BR112017001539B1 - Levedura recombinante produtora de 2,3-butanodiol, uso desta e método para produzir 2,3-butanodiol - Google Patents

Abstract

LEVEDURA RECOMBINANTE PRODUTORA DE 2,3-BUTANODIOL, USO DESTA E MÉTODO PARA PRODUZIR 2,3-BUTANODIOL. Levedura recombinante, caracterizada pelo fato de que possui uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida no genoma do qual foi inserida: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma síntese de acetolactato ou ALS, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um acetolactato decarboxilase ou ALD, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um butanodiol desidrogenase ou BDH, e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando um NADH oxidase ou NOXE.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito a microrganismos tendo um percurso de 2,3-butanodiol melhorado. O microrganismo recombinante é modificado para melhorar a produção de 2,3-butanodiol comparado ao microrganismo não modificado. A invenção também provê métodos para usar tais microrganismos para produzir 2,3-butanodiol.

[0002] FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO:

[0003] 2,3-butanodiol (2,3-BDO) é uma plataforma química multifuncional que pode ser usada para produzir outros químicos em massa e sintetizar diversos produtos, tais como drogas, cosméticos e solventes industriais (Celinska and Grajek, 2009; Syu, 2001).

[0004] Mais particularmente, 2,3-BDO pode ser usado em aplicações industriais consideráveis em mercados importantes, doravante resumidos.

[0005] Duas das aplicações mais interessantes de 2,3-BDO são Metil Etil Cetona (solvente MEK) e butadieno (BDE), um monômero principal na produção de borracha sintética e pneus.

[0006] A síntese química tradicional de 2,3-BDO encontra a desvantagem da deficiência de petróleo e poluição ambiental, enquanto a produção de 2,3-BDO está atualmente crescendo a uma taxa anual de 4 a 7% (Jiayang et al., 2006).

[0007] Muitos químicos que poderiam apenas ser produzidos por processos químicos tradicionais no passado agora possuem o potencial de serem gerados biologicamente usando recursos renováveis (Danner & Braun, 1999; Hatti-Kaul et al., 2007). Produção microbiana de 2,3-BDO é um exemplo. Interesse neste bioprocesso aumentou significativamente devido ao 2,3-BDO possuir um alto número de aplicações industriais, conforme mencionado acima, e produção microbiana aliviar a dependência de fornecimento de óleo para a produção de plataformas químicas (Celmska & Grajek, 2009; Wu et al., 2008). Saccharomyces cerevisiae é uma plataforma bem adequada para tal bioprocesso (Nielsen et al., 2013).

[0008] No entanto, no momento, o 2,3-BDO produzido por processo microbiano é um composto raramente usado em uma escala industrial devido a seu alto custo de produção, notavelmente ligado ao rendimento de produção pobre. A indústria química usa preferencialmente outros compostos químicos C4, tais como 1,4-BDO e ácido succínico.

[0009] Em relação à produção microbiana de 2,3-BDO, a maior parte dos estudos usou bactérias, tais como Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes e Paenibacillus polymyxa para produzir 2,3-BDO (Cho et al., 2012; Han et al., 2013; Hassler et al., 2012; Jung et al., 2012). Enquanto estas bactérias são capazes de produzir 2,3- BDO com alto rendimento e produtividade, elas são, entretanto, classificadas como bactérias patogênicas, de modo que a fermentação em larga escala possa ser difícil em termos de segurança e industrialização (Celinska and Grajek, 2009).

[00010] Produção de 2,3-BDO por um microrganismo GRAS (por exemplo, geralmente reconhecido como seguro) seria, portanto, desejável. Levedura, e mais particularmente Saccharomyces cerevisiae, é um microrganismo apropriado neste contexto. S. cerevisiae é conhecida para a produção de 2,3-BDO de modo natural, mas a produção e produtividade de produção de 2,3-BDO são pobres. Produção de etanol é, claramente, a barreira mais óbvia para a produção de 2,3-BDO eficiente em S. cerevisiae devido ao piruvato, um intermediário chave, ser preferencialmente usado para a produção de etanol em detrimento de 2,3-BDO.

[00011] De modo a minimizar a produção de etanol e maximizar a produção de 2,3-BDO, um piruvato descarboxilase mutante deficiente (Pdc) foi utilizado para a produção de 2,3-BDO, Entretanto, cepas deficientes de Pdc possuem o potencial de defeito para fermentações industriais (Flikweert et al., FEMS Microbiology Letters 174, 1999 73-79).

[00012] WO 2013/076144, WO 2011/040901 e US 2011/0124060 divulgam ocorrências não naturais de microrganismo tendo um percurso de 2,3-BDO melhorado. A interrupção de percursos de produção de etanol e acetato, US 2011/0124060 e WO 2013/076144 descrevem que isto leva a um estado redox desbalanceado ao qual a solução proposta consiste em aumentar a atividade de enzima dependente de NADH, e, possivelmente, a reserva de NAD+.

[00013] Em Soo-Jung Kim et al. (Bioresource Technology 146 (2013) 274-281) foi construído uma cepa deficiente de Pdc e envolvida para crescimento em glicose. A cepa deficiente de Pdc envolvida foi genotipada para identificar mudanças genéticas que possibilitem que a cepa deficiente de Pdc cresça em uma alta concentração de glicose. Entretanto, estas cepas crescem mais devagar quando comparado a cepas que tenham retido alguma atividade de pdc. Subsequentemente, o percurso de 2,3-BDO biosintético de Bacillus subtilis foi introduzido na cepa deficiente de Pdc para produzir 2,3-BDO de glicose de modo eficiente em S. cerevisiae. Esta cepa é mostrada como produzindo 96,2 g/L após 244h de cultivo, com uma produção de 2,3-BDO (0,28 g 2,3-BDO/g de glicose) e produtividade volumétrica (0,39 g 2,3-BDO/Lh-1). Entretanto, esta produção de 2,3-BDO não parece apropriada para ser economicamente viável sob um ponto de vista industrial.

[00014] Portanto, por razões óbvias, melhorar a produção de 2,3- BDO através de processos micróbicos, e mais particularmente de conversão de piruvato para 2,3-BDO, permanece um objetivo constante. Mais particularmente, ainda há a necessidade de um microrganismo recombinante estável tendo um rendimento de produção melhorado de 2,3- butanodiol, particularmente compatível com requisitos de industrialização.

[00015] RESUMO DA INVENÇÃO

[00016] A presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida no genoma do qual for inserida: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato sintase ou ALS, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um acetolactato decarboxilase ou ALD, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um butanodiol desidrogenase ou BDH, e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando um NADH oxidase ou NOXE.

[00017] De acordo com uma modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, pode compreender um ou mais construtos de DNA selecionados em um grupo compreendendo as seguintes fórmulas: (I) 5'-[Gene 1]x1-3’ e 5'-[Gene 2]x2-3’e 5'-[Gene 3]x3-3’ e 5'-[Gene 4]x4-3’, (II) 5'-[Gene 1]x1-[Gene 2]x2-[Gene 3]x3-3’ e 5’-[Gene 4]x4-3', (III) 5'-[Gene 1]x1-[Gene 2]x2-3’ e 5'-[Gene 3]x3-[Gene 4]x4-3', (IV) 5'-[Gene 1]x1-[Gene 2]x2-[Gene 3]x3-[Gene 4]x4-3', e uma combinação destes, em que: - "Gene 1" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE; - "Gene 2" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE, mas diferente do gene 1; - "Gene 3" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE, mas diferente dos genes 1 e 2; - "Gene 4" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE, mas diferente dos genes de 1 a 3; - "ALS" é um ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase; - “ALD” é um ácido nucleico codificando um acetolactato descarboxilase; - “BDH” é um ácido nucleico codificando um butanodiol desidrogenase; - “NOXE” é um ácido nucleico codificando um NADH oxidase; - cada um dos “x1”, “x2”, “x3” e “x4”, formados independente de outros, representa um número inteiro variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, mais preferencialmente um, e

[00018] provido que dita levedura recombinante compreenda pelo menos um ácido nucleico codificando para cada um de ALS, ALD, BDH e NOXE.

[00019] Preferencialmente, cada um dentre “x1”, “x2”, “x3” e”x4”, independentemente uns dos outros, representa um número inteiro no intervalo de 0 a 10, mais particularmente no intervalo de 0 a 5, particularmente no intervalo de 0 a 3, e ainda representa melhor um número inteiro igual a 1.

[00020] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois construtos de DNA de fórmula mencionada acima (II) idênticos ou diferentes, em que “Gene 4” significa um ácido nucleico codificando NADH oxidase.

[00021] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, construtos de DNA de fórmula (IIa), idênticos ou diferentes, em que cada fórmula (Iia) possui a seguinte fórmula.

[00022] (Iia) 5’-[(prom5)y1-Gene 1-term5]x5-[prom1-Gene 1- term1]x1-[prom2-Gene 2-term2]x2-[prom3-Gene 3-(term3)z1]x3-3’ e 5’- [(prom4)y2-Gene 4-(term4)z2]x4-3’ em que: - Gene 1, Gene 2, Gene 3, Gene 4, “x1”, “x2”, “x3” and “x4” são tais como definidos acima; - “x5” representa um número inteiro igual a 0 ou 1; - “y1”, “y2”, “z1” e “z2”, independente de outros, representam um número inteiro igual a 0 ou 1; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (Iia), então “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” e “z2” podem ser idênticos ou diferentes; - “prom 1” é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 1; - “prom 2” é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 2; - “prom 3” é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 3; - “prom 4” é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 4; - “prom 5” é uma sequência reguladora que controla a expressão do Gene 1, dito prom 5 sendo idêntico ou diferente do prom 1; - “term 1” é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 1; - “term 2” é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 2; - “term 3” é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 3; - “term 4” é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 4; e - “term5” é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de Gene 1, o dito term5 sendo idêntico ou diferente do term1.

[00023] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, construtos de DNA de fórmula (Iib), idênticos ou diferentes, em que cada fórmula (Iib) possui a seguinte fórmula.

[00024] (Iib) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1- [prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ e 5’-[(prom4)y2-NOXE- (term4)z2]x4-3’ em que: - ALS, ALD, BDH, NOXE, “x1”, “x2”, “x3”, “x4”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” e “z2” são tais como definidos acima; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (Iib), então “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” e “z2” podem ser idênticos ou diferentes; - “prom 1” é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação da acetolactato sintase; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação da acetolactato descarboxilase; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação de butanodiol desidrogenase; - "prom 4" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação de NADH oxidase; - "prom 5" é uma sequência reguladora que controla a expressão de sequência de codificação da acetolactato sintase, dito prom 5 sendo idêntico ou diferente do prom 1; - "term 1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação da acetolactato sintase; - "term 2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação da acetolactato descarboxilase; - "term 3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação de butanodiol desidrogenase; - "term 4" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação de NADH oxidase; e - "term 5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação da acetolactato sintase, dito term 5 sendo idêntico ou diferente do term 1.

[00025] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb), provido que todas as cópias de ácido nucleico NOXE estão localizadas em uma única de pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb).

[00026] De acordo com outra modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois, preferencialmente exatamente dois construtos de DNA das seguintes fórmulas (IIc) e (IId):

[00027] (IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1- [prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ e 5’-[(prom4)y2-NOXE- (term4)z2]x6-3'; e

[00028] (IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1- [prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ e 5’-[(prom4)y2-NOXE- (term4)z2]x7-3'; e em que: - ALS, ALD, BDH, NOXE, “prom1”, “prom2”, “prom3”, “prom4”, “prom5”, “term1”, “term2”, “term3”, “term4”, “term5”, “x1”, “x2”, “x3”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” e “z2” são tais como definidos acima. - "x1" a "x3" para cada fórmula (IIc) e (IId) sendo idênticos ou diferentes; - "x1" a "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" para cada fórmula (IIc) e (IId) sendo idênticas ou diferentes; e - "x6" e "x7" representam números inteiros variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 12, mais particularmente de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4 e ainda melhor igual a 3, provido que apenas um dentre "x6" e "x7" represente 0.

[00029] Esta invenção também pertence a um uso de uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, para a produção de 2,3-butanodiol (BDO) e/ou derivados diretos destes.

[00030] Particularmente, ditos derivados diretos de 2,3-butanodiol (BDO) podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em butano- dieno (BDE), Metil-Etil-Cetona (MEK) ou uma mistura destes.

[00031] A invenção também diz respeito a um método para a produção de 2,3-butanodiol (BDO), dito método compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção em um meio de cultura apropriado; e (c) recuperar o 2,3-butanodiol (BDO).

[00032] Preferencialmente, dito meio de cultura compreende uma fonte de carbono, preferencialmente selecionado em um grupo compreendendo glicose e sacarose.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00033] A figura 1 mostra o percurso metabólico em uma cepa de levedura recombinante de modo a substituir a produção de etanol em prol de 2,3-BDO.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[00034] Os termos 2,3-butanodiol, 2,3-BDO ou BDO são usados de modo intercambiável no presente relatório descritivo, e se referem a butano-2,3-diol, também chamado de dimetileno glicol.

[00035] O termo "microrganismo", conforme usado neste documento, se refere a uma levedura que não é modificada artificialmente. O microrganismo pode ser "doador" se prover elemento genético para ser integrado no microrganismo "aceitador" que irá expressar este elemento genético exterior ou se for usado como ferramenta para construções genéticas ou expressões de proteínas. O microrganismo da invenção é escolhido dentre levedura que expressa genes para a biossíntese de 2,3- butanodiol.

[00036] O termo "microrganismo recombinante" ou "microrganismo geneticamente modificado" ou "levedura recombinante" ou "levedura geneticamente modificada", conforme usado neste documento, refere-se a uma levedura geneticamente modificada ou geneticamente criada. Isso significa, de acordo com o significado comum destes termos, que o microrganismo da invenção não é encontrado na natureza, e é modificado tanto pela introdução quanto deleção ou modificação de elementos genéticos de microrganismos equivalentes encontrados na natureza. Isso também pode ser modificado ao forçar o desenvolvimento e evolução de novos percursos metabólicos pela combinação direcionada de mutagênese e evolução sob pressão de seleção específica (ver, por exemplo, WO 2004/076659).

[00037] Um microrganismo pode ser modificado para expressar genes exógenos se estes genes foram introduzidos no microrganismo com todos os elementos permitindo suas expressões no microrganismo hospedeiro. Um microrganismo pode ser modificado para modular o nível de expressão de um gene endógeno. A modificação ou "transformação" de microrganismo, como levedura, com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para aqueles versados na técnica. Particularmente, uma modificação genética de um microrganismo, de acordo com a invenção, mais particularmente a(s) modificação(ões) genética(s) definidas neste documento, podem ser realizadas pelo uso de sistemas CRISPR-Cas, conforme descrito em DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., vol. 41, n° 7, 2013: 4336-4343).

[00038] O termo "gene endógeno" significa que o gene estava presente no microrganismo anteriormente a qualquer modificação genética, na cepa de tipo selvagem. Genes endógenos podem ser sobreexpressados pela introdução de sequências heterólogas em adição a, ou substituindo, elementos regulatórios endógenos, ou pela introdução de uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou plasmídeo. Genes endógenos também podem ser modificados para modular suas expressões e/ou atividades. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas na sequência de codificação para modificar o produto de gene, ou sequências heterólogas podem ser introduzidas em adição a, ou substituindo, elementos regulatórios endógenos. Modulação de um gene endógeno pode resultar em regulação e/ou melhoria da atividade do produto de gene, ou alternativamente, na regulação e/ou atenuação da atividade do produto de gene endógeno. Outra maneira de melhorar a expressão de genes endógenos é introduzir uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou em um plasmídeo.

[00039] O termo "gene endógeno" significa que o gene foi introduzido em um microrganismo, por meios bem conhecidos pelos versados na técnica, enquanto este gene não é ocorre de modo natural no microrganismo de tipo selvagem. Microrganismos podem expressar genes endógenos se estes genes forem introduzidos no microrganismo com todos os elementos permitindo suas expressões no microrganismo hospedeiro. Transformar microrganismos com DNA endógeno e uma tarefa de rotina para o versado na técnica. Genes endógenos podem ser integrados no cromossomo hospedeiro ou ser expressos de modo extra-cromossomático a partir de plasmídeos ou vetores. Uma variedade de plasmídeos, os quais diferem em relação a suas origens de replicação e seus números de cópias na célula, são conhecidos na técnica. A sequência de genes endógenos pode ser adaptada para suas expressões no microrganismo hospedeiro. Assim, o versado na técnica conhece a noção de polarização de uso de códon e como adaptar sequências nucleicas para uma polarização de uso de códon particular sem modificar a proteína deduzida.

[00040] O termo "gene heterólogo" significa que o gene é derivado a partir de uma espécie de microrganismo diferente a partir do microrganismo receptor que o expressa. Refere-se a um gene que não ocorre naturalmente no microrganismo.

[00041] No presente pedido, todos os genes são referenciados com seus nomes comuns e com referências a suas sequências nucleotídicas e, caso apareça, a suas sequências de aminoácidos. Usando as referências dadas em número de ascensão para genes conhecidos, aqueles versados na técnica serão capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas de bactérias, levedura, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando sequências consenso que podem ser determinadas pela realização de alinhamentos de sequência com genes derivados a partir de outros microrganismo e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo.

[00042] Versados na técnica conhecem diferentes maneiras de modular, e, particularmente, regular para cima ou para baixo a expressão de genes endógenos. Por exemplo, uma maneira de melhorar a expressão de genes endógenos é introduzir uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou em um plasmídeo.

[00043] Outra maneira é substituir o promotor endógeno de um gene com um promotor mais forte. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Promotores homólogos conhecidos que permitem um alto nível de expressão em levedura são os selecionados no seguinte grupo: ADH1, GPDH, TEF1, HXT7 truncado, PFK1, FBA1, PGK1, TDH3, etc. Promotores particularmente interessantes na presente invenção são doravante definidos em maiores detalhes.

[00044] Em levedura, construto de expressão de ácido nucleico preferencialmente compreende sequências reguladoras, tais como promotores e sequências terminadoras, as quais são operativamente ligadas com a codificação de sequência de ácido nucleico dos genes considerados, e mais particularmente para cada uma das enzimas ALS, ALD, BDH e NOXE mencionadas acima, de acordo com a presente invenção.

[00045] Construto de expressão de ácido nucleico pode adicionalmente compreender sequências de reconhecimento de 5' e/ou 3' e ou marcadores de seleção.

[00046] O termo "superexpressão" significa que a expressão de um gene ou de uma enzima é aumentada conforme comparado ao microrganismo não modificado. O aumento a expressão de uma enzima é obtido ao aumentar a expressão de um gene codificando dita enzima. O aumento da expressão de um gene pode ser realizado por todas as técnicas conhecidas pelos versados na técnica. A este respeito, deve ser notavelmente citado a implementação de um promotor forte a montante do ácido nucleico pretendido a ser superexpresso, ou a introdução de diversas cópias do dito ácido nucleico entre um promotor, especialmente um promotor forte e um terminador.

[00047] A "atividade" de uma enzima é usada de modo intercambiável com o termo "função", e designa, no contexto da invenção, a capacidade de uma enzima em catalisar a reação desejada.

[00048] Os termos "atividade reduzida" ou atividade atenuada" de uma enzima significa tanto uma atividade catalítica específica reduzida da proteína obtida pela mutação na sequência de aminoácidos e/ou concentrações diminuídas da proteína na célula obtida por mutação da sequência nucleotídica ou por deleção do gene cognato correspondente.

[00049] O termo "atividade reforçada" de uma enzima designa tanto uma atividade catalítica específica aumentada da enzima, e/ou uma quantidade/disponibilidade aumentada da enzima na célula, obtida, por exemplo, por superexpressão do gene codificando a enzima.

[00050] Os termos "codificar" ou "codificação" se referem ao processo pelo qual um polinucleotídio, através de mecanismos de transcrição e tradução, produz uma sequência de aminoácidos.

