JP6847036B2 - アセトインを産生する方法 - Google Patents
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Description
- アセト乳酸シンターゼ又はALSをコードする1つ又は複数の核酸、
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ又はALDをコードする1つ又は複数の核酸、及び
- NADHオキシダーゼ(NOXE)をコードする1つ又は複数のコピーの核酸
が挿入されている。
(I)5'-[遺伝子1]x1-3'及び5'-[遺伝子2]x2-3'及び5'-[遺伝子3]x3-3'、
(II)5'-[遺伝子1]x1-[遺伝子2]x2-3'及び5'-[遺伝子3]x3-3'、
(III)5'-[遺伝子1]x1-[遺伝子2]x2-[遺伝子3]x3-3'、並びに
その組合せ、
(式中:
- 「遺伝子1」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択される核酸を意味し;
- 「遺伝子2」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1とは異なる核酸を意味し;
- 「遺伝子3」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1及び2とは異なる核酸を意味し;
- 「ALS」は、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸であり;
- 「ALD」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であり;
- 「NOXE」は、NADHオキシダーゼをコードする核酸であり;
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50、好ましくは0から20の範囲の整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、ALS、ALD及びNOXEのそれぞれをコードする少なくとも1つの核酸を含む)
を含む群から選択される1つ又は複数のDNA構築物を含んでいてもよい。
(IIa) 5'-[(prom5)y1-遺伝子1-term5]x5-[prom1-遺伝子1-term1]x1-[prom2-遺伝子2-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-遺伝子3-(term3)z2]x3-3'
(式中:
- 遺伝子1、遺伝子2、遺伝子3、「x1」、「x2」及び「x3」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 「x5」は、0又は1に等しい整数を表し;
- 「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、相互に独立に、0又は1に等しい整数を表し;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIa)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、遺伝子1の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 5」は、遺伝子1の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)
を有するDNA構築物を含んでいてもよい。
(IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'
(式中:
- ALS、ALD、NOXE;「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)
を有するDNA構築物を含んでいてもよい。
(IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3';並びに
(IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3'
(式中:
- ALS、ALD、NOXE;「prom1」、「prom2」、「prom3」、「prom5」、「term1」、「term2」、「term3」及び「term5」;「x1」、「x2」及び「x3」;及び「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は各式(IIc)及び(IId)について同一又は異なり;並びに
- 「x6」及び「x7」は、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から12、より詳細には2から5、好ましくは3から4の範囲、及び更に好ましくは(better still)3に等しい整数を表し、但し、「x6」及び「x7」のうちの1つは0を表す)
のDNA構築物を含んでいてもよい。
(a)適切な培養培地において本発明による組換え酵母を培養する工程;及び
(c)アセトインを回収する工程
を含む。
本明細書で使用される、用語「微生物」は、人工的に改変されていない酵母を指す。微生物「アクセプター」に組み込まれ、発現することになる外来の遺伝因子を供する場合、又は遺伝子構築若しくはタンパク質発現のためのツールとして使用される場合に、微生物は「ドナー」となりうる。本発明の微生物は、アセトインの生合成のための遺伝子を発現する酵母のうちから選ばれる。
上述のように、本発明は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する組換え酵母に関し、そのゲノム中には以下のものが挿入されている:
- アセト乳酸シンターゼ又はALSをコードする1つ又は複数の核酸、
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ又はALDをコードする1つ又は複数の核酸、及び
- NADHオキシダーゼ(又はNOXE)をコードする1つ又は複数のコピーの核酸。
(I) 5'-[遺伝子1]x1-3'及び5'-[遺伝子2]x2-3'及び5'-[遺伝子3]x3-3'、
(II) 5'-[遺伝子1]x1-[遺伝子2]x2-3'及び5'-[遺伝子3]x3-3'、
(III) 5'-[遺伝子1]x1-[遺伝子2]x2-[遺伝子3]x3-3'、並びに
その組合せ、
(式中:
- 「遺伝子1」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択される核酸を意味し;
- 「遺伝子2」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1とは異なる核酸を意味し;
