CN105132348B - 运动发酵单胞菌的易错全基因组改组方法及耐受糠醛运动发酵单胞菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运动发酵单胞菌的易错全基因组改组方法及耐受糠醛运动发酵单胞菌，耐受糠醛运动发酵单胞菌其分类命名为运动发酵单胞菌F2.5‑4(Zymomonas mobilis)F2.5‑4，保藏号CCTCC NO：M2015366。本发明的方法获得的耐受糠醛的运动发酵单胞菌，能在3g/L糠醛的RM培养基中高效的生长。与传统的全基因组改组技术相比，本发明有效地运用易错PCR技术实现无需理化诱变和原生质体融合即能快速有效获得耐受糠醛的运动发酵单胞菌。在糠醛浓度为3g/L的培养基中出发菌株运动发酵单胞菌的生长受到严重抑制，而本发明的方法获得的耐受糠醛的运动发酵单胞菌比出发菌株运动发酵单胞菌耐受糠醛能力强。

Description

运动发酵单胞菌的易错全基因组改组方法及耐受糠醛运动发 酵单胞菌

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种运用易错全基因组改组技术提高运动发酵单胞菌的糠醛耐受性的方法及耐受糠醛运动发酵单胞菌。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁可替代能源已成为全球的研究热点，以木质纤维素为原料发酵生产燃料乙醇的研发工作更是备受关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富,其主要成份是纤维素、半纤维素和木质素。酿酒酵母和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为生产乙醇的菌株而备受关注。运动发酵单胞菌是目前唯一一种通过ED途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，与酿酒酵母相比具有糖吸收比速率快、乙醇得率高、生物量形成少等产醇优势^[1]，可作为工业化生产乙醇的优势菌株。木质纤维素难于降解，需要物理、化学等预处理手段打破纤维素微纤维之间的交联耦合。在预处理过程中，会产生三类抑制酶解和发酵的抑制物：1.弱酸(乙酸、甲酸和乙酰丙酸)等；2.木质素降解产物(酚醛树脂、香草醛和木质素单体等)；3.糖的热降解过程中，由于焦糖化作用和美拉德反应而产生的糠醛和5-羟甲基糠醛等热降解产物^[2]。糠醛、5-羟甲基糠醛等发酵抑制物，抑制菌体生长和微生物发酵，从而降低乙醇效率^[3]。构建能耐受木质纤维素水解液中抑制物的工程菌株可以使菌株在水解液中高效发酵，降低预处理过程中工艺水洗抑制物的用量，节约生产成本，对纤维素乙醇的工业化具有重要意义。

目前发现运动发酵单胞菌的hfq(ZMO0347)基因在抵抗多种木质纤维素预处理抑制剂(乙酸甲酯，香草醛，糠醛和羟甲基糠醛)中发挥作用，在hfq的突变株中过表达该基因能恢复运动发酵单胞菌的糠醛耐受性^[4]。但是转录组的研究也表明细菌呈现环境胁迫，酸、酚和糠醛等水解抑制物胁迫时，多基因表达发生改变。即多基因表达水平同时改变更有利于细菌获得耐受性能^[5]。然而，目前对细菌的耐受胁迫机制研究尚不清楚。一些学者也利用基因工程、适应性培养、诱变等手段实现多基因同时改变以有效的提高细菌的耐胁迫性^[6]，但获得的耐受水解液抑制物的运动发酵单胞菌较少。传统的易错PCR技术只能对特定的基因进行有效突变，而全基因组改组技术需要结合理化诱变获得优良菌株进而通过原生质体融合而实现各菌株全基因的洗牌，从而筛选出耐受性状提高的菌^[7]。理化诱变筛选菌的方法对操作人员有一定的危害、适应进化也费时费力；运用分子生物学手段对某一或某几个特定基因过表达或敲除难以多方位改造菌的特性、大幅度提高其耐受性，运用合成生物学手段系统的实现多基因改造以改善菌的耐受性需要对机制有充分的理解。因而，目前急需建立快速有效的手段获得具有耐受性的运动发酵单胞菌，以提高其在木质纤维素水解液中的应用能力。

参考文献：

1.Rogers PL，Jeoo YJ，Lee KJ，et al.Zymomonas mobilis for fuel ethanoland higher value products[J].Advances in biochemical engineeringbiotechnology，2007，108：263.

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3.Piotrowski JS，Zhang Y,Bates DM,et al.Death by a thousand cuts:thechallenges and diverse landscape of lignocellulosic hydrolysate inhibitors[J]Front Microbiol，2014，5：90.