[00051] O(s) gene(s) codificando a(s) enzima(s) considerados na presente invenção podem ser exógenos ou endógenos.

[00052] "Atenuação" de genes significa que genes são expressos a uma taxa inferior a em microrganismos não modificados. A atenuação pode ser alcançada por meios e métodos conhecidos aos versados na técnica, e contém deleção de gene obtida por recombinação homóloga, atenuação de gene pela inserção de um elemento externo no gene ou expressão de gene sob um promotor fraco. Versados na técnica conhecem uma variedade de promotores que exibem forças diferentes e qual promotor deve-se usar para uma expressão genética fraca.

[00053] Os métodos implementados na presente invenção requerem, preferencialmente, o uso de um ou mais construtos de integração cromossomática para a introdução estável de uma sequência de nucleotídeo heterólogo em um local específico em um cromossomo ou para a interrupção funcional de um ou mais genes alvo em uma célula microbial modificada geneticamente. Em algumas modalidades, interrupção do gene alvo previne a expressão de proteína funcional relacionada. Em algumas modalidades, interrupção do gene alvo resulta na expressão de uma proteína não funcional a partir do gene interrompido.

[00054] Parâmetros de construtos de integração cromossomática que podem ser variados na prática da presente invenção incluem, mas não são limitados a comprimentos de sequências homólogas; sequência nucleotídica das sequências homólogas; comprimento da sequência de integração; sequência nucleotídica da sequência de integração; e a sequência de nucleotídica do local alvo. Em algumas modalidades, um intervalo efetivo do comprimento de cada sequência homóloga é de 20 a 5000 pares de base, preferencialmente de 50 a 100 pares de base. Em modalidades particulares, o comprimento de cada sequência homóloga é de cerca de 50 pares de base. Para mais informações sobre o comprimento de homologia requerida para cada gene alvo, ver D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harborlaboratory course Manual (2000).

[00055] Em algumas modalidades, o(s) gene(s) de piruvato descarboxilase interrompido em que o(s) construto(s) de DNA mencionados acima está(ão) inseridos pode(m) adicionalmente compreender um ou mais marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células microbianas transformadas. Preferencialmente, ditos marcadores selecionáveis são compreendidos no(s) construto(s) de DNA, de acordo com a presente invenção.

[00056] Em algumas modalidades, o marcador selecionável é um marcador resistente a antibiótico. Exemplos ilustrativos de marcadores de resistência a antibiótico incluem, mas não estão limitados a produtos de gene NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<;R>, e SH BLE. O produto de gene NAT 1 de S. noursei confere resistência a nourseotricina; o produto de gene AURI-C de Saccharomyces cerevisiae confere resistência a Auerobasidin A (AbA); o produto de gene HPH de Klebsiella pneumonia confere resistência a Hygromycin B; o produto de gene DSDA de E. coli permite que células cresçam em placas com D-serina como a fonte única de nitrogênio; o gene KAN<R> de Tn903 transposon confere resistência a G418; e o produto de gene SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confere resistência a Zeocina (bleomicina).

[00057] Em algumas modalidades, o marcador resistente a antibiótico é deletado após a célula microbiana geneticamente modificada da invenção ser isolada. Os versados na técnica são capazes de escolher marcador adequado em contexto genético específico.

[00058] Em algumas modalidades, o marcador selecionável resgada uma auxotrofia (por exemplo, uma auxotrofia nutricional) na célula microbiana geneticamente modificada. Em tais modalidades, uma célula microbiana parental compreende uma interrupção funcional em um ou mais produtos de gene que agem em um percurso de aminoácido ou de nucleotídeo biossintético, tal como, por exemplo, os produtos de gene HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 e URA 3 em levedura, o que resulta na célula microbiana parental incapaz de crescer no meio sem suplementação com um ou mais nutrientes (fenótipo auxotrófico). O fenótipo auxotrófico pode ser, então, resgatado pela transformação da célula microbiana parental com uma integração cromossômica codificando uma cópia funcional de um produto de gene interrompido (NB: a cópia funcional do gene pode se originar a partir de espécies fechadas, tais como Kluveromyces, Candida, etc.) e a célula microbiana geneticamente modificada pode ser selecionada com base na perda do fenótipo auxotrófico da célula microbiana parental.

[00059] Para cada uma das sequências de ácido nucleico compreendendo uma sequência de promotor, uma sequência de codificação (por exemplo, uma sequência de codificação de enzima), ou uma sequência de terminação, sequências de referência são descritas neste documento. O presente relatório descritivo também compreende sequências de ácido nucleico tendo porcentagens específicas de identidade de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico de referência.

[00060] Para cada uma das sequências de aminoácidos de interesse, sequências de referência são descritas neste documento. O presente relatório descritivo também compreende sequências de aminoácidos (por exemplo, sequências de enzimas de aminoácidos) tendo porcentagens específicas de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência.

[00061] Por razões óbvias, em toda a descrição presente, uma sequência específica de ácido nucleico, ou uma sequência específica de aminoácido que cumpre com, respectivamente, o nucleotídeo considerado ou a identidade de aminoácido, deve adicionalmente levar à obtenção de uma proteína (ou enzima) que apresenta a atividade biológica desejada. Conforme usado neste documento, a " porcentagem de identidade" entre duas sequências de ácido nucleico ou entre duas sequências de aminoácido é determinada pela comparação de ambas as sequências otimamente alinhadas através de uma janela de comparação.

[00062] A porção do nucleotídeo ou da sequência de aminoácido na janela de comparação pode, portanto, incluir adições ou deleções (por exemplo, "lacunas") em comparação com a sequência de referência (a qual não inclui estas adições ou estas deleções) de modo a obter um alinhamento ideal entre ambas as sequências.

[00063] A porcentagem de identidade é calculada ao determinar o número de posições em que uma base nucleica idêntica, ou um resíduo aminoácido idêntico, pode ser notado para ambas as sequências comparadas, então ao dividir o número de posições em que a identidade possa ser observada entre ambas as bases nucleicas, ou entre ambos os resíduos de aminoácidos, pelo número total de posições na janela de comparação, então ao multiplicar o resultado por cem para obter a porcentagem de identidade de nucleotídeo entre as duas sequências da porcentagem de identidade de aminoácido entre as duas sequências.

[00064] A comparação da sequência de alinhamento ideal pode ser efetivada por um computador usando algoritmos conhecidos.

[00065] Mais preferencialmente, a porcentagem de identidade de sequência é determinada usando o software CLUSTAL W (versão 1,82), cujos parâmetros são estabelecidos conforme segue: (1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUTORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREETYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAPOPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAPEXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram" and (18) TREE GRAPDISTANCES="hide".

[00066] A "fermentação" ou "cultura" é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura apropriado adaptado ao microrganismo sendo cultivado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e, se necessário, co-substratos.

[00067] Microrganismos divulgados neste documento podem ser crescidos em meio de fermentação para a produção de um produto de piruvato. Para produção máxima de 2,3-BDO, as cepas de microrganismo usadas como hospedeiras de produção preferencialmente possuem uma alta taxa de utilização de carboidrato. Estas características podem ser conferidas por mutagênese e seleção, engenharia genética ou podem ser natural. Meios de fermentação, ou "meio de cultura", para as presentes células podem conter pelo menos cerca de 10 g/L de glicose. Substratos de carbono adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, monossacarídeos, tais como frutose, manose, xilose e arabinose; oligossacarídeos tais como a lactose, maltose, galactose ou sacarose; polissacarídeos tais como amido ou celulose; ou misturas destes e misturas impuras de matérias-primas renováveis, tais como licor de lavagem de milho permeado por soro de queijo, melaço de beterraba sacarina e malte de cevada. Outros substratos de carbono podem incluir glicerol.

[00068] Portanto, é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode compreender uma alta variedade de carbono contendo substratos e irá apenas ser limitada pela escolha de organismo.

[00069] Embora seja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e misturas destes são adequados na presente invenção, substratos de carbono preferenciais são glicose, frutose e sacarose, ou misturas destes com açucares C5, tais como xilose e/ou arabinose para microrganismos modificados para usar açucares C5, e, mais particularmente, glicose.

[00070] Um substrato preferencial de carbono é sacarose.

[00071] De acordo com uma modalidade particular, um substrato de carbono, de acordo com a presente invenção, não consiste de xilose.

[00072] Em adição a uma fonte de carbono apropriada, meio de fermentação pode conter minerais adequados, sais, cofactores, sais- tampão e outros componentes conhecidos aos versados na técnica, adequados para o crescimento das culturas e promoção do percurso enzimático para a produção do produto desejado.

[00073] Além disso, modificações genéticas adicionais adequadas para o crescimento de microrganismos recombinantes, de acordo com a invenção, podem ser consideradas.

[00074] A presença de ácidos fracos é conhecida como uma limitação para o crescimento e são frequentemente presentes em celulose ou meios derivados de melaço.

[00075] Modificações genéticas adicionais, tais como a interrupção do gene JEN1 (ou nome sistemático: YKL217W ou número de ascensão de proteína P36035 (UniProtKB swiss-Prot)) e/ou a superexpressão do gene HAA-1 (nome sistemático: YPR008W ou número de ascensão Q12753 (UniProtKB swiss-Prot)) leva à melhoria da resistência de cepas para ácidos fracos no meio de cultura implementado.

[00076] Jen 1 é uma proteína de membrana responsável para importar lactato na célula (Casal M, et al. (1999), J. Bacteriol., 181(8): 26203).

[00077] HAA-1 é um ativador transcricional que controla a expressão de proteínas de estresse de membrana responsáveis por resistência à ácidos fracos. Sua superexpressão melhora a resistência de levedura para ácidos acéticos (Tanaka et al. (2012) Appl Environ Microbiol., 78(22): 8161-3).

[00078] A interrupção do gene JEN1 e a superexpressão do gene HAA-1 pertence ao conhecimento geral dos versados na técnica, e pode ser notavelmente realizada no uso de métodos apresentados neste documento.

[00079] Tendo em vista a equação presente neste documento para a síntese de 2,3-BDO em levedura, as condições para considerar na presente invenção são necessariamente condições aeróbicas.

[00080] O termo "condições aeróbicas" se refere a concentrações de oxigênio no meio de cultura que são suficientes para um microrganismo aeróbico ou anaeróbico facultativo para usar di-oxigênio como um aceitador de elétron terminal.

[00081] "Condição microaeróbica" se referem a um meio de cultura em que a concentração de oxigênio é menor do que no ar, por exemplo, concentração de oxigênio de até 6% 02.

[00082] Um "meio de cultura apropriado" designa um meio (por exemplo, um meio líquido estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos à manutenção e/ou crescimento da célula, tal como fontes de carbono ou substrato de carbono, fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, ureia, sulfato de amônia, cloreto de amônia, nitrato de amônia e fosfato de amônia; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico ou fosfato dipotássico; elementos residuais (por exemplo, sais de metal), por exemplo, sais de magnésio, sais de cobalto e/ou sais de manganês; bem como fatores de crescimento, tais como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e semelhantes. O termo "fonte de carbono" ou "substrato de carbono" ou "fonte de carbono", de acordo com a presente invenção denota qualquer fonte de carbono que possa ser usada por aqueles versados na técnica para auxiliar o crescimento normal de um microrganismo, incluindo hexoses (tais como glicose, galactose ou lactose), pentose, monossacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos (tais como sucarose, celobiose ou maltose), melaços, amido ou seus derivados, celulose, hemiceluloses e combinações destes.

[00083] Levedura recombinante, de acordo com a invenção

[00084] Conforme mencionado acima, a presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida no genoma da qual foi inserida: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato sintase ou ALS, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um acetolactato decarboxilase ou ALD, - um ou mais ácidos nucleicos codificando um butanodiol desidrogenase ou BDH, e - uma ou mais cópias de ácidos nucleicos codificando um NADH oxidase ou NOXE.

[00085] Conforme mostrado nos exemplos neste documento, os inventores descobriram que a presença de um ácido nucleico codificando uma NADH oxidase, vantajosamente a presença de uma pluralidade de cópias destes, em uma levedura recombinante em que a atividade de descarboxilase de piruvato tenha sido reduzida e em que tenha sido adicionalmente integrado genes permitindo expressão das enzimas ALS, ALD e BDH requeridas para a síntese de 2,3-BDO, não apenas contribui para estabilizar dita levedura recombinante, mas também permite uma melhoria significante do crescimento desta cepa, bem como o rendimento de produção de 2,3-BDO.

[00086] O uso de organismos de levedura de Crabtree positiva, tal como saccharomyces cerevisiae, e, especialmente, de organismos de levedura recombinante, tais como saccharomyces cerevisiae, para produção de metabolitos de interesse é vantajoso, uma vez que, em contraste com a bactéria, células de levedura possuem a capacidade de realizar fermentação na presença de oxigênio de quantidade suficiente de açúcar, tal como glicose ou sacarose. Em contraste, bactéria realiza fermentação apenas em condições anaeróbicas. Adicionalmente, organismos de levedura não estão sujeitos a infecção viral em contraste com bacteriófagos para bactéria. Ainda adicionalmente, cultura de organismos de levedura estão raramente sujeitos a contaminação por microrganismos não desejados, tais como bactéria devido às células de levedura causarem acidificação rápida de seu ambiente a até pH4, por exemplo, meio de cultura auxiliando seu crescimento. Ainda adicionalmente, células de levedura não excretam um número de metabólitos indesejados, tais como ácido láctico, a presença do qual, no meio de cultura, é uma desvantagem atual para purificação subsequente de metabólito(s) de interesse. Ainda adicionalmente, organismos de levedura, incluindo organismos de levedura recombinante, possuem maior estabilidade genética quando comparados a bactéria.

[00087] A equação para a síntese de 2,3-BDO em levedura é: Glicose (C6H12O6) + h02 4 2,3-BDO (C4H1oO2) + 2x C02 + H20 (*) [100 g] + [8,8g] [50,0g] + [48,8 g] + [9 9 g] (*) possível devido ao fato de que S. cerevisiae pode fermentar mesmo na presença de oxigênio.

[00088] Tendo em conta a equação acima, o rendimento teórico máximo de 2,3-BDO seria 100 g para uma entrada de 200 g de glicose.

[00089] Conforme mostrado nos exemplos neste documento, o rendimento de eficaz de 2,3-BDO com levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, está muito próximo deste rendimento teórico máximo. De acordo com o conhecimento do inventor, tal rendimento nunca foi obtido até agora.

[00090] Assim, a produção com um alto rendimento de 2,3-BDO com êxito é alcançada em uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pavimentando o caminho para a produção industrial de 2,3-BDO em usar a levedura.

[00091] Assim, como também é mostrado nos exemplos neste documento, nenhuma toxicidade de 2,3-BDO produzido nas células de levedura é observada, mesmo em altas concentrações de 2,3-BDO sintetizado. Além disso, o 2,3-BDO sintetizado é exportado inteiramente fora das células, substancialmente simplificando, assim, o processo de purificação.

[00092] NADH oxidase usado na levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, é uma enzima muito específica "dependente de NADH", uma vez que não consome qualquer aceitador carbonatado. Por esta razão, a NADH oxidase selecionado não interfere diretamente no metabolismo carbonatado, mas reabastece a reserva de NAD+ na produção de água.

[00093] A este respeito, a NADH oxidase usado na levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, difere notavelmente da enzima "dependente de NADH", divulgada nos documentos do estado da técnica mencionados acima, e especialmente em US 2011/0124060 e WO 2013/076144.

[00094] De acordo com certas modalidades particulares, a levedura recombinante pode compreender um ou mais construtos de DNA selecionados em um grupo compreendendo as seguintes fórmulas: (I) 5'-[Gene 1]x1-3’ and 5'-[Gene 2]x2-3’and 5'-[Gene 3]x3-3’ and 5'-[Gene 4]x4-3’, (II) 5'-[Gene 1]x1-[Gene 2]x2-[Gene 3]x3-3’ e 5’-[Gene 4]x4-3', (III) 5'-[Gene 1]x1-[Gene 2]x2-3’ e 5'-[Gene 3]x3-[Gene 4]x4-3', (IV) 5'-[Gene 1]x1-[Gene 2]x2-[Gene 3]x3-[Gene 4]x4-3', e uma combinação destes, em que: - "Gene 1" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE; - "Gene 2" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE, mas diferente do gene 1; - "Gene 3" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE, mas diferente dos genes 1 e 2; - "Gene 4" significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH ou NOXE, mas diferente dos genes de 1 a 3; - "ALS" é um ácido nucleico codificando uma acetolactato sintase; - "ALD" é um ácido nucleico codificando um acetolactato descarboxilase; - "BDH" é um ácido nucleico codificando um butanodiol desidrogenase; - "NOXE" é um ácido nucleico codificando um NADH oxidase; - cada um dentre "x1", "x2", "x3" e "x4", um independente de outros, representa um número inteiro que varia de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, e provido que dita levedura recombinante compreende pelo menos um ácido nucleico codificando para cada ALS, ALD, BDH e NOXE.

[00095] Preferencialmente, cada um dentre "x1", "x2", "x3" e"x4", independentemente uns dos outros, representa um número inteiro no intervalo de 0 a 10, mais particularmente no intervalo de 0 a 5, particularmente no intervalo de 0 a 3, e ainda representa melhor um número inteiro igual a 1.

[00096] Conforme previsto neste documento, cada um dos x1, x2, x3 e x4 pode ter um valor selecionado em um grupo compreendendo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50.

[00097] Em certas modalidades em que em um construto de DNA de fórmulas de (I) a (IV) acima, um ou mais dos inteiros "x1", "x2", "x3" e/ou "x4", uma forma independente de outros, tem um valor de dois ou mais, em seguida, cada uma das duas ou mais cópias do gene correspondente entre Gene 1, Gene 2, Gene 3 ou Gene 4 relacionados podem ser idênticos ou diferentes. Várias sequências distintas de ALS, ALD, BDH e NOXE estão aqui representadas na tabela 1.

[00098] Em modalidades ilustrativas de um construto de DNA selecionado dentre aqueles de fórmulas de (I) a (IV) acima, em que "x1" é um número inteiro igual a 2, e Gene 1 é um ácido nucleico codificando um acetolactato sintase (ALS) e, em seguida, duas sequências de codificação ALS contidas em dito construto de DNA podem ser idênticas ou diferentes,

[00099] Por exemplo, de acordo com esta modalidade particular, isso significa que a primeira cópia do ácido nucleico codificando um acetolactato sintase pode ser o ácido nucleico codificando ALS.BS e a segunda cópia do ácido nucleico codificando um acetolactato sintase pode ser o ácido nucleico codificando ALS.Pp.

[000100] Nas modalidades de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, em que dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA selecionados no grupo que compreende construtos de DNA de fórmulas de (I) a (IV), cada construto de DNA, e mais particularmente cada um dos genes dentre Gene 1, Gene 2, Gene 3 ou Gene 4 relacionados contidos ali, podem ser idênticos ou diferentes.

[000101] Neste documento são apresentadas algumas modalidades ilustrativas de um construto de DNA selecionado em um grupo compreendendo as construções de DNA de fórmula (I), (II), (III) e (IV).

[000102] Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (I): (I) 5'-[ALS]2-3’ e 5'-[ALD]2-3’ e 5'-[BDH]2-3’ e 5'-[NOXE]3-3’,

[000103] Uma levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (I) acima tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida e possui quatro seguintes sub-construtos de DNA de (i) a (iv) que foram introduzidos no genoma destes: (i) um sub-construto de DNA compreendendo dois ácidos nucleicos, idênticos ou distintos um do outro, cada ácido nucleico codificando ALS, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante; (ii) um sub-construto de DNA compreendendo dois ácidos nucleicos, idênticos ou distintos uns dos outros, cada ácido nucleico codificando ALD, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do local em que foram inseridos os ácidos nucleicos codificando ALS; (iii) um sub-construto de DNA compreendendo dois ácidos nucleicos, idênticos ou distintos uns dos outros, cada ácido nucleico codificando BDH, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um terceiro local no genoma de dita levedura recombinante, distinto dos primeiros e segundos locais em que foram inseridos os ácidos nucleicos codificando ALS e os ácidos nucleicos codificando ALD; e (iv) um sub-construto de DNA compreendendo três ácidos nucleicos, idênticos ou distintos uns dos outros, cada ácido nucleico codificando NOXE, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um quarto local no genoma de dita levedura recombinante, distinto dos primeiro, segundo e terceiro locais em que foram inseridos os ácidos nucleicos codificando ALS e ácidos nucleicos codificando ALD e BDH, respectivamente.

