BR112017001542B1 - Levedura recombinante produtora de acetoína, uso desta e método para produzir acetoína - Google Patents

Abstract

LEVEDURA RECOMBINANTE PRODUTORA DE ACETOÍNA, USO DESTA E MÉTODO PARA PRODUZIR ACETOÍNA. Levedura recombinante, caracterizada pelo fato de que possui uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida no genoma do qual foi inserida: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma síntese de acetolactato ou ALS, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um acetolactato decarboxilase ou ALD, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um butanodiol desidrogenase ou BDH, e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando um NADH oxidase ou NOXE.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito a microrganismos com uma via de acetoína melhorada. O microrganismo recombinante é modificado para melhorar a produção de acetoína comparado ao microrganismo não modificado. A invenção também provê métodos para usar tais microrganismos para produzir acetoína.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] Acetoína, também conhecida como 3-hidroxibutanona ou acetil metil carbinol, é formada em bactérias a partir de piruvato pela ação das duas enzimas, ou seja, α-acetolactato sintase, que catalisa a condensação de duas moléculas de piruvato com uma única descarboxilação para render α-acetolactato e α-acetolactato descarboxilase que descarboxila este último para acetoína (Juni, 1952).

[0003] Acetoína é um sabor comumente usado na indústria alimentícia onde substitui diacetil porque é considerado como o mais seguro (Huang, 2011). Acetoína é usada como ingrediente aromático em formulações para aromas de framboesa, morango, baunilha, nozes, rum, manteiga, doce de manteiga (butterscotch), caramelo, coco, café e frutas. Acetoína pode ser adicionada a bebidas alcoólicas e não alcoólicas, tais como refrigerante. Seu sabor amanteigado é adequado para sorvete, gelos, doces, produtos de panificação, margarina, gelatinas, queijo cottage, margarina e gorduras. Acetoína também é usada pela indústria de cosméticos em perfumes e fragrâncias como um portador de aroma. Finalmente, a acetoína é um dos melhores aditivos químicos em cigarros e como um agente de sabor em cigarros eletrônicos. Além disso, a acetoína é um precursor de metil vinil cetona (MVK), que é um intermediário útil para química.

[0004] A síntese química tradicional de acetoína enfrentou o inconveniente da deficiência de petróleo e poluição ambiental, enquanto o mercado para acetoína como um sabor de alimento ainda está crescendo atualmente por uma taxa anual de 5 a 5,5% e deve chegar a US$ 14 bilhões em 2018. O mercado de fragrância deve exceder US$ 16 bilhões em 2018.

[0005] Muitos químicos que poderiam apenas ser produzidos por processos químicos tradicionais no passado agora possuem o potencial de serem gerados biologicamente usando recursos renováveis (Danner & Braun, 1999; Hatti-Kaul et al., 2007). Produção microbiana de acetoína é um exemplo. Interesse neste bioprocesso aumentou significativamente porque a acetoína possui um alto número de aplicações industriais, como mencionado acima, e produção microbiana aliviará a dependência de fornecimento de óleo para a produção de plataformas químicas. Saccharomyces cerevisiae é uma plataforma especialmente adequada para tais bioprocessos (Nielsen 2013) no que se refere à produção microbiana de acetoína, a maioria dos estudos utilizaram microrganismos, tais como Candida glabrata, Bacillus subtilis, para produzir acetoína (Shubo Li et al., Microbial Cell Factories 2014, 13:55; Silbersack J et al., Appl Microbiol Biotechnol., dezembro de 2006; 73(4):895-903;

[0006] Produção de acetoína por um microrganismo GRAS (por exemplo, geralmente reconhecido como seguro) seria, deste modo, desejável. Levedura e, mais particularmente, Saccharomyces cerevisiae, é um microrganismo apropriado neste contexto. S. cerevisiae é conhecida por produzir acetoína de modo natural, mas a produção e produtividade de produção de acetoína são pobres. Produção de etanol é, certamente, a barreira mais óbvia para a produção eficiente de acetoína em S. cerevisiae porque o piruvato, um intermediário chave, é preferencialmente usado para a produção de etanol em vez de acetoína.

[0007] Portanto, por razões óbvias, melhorar a produção de acetoína através de processos microbianos e mais particularmente da conversão de piruvato para acetoína, permanece um objetivo constante. Mais particularmente, ainda há uma necessidade de um microrganismo recombinante estável com um rendimento de produção melhorado de acetoína, particularmente compatível com requisitos de industrialização.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, no genoma da qual foi inserida: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato sintase ou ALS, - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato descarboxilase ou ALD e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando uma NADH oxidase (NOXE).

[0009] De acordo com uma modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, pode compreender um ou mais construtos de DNA selecionados a partir de um grupo compreendendo as seguintes fórmulas: (I) 5'-[Gene 1]xi-3‘ e 5'-[Gene 2]x2-3' e 5'-[Gene 3]x3-3', (II) 5'-[Gene 1]xi-[Gene 2]x2-3' e 5'-[Gene 3]x3-3', (III) 5'-[Gene i]xi-[Gene 2]x2-[Gene 3]x3-3', e uma combinação destes, em que: - "Gene 1" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD ou NOXE; - "Gene 2" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD ou NOXE, mas diferente do gene 1; - "Gene 3" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD ou NOXE, mas diferente dos genes 1 e 2; - "ALS" é um ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase; - "ALD" é um ácido nucleico codificando uma acetolactato descarboxilase; - "NOXE" é um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase; - cada um dentre "x1", "x2" e "x3", um independentemente dos outros, representa um número inteiro variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, e desde que dita levedura recombinante compreenda pelo menos um ácido nucleico codificando cada uma dentre ALS, ALD e NOXE.

[0010] Preferencialmente, cada um dentre "x1", "x2" e "x3", independentemente entre si, representa um número inteiro que varia de 0 a 15, o qual inclui de 0 a 12, mais particularmente que varia de 0 a 5, particularmente variando de 0 a 3, e ainda representa melhor um número inteiro igual a 1.

[0011] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois construtos de DNA de fórmula mencionada acima (II) idênticos ou diferentes, em que "Gene 3" significa um ácido nucleico codificando NADH oxidase.

[0012] De acordo com ainda outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, construtos de DNA de fórmula (IIa), idênticos ou diferentes, em que cada fórmula (IIa) possui a seguinte fórmula: (IIa) 5'-[(prom5)y1-Gene 1-term5]x5-[prom1-Gene 1-term1]x1-[prom2- Gene 2-(term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-Gene 3-(term3)z2]x3-3‘ em que: - Gene 1, Gene 2, Gene 3, "x1", "x2" e "x3" são tais como definidos acima; - "x5" representa um número inteiro igual a 0 ou 1; - "y1", "y2", "z1" e "z2", um independentemente dos outros, representam um número inteiro igual a 0 ou 1; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (IIa), então "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" podem ser idênticos ou diferentes; - "prom 1" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando o gene 1; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando o gene 2; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando o gene 3; - "prom5" é uma sequência reguladora que controla a expressão de Gene 1, dito prom5 sendo idêntico ou diferente de prom1; - "term1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando o gene 1; - "term2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando o gene 2; - "term3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando a o gene 3; - "term5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de Gene 1, dito term5 sendo idêntico ou diferente de term1.

[0013] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, construtos de DNA de fórmula (IIb), idênticos ou diferentes, em que cada fórmula (IIb) possui a seguinte fórmula: (IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD- (term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3‘ em que: - ALS, ALD, NOXE, "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" são tais como definidos acima; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (IIb), então "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" podem ser idênticos ou diferentes; - "prom 1" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando a acetolactato sintase; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando acetolactato descarboxilase; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando a NADH oxidase; - "prom 5" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando acetolactato sintase, dito prom5 sendo idêntico ou diferente de prom1; - "term 1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando acetolactato sintase; - "term 2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando acetolactato descarboxilase; - "term3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando a NADH oxidase; e - "term5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando acetolactato sintase, dito term5 sendo idêntico ou diferente de term1.

[0014] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb), desde que todas as cópias de ácido nucleico de NOXE estejam localizadas em um único dentre pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb).

[0015] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois, preferencialmente exatamente dois construtos de DNA das seguintes fórmulas (IIc) e (IId): (IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD- (term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3‘; e (IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD- (term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3'; em que: - ALS, ALD, NOXE, "prom1", "prom2", "prom3", "prom5", "term1", "term2", "term3" e "term5"; "x1", "x2", "x3" e "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" são tais como definidos acima; - "x1" a "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" para cada uma das fórmulas (IIc) e (IId) sendo idênticos ou diferentes; e - "x6" e "x7" representam números inteiros variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 12, mais particularmente de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4 e ainda melhor igual a 3, desde que um dentre "x6" e "x7" represente 0.

[0016] Esta invenção também diz respeito ao uso de uma levedura recombinante de acordo com a presente invenção, para a produção de acetoína e/ou derivados destes, os quais englobam metil vinil cetona.

[0017] A invenção também diz respeito a um método para a produção de acetoína, dito método compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, em um meio de cultura apropriado; e (c) recuperar a acetoína.

[0018] Preferencialmente, o dito meio de cultura compreende uma fonte de carbono, preferencialmente selecionada em um grupo compreendendo glicose e sacarose.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] A Figura 1 mostra a via metabólica em uma cepa de levedura recombinante de modo a substituir a produção de etanol em prol de acetoína.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0020] O termo "microrganismo", como usado neste documento, refere-se a uma levedura que não é modificada artificialmente. O microrganismo pode ser "doador" se prover elemento genético para ser integrado no microrganismo "aceitador" que irá expressar este elemento genético exterior ou se for usado como ferramenta para construções genéticas ou expressões de proteínas. O microrganismo da invenção é escolhido dentre levedura que expressa genes para a biossíntese de acetoína.

[0021] O termo "microrganismo recombinante", ou "microrganismo geneticamente modificado", ou "levedura recombinante" ou "levedura geneticamente modificada", como usado neste documento, refere-se a uma levedura geneticamente modificada ou geneticamente criada. Isso significa, de acordo com o significado comum destes termos, que o microrganismo da invenção não é encontrado na natureza e é modificado tanto pela introdução quanto pela deleção ou modificação de elementos genéticos de microrganismos equivalentes encontrados na natureza. Isso também pode ser modificado ao forçar o desenvolvimento e evolução de novas vias metabólicas pela combinação de mutagênese direcionada e evolução sob pressão de seleção específica (vide, por exemplo, WO 2004/076659).

[0022] Um microrganismo pode ser modificado para expresser genes exógenos se estes genes forem introduzidos no microrganismo com todos os elementos permitindo suas expressões no microrganismo hospedeiro. Um microrganismo pode ser modificado para modular o nível de expressão de um gene endógeno. A modificação ou "transformação" de microrganismo, como levedura, com DNA exógeno é uma tarefa rotineira para aqueles versados na técnica. Particularmente, uma modificação genética de um microrganismo, de acordo com a invenção, mais particularmente a(s) modificação(ões) genética(s) definida(s) neste documento, podem ser realizadas pelo uso de sistemas CRISPR-Cas, conforme descrito em DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., vol. 41, N° 7, 2013: 4336-4343).

[0023] O termo "gene endógeno" significa que o gene estava presente no microrganismo anteriormente a qualquer modificação genética, na cepa de tipo selvagem. Genes endógenos podem ser super-expressos pela introdução de sequências heterólogas adicionalmente a, ou para substituir elementos reguladores endógenos ou pela introdução de uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou um plasmídeo. Genes endógenos também podem ser modificados para modular suas expressões e/ou atividades. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas na sequência de codificação para modificar o produto de gene ou sequências heterólogas podem ser introduzidas além de ou para substituir elementos reguladores endógenos. Modulação de um gene endógeno pode resultar na suprarregulação e/ou melhoria da atividade do produto de gene ou alternativamente, na infra-regulação e/ou atenuação da atividade do produto de gene endógeno. Outra maneira de melhorar a expressão de genes endógenos é introduzir uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou em um plasmídeo.

[0024] O termo "gene exógeno" significa que o gene foi introduzido em um microrganismo, por meios bem conhecidos pelos versados na técnica, considerando que este gene não ocorre de modo natural no microrganismo de tipo selvagem. Microrganismos podem expressar genes exógenos se estes genes forem introduzidos no microrganismo com todos os elementos permitindo suas expressões no microrganismo hospedeiro. Transformar microrganismos com DNA exógeno é uma tarefa rotineira para o versado na técnica. Genes exógenos podem ser integrados no cromossomo hospedeiro ou ser expressos de modo extra-cromossomático a partir de plasmídeos ou vetores. Uma variedade de plasmídeos, os quais diferem em relação a suas origens de replicação e seus números de cópias na célula, são conhecidos na técnica. A sequência de genes exógenos pode ser adaptada para sua expressão no microrganismo hospedeiro. Assim, o versado na técnica conhece a noção de polarização de uso de códon e como adaptar sequências nucleicas para uma polarização de uso de códon particular sem modificar a proteína deduzida.