4.Yang S，Pelletier DA，Lu TY，et al.The Zymomonas mobilis regulator hfqcontributes to tolerance against multiple lignocellulosic pretreatmentinhibitors[J].BMC Microbiol，2010，10：135.

5.He M.X.，et al.Transcriptome profiling of Zymomonas mobilis underfurfural stress[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，95(1)：189-199.

6.范超，通过菌种驯化及循环发酵高效利用木质纤维素水解液生产燃料乙醇的研究.上海：上海交通大学，2013硕士论文.

7.罗剑，杨民和，施巧琴.微生物菌种选育中的基因组改组技术及其应用进展生物技术2008,81-83.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种运动发酵单胞菌的易错全基因组改组方法。

本发明的第二个目的是提供耐受糠醛运动发酵单胞菌。

本发明的技术方案概述如下：

运动发酵单胞菌的易错全基因组改组方法，包括如下步骤：

(1)基因组DNA提取：提取出发菌株运动发酵单胞菌的基因组DNA；

(2)易错PCR扩增全基因组：

取5μL的dNTPS母液、16.6μL的100uM10-17个碱基的随机引物、3μL的15mM的MnCl₂、5μL的10×突变buffer、20ng步骤(1)获得的基因组DNA、2.5μL的2U/μL Taq DNA聚合酶、补充无菌水至50μL；所述dNTPS母液含10mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP；所述10×突变buffer含1mM pH8.3的Tris-HCl，0.7mM MgCl₂、5mM KCl、1g/100mL甘油；

易错PCR反应条件：94℃预变性5分钟；92℃1min，再在37℃的条件下退火1min，再由37℃以每秒变化0.1℃的速度升至55℃，55℃延伸4min，进行50个循环，55℃补充延伸10min；

(3)全基因组改组：将步骤(2)获得的PCR产物通过乙醇沉淀浓缩10倍；制备出发菌株运动发酵单胞菌的感受态细胞；取浓缩后的PCR产物3-5μL至50ul所述运动发酵单胞菌的感受态细胞，1800V电击后加入RM液体培养基，混匀后转移到无菌离心管中于30℃静置培养12-17小时，涂布于糠醛浓度为1-3g/L的RM固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱30℃培养2-5天，得到单克隆，即转化子；

(4)评价：挑取步骤(3)所述单克隆至RM液体培养基中于静置培养至对数晚期,保存菌液；分别接种上述单克隆的菌液和出发菌株运动发酵单胞菌至RM液体培养基，培养至OD₆₀₀为1.2-1.6；再分别转接至糠醛浓度为3g/L的含糠醛的RM液体培养基使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐糠醛的转化子。

耐受糠醛运动发酵单胞菌，其分类命名为运动发酵单胞菌F2.5-4(Zymomonasmobilis)F2.5-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2015366。

本发明的方法获得的耐受糠醛的运动发酵单胞菌,能在3g/L糠醛的RM培养基中高效的生长。与传统的全基因组改组技术相比，本发明有效地运用易错PCR技术实现无需理化诱变和原生质体融合即能快速有效获得耐受糠醛的运动发酵单胞菌。在糠醛浓度为3g/L的培养基中出发菌株运动发酵单胞菌的生长受到严重抑制，而本发明的方法获得的耐受糠醛的运动发酵单胞菌比出发菌株运动发酵单胞菌耐受糠醛能力强。

本发明采用全基因组改组技术能高效地获得耐受糠醛的运动发酵单胞菌，比适应性驯化的方法效率高，时间短；与传统的基因组改组的方法比，无需原生质体融合和诱变、所使用的试剂安全环保，操作快捷高效。因此本发明的菌株和方法对有效的利用废弃的木质纤维素生产清洁能源、解决当前能源危机具有重要意义。

附图说明

图1为运动发酵单胞菌CP4的基因组DNA及易错PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1和2分别为纯化和粗提的运动发酵单胞菌CP4的基因组DNA，M为marker，泳道3-8为实施例2中用12-17bp的随机引物获得的5μl的易错PCR产物电泳图。