[000104] Em algumas modalidades, atividade de piruvato descarboxilase reduzida da dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um sub-construto de DNA de (i) a (iv), ou, alternativamente, uma combinação dos mesmos.

[000105] Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (II): (II) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3’e 5'-[NOXE]3-3’

[000106] A levedura recombinante resultante tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que foi inserido os dois sub-construtos de DNA (A) e (B), ou seja: (A) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3’, dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub-construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e (iii) um ácido nucleico codificando BDH; (B) um segundo sub-construto de DNA 5'-[NOXE]3-3 ', dito sub- construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do primeiro local em que o primeiro sub-construto de DNA foi inserido, e dito segundo sub-construto de DNA compreendendo (iv) três ácidos nucleicos, idênticos ou distintos uns dos outros (s), cada ácido nucleico codificando NOXE.

[000107] Em certas modalidades, atividade de piruvato descarboxilase reduzida da dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um primeiro sub-construto de DNA.

[000108] Levedura recombinante compreendendo dois construtos de DNA de fórmula (II): (II-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3’e 5'-[NOXE]3-3’, e (II-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3’e 5'-[NOXE]0-3’.

[000109] A levedura recombinante resultante tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que foi inserido os três sub-construtos de DNA (A), (B) e (C) ou seja: (C) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3’, dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub-construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e (iii) um ácido nucleico codificando BDH; (D) um segundo sub-construto de DNA 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3’, dito segundo sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante e dito segundo sub-construto de DNA compreendendo; (i) um ácido nucleico codificando ALS; (ii) um ácido nucleico codificando ALD; e (iii) um ácido nucleico codificando BDH; e (E) um terceiro sub-construto de DNA 5'-[NOXE]3-3 ', dito sub- construto de DNA sendo introduzido em um terceiro local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do primeiro local em que o primeiro sub-construto de DNA foi inserido, e distinto do segundo local em que o segundo sub-construto de DNA foi inserido, e dito terceiro sub-construto de DNA compreendendo (iv) três ácidos nucleicos, idênticos ou distintos uns dos outros (s), cada ácido nucleico codificando NOXE.

[000110] Em certas modalidades, atividade de piruvato descarboxilase reduzida da dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um primeiro sub-construto de DNA e/ou segundo sub-construto de DNA.

[000111] Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (III): (III) 5'-[ALS]2-[ALD]2-3’ e 5'-[BDH]2-[NOXE]3-3’,

[000112] A levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (III) acima tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida, e possui um genoma em que foi inserido os dois sub-construtos de DNA (A) e (B), ou seja: (A) um primeiro sub-construto de DNA 5'-[ALS]1-[ALD]4-3’, dito primeiro sub-construto de DNA sendo introduzido em um primeiro local no genoma de dita levedura recombinante e dito primeiro sub-construto de DNA compreendendo; (i) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando ALS; e (ii) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando ALS; e (B) um segundo sub-construto de DNA 5'-[BDH]3-[NOXE]3-3’, dito sub-construto de DNA sendo introduzido em um segundo local no genoma de dita levedura recombinante, distinto do primeiro local em que o primeiro sub-construto de DNA foi inserido, e dito segundo sub-construto de DNA foi inserido compreendendo: (C) i) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando BDH; e (D) ) três ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando NOXE.

[000113] Em certas modalidades, atividade de piruvato descarboxilase reduzida da dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção em pelo menos um dos genes pdc de levedura de pelo menos um primeiro sub-construto de DNA e/ou segundo sub-construto de DNA.

[000114] Levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (IV): (IV) 5'-[ALS]2-[ALD]2-[BDH]2-[NOXE]3-3’,

[000115] Uma levedura recombinante compreendendo um construto de DNA de fórmula (IV) acima tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida e possui um genoma em que foi inserido um construto de DNA localizado em um local desejado no genoma de dita levedura recombinante, dito construto de DNA compreendendo; (i) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando ALS; (ii) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando ALS; e (iii) dois ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando BDH; e (iv) três ácidos nucleicos, idênticos ou diferentes um do outro, cada ácido nucleico codificando NOXE.

[000116] Em certas modalidades, a atividade de piruvato descarboxilase reduzida necessária da dita levedura recombinante específica pode ser obtida pela inserção de dito construto de DNA em pelo menos um dos genes pdc de levedura.

[000117] Para cada uma destas cinco modalidades ilustrativas acima de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, e conforme mencionado acima, quando "x1" para "x4", um independente de outros, representa um número inteiro tendo um valor de dois ou mais, então: - uma cópia de ALS dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia do ALS compreendida em dito construto de DNA ou pode ser idêntico para todas as outras cópias de ALS contidos em dito construto de DNA, ou, alternativamente, dita uma cópia de ALS pode ser distinta de cada outra cópia de ALS contida em dito construto de DNA. - uma cópia de ALD dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia de ALD compreendida em dito construto de DNA ou pode ser idêntica para todas as outras cópias de ALD contidas em dito construto de DNA, ou, alternativamente, dita uma cópia de ALD pode ser distinta da outra cópia do ALD contida em dito construto de DNA. - uma cópia de BDH dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia do BDH compreendida em dito construto de DNA, ou pode ser idêntica a todas as outras cópias de BDH contidos em dito construto de DNA, ou, alternativamente, dita uma cópia de BDH pode ser distinta de cada outra cópia de BDH contida em dito construto de DNA. - uma cópia de NOXE dentro de um único construto de DNA pode ser idêntica à outra cópia de NOXE compreendida em dito construto de DNA ou pode ser idêntica para todas as outras cópias de NOXE contidas em dito construto de DNA, ou, alternativamente, dita uma cópia de NOXE pode ser distinta da outra cópia do NOXE contida em dito construto de DNA.

[000118] De acordo com certas modalidades específicas, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois construtos de DNA de fórmula mencionada acima (II) em que "Gene 4" significa um ácido nucleico codificando um NADH oxidase (NOXE).

[000119] De acordo com estas modalidades específicas, cada ácido nucleico entre Gene 1, Gene 2 e Gene 3 necessariamente significa um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD e BDH. Nestas modalidades, pelo menos uma cópia de ALS, ALD e BDH inseridos está presente. Nas modalidades em que apenas um construto de fórmula (II) é inserido no genoma de levedura, então cada ácido nucleico entre Gene 1, Gene 2 e Gene 3 significa necessariamente um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH e uma cópia de cada uma dentre ALS, ALD e BDH está presente. Nas modalidades em que um conjunto de dois ou mais construtos de fórmula (II) são inseridos no genoma de levedura, e, em seguida, cada ácido nucleico dentre Gene 1, Gene 2 e Gene 3 significa necessariamente um ácido nucleico selecionado a partir de um grupo compreendendo ALS, ALD, BDH e pelo menos uma cópia de cada uma dentre ALS, ALD e BDH está presente em dito conjunto de dois ou mais construtos de DNA de fórmula (II).

[000120] Adicionalmente, quando dita levedura recombinante, de acordo com a invenção, compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II) acima, ditos construtos de DNA de fórmula (II) mencionada acima podem ser idênticos ou diferentes.

[000121] De acordo com uma modalidade preferencial, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, construtos de DNA de fórmula (IIa), idênticos ou diferentes, em que cada fórmula (IIa) possui a seguinte fórmula:

[000122] (IIa) 5'-[(prom5)y1-Gene 1-term5]x5-[prom1-Gene 1- term1]x1-[prom2-Gene 2-term2]x2-[prom3-Gene 3-(term3)z1]x3-3’ e 5’- [(prom4)y2-Gene 4-(term4)z2]x4-3' em que: - Gene 1, Gene 2, Gene 3 e Gene 4, “x1”, “x2”, “x3” and “x4” são tais como definidos acima; - "x5" representa um número inteiro igual a 0 ou 1; - "y1", "y2", "z1" e "z2", independente de outros, representam um número inteiro igual a 0 ou 1; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (IIa), então "x1" a "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" podem ser idênticos ou diferentes; - "prom 1" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 1; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 2; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 3; - "prom 4" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação do gene 4; - "prom 5" é uma sequência reguladora que controla a expressão do Gene 1, dito prom 5 sendo idêntico ou diferente do prom 1; - "term 1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 1; - "term 2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 2; - "term 3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 3; - "term 4" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação do gene 4; e - "term5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de Gene 1, o dito term5 sendo idêntico ou diferente do term1.

[000123] Para uma melhor clareza sobre as características "x5" e "y1", são doravante apresentados exemplos para ilustrar em detalhes relacionados a modalidades particulares: - quando "x5" é um número inteiro igual a 1 e "y1" representa um número inteiro igual a 0, então significa que o considerado Gene 1 está sob o controle do promotor do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerada foi inserida; ou - quando "x5" é um número inteiro igual a 1 e "y1" representa um número inteiro igual a 1, então significa que o Gene 1 considerado está sob o controle do promotor "prom5". A este respeito, a sequência do promotor do gene endógeno, preferencialmente de gene pdc, em que o construto de DNA é inserido é eliminada, ou pelo menos interrompida, bem como a sequência de sua região de codificação relacionada.

[000124] Em adição, notavelmente com relação às características "y2" e "z2", é doravante apresentados exemplos para ilustrar modalidades particulares em detalhes relacionados (claro, nestes exemplos, "x4" representa um número inteiro igual a 1 ou mais): - quando "y2" é um número inteiro igual a 0, então significa que o Gene 4 considerado está sob o controle do promotor do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido; ou - quando "y2" é um número inteiro igual a 1, então significa que o Gene 4 considerado está sob o controle do promotor "prom4". A este respeito, a sequência do promotor do gene endógeno, em que o construto de DNA é inserido é eliminada, ou pelo menos interrompida, bem como a sequência de sua região de codificação relacionada. - quando "z2" é um número inteiro igual a 0, então significa que o Gene 4 está ligado ao terminador de transcrição do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido; ou - quando "z2" é um número inteiro igual a 1, então isso significa que o Gene 4 considerado está ligado ao terminador de transcrição "term4". A este respeito, a sequência do terminador de transcrição de gene endógeno, em que o construto de DNA é inserido é eliminado, ou pelo menos interrompido, bem como a sequência de sua região de codificação relacionada. - com relação a "z1", quando presente em fórmulas descritas no presente relatório descritivo, o acima mencionado sobre "z2" aplica mutatis mutandis.

[000125] De acordo com outra modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois construtos de DNA das seguintes fórmulas (IId):

[000126] (IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1- [prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ e 5’-[(prom4)y2-NOXE- (term4)z2]x4-3' em que: - ALS, ALD, BDH, NOXE, “x1”, “x2”, “x3”, “x4”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” e “z2” são tais como definidos acima; - quando dita levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (IIb), então "x1" a "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" podem ser idênticos ou diferentes; - "prom 1" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação da acetolactato sintase; - "prom 2" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação da acetolactato descarboxilase; - "prom 3" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação de butanodiol desidrogenase; - "prom 4" é uma sequência reguladora que controla a expressão da sequência de codificação de NADH oxidase; - "prom 5" é uma sequência reguladora que controla a expressão de sequência de codificação da acetolactato sintase, dito prom 5 sendo idêntico ou diferente do prom 1; - "term 1" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação da acetolactato sintase; - "term 2" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação da acetolactato descarboxilase; - "term 3" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação de butanodiol desidrogenase; - "term 4" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação de NADH oxidase; e - "term 5" é uma sequência de terminação de transcrição que finaliza a expressão de sequência de codificação da acetolactato sintase, dito term 5 sendo idêntico ou diferente do term 1.

[000127] De acordo com outra modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb), desde que todas as cópias de ácido nucleico NOXE estejam localizadas em um único de pelo menos dois construtos de DNA de fórmula (II), (IIa) ou (IIb).

[000128] De acordo com outra modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois, preferencialmente exatamente dois construtos de DNA das seguintes fórmulas (IIc) e (IId):

[000129] (IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1- [prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ e 5’-[(prom4)y2-NOXE- (term4)z2]x6-3'; e

[000130] (IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1- [prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ e 5’-[(prom4)y2-NOXE- (term4)z2]x7-3'; em que: - ALS, ALD, BDH, NOXE, “prom1”, “prom2”, “prom3”, “prom4”, “prom5”, “term1”, “term2”, “term3”, “term4” e “term5”, “x1”, “x2”, “x3”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” e “z2” são tais como definidos acima; e - "x1" a "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" e "z2" para cada fórmula (IIc) e (IId) sendo idênticas ou diferentes; e - "x6" e "x7" representam números inteiros variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 12, mais particularmente de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4 e ainda melhor igual a 3, provido que apenas um dentre "x6" e "x7" represente 0.

[000131] Vantajosamente, o primeiro gene 1 em 5'- em um construto de DNA de fórmulas de (I) a (IV), preferencialmente um gene representado por um ácido nucleico codificando ALS, está sob o controle do promotor do gene da levedura recombinante em que o construto de DNA considerado foi inserido.

[000132] Mais especificamente, isso significa que, para um construto de DNA de fórmula (IIa), (IIb), (IIc) ou (IId), "x5" vantajosamente representa um número inteiro igual a 1, e "y1" representa um número inteiro igual a 0.

[000133] Tendo em conta a complexidade dos construtos de DNA e sub-construtos de DNA mencionados acima, de acordo com a presente invenção, enfatiza-se que: - em relação a um construto de DNA da invenção, quando "x1", "x2", "x3" e/ou "x4" representa um número inteiro maior ou igual a 2, então: - cada cópia para um ácido nucleico relacionado dentre Gene 1, Gene 2, Gene 3 e/ou Gene 4 pode ser idêntica ou diferente; e/ou - o promotor e/ou terminador para cada cópia de um ácido nucleico relacionado entre Gene 1, Gene 2, Gene 3 ou Gene 4 pode ser idêntico ou diferente; - Quando uma levedura recombinante compreende pelo menos dois construtos de DNA, ditos pelo menos dois construtos de DNA podem ser idênticos ou diferentes em relação a: (i) sua fórmula geral em que um construto de DNA pode ser caracterizado por uma fórmula selecionada dentre o grupo compreendendo fórmulas de (I) a (IV); (ii) o valor de "x1" para "x7", "y1", "y2", "z1" e/ou "z2"; (iii) a natureza do promotor em relação a um mesmo gene; (iv) a natureza do terminador em relação um mesmo gene; e/ou (v) a natureza do mesmo gene propriamente dito, em que ALS, ALD, BDH e NOXE podem derivar de organismos pertencentes a diferentes gêneros, como nomeadamente exibido a seguir na tabela 1.

[000134] Métodos implementados para realizar um construto de DNA, tal como acima definido, pertence ao conhecimento geral dos versados na técnica.

[000135] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 2: e16) e Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517; 203, eventualmente apenas com menor variação e é mais particularmente desenvolvido nos exemplos a seguir. ATIVIDADE DE PIRUVATO DESCARBOXILASE REDUZIDA

[000136] Atividade de descarboxilase de piruvato endógena em levedura converte piruvato para acetaldeído, o qual é, então, convertido a etanol ou a acetil-CoA através de acetato.

[000137] Conforme previamente mencionado, a presente invenção diz respeito a uma levedura recombinante com uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida no genoma da qual foi inserido um construto de DNA específico:

[000138] De acordo com uma modalidade particular, a levedura recombinante é caracterizada pelo fato de que um ou mais genes de codificando piruvato descarboxilase endógenos podem ser desligados.

[000139] A atividade de descarboxilase de piruvato de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção pode ser reduzida por todos os métodos conhecidos por versados na técnica.

[000140] A este respeito, a atividade de piruvato descarboxilase de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode, por exemplo, ser reduzida por (i) interromper pelo menos um gene que codifica um piruvato descarboxilase ao inserir dentro dito pelo menos um gene que codifica um piruvato descarboxilase pelo menos um construto de DNA exógeno, (ii) mutações em regiões reguladoras, (iii) mutações em um códon de início, nomeadamente substituindo AUG por GUG e (iv) mutações em sequência de codificação alterando a atividade enzimática (v) mutações, inserções ou exclusão na sequência de codificação alterando a estabilidade de proteínas (vi) mutações alterando a meia-vida do mRNA da piruvato descarboxilase. A respeito da primeira opção (i), o construto de DNA implementado para interromper um gene considerado pdc pode ser um construto de DNA exógeno diferente dos construtos de DNA, de acordo com a invenção, conforme descrito anteriormente, um construto de DNA, de acordo com a invenção, ou uma combinação destes.

[000141] Também, e conforme acima mencionado, os construtos de DNA, de acordo com a invenção, de fórmula (I), (II) e (III) são, cada um, compostos de dois ou mais sub-construtos de DNA.

[000142] Portanto, de acordo com uma variante determinada de realização, a atividade de piruvato descarboxilase de uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser reduzida por interromper o pelo menos um gene que codifica um piruvato descarboxilase pela inserção dentro de dito gene, apenas pelo menos um sub-construto de DNA de pelo menos um construto de DNA, de acordo com a invenção, de fórmula (I), (II) e (III).

[000143] Preferencialmente, a atividade de piruvato descarboxilase endógena pode ser reduzida pela interrupção de pelo menos um gene de pdc.

[000144] Assim, leveduras podem ter um ou mais genes que codificam piruvato descarboxilase. Por exemplo, existe um gene que codifica o piruvato descarboxilase em Kluyveromyces lactis, enquanto existem três isoenzimas de piruvato descarboxilase codificadas pelos genes PDC1, PCD5 e PDC6 em Saccharomyces cerevisiae, bem como um gene regulatório de piruvato descarboxilase PDC2.

[000145] Preferencialmente, e como doravante definido, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser do gênero Saccharomyces recombinante, e, preferencialmente, uma espécie de Saccharomyces cerevisiae recombinante.

[000146] Assim, a levedura recombinante, preferencialmente pertence ao gênero Saccharomyces, e preferencialmente à espécie Saccharomyces cerevisiae.

[000147] A este respeito, e de acordo com uma primeira variante, a atividade de piruvato descarboxilase pode ser reduzida pela interrupção de pelo menos um gene pdc, preferencialmente de pelo menos dois genes pdc, e mais particularmente de apenas dois genes pdc.

[000148] Em adição, os genes pdc interrompidos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste de pdc1, pdc5, pdc6 e uma mistura destes, e preferencialmente de pdc1 e pdc6.

[000149] Preferencialmente, quando a levedura recombinante pertence ao gênero Saccharomyces, então a atividade de piruvato descarboxilase pode ser reduzida pela interrupção de pelo menos dois genes pdc, preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo de pdc1, pdc5, pdc6 e uma combinação destes, e, mais particularmente, a partir do grupo consistindo em pdc1 e pdc6.

[000150] Assim, a interrupção dos três genes pdc no gênero Saccharomyces, preferencialmente, espécies de Saccharomyces cerevisiae, reduz drasticamente o crescimento da cepa, tornando-o incompatível com qualquer aplicação industrial.

[000151] De acordo com uma variante particular, no gênero Saccharomyces, preferencialmente espécies Saccharomyces cerevisiae, apenas genes pdc1 e pdc6 são rompidos, e a expressão de pdc5 é atenuada.

[000152] O método implementado para atenuar a expressão de um gene específico pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[000153] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente se referir a qualquer método que seja conhecido na técnica.