- 「遺伝子3」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1及び2とは異なる核酸を意味し;
- 「ALS」は、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸であり;
- 「ALD」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であり;
- 「NOXE」は、NADHオキシダーゼをコードする核酸であり;
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50、好ましくは0から20の範囲の整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、ALS、ALD及びNOXEのそれぞれをコードする少なくとも1つの核酸を含む)
を含む群から選択される1つ又は複数のDNA構築物を含んでいてもよい。
(I) 5'-[ALS]2-3'及び5'-[ALD]2-3'及び5'-[NOXE]3-3'
上記式(I)のDNA構築物を含む組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、そのゲノム中に導入される以下の3つのDNA部分構築物(i)から(iii):
(i)相互に同一又は異なり、2つの核酸を含むDNA部分構築物であって、各核酸はALSをコードし、前記DNA部分構築物は前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入される、DNA部分構築物;
(ii)相互に同一又は異なり、2つの核酸を含むDNA部分構築物であって、各核酸はALDをコードし、前記DNA部分構築物は前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、その位置はALSをコードする核酸を含むDNA部分構築物が挿入されている位置とは別個である、DNA部分構築物;並びに
(iii)相互に同一又は異なり、3つの核酸を含むDNA部分構築物であって、各核酸はNOXEをコードし、前記DNA部分構築物は前記組換え酵母のゲノムにおける第3の位置に導入され、その位置は、それぞれ、ALSをコードする核酸を含むDNA部分構築物及びALDをコードする核酸を含むDNA部分構築物が挿入されている、第1及び第2の位置とは別個である、DNA部分構築物
を有する。
(II) 5'-[ALS]2-[ALD]2-3'及び5'-[NOXE]3-3'
上記式(II)のDNA構築物を含む組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の2つのDNA部分構築物(A)及び(B)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]2-[ALD]2-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)相互に同一又は異なり、各核酸がALSをコードする、2つの核酸;及び
(ii)相互に同一又は異なり、各核酸がALDをコードする、2つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;並びに
(B)第2のDNA部分構築物5'-[NOXE]3-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、その位置が、第1のDNA部分構築物が挿入されている第1の位置から離れており、(iii)相互に同一又は異なり、各々がNOXEをコードする3つの核酸を含む、前記第2のDNA部分構築物。
(III) 5'-[ALS]2-[ALD]2-[NOXE]3-3'
上記式(III)のDNA構築物を含む組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、前記組換え酵母のゲノム中の所望の位置に位置する1つのDNA構築物が挿入されているゲノムを有し、前記DNA構築物は以下のもの:
(i)相互に同一又は異なり、各核酸がALSをコードする、2つの核酸;
(ii)相互に同一又は異なり、各核酸がALDをコードする、2つの核酸;及び
(iii)相互に同一又は異なり、各核酸がNOXEをコードする、3つの核酸
を含む。
- 単一のDNA構築物内の1コピーのALSは、前記DNA構築物に含まれる別のコピーのALSと同一であってもよく又は前記DNA構築物に含有される全ての他のコピーのALSと同一であってもよく、或いは、代わりに前記1コピーのALSは前記DNA構築物に含有される互いのコピーのALSと別個であってもよい。
- 単一のDNA構築物内の1コピーのALDは、前記DNA構築物に含まれる別のコピーのALDと同一であってもよく又は前記DNA構築物に含有される全ての他のコピーのALDと同一であってもよく、或いは、代わりに前記1コピーのALDは前記DNA構築物に含有される互いのコピーのALDと別個であってもよい。
- 単一のDNA構築物内の1コピーのNOXEは、前記DNA構築物に含まれる別のコピーのNOXEと同一であってもよく又は前記DNA構築物に含有される全ての他のコピーのNOXEと同一であってもよく、或いは、代わりに前記1コピーのNOXEは前記DNA構築物に含有される互いのコピーのNOXEと別個であってもよい。
(III) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'、及び
(I) 5'-[ALS]0-3'及び5'-[ALD]0-3'及び5'-[NOXE]12-3'
生じた組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の2つのDNA部分構築物(A)及び(B)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;
(ii)ALDをコードする1つの核酸;及び
(iii)NOXEをコードする1つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;
並びに
(B)第2のDNA部分構築物5'-[ALS]0-3'及び5'-[ALD]0-3'及び5'-[NOXE]12-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、以下のもの:
(i)NOXEをコードする12の核酸
を含む前記第2のDNA部分構築物。
(III-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'、
(III-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'、
(I) 5'-[ALS]0-3'及び5'-[ALD]0-3'及び5'-[NOXE]12-3'