图2为运动发酵单胞菌CP4和实施例3获得的单克隆在糠醛浓度为3g/L的RM液体培养基中的生长发酵比较。

图3为运动发酵单胞菌CP4和实施例4筛选出的耐受糠醛的运动发酵单胞菌F2.5-4在糠醛浓度为1g/L RM固体培养基上的生长状况。

图4是实施例4筛选出的耐受糠醛的运动发酵单胞菌F2.5-4和运动发酵单胞菌CP4在葡萄糖质量浓度为2％和4％、糠醛浓度为3g/L的RM液体培养基中的生长曲线。

生物材料样品保藏

本发明涉及的耐受糠醛运动发酵单胞菌，其分类命名为运动发酵单胞菌F2.5-4(Zymomonas mobilis)F2.5-4，该菌株已于2015年6月12日保藏于地址为中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号CCTCC NO：M2015366。

具体实施方式

本发明以保藏号为CICC 10232的运动发酵单胞菌CP4为出发菌株，是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对出发菌株进行限制，采用其它的运动发酵单胞菌为出发菌株，也可以用于本发明。

保藏号为CICC 10232的运动发酵单胞菌CP4购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称运动发酵单胞菌CP4)。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1基因组DNA提取：

提取出发菌株运动发酵单胞菌CP4的基因组DNA，(图1)，具体操作如下：甘油管中的上述菌液转接至含有5mL的RM液体培养基的试管中，30℃培养过夜，使OD600＝2～4。将培养物移至离心管中，4℃13000rpm离心1分钟后弃上清，沉淀用30μL无菌水重悬后，离心弃上清。在离心管内加入120μL破菌缓冲液、60μL Tris饱和酚、60μL氯仿、120μL TE缓冲液，120μL体积石英砂，充分震荡4min后，4℃13000rpm/5min离心取上清液。在上清液中加入1mL无水乙醇，颠倒混匀，于‐20℃放置30min后，于4℃，13000rpm/25min离心，弃上清液，沉淀晾干，取50μL无菌水重悬得到基因组DNA。

RM液体培养基为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH₂PO₄2g/L，余量为水；

RM固体培养基为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L琼脂粉和KH₂PO₄2g/L，余量为水。

破菌缓冲液：

2％(V/V)TritonX-100，1％(W/V)SDS，100nmol/L NaCl，1nmol/L EDTA，10nmol/LpH8.0 Tris-cl.

TE缓冲液10nmol/L Tris-cl(pH8.0)；1nmol/L pH8.0 EDTA

实施例2易错PCR扩增全基因组：

取5μL的dNTPS母液、16.6μL的100uM10-17个碱基的随机引物、3μL的15mM的MnCl₂、5μL的10×突变buffer、20ng步骤(1)获得的基因组DNA、2.5μL的2U/μL Taq DNA聚合酶、补充无菌水至50μL；所述dNTPS母液含10mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP；所述10×突变buffer含1mM pH8.3的Tris-HCl，0.7mM MgCl₂、5mM KCl、1g/100mL甘油；

易错PCR反应条件：94℃预变性5分钟；92℃1min，再在37℃的条件下退火1min，再由37℃以每秒变化0.1℃的速度升至55℃，55℃延伸4min，进行50个循环，55℃补充延伸10min；扩增产物如图1所示。

16.6μL的100uM10-17个碱基的任意引物均可以扩增出易错PCR产物。

16.6μL的100uM10-17个碱基分别为：

8.3μL 100uM 10个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 12个碱基的随机引物；

10μL 100uM 10个碱基的随机引物和6.6μL 100uM 12个碱基的随机引物；

16.6μL 100uM 12个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 12个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 15个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 12个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 15个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 16个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 17个碱基的随机引物。

本实施例以上述随机引物为例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

图1中，

泳道3是使用8.3μL 10个碱基的随机引物和8.3μL 12个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；

泳道4为10μL10个碱基的随机引物和6.6μL 12个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；

泳道5为16.6μL 12个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；

泳道6为8.3μL 12个碱基的随机引物和8.3μL 15个碱基的随机引物扩增的PCR产物；

泳道7为8.3μL 12个碱基的随机引物和8.3μL 15个碱基的随机引物扩增的PCR产物；

泳道8为8.3μL 16个碱基的随机引物和8.3μL 17个碱基的随机引物扩增的PCR产物。

实施例3全基因组改组：

将实施例2获得的各种PCR产物混匀，通过乙醇沉淀浓缩10倍用于电转化；

将出发菌株运动发酵单胞菌CP4接种到3mlRM液体培养基中长至对数晚期后，将其培养物按0.5％接种量接种到装有50ml RM液体培养基中，30℃静止培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5(也可以是0.4-0.5的任意一值)；6000rpm离心5min，收集菌体，用冰浴的体积百分含量为10％的甘油水溶液洗涤2次，用2ml体积百分含量为10％的甘油水溶液悬浮混匀，即得感受态细胞；

