CN1849393A - Nadh依赖型l－木酮糖还原酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的DNA分子，所述分子包含编码具有NADH依赖性L－木酮糖还原酶活性的酶蛋白的基因。鉴定了编码所述酶蛋白的DNA序列。本发明进一步涉及被本发明的所述DNA分子转化的微生物以及NADH依赖性L－木酮糖还原酶。本发明可用于将含有碳水化合物的生物材料、例如工业废料转化成有用的终产物。

Description

NADH依赖型L-木酮糖还原酶

发明领域

本发明涉及分离的DNA分子和被所述DNA分子转化的微生物，所述DNA分子包含编码能够用于在体内和体外利用糖类例如蔗糖或其衍生物的酶的基因。本发明进一步涉及由所述DNA分子编码的酶蛋白，及其用于蔗糖或其衍生物转化的用途。

发明背景

来自工业(包括农业)的生物学废料包含例如碳水化合物，诸如糖类。长期以来，将这些废料转化成有用的产品一直是生物技术学领域的热点和挑战。

作为碳水化合物的特定示例，可提及L-阿拉伯糖，其是植物材料的主要成分。因此L-阿拉伯糖发酵也有潜在的生物工程学意义。

能够利用L-阿拉伯糖的真菌不一定适合工业用途。许多利用戊糖的酵母品种例如具有较低的乙醇耐受性，使其不适合于乙醇生产。一个方法是提高这些生物体的工业特性。另一个方法是为合适的生物体提供利用L-阿拉伯糖的能力。

对于L-阿拉伯糖的分解代谢，已知存在两个截然不同的途径，即细菌途径和真菌途径(参见图1)。在细菌途径中，三种酶，即L-阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和5-磷酸L-核酮糖4差向酶，将L-阿拉伯糖转化成5-磷酸D-木酮糖。Chiang和Knight在Biochem BiophysRes Commun，3，1960，554-559中第一次描述了真菌途径：霉菌Penicillium chrysogenum的“戊糖代谢新途径”。其也将L-阿拉伯糖转化成5磷酸D-木酮糖，但却是通过L-阿拉伯糖还原酶、L-阿糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶。在该途径中，L-阿拉伯糖还原酶和L-木酮糖还原酶使用NADPH作为辅因子，而L-阿糖醇4-脱氢酶和木糖醇脱氢酶使用NAD⁺作为辅因子。

在黑曲霉(Aspergillus niger)中描述了相同的途径(Witteveen等人：″L-arabinose and D-xylose catabolism in Aspergillusniger″，J Gen Microbiol，135，1989，2163-2171)。使用来自霉酵Hypocrea jecorina的基因在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达了所述途径，并且显示具有功能，即，所得的菌株可在L-阿拉伯糖中生长并使阿拉伯糖发酵，但发酵的速率非常低(Richard等人：″Cloning and expression of a fungal L-arabinitol4-dehydrogenase gene″，J Biol Chem，276，2001，40631-7；Richard等人：″The missing link in the fungal L-arabinose catabolicpathway，identification of the L-xylulose reductase gene″，Biochemistry，41，2002，6432-7；Richard等人：″Production ofethanol from L-arabinose by Saccharomyces cerevisiaecontaining a fungal L-arabinose pathway″，FEMs Yeast Res，3，2003，185-9)。有关酵母中相应途径的信息非常少。Shi等人：“Characterization and complementation of a Pichia stipitismutant unable to grow on D-xylose or L-arabinose”，Appl BiochemBiotechnol，84-86，2000，201-16提供了酵母途径需要木糖醇脱氢酶的证据。在Pichia stipitis的突变体中(所述突变体不能在L-阿拉伯糖中生长)，木糖醇脱氢酶的过表达可恢复其在L-阿拉伯糖上的生长。

Dien等人：“Screening for L-arabinose fermenting yeasts”，Appl Biochem Biotechnol，57-58，1996，233-42就L-阿拉伯糖发酵检验了超过100个酵母品种。其大部分产生阿糖醇(arabinitol)和木糖醇，表明酵母途径与霉菌途径相似，但与细菌途径不同。但对酵母途径中催化步骤的辅因子特征知之甚少。

真菌L-阿拉伯糖途径与真菌D木糖途径具有相似性。在两个途径中，戊糖经历还原和氧化反应，其中还原反应是NADPH偶联的，而氧化反应是NAD⁺-偶联的。D木糖经历一对还原和氧化反应，而L-阿拉伯糖经历两对氧化还原反应。所述过程是氧化还原中性的，但具有不同的氧化还原辅因子，即使用了NADPH和NAD⁺，其必须分别地在其它代谢途径中再生。在D木糖途径中，NADPH偶联的还原酶将D木糖转化成木糖醇，然后所述木糖醇又被NAD⁺-偶联的脱氢酶转化为D木酮糖，接着被木酮糖激酶转化为5磷酸D木酮糖。D木糖途径的酶全部可用于L-阿拉伯糖途径。两个途径中的第一种酶是醛糖还原酶(EC1.1.1.21)。已在不同的真菌中表征了所述酶并且克隆了相应的基因。具柄毕赤酵母(Pichia stipitis)酶比较特别，因为它可使用NADPH和NADH作为辅因子(Verduyn等人：″Properties of theNAD(P)H-dependent xylose reductase from the xylose-fermentingyeast Pichia stipitis″，Biochem J，226，1985，669-77)。其对糖类也是非特异性的，并且可以大致相同的速率使用L-阿拉伯糖或D木糖，分别产生L-阿糖醇或木糖醇。还有，在真菌的D木糖和L-阿拉伯糖途径中，木糖醇脱氢酶(也称作D木酮糖还原酶EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶EC 2.7.1.17都相同。已知来自各种真菌的D木酮糖还原酶和木酮糖激酶的基因。近来在专利申请WO 02/066616中已描述了编码L-阿糖醇4脱氢酶(EC1.1.1.12)或L-木酮糖还原酶(EC1.1.1.10)的基因。

使用真菌途径的L-阿拉伯糖的分解代谢较慢。据信这是由于在所述途径中使用不同辅因子之故。为转化1摩尔L-阿拉伯糖，要将2摩尔NADPH和2摩尔NAD⁺分别转化成NADP⁺和NADH，即，尽管所述途径中总体反应是氧化还原中性的，但产生了氧化还原辅因子的不平衡。如果所述途径只使用NAD⁺/NADH辅因子对，则可避免该状况。