生じた組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の3つのDNA部分構築物(A)、(B)及び(C)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;
(ii)ALDをコードする1つの核酸;及び
(iii)NOXEをコードする1つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;
(B)第2のDNA部分構築物5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;
(ii)ALDをコードする1つの核酸;及び
(iii)NOXEをコードする1つの核酸
を含む前記第2のDNA部分構築物;
並びに
(C)第3のDNA部分構築物5'-[ALS]0-3'及び5'-[ALD]0-3'及び5'-[NOXE]12-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第3の位置に導入され、以下のもの:
(i)NOXEをコードする12の核酸
を含む前記第3のDNA部分構築物。
(II-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-3'及び5'-[NOXE]0-3'、
(II-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-3'及び5'-[NOXE]0-3'、
(I) 5'-[ALS]0-3'及び5'-[ALD]0-3'及び5'-[NOXE]12-3'
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]1-[ALD]1-3'及び5'-[NOXE]0-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;及び
(ii)ALDをコードする1つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;
(B)第2のDNA部分構築物5'-[ALS]1-[ALD]1-3'及び5'-[NOXE]0-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;及び
(ii)ALDをコードする1つの核酸
を含む前記第2のDNA部分構築物;
並びに
(C)第3のDNA部分構築物5'-[NOXE]12-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第3の位置に導入され、その位置が、第1のDNA部分構築物が挿入されている第1の位置から離れており、(iii)相互に同一又は異なり、各々がNOXEをコードする、12の核酸を含むDNA部分構築物。
(IIa) 5'-[(prom5)y1-遺伝子1-term5]x5-[prom1-遺伝子1-term1]x1-[prom2-遺伝子2-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-遺伝子3-(term3)z2]x3-3'
(式中:
- 遺伝子1、遺伝子2及び遺伝子3、「x1」、「x2」及び「x3」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 「x5」は、0又は1に等しい整数を表し;
- 「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、相互に独立に、0又は1に等しい整数を表し;
- 前記組換え酵母が式(IIa)の少なくとも2つのDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよい又は異なっていてもよい;
- 「prom 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、遺伝子1の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;及び
- 「term 5」は、遺伝子1の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)
を有するDNA構築物を含んでいてもよい。
・「x5」が1に等しい整数であり、「y1」が0に等しい整数を表す場合、考慮される遺伝子1が、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子のプロモーターの制御下にあることを意味する;又は
・「x5」が1に等しい整数であり、「y1」が1に等しい整数を表す場合、考慮される遺伝子1が、プロモーター「prom5」の制御下にあることを意味する。これに関して、DNA構築物が挿入される、内因性遺伝子の、好ましくはpdc遺伝子のプロモーターの配列は、排除される又は少なくとも中断され、並びにその関連するコード領域の配列である。
・「y2」が0に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子のプロモーターの制御下にあることを意味する;又は
・「y2」が1に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、プロモーター「prom3」の制御下にあることを意味する。これに関して、DNA構築物が挿入される、内因性遺伝子のプロモーターの配列は、排除される又は少なくとも中断される、並びにその関連するコード領域の配列である。
・「z2」が0に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子の転写ターミネーターに連結されることを意味する;又は
・「z2」が1に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、転写ターミネーター「term3」に連結されることを意味する。これに関して、DNA構築物が挿入される、内因性遺伝子の転写ターミネーターの配列は、排除される又は少なくとも中断され、並びにその関連するコード領域の配列である。
(IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'
(式中:
- ALS、ALD、NOXE、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)。
(IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3';並びに
(IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD--(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3';
(式中:
- ALS、ALD、NOXE、「prom1」、「prom2」、「prom3」、「prom5」、「term1」、「term2」、「term3」、「term5」、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;並びに
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は各式(IIc)及び(IId)について同一又は異なり;並びに
- 「x6」及び「x7」は、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から12、より詳細には2から5、好ましくは3から4の範囲、及び更に好ましくは3に等しい整数を表し、但し、「x6」及び「x7」のうちの1つは0を表す)。
・本発明の1つのDNA構築物に関して、「x1」、「x2」及び/若しくは「x3」は、2以上の整数を表し:
o遺伝子1、遺伝子2及び/若しくは遺伝子3のうちの関連する核酸についての各コピーは、同一であってもよく若しくは異なっていてもよく;並びに/又は
o遺伝子1、遺伝子2及び/若しくは遺伝子3のうちの関連する核酸についての各コピーについてのプロモーター及び/若しくはターミネーターは、同一であってもよく若しくは異なっていてもよく;
・組換え酵母が少なくとも2つのDNA構築物を含む場合、前記少なくとも2つのDNA構築物は、以下のことに関して、同一であってもよく又は異なっていてもよい:
(i)DNA構築物が式(I)から(III)を含む群のうちから選択される式により特徴付けられうる、それらの一般式;
(ii)「x1」から「x3」及び「x5」から「x7」、「y1」、「y2」、「z1」及び/若しくは「z2」の値;
(iii)同じ遺伝子に関するプロモーターの性質;
(iv)同じ遺伝子に関するターミネーターの性質;並びに/又は
(v)ALS、ALD及びNOXEが、特に以下Table 1(表1)に示されるように、異なる属に属する生物から由来しうる、同じ遺伝子それ自体の性質。
酵母における内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換し、これは次にエタノールに又はアセチル-CoAにアセテートを経て変換される。
アセト乳酸シンターゼ(ALS)酵素(アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、α-アセトヒドロキシ酸シンセターゼ、α-アセトヒドロキシ酸シンターゼ、α-アセト乳酸シンターゼ、α-アセト乳酸シンセターゼ、アセトヒドロキシ酸シンセターゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸ピルビン酸リアーゼ(カルボキシル化)、アセト乳酸シンセターゼとしても知られている)は、分枝状鎖アミノ酸(バリン、ロイシン、及びイソロイシン)の合成における第1のステップを触媒するタンパク質である。
アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALD)酵素(α-アセト乳酸デカルボキシラーゼ、(S)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソブタノエートカルボキシ-リアーゼ、(S)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソブタノエートカルボキシ-リアーゼ[(R)-2-アセトイン-形成]又は(S)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソブタノエートカルボキシ-リアーゼ[(3R)-3-ヒドロキシブタン-2-オン-形成]としても知られている)は、リアーゼのファミリー、具体化には炭素間結合を切断し、ブタノエート代謝及びc5-分枝二塩基酸代謝に参加するカルボキシリアーゼに属する。
少なくとも1つのpdc遺伝子の活性の不活性化又は減少は、酵母におけるエタノール発酵経路を不活化又は減少させる。結果として、このことにより、ALS及びALDの発現によって解放されないアンバランスなレドックス状態が誘導される。実際、グルコースから2ピルビン酸への経路は、2NADH均等物を生成し、他方では、2ピルビン酸からアセトインへの転換はNADHからNAD+にリサイクルしない(図1を参照されたい)。
2NADH + 1/2O2 → 2NAD+ + H2O
明らかな理由のため、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びNADHオキシダーゼをコードする核酸のそれぞれは、同一又は異なる、プロモーターの制御下にある。
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からpADH1(ADH1遺伝子=配列番号32)、
・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からpTDH3(TDH3遺伝子=配列番号39)、
・翻訳伸長因子EF-1アルファをコードする遺伝子からpTEF2.Kl(TEF2遺伝子=配列番号30)、
・グリセリン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子からpGPM1(GPM1遺伝子=配列番号33)、
・ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子からpPDC1(PDC1遺伝子=配列番号35)、
・エノラーゼIIをコードする遺伝子からpENO2(ENO2遺伝子=配列番号29)、
・翻訳伸長因子eEF1Bのガンマサブユニットをコードする遺伝子からpTEF3(TEF3遺伝子=配列番号31)、
・フルクトース1,6-二リン酸エステルアルドラーゼIIをコードする遺伝子からpFBA1(FBA1遺伝子=配列番号34)、
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子からpPGK1(PGK1遺伝子=配列番号36)、
・ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子からpPYK1(PYK1遺伝子=配列番号49)、
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からpTPI1(TPI1遺伝子=配列番号50)、又は
・翻訳伸長因子EF-1アルファをコードする遺伝子からpTEF1(TEF1遺伝子=配列番号38)。
明らかな理由のため、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びNADHオキシダーゼをコードする核酸のそれぞれは、同一又は異なる、転写ターミネーター(本明細書において「ターミネーター」とも称されうる)に連結される。
