CN100575477C

CN100575477C - 东方伊萨酵母的新用途

Info

Publication number: CN100575477C
Application number: CN200710175714A
Authority: CN
Inventors: 杨秀山
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2007-10-10
Publication date: 2009-12-30
Anticipated expiration: 2027-10-10
Also published as: CN101165165A

Abstract

本发明提供了东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)在木质纤维素水解产物发酵中的应用。利用东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)及其驯化菌株对木质纤维素水解产物进行发酵可快速降解发酵抑制剂、高效代谢葡萄糖产乙醇，为降低木质纤维素生产乙醇的成本，进行大规模工业化生产奠定了可靠基础。此外，本发明还提供了一株东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)高效发酵菌株Y4。

Description

东方伊萨酵母的新用途

技术领域

本发明涉及东方伊萨酵母的新用途，具体地说是在木质纤维素水解产物发酵中的应用。

背景技术

以非粮食物质-木质纤维素原料生产乙醇是保证国家能源安全、保护环境、使我国经济和社会可持续发展的重要途径之一。木质纤维素水解产物的成分：葡萄糖+木糖的混合糖浓度6％，乙酸10g/L，糠醛2g/L，羟甲基糠醛1g/L，并含有酚类化合物和芳香烃类化合物。木质纤维素的高效快速水解以及水解产物的高效乙醇发酵是国内外工业化生产燃料乙醇的两个技术瓶颈。在木质纤维素水解产物中除含有混合糖外，还含有糠醛、羟甲基糠醛，酚类化合物等发酵抑制剂，严重地影响着微生物的生长和乙醇发酵。在木质纤维素中，占纤维素原料20-30％的半纤维素水解主要产物是木糖。葡萄糖可被传统酿酒酵母发酵成酒精，而木糖则传统酿酒酵母不能转化成酒精，因此，木质纤维素原料酒精发酵的菌种，除具有高效转化葡萄糖产酒精和抑制剂外，应具有转化木糖的能力。

研究表明糠醛量达到1g/L时，乙醛脱氢酶的活性下降70％以上，如果有其他的抑制物协同作用时，其活性将会更低；在含有1.35g/L5-羟甲基糠醛、0.37g/L糠醛的水解产物中以0.5h-1的稀释率发酵，发现糠醛能被降解63％，5-羟甲基糠醛能被降解43％，葡萄糖的转化率为70％；利用细胞固定化和细胞循环的方法进行发酵，在稀释率数为0.2h-1，发酵失败；水解产物含有0.7g/L糠醛，0.16g/L 5-羟甲基糠醛，酿酒酵母在加入水解产物的体积占培养基总体的90％时生长停止；含有2g/L糠醛的合成培养基中，工业和实验用途的酿酒酵母都不能生长；将几种酿酒酵母菌株接到含有1g/L糠醛的培养基中，发现所有被测菌株均不能生长；利用Saccharomyces cerevisiae CBS8066在含有0.95g/L糠醛不经过任何脱毒处理的水解液批式发酵，己糖的利用率仅为23％，细胞数量减少99％，同时在这过程中葡萄糖和其他水解产物没有明显减少。

木质纤维素水解产物用东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)Y4进行乙醇发酵，快速降解木质纤维素水解物中发酵抑制剂，高效代谢水解物中的葡萄糖产乙醇。该项技术在国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)在木质纤维素水解产物发酵中的应用。

经研究发现，利用东方伊萨酵母对木质纤维素水解产物进行发酵可快速降解水解产物中的发酵抑制剂、高效代谢水解产物中的葡萄糖成乙醇。

下面通过具体实验来说明本发明的实质。

培养基：酵母浸膏3g/L、KH₂PO₄ 3g/L、麦芽提取物3g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5g/L、胰蛋白胨3g/L，其余为木质纤维素水解产物原液，PH5.0

培养条件：连续发酵培养，30℃，80rpm，接种量为10％。

结果：

表1乙醇发酵重复实验1

表2乙醇发酵重复实验2

表3乙醇发酵重复实验3

由表1～3可以看出东方伊萨酵母具有降解葡萄糖生成乙醇的能力，并且能够降解抑制剂糠醛以及5-羟甲基糠醛的能力。

本发明经过大量工作从环境中分离筛选得到了一株降解葡萄糖以及抑制剂综合性能较好的东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)新菌株，将其命名为Y4，该菌株已于2007年9月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.2159。