已描述了霉菌和高等动物的L-木酮糖还原酶。从仓鼠的肝中鉴定了编码双乙酰还原酶的基因，所述双乙酰还原酶也具有L-木酮糖还原酶活性(Ishikura等人：″Molecular cloning，expression andtissue distribution of hamster diacetyl reductase.Identitywith L-xylulose reductase″，Chem Biol Interact，130-132，2001，879-89)。

所有这些L-木酮糖还原酶活性的共同点是均严格地与NADPH偶联。就我们所知，没有与NADH偶联的L-木酮糖还原酶活性有关的报道。

Hallborn等人：“A short-chain dehydrogenase gene fromPichia stipitis having D-arabinitol dehydrogenase activity”，Yeast，11，1995，839-47描述了NAD⁺依赖性的D阿糖醇脱氢酶，所述脱氢酶从D阿糖醇形成D-核酮糖。在他们的报道中还提到针对NAD⁺和木糖醇的活性，但其结论是D木酮糖是该活性的产物。

一直存在对提供工业上可应用的将廉价生物物质转化成有用产物的生物工程学方法的需要。

发明概述

因此，本发明提供了新的分离的DNA分子，所述分子包含编码表现优选特性的酶蛋白的基因。

此外，本发明提供了经遗传工程改造的包含本发明基因的DNA分子，所述分子使本发明的基因能够便利地在宿主微生物中转化和表达。

本发明进一步提供了经遗传修饰的微生物，所述微生物被本发明的DNA分子所转化，并且能够有效地使来自生物材料的碳水化合物(例如糖类或其衍生物)发酵，从而获得有用的发酵产品。

本发明的另一个目的是提供酶蛋白，该酶蛋白能够由宿主表达，用于将碳水化合物、特别是糖类或其衍生物例如糖醇在发酵介质中转化成有用的转化产品，或者该酶蛋白以酶制剂形式存在，用于在体外将上述碳水化合物转化成有用的终产物或中间产物。

附图简述

图1.L-阿拉伯糖利用的真菌和细菌途径。

图2.包含于编码NADH依赖性L-木酮糖还原酶的DNA分子中的SEQ ID No.1所示cDNA序列以及由所述cDNA编码的SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

发明详述

本发明首次提供了分离的DNA分子，所述分子包含编码酶蛋白的基因，所述酶蛋白表现NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性。下面描述分离和鉴定方法。

术语“NADH依赖性L-木酮糖还原酶”或“具有NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性的酶蛋白”此处是指本发明的酶蛋白表现L-木酮糖还原酶活性并且使用NADH作为辅因子，即是严格地NADH依赖性的酶，所述酶与已知的只使用NADPH作为辅因子的L-木酮糖还原酶相反。

术语“基因”此处是指包含编码特定酶蛋白特征性的氨基酸序列的核酸序列的核酸片段。因此，本发明的基因包含这样的核酸序列，所述核酸序列编码具有NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性的酶蛋白特征性的氨基酸序列。“基因”可选地可包含进一步的核酸序列，例如调控序列。

很明显，术语“DNA分子”、“DNA序列”和“核酸序列”也包括cDNA(互补DNA)。

由于NADH依赖性的原因，本发明的L-木酮糖还原酶提供了在包含L-木酮糖还原酶作为代谢途径中的酶之一的所述途径中用于氧化还原辅因子再生的可选择方法。特别地，本L-木酮糖还原酶改善了例如真菌L-阿拉伯糖途径中的NADP⁺-NAD⁺平衡。结果可提供工业上有利的真菌途径，例如L-阿拉伯糖途径，所述途径可将L-阿拉伯糖转化成D木酮糖，而不引起氧化还原辅因子的不平衡。

优选地，本发明的DNA分子的基因编码NADH依赖性L-木酮糖还原酶，所述酶表现出可逆的将糖类转化成糖醇的催化活性，其中，在费希尔投影式中，在L构型上，所述糖类在碳2(C2)上具有酮基基团，而所述糖醇在C2上具有羟基基团。特别地，所述NADH依赖性L-木酮糖还原酶表现可逆的将L-木酮糖转化为木糖醇的催化活性。另一种有用的活性是将D-木酮糖和D-核酮糖转化为D-阿糖醇的可逆反应。

在本发明的一个优选实施方案中，DNA分子的基因编码包含SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的酶蛋白或其功能性等同变体。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述分离的DNA分子包含编码真菌来源的NADH依赖性L-木酮糖还原酶的基因，即所述基因序列具有可从真菌L-木酮糖还原酶获得的序列或其等同基因序列。优选的真菌来源的实例是Ambrosiozyma monospora，特别是上述菌株NRRLY-1484。

根据其它优选的实施方案，DNA分子的基因包含SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性等同变体。

2003年8月5日(5.8.2003)在布达佩斯协议条款下，VTTBiotechnology(地址是P.O.Box 1500，Tietotie 2，02044 VTT，Finland)针对SEQ ID No.1的cDNA序列在国际保藏机构DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)作了保藏，并已分配保藏号DSM 15821。所述保藏菌株酿酒酵母(S.cerevisiae)DSM 15821含有存在于多拷贝质粒上、处于组成型酵母启动子控制下的SEQ IDNo.1所示cDNA(也参见图2)，所述cDNA在下面的实验部分也称作ALX1基因。在该菌株中，L-木酮糖还原酶得到表达。保藏的核酸序列来源于已知的Ambrosiozyma monospora NRRL Y-1484。在下面的实验部分，例如在实施例1和2以及图2中给出了本发明的核酸和氨基酸序列、所述保藏菌株中使用的质粒和保藏菌株的更详细情况。SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的序列列表也支持该数据。

众所周知，来自不同生物、编码具有相同催化活性的基因具有序列相似性，并且本领域技术人员可以多种方式利用这些相似性克隆来自其它生物的具有相同催化活性的其它基因。这些基因也适合于实施本发明。

因此，很明显，基因的核苷酸序列中很多小的变异不会显著地改变被编码的蛋白的催化特性。例如，核苷酸序列中的许多改变不会改变被编码的蛋白质的氨基酸序列。此外，氨基酸序列可具有不改变蛋白功能特性的变异，特别是其不阻止酶发挥其催化功能。DNA分子核苷酸序列上或氨基酸序列上的这些变异称为“功能性等同变体”，因为其分别地不会显著地改变基因编码具有特定功能(例如催化特定反应)的蛋白的功能，并不会显著地改变具有特定功能的蛋白质的功能。因此，SEQ ID NO 1所示核苷酸序列以及SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的这些功能性等同变体(包括片段)包括在本发明的范围内。