[000154] Vantajosamente, para atenuar a expressão do pdc 5, sua transcrição pode ser colocada sob o controle de um promotor fraco, tal como, nomeadamente RPLA1, URA3, MET25, HIS3, TRP1, GAP1, NUP57 ou TFC1, e preferencialmente RPLA1 (= Sequência SEQ ID N°37).

[000155] Um método implementado para medir o nível de atividade de um piruvato descarboxilase pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[000156] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).

[000157] ACETOLACTATO SINTASE

[000158] A enzima de acetolactato sintase (ALS) (também conhecida como sintase de ácido acetohidróxi (AHAS), sintetase de ácido a-acetohidróxi, sintase de a-acetohidroxiácido, sintase de α-acetolactato, sintetase de α-acetolactato, sintetase de ácido acetohidróxi, sintase acetohidroxiácido, acetolactato piruvato-liase (carboxilação), sintetase acetoláctica) é uma proteína que catalisa o primeiro passo na síntese de aminoácidos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina).

[000159] ALS é uma enzima especificamente envolvida em uma reação química envolvendo a conversão de duas moléculas de piruvato para uma molécula de acetolactato e dióxido de carbono. A reação usa tiamina pirofosfato para vincular as duas moléculas de piruvato.

[000160] Um método implementado para medir o nível de atividade de um acetolactato sintase pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[000161] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Poulsen et al. (Eur. J. Biochem. 185, 1989: 433-439).

[000162] Acetolactato sintase preferencial na presente invenção é conhecido pelo número EC 2.2.1.6.

[000163] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando uma acetolactato sintase ou ALS pode ser ácido(s) nucleico(s), preferencialmente selecionados a partir de um grupo compreendendo Bacillus subtilis, Nicotiana tabacum, Paenibacilluspolymyxa e uma mistura destes, preferencialmente Nicotiana tabacum e Paenibacillus polymyxa.

[000164] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um acetolactato sintase ou ALS pode ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, 3 e 5.

[000165] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 65% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência abrange sequências de ácido nucleico tendo pelo menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com dita sequência de ácido nucleico de referência.

[000166] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência abrange sequências de ácidos nucleicos tendo pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com dita sequência do ácido nucleico de referência.

[000167] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um acetolactato sintase pode ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com sequências de SEQ ID NO: 2, 5 e 6.

[000168] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 65% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácidos de referência abrangendo sequências de aminoácido tendo pelo menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[000169] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácidos de referência abrangendo sequências de aminoácido tendo pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[000170] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de ALS na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido em detalhes, os quais estão presentes na posição 5' e 3', respectivamente, da sequência de codificação de ácido nucleico de ALS.

[000171] ACETOLACTATO DESCARBOXILASE

[000172] A enzima de acetolactato descarboxilase (ALD) (também conhecida como α-acetolactato descarboxilase, (S) -2-hidroxi-2-metil-3- oxobutanoato carboxi-liase, (S) -2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxi- liase [formação de (R) -2-acetoína] ou (S) -2-hidroxi-2-metil-3- oxobutanoato-carboxi-liase [formação de (3R) -3-hidroxibutan-2-ona] pertencem à família de liases, especificamente os carboxi-liases, as quais possuem ligações carbono-carbono e participam no metabolismo de butanoato e metabolismo de ácido dibasico ramificado c5.

[000173] ALD é uma enzima especificamente envolvida em uma reação química envolvendo a conversão de molécula de α-acetolactato para uma molécula de acetoína e dióxido de carbono.

[000174] Um método implementado para medir o nível de um acetolactato descarboxilase pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[000175] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Dulieu et al. (Enzyme and Microbial Technology 25, 1999: 537-542).

[000176] Acetolactato descarboxilase preferencial na presente invenção é conhecido pelo número EC 4.1.1.5.

[000177] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um acetolactato descarboxilase ou ALD pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo compreendendo Brevibacillus brevis, Enterobacter aerogenes, Lactococcus lactis e uma mistura destes, e, preferencialmente, Brevibacillus brevis e Enterobacter aerogenes.

[000178] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um acetolactato descarboxilase ou ALD pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 36%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, 9 e 11.

[000179] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 36% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência abrange sequências de ácido nucleico tendo pelo menos 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com dita sequência de ácido nucleico de referência.

[000180] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um acetolactato sintase pode ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 36%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com sequências de SEQ ID NO: 8, 10 e 12.

[000181] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 36% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácido de referência abrangendo sequências de aminoácido tendo pelo menos 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[000182] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de ALD na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido em detalhes, os quais estão presentes, respectivamente, na posição 5' e 3', respectivamente, da sequência de codificação de ácido nucleico de ALD.

[000183] BUTANEDIOL DESIDROGENASE

[000184] A enzima butanodiol desidrogenase (BDH) (também conhecida como (R, R)-butanodiol desidrogenase, (R)-2,3-butanodiol desidrogenase, (R)-diacetil redutase, 1-amino-2-propanol desidrogenase, 1- amino-2-propanol oxidoredutase, 2,3-butanodiol desidrogenase, aminopropanol oxidoredutase, butilenoglicol desidrogenase, butilenoglicol desidrogenase, D-(-)-butanodiol desidrogenase, D-1-amino-2-propanol desidrogenase, D-1-amino-2-propanol: NAD (2) oxidorredutase, D- aminopropano desidrogenase, D-butanodiol desidrogenase, diacetil (acetoína) redutase) pertence à família de oxireductases, especificamente aquelas agindo no grupo CH-OH de doador com NAD+ ou NADP+ como aceptores.

[000185] BDH é uma enzima especificamente envolvida em uma reação química envolvendo a conversão de uma molécula de acetoína usando NADH + e H+ a uma molécula de butano-2,3-diol e NAD+.

[000186] Um método implementado para medir o nível de atividade de um butanodiol desidrogenase pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[000187] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao protocolo descrito em Gao et al. (2012) journal of basic microbiology 52, 1-9. Particularmente, a atividade de BDH é monitorizada, seguindo a aparência de NADH através da absorbância em 340 nm.

[000188] Butanodiol desidrogenase preferencial na presente invenção é conhecido pelo número EC 1.1.1.4.

[000189] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um butanodiol desidrogenase ou BDH pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo compreendendo Enterobacter aerogenes, Paenibacillus polymyxa, Klebsiella oxycota, Saccharomyces cerevisiae e uma mistura destes, e preferencialmente Enterobacter aerogenes e Saccharomyces cerevisiae.

[000190] Mais particularmente, quando o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um butanodiol desidrogenase for(em) um ácido nucleico selecionado de Saccharomyces cerevisiae, significa que há uma superexpressão do ácido nucleico codificando o butanodiol desidrogenase endógeno.

[000191] De acordo com outra modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um butanodiol desidrogenase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 63%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com as sequências SEQ ID NO: 13, 15, 17 e 19.

[000192] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 63% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência abrange sequências de ácido nucleico tendo pelo menos 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com dita sequência de ácido nucleico de referência.

[000193] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um butanodiol desidrogenase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 63%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14, 16, 18 e 20.

[000194] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 63% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácidos de referência abrangendo sequências de aminoácido tendo pelo menos 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[000195] De acordo com uma modalidade particular, quando o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando butanodiol desidrogenase é/são ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo compreendendo Enterobacter aerogenes, Paenibacillus polymyxa, Klebsiella oxycota, e uma mistura destes, então, o gene codificando o butanodiol desidrogenase endógena é desligado.

[000196] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de BDH na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido em detalhes, os quais estão presentes, respectivamente, na posição 5' e 3', respectivamente, da sequência de codificação de ácido nucleico de BDH.

[000197] NADH OXIDASE

[000198] A inativação ou redução da atividade de pelo menos um gene pdc inativa ou reduz o percurso de fermentação de etanol em levedura. Em consequência, isto induz um estado redox desbalanceado que é apenas parcialmente aliviado pela expressão de BDH. Assim, o percurso de glicose a 2 piruvato gera 2 NADH equivalente, enquanto a transformação de 2 piruvato a butanodiol recicla apenas 1 NADH em NAD+ (ver figura 1).

[000199] Os inventores descobriram que uma água bacteriana formando enzima de NADH oxidase (também chamada, na presente descrição, de NOXE oxidase ou NOXE), em um nível de expressão específico, pode não apenas permitir o equilíbrio do estado redox que permite reforçar a estabilidade desta cepa, mas também permite reforçar o crescimento desta cepa e adicionalmente melhorar o rendimento do 2,3- BDO.

[000200] Uma água bacteriana formando NADH oxidase é uma enzima que catalisa a seguinte reação:

[000201] 2 NADH + 1/2 O2 ^ 2NAD+ + H2O

[000202] Água preferencial formando NADH oxidase na presente invenção é conhecida pelo número EC 1.6.3.1 e 1.6.99.3 (também conhecida como NAD(P)H oxidase formando (H(2)O(2)), Oxidase dupla, NAD(P)H oxidase, ThOX, THOX2, Tireóide NADPH oxidase, Tiróide oxidase Tireóide oxidase 2 para EC 1.6.3.1 e NADH desidrogenase, beta- NADH desidrogenase dinucleótido, citocromo c redutase, diaforase, dihidrocodesidrogenase I desidrogenase, dihidronicotinamida adenina dinucleótido desidrogenase Difosfopirinase, diaforase de DPNH, diaforase de NADH, hidrogenase de NADH, oxidoreductase de NADH, oxidoredutase de NADH-menadiona, NADH: Citocromo c oxidoreductase, difosfopiridina nucleótido diaforase reduzida, desidrogenase Tipo 1, desidrogenase Tipo 1 para EC 1.6.99.3).

[000203] Uma água formando NADH oxidase que pode ser considerado na presente invenção é notavelmente descrita em WO 2006/134277.

[000204] Um método implementado para medir o nível de atividade de uma NADH oxidase, de acordo com a invenção, pertence ao conhecimento geral de versados na técnica.

[000205] A este respeito, o versado na técnica pode vantajosamente referir-se ao método descrito em Lopez DE FELIPE et al. (International Daily Journal, 2001, vol. 11: 37-44 (ISSN 0958-6946)).

[000206] De acordo com uma modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um NADH oxidase ou NOXE pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir de grupos compreendendo Streptococcus pneumoniae, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus brevis e uma mistura destes, e, preferencialmente, Streptococcus pneumoniae.

[000207] De acordo com outra modalidade preferencial, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um NADH oxidase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 78%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico SEQ ID NO: 21, 23, 25 e 27.

[000208] Conforme descrito neste documento, uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 78% de identidade de nucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de referência abrange sequências de ácidos nucleicos tendo pelo menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de nucleotídeo com dita sequência do ácido nucleico de referência.

[000209] De acordo com outra modalidade particular, o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um NADH oxidase pode(m) ser ácido(s) nucleico(s) codificando uma sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em sequências com pelo menos 78%, preferencialmente pelo menos 80%, de identidade com sequências de SEQ ID NO: 22, 24, 26 e 28.

[000210] Conforme descrito neste documento, uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 78% de identidade de aminoácido com uma sequência de aminoácidos de referência abrangendo sequências de aminoácido tendo pelo menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de aminoácido com dita sequência de aminoácido de referência.

[000211] Conforme mencionado acima, o nível de expressão de NADH oxidase na presente invenção é regulado por pelo menos um promotor e pelo menos um terminador, tal como doravante definido em detalhes, os quais estão presentes, respectivamente, na posição 5'- e 3'-, respectivamente, da sequência de codificação de ácido nucleico de NADH oxidase.

[000212] Adicionalmente, os efeitos técnicos vantajosos acima mencionados estão ligados ao nível de expressão de dito NADH oxidase. Assim, e como ressaltam os exemplos neste documento, não só a simples presença de um NADH oxidase é importante, mas o nível de expressão de NADH oxidase também tem extrema importância na produção de 2,3-BDO.

[000213] Conforme acima mencionado, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, tem uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida e no genoma dos quais foi inserido, nomeadamente, uma ou mais cópias de um ácido nucleico codificando um NADH oxidase ou NOXE.

[000214] A este respeito, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender, nomeadamente, de 1 a 20 cópias de um ácido nucleico codificando um NADH oxidase.

[000215] Preferencialmente, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode compreender de 1 a 12, em especial de 2 a 5, preferencialmente de 3 para 4, e, melhor ainda, igual a 3 cópias de um ácido nucleico codificando um NADH oxidase.

[000216] De acordo com uma modalidade particular, o construto de DNA de fórmulas de (I) a (IV) compreendendo pelo menos o(s) gene(s) NOXE podem ser inseridos no gene URA3 endógeno de dita levedura recombinante.

[000217] Em vista do exposto, cada um dos ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e NADH oxidase está sob o controle de um promotor e de um terminador a fim de evitar regulamento indesejado, nomeadamente como definido doravante.

[000218] PROMOTOR

[000219] Por razões óbvias, cada um dos ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e NADH oxidase está sob o controle de um promotor, idêntico ou diferente.

[000220] Ditos promotores, idênticos ou diferentes, os quais permitem a expressão constitutiva sobrexpressão de um determinado gene, podem ser encontrados na literatura (velculescu et al. (1997) Cell 88, 243251).

[000221] Promotores mais particularmente interessantes na presente invenção podem ser selecionados a partir o grupo compreendendo: - pADH1 do gene codificando para o álcool desidrogenase (gene ADH1 = sequência SEQ ID N° 32) - pTDH3 do gene codificando para o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gene TDH3 = sequência SEQ ID N° 39), - pTEF2.Kl do gene codificando para o fator alfa EF-1 de alongamento translacional (gene TEF2 = sequência SEQ ID N° 30), - pGPM1 do gene codificando para Glicerato FosfoMutase (gene GPM1 = sequência SEQ ID N° 33), - pPDC1 do gene codificando para piruvato descarboxilase (gene PDC1 = sequência SEQ ID N° 35), - pENO2 do gene codificando para Enolase II (gene ENO2 = sequência SEQ ID N° 29), - pTEF3 do gene codificando para a subunidade Gamma de fator eEF1B de alongamento translacional (gene TEF3 = sequência SEQ ID N° 31), - pFBA1 do gene codificando para a Frutose aldolase 1,6- bisfosfato II (gene FBA1 = sequência SEQ ID N° 34), - pPGK1 do gene codificando para a quinase 3-fosfoglicerato (gene PGK1 = sequência SEQ ID N° 36), - pPYK1 do gene codificando para a quinase de piruvato (gene PYK1 = sequência SEQ ID N° 49), - pTPI1 de gene codificando para a Triose Fosfato Isomerase (gene TPI1 = sequência SEQ ID N° 50), ou - pTEF1.Kl do gene codificando para o fator alfa EF-1 de alongamento translacional (gene TEF1 = sequência SEQ ID N° 38),

[000222] Em adição, promotores homólogos das outras leveduras intimamente relacionadas também podem ser usados como promotores a partir de outras formas de leveduras do gênero Saccharomyces, ou levedura de outro gênero, tais como a Candida, Debaryomyces, Pichia ou Kluveromyces.

[000223] Promotores sintéticos, conforme descrito em Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58 também podem ser usados.

[000224] Mais particularmente, ditos promotores, idênticos ou diferentes, podem ser preferencialmente caracterizados por uma sequência de ácido nucleico selecionado do grupo constituído por sequências tendo pelo menos 80% de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29 a 39, 49 e 50.

[000225] TERMINADOR

[000226] Por razões óbvias, cada um dos ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e NADH oxidase é vinculado a um terminador de transcrição (que também pode ser denominado "terminador" neste documento), idêntico ou diferente.

[000227] Ditos terminadores de transcrição, idênticos ou diferentes, podem ser encontrados na literatura Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.

[000228] Terminadores mais particularmente interessantes na presente invenção podem ser selecionados a partir o grupo compreendendo: - tTPI1 de gene codificando para a Triose Fosfato Isomerase (gene TPI1 = sequência SEQ ID N° 44), - tMET25 de gene codificando para O-acetil homoserina-O-acetil serina sulfidrilase (gene Met25 = sequência SEQ ID N° 45), - tADH1 do gene codificando para o álcool desidrogenase (gene ADH1 = sequência SEQ ID N° 43) - tENO2 do gene codificando para Enolase II (gene ENO2 = sequência SEQ ID N° 46), - tTDH2 do gene codificando para o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, isozima 2 (gene TDH2 = sequência SEQ ID N° 40), - tPGK1 do gene codificando para a quinase 3-fosfoglicerato (gene PGK1 = sequência SEQ ID N° 48), - tCYC1 (= sequência SEQ ID N° 41), - tMET3 (= sequência SEQ ID N° 47), - tTDH3 (= sequência SEQ ID N° 42) e - tDIT1 (= sequência SEQ ID N° 51).

[000229] Mais particularmente, dito terminador, idêntico ou diferente, pode ser preferencialmente caracterizado por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo constituído por sequências tendo pelo menos 80% de identidade de ácido nucleico com as sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40 a 48 e 51.

[000230] De acordo com uma modalidade particular, cada um de ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e NADH oxidase está sob controle de um terminador de transcrição, idêntico ou diferente, ditos terminadores de transcrição sendo caracterizados por uma sequência de ácido nucleico selecionado a partir do grupo consistindo em sequências tendo pelo menos 80% de identidade de ácido nucleico com sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40 a 48.

[000231] LEVEDURA RECOMBINANTE

[000232] Geralmente, levedura pode crescer rapidamente e pode ser cultivada em maior densidade, em comparação com as bactérias, e não requer um ambiente asséptico no cenário industrial. Adicionalmente, células de levedura podem ser mais facilmente separadas do meio de cultura, em comparação com as células bacterianas, simplificando o processo de extração e purificação do produto.

[000233] Preferencialmente, a levedura da invenção pode ser selecionada dentre os gêneros Saccharomyces, CandidaAshbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus ou Malassezia.

[000234] Mais preferencialmente, a levedura pode ser levedura positiva Crabtree do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces ou Brettanomycces.

[000235] Mais preferencialmente, a levedura pode ser da espécie Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus ou Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa ou Torulaspora glabrata.

[000236] Conforme mencionado acima, uma levedura recombinante, de acordo com a invenção, preferencialmente possui uma atividade de piruvato descarboxilase que é reduzida pela inserção de pelo menos um construto de DNA selecionado a partir do grupo compreendendo as fórmulas de (I) a (IV), e preferencialmente de pelo menos um de dito construto de DNA compreendendo apenas pelo menos um ácido nucleico codificando ALS, ALD e/ou BDH.

[000237] De acordo com uma modalidade preferencial, a levedura recombinante pode ser Saccharomyces cerevisiae recombinante, e a atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção de apenas dois genes pdc.

[000238] Mais preferencialmente, os genes pdc interrompidos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste de pdc1, pdc5, pdc6 e uma mistura destes, e preferencialmente de pdc1 e pdc6.

[000239] Métodos implementados para inserir uma construção de DNA específica dentro de um gene, e mais particularmente um gene piruvato descarboxilase, pertencem ao conhecimento geral de versados na técnica. Um método relacionado é descrito em mais detalhes nos exemplos a seguir.

[000240] MODALIDADES MAIS PREFERENCIAIS

[000241] Vantajosamente, os ácidos nucleicos codificando enzimas implementadas na presente invenção são vantajosamente escolhidos entre ALS.BS, ALS.Pp, ALD.L1, ALD.Ea, BDH.Ea, BDH.Sc, NOXE.Spn, NOXE.L1 e uma mistura destes.