[0025] O termo "gene heterólogo" significa que o gene é derivado a partir de uma espécie de microrganismo diferente a partir do microrganismo receptor que o expressa. Refere-se a um gene que não ocorre naturalmente no microrganismo.

[0026] No presente pedido, todos os genes são referenciados com seus nomes comuns e com referências a suas sequências nucleotídicas e, caso apareça, a suas sequências de aminoácidos. Usando as referências dadas em número de ascensão para genes conhecidos, aqueles versados na técnica serão capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas de bactérias, levedura, fungos, mamíferos, plantas etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando sequências consenso que podem ser determinadas pela realização de alinhamentos de sequência com genes derivados a partir de outros microrganismos e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo.

[0027] Versados na técnica conhecem diferentes maneiras de modular, e, particularmente, regular para cima ou para baixo a expressão de genes endógenos. Por exemplo, uma maneira de potencializar a expressão de genes endógenos é introduzir uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou em um plasmídeo.

[0028] Outra maneira é substituir o promotor endógeno de um gene com um promotor mais forte. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Promotores homólogos conhecidos para permitir um alto nível de expressão em levedura são aqueles selecionados no grupo a seguir; ADH1, GPDH, TEF1, HXT7 truncado, PFK1, FBA1, PGK1, TDH3 etc. Promotores particularmente interessantes na presente invenção são doravante definidos em maiores detalhes.

[0029] Em levedura, construto de expressão de ácido nucleico preferencialmente compreende sequências reguladoras, tais como promotores e sequências terminadoras, as quais são ligadas de forma operacional com a codificação de sequência de ácido nucleico dos genes considerados, e mais particularmente a cada uma das enzimas ALS, ALD e NOXE mencionadas acima, de acordo com a presente invenção.

[0030] O construto de expressão de ácido nucleico pode adicionalmente compreender sequências de reconhecimento de 5' e/ou 3' e ou marcadores de seleção.

[0031] O termo "super-expressão" significa que a expressão de um gene ou de uma enzima é aumentada conforme comparado ao microrganismo não modificado. O aumento da expressão de uma enzima é obtido ao aumentar a expressão de um gene codificando dita enzima. O aumento da expressão de um gene pode ser realizado por todas as técnicas conhecidas pelos versados na técnica. A este respeito, deve ser notavelmente citada a implementação de um promotor forte a montante do ácido nucleico destinado a ser super-expresso, ou a introdução de diversas cópias do dito ácido nucleico entre um promotor, especialmente um promotor forte e um terminador.

[0032] A "atividade" de uma enzima é usada de modo intercambiável com o termo "função", e designa, no contexto da invenção, a capacidade de uma enzima em catalisar a reação desejada.

[0033] Os termos "atividade reduzida" ou "atividade atenuada" de uma enzima significa uma atividade catalítica específica reduzida da proteína obtida pela mutação na sequência de aminoácidos e/ou concentrações diminuídas da proteína na célula obtida por mutação da sequência nucleotídica ou por deleção do gene cognato correspondente.

[0034] O termo "atividade potencializada" de uma enzima designa uma atividade catalítica específica aumentada da enzima, e/ou uma quantidade/disponibilidade aumentada da enzima na célula, obtida, por exemplo, por super-expressão do gene codificando a enzima.

[0035] Os termos "codificar" ou "codificação" se referem ao processo pelo qual um polinucleotídeo, através de mecanismos de transcrição e tradução, produz uma sequência de aminoácidos.

[0036] O(s) gene(s) codificando a(s) enzima(s) considerada(s) na presente invenção podem ser exógenos ou endógenos.

[0037] "Atenuação" de genes significa que genes são expressos a uma taxa inferior a em microrganismos não modificados. A atenuação pode ser alcançada por meios e métodos conhecidos aos versados na técnica, e contém deleção de gene obtida por recombinação homóloga, atenuação de gene pela inserção de um elemento externo no gene ou expressão de gene sob um promotor fraco. Versados na técnica conhecem uma variedade de promotores que exibem forças diferentes e qual promotor deve-se usar para uma expressão genética fraca.

[0038] Os métodos implementados na presente invenção requerem, preferencialmente, o uso de um ou mais construtos de integração cromossômica para a introdução estável de uma sequência de nucleotídeo heterólogo em um local específico em um cromossomo ou para a interrupção funcional de um ou mais genes alvo em uma célula microbiana modificada geneticamente. Em algumas modalidades, interrupção do gene alvo previne a expressão de proteína funcional relacionada. Em algumas modalidades, interrupção do gene alvo resulta na expressão de uma proteína não funcional a partir do gene interrompido.

[0039] Parâmetros de construtos de integração cromossômica que podem ser variados na prática da presente invenção incluem, mas não são limitados a, os comprimentos de sequências homólogas; a sequência nucleotídica das sequências homólogas; o comprimento da sequência de integração; a sequência nucleotídica da sequência de integração; e a sequência nucleotídica do local alvo. Em algumas modalidades, um intervalo efetivo do comprimento de cada sequência homóloga é de 20 a 5.000 pares de base, preferencialmente de 50 a 100 pares de base. Em modalidades particulares, o comprimento de cada sequência homóloga é de cerca de 50 pares de base. Para mais informações sobre o comprimento de homologia requerida para cada gene alvo, vide D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).

[0040] Em algumas modalidades, o(s) gene(s) de piruvato descarboxilase interrompida em que o(s) construto(s) de DNA mencionados acima está(ão) inseridos pode(m) vantajosamente compreender um ou mais marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células microbianas transformadas. Preferencialmente, dito(s) marcador(es) selecionável(is) é(são) compreendido(s) no(s) construto(s) de DNA, de acordo com a presente invenção.

[0041] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um marcador resistente a antibiótico. Exemplos ilustrativos de marcadores resistentes à antibiótico incluem, mas não estão limitados a, os produtos de gene NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<R>, e SH BLE. O produto de gene NAT 1 de S. noursei confere resistência à nourseotricina; o produto de gene AURI-C de Saccharomyces cerevisiae confere resistência à Aureobasidina A (AbA); o produto de gene HPH de Klebsiella pneumonia confere resistência a Higromicina B; o produto de gene DSDA de E. coli permite que células cresçam em placas com D-serina como a fonte única de nitrogênio; o gene KAN<R> do transposon Tn903 confere resistência a G418; e o produto de gene SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confere resistência à Zeocina (bleomicina).

[0042] Em algumas modalidades, o marcador resistente a antibiótico é deletado após a célula microbiana geneticamente modificada da invenção ser isolada. Os versados na técnica são capazes de escolher marcador adequado em contexto genético específico.

[0043] Em algumas modalidades, o marcador selecionável resgata uma auxotrofia (por exemplo, uma auxotrofia nutricional) na célula microbiana geneticamente modificada. Em tais modalidades, uma célula microbiana precursora compreende uma interrupção funcional em um ou mais produtos de gene que agem em uma via biossintética de aminoácido ou de nucleotídeo, tal como, por exemplo, os produtos de gene HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 e URA3 em levedura, o que torna a célula microbiana precursora incapaz de crescer no meios sem suplementação com um ou mais nutrientes (fenótipo auxotrófico). O fenótipo auxotrófico pode ser, então, resgatado pela transformação da célula microbiana precursora com uma integração cromossômica codificando uma cópia funcional do produto de gene interrompido (NB: a cópia funcional do gene pode se originar a partir de espécies próximas, tais como Kluveromyces, Candida etc.), e a célula microbiana geneticamente modificada gerada pode ser selecionada com base na perda do fenótipo auxotrófico da célula microbiana precursora.

[0044] Para cada uma das sequências de ácido nucleico compreendendo uma sequência de promotor, uma sequência de codificação (por exemplo, uma sequência de codificação de enzima), ou uma sequência de terminação, sequências de referência são descritas neste documento. O presente relatório descritivo também engloba sequências de ácido nucleico com porcentagens específicas de identidade de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico de referência.

[0045] Para cada uma das sequências de aminoácidos de interesse, sequências de referência são descritas neste documento. O presente relatório descritivo também engloba sequências de aminoácidos (por exemplo, sequências de enzimas de aminoácidos) com porcentagens específicas de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência.

[0046] Por razões óbvias, em todo o presente relatório descritivo, uma sequência específica de ácido nucleico ou uma sequência específica de aminoácido que cumpre com, respectivamente, o nucleotídeo considerado ou a identidade de aminoácido, deve adicionalmente levar à obtenção de uma proteína (ou enzima) que exibe a atividade biológica desejada. Conforme usado neste documento, a " porcentagem de identidade" entre duas sequências de ácido nucleico ou entre duas sequências de aminoácido é determinada pela comparação de ambas as sequências otimamente alinhadas através de uma janela de comparação.

[0047] A porção do nucleotídeo ou da sequência de aminoácido na janela de comparação pode, deste modo, incluir adições ou deleções (por exemplo, "lacunas") em comparação com a sequência de referência (a qual não inclui estas adições ou estas deleções) de modo a obter um alinhamento ideal entre ambas as sequências.

[0048] A porcentagem de identidade é calculada ao determiner o número de posições em que uma base nucleica idêntica, ou um resíduo de aminoácido idêntico, pode ser notada para ambas as sequências comparadas, então ao dividir o número de posições em que a identidade possa ser observada entre ambas as bases nucleicas, ou entre ambos os resíduos de aminoácidos, pelo número total de posições na janela de comparação, então ao multiplicar o resultado por cem para obter a porcentagem de identidade de nucleotídeo entre as duas sequências da porcentagem de identidade de aminoácido entre as duas sequências.

[0049] A comparação da sequência de alinhamento ideal pode ser executada por um computador usando algoritmos conhecidos.

[0050] Mais preferencialmente, a porcentagem de identidade de sequência é determinada usando o software CLUSTAL W (versão 1.82), cujos parâmetros são estabelecidos conforme segue: (1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUTORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAP OPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAP EXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram" e (18) TREE GRAP DISTANCES="hide".

[0051] A "fermentação" ou "cultura" é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura apropriado adaptado ao microrganismo sendo cultivado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e, se necessário, co-substratos.

[0052] Microrganismos divulgados neste documento podem ser cultivados em meios de fermentação para a produção de um produto de piruvato. Para produção máxima de acetoína, as cepas de microrganismo usadas como hospedeiras de produção preferencialmente possuem uma alta taxa de utilização de carboidrato. Estas características podem ser conferidas por mutagênese e seleção, engenharia genética ou podem ser naturais. Meios de fermentação, ou "meio de cultura", para as presentes células podem conter pelo menos cerca de 10 g/l de glicose. Substratos de carbono adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, monossacarídeos, tais como frutose, manose, xilose e arabinose; oligossacarídeos, tais como lactose, maltose, galactose ou sacarose; polissacarídeos, tais como amido ou celulose; ou misturas destes e misturas impuras de matérias-primas renováveis, tais como licor de lavagem de milho permeado por soro de queijo, melaço de beterraba sacarina e malte de cevada. Outros substratos de carbono podem incluir glicerol.

[0053] Consequentemente, é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma alta variedade de carbono contendo substratos e irá apenas ser limitada pela escolha de organismo.

[0054] Embora seja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e misturas destes são adequados na presente invenção, substratos de carbono preferenciais são glicose, frutose e sacarose, ou misturas destes com açucares C5, tais como xilose e/ou arabinose para microrganismos modificados para usar açucares C5, e, mais particularmente, glicose.

[0055] Um substrato de carbono preferencial é sacarose.

[0056] De acordo com uma modalidade particular, um substrato de carbono, de acordo com a presente invenção, não consiste de xilose.

[0057] Além de uma fonte de carbono apropriada, meios de fermentação podem conter minerais adequados, sais, cofatores, tampões e outros componentes conhecidos aos versados na técnica, adequados para o crescimento das culturas e promoção da via enzimática necessária para a produção do produto desejado.

[0058] Além disso, modificações genéticas adicionais adequadas para o crescimento de microrganismos recombinantes, de acordo com a invenção, podem ser consideradas.

[0059] De modo a impedir a fuga da acetoína em direção ao 2,3- BDO, os genes que estão envolvidos na redução da acetoína em 2,3-BDO podem ser desativados. A este respeito, pode ser citado a desidrogenase debutanodiol endógena bdh1 e bdh2 (notavelmente conhecida pelo número EC 1.1.1.4.), mas também desidrogenase de álcool endógena adh1, adh3 e adh4 (notavelmente conhecido pelo número EC 1.1.1.1). A inativação de ditos genes pertence ao conhecimento geral de um versado na técnica.