此外，发明也涉及经遗传工程改造的DNA分子，即重组DNA，合适地是载体特别是表达载体，所述DNA分子包含如上所述的本发明DNA分子的基因，从而使其能够在宿主细胞即微生物中表达。在重组DNA中，本发明的基因特别地可以有效地与启动子连接。所述载体可以是例如常规载体，例如病毒(如噬菌体)，或质粒，优选地是质粒。表达载体的构建在本领域技术人员的技能之内。下面描述一般方法和具体的实施例。

此外，上面定义的DNA分子优选地用于转化微生物以产生NADH依赖性L-木酮糖酶，所述酶包含由如上定义的DNA分子的基因编码的氨基酸。因此，提供了包含如上定义的本发明DNA分子以表达所述NADH依赖性L-木酮糖的经遗传修饰的微生物。

本发明的DNA分子可转移至任何适合用于从生物材料生产想要的转化产物的微生物，所述生物材料包含碳水化合物，优选地糖类或糖类衍生物。很明显，对于本领域技术人员来说，“合适的微生物”是指：(1)其能够表达编码所述酶蛋白的本发明DNA的基因，并且可选地，(2)其可产生工业转化原材料(即生物材料)以获得想要的产物所需要的其它酶，和(3)其可耐受所形成的转化产物，即任何中间产物和/或终产物，以便能够进行工业生产。可以生物技术领域内已知的方法，优选地使用如上所述的或下面实施例部分描述的本发明载体实现微生物的转化(或转染)。

自然地，或者本发明的所述微生物所利用的生物材料包括可由本NADH依赖性L-木酮糖还原酶转化的糖类产物，或者所述微生物能够表达进一步的基因，从而生成将起始生物材料转化为可由本发明基因表达的所述还原酶利用的糖类产物所需要的酶。

此外，取决于想要的转化产物，所述微生物可包含额外的用于表达一个或多个其它酶的基因，所述酶可将本发明的NADH依赖性L-木酮糖还原酶的转化产物转化成想要的产物。优选地，本发明的酶和至少部分所述可选的其它酶是同一代谢途径中的成员。此外，本发明的微生物可包含两个或更多个代射途径中的酶的基因，以使其中一条途径的产物可被另一条代谢途径利用。

也很明显的是，在所述微生物的基因组中可包含、例如用于表达本发明酶产物的代谢途径和/或其它途径中的酶所需要的所述可选的其它基因，或所述微生物可用所述其它基因中的任何缺少的基因进行转化。

本发明的经遗传修饰的微生物具有利用碳水化合物例如糖类或其衍生物(例如糖醇)的能力。本发明提供了从碳源包含碳水化合物例如糖类或其衍生物的生产发酵产物的方法，其包括在合适的发酵条件下，在存在所述碳源的情况下培养如上所述的经遗传修饰的微生物，并可选地回收想要的发酵产物。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述经遗传修饰的微生物具有增加的利用L-阿拉伯糖的能力。优选地，所述微生物产生真菌L-阿拉伯糖途径和/或磷酸戊糖途径的产物。特别是，所述经遗传修饰的微生物利用包含L-阿拉伯糖的生物材料，并且至少包含真菌L-阿拉伯糖途径的基因用于其表达，所述基因编码醛醣还原酶(特别是EC1.1.1.21)和L-阿糖醇4-脱氢酶(特别是EC 1.1.1.12)的酶。更特别地，所述微生物进一步包含真菌L-阿拉伯糖途径的基因以及任选地编码已知的磷酸戊糖途径中的酶的基因，所述真菌L-阿拉伯糖途径的基因编码D木酮糖还原酶(特别是EC 1.1.1.9)和/或木酮糖激酶(特别是EC 2.7.1.17)的酶。

可通过遗传修饰的微生物获得的所需转化产物可包括真菌L-阿拉伯糖途径的转化产物，尤其是L-阿糖醇、L-木酮糖、木糖醇、D木酮糖和/或5磷酸D-木酮糖；和已知的磷酸戊糖途径或其它途径的转化产物(特别是乙醇和/或乳酸)，所述途径可利用例如真菌L-阿拉伯糖途径的终转化产物5磷酸D木酮糖。

本发明的经遗传修饰的微生物优选地是真菌，其可选自酵母和丝状真菌。合适地，所述真菌是酵母。

工业酵母具有加工工艺的有利方面，例如高乙醇耐受性、其它工业压力的耐受性和快速发酵。其通常是多倍体的，并且其基因工程改造与实验室菌株相比更加困难，但用于其基因工程改造的方法在本领域是已知的(参见，例如，Blomqvist等人：“Chromosomal integrationand expression of two bacterialα-acetolactate decarboxylasegenes in brewer′s yeast”，Appl.Environ.Microbiol.57，1991，2796-2803；Henderson等人：“The transformation of brewingyeasts with a plasmid containing a gene for copper resistance”，Current Genetics，9，1985，133-138)。可根据本发明被转化从而用于利用本发明碳源(例如L-阿拉伯糖)的酵母特别地包括酵母属(Saccharomyces)品种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)种类例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)品种、毕赤酵母属(Pichia)品种、念珠菌属(Candida)品种或Pachysolen品种。也可提及许旺酵母(Schwanniomyces spp.)、Arxula，spp.、丝孢酵母(Trichosporonspp.)、汉逊酵母(Hansenula spp.)和Yarrowia spp.。一种优选的酵母是例如酿酒酵母的工业菌株，例如啤酒用酵母、酿酒或面包酵母。

此外，根据本发明也可转化丝状真菌。这些真菌包括木霉属(Trichoderma)种类、链孢菌属(Neurospora)种类、镰孢属(Fusarium)种类、青霉属(Penicillium)种类、腐质霉属(Humicol)种类、Tolypocladium geodes，Trichoderma reesei(Hypocreajecorina)、毛霉属(Mucor)种类、Trichoderma longibrachiatum，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)等。

优选地，经转化的本发明的微生物是酿酒酵母的工业菌株，其包含本发明的经转化的基因，并额外地包含真菌L-阿拉伯糖途径和可选地磷酸戊糖途径的其它基因，并且所述菌株可将包含L-阿拉伯糖途径的至少一种可利用产物(优选地L-阿拉伯糖)的碳源转化成所述途径的终产物和/或中间产物，或可选地转化成磷酸戊糖途径的产物。所有或部分所述其它基因可存在于所述菌株的基因组中，或所述菌株可以是经遗传工程改造的菌株，它已被所有或部分所述其它基因所转化。合适的示例是根据本发明被转化的、并从起始生物材料产生乙醇的酿酒酵母。