[000242] De acordo com uma modalidade preferencial, uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Saccharomyces, particularmente espécies Saccharomyces cerevisiae, em que atividade de piruvato descarboxilase endógeno é reduzida pela interrupção de pelo menos dois dos genes pdc, particularmente pela interrupção de genes pdc 1 e pdc 6, em que: - um dos genes pdc, preferencialmente o gene pdc 1, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIe) abaixo: 5’-[(prom5)y1-ALS.Bs-term5]x5-[prom1-ALS.Bs-term1]x1-[prom2- ALD.Ll-term2]x2-[prom3-BDH.Ea-(term3)z1]x3-3’ (IIe), e - pelo menos outro gene pdc, distinto do gene pdc interrompido mencionado acima, e, preferencialmente, o gene pdc 6, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIf') abaixo: 5’-[(prom5)y1-ALS.Pp-term5]x5-[prom1-ALS.Pp-term1]x1-[prom2- ALD.Ea-term2]x2-[prom3-BDH.Sc-(term3)z1]x3-3’ (IIf’), e em que o construto de DNA da seguinte fórmula (IIf’’): 5’-[(prom4)y2-NOXE.Spn-(term4)z2]x4-3’ (IIf’’), é inserido no gene URA3, em que: - prom1, prom2, prom3, prom4, prom5, term1, term2, term3, term4, term5, "y1", "y2", "z1" e "z2" são tais como definidos acima e ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.L1, ALD.Ea, BDH.Ea, BDH.Sc e NOXE.Spn, NOXE.L1 são tais como definidos na tabela 1 a seguir, - cada um dentre "x1", "x2" e "x3", independentemente uns dos outros, representa um número inteiro no intervalo de 0 a 50, mais particularmente no intervalo de 0 a 20, particularmente no intervalo de 0 a 10, mais particularmente de 0 a 3, e particularmente igual a 1; - "x4" representa um número inteiro variando de 0 a 50, preferencialmente de 0 a 20, preferencialmente de 0 a 12, mais particularmente de 2 a 5, preferencialmente de 3 a 4 e ainda melhor igual a 3,

[000243] provido que dita levedura recombinante compreende pelo menos um ácido nucleico codificando para cada ALS, ALD, BDH e NOXE, e mais particularmente, provido que cada construto de DNA de fórmula (IIe) e (IIf') compreende cada ácido nucleico codificando para cada ALS, ALD e BDH.

[000244] Em vista do exposto, e embora seja implicitamente divulgado, especifica-se que, entre cada fórmula (IIe) e (IIf'): - "x1" para "x3", "x 5", "y1", "y2", "z1" e "z2"; e/ou - o promotor e/ou terminador para cada cópia de ácidos nucleicos para um gene considerado, pode ser idêntica ou diferente.

[000245] De acordo com uma modalidade particular, uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, pode ser caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Saccharomyces, particularmente espécies Saccharomyces cerevisiae, em que atividade de piruvato descarboxilase endógeno é reduzida pela interrupção de pelo menos dois dos genes pdc, particularmente pela interrupção de genes pdc 1 e pdc 6, em que: - um dos genes pdc, preferencialmente o gene pdc 1, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIg) abaixo: 5’-[ALS.Bs-tTDH2]1-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]1-[pTEF3-BDH.Ea- tTDH3]1-3’ (IIg) - pelo menos outro gene pdc, distinto do gene pdc interrompido mencionado acima, e, preferencialmente, o gene pdc 6, é interrompido pela inserção de um construto de DNA da fórmula (IIh) abaixo: 5’-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]1-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]1-[pGMP1- BDH.Sc-tENO2]1-3’ e em que o construto de DNA da seguinte fórmula (IIh): 5’-[pENO2- NOXE.Spn -tPGK1]-3’ (IIh’’) é inserido no gene URA3, em que: - o gene "ALS.Bs" de construto de DNA de fórmula (IIg) está sob o controle do promotor do gene pdc em que dito construto de DNA de fórmula (IIg) é inserido, - pENO2, pTEF3, pADH1, pTDH3, pGMP1, tTDH2, tCYC1, tTDH3, tDPI1, tMET25, tENO2 e tPGK1 são tais como definidos na presente descrição e mais particularmente nas sequências de listagem a seguir, - ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.L1, ALD.Ea, BDH.Ea, BDH.Sc e NOXE.Spn, NOXE.L1 são tais como definidos adiante na tabela 1, e particularmente em modo nas sequências de listagem a seguir.

OPTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL

[000246] De acordo com uma modalidade particular, a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pode ser adicionalmente modificada para otimizar a produção de 2,3-butanodiol.

[000247] Uso de fontes alternativas de açúcar:

[000248] Diretamente o uso de uma fonte alternativa de açúcar, como amido, exige adicionalmente a expressão em levedura de α-amilase exógena e glicoamilase (Buscke et al. biosource technology2013). Importação de açúcar- Melhoria da importação de açúcar C5:

[000249] A importação de pentoses por microrganismo recombinante é um tema importante para o processo industrial, uma vez que açúcares C5 são constituintes principais de biomassa lignocelulósica hidrolisada. Cepas nativas de S. cerevisiae, como muitos outros tipos de levedura, são incapazes de utilizar tanto xilose quanto arabinose, como substratos fermentativos (Hahn-Hagerdal et al., 2007; Jin et al., 2004). Curiosamente, é capaz de absorver xilose mesmo que o açúcar não seja um substrato natural (Hamacher et al., 2002).

[000250] S. cerevisiae GAL2, HXT1, HXT2, HXT4, HXT5 e HXT7 catalisam a absorção de xilose porque eles têm uma especificidade de substrato ampla (Hamacher et al., 2002; Saloheimo et al., 2007; Sedlak & Ho 2004). No entanto, sua afinidade com xilose é muito menor do que para a glicose, e a absorção de xilose pelos transportadores é fortemente inibida pela glicose (Saloheimo et al., 2007).

[000251] Várias mudanças são necessárias para obter uma cepa capaz de crescer e consumir xilose e/ou arabinose. Essas modificações diferentes são uma parte da invenção.

[000252] Superexpressão de transportadores heterólogos de xilose:

[000253] De modo a melhorar a absorção de xilose e arabinose, a cepa de produtor de 2,3-BDO recombinante tem que ser modificada para expressar genes heterólogos que codificam para transportadores de xilose ou arabinose. Por exemplo, os genes GXF1, SUT1 e AT5g59250 de Candida intermedia, Pichia stipitis e Arabidopsis thaliana, respectivamente, são superexpressados para melhorar a utilização de xilose pela levedura (Runquist et al. 2010).

[000254] Superexpressão dos percursos envolvidos no metabolismo de xilose e arabinose:

[000255] Cepas de leveduras são capazes de absorver xilose, mesmo que o açúcar não seja um substrato natural. Apesar dos genes para a absorção de xilose estarem presentes em S. cerevisiae não estão expressos em um nível suficiente para permitir a absorção significativa do açúcar. Assim, as modificações genéticas são necessárias para melhorar a absorção de açúcares de pentose. Todas as enzimas que permitem a transformação de xilose ou arabinose de xilitol precisam ser melhoradas, assim como as enzimas que convertem o xilitol em xilulose e xilulose em xilulose-5-fosfato. Ou os genes homólogos de percursos de xilose e arabinose devem ser genes superexpressados ou heterólogos de bactérias devem ser superexpressados.

[000256] Em uma modalidade da invenção, a absorção de xilose e sua assimilação pela cepa são melhoradas pela superexpressão, por exemplo: 1) Genes XYL1 ou GRE3 codificam a redutase aldolase de P. stipitis e S. cerevisiae, respectivamente, associados à superexpressão de XYL2 codificando xilitol desidrogenase de P. stipitis, combinado com a superexpressão de genes XKS 1 ou XYL3 codificando a xiluloquinase de S. cerevisiae e P. stipitis, respectivamente, 2) O gene xylA codificando uma isomerase xilose de bactérias ou Piromyces associada a superexpressão de genes XKS1 ou XYL3 codificando xiluloquiinase de S. cerevisiae e P. stipitis, respectivamente.

[000257] Em outra modalidade da invenção, a absorção de arabinose e sua assimilação pela cepa são melhoradas pela superexpressão, por exemplo: 1) Genes homólogos XYL1 ou GRE3 codificando a redutase aldolase de P. stipitis e S. cerevisiae, respectivamente, associados à ladl codificando L-arabinitol 4-hidrogenase e Ixrl codificando L-xilulose redutase de Trichoderma reesei, em combinação com a superexpressão de XYL2, codificando xilitol desidrogenase de P. stipitis, e, além da superexpressão de genes XKS1 ou XYL 3 codificando xiluloquinase de S. cerevisiae e P. stipitis, respectivamente, 2) Genes heterólogos araA e araB codificando arabinose isomerase bacteriana e quinase de ribulose.

[000258] Otimização do percurso de pentose-fosfato:

[000259] Isso pode ser feito pela superexpressão de pelo menos um gene pertencente ao percurso de pentose fosfato não oxidativo; TALI, TKL1, RKL1 e RPE1 da cepa de levedura.

[000260] Otimização da disponibilidade dos cofactores NAPDH exigidos pelas enzimas envolvidas no metabolismo de açúcares C5.

[000261] Isto é alcançado pela expressão de transidrogenases de E. coli na cepa de levedura. Os genes udhA e/ou pntAB de E. coli vai ser superexpresso na cepa produtora.

[000262] Prevenção do consumo de glicose para a síntese de glicerol

[000263] Isso pode ser feito pela interrupção do gene GPD1 que codifica o glicerol-3-fosfato desidrogenase EC 1.1.1.8. (GPDH).

[000264] A presente invenção, de acordo com esta modalidade, é interessante, nomeadamente tendo em conta o rendimento em 2,3-BDO, apesar do fato de que a interrupção do gene GPD1 leva à remoção de uma atividade de enzima que consome NADH em favor de NAD. Para contrabalançar o desequilíbrio redox assim gerado, cepa interrompida por GPD1 pode exigir expressão adicional de NOXE.

[000265] De acordo com uma determinada modalidade, uma cepa recombinante, de acordo com a presente invenção, é tal que não compreende quaisquer modificações genéticas, as quais podem ter o efeito de reduzir a repressão de glicose, conforme divulgado em WO 2011/041426 ou Kim et al. (Bioresource Technology, Vol. 146, 2013: 274).

[000266] De acordo com uma modalidade particular, uma cepa recombinante, de acordo com a presente invenção, é tal que não compreende quaisquer modificações genéticas para permitir expressar quaisquer percursos de assimilação de xilose, conforme divulgado em Kim et al. (Journal of Biotechnology, 2014.

CONDIÇÕES DE CULTURA

[000267] A presente invenção também diz respeito ao uso de uma levedura recombinante, tal como definido acima, para a produção de 2,3- butanodiol (BDO) e/ou derivados diretos destes, particularmente, ditos derivados diretos de 2,3-butanodiol (BDO) sendo selecionados a partir do grupo consistindo em butano-dieno (BDE), Metil-Etil-Cetona (MEK) ou uma mistura destes.

[000268] A presente invenção adicionalmente refere-se a um método para produção de 2,3-butanodiol (BDO), compreendendo as seguintes etapas: - fornecer um microorganismo recombinante, como descrito anteriormente, cultivando o microorganismo recombinante em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono, e - recuperar o 2,3-butanodiol.

[000269] Normalmente, os microrganismos da invenção são cultivados a uma temperatura no intervalo de cerca de 20° C para cerca de 37° C, preferencialmente a uma temperatura que varia de 27 a 34° C, em um meio de cultura apropriado.

[000270] Quando a levedura recombinante, de acordo com a invenção, pertence à espécie S. cerevisiae, a temperatura pode vantajosamente variar de 27 a 34° C, em um meio de cultura apropriado.

[000271] Meios de crescimento adequados para a levedura são meios comuns preparados comercialmente, tal como caldo que inclui base de nitrogênio de levedura, sulfato de amônia e dextrose como fonte de carbono/energia) ou Meio YPD, uma mistura de peptona, extrato de levedura e dextrose em proporções ideais para cultivo. Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser utilizados, e o meio adequado para o crescimento dos microrganismos particulares será conhecido por versados na técnica de ciência de microbiologia ou fermentação.

[000272] O termo "meio de cultura apropriado" é definido acima.

[000273] Exemplos de meios de cultura conhecidos para uma levedura recombinante, de acordo com a presente invenção, são conhecidos por versados na técnica, e são apresentados na publicação D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold springharbor laboratory course Manual (2000).

[000274] Intervalos de pH adequados para a fermentação podem ser entre pH 3,0 a pH 7,5, em que o pH 4,5 a pH 6,5 é preferencial como a condição inicial.

[000275] Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbias ou condições microaeróbias.

[000276] A quantidade de produto no meio de fermentação pode ser determinada usando um número de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou a cromatografia gasosa (GC).

[000277] O presente processo pode empregar um método de lote de fermentação. Uma fermentação de lote clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é definida no início da fermentação, e não estão sujeitos a alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo ou organismos desejados, e fermentação pode ocorrer sem acrescentar nada ao sistema. Normalmente, no entanto, uma fermentação de "lote" é de lote com respeito a adição de fonte de carbono, e são frequentemente feitas tentativas em controlar fatores como temperatura, pH e concentração de oxigênio. Em sistemas em lote, as composições de metabólito e biomassa do sistema mudam constantemente até o momento quando a fermentação é interrompida. Dentro do progresso de células de culturas em lote através de uma fase de retardo estático para uma fase de registro de crescimento elevada, e, finalmente, para uma fase estacionária em que a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Se não forem tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrerão. Células em fase de registro geralmente são responsáveis pela maior parte da produção do produto final ou intermediário.

[000278] Um sistema Fed-Batch (alimentação de lote) também pode ser usado na presente invenção. Um sistema Fed-Batch é semelhante a um sistema típico de lote com a exceção de que o substrato de fonte de carbono é adicionado em incrementos no decorrer da fermentação. Sistemas Fed-Batch são úteis quando a repressão catabólica (por exemplo, repressão de glicose) é capaz de inibir o metabolismo das células e em que é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. Medição da concentração de substrato real em sistemas Fed-Batch é difícil, e estima- se, portanto, com base nas mudanças de fatores mensuráveis como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tais como CO2.

[000279] Fermentações são comuns e bem conhecidas na técnica, e exemplos podem ser encontrados em Sunderland et al., (1992), incorporado neste documento por referência. Embora a presente invenção seja executada em modo de lote, está previsto que o método seja adaptável à fermentação contínua.

[000280] Fermentação contínua é um sistema aberto, em que um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removido simultaneamente para processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, em que as células estão principalmente na fase de registro de crescimento.

[000281] Fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam a concentração de crescimento ou produto final de célula. Por exemplo, um método irá manter um nutriente limitante como o nível de fonte ou nitrogênio de carbono em uma taxa fixa e permitirá que todos os outros parâmetros variem. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode ser continuamente alterada, enquanto a concentração de células, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Sistemas contínuos lutam para manter as condições de estado de crescimento estacionário, e, assim, a perda de células devido ao meio ser retirado deve ser balanceada contra a taxa de crescimento de célula na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica da microbiologia industrial.

[000282] É previsto que a presente invenção possa ser praticada usando lote, fed-batch ou processos contínuos, e que qualquer modo conhecido de fermentação seria adequado. Adicionalmente, é contemplado que células possam ser imobilizadas em um substrato como catalisadores de células inteiras e sujeitos a condições de fermentação para a produção.

[000283] PURIFICAÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL

[000284] De acordo com um aspecto específico da invenção, a produção fermentativa de 2,3-butanodiol compreende uma etapa de isolamento do 2,3-butanodiol do meio de cultura. Recuperando o 2,3- butanodiol do meio de cultura é uma tarefa rotineira para versados na técnica. Isso pode ser alcançado por uma série de técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitando a, destilação, a extração de agentes, pervaporação ou extração líquida. O perito no campo sabe como adaptar os parâmetros de cada dependente de técnica sobre as características do material a ser separado.

[000285] A levedura como modelo de microorganismo na presente invenção foi mantida em que o 2,3-BDO sintetizado seja inteiramente exportado fora das pilhas, simplificando, assim, o processo de purificação.

[000286] O 2,3-BDO sintetizado pode ser coletado por destilação. Destilação pode envolver um componente opcional diferente do meio de cultura a fim de facilitar o isolamento de 2,3-butanodiol formando azeótropo, e, nomeadamente, com água. Este componente opcional é um solvente orgânico, tal como o ciclo-hexano, pentano, butanol, benzeno, tolueno, tricloroetileno, octano, éter dietílico ou uma mistura destes.

[000287] Gás de remoção é conseguido com um gás de remoção escolhido dentre hélio, argônio, dióxido de carbono, hidrogênio, nitrogênio ou mistura destes.

[000288] Extração líquida é conseguida com solvente orgânico, tal como a fase hidrofóbica, como pentano, hexano, heptano, dodecano.

[000289] As condições de purificação podem ser especificamente adaptadas para a transformação a jusante de 2,3-BDO para Metil Etil Cetona e/ou 1,3-butadieno, incluindo manter vários co-produtos em 2,3- BDO parcialmente purificado.

[000290] Em toda a descrição, incluindo as reivindicações, a expressão "compreendendo" deve ser entendida como sendo sinônimo de "compreendendo pelo menos um", a menos que especificado de outra forma.

[000291] Adicionalmente, a expressão "fórmulas de (I) a (IV), de acordo com o contexto considerado e salvo indicações contrárias, designa o construto de DNA de fórmulas (I), (II), (III) e (IV), mas também (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf'), (IIf"), (IIg), (IIh') e/ou (IIh").

[000292] Os termos "entre... e... " e "variando de... até..." devem ser entendidos por serem inclusivos dos limites, a menos que especificado de outra forma.

[000293] Os exemplos e figuras os quais se seguem são apresentados a título de ilustração e sem limitação implícita da invenção. EXEMPLOS a) Protocolo para fazer uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae, de acordo com a invenção

[000294] Todas as cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae implementadas adiante foram construídas a partir da cepa padrão W303 (Thomas e Rothstein (1989), Cell. 56, 619-630) usando o procedimento de genética molecular de leveduras padrão (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratorycourse Manual (2000) por D. Burke, D. Dawson, T. StearnsCSHL Press).

[000295] Nestas cepas, atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção de pelo menos um dos genes pdc (pdc1, pdc5, pdc6) ou por substituição de seu promotor de transcrição cognato por um promotor fraco.

[000296] Nas cepas mais eficientes, somente pdc1 e pdc6 foram excluídos.

[000297] Uma variedade de enzimas exógenas foi expressa na cepa considerada recombinante de Saccharomyces cerevisiae. Eles foram escolhidos de acordo com seus parâmetros enzimáticos de Michaelis Menten quando disponível (ver tabela 1 adiante). Kcat alto pela alta eficiência e variedade de Km para cobrir uma concentração diferente no substrato. Enzimas paenibacillus polymyxa foram escolhidas porque este organismo é um produtor de 2,3-BDO natural.

[000298] A nomenclatura de genes em relação às enzimas de acetolactato sintase exógenas implementadas, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e água formando NADH oxidase é exibida na tabela 1 a seguir.

[000299] Estes genes são designados pela sigla da enzima seguida pela sigla do organismo de origem, conforme segue: Adicionalmente, para melhor compreensão dos seguintes genótipos: - ade2, his3, leu2, trp1 e ura3 são genes marcadores de auxotrofia. - Letras minúsculas significam que o gene considerado está inativo, letras maiúsculas refletem um gene ativo. - "::": após um nome de gene significa que o gene é interrompido pelo que se segue (se mais de um gene for inserido, fazem-se notar entre colchetes []). A interrupção do gene é concomitante com uma exclusão completa da sequência de codificação, mas preserva o promotor. Em consequência, o gene seguido por "::" é inativo e é observado em minúsculas. Se não especificado, a transcrição do gene inserido é controlada pelo promotor do gene interrompido. - "gene.Kl"significa que o gene se origina de Kluyveromyces lactis. - Promotores de Transcrição, os quais permitem a sobrexpressão constitutiva de um determinado gene, podem ser encontrados na literatura (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251). Os promotores utilizados neste documento são designados por "p", seguido de seu nome cognato de gene. Seu número de sequência respectiva também é mencionado adiante. - Terminadores de Transcrição também são colocados após cada gene. Para evitar regulação indesejável, promotores e terminadores dando estrutura a um gene inserido não foram tirados do mesmo gene original. Os terminadores utilizados neste documento são designados por "t", seguido de seu nome cognato de gene. Seu número de sequência respectiva também é mencionado adiante.