本发明进一步通过对菌种的驯化提高菌种的耐毒能力，下面是驯化的方法：

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨20，酵母浸膏10，pH5.0。

水解产物驯化培养基(g/L)：酵母浸膏3，KH₂PO₄ 3，麦芽提取物3，(NH₄)₂SO₄ 1，MgSO₄.7H₂O 0.5，胰蛋白胨3，水解产物原液，pH5.0。

将Y4菌株在YPD培养基中富集，接种量1％，30℃，150rpm，培养48h。将富集好的菌液分别离心去上清，接种到水解产物的驯化培养基中，Y4摇床培养，30℃，80rpm。每24h取样，测定葡萄糖、木糖残量以及乙醇和木糖醇含量。同样方法驯化培养三次，每次挑选优秀菌株，表4是经三次驯化培养后挑选得到的菌株生产性能。

表4驯化培养

	木糖(g/100ml)	葡萄糖(g/100ml)	乙醇(g/100ml)
	木糖(g/100ml)	葡萄糖(g/100ml)	乙醇(g/100ml)	0h	1.35	2.76	0
24h	1.39	2.51	0.29	0h	1.35	2.76	0
24h	1.39	2.51	0.29	48h	1.36	1.64	0.39
65h	1.41	1.32	0.32	48h	1.36	1.64	0.39
65h	1.41	1.32	0.32	96h	1.41	1.16	0.28

经过驯化培养后，驯化菌株对葡萄糖及木糖的转化能力有所提高。

本发明还给出了东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)乙醇发酵的条件：

发酵培养基的成分(范围值)：酵母浸膏2-5g/L、KH₂PO₄ 2-5g/L、麦芽提取物2-5g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.5-2g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5-1.5g/L、胰蛋白胨2-5g/L，其余为木质纤维素水解产物原液，调节pH至4.5-6.0。优选发酵培养基成分：酵母浸膏3g/L、KH₂PO₄ 3g/L、麦芽提取物3g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5g/L、胰蛋白胨3g/L、其余为水解产物原液、pH5.0。发酵条件(范围值)：28-35℃，50-100rpm优选发酵条件：30℃，80rpm。

利用Y4及其驯化菌株对木质纤维素水解产物进行发酵可快速降解发酵抑制剂、高效代谢葡萄糖产乙醇，为降低木质纤维素生产乙醇的成本，进行大规模工业化生产奠定了可靠基础。

附图说明

图1是基于26S rDNA D1/D2区域序列和Neighbor-Joining分析绘制的系统树。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1Y4的分离鉴定

Y4分离方法：从某糠醛厂附近的土壤表层下深1-5厘米处采集土样，并将采集到的土样活化后加入到YPD培养基中富集培养，然后取10mL富集后的菌液分别接入到含有90mL水解液培养基(酵母浸膏3g/L、KH₂PO₄ 3g/L、麦芽提取物3g/L、(NH₄)₂SO₄1g/L、MgSO₄.7H₂O1g/L、胰蛋白胨3g/L，其余为木质纤维素水解产物原液，调节pH至5.0-6.0)的250mL三角瓶中，80rpm，30℃培养48h，再将此培养液取10mL接入到90mL新鲜的相同培养基中，继续在80rpm，30℃条件下培养48h，如此反复，经过4-5次转接后，取10uL经过一定梯度稀释后的培养液涂布到相同培养基固体平板上，30℃条件下培养48h后，挑取典型酵母形态的单菌落，再在相同培养培养基固体平板上重复划线纯化三次后，4℃保存。然后通过水解液发酵实验检验这些分离出来的菌株在发酵过程中的乙醇产率、发酵周期及对水解液中发酵抑制剂的降解情况，最后根据发酵实验结果筛选出效果较好的菌株。