本发明不局限于酵母和其它真菌。可在不能利用或不能有效地利用L-阿拉伯糖的任何生物例如细菌、植物或高等真核细胞中，通过使用本领域合适的和已知针对该特定生物的遗传工具表达编码L-木酮糖还原酶的基因。

也已分离和鉴定了具有NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性的新型酶蛋白。

本发明的其它方面也提供了酶蛋白，所述酶蛋白具有NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性，并包含由如上定义的DNA分子的基因编码的氨基酸序列。

在本发明的一个特定实施方案中，所述酶蛋白包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或其功能性等同变体。所述功能性等同变体包含具有与SEQ ID NO.2至少30％、优选地至少50％、合适地至少70％，例如至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

本发明进一步涉及体外酶促制剂，其至少包含如上所述的酶蛋白。所述制剂可以酶制剂领域已知的形式存在，例如以粉剂形式例如冻干形式或是以溶液形式存在。粉剂形式的制剂可就此使用或在使用前溶解于合适的溶液中。与上述相似地，对于经遗传修饰的微生物，本发明的酶制剂可包含一种或多种其它的酶，其可将起始材料转化成可被本发明的酶产物利用的糖类产物和/或将所得的该酶的转化产物转化成进一步的转化产物。对于所述经转化的微生物，可转化的原始材料、进一步的酶和/或想要的终产物可以是例如如上定义的。

此外，本发明提供了如上定义的NADH依赖性L-木酮糖还原酶用于将在C2位置具有酮基的糖转化成其中C2羟基在Fisher投影中处于L-构型的糖醇或用于其相反的转化，优选地用于将L-木酮糖转化为木糖醇或用于其相反转化的用途。

在转化方法的一个实施方案中，所述酶可以由如上定义的经遗传工程改造的微生物在发酵条件下在发酵介质中生成，所述条件使得所产生的酶能够进行转化作用，所述发酵介质相应地包含糖类或糖醇。

在其它实施方案中，作为体外转化，使用如上定义的酶制剂进行转化方法。可通过在微生物中表达酶和回收获得的酶产物，或例如以肽化学中已知的方法化学地制备酶产物来获得该制剂。酶制剂的转化产物可就此使用(终产物)，或用作中间产物，所述中间产物由例如生物技术或化学方法进一步转化。

用于分离和鉴定本发明的DNA分子的方法的描述

为鉴定本发明的L-木酮糖还原酶基因，可以采用不同的方法，并且本领域技术人员可能使用不同的方法。一个方法是纯化具有相应活性的蛋白和使用有关该蛋白的信息以克隆相应的基因。其可包括经纯化的蛋白的蛋白水解消化、蛋白水解产物的氨基酸序列测序和通过用来源于所述氨基酸序列的引物进行PCR来克隆该基因的部分。然后可以各种方法获得该DNA序列的其余部分。一个方法是通过使用来自文库载体和该基因的已知部分的引物进行PCR而从cDNA文库中获得。当完整的序列是已知时，就可从cDNA文库扩增所述基因并克隆入表达载体，在异源宿主中表达。如果筛选策略或基于序列间同源性的策略不合适时，这是个有用的策略。

克隆基因的另一个方法是筛选DNA文库。当单个基因的过表达会导致容易检测的表型时，这是个特别好和快捷的方法。既然我们已经公开了用编码L-阿糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的基因对利用木糖的真菌进行转化提供了其在L-阿拉伯糖中生长的能力，所以另一个寻找L-木酮糖还原酶基因的策略如下：构建具有L-阿拉伯糖途径中除了L-木酮糖还原酶外的所有基因的菌株用DNA文库进行转化，并通过其在L-阿拉伯糖中生长的能力进行筛选。

还存在其它的克隆L-木酮糖还原酶基因的方法和可能性：

可针对例如在L-木酮糖上的生长进行筛选以发现L-木酮糖还原酶。

可筛选现存的数据库，以寻找与来自相关蛋白家族的基因有同源性的基因，并检验其是否编码所需的酶活性。既然我们已公开了L-木酮糖还原酶基因的序列(SEQ ID NO 1)，本领域技术人员很容易筛选数据库中与SEQ ID NO 1同源的基因。通过使用基于SEQ ID NO 1的探针对DNA文库进行物理筛选也可容易地发现同源基因。合适的DNA文库包括从分离自能够利用L-阿拉伯糖或L-木酮糖的真菌和其它微生物的DNA或RNA产生的文库。

对于本领域技术人员来说，存在许多不同的途径来鉴定编码具有所需酶活性的基因。此处描述的方法举例说明了我们的发明，但也可使用本领域已知的任何其它方法。

可将L-阿拉伯糖途径中的所有或一部分基因(包括本NADH依赖性L-木酮糖还原酶)导入新的宿主生物体中，所述生物体缺少该途径或已具有部分所述途径。例如，可利用D木糖的真菌可能只需要将L-阿糖醇转化成木糖醇的酶。然后，L-阿糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶的表达足以完成L-阿拉伯糖途径。已描述了针对真菌阿拉伯糖途径所有步骤的酶测定法(Witteveen等人，1989)，如果需要的话，可使用这些方法来帮助鉴定特定宿主中缺少或低效的步骤。

在实施例中使用来自酿酒酵母的PGK1启动子表达L-木酮糖还原酶。所述启动子被认为是强的组成型启动子。可使用更强的或稍弱些的其它启动子。使用组成型启动子也不一定是必需的。可使用可诱导的或可抑制的启动子，所述启动子可以具有有利方面，例如，如果想要按顺序发酵不同的糖时就比较有利。

在我们的实施例中，针对L-木酮糖还原酶的基因，我们使用质粒。所述质粒包含选择性标记。所述基因也可从不具有选择性标记的质粒中表达，或可整合入染色体中。使用选择性标记可更容易地发现成功的转化，并稳定遗传构建体。用醋酸锂方法转化酵母菌株。其它转化方法在本领域是已知的，一些方法对于特定的宿主而言比较优选，它们可用于实现我们的发明。

本发明的特定实施方案

根据本发明的一个优选的实施方案，通过真菌的遗传修饰解决了所述真菌不能有效地利用L-阿拉伯糖的缺点，该方法的特征在于用NADH依赖性L-木酮糖还原酶基因转化所述真菌。