[0060] A presença de ácidos fracos é conhecida como uma limitação para o crescimento e são frequentemente presentes em celulose ou meios derivados de melaço.

[0061] Modificações genéticas adicionais, tais como a interrupção do gene JEN1 (ou nome sistemático: YKL217W ou número de acesso de proteína P36035 (UniProtKB swiss-Prot)) e/ou a super- expressão do gene HAA-1 (nome sistemático: YPR008W ou número de acesso Q12753 (UniProtKB swiss-Prot)) leva à melhoria da resistência de cepas para ácidos fracos no meio de cultura implementado.

[0062] Jen 1 é uma proteína de membrana responsável por importar lactato na célula (Casal M, et al. (1999), J. Bacteriol., 181(8): 26203).

[0063] HAA-1 é um ativador transcricional que controla a expressão de proteínas de estresse de membrana responsáveis por resistência a ácidos fracos. Sua super-expressão potencializa a resistência de levedura a ácidos acéticos (Tanaka et al. (2012) Appl Environ Microbiol., 78(22): 8161-3).

[0064] A interrupção do gene JEN1 e a super-expressão do gene HAA-1 pertence ao conhecimento geral dos versados na técnica, e pode ser notavelmente realizada no uso de métodos apresentados neste documento.

[0065] Tendo em vista a equação presente neste documento para a síntese de acetoína em levedura, as condições para considerar na presente invenção são necessariamente condições aeróbicas.

[0066] O termo "condições aeróbicas" se refere a concentrações de oxigênio no meio de cultura que são suficientes para um microrganismo aeróbico ou anaeróbico facultativo usar di-oxigênio como um aceitador de elétron terminal.

[0067] "Condição microaeróbica" se refere a um meio de cultura em que a concentração de oxigênio é menor do que no ar, por exemplo, concentração de oxigênio de até 6% de O2.

[0068] Um "meio de cultura apropriado" designa um meio (por exemplo, um meio líquido estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos à manutenção e/ou crescimento da célula, tal como fontes de carbono ou substrato de carbono, fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico ou fosfato dipotássico; elementos residuais (por exemplo, sais de metal), por exemplo, sais de magnésio, sais de cobalto e/ou sais de manganês; bem como fatores de crescimento, tais como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e semelhantes. O termo "fonte de carbono", ou "substrato de carbono" ou "fonte de carbono", de acordo com a presente invenção denota qualquer fonte de carbono que possa ser usada por aqueles versados na técnica para auxiliar o crescimento normal de um microrganismo, incluindo hexoses (tais como glicose, galactose ou lactose), pentose,monossacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos (tais como sacarose, celobiose ou maltose), melaços, amido ou seus derivados, celulose, hemiceluloses e combinações destes.

Levedura recombinante de acordo com a invenção

[0069] Conforme mencionado acima, a presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, em cujo genoma foi inserido: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato sintase ou ALS, - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato descarboxilase ou ALD, e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando um NADH oxidase (ou NOXE).

[0070] Conforme mostrado nos exemplos neste documento, os inventores verificaram que a presença de um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase, vantajosamente a presença de uma pluralidade de cópias destes, em uma levedura recombinante em que a atividade de descarboxilase de piruvato tenha sido reduzida e em que tenha sido adicionalmente integrado genes permitindo expressão das enzimas ALS e ALD requeridas para a síntese de acetoína, não apenas contribui para estabilizar dita levedura recombinante, mas também permite uma potencialização significante do crescimento desta cepa, bem como o rendimento de produção de acetoína.

[0071] O uso de organismos de levedura de Crabtree positiva, tal como saccharomyces cerevisiae, e, especialmente, de organismos de levedura recombinante, tais como saccharomyces cerevisiae, para produção de metabolitos de interesse é vantajoso, uma vez que, em contraste com as bactérias, células de levedura possuem a capacidade de executar fermentação na presença de oxigênio de quantidade suficiente de açúcar, tal como glicose ou sacarose. Em contraste, bactérias realizam fermentação apenas em condições anaeróbicas. Adicionalmente, organismos de levedura não estão sujeitos a infecção viral em contraste com bacteriófagos para bactérias. Ainda adicionalmente, cultura de organismos de levedura está raramente sujeita à contaminação por microrganismos não desejados, tais como bactérias em função de células de levedura causarem acidificação rápida de seu ambiente a até pH4, por exemplo, o meio de cultura auxiliando seu crescimento. Ainda adicionalmente, células de levedura não excretam um número de metabólitos indesejados, tais como ácido lático, cuja presença no meio de cultura é uma desvantagem atual para purificação subsequente de metabólito(s) de interesse. Ainda adicionalmente, organismos de levedura, incluindo organismos de levedura recombinante, possuem maior estabilidade genética quando comparados a bactérias.

[0072] A equação para a síntese de acetoína em levedura é:

[0073] Dita equação de massa é possível devido ao fato de que S. cerevisiae pode fermentar mesmo na presença de oxigênio.

[0074] Tendo em conta a equação acima, o rendimento teórico máximo de acetoína seria 97,78 g para uma entrada de 200 g de glicose.

[0075] Conforme mostrado nos exemplos neste documento, o rendimento eficaz de acetoína com levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, está relativamente próximo deste rendimento teórico máximo (até 83%). De acordo com o conhecimento do inventor, tal rendimento nunca foi obtido em levedura até agora.

[0076] Deste modo, a produção com um alto rendimento de acetoína com êxito é atingida em uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, preparando o caminho para a produção industrial de acetoína em levedura.

[0077] Assim, como também é mostrado nos exemplos neste documento, nenhuma toxicidade de acetoína produzida nas células de levedura é observada, mesmo em altas concentrações de acetoína sintetizada. Além disso, a acetoína sintetizada é inteiramente exportada para fora das células, deste modo, substancialmente simplificando o processo de purificação.

[0078] A NADH oxidase (ou NOXE) usada na levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, é uma enzima "dependente de NADH" muito específica, uma vez que não consome qualquer aceitador carbonatado. Por esta razão, a NADH oxidase selecionada não interfere diretamente no metabolismo carbonatado, mas reabastece a reserva de NAD+ na produção de água.

[0079] A este respeito, a NADH oxidase usada na levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, difere notavelmente da enzima "dependente de NADH", divulgada nos documentos do estado da técnica mencionados acima, e especialmente em US 2011/0124060 e WO 2013/076144.

[0080] De acordo com certas modalidades, a levedura recombinante pode compreender um ou mais construtos de DNA selecionados a partir de um grupo compreendendo as seguintes fórmulas: (I) 5'-[Gene 1]xi-3‘ e 5'-[Gene 2]x2-3' e 5'-[Gene 3]x3-3', (II) 5'-[Gene 1]xi-[Gene 2]x2-3' e 5'-[Gene 3]x3-3', (III) 5'-[Gene i]xi-[Gene 2]x2-[Gene 3]x3-3', e uma combinação destes, em que: - "Gene 1" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD ou NOXE; - "Gene 2" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD ou NOXE, mas diferente do gene 1; - "Gene 3" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD ou NOXE, mas diferente dos genes 1 e 2; - "ALS" é um ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase; - "ALD" é um ácido nucleico codificando uma acetolactato descarboxilase; - "NOXE" é um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase; - cada um dentre "x1", "x2" e "x3", um independentemente dos outros, representa um número inteiro variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, e desde que dita levedura recombinante compreenda pelo menos um ácido nucleico codificando cada uma dentre ALS, ALD e NOXE.

[0081] Preferencialmente, cada um dentre "x1", "x2" e "x3", independentemente entre si, representa um número inteiro no intervalo de 0 a 10, mais particularmente no intervalo de 0 a 5, particularmente no intervalo de 0 a 3, e ainda representa melhor um número inteiro igual a 1.

[0082] Conforme previsto neste documento, cada um dentre x1, x2 e x3 pode ter um valor selecionado em um grupo compreendendo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50.

[0083] Em certas modalidades em que, em um construto de DNA de fórmulas de (I) a (III) acima, um ou mais dos números inteiros "x1", "x2" e/ou "x3", uma independentemente dos outros, tem um valor de dois ou mais, então, cada um dentre duas ou mais cópias do gene correspondente entre Gene 1, Gene 2 e/ou Gene 3 relacionados pode ser idêntico ou diferente. Várias sequências distintas de ALS, ALD e NOXE estão aqui representadas na Tabela 1.

[0084] Em modalidades ilustrativas de um construto de DNA selecionado dentre aqueles de fórmulas de (I) a (III) acima, em que "x1" é um número inteiro igual a 2, e Gene 1 é um ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase (ALS), então, as duas sequências de codificação de ALS contidas em dito construto de DNA podem ser idênticas ou diferentes,

[0085] Por exemplo, de acordo com esta modalidade particular, isso significa que a primeira cópia do ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase pode ser o ácido nucleico codificando ALS.BS e a segunda cópia do ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase pode ser o ácido nucleico codificando ALS.Pp.

[0086] Nas modalidades de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, em que dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA selecionados no grupo que compreende os construtos de DNA de fórmulas de (I) a (III), cada construto de DNA, e mais particularmente cada um dos genes dentre Gene 1, Gene 2 e/ou Gene 3 relacionados contidos ali, podem ser idênticos ou diferentes.

[0087] Neste documento são apresentadas algumas modalidades ilustrativas de um construto de DNA selecionado em um grupo compreendendo as construções de DNA de fórmula (I), (II) e (III). Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (I): (I) 5'-[ALS]2-3' e 5'-[ALD]2-3' e 5'-[NOXE]3-3',

[0088] Uma levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (I) acima tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida e possui os quatro sub-construtos de DNA a seguir de (i) a (iii) que foram introduzidos no genoma destes:(i) um sub-construto de DNA compreendendo dois ácidos nucleicos, idênticos ou distintos entre si, cada ácido nucleico codificando ALS, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante; (ii) um sub-construto de DNA compreendendo dois ácidos nucleicos, idênticos ou distintos entre si, cada ácido nucleico codificando ALD, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do local em que o sub- construto de DNA compreendendo os ácidos nucleicos codificando ALS foram inseridos; e (iii) um sub-construto de DNA compreendendo três ácidos nucleicos, idênticos ou distintos entre si, cada ácido nucleico codificando NOXE, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um terceiro local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do primeiro e segundo local em que o sub-construto de DNA compreendendo ácidos nucleicos codificando ALS e do sub-construto de DNA compreendendo ácidos nucleicos codificando ALD, respectivamente, foram inseridos.

[0089] Em algumas modalidades, a atividade de piruvato descarboxilase reduzida da dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um sub-construto de DNA de (i) a (iii), ou, alternativamente, uma combinação destes. Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (II): (II) 5'-[ALS]2-[ALD]2-3' e 5'-[NOXE]3-3',

[0090] Uma levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (III) acima tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que foi inserido os dois sub-construtos de DNA (A) e (B), ou seja: (A) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]2-[ALD]2-3', dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub-construto de DNA compreendendo; (i) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes entre si, cada ácido nucleico codificando ALS; e (ii) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes entre si, cada ácido nucleico codificando ALD; e (B) um segundo sub-construto de DNA 5'-[NOXE]3-3', dito sub- construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do primeiro local em que o primeiro sub-construto de DNA foi inserido, e dito segundo sub-construto de DNA compreendendo (iii) três ácidos nucleicos, idênticos ou distintos entre si, cada ácido nucleico codificando NOXE.

[0091] Em certas modalidades, a atividade de piruvato descarboxilase reduzida de dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um primeiro sub-construto de DNA e/ou segundo sub-construto de DNA. Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (III): (III) 5'-[ALS]2-[ALD]2-[NOXE]3-3',

[0092] Uma levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (III) acima tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida e possui um genoma em que foi inserido um construto de DNA localizado em um local desejado no genoma de dita levedura recombinante, dito construto de DNA compreendendo; (i) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes entre si, cada ácido nucleico codificando ALS; (ii) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes entre si, cada ácido nucleico codificando ALD; e (iii) três ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes entre si, cada ácido nucleico codificando NOXE.

[0093] Em certas modalidades, a atividade de piruvato descarboxilase reduzida necessária de dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção de dito construto de DNA em pelo menos um dos genes pdc de levedura.