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からtTPI1(TPI1遺伝子=配列番号44)、
・O-アセチルホモセリン-O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子からtMET25(Met25遺伝子=配列番号45)、
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からtADH1(ADH1遺伝子=配列番号43)、
・エノラーゼIIをコードする遺伝子からtENO2(ENO2遺伝子=配列番号46)、
・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム2をコードする遺伝子からtTDH2(TDH2遺伝子=配列番号40)、
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子からtPGK1(PGK1遺伝子=配列番号48)、
・tCYC1(=配列番号41)、
・tMET3(=配列番号47)、及び
・tTDH3(=配列番号42)、及び
・tDIT1(=配列番号43)。
一般に、酵母は、急速に増殖することができ、細菌と比較して高密度で培養することができ、産業上の設定において無菌的な環境を必要としない。更に、酵母細胞は、産物抽出及び精製のための非常に単純化されたプロセスで、細菌細胞と比較して、培養培地からより容易に分離することができる。
有利には、本発明において施行される酵素をコードする核酸は、ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea、NOXE.spn、NOXE.Ll及びそれらの混合物のうちから有利に選ばれる。
- 1つのpdc遺伝子、好ましくはpdc1遺伝子は、以下の式(IIe):
5'-[(prom5)y1-ALS.Bs-term5]x5-[prom1-ALS.Bs-term1]x1-[prom2-ALD.Ll-(term2)z1]x2-3' (IIe)
のDNA構築物の挿入によって破壊される、及び
- 上述の破壊されたpdc遺伝子と別個に、少なくとも他のpdc遺伝子、及び好ましくはpdc6遺伝子は、以下の式(IIf'):
5'-[(prom5)y1-ALS.Pp-term5]x5-[prom1-ALS.Pp-term1]x1-[prom2-ALD.Ea-(term2)z1]x2-3' (IIf')
のDNA構築物の挿入によって破壊される、
並びに、ここで、以下の式(IIf''):
5'-[(prom3)y2-NOXE.Ll-(term3)z2]x3-3' (IIf'')
のDNA構築物は、URA3遺伝子に挿入され、
式中:
- prom1、prom2、prom3、prom5、term1、term2、term3、term5、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定され、ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea及びNOXE.Llは、例えば、以下のTable 1(表1)で規定され、
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から10、より詳細には0から3の範囲の、及び特に1に等しい整数を表し;
- 「x3」は、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から12、より詳細には2から5、好ましくは3から4の範囲、及び更に好ましくは3に等しい整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、各ALS、ALD及びNOXEをコードする少なくとも1つの核酸を含み、但し、より詳細には式(IIe)及び(IIf')の各DNA構築物は、ALS及びALDをコードするそれぞれの少なくとも1つの核酸を含む。
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」;並びに/又は
- 考慮される遺伝子についての各コピーの核酸についてのプロモーター及び/又はターミネーターは、同一であってもよく又は異なっていてもよいことが特定される。
- 1つのpdc遺伝子、好ましくはpdc1遺伝子は、以下の式(IIg):
5'-[ALS.Bs-tTDH2]1-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]1-3' (IIg)
のDNA構築物の挿入によって破壊され、
- 上述の破壊されたpdc遺伝子と別個に、少なくとも他のpdc遺伝子、及び好ましくはpdc6遺伝子は、以下の式(IIh'):
5'-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]1-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]1-3' a (IIh')
のDNA構築物の挿入によって破壊され、
並びに、ここで、以下の式(IIh'')のDNA構築物:
5'-[pENO2-NOXE. Ll-tPGK1]12-3' (IIh'')
は、URA3遺伝子に挿入され、
ここで:
- 式(IIg)のDNA構築物の「ALS.Bs」遺伝子は、式(IIg)の前記DNA構築物が挿入される、pdc遺伝子のプロモーターの制御下にあり、
- pENO2、pADH1、pTDH3、tTDH2、tCYC1、tDPI1、tMET25及びtPGK1は、例えば、本記載において、並びに、より詳細には以下の配列表において規定され、
- ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea及びNOXE.Llは、例えば、以下のtable 1(表1)において、並びに、より詳細には以下の配列表において規定される。
糖の代替供給源、例えば、デンプンの直接的な使用は、外因性α-アミラーゼ及びグルコアミラーゼの酵母における過剰発現を更に必要とする(busckeら、biosource technology 2013)。
組換え微生物によるペントースの取込み輸送は、産業上のプロセスについての重要な課題であり、その理由は、C5糖が、加水分解されたリグノセルロース性バイオマスの主要な構成要素であるからである。多くの他のタイプの酵母の様な出芽酵母の天然の株は、発酵基質としてキシロース又はアラビノースのいずれも利用することができない(Hahn-Hagerdalら、2007;Jinら、2004)。興味深いことに、その株は、キシロースが天然の基質ではないとしても、その糖を取り込むことが可能である(Hamacherら、2002)。