根据另一个实施方案，用编码L-阿拉伯糖途径的酶的所有或一些基因转化微生物(优选地真菌)，即至少用醛醣还原酶、L-阿糖醇4-脱氢酶和本L-木酮糖还原酶基因进行转化，并可选地用D-木酮糖还原酶和/或木酮糖激酶进行转化。优选地，用L-阿拉伯糖途径中的所有基因转化该微生物。然后，所得的微生物例如真菌能够更有效地利用L-阿拉伯糖。

在其它实施方案中，用L-阿糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶的基因转化可利用D木糖、但不能利用L-阿拉伯糖的真菌，例如经遗传工程改造的酿酒酵母，以利用L-阿拉伯糖。

术语“利用”此处是指生物体能够使用碳水化合物，例如糖或其衍生物，例如L-阿拉伯糖，作为碳源或作为能源，或指其可将所述产物(例如阿拉伯糖)转化成另一种有用的化合物。

下面用优选的实施方案描述本发明，以在实践中显示真菌微生物可通过遗传工程改造来利用包含碳水化合物、例如糖类或其衍生物(例如L-阿拉伯糖)的生物材料。一些真菌可天然地利用例如L-阿拉伯糖，其它的则不能。将利用L-阿位伯糖的能力转移至缺乏L-阿拉伯糖利用能力、但具有其它所需特性(例如耐受工业条件或产生特定的有用产物例如乙醇或乳酸或木糖醇的能力)的生物体中是合乎需要的。为了通过遗传工程转移L-阿拉伯糖利用能力，必需知道可在宿主细胞中一起作用而将L-阿拉伯糖转化成所述宿主可分解代谢从而产生有用产物的衍生物(例如5-磷酸D-木酮糖)所有的一套酶的基因。然后在特定的宿主中通过用编码缺失的酶的基因转化宿主来使该特定宿主内的该套酶完整。

一个示例是遗传工程改造的酿酒酵母以利用L-阿拉伯糖。酿酒酵母是个良好的乙醇生产者，但缺乏利用L-阿拉伯糖的能力。其它示例是具有有用特性、但缺乏功能性L-阿拉伯糖途径的至少部分的生物体。

据信在真菌中发挥作用的L-阿拉伯糖途径显示于表1中。编码醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)、D-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的基因是已知的。此外，近来在WO 02/066616中已显示了所需要的两个额外的基因，即L-阿糖醇4-脱氢酶(EC1.1.1.12)和L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)的基因以及氨基酸序列，此处将该文献引用作为参考。

在例如WO 02/066616中公开的L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)将木糖醇和NADP⁺转化成L-木酮糖和NADPH。本发明提供了可选择的L-木酮糖还原酶，它是NADH依赖性的，并且可有利地代替已知的NADPH依赖性还原酶使用。

不能利用L-阿拉伯糖、但却是良好的乙醇生产者的真菌、例如酿酒酵母可用醛糖还原酶、L-阿糖醇4-脱氢酶、本L-木酮糖还原酶、D-木酮糖还原酶和木酮糖激酶进行转化，其变得能够有效地利用L-阿拉伯糖和D-木糖。在该菌株中，可将最丰富的己醣和戊糖发酵成乙醇。

有时生物体含有在生物工程应用中有用的条件下不表达的基因。例如，尽管曾普遍地相信S.cerevisiae不能利用木糖，从而预期酿酒酵母不含有编码能够使其利用木糖的酶的基因，但已显示酿酒酵母确实含有这样的基因(Richard等人：″Evidence that the geneYLR070c of Saccharomyces cerevisiae encodes a xylitoldehydrogenase″，FEBS Lett，457，1999，135-8)。然而，这些基因通常表达不充分。因此，我们的发明的另一方面是在宿主生物体自身中鉴定NADH依赖性的L-木酮糖还原酶的基因，和使所述基因在便于生物工程加工(例如含有L-阿拉伯糖的生物物质的乙醇发酵)的条件下在该相同的生物体中表达。我们公开了鉴定这类正常情况下不表达的基因的候选者的方法，所述方法是搜索与SEQ ID NO 1的相似性。然后可将候选基因克隆入表达载体并在合适的宿主中表达，并如实施例中所述就合适的催化活性对宿主的无细胞提取物进行测试。当正常情况下不表达或不充分表达的基因已被证实编码所需的酶时，可将所述基因克隆回该原始的生物体中，但其具有可使该基因在恰当的生物工程条件下表达的新启动子。这也可通过在完整的生物体中遗传工程改造所述基因的启动子来实现。

在本发明的另一个方面，现在通过与SEQ ID NO 1的相似性可容易地鉴定编码来自具有利用L-阿拉伯糖的能力的真菌(包括例如丝状真菌)的L-木酮糖还原酶的基因。然后通过例如将其启动子改变成更强的启动子或具有不同特性的启动子来修饰该基因，以增强该生物体利用L-阿拉伯糖的能力。

真菌可能天然地不具有乳酸生产所需的酶，或其可能低效地产生乳酸。在这些情况下，可在真菌中增加或提高编码乳酸脱氢酶(LDH)的基因的表达，从而真菌可更有效地产生乳酸(例如WO 99/14335)。类似地，通过使用本领域已知的方法，可进一步修饰本发明中描述的经修饰而能更有效地利用阿拉伯糖的真菌，以生产乳酸。同乙醇、乳酸和糖醇例如阿糖醇和木糖醇一样，也可从本发明的利用L-阿拉伯糖的真菌获得、其它有用的产物。这些真菌通过阿拉伯糖途径将L-阿拉伯糖转化为5-磷酸木酮糖，其是磷酸戊糖途径的中间产物。因此，也可生成磷酸戊糖途径的衍生物，例如芳香族氨基酸，以及来源于丙酮酸(乳酸和乙醇的共同前体)的其它物质。

然后将经转化的真菌用于发酵碳源，例如包含农业或森林产物的生物物质和含有例如L-阿拉伯糖和可能地还有其它戊糖或其它可发酵糖类的废产物。用于发酵的碳源的制备和发酵条件可与使用宿主真菌发酵相同碳源的相同。然而，本发明的经转化的真菌比宿主真菌消耗更多的L-阿拉伯糖，并且在总碳水化合物上产生以比宿主真菌更高的产率生成乙醇。众所周知，可根据被发酵的原材料和用于发酵的真菌的特性优化发酵条件，包括碳源的制备、共底物和其它营养物的加入、以及发酵温度、搅拌、供气、供氮、pH控制、加入的发酵用生物体的量。因此，与宿主真菌相比，经转化的真菌的改善了的性能可通过按照已良好建立的加工工程方法优化发酵条件而得到进一步提高。