[0094] Para cada uma destas três modalidades ilustrativas acima de uma levedura recombinante de acordo com a invenção, e conforme mencionado acima, quando "x1" a "x3", um independente dos outros, representa um número inteiro com um valor de dois ou mais, então: - uma cópia de ALS dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia de ALS compreendida em dito construto de DNA ou pode ser idêntico para todas as outras cópias de ALS contidas em dito construto de DNA, ou, alternativamente, a dita uma cópia de ALS pode ser distinta de cada outra cópia de ALS contida em dito construto de DNA. - uma cópia de ALD dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia de ALD compreendida em dito construto de DNA ou pode ser idêntica para todas as outras cópias de ALD contidas em dito construto de DNA, ou, alternativamente, dita uma cópia de ALD pode ser distinta de cada outra cópia de ALD contida em dito construto de DNA. - uma cópia de NOXE dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia de NOXE compreendida em dito construto de DNA ou pode ser idêntica para todas as outras cópias de NOXE contidas em dito construto de DNA, ou, alternativamente, a dita uma cópia de NOXE pode ser distinta de cada outra cópia de NOXE contida em dito construto de DNA. Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (III) e um construto de DNA de fórmula (I): (III) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', e (I) 5'-[ALS]o-3' e 5'-[ALD]o-3' e 5'-[NOXE]i2-3',

[0095] A levedura recombinante resultante tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que foi inserido os dois sub-construtos de DNA (A) e (B), ou seja: (A) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]i-[ALD]i-[NOXE]i-3', dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub-construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e (iii) um ácido nucleico codificando NOXE; e (B) um segundo sub-construto de DNA 5'-[ALS]o-3‘ e 5'-[ALD]o-3‘ e 5'-[NOXE]12-3', dito segundo sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante e dito segundo sub-construto de DNA compreendendo; (1) doze ácidos nucleicos codificando NOXE. Levedura recombinante compreendendo dois construtos de DNA de fórmula (III) e um construto de DNA de fórmula (I): (III-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', (III-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', (I) 5'-[ALS]O-3' e 5'-[ALD]o-3' e 5'-[NOXE]i2-3',

[0096] A levedura recombinante resultante tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que foi inserido os dois sub-construtos de DNA (A), (B) e (C), ou seja: (A) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]i-[ALD]i-[NOXE]i-3', dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub-construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e (iii) um ácido nucleico codificando NOXE; (8) um segundo sub-construto de DNA 5'-[ALS]i-[ALD]i-[NOXE]i- 3', dito segundo sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante e dito segundo sub- construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e (iii) um ácido nucleico codificando NOXE; e (B) um terceiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]o-3‘ e 5'-[ALD]o-3‘ e 5'-[NOXE]12-3', dito terceiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um terceiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito terceiro sub- construto de DNA compreendendo; (1) doze ácidos nucleicos codificando NOXE; Levedura recombinante compreendendo dois construtos de DNA de fórmula (II) e um construto de DNA de fórmula (I): (II-1) 5'-[ALS]i-[ALD]i-3' e 5'-[NOXE]o-3', (II-2) 5'-[ALS]I-[ALD]I-3' e 5'-[NOXE]O-3', (1) 5'-[ALS]O-3' e 5'-[ALD]O-3' e 5'-[NOXE]I2-3',

[0097] A levedura recombinante resultante tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que os três sub- construtos de DNA (A), (B) e (C) foram inseridos, ou seja: (A) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]I-[ALD]I-3' e 5'- [NOXE]0-3', dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub- construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; e (ii) um ácido nucleico codificando ALD; (B) um segundo sub-construto de DNA 5'-[ALS]I-[ALD]I-3' e 5'- [NOXE]0-3', dito segundo sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante e dito segundo sub-construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; e (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e - B) um terceiro sub-construto de DNA 5'-[NOXE]12-3', dito sub- construto de DNA sendo introduzido em um terceiro local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do primeiro local em que o primeiro sub-construto de DNA foi inserido, e dito segundo sub-construto de DNA compreendendo (iii) doze ácidos nucleicos, idênticos ou distintos entre si, cada ácido nucleico codificando NOXE.

[0098] Em certas modalidades, a atividade de piruvato descarboxilase reduzida de dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um primeiro sub-construto de DNA e/ou segundo sub-construto de DNA.

[0099] De acordo com certas modalidades específicas, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois construtos de DNA da fórmula mencionada acima (II), em que "Gene 3" significa um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase (ou NOXE).

[00100] De acordo com estas modalidades específicas, cada ácido nucleico dentre Gene 1 e Gene 2 necessariamente significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS e ALD. Nestas modalidades, pelo menos uma cópia de ALS e ALD inserida está presente. Nas modalidades em que apenas um construto de fórmula (II) é inserido no genoma de levedura, então cada ácido nucleico dentre Gene 1 e Gene 2 significa necessariamente um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS e ALD e uma cópia de cada uma dentre ALS e ALD está presente. Nas modalidades em que um conjunto de dois ou mais construtos de fórmula (II) são inseridos no genoma de levedura, então, cada ácido nucleico dentre Gene 1 e Gene 2 significa necessariamente um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS e ALD, e pelo menos uma cópia de cada uma dentre ALS e ALD está presente em dito conjunto de dois ou mais construtos de DNA de fórmula (II).

[00101] Além disso, quando dita levedura recombinante, de acordo com a invenção, compreende pelo menos dois construtos de DNA da fórmula (II) acima, então ditos construtos de DNA da fórmula (II) mencionada acima podem ser idênticos ou diferentes.

[00102] De acordo com uma modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, construto(s) de DNA de fórmula (IIa), idênticos ou diferentes, em que cada fórmula (IIa) possui a seguinte fórmula: (IIa) 5'-[(prom5)y1-Gene 1-term5]x5-[prom1-Gene 1-term1]x1-[prom2- Gene 2-(term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-Gene 3-(term3)z2]x3-3‘ em que: - Gene 1, Gene 2, Gene 3, "x1", "x2" e "x3" são tais como definidos acima; - "x5" representa um número inteiro igual a 0 ou 1; - "y1", "y2", "z1" e "z2", um independentemente dos outros, representam um número inteiro igual a 0 ou 1; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (IIa), então "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" podem ser idênticos ou diferentes; - "prom 1" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando o gene 1; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando o gene 2; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando o gene 3; - "prom5" é uma sequência reguladora que controla a expressão de Gene 1, dito prom5 sendo idêntico ou diferente de prom1; - "term1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando o gene 1; - "term2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando o gene 2; - "term3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando o gene 3; e - "term5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de Gene 1, dito term5 sendo idêntico ou diferente de term1.

[00103] Para uma melhor clareza sobre as características "x5" e "y1", são doravante apresentados exemplos para ilustrar mais detalhadamente modalidades particulares relacionadas: - quando "x5" é um número inteiro igual a 1 e "y1" representa um número inteiro igual a 0, então significa que o Gene 1 considerado está sob o controle do promotor do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido; ou - quando "x5" é um número inteiro igual a 1 e "y1" representa um número inteiro igual a 1, então significa que o Gene 1 considerado está sob o controle do promotor "prom5". A este respeito, a sequência de promotor do gene endógeno, preferencialmente de gene pdc, em que o construto de DNA é inserido é eliminada, ou pelo menos interrompida, bem como a sequência de sua região de codificação relacionada.

[00104] Além disso, notavelmente com relação às características "y2" e "z2", são doravante apresentados exemplos para ilustrar mais detalhadamente modalidades particulares relacionadas (certamente, nestes exemplos, "x3" representa um número inteiro igual a 1 ou mais): - quando "y2" é um número inteiro igual a 0, então significa que o Gene 3 considerado está sob o controle do promotor do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido; ou - quando "y2" é um número inteiro igual a 1, então significa que o Gene 3 é considerado sob o controle do promotor "prom3". A este respeito, a sequência do promotor do gene endógeno, em que o construto de DNA é inserido é eliminada, ou pelo menos interrompida, bem como a sequência de sua região de codificação relacionada. - quando "z2" é um número inteiro igual a 0, então significa que o Gene 3 está ligado ao terminador de transcrição do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido; ou - quando "z2" é um número inteiro igual a 1, então isso significa que o Gene 3 considerado está ligado ao terminador de transcrição "term3". A este respeito, a sequência do terminador de transcrição do gene endógeno, em que o construto de DNA é inserido é eliminada, ou pelo menos interrompida, bem como a sequência de sua região de codificação relacionada.

[00105] Com relação a "z1", quando presente em formulas descritas no presente relatório descritivo, o acima mencionado com relação a "z2" se aplica mutatis mutandis.

[00106] De acordo com outra modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois construtos de DNA das seguintes fórmulas (IIb): (IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD- (term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3‘ em que: - ALS, ALD, NOXE, "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" são tais como definidos acima; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (IIb), então "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" podem ser idênticos ou diferentes; - "prom 1" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando a acetolactato sintase; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando acetolactato descarboxilase; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando a NADH oxidase; - "prom 5" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência codificando acetolactato sintase, dito prom5 sendo idêntico ou diferente de prom1; - "term1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando acetolactato sintase; - "term2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando acetolactato descarboxilase; - "term3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando a NADH oxidase; e - "term5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão da sequência codificando acetolactato sintase, dito term5 sendo idêntico ou diferente de term1.

[00107] De acordo com outra modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb), desde que todas as cópias de ácido nucleico de NOXE estejam localizadas em um único dentre os pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb).

[00108] De acordo com outra modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois, preferencialmente exatamente dois construtos de DNA das seguintes fórmulas (IIc) e (IId): (IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD- (term2) zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3'; e (IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-- (term2)zi]x2-3‘ e 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3'; em que: - ALS, ALD, NOXE, "prom1", "prom2", "prom3", "prom5", "term1", "term2", "term3", "term5", "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" são tais como definidos acima; e - "x1" a "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" para cada uma das fórmulas (IIc) e (IId) sendo idênticos ou diferentes; e - "x6" e "x7" representam números inteiros variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 12, mais particularmente de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4 e ainda melhor igual a 3, desde que um dentre "x6" e "x7" represente 0.

[00109] Vantajosamente, o primeiro gene 1 em 5'- em um construto de DNA de fórmulas de (I) a (III), preferencialmente um gene representado por um ácido nucleico codificando ALS e mais particularmente dito primeiro gene 1, está sob o controle do promotor do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido.

[00110] Mais particularmente, isso significa que, para um construto de DNA de fórmula (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId), "x5" vantajosamente representa um número inteiro igual a 1, e "y1" representa um número inteiro igual a 0.

[00111] Tendo em conta a complexidade dos construtos de DNA e sub-construtos de DNA mencionados acima, de acordo com a presente invenção, enfatiza-se que: - em relação a um construto de DNA da invenção, quando "x1", "x2" e/ou "x3" representa um número inteiro maior ou igual a 2, então: o cada cópia para um ácido nucleico relacionado dentre Gene 1, Gene 2 e/ou Gene 3 pode ser idêntica ou diferente; e/ou o o promotor e/ou terminador para cada cópia de um ácido nucleico relacionado entre Gene 1, Gene 2 e/ou Gene 3 pode ser idêntico ou diferente; - quando uma levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA, ditos pelo menos dois construtos de DNA podem ser idênticos ou diferentes em relação a: (i) sua fórmula geral em que um construto de DNA pode ser caracterizado por uma fórmula selecionada dentre o grupo compreendendo fórmulas de (I) a (III); (ii) o valor de "x1" a "x3" e "x5" a "x7", "y1", "y2", "z1" e/ou "z2"; (iii) a natureza do promotor em relação a um mesmo gene; (iv) a natureza do terminador em relação um mesmo gene; e/ou (v) a natureza do mesmo gene propriamente dito, em que ALS, ALD e NOXE podem derivar de organismos pertencentes a diferentes gêneros, como notavelmente exibido a seguir na Tabela 1.

[00112] Métodos implementados para realizar um construto de DNA, tal como definido acima, pertencem ao conhecimento geral do versado na técnica.

[00113] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, N° 2: e16) e Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517: 203, eventualmente apenas com menor variação e é mais particularmente desenvolvido nos exemplos a seguir.

ATIVIDADE DE PIRUVATO DESCARBOXILASE REDUZIDA

[00114] Atividade de piruvato descarboxilase endógena em levedura converte piruvato para acetaldeído, o qual é, então, convertido em etanol ou a acetil-CoA por meio de acetato.

[00115] Conforme previamente mencionado, a presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida no genoma da qual foi inserido um construto de DNA específico:

[00116] De acordo com uma modalidade particular, a levedura recombinante é caracterizada pelo fato de que um ou mais genes de codificação de piruvato descarboxilase endógena podem ser desativados.

[00117] A atividade de piruvato descarboxilase de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser reduzida por todos os métodos conhecidos por versados na técnica.