キシロース及びアラビノース取込みを改善するために、組換えアセトイン産生株は、キシロース又はアラビノーストランスポーターをコードする異種遺伝子を発現するため改変されなければならない。例えば、カンジダインターメディア(Candida intermedia)、ピキアスティピティス(Pichia stipitis)及びシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のそれぞれからの遺伝子GXF1、SUT1及びAT5g59250は、酵母によるキシロース利用を改善するため過剰発現される(Runquistら、2010)。
酵母株は、キシロースが天然の基質ではないとしても、その糖を取込むことが可能である。キシロース同化作用についての遺伝子が出芽酵母中に存在するとしても、それらは有意な糖同化作用を可能にする十分なレベルで発現されない。したがって、遺伝的な改変は、ペントース糖の同化作用を改善するため必要である。キシロース又はアラビノースのキシリトールへの転換を可能にする全ての酵素が増強されること並びにキシリトールをキシルロースに及びキシルロースをキシルロース-5-リン酸に変換する酵素が必要である。キシロース及びアラビノース経路からの相同遺伝子は過剰発現されなければならないか又は細菌からの異種遺伝子は過剰発現されなければならないかのいずれかである。
1)P.スティピティスからのキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするXYL2の過剰発現と関連させ、それぞれ出芽酵母及びP.スティピティスからのキシルロキナーゼをコードする遺伝子XKS1又はXYL3の過剰発現と組み合わせた、それぞれP.スティピティス及び出芽酵母のアルドラーゼレダクターゼをコードする遺伝子XYL1又はGRE3、
2)それぞれ出芽酵母及びP.スティピティスからのキシルロキナーゼをコードする遺伝子XKS1又はXYL3の過剰発現と関連させた細菌又はピロマイセス(Piromyces)からのキシロースイソメラーゼをコードする遺伝子xylA。
1)トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)からのL-アラビニトール4-ヒドロゲナーゼをコードするladl及びL-キシルロースレダクターゼをコードするIxrlと関連させ、P.スティピティスからのキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするXYL2の過剰発現、並びに、加えて、それぞれ出芽酵母及びP.スティピティスからのキシルロキナーゼをコードする遺伝子XKS1又はXYL3の過剰発現と組み合わせた、それぞれP.スティピティス及び出芽酵母のアルドラーゼレダクターゼをコードする相同遺伝子XYL1又はGRE3、
2)細菌性アラビノースイソメラーゼ及びリブロースキナーゼをコードする異種遺伝子araA及びaraB。
これは、酵母株からの非酸化的ペントースリン酸経路に属する少なくとも1つの遺伝子;TALI、TKL1、RKL1及びRPE1を過剰発現によって行うことができる。
これは、酵母株において大腸菌のトランスヒドロゲナーゼ発現させることによって達成される。大腸菌からの遺伝子udhA及び/又はpntABは、産生株中で過剰発現される。
これは、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼEC1.1.1.8.(GPDH)をコードするGPD1遺伝子の破壊によって行うことができる。
本発明はまた、アセトイン及び/又はその誘導体、特にメチルビニルケトン(MVK)の産生のための、例えば、上記で規定される、組換え酵母の使用に関する。
- 前に述べたような組換え微生物を用意する工程、炭素の供給源を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程、及び
- アセトインを回収する工程。
本発明の特定の態様によると、アセトインの発酵性産生は、培養培地からのアセトインの単離の工程を含む。培養培地からアセトインを回収する工程は、当業者にとってルーチン作業である。蒸留、ガスストリッピング、浸透気化法又は液体抽出を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において周知される幾つかの技術によって達成されてもよい。当該分野における専門家は、どのようにして分離される物質の特徴に依存して各技術のパラメータに適合させるかについて知っている。
全ての以下の施行される組換え出芽酵母株を、標準株W303(Thomas及びRothstein (1989)、Cell. 56、619-630)から標準的な酵母分子遺伝学手順(Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke、D. Dawson、T. Stearns CSHL Press)を用いて構築した。
- ade2、his3、leu2、trp1及びura3は、栄養要求性マーカー遺伝子である。
- 小文字は考慮される遺伝子が不活性であることを意味し、大文字は活性遺伝子を反映している。
- 遺伝子名に続く「::」:は、遺伝子が、続くものによって中断されることを意味する(一を超える遺伝子が挿入される場合に、それらは角型括弧[]中に注記される)。遺伝子の中断は、コード配列の全体的な欠失が付随するが、しかし、プロモーターは保存される。結果として、「::」が続く遺伝子は、不活性であり、小文字で注記される。特定されない場合に、挿入される遺伝子の転写は、破壊された遺伝子のプロモーターによって制御される。
- 「遺伝子.Kl」は、遺伝子が、クライベロマイセスラクティスに由来することを意味する。
- 所与の遺伝子の構成的な過剰発現を可能にする転写プロモーターは、文献(velculescuら、(1997) Cell 88、243-251)中に見出される。本明細書に使用されるプロモーターは、「p」と続くそれらの同族遺伝子名によって指定される。それらそれぞれの配列番号も、以下に記述される。
- 転写ターミネーターも、各遺伝子の後に配置される。不用な制御プロモーター及びターミネーター枠を回避するため、ある挿入される遺伝子は、同じオリジナル遺伝子から取得されなかった。本明細書に使用されるターミネーターは、「t」と続くそれらの同族遺伝子名によって指定される。それらそれぞれの配列番号も、以下に記述される。
ALS及びALD酵素は、個々に評価せず、アセトインの収率を通じて、ペア(ALS+ALD)で評価した。3つの外因性ALD及びALSを、それらの動力学的なパラメータに従って選び、ALS.Nt、ALS.Pp、ALS.Bs及びALD.Bb、ALD.Ll、ALD.Eaとした(上記を参照されたい)。
YA747: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::HIS5.Sp、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3.