使用本发明的经转化的真菌从包含L-阿拉伯糖和其它可发酵糖类的碳源生产乙醇具有几个工业上的优势。这些优势包括每吨碳源产生乙醇的产率更高和发酵材料中乙醇的浓度更高，两者都有助于降低生产例如用作燃料的蒸馏乙醇的成本。此外，因为L-阿拉伯糖的含量降低，来自发酵的废物中的污染物质有所降低，这是一条更清洁的加工方法。

在自然界中，木素纤维素原材料非常丰富，从而为微生物加工提供了可再生和廉价的碳源。含有阿拉伯糖的原材料是例如各种果胶和半纤维素(例如木聚糖)，其包含己醣和戊糖(木糖，阿拉伯糖)的混合物。有用的原材料包括来自纸张和制浆工业的副产品，例如废液和木材水解产物，以及农业副产品，例如糖蔗渣、玉米穗轴、玉米纤维、燕麦、小麦、大麦和水稻谷壳、茎杆及其水解产物。还可利用包含聚合材料的阿聚糖或半乳糖醛酸。

因此，本发明提供了用于表达所述途径中的酶例如L-阿拉伯糖以及可选地磷酸戊糖途径中的酶、以便于在微生物特别是真菌中利用L-阿拉伯糖的有利方法。

实施例

实施例1：筛选在阿拉伯糖中提高的生长

使用酿酒酵母菌株H2651(Richard等人：″The missing link inthe fungal L-arabinose catabolic pathway，identification of theL-xylulose reductase gene″，Biochemistry，41，2002，6432-7)就L-阿拉伯糖中提高的生长对Ambrosiozyma monospora cDNA文库进行筛选。H2651含有真菌L-阿拉伯糖途径的所有基因。将分别编码醛糖还原酶和木糖醇脱氢酶的Pichia stipitis XYL1和XYL2基因整合入URA3基因座。所述菌株也表达编码木酮糖激酶的内源性XKS1基因。编码来自Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei)的L-阿糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的lad1和lxr1基因分别存在于具有LEU2和URA3标记基因的多拷贝表达载体上。

Ambrosiozyma monospora cDNA文库的建立

在含有2％L-阿拉伯糖作为碳源的YNB培养基(Difco)中培养酵母Ambrosiozyma monospora(NRRL Y-1484)。将所述细胞在30℃下培养过夜并通过离心收集。根据厂商说明书使用Trizol reagent试剂盒(Life Technologies Inc.)从细胞中提取总RNA。用Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen)从总RNA中分离mRNA。使用SuperScript cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA并汇集含有cDNA的级分，将其与经SalI-NotI切割的pEXP-AD502载体(Invitrogen)连接。根据厂商说明书，通过在′Gene pulser/micro pulser cuvette′(BioRad)中进行电穿孔将所述连接混合物转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株。温育过夜后，从氨苄青霉素板中汇集大约30 000个独立的集落并在-80℃下贮存于50％甘油+0.9％NaCl中。在从转化体中提取质粒之前，将其在LB培养基中培养4小时以扩增文库。

筛选酿酒酵母的cDNA文库

使用Gietz Lab Transformation试剂盒(Molecular ResearchReagents Inc.)用cDNA文库转化酿酒酵母菌株H2651。将所述转化体在缺少尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸、含有2％葡萄糖作为碳源的选择性培养基上涂板。2天后，将平板复制在含有1％L-阿拉伯糖作为碳源的平板上。从出现的第一批集落中取出质粒，并将其转化入大肠杆菌DH5α菌株。通过用针对pEXP-AD502载体的特异性引物进行PCR来鉴定携带来自文库的质粒的集落，引物f2为：5′-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3′，引物γ为：5′-TAAATTTCTGGCAAGGTAGAC-3′。提取质粒并进行用相同的引物测序。

其中一个克隆含有携带开放阅读框架的质粒，所述阅读框架编码具有272个氨基酸、分子量为29 495Da的蛋白。推测的蛋白质序列与从P.stipitis，白色念珠菌(Candida albicans)和热带念珠菌(Candida tropicalis)中发现的D-阿糖醇脱氢酶具有高度同源性。此外，其与H.jecorina的编码L-木酮糖还原酶的lxr1基因产物具有较低的同源性。A.monospora L-木酮糖还原酶的基因被命名为ALX1。其序列列于SEQ ID NO 1中。

实施例2：酿酒酵母中L-木酮糖还原酶的表达

在用SalI-NotI消化后分离ALX1基因，并将其连接至具有尿嘧啶选择性和PGK1启动子的多拷贝表达载体上。通过将SalI和NotI限制性位点引入多克隆位点，从pFL60产生所述表达载体。所得的质粒被称为p2178。然后将其转化入酿酒酵母菌株CEN.PK2。该菌株被称为H2986，并且如上所述以保藏号DSM 15821作了保藏。

细胞提取物中的酶促测量

使用来自菌株H2986的细胞提取物测试对各种底物的酶促活性。将细胞在选择性葡萄糖培养基上培养过夜，并用Y-PER试剂(Pierce)制备细胞提取物。使用0.5ml所述试剂裂解0.1g细胞。在裂解前，将′不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂(Complete protease inhibitorswithout EDTA)′(Roche)加入到细胞悬浮液中。

在含有100mM Tris-HCl、0.5mM MgCl₂和2mM NAD⁺或2mM NADP⁺的试剂中测量D-阿糖醇和木糖醇的酶促活性。为开始反应，加入100mM糖醇(终浓度)。在30℃下在Cobas Mira自动分析仪(Roche)中进行所有测定。

当糖醇是D-阿糖醇或木糖醇时观察到以糖醇和NAD⁺为底物的活性。针对这些多元醇的活性是相似的。使用只缺少ALX1的相似菌株作为对照。对照菌株显示没有活性。对于表达ALX1的菌株没有观察到对C5糖醇即L-阿糖醇和C6糖醇即D-甘露醇和D-山梨醇的活性。