[000300] Agrupamento de genes acima mencionados foram prontamente integrados em levedura recombinante usando a capacidade de levedura para eficientemente recombinar extremidades livres de DNA que possuem homologia de sequência.

[000301] Leveduras recombinantes foram obtidas de acordo com métodos publicados disponíveis para versados na técnica. Nomeadamente, pode ser seguido o método descrito em Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 2: e16) e Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517: 203), eventualmente com apenas pequena variação.

[000302] Mais particularmente, as sequências de codificação a serem clonadas artificialmente foram sintetizadas. Para sequências heterólogas (não-levedura), as sequências de ácidos nucleicos foram modificadas a fim de obter a sequência sinônima de código usando o uso de códon de levedura. Usando a tecnologia de clonagem clássica e enzima de restrição, cada sequência sintética foi clonada entre um promotor de transcrição e um terminador de transcrição. Cada sequência de promotor é precedida por uma sequência de 50 a 200 nucleotídeos homólogos para a sequência do terminador do gene a montante. Da mesma forma, o terminador de cada gene (um gene compreendendo o promotor codificante de sequência de terminador) é seguido por sequências homólogas ao gene imediatamente a seguir. De modo que cada um da unidade seja integrado, há uma sobreposição de nucleotídeos de 50-200, tanto com a unidade a montante quanto com a unidade a jusante. Para a primeira unidade, o promotor é precedido por 50-200 nucleotídeos homólogos para o nucleotídeo do cromossoma de levedura para o local em que será integrado. Da mesma forma, para a última unidade, o terminador é seguido por 50-200 nucleotídeos homólogos para o nucleotídeo do cromossoma de levedura para o local em que será integrado.

[000303] Cada unidade é, então, amplificado por PCR a partir de construtos de plasmídeos, rendendo X unidades de DNA linear tendo sobreposição de sequências. Um deste gene é um marcador de auxotróficos a fim de selecionar em caso de recombinação. Todos os fragmentos lineares são prontamente transformados na levedura, e levedura recombinante é selecionada para a auxotrofia relacionada com o marcador usado. A integridade da sequência é verificada por PCR e sequenciamento. b) em relação às enzimas ALS e ALD

[000304] Enzimas ALS e ALD não foram avaliadas individualmente, mas em pares (ALS + ALD) através do rendimento de acetoína. Três ALD e ALS exógenos foram escolhidos de acordo com seus parâmetros cinéticos: ALS.Nt, ALS.Pp, ALS.Bs e ALD.Bb, ALD.Ll, ALD.Ea (ver acima).

[000305] Oito das nove combinações possíveis de ALS e ALD foram conjuntamente inseridos no cromossomo de uma cepa de levedura ura3 atrás de promotores e seguidas por um terminador.

[000306] A inserção destes dois genes interrompe o gene pdc1. O gene marcador URA3 é concomitantemente inserido para selecionar os transformantes. Combinação de ALS/ALD foram inseridas na cepa YA747, ou seja, um derivado W303 tendo o seguinte genótipo: YA747: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp, pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3.

[000307] Foram construídas as seguintes cepas: YA768: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Bs- tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3

[000308] NB: neste caso, o gene "ALS.Bs"está sob o controle do promotor natural de pdc1, ou seja, o promotor pPDC1. YA769: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Nt- tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA770: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp- tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA771: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Nt- tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA772: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[- ALS.Nt- tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA773: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp- tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA810: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs- tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3 YA811: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp- tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3

[000309] Todas estas cepas foram cultivadas por 24 horas em 8% de glicose YPA (1% de extrato de levedura, 2% de Bacto peptona, adenina 0,1 mM, 8% de glicose). Eles foram colhidos, e acetoína, etanol e o teor de 2,3-BDO foi determinado de acordo com os métodos padrões com especificidade adaptada em Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

[000310] Para algumas cepas, vários clones foram analisados, o último número após o "-" é o número de clone. Observe que, como a enzima endógena bdh é interrompida, 2,3-BDO não é produzido.

[000311] A produção de etanol, acetoína e 2,3-BDO são monitoradas seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679. Resultados

[000312] Tabela 2 a seguir exibe a produção acetoína das cepas testadas mencionadas acima.

[000313] A partir desses resultados, é possível concluir que, tomados separadamente, as melhores enzimas para aumentar a produção de acetoína ALS Pp, ALS Nt, ALD Ea e ALD Bb, que, de fato, aparece como sendo a enzima mais eficiente. A maior parte das combinações dos casais ALS e ALD tem sido analisada em cepas também superexpressando BDH. Estas cepas foram primeiramente classificadas no seu crescimento em glicose. Então duas das cepas de crescimento rápido foram analisadas para produção de butanodiol, nomeadamente:

[000314] YA538-5C: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, URA3.Kl], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3

[000315] YA 919-19: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALD.Bb-tPGK1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, pENO2-ALS.Nt-tCYC1, LEU2.Kl], pdc6::[ pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3

[000316] Ambos os clones foram cultivados por 48 horas em 16% de glicose YPA em um frasco regulador de fluxo de 250 ml sob agitação vigorosa a 28° C. As amostras foram colhidas em 24h, 32h e 48h. O teor etanol, acetoína e butanodiol no lisado foi analisado de acordo com os mesmos protocolos, conforme referido acima. Resultados

[000317] Tabela 3 a seguir exibe esses teores de etanol, acetoína e 2,3-BDO em 16% de glicose YPA.

[000318] A partir desses resultados, conclui-se que a superexpressão de dois ALS e dois ALD aumentam significativamente a produção de 2,3-BDO (e, portanto, transitoriamente, acetoína), de modo a comparar a ALS único e um ALD (ver os resultados na tabela 3 vs tabela 2).

[000319] A melhor combinação é ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Bb e ALD.Ea, embora ALS.Bs e ALD.Bb não suportam uma forte produção de acetoína por conta própria. c) determinação das enzimas BDH mais eficientes

[000320] Quatro enzimas exógenas foram superexpressadas usando o promotor pTEF1 em uma cepa de levedura em que a enzima endógena de BDH1 tem estado inativada. A atividade de BDH presente em lisatos de célula diferentes foi analisada e comparada com a atividade endógena.

[000321] A atividade de BDH é monitorizada, seguindo a aparência de NADH através da absorbância em 340 nm, seguindo o protocolo descrito em Gao et al. (2012) journal of basic microbiology 52, 19. Resultados

[000322] Tabela 4 a seguir exibe a atividade de BDH. Tabela 4

[000323] Enzimas de Saccharomyces cerevisiae (Sc) e de Enterobacter aerogenes (Ea) parecem, assim, eficientes. d) O efeito técnico vantajoso da enzima NOXE no rendimento de 2,3- BDO

[000324] Três cópias de pENO2-NOXE.Spn-tPGK1 foram inseridas na cepa YA538-5C mencionada acima, produzindo, assim, a cepa YA724-2. As duas cepas foram comparadas para a sua produção de 2,3- BDO respectiva:

[000325] YA538-5C: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, URA3.Kl-], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3

[000326] YA724-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.Kl-], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-URA3Kl-tPGK1]x3

[000327] YA538-5C e YA724-2 foram cultivadas em 24% de glicose YPA. Alíquotas foram tiradas ao longo da cultura, e teores de etanol, acetoína e BDO de glicose na cultura foram analisados de acordo com o procedimento padrão.

[000328] O teor etanol, acetoína e butanodiol foi analisado de acordo com os mesmos protocolos, conforme referido acima.

[000329] O consumo de glicose também é monitorado segundo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679. Resultados

[000330] Os resultados são relatados nas tabelas 5a e 5b a seguir. * ND: Não Detectado * ND: Não Detectado

[000331] Esses resultados mostram que a superexpressão de NOXE leva a um acúmulo mais rápido de 2,3-BDO do que sem NOXE. Cultura longa leva a uma oxidação de 2,3-BDO novamente para acetoína.

[000332] Genes NOXE de origem diferente de onde inserido na cepa YA388-1C, tendo o seguinte genótipo: MAT-a, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp, pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea- tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3

[000333] YA679-8, YA679-6 e YA 679-4 contém 1, 2 e 12 cópias de pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, respectivamente.

[000334] YA680-2, YA680-3, YA724-2 et YA721-2D contém 1, 2, 3 e 4 cópias de pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, respectivamente.

[000335] Atividade NOXE na levedura lisada foi determinada de acordo com Lopez de Felipe and Hungenholtz (2001) International DiaryJournal 11, 37-44. Resultados

[000336] Os resultados são relatados na tabela 6 a seguir. Tabela 6

[000337] Todos os genes NOXE apresentam uma atividade NOXE interessante. No entanto, NOXE.Spn aparece mais ativo do que NOXE.Ll.

[000338] A fim de otimizar a produção de 2,3-BDO, genes NOXE de origem diversa e em número de cópias diferentes foram expressos em YA538-5C.

[000339] Assim, as seguintes cepas recombinantes foram obtidas.

[000340] YA719-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3,LEU2.Kl], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1-URA3]x12

[000341] YA721-2D: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.Kl], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-tPGK1-URA3]x4

[000342] YA724-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.Kl], pdc6::[pADH1- ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1- BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-tpGK1-URA3Kl]x3

[000343] Estas cepas foram cultivadas em 1,5 L de 30% de glicose YPA em um fermentador de 3L a 30° C sob agitação (800 rpm), uma oxigenação constante foi mantida por borbulhamento a 0,5 L/min-1 de ar. Alíquotas foram tiradas a 24, 32, 48, 56 h, teor de etanol e 2,3-BDO e de glicose no meio foi determinado de acordo com os métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679. Resultados

[000344] Os resultados são relatados nas tabelas 7a, 7b e 7b a seguir.

[000345] Em conclusão, o nível de expressão NOXE tem uma extrema importância na produção de 2,3-BDO. YA724-2, o qual expressa menos NOXE do que as outras duas cepas atinge um nível ótimo. A outra cepa que expressa níveis mais elevados de NOXE não acumula tanto 2,3 BDO. Deve-se adicionalmente notar que 135,5 g de 2,3-BDO representa 90% de rendimento teórico ideal (150g) ao iniciar 300 g de glicose. e) Cepa recombinante prototrófica pela inserção do gene HIS3

[000346] A cepa YA724-2 descrita acima foi tomada como prototrófica pela inserção do gene HIS3.

[000347] A cepa recombinante resultante é chamada YA1044, e possui o seguinte genótipo:

[000348] YA1044-4: MAT-a, his3::HIS3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs- tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.Kl-], pdc6::[ pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2.Kl-TRP1.Sc- tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-tPGK1- URA3Kl]x3

[000349] Esta cepa foi, então, analisada para produção de 2,3- BDO em 30% de glicose YPA nas mesmas condições do descrito acima.

[000350] A produção de etanol, acetoína e 2,3-BDO e o consumo de glicose são monitorados seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679. Resultados

[000351] Os resultados são relatados na tabela 8 a seguir.

[000352] Esta variedade produz 147,9 g de 2,3-BDO (98% de rendimento teórico a partir de 300g de glicose).

[000353] Esta cepa também produz 2,3-BDO eficientemente em 30% de sacarose YPA (a não ser que explícito o contrário, nas mesmas condições que o acima).

[000354] Os resultados são relatados na tabela 9 a seguir.

[000355] Esta variedade também produz 2,3-BDO eficientemente em um meio de infusão de milho. f) Atenuação do pdc 5

[000356] A levedura recombinante, de acordo com YA1044-4, tal como mencionado acima, mas que difere em que o gene pdc 5 é adicionalmente atenuado, foi preparada. A levedura recombinante resultante é chamada YA1245-1.

[000357] YA1245-1 : pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl-], pdc5::[HIS5.Sp,pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Spn-URA3]x3

[000358] Esta cepa foi, então, analisada para produção de 2,3- BDO em 30% de glicose CSL (Licor Embebido em Milho) nas mesmas condições do descrito acima.

[000359] A produção de etanol, acetoína e 2,3-BDO e o consumo de glicose são monitorados seguindo métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679. Resultados

[000360] Os resultados são relatados na tabela 10 a seguir.

[00361] Esta cepa também produz 2,3-BDO eficientemente em glicose YPA (a não ser que explícito o contrário, nas mesmas que o acima).

[00362] Os resultados são relatados na tabela 11 a seguir. g) Modificações genéticas adicionais

[000363] Os exemplos a seguir iniciam a partir da levedura recombinante YA1245-1 mencionada acima, ou seja:

[000364] YA1245-1: Mat-a, his3, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2,pENO2- ALD.Ll -tCYC1, pTEF3 -BDH.Ea-tTDH3-LEU2.Kl], pdc5::[HIS5.Sp-RS- pRPLA1-PDC5-], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2kl-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1-BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2- NOXE.Sp-tPGK1, URA3]x3

[000365] Estas cepas foram cultivadas em 1,5 L de 35% de glicose YPA em um fermentador de 3L a 30° C sob agitação (800 rpm), uma oxigenação constante foi mantida por borbulhamento a 0,5 L/min-1 de ar. Alíquotas foram tiradas a 24, 32 e 48 h, teor de etanol, acetoína, 2,3-BDO e de glicose no meio foi determinado de acordo com os métodos padrões e Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.

[000366] Os resultados são relatados na tabela 12 a seguir.

[000367] Este rendimento em 2,3-BDO é 96,6% do rendimento máximo teórico.

[000368] Estes resultados confirmam, assim, a capacidade de uma cepa recombinante, de acordo com a invenção de crescer, e também para produzir eficientemente 2,3-BDO em sacarose.

[000369] Duas cepas adicionais YA1898-3 e YA1950-1, derivadas da cepa recombinante YA1245-1 exibida acima, foram realizadas.

[000370] A cepa YA1898-3 difere da cepa YA1245-1, em que o gene LEU2.Kl foi extirpado.

[000371] O gene LEU2.Kl se relaciona com as sequências SEQ ID N° 55 e 56.

[000372] YA1898-3: Mat-a, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll- BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000373] A cepa YA1953-1 difere da cepa YA1245-1, em que os genes LEU2.Kl e HIS5 foram extirpados.

[000374] YA1953-1: Mat-a, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll- BDH.Ea-], pdc5::[RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc- BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 g)1) Melhorar a resistência de ácidos fracos no meio de cultura

[000375] A presença de ácidos fracos é conhecida como uma limitação para o crescimento quando as cepas são cultivadas em celulose ou meios derivados de melaço. Nas seguintes cepas, as quais derivaram da cepa mencionada acima YA1898-3 ou YA1950-1, uma ou duas modificações foram inseridas a fim de tentar melhorar a resistência de cepas a ácidos fracos no meio. As modificações consistem na interrupção do gene Jen1 ou a sobre-expressão do gene de HAA-1.

[000376] A sequência do ácido nucleico e a sequência de aminoácidos do gene HAA-1 refere-se a sequências SEQ ID N° 53 e 54 respectivamente.

[000377] Em YA1950-1, jen1 foi interrompido por LEU2.Kl.

[000378] YA1950-1: Mat-a, his3, jen1::LEU2.Kl-RS, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000379] Nas seguintes cepas YA1955-11, YA1997-2B e YA2036- 1, HAA1 é superexpresso usando diferentes terminadores. A este respeito, o terminator tDIT1 refere-se à sequência de SEQ ID N° 51.

[000380] YA1955-11: Mat-a, his3, leu2::[LEU2.Kl-pTDH3-HAA1- tDIT1], pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000381] YA1997-2B: Mat-α, his3, leu2::[LEU2.Kl-pTDH3-HAA1- tDIT1], pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000382] YA2036-1: Mat-a, his3, leu2::[LEU2.Kl-pTDH3-HAA1- tTDH3], pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3.

[000383] Nas seguintes cepas, YA2007-2 e YA2008-13, HAA-1 foi inserido em jlp1 (gene de sulfonato dioxigenase) e SAM3 (gene de s- adenosil permease) respectivamente:

[000384] YA2007-2: Mat-a, his3, jlp1::[LEU2.Kl- pTDH3-HAA1- tDIT1], leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.Sp- pRPLA1- PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp- URA3]x3

[000385] YA2008-13: Mat-a, his3, sam3::[LEU2.Kl- pTDH3-HAA1- tDIT1], leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.Sp- pRPLA1- PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp- URA3]x3

[000386] Nas seguintes cepas YA2188-2A, YA2208-1C e YA2208- 3C, HAA1 foi inserido em Jen1, que, por conseguinte, é inativado:

[000387] YA2188-2A: Mat-a, his3, jen1::[LEU2.Kl- pTDH3-HAA1- tTDH3], leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.Sp- pRPLA1- PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp- URA3]x3

[000388] YA2208-1C: Mat-α, his3, jen1::[LEU2.Kl- pTDH3-HAA1- tTDH3], leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.Sp- pRPLA1- PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp- URA3]x3 g)2) Prevenção do consumo de glicose para a síntese de glicerol

[000389] Nas seguintes cepas YA2153-1 e YA2153-11, derivadas da cepa YA1898-3 acima, o gene PIB1 de glicerol fosfato desidrogenase tem sido inativado por interrupção, a fim de evitar o consumo de glicose para a síntese de glicerol:

[000390] YA2153-1: Mat-a, gpd1::LEU2.Kl-RS, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp- pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 g)3) Interrupção adicional de uma pluralidade de genes

[000391] As seguintes cepas têm os mesmos promotores e terminadores que a cepa YA-1245 definida acima exceto se mencionado o contrário. Uma pluralidade dos genes foi interrompida usando LoxP, o qual é um curto-circuito tendo a sequência SEQ ID N° 52.

[000392] DA385: MAT-a/MAT-α, his3/his3, leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl-]/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea- LEU2.Kl], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5]/pdc5::HIS5.Sp, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc- BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000393] DA411: MAT-a/MAT-α, ade2/ade2, his3/his3, leu2/leu2, pdc1::loxP/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl], pdc5::loxP/pdc5::[HIS5.Sp -pRPLA1-PDC5], pdc6::loxP/pdc6::[ALS.Pp- ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000394] DA426: MAT-a/MAT-α, ADE2/ade2, his3/his3, leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl]/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea- LEU2.Kl], pdc5::[HIS5.Sp- pRPLA1-PDC5]/pdc5::URA3.Kl-, pdc6::[ALS.Pp- ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3

[000395] DA510: MAT-a/MAT-α, his3/his3, JEN1/jen1::[LEU2.Kl- RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll- BDH.Ea]/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1- PDC5]/pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000396] DA511: MAT-a/MAT-α, his3/his3, JEN1/jen1::[LEU2.Kl- RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll- BDH.Ea]/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl], pdc5::[HIS5.Sp-RS- pRPLA1-PDC5]/pdc5::HIS5.Sp, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc- BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3

[000397] DA512: MAT-a/MAT-α, his3/his3, JEN1/jen1::[ LEU2.Kl- RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll- BDH.Ea]/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl], pdc5::[HIS5.Sp-RS- pRPLA1-PDC5]/pdc5::URA3.Kl, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc- BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3

[000398] DA540: MAT-a/MAT-α, his3/his3, jen1::[ LEU2.Kl-RS- pTDH3-HAA1-tTDH3]/jen1::[ LEU2.Kl-RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-]/pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.Kl], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5]/pdc5::URA3.Kl, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea- TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 Conclusão

[000399] Todas as cepas descritas no atual item g) foram testadas para a produção de 2,3 BDO; elas produzem uma quantidade equivalente à cepa recombinante mencionada acima YA1245.

