RM琼脂固体平板培养基上，刮取单克隆置于RM液体培养基中，在30℃下静置培养过夜。对照菌株ZM4-rpoD中的rpoD未受任何突变处理。
实施例3
1）细菌生长的表征：
将实施例2所得本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD于RM培养基，在30℃下培养至OD600=1.0，再进行10倍梯度稀释，将稀释后的菌液铺于含有不同浓度乙醇的RM琼脂固体平板上，于30℃培养4-5天。
2）生长曲线的绘制
将实施例2所得本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD于Bioscreen C system中进行培养。取十分之一（v/v）的过夜菌液加入1ml含有不同乙醇浓度（0%、6%、8%、10%）的新鲜RM液体培养基中，加入后，菌液的浓度为OD600=0.15-0.20。然后，将细菌加入Bioscreen plate上，每孔加入量为300μl，将温度控制在30℃，OD设为600，每隔1h测定一次吸光度，一共进行14h，每次测定时，将细菌培养物摇晃60s。
如说明书附图1所示，本发明菌株ZM4-mrpoD与对照菌株ZM4-rpoD在没有乙醇时，生长情况没有显著差别，当乙醇浓度为6%或8%时，对照菌株ZM4-rpoD的生长能力显著下降，而当乙醇浓度为10%时，对照菌株ZM4-rpoD几乎不再生长。而本发明菌株ZM4-mrpoD在乙醇浓度为6%和8%时均能很好生长，在乙醇浓度为10%时也具有一定生长能力。
如说明书附图2所示，本发明菌株ZM4-mrpoD与对照菌株ZM4-rpoD在没有乙醇时，生长曲线没有显著差别。在乙醇浓度为5%时，本发明菌株ZM4-mrpoD在7-8小时后，便进入稳定期，比对组菌株ZM4-rpoD早3小时；当乙醇浓度为8%时，本发明菌株ZM4-mrpoD的最高菌浓可达OD600=0.9，而对照菌株ZM4-rpoD只能达到OD600=0.4；当乙醇浓度为10%时，本发明菌株ZM4-mrpoD的生长也显著快于对照菌株ZM4-rpoD。
实施例4
乙醇胁迫条件下细菌对葡萄糖的消耗利用：
将实施例2所得本发明菌株ZM4-mrpoD和对照菌株ZM4-rpoD置于含有20g/L的RM培养基中，于30℃培养至对数中期，取10ml菌液加入到100ml含有9%乙醇的新鲜RM液体培养基中，加入后，菌液的OD600为0.2左右。将细菌于30℃下培养2-3天。培养过程中，每隔6h取1ml菌液作为测试样品，共取9次，样品存于-20℃中。葡萄糖浓度是利用硫酸作为流动性，通过HPLC进行测定的，流动相流速为0.6ml/min，柱温为35℃。
如说明书附图3所示，在含有乙醇浓度为9%的RM培养基中，本发明菌株ZM4-mrpoD在培养48h后，菌浓便达到了OD600=1.5，而对照菌株ZM4-rpoD的菌浓仅为OD600=0.8。
在含有乙醇浓度为9%的培养基中培养24h之后，本发明菌株ZM4-mrpoD消耗了近78%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-rpoD仅仅消耗了35%左右的葡萄糖；培养56h之后，本发明菌株ZM4-mrpoD消耗了近93%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-rpoD仅消耗了70%左右的葡萄糖。
实施例5
定量PCR检测：
利用BIOPRAD Real-Time PCR系统对adhB和pdc的表达进行检测。所用引物由引物设计软件设计，并在目标基因的3端上扩增约100bp。PCR的过程为：94℃变性15min进入循环，循环参数为：94℃变性20s，60℃退火30s，共循环40次，然后于72℃延伸5min。PCR扩增产物用SYBR Green进行检测。编码有16S RNA的ssrA基因作为内生性控制基因。本发明所用引物序列如表1所示：
实施例5
酶的检测：
PDC（丙酮酸脱羧酶）活性的检测方法参考文献Promoter and nucleotide sequences of the Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase进行。
ADHB活性是通过采用乙醇依赖的NAD+ 还原反应进行测定。首先，参考文献，对细菌进行通透性处理，再将细菌溶解液加入1ml溶液中，该溶液含有333mM乙醇、8.3mM NAD+ 和50mM磷酸钠缓冲液，溶液的pH为6.5。NADH的形成是通过在340nm的吸光度的变化来测定。PDC/ADH的单位活性定义为在特定条件下每分钟所形成的1μmol的NAD+/NADH。
如说明书附图4所示，在乙醇浓度为9%时，当培养时间为6h时，本发明菌株ZM4-mrpoD与对照菌株ZM4-rpoD的PDC活性和ADH活性没有显著区别，而当培养时间为24h和48h时，本发明菌株ZM4-mrpoD的PDC活性和ADH活性显著高于对照菌株ZM4-rpoD。
如说明书附图5所示，当不加乙醇，培养时间为6h时，本发明菌株ZM4-mrpoD对adhb基因的表达水平与对组菌株相比，但本发明菌株ZM4-mrpoD对pdc基因的表达上调了2.16倍。当培养时间为24h时，本发明菌株ZM4-mrpoD对adhb基因的表达下调了2.7倍，对pdc基因的表达上调了2.74倍。
当添加的乙醇浓度为9%，培养时间为6h时，本发明菌株ZM4-mrpoD对adhb的表达与对照菌株ZM4-rpoD没有区别，培养24h时，本发明菌株ZM4-mrpoD对adhb的表达下调了2.13倍。特别的，在培养6h和24h时，本发明菌株ZM4-mrpoD中的pdc mRNA的水平与对照菌株ZM4-rpoD的相比，分别提高了8.96倍和12.74倍。

Claims (7)

1.一株耐乙醇运动发酵单胞菌，其特征在于，所述耐乙醇运动发酵单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N；所述耐乙醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的乙醇；所述耐乙醇运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas mobilis ZM4-mropD，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.10617，保藏时间为2015年3月12日。
2.制备如权利要求1所述耐乙醇运动发酵单胞菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）突变rpoD基因的制备：利用GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis Kit对rpoD的PCR产物进行易错聚合酶链式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q57L、G426C和I448N的突变rpoD基因；
2）重组质粒pBmrpoD的构建：将步骤1）所得物进行纯化后，用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ处理，再连接到与质粒pBBR1MCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒pBmrpoD，所述pBBR1MCS-tet含有丙酮酸脱羧化酶的启动子和终止子；
3）将重组质粒pBmrpoD转化入运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4中，并在培养基中进行培养；
4）将步骤3）的培养物接种到含有乙醇的培养基中，乙醇初始浓度为7-9%，经三轮筛选后，将菌液涂布于含有9%乙醇和5 μg/ml四环素的固体培养基上培养，随机挑选单克隆，提取质粒后，进行DNA测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述纯化是利用E.Z.N.A®Gel Extraction Kit，并严格按照产品说明书操作说明进行的。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）和步骤4）中，所述培养基为RM培养基。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述转化为电转化。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3中，在所述培养时，培养方式为：先于RM固体培养基进行培养，再于RM液体培养基中在30℃下静置过夜培养。
7.权利要求1所述的耐乙醇运动发酵单胞菌在乙醇生产上的应用。
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