YA768: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1:: [-ALS.Bs-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
NB:このケースでは、遺伝子「ALS.Bs」は、pdc1の天然プロモーター、すなわちプロモーターpPDC1の制御下にある。
YA769: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1:: [-ALS.Nt-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA770: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA771: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1、pTDH3-ALD.Bb-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA772: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[- ALS.Nt-tTPI1、pTDH3-ALD.Ll-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA773: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ll-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA810: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTPI1、pTDH3-ALD.Bb-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA811: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Bb-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
以下のTable 2(表2)は、上述の検査した株のアセトイン産生を示す。
YA1609による組換え酵母が、調製されている。
YA1609: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2- pENO2-ALD.Ll- tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
結果は、以下のTable 3(表3)に報告される。
環境:0.5l YPA、16%グルコース。
細胞培養の開始の16時間後、細胞を、16% w/wグルコースの最終濃度を含む培養培地中で8時間の期間インキュベートした。
撹拌:800rpm(2枚羽根)、1.9ms-1
温度:30℃
空気:0.15L/分(0.3vvm)
結果は、以下のTable 4(表4)に報告される。
更なる組換え酵母が、調製され、以下に記載される。
YA1573-4: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
YA1609-4: MAT-a,his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
YA1661-2: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、pENO2-NOXE.Spn-tPGK1]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12.
結果は、以下のTable 5(表5)に報告される。
以下の内因性bdh1、bdh2、adh1、adh3及び/又はadh4遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子が、不活化されてもよい。幾つかの株において、栄養要求性マーカーを再導入して、それらを原栄養体とした。それらは、全てYA1660と比べ同じプロモーター及びターミネーターを有する:
YA1660-2、YA1660-3、YA1660-4、及びYA1711-16C: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、pENO2-NOXE.Spn-tPGK1、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12.
YA1711-45c : Mat-α、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、pENO2-NOXE.Spn-tPGK1、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
YA1711-13A、YA1711-16B: Mat-a、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1711-19A及びYA1711-46A: Mat-α、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1822-1及びYA1822-2: Mat-α、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1::TRP1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA 1870-10A: Mat-a、adh3::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA 1870-11B: Mat-α、adh3::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1870-10B: Mat-α、adh1::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1870-11A: Mat-α、adh1::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1870-2A及びYA1870-3D: Mat-a、adh1::TRP1.Kl、adh3::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp-loxP]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl-loxP]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
株YA1711-19Aを、3l発酵槽中、酵母抽出物2%、スクロース10%中で、0から24時間増殖させ、次に600gのグルコースをゆっくりと添加した(30g/lで20時間)。
Claims (15)
- 対応する非組換え酵母と比較して減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する、Saccharomyces cerevisiae(サッカロマイセス・セレビシエ)種に属する組換え酵母であって、そのゲノム中に:
- アセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードする1つ又は複数の核酸、
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALD)をコードする1つ又は複数の核酸、並びに、
- 核酸配列の配列番号13又は15を有する核酸配列を有する、NADHオキシダーゼ(NOXE)をコードする1つ又は複数のコピーの核酸