[00118] A este respeito, a atividade de piruvato descarboxilase de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode, por exemplo, ser reduzida por (i) interromper pelo menos um gene que codifica um piruvato descarboxilase ao inserir dentro de dito pelo menos um gene que codifica uma piruvato descarboxilase pelo menos um construto de DNA exógeno por métodos conhecidos pelo versado na técnica, (ii) mutações em regiões reguladoras reduzindo a transcrição de piruvato descarboxilase, (iii) mutações em um códon de início, notavelmente substituindo AUG por GUG e (iv) mutações em sequências de codificação alterando a atividade (v) mutações, inserções ou deleções na sequência de codificação alterando a estabilidade de proteína (vi) mutações alterando a meia-vida do mRNA da piruvato descarboxilase.

[00119] A respeito da primeira opção (i), o construto de DNA implementado para interromper um gene pdc considerado pode ser um construto de DNA exógeno diferente dos construtos de DNA, de acordo com a invenção, conforme descrito anteriormente, um construto de DNA, de acordo com a invenção, ou uma combinação destes.

[00120] Também, e conforme mencionado acima, os construtos de DNA, de acordo com a invenção, de fórmula (I) e (II) são, cada um, compostos de dois ou mais sub-construtos de DNA.

[00121] Portanto, de acordo com uma variante particular de realização, a atividade de piruvato descarboxilase de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser reduzida ao interromper o pelo menos um gene que codifica uma piruvato descarboxilase pela inserção dentro de dito gene, apenas pelo menos um sub-construto de DNA de pelo menos um construto de DNA, de acordo com a invenção, de fórmula (I) e (II).

[00122] Preferencialmente, a atividade de piruvato descarboxilase endógena pode ser reduzida pela interrupção de pelo menos um gene de pdc.

[00123] Assim, leveduras podem ter um ou mais genes que codificam piruvato descarboxilase. Por exemplo, há um gene que codifica a piruvato descarboxilase em Kluyveromyces lactis, enquanto há três isoenzimas de piruvato descarboxilase codificadas pelos genes PDC1, PCD5 e PDC6 em Saccharomyces cerevisiae, bem como um gene regulatório de piruvato descarboxilase PDC2.

[00124] Preferencialmente, e como doravante definido, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser do gênero Saccharomyces recombinante, e, preferencialmente, uma espécie de Saccharomyces cerevisiae recombinante.

[00125] A este respeito, e de acordo com uma primeira variante, a atividade de piruvato descarboxilase pode ser reduzida pela interrupção de pelo menos um gene pdc, preferencialmente de pelo menos dois genes pdc, e mais particularmente de apenas dois genes pdc.

[00126] Além disso, os genes pdc interrompidos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em pdc1, pdc5, pdc6 e uma mistura destes, e, preferencialmente, de pdc1 e pdc6.

[00127] Preferencialmente, quando a levedura recombinante pertence ao gênero Saccharomyces, então a atividade de piruvato descarboxilase pode ser reduzida pela interrupção de pelo menos dois genes pdc, preferencialmente selecionados a partir do grupo consistindo em pdc1, pdc5, pdc6 e uma combinação destes, e, mais particularmente, a partir do grupo consistindo em pdc1 e pdc6.

[00128] Assim, a interrupção dos três genes pdc no gênero Saccharomyces, preferencialmente, espécies de Saccharomyces cerevisiae, reduz drasticamente o crescimento da cepa, tornando-o incompatível com qualquer aplicação industrial.

[00129] De acordo com uma variante particular, no gênero Saccharomyces, preferencialmente espécies Saccharomyces cerevisiae, apenas genes pdc1 e pdc6 são interrompidos, e a expressão de pdc5 é atenuada.

[00130] O método implementado para atenuar a expressão de um gene específico pertence ao conhecimento geral do versado na técnica.

[00131] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente se referir a qualquer método que seja conhecido na técnica.

[00132] Vantajosamente, para atenuar a expressão de pdc 5, sua transcrição pode ser colocada sob o controle de um promotor fraco, tal como, notavelmente RPLA1, URA3, MET25, HIS3, TRP1, GAP1, NUP57 ou TFC1, e, preferencialmente, RPLA1 (= Sequência SEQ ID N° 37).

[00133] Um método implementado para medir o nível de atividade de um piruvato descarboxilase pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[00134] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).

ACETOLACTATO SINTASE

[00135] A enzima acetolactato sintase (ALS) (também conhecida como sintase de ácido acetohidróxi (AHAS), sintetase de ácido α- acetohidróxi, sintase de a-acetohidroxiácido, sintase de α-acetolactato, sintetase de α-acetolactato, sintetase de ácido acetohidróxi, sintase acetohidroxiácido, acetolactato piruvato-liase (carboxilação), sintetase acetoláctica) é uma proteína que catalisa a primeira etapa na síntese de aminoácidos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina).

[00136] ALS é uma enzima especificamente envolvida na reação química envolvendo a conversão de duas moléculas de piruvato em uma molécula de acetolactato e dióxido de carbono. A reação usa tiamina pirofosfato a fim de ligar as duas moléculas de piruvato.

[00137] Um método implementado para medir o nível de atividade de uma acetolactato sintase pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[00138] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Poulsen et al. (Eur. J. Biochem. 185, 1989: 433-439).

[00139] Acetolactato sintase preferencial na presente invenção é conhecida pelo número EC 2.2.1.6.

[00140] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato sintase ou ALS pode(m) ser ácido(s) nucleico(s), preferencialmente selecionado(s) a partir de um grupo compreendendo Bacillus subtilis, Nicotiana tabacum, Paenibacillus polymyxa e uma mistura destes, e, preferencialmente, Nicotiana tabacum e Paenibacillus polymyxa.

[00141] Ainda de acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato sintase ou ALS pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, 3 e 5.

[00142] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 65% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência engloba sequências de ácido nucleico com pelo menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com a dita sequência de ácido nucleico de referência.

[00143] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência engloba sequências de ácidos nucleicos com pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com a dita sequência de ácido nucleico de referência.

[00144] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato sintase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com sequências de SEQ ID NO: 2, 5 e 6.

[00145] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido com pelo menos 65% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência engloba sequências de aminoácido com pelo menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[00146] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido com pelo menos 80% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência engloba sequências de aminoácido com pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[00147] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de ALS na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido mais detalhadamente, os quais estão presentes na posição 5' e 3', respectivamente, da sequência de ácido nucleico codificando ALS.

ACETOLACTATO DESCARBOXILASE

[00148] A enzima acetolactato descarboxilase (ALD) (também conhecida como α-acetolactato descarboxilase, (S)-2-hidroxi-2-metil-3- oxobutanoato carboxi-liase, (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxi- liase [formação de (R)-2-acetoína] ou (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxi-liase [formação de (3R)-3-hidroxibutan-2-ona]) pertence à família de liases, especificamente as carboxi-liases, as quais possuem ligações carbono-carbono e participam no metabolismo de butanoato e metabolismo de ácido dibásico ramificado c5.

[00149] ALD é uma enzima especificamente envolvida na reação química envolvendo a conversão de molécula de α-acetolactato em uma molécula de acetoína e dióxido de carbono.

[00150] Um método implementado para medir o nível de uma acetolactato descarboxilase pertence ao conhecimento geral do versado na técnica.

[00151] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Dulieu et al. (Enzyme and Microbial Technology 25, 1999: 537-542).

[00152] Acetolactato descarboxilase preferencial na presente invenção é conhecida pelo número EC 4.1.1.5.

[00153] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato descarboxilase ou ALD pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) a partir do grupo compreendendo Brevibacillus brevis, Enterobacter aerogenes, Lactococcus lactis e uma mistura destes, e, preferencialmente, Brevibacillus brevis e Enterobacter aerogenes.

[00154] Ainda de acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato descarboxilase ou ALD pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 36%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, 9 e 11.

[00155] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 36% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência engloba sequências de ácido nucleico com pelo menos 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com a dita sequência de ácido nucleico de referência.

[00156] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato sintase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 36%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com sequências de SEQ ID NO: 8, 10 e 12.

[00157] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido com pelo menos 36% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência engloba sequências de aminoácido com pelo menos 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com a dita sequência de aminoácido de referência.

[00158] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de ALD na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido em detalhes, os quais estão respectivamente presentes na posição 5' e 3' da sequência de ácido nucleico codificando ALD.

NADH OXIDASE

[00159] A inativação ou redução da atividade de pelo menos um gene pdc inativa ou reduz a via de fermentação de etanol em levedura. Em consequência, isto induz um estado redox desbalanceado, que não é aliviado pela expressão de ALS e ALD. Assim, a via de glicose a 2 piruvato gera 2 NADH equivalentes, enquanto a transformação de 2 piruvato a acetoína não recicla nenhuma NADH em NAD+ (vide figura 1).

[00160] Os inventores verificaram que uma enzima NADH oxidase formadora água bacteriana (também chamada, na presente descrição, de NOXE oxidase ou NOXE), em um nível de expressão específico, pode não apenas permitir o equilíbrio do estado redox que permite potencializar a estabilidade desta cepa, mas também permite potencializar o crescimento desta cepa e adicionalmente melhorar o rendimento de acetoína.

[00161] Uma NADH oxidase formadora água bacteriana é uma enzima que catalisa a seguinte reação:

[00162] NADH oxidase formadora de água preferencial na presente invenção é conhecida pelo número EC 1.6.3.1 e 1.6.99.3 (também conhecida como NAD(P)H oxidase formadora de (H(2)O(2)), oxidase dupla, NAD(P)H oxidase, ThOX, THOX2, NADPH oxidase na tireoide, oxidase na tiroide, oxidase 2 na tireoide para EC 1.6.3.1 e NADH desidrogenase, beta- NADH desidrogenase dinucleotídeo, citocromo c redutase, diaforase, dihidrocodesidrogenase I desidrogenase, dihidronicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase, difosfopirinase, DPNH diaforase, NADH diaforase, NADH hidrogenase, NADH oxidoreductase, NADH-menadiona oxidoredutase, NADH:citocromo c oxidoredutase, difosfopiridina nucleotídeo diaforase reduzida, desidrogenase Tipo 1, desidrogenase Tipo 1 para EC 1.6.99.3).

[00163] Uma NADH oxidase formadora de água que pode ser considerada na presente invenção é notavelmente descrita em WO 2006/134277.

[00164] Um método implementado para medir o nível de atividade de uma NADH oxidase, de acordo com a invenção, pertence ao conhecimento geral do versado na técnica.

[00165] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Lopez DE FELIPE et al. (International Daily Journal, 2001, vol. 11: 37-44 (ISSN 0958-6946)).

[00166] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma NADH oxidase ou NOXE pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) a partir do grupo compreendendo Streptococcus pneumoniae, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus brevis e uma mistura destes, e, preferencialmente, Streptococcus pneumoniae.

[00167] De acordo com outra modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma NADH oxidase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 78%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico SEQ ID NO: 21, 23, 25 e 27.

[00168] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 78% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência engloba sequências de ácido nucleico com pelo menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com a dita sequência de ácido nucleico de referência.

[00169] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma NADH oxidase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 78%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com sequências de SEQ ID NO: 22, 24, 26 e 28.

[00170] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido com pelo menos 78% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência engloba sequências de aminoácido com pelo menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com a dita sequência de aminoácido de referência.

[00171] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de NADH oxidase na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido mais detalhadamente, os quais estão respectivamente presentes na posição 5' e 3' da sequência de ácido nucleico codificando a NADH oxidase.

[00172] Além disso, os efeitos técnicos vantajosos mencionados acima estão ligados ao nível de expressão de dita NADH oxidase. Assim, e como ressaltam os exemplos neste documento, não apenas a simples presença de uma NADH oxidase é importante, mas o nível de expressão de NADH oxidase também tem extrema importância na produção de acetoína.

[00173] Conforme mencionado acima, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida e em cujo genoma foi inserida, notavelmente, uma ou mais cópias de um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase ou NOXE.

[00174] A este respeito, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender, notavelmente, de 1 a 20 cópias de um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase.

[00175] Preferencialmente, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender de 1 a 12, em especial de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4, e, melhor ainda, igual a 3 cópias de um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase.

[00176] De acordo com uma modalidade particular, o(s) construto(s) de DNA de fórmulas de (I) a (III) compreendendo pelo menos o(s) gene(s) NOXE podem ser inseridos no gene URA3 endógeno de dita levedura recombinante.

[00177] Em vista do exposto, cada um dentre ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e NADH oxidase está sob o controle de um promotor e de um terminador de modo a evitar regulação indesejada, notavelmente como definido doravante.

PROMOTOR

[00178] Por razões óbvias, cada um dentre ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e NADH oxidase está sob o controle de um promotor, idêntico ou diferente.