取4份感受态细胞，每份50μl，分别将浓缩10倍的PCR产物3μL，4μL，5μL，及无菌超纯水5μL加入至50μl的感受态细胞，分别转移至无菌预冷的1mm电击杯中，1800V电击，加入30℃预热的450ul RM液体培养基，混匀后转移到1.5ml无菌离心管中，30℃静置14小时(也可以选12小时或17小时)，将每个电击后的约500μL培养物各取100μL涂布于糠醛浓度为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L(也可以是1-3g/L之间的任意浓度)的RM固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱30℃培养2-5天，观察平板上单克隆菌落的生长状况，若用无菌超纯水5μL电转化后所涂的平板未长出菌落而浓缩PCR电转化细胞的样品所涂的平板长出菌落，则挑取转化板上的单克隆用于后续糠醛耐受性评价。

实施例4耐受糠醛转化子的评价

将实施例3中平板长出的单克隆分别命名为F2-1、F2-2、F2.5-1、F2.5-2、F2.5-3、F2.5-4、F2.5-5，接种RM液体培养基中于30℃静置培养至对数晚期,保存菌液。为了比较转化子与运动发酵单胞菌CP4在含3g/L糠醛RM培养中的生长差别，从而选出耐受糠醛能力强的菌株，分别接种上述单克隆的菌液和运动发酵单胞菌CP4至RM液体培养基中于30℃静置培养至OD₆₀₀为1.2-1.6，5000g/18℃的条件下离心5min，弃上清，加入RM培养基使浓缩后OD₆₀₀为25，再分别转接至50mL糠醛浓度为3g/L的含糠醛的RM液体培养基，初始OD600控制在0.2，测定各菌株的生长曲线见图2。

3g/L糠醛对于运动发酵单胞菌的抑制作用较为明显，在0h左右，起始菌浓度基本相同，0-20h时细菌都受到糠醛较强的抑制作用生长速度缓慢。20h后，转化菌株进入对数期，大量繁殖，50h后进入平台期，运动发酵单胞菌CP4依然受到较强的抑制。菌F2.5-1，F2.5-2，F2.5-3，F2.5-4，F2.5-5对于糠醛的抗性都要明显好于运动发酵单胞菌CP4，在42h时候OD600能达0.8到以上，出发菌运动发酵单胞菌CP4为0.2，说明用该技术进行的全基因组改组有效。F2.5-4糠醛抗性最强，最高OD600＝1.1。

将抗性转化子F2.5-4以及运动发酵单胞菌CP4，分别在含有1g/L糠醛RM平板中划线观察，F2.5-4在第3天含1g/L糠醛的RM平板上长出单菌落，运动发酵单胞菌CP4在含1g/L糠醛的RM平板上无单菌落长出(图3)。

将抗性转化子F2.5-4以及运动发酵单胞菌CP4，分别在含有1.5g/L糠醛的RM平板中，F2.5-4在第9天含1.5g/L糠醛的RM平板上长出单菌落，运动发酵单胞菌CP4在含1.5g/L糠醛的RM平板上无单菌落长出。进一步说明该方法高效可靠。将F2.5-4进行保藏，见“生物材料样品保藏”。

实施例5转化子F2.5-4的耐糠醛评价

接种实施例4获得的耐糠醛的转化子(以F2.5-4为例)和运动发酵单胞菌CP4接种至RM液体培养基培养至OD₆₀₀为1.2-1.6，离心浓缩后分别转接100mL RM液体培养基和100mL碳源浓度不同的RM液体培养基(碳源浓度不同的RM液体培养基与RM液体培养基不同之处是葡萄糖的浓度为40g/L)中，30℃静置培养至OD600为0.36时加糠醛使各培养基中糠醛的浓度为3g/L，测定生长曲线，F2.5-4的细胞密度和比生长速率比运动发酵单胞菌CP4大，在40g/L葡萄糖中差别更明显。该方法避免了初始接种量低难于控制测定起始菌浓度导致评价缺失客观真实性，在菌长至OD₆₀₀＝0.36时加3g/L糠醛，能有效的评价出糠醛耐受菌对糠醛的耐受性。

Claims (1)

1.耐受糠醛运动发酵单胞菌，其分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)F2.5-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2015366。