が挿入されている組換え酵母。 - 以下の式を含む群から選択される1つ又は複数のDNA構築物を含む、請求項1に記載の組換え酵母:
(I) 5'-[遺伝子1]x1-3'及び5'-[遺伝子2]x2-3'及び5'-[遺伝子3]x3-3'、
(II) 5'-[遺伝子1]x1-[遺伝子2]x2-3'及び5'-[遺伝子3]x3-3'、
(III) 5'-[遺伝子1]x1-[遺伝子2]x2-[遺伝子3]x3-3'、並びに
その組合せ、
(式中:
- 「遺伝子1」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択される核酸を意味し;
- 「遺伝子2」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1とは異なる核酸を意味し;
- 「遺伝子3」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1及び2とは異なる核酸を意味し;
- 「ALS」は、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸であり;
- 「ALD」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であり;
- 「NOXE」は、NADHオキシダーゼをコードする核酸であり;
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50の範囲の整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、ALS、ALD及びNOXEのそれぞれをコードする少なくとも1つの核酸を含む)。 - 少なくとも1つの式(II)のDNA構築物を含み、「遺伝子3」がNADHオキシダーゼをコードする核酸を意味する、請求項2に記載の組換え酵母。
- 同一又は異なる、少なくとも1つの式(IIa)のDNA構築物を含み、各式(IIa)が以下の式を有する、請求項2に記載の組換え酵母:
(IIa) 5'-[(prom5)y1-遺伝子1-term5]x5-[prom1-遺伝子1-term1]x1-[prom2-遺伝子2-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-遺伝子3-(term3)z2]x3-3'
(式中:
- 遺伝子1、遺伝子2及び遺伝子3は、請求項2又は3に規定したものであり、「x1」、「x2」及び「x3」は、請求項2に規定したものであり;
- 「x5」は、0又は1に等しい整数を表し;
- 「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、相互に独立に、0又は1に等しい整数を表し;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIa)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom5」は、遺伝子1の発現を制御する制御配列であり、前記prom5はprom1と同一又は異なり;
- 「term1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term5」は、遺伝子1の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term5はterm1と同一又は異なる)。 - 同一又は異なる、少なくとも1つの式(IIb)のDNA構築物を含み、各式(IIb)が以下の式を有する、請求項2に記載の組換え酵母:
(IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'
(式中:
- ALS、ALD及びNOXEは、請求項1に規定したものであり;「x1」、「x2」及び「x3」は、請求項2に規定したものであり;「x5」及び「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、請求項4に規定したものであり;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり、前記prom5はprom1と同一又は異なり;
- 「term1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term5はterm1と同一又は異なる)。 - 少なくとも2つの、式(II)、請求項4に規定される式(IIa)、又は、請求項5に規定される式(IIb)のDNA構築物を含み、但し、NOXEの核酸の全てのコピーは、少なくとも2つの式(II)、(IIa)又は(IIb)のDNA構築物の1つに位置する、請求項2に記載の組換え酵母。
- 少なくとも2つの、以下の式(IIc)及び(IId)のDNA構築物を含む、請求項2に記載の組換え酵母:
(IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3';並びに
(IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3'及び5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3';
(式中:
- ALS、ALD及びNOXEは、請求項1に規定したものであり;「prom1」、「prom2」、「prom3」、「prom5」、「term1」、「term2」、「term3」及び「term5」は、請求項4から5のいずれか一項に規定したものであり;「x1」、及び、「x2」は、請求項2に規定したものであり;「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、請求項4に規定したものであり;
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は各式(IIc)及び(IId)について同一又は異なり;並びに
- 「x6」及び「x7」は、0から50の範囲の整数を表し、但し、「x6」及び「x7」のうちの1つは0を表す)。 - アセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードする核酸は、核酸配列の配列番号1、3及び5からなる群から選択される核酸である、請求項1に記載の組換え酵母。
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALD)をコードする核酸は、核酸配列の配列番号7、9及び11からなる群から選択される核酸である、請求項1に記載の組換え酵母。
- ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つのpdc遺伝子の破壊によって減少される、請求項1に記載の組換え酵母。
- ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、請求項2に規定される式(I)から(III)を含む群から選択される少なくとも1つのDNA構築物の挿入によって減少される、請求項10に記載の組換え酵母。
- 少なくともNOXE遺伝子を含む式(I)から(III)を含む群から選択されるDNA構築物は、前記組換え酵母の内因性URA3遺伝子に挿入される、請求項2に記載の組換え酵母。
- アセトイン又はメチルビニルケトンの産生のための、請求項1に記載の組換え酵母の使用。
- (a)請求項1に記載される組換え酵母を適切な培養培地において培養する工程;及び
(c)アセトインを回収する工程
を含む、アセトインを産生する方法。 - 前記培養培地は炭素源を含む、請求項14に記載の方法。
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