His标记的NAD-LXR1的纯化

通过使用下列引物进行PCR来扩增基因，从而将含有6组氨酸的组氨酸标记加到蛋白的N末端：5′-GACT GGATCCATCATGCATCATCATCATCATCATATGACTGACTACATTCCAAC-3′和5′-ATGC GGATCCCTATATATACCGGAAAATCGAC-3′。两个引物都具有BamHI位点以便于克隆。将基因克隆入具有PGK1启动子的多拷贝表达载体YEplac195(Verho等人：″Identification of the first fungalNADP-GAPDH from Kluyveromyces lactis″，Biochemistry，41，2002，13833-8)。所得的质粒被称作p2250。将所述基因在酿酒酵母菌株CEN.PK2中表达，并在细胞提取物中用酶活性测量法确定组氨酸标记的蛋白质的活性。为纯化该蛋白质，将表达组氨酸标记的构建体的酵母菌株在含有2％葡萄糖的500ml选择性培养基中培养过夜，收集细胞。如上所述用Y-PER试剂裂解所述细胞，并将裂解产物加入至NiNTA柱(Qiagen)中。

使用纯化的组氨酸标记的蛋白质的酶促测量

与用粗细胞提取物观察到的相似，当糖醇是D-阿糖醇或木糖醇时，观察到了以糖醇和NAD⁺作为底物的活性。对于C5糖醇即L-阿糖醇和侧金盏花醇(核糖醇)以及C6糖醇即卫矛醇(半乳糖醇)没有观察到活性。为起始反应，除了卫矛醇(半乳糖醇)之外，针对所有其它糖醇均加入100mM糖醇(终浓度)。对卫矛醇使用10mM的浓度。当用NADp⁺取代NAD⁺时，没有发现活性。也利用纯化的蛋白测量正向反应。在含有100mM Hepes-NaOH pH 7、2mM MgCl₂和0.2mM NADH的试剂中进行以糖为底物的正向反应的活性测量。除了D-山梨糖外，对所有其它糖类使用50mM终浓度的糖来起始反应。对于D-山梨糖使用10mM的终浓度。在使用糖和NADH为底物的方向上，观察到对L-木酮糖和D-核酮糖的活性。对戊酮糖D-木酮糖观察到显著降低的活性，没有观察到对已酮糖D-山梨糖、L-山梨糖和D-阿洛酮糖和D-果糖的活性。

也利用该纯化的蛋白质来确定酶的米-曼氏常数。针对D-核酮糖的K_m是2,2±0,8mM，针对L-木酮糖的K_m是8,1±0,7mM。针对D-核酮糖的V_max值是1900±330nkat/mg，针对L-木酮糖的Vmax是4100±100nkat/mg。针对木糖醇的上述动力学参数是7,6±1,3mM和220±15nkat/mg，针对D-阿糖醇的上述动力学参数是2,4±0,1mM和210±11nkat/mg。

通过HPLC进行的产物鉴定

也利用纯化的酶来鉴定反应产物。对于正向反应，使用100mMHepes-NaOH pH 7、2mM MgCl₂、2mM NADH、2mM戊酮糖的混合物。在含有100mM Tris-HCl、pH 9、2mM MgCl₂、10mM NAD⁺和20mM多元醇的试剂中鉴定反向反应的产物。将6nkat的酶加入到反应试剂中并在室温下温育3小时。

用HPLC分析鉴定产物。在85℃下用水以0.6ml/分钟的流速流经Aminex Pb柱(Bio-Rad)。用Waters 410 RI检测器检测多元醇和戊酮糖。

因为观察到在还原反应中针对D-核酮糖和L-木酮糖以及在氧化反应中针对木糖醇和D-阿糖醇的主要活性，所以通过HPLC鉴定这些反应中的产物。从L-木酮糖形成了木酮醇。所述分析排除了任何阿糖醇或侧金盏花糖醇(核糖醇)的生成。从D-核酮糖形成阿糖醇。使用的HPLC方法不能够区分L-和D-阿糖醇。在反向方向，从D-阿糖醇形成核酮糖和木酮糖，从木糖醇形成木酮糖。同样，所述方法也不能区别L-和D-木酮糖或L-和D-核酮糖。

                                序列表

<110>Valtion teknillinen tutkimuskeskus

<120>体内和体外利用碳水化合物的新型酶

<130>BP110008

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>816

<212>DNA

<213>Ambrosiozyma monospora

<220>

<223>cDNA

<400>1

atgactgact acattccaac ttttagattc gatggccact taaccattgt cacaggtgcc     60

tgtggtggtt tagctgaagc tttaatcaag ggtttgttgg cctacggttc tgacattgct    120

ttgcttgata tcgaccaaga aaagactgct gccaaacaag ccgaatacca caaatacgct    180

actgaagaat tgaagttgaa agaagttcca aagatgggtt catatgcctg tgatatttct    240

gattctgata ccgttcacaa ggtgtttgct caagttgcta aggattttgg taagttgcca    300

ttgcacttgg ttaacacagc tggttactgt gaaaacttcc catgtgaaga ttacccagcc    360

aagaacgctg agaagatggt gaaggttaac ttgttgggtt ctttgtatgt ttctcaagcc    420

tttgctaagc cattgatcaa agaaggtatc aagggtgctt ctgttgtttt gattggttct    480

atgtctggtg ccattgtcaa cgatcctcaa aaccaagttg tctacaacat gtccaaggct    540

ggtgttatcc atttggctaa gactttggct tgtgaatggg ctaagtacaa catcagagtt    600

aattctttaa acccaggtta catctacggt cctttgacca agaatgttat caatggtaac    660

gaagaattgt acaacagatg gatctctggt atcccacaac aaagaatgtc cgaaccaaag    720

gaatacattg gtgctgtttt gtacttgctt tctgaatctg ctgcttcata cactactggt    780

gccagcttac tggttgatgg tggtttcact tcttgg                              816

<210>2

<211>272

<212>PRT

<213>Ambrosiozyma monospora

<400>2

Met Thr Asp Tyr Ile Pro Thr Phe Arg Phe Asp Gly His Leu Thr Ile

1               5                   10                  15

Val Thr Gly Ala Cys Gly Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ile Lys Gly Leu