[00179] Ditos promotores, idênticos ou diferentes, os quais permitem a super-expressão constitutiva de um determinado gene, podem ser encontrados na literatura (velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251).

[00180] Promotores mais particularmente interessantes na presente invenção podem ser selecionados a partir o grupo compreendendo: • pADH1 do gene codificando o álcool desidrogenase (gene ADH1 = Sequência SEQ ID N° 32), • pTDH3 do gene codificando o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gene TDH3 = Sequência SEQ ID N° 39), • pTEF2.Kl do gene codificando o fator EF-1 alfa de alongamento translacional (gene TEF2 = Sequência SEQ ID N° 30), • pGPM1 do gene codificando Glicerato FosfoMutase (gene GPM1 = Sequência SEQ ID N° 33), • pPDC1 do gene codificando piruvato descarboxilase (gene PDC1 = Sequência SEQ ID N° 35), • pENO2 do gene codificando Enolase II (gene ENO2 = sequência SEQ ID N° 29), • pTEF3 do gene codificando a subunidade Gama de fator eEFIB de alongamento translacional (gene TEF3 = Sequência SEQ ID N° 31), • pFBA1 do gene codificando a Frutose 1,6-bisfosfato aldolase II (gene FBA1 = Sequência SEQ ID N° 34), • pPGK1 do gene codificando a 3-fosfoglicerato quinase (gene PGK1 = Sequência SEQ ID N° 36), • pPYK1 do gene codificando a piruvato quinase (gene PYK1 = sequência SEQ ID N° 49), • pTPI1 do gene codificando a Triose Fosfato Isomerase (gene TPI1 = Sequência SEQ ID N° 50), ou • pTEF1 do gene codificando o fator EF-1 alfa de alongamento translacional (gene TEF1 = Sequência SEQ ID N° 38).

[00181] Além disso, promotores homólogos de outras leveduras intimamente relacionadas também podem ser usados como promotores a partir de outras formas de leveduras do gênero Saccharomyces, ou levedura de outro gênero, tais como a Candida, Debaryomyces, Pichia ou Kluveromyces.

[00182] Promotores sintéticos, conforme descrito em Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58 também podem ser usados.

[00183] Mais particularmente, ditos promotores, idênticos ou diferentes, podem ser preferencialmente caracterizados por uma sequência de ácido nucleico selecionado a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80% de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29 a 39, 49 e 50.

[00184] De acordo com uma modalidade particular, cada um dentre ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e NADH oxidase está sob o controle de um terminador de transcrição, idêntico ou diferente, ditos terminadores de transcrição sendo caracterizados por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80% de identidade de ácido nucleico com sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40 a 48.

TERMINADOR

[00185] Por razões óbvias, cada um dentre ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e NADH oxidase é ligado a um terminador de transcrição (que também pode ser denominado "terminador" neste documento), idêntico ou diferente.

[00186] Ditos terminadores de transcrição, idênticos ou diferentes, podem ser encontrados na literatura Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.

[00187] Terminadores mais particularmente interessantes na presente invenção podem ser selecionados a partir o grupo compreendendo: • tTPI1 do gene codificando a Triose Fosfato Isomerase (gene TPIl = Sequência SEQ ID N° 44), • tMET25 do gene codificando a O-acetil homoserina-O-acetil serina sulfidrilase (gene Met25 = Sequência SEQ ID N° 45), • tADH1 do gene codificando o álcool desidrogenase (gene ADH1 = Sequência SEQ ID N° 43), • tENO2 do gene codificando Enolase II (gene ENO2 = Sequência SEQ ID N° 46), • tTDH2 do gene codificando o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, isoenzima 2 (gene TDH2 = Sequência SEQ ID N° 40), • tPGK1 do gene codificando a 3-fosfoglicerato quinase (gene PGKl = Sequência SEQ ID N° 48), • tCYCI (= Sequência SEQ ID N° 41), • tMET3 (= Sequência SEQ ID N° 47), • tTDH3 (= Sequência SEQ ID N° 42) e • tDITI (= Sequência SEQ ID N° 43).

[00188] Mais particularmente, dito terminador, idêntico ou diferente, pode ser preferencialmente caracterizado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80% de identidade com sequências SEQ ID NO: 32 a 40 e 43.

LEVEDURA RECOMBINANTE

[00189] De modo geral, levedura pode crescer rapidamente e pode ser cultivada em maior densidade em comparação com bactérias, e não requer um ambiente asséptico no cenário industrial. Adicionalmente, células de levedura podem ser mais facilmente separadas do meio de cultura em comparação com as células bacterianas, simplificando muito o processo de extração e purificação de produto.

[00190] Preferencialmente, a levedura da invenção pode ser selecionada dentre o gênero Saccharomyces, CandidaAshbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus ou Malassezia.

[00191] Mais preferencialmente, a levedura pode ser levedura Crabtree positiva do gênero dentre Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces ou Brettanomycces.

[00192] Mais preferencialmente, a levedura pode ser da espécie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus ou Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa, Torulaspora glabrata.

[00193] Mais preferencialmente, a levedura recombinante pode pertencer ao gênero Saccharomyces, e, preferencialmente, à espécie Saccharomyces cerevisiae.

[00194] Conforme mencionado acima, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, possui uma atividade de piruvato descarboxilase que é reduzida pela inserção de pelo menos um construto de DNA selecionado a partir do grupo compreendendo as fórmulas de (I) a (III), e, preferencialmente, de pelo menos um dentre dito construto de DNA compreendendo apenas pelo menos um ácido nucleico codificando ALS e/ou ALD.

[00195] De acordo com uma modalidade preferencial, a levedura recombinante pode ser uma Saccharomyces cerevisiae recombinante, e a atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção de apenas dois genes pdc. Mais preferencialmente, o(s) gene(s) pdc interrompido(s) pode(m) ser selecionado(s) a partir do grupo que consiste em pdc1, pdc5, pdc6 e uma mistura destes, e preferencialmente em pdc1 e pdc6.

[00196] Métodos implementados para inserir um construto de DNA específico dentro de um gene, e mais particularmente um gene de piruvato descarboxilase, pertencem ao conhecimento geral de um versado na técnica. Um método relacionado é descrito mais detalhadamente nos exemplos a seguir.

MODALIDADES MAIS PREFERENCIAIS

[00197] Vantajosamente, os ácidos nucleicos codificando enzimas implementadas na presente invenção são vantajosamente escolhidos dentre ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea, NOXE.spn, NOXE. Ll e uma mistura destes.

[00198] De acordo com uma modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Saccharomyces, particularmente espécies Saccharomyces cerevisiae, em que a atividade de piruvato descarboxilase endógena é reduzida pela interrupção de pelo menos dois genes pdc, particularmente pela interrupção de genes pdc 1 e pdc 6, em que: - um dos genes pdc, preferencialmente o gene pdc 1, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIe) abaixo: 5'-[(prom5)y1-ALS.Bs-term5]x5-[prom1-ALS.Bs-term1]x1-[prom2-ALD.Ll- (term2)z1]x2-3' (IIe), e - o pelo menos outro gene pdc, distinto do gene pdc interrompido mencionado acima, e, preferencialmente, o gene pdc 6, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIf') abaixo: 5'-[(prom5)y1-ALS.Pp-term5]x5-[prom1-ALS.Pp-term1]x1-[prom2- ALD.Ea-(term2)z1]x2-3' (IIf'), e em que o construto de DNA da seguinte fórmula (IIf"): 5'-[(prom3)y2-NOXE. Ll-(term3)z2]x3-3' (IIf"), é inserido no gene URA3, em que: - prom1, prom2, prom3, prom5, term1, term2, term3, term5, "y1", "y2", "z1" e "z2" são tais como definidos acima e ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea e NOXE.Ll são tais como definidos na Tabela 1 a seguir, - cada um dentre "x1", "x2" e "x3", independentemente entre si, representa um número inteiro que varia de 0 a 50, mais particularmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 10, mais particularmente de 0 a 3, e, em particular, igual a 1; - "x3" representa um número inteiro que varia de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 12, mais particularmente de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4 e ainda melhor igual a 3, desde que dita levedura recombinante compreenda pelo menos um ácido nucleico codificando cada ALS, ALD e NOXE, e mais particularmente, desde que cada construto de DNA de fórmula (IIe) e (IIf') compreenda, cada um, pelo menos um ácido nucleico codificando cada ALS e ALD.

[00199] Em vista do exposto acima, e embora seja implicitamente divulgado, especifica-se que, entre cada um das fórmulas (IIe) e (IIf'): - "x1" a "x3", "x 5", "y1", "y2", "z1" e "z2"; e/ou - o promotor e/ou terminador para cada cópia de ácidos nucleicos para um gene considerado podem ser idênticos ou diferentes.

[00200] De acordo com uma modalidade preferencial particular, uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Saccharomyces, particularmente espécies Saccharomyces cerevisiae, em que a atividade de piruvato descarboxilase endógena é reduzida pela interrupção de pelo menos dois dos genes pdc, particularmente pela interrupção de genes pdc 1 e pdc 6, em que: - um dos genes pdc, preferencialmente o gene pdc 1, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIg) abaixo: 5'-[ALS.Bs-tTDH2]1-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]1-3' (IIg), - pelo menos outro gene pdc, distinto do gene pdc interrompido mencionado acima, e, preferencialmente, o gene pdc 6, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIh') abaixo: 5'-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]1-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]1-3'a (IIh') e em que o construto de DNA da seguinte fórmula (IIh"): 5'-[pENO2-NOXE. Ll-tPGK1]12-3' (IIh") é inserido no gene URA3, em que: - o gene "ALS.Bs" de construto de DNA de fórmula (IIg) está sob o controle do promotor do gene pdc em que dito construto de DNA de fórmula (IIg) é inserido, - pENO2, pADH1, pTDH3, tTDH2, tCYC1, tDPI1, tMET25 e tPGK1 são tais como definidos no presente relatório descritivo e mais particularmente nas sequências de listagem a seguir, - ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea e NOXE.Ll são tais como definidos na tabela 1 a seguir e de modo particular na listagem de sequências a seguir.

[00201] De acordo com uma modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser adicionalmente modificada para otimizar a produção de acetoína.

Uso de fontes alternativas de açúcar:

[00202] O uso direto de uma fonte alternativa de açúcar, tal como amido, exige, adicionalmente, a super-expressão em levedura de α-amilase exógena e glicoamilase (Buscke et al. biosource technology 2013).

Importação de açúcar- Melhoria da importação de açúcar C5

[00203] A importação de pentoses por microrganismo recombinante é um tema importante para o processo industrial, uma vez que açúcares C5 são constituintes principais de biomassa lignocelulósica hidrolisada. Cepas nativas de S. cerevisiae, como muitos outros tipos de levedura, são incapazes de utilizar tanto xilose quanto arabinose, como substratos fermentativos (Hahn-Hagerdal et al., 2007; Jin et al., 2004). Curiosamente, é capaz de absorver xilose, embora o açúcar não seja um substrato natural (Hamacher et al., 2002).

[00204] S. cerevisiae GAL2, HXT1, HXT2, HXT4, HXT5 e HXT7 catalisam a absorção de xilose porque eles têm uma especificidade de substrato ampla (Hamacher et al., 2002; Saloheimo et al., 2007; Sedlak & Ho 2004). Entretanto, sua afinidade com xilose é muito menor do que para com glicose, e a absorção de xilose pelos transportadores é fortemente inibida pela glicose (Saloheimo et al., 2007).

[00205] Várias mudanças são necessárias para obter uma cepa capaz de crescer e consumir xilose e/ou arabinose. Essas modificações diferentes são uma parte da invenção.

Super-expressão de transportadores de xilose heteróloga:

[00206] A fim de melhorar a absorção de xilose e arabinose, a cepa de produtor de acetoína recombinante tem de ser modificada para expressar genes heterólogos que codificam transportadores de xilose ou arabinose. Por exemplo, os genes GXF1, SUT1 e AT5g59250 a partir de Candida intermedia, Pichia stipitis e Arabidopsis thaliana, respectivamente, são super-expressados para melhorar a utilização de xilose pela levedura (Runquist et al., 2010).

Super-expressão das vias envolvidas no metabolismo de xilose e arabinose:

[00207] Cepas de leveduras são capazes de absorver xilose, embora o açúcar não seja um substrato natural. Embora genes para a assimilação de xilose estejam presentes em S. cerevisiae eles não são expressos em um nível suficiente para permitir a absorção significativa de açúcar. Deste modo, as modificações genéticas são necessárias para melhorar a assimilação de açúcares de pentose. Todas as enzimas que permitem a transformação de xilose ou arabinose em xilitol precisam ser potencializadas, bem como as enzimas que convertem xilitol em xilulose e xilulose em xilulose-5-fosfato. Ou os genes homólogos das vias de xilose e arabinose devem ser genes super-expressos ou heterólogos de bactérias devem ser super-expressos.