[000400] Algumas das cepas acima mencionadas adicionalmente exibiram efeitos técnicos vantajosos no sentido de que levam a uma redução da síntese de glicerol ou uma resistência melhor a ácidos fracos no meio de cultura. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID N° 1 (=ADN ALS.Bs)

[000401] ATGTCTACCAAAGCAACAAAAGAGCAAAAGAGCCTTG TGAAGAATAGAGGTGCAGAACTTGTCGTTGATTGCTTGGTAGAACAGG GAGTCACTCACGTTTTCGGGATACCCGGCGCTAAAATCGACGCCGTGT TTGACGCTTTACAGGATAAGGGACCAGAGATCATTGTTGCTAGACATG AACAGAATGCAGCGTTCATGGCTCAAGCTGTAGGTAGACTTACTGGGA AACCCGGTGTGGTTTTGGTTACTAGTGGACCAGGTGCATCAAATCTAG CAACAGGTTTGTTAACAGCGAATACAGAGGGAGATCCTGTTGTTGCATT AGCAGGAAACGTTATCAGAGCGGATAGACTGAAAAGAACCCATCAATC ATTGGATAATGCTGCATTATTTCAGCCAATTACGAAATATTCCGTCGAA GTACAGGATGTGAAGAACATACCTGAAGCTGTAACTAATGCGTTTCGTA TAGCTTCTGCTGGTCAAGCTGGTGCAGCTTTTGTTTCGTTTCCGCAAGA CGTTGTCAACGAGGTTACGAACACTAAGAATGTGAGAGCAGTAGCAGC CCCAAAATTAGGACCAGCTGCTGATGATGCTATATCAGCTGCTATTGCT AAGATTCAGACAGCCAAACTACCTGTTGTCTTAGTAGGTATGAAAGGTG GCAGGCCAGAAGCAATCAAGGCAGTTAGAAAACTGTTGAAGAAGGTTC AATTGCCGTTTGTGGAAACCTATCAAGCCGCAGGGACTTTGTCTAGGG ATCTAGAAGATCAATACTTCGGTAGAATAGGGTTGTTCAGAAATCAACC TGGCGACTTGTTACTGGAACAAGCCGATGTCGTGCTTACAATTGGTTA CGATCCGATTGAATATGACCCCAAATTTTGGAATATTAATGGTGATAGG ACTATTATCCACTTAGACGAGATTATTGCCGATATTGACCATGCTTATCA ACCTGATCTGGAACTGATAGGTGATATTCCAAGTACTATCAACCATATA GAGCATGATGCCGTCAAAGTGGAATTTGCCGAAAGAGAACAGAAGATC CTATCCGATCTAAAGCAGTACATGCATGAAGGCGAACAAGTTCCAGCA GATTGGAAATCCGATAGAGCACATCCATTGGAAATTGTCAAAGAATTGA GAAATGCAGTTGATGACCATGTTACAGTTACTTGTGACATAGGTAGTCA CGCTATTTGGATGTCTAGGTACTTCAGATCTTATGAGCCATTAACGTTG ATGATATCCAATGGCATGCAAACCCTTGGAGTCGCTTTACCATGGGCC ATTGGTGCGTCGTTAGTAAAGCCAGGAGAGAAAGTCGTTTCTGTGTCA GGTGATGGTGGTTTCTTGTTCTCTGCCATGGAATTGGAAACCGCCGTT CGTTTGAAAGCCCCTATAGTACACATCGTGTGGAATGATTCGACCTATG ACATGGTCGCGTTTCAACAATTGAAGAAGTACAACCGTACTTCAGCTGT TGATTTCGGCAACATTGACATTGTGAAGTACGCGGAAAGCTTTGGCGC CACAGGCCTAAGAGTCGAATCACCTGATCAATTAGCAGATGTACTTAG GCAAGGGATGAACGCTGAAGGACCTGTAATTATCGACGTACCTGTTGA CTATAGCGACAACATCAATTTAGCCAGTGATAAATTACCCAAAGAGTTT GGTGAGCTAATGAAAACGAAAGCTTTGTAA SEQ ID N° 2 (= aminoácido ALS. BS)

[000402] MSTKATKEQKSLVKNRGAELVVDCLVEQGVTHVFGIPG AKIDAVFDALQDKGPEIIVARHEQNAAFMAQAVGRLTGKPGVVLVTSGPG ASNLATGLLTANTEGDPVVALAGNVIRADRLKRTHQSLDNAALFQPITKYS VEVQDVKNIPEAVTNAFRIASAGQAGAAFVSFPQDVVNEVTNTKNVRAVA APKLGPAADDAISAAIAKIQTAKLPVVLVGMKGGRPEAIKAVRKLLKKVQLP FVETYQAAGTLSRDLEDQYFGRIGLFRNQPGDLLLEQADVVLTIGYDPIEY DPKFWNINGDRTIIHLDEIIADIDHAYQPDLELIGDIPSTINHIEHDAVKVEFAE REQKILSDLKQYMHEGEQVPADWKSDRAHPLEIVKELRNAVDDHVTVTCD IGSHAIWMSRYFRSYEPLTLMISNGMQTLGVALPWAIGASLVKPGEKVVSV SGDGGFLFSAMELETAVRLKAPIVHIVWNDSTYDMVAFQQLKKYNRTSAV DFGNIDIVKYAESFGATGLRVESPDQLADVLRQGMNAEGPVIIDVPVDYSD NINLASDKLPKEFGELMKTKAL SEQ ID N° 3 (= ADN ALS.Nt)

[000403] ATGGCTGCTGCTGCAGCTGCTCCATCTCCATCTTTTT CTAAAACCTTGTCCTCCTCCTCTTCCAAATCTTCTACTTTGTTGCCAAGA TCTACTTTCCCATTTCCACATCATCCACATAAGACTACTCCACCACCATT GCATTTGACTCCAACTCATATTCACTCCCAAAGAAGAAGATTCACCATC TCCAACGTTATTTCTACCACCCAAAAGGTTTCTGAAACTCAAAAGGCTG AAACCTTCGTTTCTAGATTTGCTCCAGATGAACCTAGAAAGGGTTCTGA TGTTTTGGTTGAAGCTTTGGAAAGAGAAGGTGTTACCGATGTTTTTGCT TATCCAGGTGGTGCTTCTATGGAAATTCATCAAGCTTTGACCAGATCCT CCATCATTAGAAATGTTTTGCCAAGACATGAACAAGGTGGTGTTTTCGC TGCTGAAGGTTATGCTAGAGCTACTGGTTTTCCAGGTGTATGTATTGCT ACTTCTGGTCCAGGTGCTACTAATTTGGTTTCTGGTTTGGCTGATGCTT TGTTGGATTCTGTTCCAATCGTTGCTATTACTGGTCAAGTTCCAAGAAG AATGATTGGTACAGATGCTTTCCAAGAAACCCCAATTGTCGAAGTTACT AGATCTATTACCAAGCACAACTACTTGGTTATGGACGTTGAAGATATCC CAAGAGTTGTTAGAGAAGCATTTTTCTTGGCTAGATCTGGTAGACCAGG TCCAGTTTTGATTGATGTTCCAAAGGATATCCAACAACAATTGGTTATC CCAGATTGGGACCAACCTATGAGATTGCCAGGTTATATGTCTAGATTGC CAAAGTTGCCAAACGAAATGTTGTTAGAACAAATCGTCAGATTGATCTC CGAATCTAAAAAGCCAGTCTTGTATGTTGGTGGTGGTTGTTCTCAATCT AGTGAAGAATTGAGAAGATTCGTCGAATTGACCGGTATTCCAGTTGCTT CTACATTGATGGGTTTGGGTGCTTTTCCAACTGGTGATGAATTGTCTTT GTCTATGTTGGGTATGCACGGTACTGTTTATGCTAATTACGCTGTTGAT TCCTCCGATTTGTTGTTAGCTTTTGGTGTTAGATTCGATGATAGAGTCA CTGGTAAGTTGGAAGCTTTTGCTTCTAGAGCTAAGATCGTTCATATCGA CATTGATTCCGCTGAAATCGGTAAAAACAAGCAACCACATGTTTCTATT TGCGCCGATATTAAGTTGGCATTGCAAGGTTTGAACAGTATCTTGGAAT CCAAAGAAGGTAAATTGAAGTTGGACTTCTCTGCTTGGAGACAAGAATT GACAGTTCAAAAGGTTAAGTACCCATTGAACTTCAAGACTTTCGGTGAT GCTATTCCACCACAATACGCTATTCAAGTTTTGGATGAATTGACCAACG GTTCCGCTATTATTTCAACTGGTGTTGGTCAACATCAAATGTGGGCTGC TCAATATTACAAGTACAGAAAACCTAGACAATGGTTGACTTCTGGTGGT TTAGGTGCTATGGGTTTTGGTTTGCCAGCTGCTATTGGTGCTGCTGTTG GTAGACCTGATGAAGTTGTTGTAGATATTGATGGTGACGGTTCCTTCAT TATGAACGTCCAAGAATTGGCTACCATCAAGGTTGAAAATTTGCCAGTC AAGATCATGTTATTGAACAATCAACACTTGGGTATGGTCGTCCAATGGG AAGATAGATTTTACAAAGCTAATAGAGCCCACACCTACTTGGGTAATCC ATCTAATGAAGCTGAAATCTTCCCAAACATGTTGAAGTTTGCTGAAGCT TGTGGTGTTCCAGCTGCAAGAGTTACTCATAGAGATGATTTGAGAGCT GCCATCCAAAAGATGTTGGATACTCCAGGTCCATACTTGTTGGATGTTA TTGTCCCACATCAAGAACATGTCTTGCCAATGATTCCATCTGGTGGTGC CTTTAAAGATGTTATTACTGAAGGTGACGGTAGATCCTCTTACTGA SEQ ID N° 4 (= aminoácido ALS.Nt)

[000404] MAAAAAAPSPSFSKTLSSSSSKSSTLLPRSTFPFPHHP HKTTPPPLHLTPTHIHSQRRRFTISNVISTTQKVSETQKAETFVSRFAPDEP RKGSDVLVEALEREGVTDVFAYPGGASMEIHQALTRSSIIRNVLPRHEQG GVFAAEGYARATGFPGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPIVAITGQVP RRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVMDVEDIPRVVREAFFLARSGRPG PVLIDVPKDIQQQLVIPDWDQPMRLPGYMSRLPKLPNEMLLEQIVRLISESK KPVLYVGGGCSQSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGAFPTGDELSLSMLG MHGTVYANYAVDSSDLLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIG KNKQPHVSICADIKLALQGLNSILESKEGKLKLDFSAWRQELTVQKVKYPL NFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGSAIISTGVGQHQMWAAQYYKYRKPRQ WLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVGRPDEVVVDIDGDGSFIMNVQELATIKV ENLPVKIMLLNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPSNEAEIFPNMLK FAEACGVPAARVTHRDDLRAAIQKMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSG GAFKDVITEGDGRSSY SEQ ID N° 5 (= ADN ALS.Pp)

[000405] ATGTCCGCACAAATACCTGAAGTTAGAAGTACAAATG AATTGAGAGAAAAATGGATGAAGCCTGAAGTAATCACTGGTTCCGAAAT ATTGTTAAGATCATTGTTATTGGAAGGTGTCGATTGTGTATTTGGTTATC CAGGTGGTGCTGTCTTGTACATCTATGATGCAATGTACGGTTTTAAAGA CTTCAAGCATGTTTTAACCAGACACGAACAAGGTGCTATACATGCTGCA GATGGTTATGCCAGAGCTTCCGGTAAAGTAGGTGTTTGCATCGCAACA AGTGGTCCAGGTGCCACCAATTTGGTTACTGGTATCGCAACAGCCTTT ATGGATTCTGTTCCTTTGGTTGTCATTACTGGTAACGTCATTTCTTCATT AATCGGTACAGATGCATTCCAAGAAGCCGACATAACTGGTATCACAAT GCCAATAACTAAGCACTCATATTTGGTTAGAGATGTCGAAGACTTGCCT AGAATAATCCATGAAGCATTTCACATAGCAAATACAGGTAGAAAGGGTC CAGTTTTGATAGATATCCCTAAAGACATATCCGCCGCTCAAACCTTATT CGTACCACAAACCGGTCCTGTTACTATGAGAGGTTACAACCCAAAGGT TTTGCCTAACAAGATACAATTGGATAAATTGACACAAGCCATCTCCGAA GCTGAAAGACCATTCATTTTGGCAGGTGGTGGTGTAGTTTATAGTGGT GGTCATGAAGCCTTATACGAATTTGTTAGAAAGACTGAAATCCCTATCA CTACAACCTTATTGGGTTTAGGTGGTTTCCCATCAGGTCATGAATTGTG GACTGGTATGCCTGGTATGCACGGTACATACACCTCCAATCAAGCAAT ACAACAATCTGATTTGTTGATCTGTATTGGTGCTAGATTTGATGACAGA GTTACTGGTAAATTGGATGGTTTCGCACCACAAGCCAAAATTGTACATA TAGATATCGACCCTGCAGAAATAGGTAAAAATGTTGCAGCCGATATTCC AATAGTAGGTGACGTTAAGGCTGTCTTAGAATTATTGAACCAAGATGTT AAGAGAGCCGATAGAGCTGACGCATGGAGAGCACAAATCCAACATTGG AAGAACGAAAAGCCATATTCCTACAAGGATAGTGAAACAGTTTTGAAAC CTCAATGGGTCGTAGAATTATTGGATGAAACTACAAAGGGTGGTGCTAT TGTCACCACTGACGTAGGTCAACACCAAATGTGGGCTGCACAATACTA CAAGTTTAATCAACCAAGATCATGGGTTACATCAGGTGGTTTAGGTACT ATGGGTTTTGGTTTCCCATCTGCTATTGGTGCACAAATGGCCAATCCTG ATAGATTGGTTATCTCTATTAACGGTGACGGTGGTATGCAAATGTGTTC ACAAGAATTAGCTATTTGCGCTATTAATAACATCCCAGTAAAGATCGTTA TCATTAATAACCAAGTTTTGGGTATGGTCAGACAATGGCAAGAATTGAT CTATAACAACAGATACTCTCATATTGATTTGGCTGGTTCACCTGACTTT GTCAAATTGGCCGAAGCCTATGGTGTAAAGGGTTTAAGAGCAACCAAT AAGGAAGAAGCCAGAAGAGCTTGGCAAGAAGCATTGGATACTCCAGGT CCTGTTGTCGTAGAATTTGTTGTCTCTAAAGAAGAAAACGTTTATCCAAT GGTTACACAAGGTTCCACAATAGACCAAATGTTGATGGGTGACGAATG A SEQ ID N° 6 (= aminoácido ALS.Pp)

[000406] MSAQIPEVRSTNELREKWMKPEVITGSEILLRSLLLEGV DCVFGYPGGAVLYIYDAMYGFKDFKHVLTRHEQGAIHAADGYARASGKV GVCIATSGPGATNLVTGIATAFMDSVPLVVITGNVISSLIGTDAFQEADITGIT MPITKHSYLVRDVEDLPRIIHEAFHIANTGRKGPVLIDIPKDISAAQTLFVPQT GPVTMRGYNPKVLPNKIQLDKLTQAISEAERPFILAGGGVVYSGGHEALYE FVRKTEIPITTTLLGLGGFPSGHELWTGMPGMHGTYTSNQAIQQSDLLICIG ARFDDRVTGKLDGFAPQAKIVHIDIDPAEIGKNVAADIPIVGDVKAVLELLNQ DVKRADRADAWRAQIQHWKNEKPYSYKDSETVLKPQWVVELLDETTKGG AIVTTDVGQHQMWAAQYYKFNQPRSWVTSGGLGTMGFGFPSAIGAQMA NPDRLVISINGDGGMQMCSQELAICAINNIPVKIVIINNQVLGMVRQWQELI YNNRYSHIDLAGSPDFVKLAEAYGVKGLRATNKEEARRAWQEALDTPGPV VVEFVVSKEENVYPMVTQGSTIDQMLMGDE SEQ ID N° 7 (= ADN ALD.Bb)

[000407] ATGGGTAAGAAGAACATTATTACCTCTATCACCTCCT TGGCTTTGGTTGCTGGTTTGTCTTTGACTGCTTTTGCTGCTACTACTGC TACTGTTCCAGCTCCACCAGCTAAACAAGAATCTAAACCAGCTGTTGCT GCTAATCCAGCTCCTAAGAATGTTTTGTTCCAATACTCTACCATCAACG CCTTGATGTTGGGTCAATTTGAAGGTGATTTGACCTTGAAGGACTTGAA GTTGAGAGGTGATATGGGTTTGGGTACTATCAATGATTTGGACGGTGA AATGATCCAAATGGGTACTAAGTTCTACCAAATCGATTCTACCGGTAAG TTGTCTGAATTGCCAGAATCTGTTAAGACTCCATTCGCTGTTACTACTC ACTTCGAACCTAAAGAAAAGACTACCTTGACCAACGTCCAAGACTACAA TCAATTGACCAAGATGTTGGAAGAAAAGTTCGAAAACAAGAACGTTTTC TACGCCGTTAAGTTGACTGGTACTTTCAAAATGGTTAAGGCTAGAACCG TTCCTAAGCAAACTAGACCATATCCACAATTGACTGAAGTCACCAAGAA GCAATCCGAATTTGAATTCAAGAACGTCAAGGGTACTTTGATCGGTTTT TACACTCCAAATTATGCTGCTGCTTTGAACGTTCCAGGTTTTCACTTGC ATTTCATTACCGAAGATAAGACCTCTGGTGGTCATGTTTTGAACTTGCA ATTTGATAACGCCAACTTGGAAATCTCCCCAATCCATGAATTTGATGTT CAATTGCCACACACCGATGATTTCGCTCATTCTGATTTGACTCAAGTTA CTACCTCCCAAGTTCATCAAGCTGAATCTGAAAGAAAGTA SEQ ID N° 8 (= aminoácido ALD. Bb)

[000408] MGKKNIITSITSLALVAGLSLTAFAATTATVPAPPAKQES KPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDL DGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDY NQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKK QSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFD NANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERK SEQ ID N° 9 (= ADN ALD.Ea)

[000409] ATGATGATGCACTCCTCCGCCTGCGACTGTGAAGCA AGTTTATGCGAAACATTGAGAGGTTTTTCCGCCAAGCACCCAGATTCC GTTATATATCAAACATCCTTGATGAGTGCTTTGTTATCTGGTGTCTACGA AGGTGACACTACAATCGCAGACTTGTTAGCTCATGGTGACTTTGGTTTG GGTACTTTTAATGAATTAGACGGTGAAATGATCGCATTTTCTTCACAAG TTTACCAATTGAGAGCTGATGGTTCAGCAAGAGCTGCAAAACCAGAAC AAAAGACACCTTTTGCAGTCATGACCTGGTTCCAACCACAATACAGAAA AACTTTTGATGCCCCAGTTTCAAGACAACAAATTCACGATGTAATAGAC CAACAAATCCCTTCAGATAATTTGTTTTGTGCCTTGAGAATAGACGGTA ACTTCAGACATGCTCACACCAGAACTGTTCCAAGACAAACTCCACCTTA TAGAGCCATGACAGATGTATTGGATGACCAACCTGTTTTTAGATTCAAT CAAAGAGAAGGTGTTTTAGTCGGTTTTAGAACCCCACAACACATGCAA GGTATCAACGTAGCAGGTTATCATGAACACTTCATTACTGATGACAGAC AAGGTGGTGGTCATTTGTTAGATTACCAATTGGAATCCGGTGTTTTGAC ATTCGGTGAAATCCACAAGTTGATGATTGATTTGCCAGCCGACAGTGCT TTCTTACAAGCCAACTTACACCCATCAAACTTAGACGCCGCAATCAGAT CAGTAGAAAACTAA SEQ ID N° 10 (= aminoácido ALD. Ea)