Y4的鉴定：通过形态特征观察、生理生化测定及26S rDNAD1/D2区域基因序列分析结果对Y4进行鉴定。

一：形态特征观察：菌落白色、形状不规则、平坦、干燥，呈豆状分布，有菌丝体外延，培养较长时间后，芽生孢子延长呈树状交错，假菌丝分支分布，细胞呈腊肠形或长椭圆形。

二：生理生化实验测定结果：

发酵实验：

葡萄糖	D-半乳糖	麦芽糖	乳糖	棉子糖	纤维二糖	淀粉
葡萄糖	D-半乳糖	麦芽糖	乳糖	棉子糖	纤维二糖	淀粉	+	-	-	-	-	-	-

同化生长实验：

(1)以下列化合物作唯一碳源同化生长实验：

D-木糖	D-半乳糖	麦芽糖	乳糖	棉子糖	L-阿拉伯糖	D-阿拉伯糖	甲醇	乙醇	木糖醇	淀粉
D-木糖	D-半乳糖	麦芽糖	乳糖	棉子糖	L-阿拉伯糖	D-阿拉伯糖	甲醇	乙醇	木糖醇	淀粉	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-

(2)以下列化合物作唯一氮源同化生长实验：

硝酸盐	亚硝酸盐	乙胺	L-赖氨酸
硝酸盐	亚硝酸盐	乙胺	L-赖氨酸	-	-	+	+

(3)好氧条件下以D-葡萄糖作为唯一碳源的生长实验：

无维生素	无生物素	于37℃生长	加入0.01％(w/v)放线菌酮	加入0.10％(w/v)放线菌酮	在50％(w/v)葡萄糖中生长	在60％(w/v)葡萄糖中生长
无维生素	无生物素	于37℃生长	加入0.01％(w/v)放线菌酮	加入0.10％(w/v)放线菌酮	在50％(w/v)葡萄糖中生长	在60％(w/v)葡萄糖中生长	+	+	+	-	-	V	-

(4)其它实验

尿素分解实验	淀粉类化合物形成实验
尿素分解实验	淀粉类化合物形成实验	-	-

三：26S rDNA D1/D2区域基因序列分析

用酵母基因组DNA提取试剂盒(由天根生化科技(北京)有限公司提供)提取Y4的全DNA，然后以提取出来的全DNA为模板，进行PCR扩增，正向引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′反向引物NL4：5′-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3′。按以下的反应条件共进行36个循环：94℃，1min；53℃，1min；72℃，1min 20s。所得PCR产物由北京华大基因公司进行纯化及序列测定。将测定出来的Y4的26S rDNA D1/D2区域序列与GenBank核酸序列数据库中的序列进行比对，采用ClustaIX软件进行匹配排列(align)，用MEGA3.1软件中的neighbor-joining分析法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验，最后用TreeView软件显示系统树。

实验得到600bp左右的基因序列，在GeneBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(RID：2V1HRAK015)，Y4与Issatchenkiaorientalis(AB281299)的源性超过99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株间差异不超过1％的标准。图1是根据26S rDNA的D1/D2区域序列所作的系统发育树。

实施例2Y4的乙醇发酵

Y4菌株接种到含有酵母浸膏3g/L、KH₂PO₄ 3g/L、麦芽提取物3g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5g/L、胰蛋白胨3g/L、水解产物原液、pH5.0的培养基中，30℃，80rpm培养，24h内利用完葡萄糖，并且在发酵过程中，木糖也逐渐减少，经过72小时后，木糖被完全消耗。乙醇的最高产量达到理论值(理论产率为0.51g/g)的96.1％。

Claims

1、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)Y4CGMCC No.2159。

2、权利要求1所述酵母在木质纤维素水解产物发酵中的应用。

3、如权利要求2所述的应用，其特征在于，应用权利要求1所述酵母对木质纤维素水解产物进行发酵来生产乙醇。

4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养条件为：28-35℃，50-100rpm。

5、如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养条件为：30℃，80rpm。

6、如权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，发酵培养基为：酵母浸膏2-5g/L、KH₂PO₄ 2-5g/L、麦芽提取物2-5g/L、(NH₄)₂SO₄0.5-2g/L、MgSO₄.7H₂O 0.5-1.5g/L、胰蛋白胨2-5g/L，其余为木质纤维素水解产物原液，调节pH至4.5-6.0。