[00208] Em uma modalidade da invenção, a absorção de xilose e sua assimilação pela cepa são melhoradas pela super-expressão, por exemplo: 1) Genes XYL1 ou GRE3 codificando aldolase redutase de P. stipitis e S. cerevisiae, respectivamente, associados à super-expressão de XYL2 codificando o xilitol desidrogenase a partir de P. stipitis, combinado com a super-expressão de genes XKS 1 ou XYL3 codificando a xiluloquinase de S. cerevisiae e P. stipitis, respectivamente, 2) O gene xylA codificando uma xilose isomerase a partir de bactérias ou Piromyces associadas à super-expressão de genes XKS1 ou XYL3 codificando xiluloquinase de S. cerevisiae e P. stipitis, respectivamente.

[00209] Em outra modalidade da invenção, a absorção de arabinose e sua assimilação pela cepa são melhoradas pela super- expressão, por exemplo: 1) Genes homólogos XYL1 ou GRE3 codificando aldolase redutase de P. stipitis e S. cerevisiae, respectivamente, associadas a ladl codificando L-arabinitol 4-hidrogenase e Ixrl codificando L-xilulose redutase a partir de Trichoderma reesei, em combinação com a super-expressão de XYL2 codificando xilitol desidrogenase a partir de P. stipitis, e, além da super-expressão de genes XKS1 ou XYL 3 codificando a xiluloquinase de S. cerevisiae e P. stipitis, respectivamente, 2) Genes heterólogos araA e araB codificando arabinose isomerase bacteriana e ribulose quinase.

Otimização da via da pentose fosfato:

[00210] Isso pode ser feito pela super-expressão de pelo menos um gene pertencente à via de pentose fosfato não oxidativa; TALI, TKL1, RKL1 e RPE1 da cepa de levedura.

[00211] Otimização da disponibilidade de cofatores NAPDH exigidos pelas enzimas envolvidas no metabolismo de açúcares C5.

[00212] Isto é obtido pela expressão de transidrogenases de E. coli na cepa de levedura. Os genes udhA e/ou pntAB de E. coli serão super- expressos na cepa produtora.

Prevenção do consumo de glicose para a síntese de glicerol:

[00213] Isso pode ser feito pela interrupção do gene GPD1 que codifica o glicerol-3-fosfato desidrogenase EC 1.1.1.8. (GPDH).

[00214] A presente invenção, de acordo com esta modalidade, é interessante, notavelmente tendo em conta o rendimento em acetoína, apesar do fato de que a interrupção do gene GPD1 leva à remoção de uma atividade de enzima que consome NADH em favor de NAD. Para contrabalançar o desequilíbrio redox assim gerado, cepa interrompida de GPD1 pode exigir expressão adicional de NOXE.

[00215] De acordo com uma modalidade particular, uma cepa recombinante, de acordo com a presente invenção, é de tal modo que não compreende quaisquer modificações genéticas, as quais tem o efeito de reduzir a repressão de glicose, conforme divulgado em WO 2011/041426 ou Kim et al. (Bioresource Technology, Vol. 146, 2013: 274).

[00216] De acordo com uma modalidade particular, uma cepa recombinante, de acordo com a presente invenção, é de tal modo que não compreende quaisquer modificações genéticas para permitir expressar quaisquer vias de assimilação de xilose, conforme divulgado em Kim et al., (Journal of Biotechnology, 2014).

CONDIÇÕES DE CULTURA

[00217] A presente invenção também refere-se ao uso de uma levedura recombinante tal como definida acima, para a produção de acetoína e/ou derivados desta, em particular, metil vinil cetona (MVK).

[00218] A presente invenção diz respeito, adicionalmente, a um método de produção de acetoína compreendendo as seguintes etapas: - prover um microrganismo recombinante, como descrito anteriormente, cultivar o microrganismo recombinante em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono e - recuperar a acetoína.

[00219] Normalmente, os microrganismos da invenção são cultivados a uma temperatura no intervalo de cerca de 20 °C a cerca de 37 °C, preferencialmente a uma temperatura que varia de 27 a 34 °C, em um meio de cultura apropriado.

[00220] Quando a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pertence à espécie S. cerevisiae, a temperatura pode vantajosamente variar de 27 a 34 °C, em um meio de cultura apropriado.

[00221] Meios de crescimento adequados para levedura são meios preparados comercialmente comuns, tal como caldo que inclui base de nitrogênio de levedura, sulfato de amônio e dextrose como fonte de carbono/energia) ou Meio YPD, uma mistura de peptona, extrato de levedura e dextrose em proporções ideais para maior cultivo. Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser usados, e o meio apropriado para o crescimento do microrganismo particular será conhecido por um versado na técnica de ciência de microbiologia ou fermentação.

[00222] O termo "meio de cultura apropriado" é definido acima.

[00223] Exemplos de meios de cultura conhecidos para uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, são conhecidos por versados na técnica e são apresentados na seguinte publicação D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).

[00224] Intervalos de pH adequados para a fermentação podem estar entre pH 3,0 a pH 7,5, em que o pH 4,5 a pH 6,5 é preferencial como a condição inicial.

[00225] Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbias ou condições microaeróbias.

[00226] A quantidade de produto no meio de fermentação pode ser determinada usando um número de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou a cromatografia gasosa (GC).

[00227] O presente processo pode empregar um método de fermentação gradual. Uma fermentação gradual clássica é um sistema fechado em que a composição do meio é definida no início da fermentação, e não submetida a alterações artificiais durante a fermentação. Deste modo, no início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo ou organismos desejados, e permite-se que a fermentação ocorra sem adicionar nada ao sistema. Normalmente, entretanto, uma fermentação "gradual" é um lote com respeito à adição de fonte de carbono, e são frequentemente feitas tentativas ao controlar fatores, tais como temperatura, pH e concentração de oxigênio. Em sistemas graduais, as composições de metabólito e biomassa do sistema mudam constantemente até o momento quando a fermentação é interrompida. Dentro do progresso de células de culturas graduais através de uma fase de retardo estático para uma fase de registro de alto crescimento, e, finalmente, para uma fase estacionária em que a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Se não forem tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrerão. Células em fase de registro geralmente são responsáveis pela maior parte da produção do produto final ou intermediário.

[00228] Um sistema de alimentação gradual (Fed-Batch) também pode ser usado na presente invenção. Um sistema de alimentação gradual é semelhante a um sistema gradual típico com a exceção de que o substrato de fonte de carbono é adicionado em incrementos no decorrer da fermentação. Sistemas de alimentação gradual são úteis quando a repressão catabólica (por exemplo, repressão de glicose) é capaz de inibir o metabolismo das células e em que é desejável ter quantidades limitadas de substrato nos meios. Medição da concentração de substrato real em sistemas de alimentação gradual é difícil, e é estimada, portanto, com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tais como CO2.

[00229] Fermentações são comuns e bem conhecidas na técnica, e exemplos podem ser encontrados em Sunderland et al., (1992), incorporado neste documento como referência. Embora a presente invenção seja executada em modo gradual, está previsto que o método fosse adaptável à fermentação contínua.

[00230] Fermentação contínua é um sistema aberto, em que um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meios condicionados é removida simultaneamente para processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, em que as células estão principalmente na fase de registro de crescimento.

[00231] Fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou concentração de produto final. Por exemplo, um método irá manter um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou nível de nitrogênio em uma taxa fixa e permitirá que todos os outros parâmetros variem. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode ser continuamente alterada, enquanto a concentração de células, medida pela turbidez dos meios, é mantida constante. Sistemas contínuos lutam para manter as condições de estado de crescimento estacionário, e, deste modo, a perda de células devido ao meio ser retirado deve ser balanceada contra a taxa de crescimento de célula na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00232] É previsto que a presente invenção possa ser praticada usando processos graduais, de alimentação gradual ou contínuos, e que qualquer modo conhecido de fermentação seria adequado. Adicionalmente, é previsto que células possam ser imobilizadas em um substrato como catalisadores de células inteiras e submetidas a condições de fermentação para a produção.

[00233] A fim de ainda melhorar a produção de acetoína, uma modalidade particular pode consistir em cultivar as células de levedura recombinante em meio de cultura apropriado, tal como mencionado acima, em que o dito meio de cultura compreende uma quantidade ideal de fonte de carbono, especialmente glicose.

[00234] Preferencialmente, as células são cultivadas em tal meio de cultura ideal durante apenas uma parte da duração de cultura inteira. Em algumas modalidades, as células de levedura são incubadas no dito meio de cultura ideal 10 horas ou mais após o início da cultura, que engloba 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 horas ou mais após o início da cultura.

[00235] Preferencialmente, as células são cultivadas em tal meio de cultura ideal durante um período de tempo que varia de 5 horas a 15 horas, que inclui de 6 horas a 10 horas, por exemplo, 8 horas após o início da cultura.

[00236] Em modalidades preferenciais, a fonte de carbon compreendida em dito meio de cultura ideal consiste em glicose. Em modalidades preferenciais, o dito meio de cultura ideal compreende 12% p/p ou mais glicose, incluindo 15% p/p ou mais de glicose. Em modalidades preferenciais, o dito meio de cultura ideal compreende no máximo 40% p/p de glicose, que inclui, no máximo 35% p/p de glicose.

[00237] Deste modo, nas modalidades preferenciais descritas acima, um método para produzir acetoína, de acordo com a invenção, pode compreender, adicionalmente, entre as etapas (a) e (c), uma etapa intermediária (b) consiste em cultivar as células de levedura no dito meio de cultura ideal.

PURIFICAÇÃO DE ACETOÍNA

[00238] De acordo com um aspecto específico da invenção, a produção fermentativa de acetoína compreende uma etapa de isolamento da acetoína do meio de cultura. Recuperar a acetoína do meio de cultura é uma tarefa rotineira para um versado na técnica. Isso pode ser alcançado por uma série de técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitando a, destilação, a extração de gás, pervaporação ou extração líquida. O perito no campo sabe como adaptar os parâmetros de cada técnica dependente das características do material a ser separado.

[00239] A levedura como modelo de microrganismo na presente invenção foi retida pelo fato de a acetoína sintetizada ser inteiramente exportada para fora das células, deste modo, simplificando o processo de purificação.

[00240] A acetoína sintetizada pode ser coletada por destilação. Destilação pode envolver um componente opcional diferente do meio de cultura a fim de facilitar o isolamento de acetoína ao formar azeótropo, e, notavelmente, com água. Este componente opcional é um solvente orgânico, tal como o ciclohexano, pentano, butanol, benzeno, tolueno, tricloroetileno, octano, éter dietílico ou uma mistura destes.

[00241] Extração de gás é alcançada com um gás de extração escolhido dentre hélio, argônio, dióxido de carbono, hidrogênio, nitrogênio ou mistura destes.

[00242] Extração líquida é conseguida com solvente orgânico, tal como a fase hidrofóbica, tal como pentano, hexano, heptano, dodecano.

[00243] A partir de acetoína que é produzida pelas células de levedura recombinante descritas no presente relatório descritivo, derivados de acetoína, incluindo metil vinil cetona, podem ser obtidos através de vários métodos que são bem conhecidos pelo versado na técnica.

[00244] Em todo o relatório descritivo, incluindo as reivindicações, a expressão "compreendendo um" deve ser entendida como sendo sinônimo de "compreendendo pelo menos um", a menos que especificado de outra forma.

[00245] Além disso, a expressão "fórmulas de (I) a (III)", de acordo com o contexto considerado e salvo indicações contrárias, significa um construto de DNA de fórmulas (I), (II) e (III), mas também (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf'), (IIf"), (IIg), (IIh') e/ou (IIh").

[00246] Os termos "entre... e... " e "variando de... até..." devem ser entendidos como sendo inclusivos dos limites, a menos que especificado de outra forma.

[00247] Os exemplos e figuras que seguem são apresentados a título de ilustração e sem limitação implícita da invenção.

EXEMPLOS a) Protocolo para fazer uma cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante, de acordo com a invenção

[00248] Todas as cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinante implementadas adiante foram construídas a partir da cepa padrão W303 (Thomas e Rothstein (1989), Cell. 56, 619-630) usando o procedimento de genética molecular de levedura padrão (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) por D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).

[00249] Nestas cepas, atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção de pelo menos um dos genes pdc (pdc1, pdc5, pdc6) ou por substituição de seu promotor de transcrição cognato por um promotor fraco.

[00250] Nas cepas mais eficientes, apenas pdc1 e pdc6 foram deletados.