            20                  25                  30

Leu Ala Tyr Gly Ser Asp Ile Ala Leu Leu Asp Ile Asp Gln Glu Lys

        35                  40                  45

Thr Ala Ala Lys Gln Ala Glu Tyr His Lys Tyr Ala Thr Glu Glu Leu

    50                  55                  60

Lys Leu Lys Glu Val Pro Lys Met Gly Ser Tyr Ala Cys Asp Ile Ser

65                  70                  75                  80

Asp Ser Asp Thr Val His Lys Val Phe Ala Gln Val Ala Lys Asp Phe

                85                  90                  95

Gly Lys Leu Pro Leu His Leu Val Asn Thr Ala Gly Tyr Cys Glu Asn

            100                 105                 110

Phe Pro Cys Glu Asp Tyr Pro Ala Lys Asn Ala Glu Lys Met Val Lys

        115                 120                 125

Val Asn Leu Leu Gly Ser Leu Tyr Val Ser Gln Ala Phe Ala Lys Pro

    130                 135                 140

Leu Ile Lys Glu Gly Ile Lys Gly Ala Ser Val Val Leu Ile Gly Ser

145                 150                 155                 160

Met Ser Gly Ala Ile Val Asn Asp Pro Gln Asn Gln Val Val Tyr Asn

                165                 170                 175

Met Ser Lys Ala Gly Val Ile His Leu Ala Lys Thr Leu Ala Cys Glu

            180                 185                 190

Trp Ala Lys Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Leu Asn Pro Gly Tyr Ile

        195                 200                 205

Tyr Gly Pro Leu Thr Lys Asn Val Ile Asn Gly Asn Glu Glu Leu Tyr

    210                 215                 220

Asn Arg Trp Ile Ser Gly Ile Pro Gln Gln Arg Met Ser Glu Pro Lys

225                 230                 235                 240

Glu Tyr Ile Gly Ala Val Leu Tyr Leu Leu Ser Glu Ser Ala Ala Ser

                245                 250                 255

Tyr Thr Thr Gly Ala Ser Leu Leu Val Asp Gly Gly Phe Thr Ser Trp

            260                 265                 270

Claims (29)

1.一种分离的DNA分子，其特征在于其包含编码具有NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性的酶蛋白的基因。

2.权利要求1的分离的DNA分子，其特征在于所述酶蛋白具有可逆的将在碳2即C2位置上具有酮基的糖转化成在C2上具有在Fischer投影中处于L-构型的羟基的糖醇的催化活性。

3.权利要求1或2的分离的DNA分子，其特征在于所述酶蛋白包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其功能性等同衍生物。

4.权利要求1至3中任一项的分离DNA分子，其特征在于所述酶蛋白是真菌来源的NADH依赖性L-木酮糖还原酶。

5.权利要求1至4中任一项的分离DNA分子，其特征在于所述真菌来源是Ambrosiozyma monospora。

6.权利要求1至5中任一项的分离DNA分子，其特征在于所述基因包含SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性等同衍生物。

7.权利要求1至6中任一项的分离DNA分子，其特征在于所述NADH依赖性L-木酮糖还原酶表现出可逆的将木酮糖转化为木糖醇的催化活性。

8.包含权利要求1至7中任一项的DNA分子的载体。

9.用权利要求1至7中任一项的DNA分子转化的经遗传修饰的微生物，其用于表达所述NADH依赖性L-木酮糖。

10.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其特征在于其已被权利要求8的载体进行了转化或转染。

11.权利要求9或10的经遗传修饰的微生物，其特征在于其具有利用糖或糖醇的能力。

12.权利要求11的经遗传修饰的微生物，其特征在于其具有利用L-阿拉伯糖的能力。

13.权利要求9至12中任一项的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述微生物产生真菌L-阿拉伯糖途径和/或磷酸戊糖途径的衍生物。

14.权利要求9至13中任一项的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述微生物至少含有真菌L-阿拉伯糖途径中编码醛糖还原酶和L-阿糖醇4-脱氢酶的基因，用于其表达。

15.权利要求14的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述微生物进一步包含真菌L-阿拉伯糖途径中编码D-木酮糖还原酶和/或木酮糖激酶的基因，并可选地包含编码磷酸戊糖途径的酶的基因。

16.权利要求9至15中任一项的经遗传修饰的微生物，其特征在于其产生阿糖醇、木糖醇、乙醇和/或乳酸。

17.权利要求9至16中任一项的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述经遗传修饰的微生物是真菌，优选地选自酵母或丝状真菌。

18.权利要求17的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述酵母是酵母属(Saccharomyces)品种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)品种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)品种、毕赤酵母属(Pichia)品种、念珠菌属(Candida)品种或Pachysolen品种的菌株。

19.权利要求18的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述菌株是酿酒酵母，例如酿酒酵母的经遗传工程改造的菌株。

20.权利要求17的经遗传修饰的微生物，其特征在于所述丝状真菌是曲霉属(Aspergillus)品种、木霉属(Trichoderma)品种、链孢菌属(Neurospora)品种、镰孢属(Fusarium)品种、青霉属(Penicillium)品种、腐质霉属(Humicola)品种，Tolypocladium geodes，Trichodermareesei(Hypocrea jecorina)、毛霉属(Mucor)品种，Trichodermalongibrachiatum，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株，例如其经遗传工程改造的菌株。

21.用于从含有碳水化合物的碳源中产生发酵产物的方法，其特征在于所述方法包括在该碳源存在的情况下在合适的发酵条件下培养权利要求9至20中任一项的经遗传修饰的微生物和可选地回收所述发酵产物的步骤。

22.权利要求21的方法，其特征在于所述碳源含有L-阿拉伯糖，并且所述微生物是权利要求12至15中定义的微生物。

23.权利要求21或22的方法，其特征在于所述碳源含有L-阿拉伯糖，并且所述发酵产物选自真菌L-阿拉伯糖途径的产物和磷酸戊糖途径的产物，优选地选自乙醇、乳酸、木糖醇和/或阿糖醇。

24.一种酶蛋白，所述酶蛋白具有NADH依赖性L-木酮糖还原酶活性，并且包含由权利要求1至7中任一项的DNA分子的基因编码的氨基酸序列。

25.权利要求24的酶蛋白，其特征在于所述酶蛋白含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其功能性等同衍生物。

26.用于从碳源生产转化产物的体外酶促制剂，其特征在于所述制剂含有包含由权利要求1至7中任一项的DNA分子编码的氨基酸序列的酶蛋白。

27.NADH依赖性L-木酮糖还原酶、优选地包含由权利要求1至7中任一项所述DNA分子之基因编码的氨基酸序列的酶用于将在C2位置处具有酮基的糖转化为其中C2位置处的羟基在Fischer投影中处于L-构型的糖醇或用于其反向转化的用途，优选地用于将木酮糖转化为木糖醇或用于其反向转化。

28.权利要求27的用途，其特征在于所述酶是由权利要求9至20中任一项的经遗传工程改造的微生物在使所产生的酶能够进行转化的发酵条件下在发酵介质中产生的，所述发酵介质包含所述糖或相应地糖醇。

29.权利要求27的用途，其特征在于所述转化是体外酶促转化，并且使用权利要求26的体外酶促制剂。

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