[00251] Uma variedade de enzimas exógenas foi expressa nas cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinante consideradas. Elas foram escolhidas de acordo com seus parâmetros enzimáticos de Michaelis Menten quando disponível (vide Tabela 1 adiante). Kcat alto para alta eficiência e variedade de Km para cobrir uma concentração diferente no substrato. Enzimas Paenibacillus polymyxa foram escolhidas porque este organismo é um produtor de 2,3 butanodiol natural, um produto derivado diretamente de acetoína. Portanto, possui enzimas que eficientemente catalisam a síntese de acetoína.

[00252] A nomenclatura de genes em relação às enzimas exógenas implementadas acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase e NADH oxidase formadora de água é exibida na Tabela 1 a seguir.

[00253] Estes genes são designados pela sigla da enzima seguida pela sigla do organismo de origem, conforme segue:Tabela 1

[00254] Além disso, para melhor compreensão dos seguintes genótipos: - ade2, his3, leu2, trp1 e ura3 são genes marcadores de auxotrofia. - Letras minúsculas significam que o gene considerado está inativo, letras maiúsculas refletem um gene ativo. - "::": após um nome de gene significa que o gene é interrompido pelo que se segue (se mais de um gene for inserido, eles são observados entre colchetes []). A interrupção do gene é concomitante com uma deleção completa da sequência de codificação, mas preserva o promotor. Em consequência, o gene seguido por "::" é inativo e é observado em minúsculas. Se não especificado, a transcrição do gene inserido é controlada pelo promotor do gene interrompido. - "gene.Kl" significa que o gene se origina a partir de Kluyveromyces lactis. - Promotores de Transcrição permitindo a super-expressão constitutiva de um determinado gene são encontrados na literatura (velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251). Os promotores usados neste documento são designados por "p", seguido de seu nome de gene cognato. Seu número de sequência respectiva também é mencionado adiante. - Terminadores de Transcrição também são colocados após cada gene. Para evitar regulação indesejável, promotores e terminadores dando estrutura a um gene inserido não foram tirados do mesmo gene original. Os terminadores usados neste documento são designados por "t", seguido de seu nome de gene cognato. Seu número de sequência respectiva também é mencionado adiante.

[00255] Agrupamento de genes mencionados acima foram prontamente integrados em levedura recombinante usando a capacidade de levedura para eficientemente recombinar extremidades livres de DNA que possuem homologia de sequência.

[00256] Levedura recombinante foi obtida de acordo com métodos publicados disponíveis ao versado na técnica. Notavelmente, pode ser seguido o método descrito em Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, N° 2: e16) e Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517: 203), eventualmente com apenas pequena variação.

[00257] Mais particularmente, as sequências de codificação a serem clonadas foram artificialmente sintetizadas. Para sequências heterólogas (não levedura), as sequências nucleicas foram modificadas a fim de obter a sequência de codificação sinônima usando o uso de códon de levedura. Usando a tecnologia de clonagem clássica e enzima de restrição, cada sequência sintética foi clonada entre um promotor de transcrição e um terminador de transcrição. Cada sequência de promotor é precedida por uma sequência de 50 a 200 nucleotídeos homóloga à sequência do terminador do gene a montante. Da mesma forma, o terminador de cada gene (um gene compreendendo o terminador de sequência de codificação de promotor) é seguido por sequências homólogas ao gene imediatamente a seguir. De tal modo, cada uma dentre a unidade a ser integrada tem uma sobreposição de 50-200 nucleotídeos, tanto com a unidade a montante quanto com a unidade a jusante. Para a primeira unidade, o promotor é precedido por 50-200 nucleotídeos homólogos ao nucleotídeo do cromossomo de levedura para o local em que será integrado. Da mesma forma, para a última unidade, o terminador é seguido por 50-200 nucleotídeos homólogos ao nucleotídeo do cromossomo de levedura para o local em que será integrado.

[00258] Cada unidade é, então, amplificado por PCR a partir dos construtos de plasmídeos, rendendo unidade X de DNA linear com sobreposição de sequências. Um deste gene é um marcador auxotrófico a fim de selecionar em caso de recombinação. Todos os fragmentos lineares são prontamente transformados na levedura, e levedura recombinante é selecionada para a auxotrofia relacionada com o marcador usado. A integridade da sequência é então verificada por PCR e sequenciamento.

b) Com relação às enzimas ALS e ALD

[00259] Enzimas ALS e ALD não foram avaliadas individualmente, mas em pares (ALS + ALD) através do rendimento de acetoína. Três ALD e ALS exógenas foram escolhidas de acordo com seus parâmetros cinéticos: ALS.Nt, ALS.Pp, ALS.Bs e ALD.Bb, ALD.Ll, ALD.Ea (vide acima).

[00260] Oito das nove combinações possíveis de ALS e ALD foram conjuntamente inseridas no cromossomo de uma cepa de levedura ura3 atrás de promotores e seguidas por um terminador.

[00261] A inserção destes dois genes interrompe o gene pdc1. O gene marcador de URA3 é concomitantemente inserido para selecionar o transformante. Combinação de ALS/ALD foram inseridas na cepa YA747, ou seja, um derivado de W303 com o seguinte genótipo: YA747: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp, pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3.

[00262] Foram construídas as seguintes cepas: YA768: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdcl:: [-ALS.Bs- tTPII, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 NB: neste caso, o gene "ALS.Bs" está sob o controle do promotor natural de pdc1, ou seja, o promotor pPDC1. YA769: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Nt- tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA770: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp- tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA771: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Nt- tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA772: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Nt- tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA773: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp- tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA810: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs- tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA811: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp- tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3

[00263] Todas estas cepas foram cultivadas por 24 horas em 8% de glicose YPA (1% de extrato de levedura, 2% de Bacto peptona, adenine 0,1 mM, 8% de glicose). Elas foram coletadas e o teor de acetoína e de etanol foi determinado de acordo com os métodos padrões com especificidade adaptada em Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

[00264] Para algumas cepas, vários clones foram analisados, o último número após o "-" é o número de clone. Observe que, como a enzima bdh endógena é interrompida, nenhum 2,3-BDO é produzido.

[00265] A produção de etanol e acetoína é monitorada seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

Resultados

[00266] Tabela 2 a seguir exibe a produção de acetoína das cepas testadas mencionadas acima.Tabela 2

[00267] A partir desses resultados, é possível concluir que, tomados separadamente, as melhores enzimas para potencializar a produção de acetoína ALS Pp, ALS Nt, ALD Ea e ALD Bb, que, de fato, aparece como sendo a enzima mais eficiente.

c) O efeito técnico vantajoso da enzima NOXE no rendimento de acetoína

[00268] Preparou-se uma levedura recombinante de acordo YA1609. YA1609: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2- pENO2-ALD.Ll- tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12

[00269] YA1609-1, YA1609-2 e YA1609-4 são clones diferentes desta cepa YA1609.

[00270] Percebe-se que estas leveduras recombinantes sempre têm sua atividade de BHH endógena natural.

[00271] Estas cepas foram então analisadas para produção de acetoína em 16% de glicose YPA (extrato de levedura 1%, Bacto peptona 2%, adenina 0,1 mM, glicose 8%) nas mesmas condições daquelas descritas acima.

[00272] A produção de etanol e acetoína é monitorada seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

Resultados

[00273] Os resultados são relatados na tabela 3 a seguir. Tabela 3

[00274] Esses resultados mostram que a presença de NOXE leva a um acúmulo muito significativo de acetoína.

[00275] YA1609-4 é agora implementado em um mesmo meio de cultura do que o mencionado acima. O presente ensaio, entretanto, difere pelos seguintes parâmetros: Ambiente: 0,5 l de YPA, 16% de glicose. 16 horas após o início da cultura celular, células foram incubadas em um meio de cultura compreendendo uma concentração final de 16% p/p de glicose por um período de 8 horas. Agitação: 800 rpm (2 blocos), 1,9 ms-1 Temperatura: 30 °C Ar: 0,15 l/min (0,3vvm)

[00276] As células foram então analisadas para produção de acetoína. A produção de etanol e acetoína é monitorada seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

Resultados

[00277] Os resultados são relatados na tabela 4 a seguir. Tabela 4

[00278] Esses resultados mostram que os parâmetros de cultura considerados também podem influenciar a produção de acetoína.

d) Exemplos adicionais de leveduras recombinantes que produzem acetoína

[00279] Leveduras recombinantes adicionais foram preparadas, as quais são descritas a seguir. YA1573-4: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll- tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea- tMET25,pTEF2-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12 YA1609-4: MAT-a,his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll- tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12 YA1661-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll- tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12.

[00280] Percebe-se que estas leveduras recombinantes sempre têm sua atividade de BHH endógena natural.

[00281] Estas cepas foram então analisadas para produção de acetoína em 16% de glicose YPA (extrato de levedura 1%, Bacto peptona 2%, adenina 0,1 mM, glicose 8%) nas mesmas condições daquelas descritas acima.

[00282] A produção de etanol e acetoína é monitorada seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

Resultados

[00283] Os resultados são relatados na tabela 5 a seguir. Tabela 5

[00284] Estes resultados da Tabela 5 mostram que a presence de uma pluralidade de ácidos nucleicos codificando NOXE na levedura recombinante leva a um maior acúmulo de acetoína, em comparação com as leveduras recombinantes transformadas com um único ácido nucleico codificando NOXE.

e) Prevenção das fugas de acetoína para 2,3-BDO

[00285] Pelo menos um gene dentre os seguintes genes endógenos bdh1, bdh2, adh1, adh3 e/ou adh4 podem ser inativados. Em algumas cepas, os marcadores de auxotrofia foram reintroduzidos para torná-las protótrofo. Todos têm os mesmos promotores e terminadores que YA1660: YA1660-2, YA1660-3, YA1660-4 e YA1711-16C: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12. YA1711-45c: Mat-α, , his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2- ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea- tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2- NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12 YA1711-13A, YA1711-16B: Mat-a, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA1711-19A e YA1711-46A: Mat-α, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA1822-1 e YA1822-2: Mat-α, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn- LEU2.Kl], trp1::TRP1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA 1870-10A: Mat-a, adh3::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA 1870-11B: Mat-α, adh3::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA1870-10B: Mat-α, adh1::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA1870-11A: Mat-α, adh1::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12 YA1870-2A e YA1870-3D: Mat-a, adh1::TRP1.Kl, adh3::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp— loxP], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl-loxP], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12

[00286] Todas as cepas descritas acima, bem como YA1609-4, YA1661-2 e combinações diploides destas cepas devem ser consideradas como cepas com um rendimento de acetoína melhorado.

f) Exemplos adicionais mostrando a prevenção da fuga de acetoína para 2,3-BDO

[00287] A cepa YA1711-19A foi cultivada em um fermentador de 3 l em extrato de levedura a 2%, sacarose a 10%, de 0 a 24 horas, então, 600 g de glicose foi lentamente adicionada (30 g/l por 20 horas)

[00288] As seguintes cepas, todas as quais consistem em cepas em que ALS, ALD e NOXE exógenas foram introduzidas, foram incubadas em frascos de Erlenmeyer de 500 ml e agitadas por 24 horas e 48 horas a 30 °C em extrato de levedura a 2% e sacarose a 30%:LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Claims (5)

1. Levedura recombinante produtora de acetoína pertencente à espécie Saccharomyces cerevisiae com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida em comparação com a levedura não recombinante correspondente, caracterizada pelo fato de que em seu genoma foi inserido: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato sintase (ALS) tendo ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) do grupo consistindo nas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 e 5, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e 6, - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato descarboxilase (ALD) tendo ácido(s) nucleico(s) selecionado(s) do grupo consistindo nas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 e 11, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e 12, e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando uma NADH oxidase (NOXE) tendo sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e 16, dita atividade de piruvato descarboxilase sendo reduzida por (i) interrupção de pelo menos um gene que codifica uma piruvato descarboxilase pela inserção no dito pelo menos um gene que codifica uma piruvato descarboxilase pelo menos um construto de DNA exógeno, (ii) mutações em regiões reguladoras, (iii) mutações em um códon inicial, notavelmente por substituição de AUG por GUG, (iv) mutações em sequências codificadoras que alteram a atividade enzimática; (v) mutações, inserções ou deleções na sequência codificadora que alteram a estabilidade da proteína ou (vi) mutações que alteram a meia-vida do RNAm da piruvato descarboxilase.

2. Levedura recombinante, de acordo a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção de pelo menos um gene pdc.

3. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção dos genes pdc1 e pdc6, e adicionalmente pela atenuação do gene pdc5.

4. Uso de uma levedura recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a produção de acetoína e/ou seus derivados, particularmente de metil vinil cetona.

5. Método para produzir acetoína, dito método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar a levedura recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em um meio de cultura apropriado contendo pelo menos uma fonte de carbono; e (b) recuperar a acetoína.