[000410] MMMHSSACDCEASLCETLRGFSAKHPDSVIYQTSLMS ALLSGVYEGDTTIADLLAHGDFGLGTFNELDGEMIAFSSQVYQLRADGSAR AAKPEQKTPFAVMTWFQPQYRKTFDAPVSRQQIHDVIDQQIPSDNLFCAL RIDGNFRHAHTRTVPRQTPPYRAMTDVLDDQPVFRFNQREGVLVGFRTP QHMQGINVAGYHEHFITDDRQGGGHLLDYQLESGVLTFGEIHKLMIDLPAD SAFLQANLHPSNLDAAIRSVEN SEQ ID N° 11 (= ADN ALD.L1)

[000411] ATGTCATCGAGAATCTTTCAACACAATACCTTCACAA CTTTGAGTAGCGGATTTTACAAAGGCACAATCACGTTGAAAGAAGCCTT AGAACACGGATCAGTTGGCATAGGTACATTAGATACTGCAAATGGTGA AGTTACCATCATCAACGGTATAGCCTATCATGGAGATTCGGAAAACCAT GTGAGATTGGTGGAAGAGGATGAAACGATGCCTTATGTCGCTATGGTT GAACATCAACCCATTGCAAAGTTCACTGATTCCTCTGTGTCAAATAGCG AAGATTTCCTATCCGCTTTAACCAAAAGGTTTCCAACCGTTAATACTGC CTACACAATTGTCATGACTGGTCAGTTTAAGGAAGTAACTGTCTCTTCT AAACCAGCGAACAATACTAGACCATATGACGAAATAATGGCTGATCAAC CGTACTTTACAAAGGAGAACATTAGTGGTACAATGGTTGGTGTATGGG CTCCTAAACATCTTACTGATCTATTTGGGTTAGGCTTTCACCTTCACTTC GTTTCTGACGATAAGACGTTTACTGCACATGTACAGAATTTCATTACAG AGAATCTGGAAATTGAGATAGGGAAAATTACCAAGATTGACCAAGAATT TCCTGATGATGACGAGAACTTCGACCAACATTTGTTCCAATAA SEQ ID N° 12 (= aminoácido ALD. L1)

[000412] MSSRIFQHNTFTTLSSGFYKGTITLKEALEHGSVGIGTL DTANGEVTIINGIAYHGDSENHVRLVEEDETMPYVAMVEHQPIAKFTDSSV SNSEDFLSALTKRFPTVNTAYTIVMTGQFKEVTVSSKPANNTRPYDEIMAD QPYFTKENISGTMVGVWAPKHLTDLFGLGFHLHFVSDDKTFTAHVQNFITE NLEIEIGKITKIDQEFPDDDENFDQHLFQ SEQ ID N° 13 (= ADN BDH.Ea)

[000413] ATGGGCAAAGTAGCGTTAGTGACAGGTGCTGGTCAA GGCATTGGAAAGGCCATTGCCTTGAGATTGGTTAAAGATGGCTTTGCG GTCGCTATAGCCGATTACAACGATGTGACTGCTAAAGCCGTTGCAGAC GAGATCAATCAACACGGAGGTAGAGCTATAGCTGTCAAAGTTGACGTC AGTGATAGAGAACAGGTTTTCGCTGCTGTAGAACAAGCACGTAAAACG TTAGGCGGTTTTAACGTCATCGTCAATAATGCGGGAGTAGCACCATCA ACCCCTATAGAGTCCATTACACCCGAAATAGTGGACAAAGTGTACAACA TCAATGTTAAGGGTGTGATTTGGGGTATTCAAGCCGCAGTTGAAGCATT CAAGAAAGAAGGTCATGGTGGCAAGATCATTAACGCCTGTTCACAAGC AGGACATGTAGGCAATCCGGAATTAGCGGTTTACTCTTCGTCTAAGTTT GCTGTTAGAGGGTTAACCCAGACAGCTGCTAGAGATCTTGCACCTCTT GGTATCACTGTAAACGGTTATTGCCCAGGTATTGTCAAAACACCAATGT GGGCAGAGATAGATAGGCAAGTATCTGAAGCTGCAGGGAAACCTCTAG GATATGGTACTGCCGAATTTGCCAAGAGGATTACGTTGGGTAGACTAT CTGAGCCAGAAGATGTTGCTGCTTGTGTTTCCTATTTGGCAAGTCCCG ACTCAGACTATATGACTGGACAGAGCTTGCTGATTGATGGTGGGATGG TTTTCAATTAA SEQ ID N° 14 (= aminoácido BDH. Ea)

[000414] MGKVALVTGAGQGIGKAIALRLVKDGFAVAIADYNDVTA KAVADEINQHGGRAIAVKVDVSDREQVFAAVEQARKTLGGFNVIVNNAGV APSTPIESITPEIVDKVYNINVKGVIWGIQAAVEAFKKEGHGGKIINACSQAG HVGNPELAVYSSSKFAVRGLTQTAARDLAPLGITVNGYCPGIVKTPMWAEI DRQVSEAAGKPLGYGTAEFAKRITLGRLSEPEDVAACVSYLASPDSDYMT GQSLLIDGGMVFN SEQ ID N° 15 (= ADN BDH.Pp)

[000415] ATGTCTGCTTTGAGATGGCATGGTGTTAAGGATTTGA GATTGGAAAACATTGAACAACCAGCTGCTTTGCCAGGTAAGGTTAAGAT TAAGGTTGAATGGTGTGGTATTTGCGGTTCTGACTTGCATGAATATGTT GCTGGTCCAATTTTCATTCCAGAAAACGCTCAACATCCATTGACTGGTG AAAAAGCTCCAATAGTTATGGGTCATGAATTCTCCGGTCAAGTTGTTGA AATTGGTGAAGGTGTTACCAAGATCCAAGTTGGTGATAGAGTTGTTGTT GAACCAGTTTTTGCTTGCGGTGAATGTGATGCTTGTAGACAAGGTAAAT ACAACTTGTGCGATAAGATGGGTTTTTTGGGTTTGGCCGGTGGCGGTG GTGGTTTTTCTGAATACGTTGCAGCTGATGAACATATGGTTCACAAGAT TCCAGAATCCGTCAGTTTTGAACAAGGTGCTTTGGTTGAACCATCTGCT GTTGCATTATATGCCGTTAGACAATCCCAATTGAAAGTCGGTGATAAGG CTGTTGTTTTTGGTGCTGGTCCTATTGGTTTGTTGGTTATTGAAGCTTT GAAGGCTTCTGGTGCTTCTGAAATCTATGCTGTTGAATTGTCCGAAGAA AGAAAGGCTAAAGCTGAAGAATTGGGTGCCATAGTTTTAGATCCAAAG ACCTATGATGTCGTCGAAGAATTGCATAAGAGAACTAATGGTGGTGTTG ATGTTGCTTACGAAGTTACTGGTGTTCCACCAGTTTTGACTCAAGCTAT TGAATCCACTAAGATCTCTGGTCAAATCATGATCGTCAGTATCTTCGAA AAAGAAGCCCCTATTAAGCCAAACAACATCGTCATGAAGGAAAGAAACT TGACTGGTATCATCGGTTACAGAGATGTTTTCCCAGCTGTTATCTCTTT GATGGAAAAGGGTTATTTTCCAGCCGATAAGTTGGTCACTAAGAGAATC AAATTGGAAGAAGTCATCGAACAAGGTTTCGAAGGTTTGTTGAAAGAAA AGAATCAAGTTAAGATCTTGGTTTCCCCAAAGGCCTAA SEQ ID N° 16 (= aminoácido BDH.Pp)

[000416] MSALRWHGVKDLRLENIEQPAALPGKVKIKVEWCGICG SDLHEYVAGPIFIPENAQHPLTGEKAPIVMGHEFSGQVVEIGEGVTKIQVG DRVVVEPVFACGECDACRQGKYNLCDKMGFLGLAGGGGGFSEYVAADE HMVHKIPESVSFEQGALVEPSAVALYAVRQSQLKVGDKAVVFGAGPIGLL VIEALKASGASEIYAVELSEERKAKAEELGAIVLDPKTYDVVEELHKRTNGG VDVAYEVTGVPPVLTQAIESTKISGQIMIVSIFEKEAPIKPNNIVMKERNLTGI IGYRDVFPAVISLMEKGYFPADKLVTKRIKLEEVIEQGFEGLLKEKNQVKILV SPKA SEQ ID N° 17 (= ADN BDH.Ko)

[000417] ATGGGTAAAGTCGCATTGGTCACTGGTGCTGGTCAA GGTATCGGTAAAGCTATCGCATTGAGATTGGTAAAAGACGGTTTCGCT GTCGCCATCGCTGATTATAATGACGCAACTGCCCAAGCTGTTGCAGAT GAAATTAACAGAAGTGGTGGTAGAGCCTTGGCTGTTAAAGTCGATGTA TCTCAAAGAGACCAAGTCTTTGCTGCAGTAGAACAAGCTAGAAAGGGT TTAGGTGGTTTCGATGTTATAGTCAATAACGCAGGTGTTGCCCCATCAA CACCTATCGAAGAAATCAGAGAAGATGTTATCGACAAGGTCTACAACAT CAACGTAAAGGGTGTTATATGGGGTATCCAAGCCGCTGTCGAAGCCTT TAAACAAGAAGGTCATGGTGGTAAAATTATTAACGCTTGTTCTCAAGCA GGTCACGTAGGTAACCCAGAATTGGCCGTTTACTCTTCATCCAAATTCG CAGTTAGAGGTTTAACTCAAACAGCAGCCAGAGATTTGGCTCATTTGG GTATCACAGTCAATGGTTATTGCCCAGGTATTGTAAAGACCCCTATGTG GGCAGAAATAGACAGACAAGTTTCAGAAGCTGCAGGTAAACCTTTGGG TTACGGTACTCAAGAATTTGCTAAGAGAATAACTTTGGGTAGATTATCC GAACCTGAAGATGTCGCTGCCTGTGTCTCCTACTTGGCTGGTACTGAC TCAAACTGTATGTGA SEQ ID N° 18 (= aminoácido BDH.Ko)

[000418] MGKVALVTGAGQGIGKAIALRLVKDGFAVAIADYNDATA QAVADEINRSGGRALAVKVDVSQRDQVFAAVEQARKGLGGFDVIVNNAG VAPSTPIEEIREDVIDKVYNINVKGVIWGIQAAVEAFKQEGHGGKIINACSQA GHVGNPELAVYSSSKFAVRGLTQTAARDLAHLGITVNGYCPGIVKTPMWA EIDRQVSEAAGKPLGYGTQEFAKRITLGRLSEPEDVAACVSYLAGTDSNC M SEQ ID N° 19 (= ADN BDH1.Sc)

[000419] ATGAGAGCTTTGGCATATTTCAAGAAGGGTGATATTC ACTTCACTAATGATATCCCTAGGCCAGAAATCCAAACCGACGATGAGG TTATTATCGACGTCTCTTGGTGTGGGATTTGTGGCTCGGATCTTCACGA GTACTTGGATGGTCCAATCTTCATGCCTAAAGATGGAGAGTGCCATAAA TTATCCAACGCTGCTTTACCTCTGGCAATGGGCCATGAGATGTCAGGA ATTGTTTCCAAGGTTGGTCCTAAAGTGACAAAGGTGAAGGTTGGCGAC CACGTGGTCGTTGATGCTGCCAGCAGTTGTGCGGACCTGCATTGCTG GCCACACTCCAAATTTTACAATTCCAAACCATGTGATGCTTGTCAGAGG GGCAGTGAAAATCTATGTACCCACGCCGGTTTTGTAGGACTAGGTGTG ATCAGTGGTGGCTTTGCTGAACAAGTCGTAGTCTCTCAACATCACATTA TCCCGGTTCCAAAGGAAATTCCTCTAGATGTGGCTGCTTTAGTTGAGC CTCTTTCTGTCACCTGGCATGCTGTTAAGATTTCTGGTTTCAAAAAAGG CAGTTCAGCCTTGGTTCTTGGTGCAGGTCCCATTGGGTTGTGTACCAT TTTGGTACTTAAGGGAATGGGGGCTAGTAAAATTGTAGTGTCTGAAATT GCAGAGAGAAGAATAGAAATGGCCAAGAAACTGGGCGTTGAGGTGTTC AATCCCTCCAAGCACGGTCATAAATCTATAGAGATACTACGTGGTTTGA CCAAGAGCCATGATGGGTTTGATTACAGTTATGATTGTTCTGGTATTCA AGTTACTTTCGAAACCTCTTTGAAGGCATTAACATTCAAGGGGACAGCC ACCAACATTGCAGTTTGGGGTCCAAAACCTGTCCCATTCCAACCAATG GATGTGACTCTCCAAGAGAAAGTTATGACTGGTTCGATCGGCTATGTT GTCGAAGACTTCGAAGAAGTTGTTCGTGCCATCCACAACGGAGACATC GCCATGGAAGATTGTAAGCAACTAATCACTGGTAAGCAAAGGATTGAG GACGGTTGGGAAAAGGGATTCCAAGAGTTGATGGATCACAAGGAATCC AACGTTAAGATTCTATTGACGCCTAACAATCACGGTGAAATGAAGTAA SEQ ID N° 20 (= aminoácido BDH1.Sc)

[000420] RALAYFKKGDIHFTNDIPRPEIQTDDEVIIDVSWCGICGS DLHEYLDGPIFMPKDGECHKLSNAALPLAMGHEMSGIVSKVGPKVTKVKV GDHVVVDAASSCADLHCWPHSKFYNSKPCDACQRGSENLCTHAGFVGL GVISGGFAEQVVVSQHHIIPVPKEIPLDVAALVEPLSVTWHAVKISGFKKGS SALVLGAGPIGLCTILVLKGMGASKIVVSEIAERRIEMAKKLGVEVFNPSKH GHKSIEILRGLTKSHDGFDYSYDCSGIQVTFETSLKALTFKGTATNIAVWGP KPVPFQPMDVTLQEKVMTGSIGYVVEDFEEVVRAIHNGDIAMEDCKQLITG KQRIEDGWEKGFQELMDHKESNVKILLTPNNHGEMK SEQ ID N° 21 (= ADN NOXE.L1)

[000421] ATGGGTATTGTCGTAATAGGTACTAACCATGCCGGAA TAGCTACAGCAAATACCTTAATCGACCAATATCCAGGACATGAAATTGT TATGATTGACAGAAACTCGAATATGAGTTATCTTGGCTGTGGTACAGCG ATTTGGGTTGGGAGACAAATCGAGAAACCTGATGAACTTTTCTATGCAA AAGCAGAAGATTTCGAAAAGAAGGGTGTTAAAATCCTGACCGAGACTG AAGTGTCAGAAATCGACTTTACCAACAAAATGATATATGCCAAAAGCAA GACTGGGGAGAAAATCACGGAATCTTATGATAAGCTAGTATTGGCAAC AGGAAGCAGACCAATCATACCCAATTTGCCTGGTAAAGATCTTAAAGGA ATTCATTTCTTAAAGTTATTCCAGGAAGGTCAAGCCATTGACGAAGAAT TCGCAAAGAATGACGTGAAAAGAATCGCGGTAATTGGTGCTGGTTATA TTGGAACAGAGATAGCTGAAGCAGCTAAACGTAGAGGGAAAGAAGTGT TGTTGTTTGATGCTGAAAGTACCTCATTAGCGTCATACTACGACGAAGA ATTTGCCAAAGGCATGGATGAAAATTTGGCACAACACGGGATTGAGTT GCACTTTGGTGAACTTGCCCAAGAGTTCAAGGCAAATGAAGAAGGTCA TGTCTCCCAGATTGTTACAAACAAATCCACTTATGATGTGGATCTGGTC ATCAATTGCATAGGATTTACTGCCAATTCAGCCTTAGCTGGTGAGCATC TAGAAACGTTTAAGAACGGTGCCATAAAGGTTAATAAGCATCAACAATC TAGTGATCCAGACGTGTATGCAGTTGGTGATGTTGCAACTATCTACTCT AACGCTTTGCAAGACTTTACTTACATCGCTTTAGCTAGCAATGCTGTTA GATCAGGCATTGTTGCTGGACACAATATTGGCGGTAAATCCATAGAATC TGTCGGTGTTCAGGGTAGTAACGGCATTTCTATATTCGGATACAATATG ACAAGTACTGGTTTATCAGTAAAAGCTGCTAAGAAGATTGGTCTAGAAG TCTCCTTTTCTGATTTTGAAGATAAGCAAAAGGCTTGGTTTCTGCATGA GAACAATGATTCGGTCAAAATAAGGATCGTATACGAAACAAAATCCAGG AGAATAATTGGCGCACAATTGGCATCGAAATCAGAGATTATAGCGGGC AACATTAACATGTTCTCTTTAGCCATTCAGGAAAAGAAAACGATTGATG AGTTAGCCCTATTGGATTTGTTCTTTCTGCCTCACTTTAACTCTCCGTAC AATTATATGACCGTAGCTGCGTTGAATGCTAAATAA SEQ ID N° 22 (= aminoácido NOXE. L1)

[000422] MGIVVIGTNHAGIATANTLIDQYPGHEIVMIDRNSNMSYL GCGTAIWVGRQIEKPDELFYAKAEDFEKKGVKILTETEVSEIDFTNKMIYAK SKTGEKITESYDKLVLATGSRPIIPNLPGKDLKGIHFLKLFQEGQAIDEEFAK NDVKRIAVIGAGYIGTEIAEAAKRRGKEVLLFDAESTSLASYYDEEFAKGMD ENLAQHGIELHFGELAQEFKANEEGHVSQIVTNKSTYDVDLVINCIGFTANS ALAGEHLETFKNGAIKVNKHQQSSDPDVYAVGDVATIYSNALQDFTYIALA SNAVRSGIVAGHNIGGKSIESVGVQGSNGISIFGYNMTSTGLSVKAAKKIGL EVSFSDFEDKQKAWFLHENNDSVKIRIVYETKSRRIIGAQLASKSEIIAGNIN MFSLAIQEKKTIDELALLDLFFLPHFNSPYNYMTVAALNAK SEQ ID N° 23 (= ADN NOXE.Spn)

[000423] ATGTCTAAGATAGTGGTAGTTGGTGCTAACCATGCAG GAACTGCTTGCATCAATACGATGTTGGATAATTTCGGCAATGAAAATGA GATAGTGGTGTTTGATCAGAATTCCAACATCAGCTTTCTAGGTTGTGGT ATGGCGTTATGGATTGGGGAGCAAATAGATGGTGCTGAAGGGTTGTTT TACTCAGACAAAGAGAAATTGGAAGCCAAAGGTGCCAAAGTCTACATG AATTCGCCAGTCCTGAGTATAGACTATGACAACAAAGTGGTAACTGCA GAAGTAGAAGGCAAAGAGCACAAAGAATCCTATGAGAAACTGATCTTT GCTACTGGTTCAACACCGATTTTACCACCTATTGAAGGAGTCGAGATC GTTAAAGGTAATAGAGAATTTAAGGCCACACTTGAAAACGTACAATTTG TTAAGTTGTATCAGAATGCTGAAGAAGTCATCAACAAGCTTTCAGATAA AAGCCAGCATTTAGATAGGATTGCTGTTGTTGGAGGTGGATACATTGG TGTTGAATTGGCTGAAGCCTTTGAAAGACTAGGAAAAGAAGTTGTGTTA GTTGACATTGTGGACACTGTCTTAAACGGGTATTATGACAAAGATTTCA CCCAAATGATGGCCAAGAATCTTGAGGATCACAACATTAGACTTGCTTT AGGCCAAACAGTGAAGGCTATTGAAGGCGATGGTAAGGTAGAAAGGTT GATTACAGACAAGGAGTCTTTCGATGTTGACATGGTCATTTTAGCAGTA GGATTTAGACCAAACACTGCTTTGGCAGATGGGAAAATTGAATTGTTTA GAAATGGTGCTTTTCTGGTGGATAAGAAACAAGAAACTTCAATACCCGA TGTTTATGCAGTTGGTGATTGTGCAACAGTCTATGATAATGCCAGAAAG GATACTTCCTACATAGCATTGGCATCTAATGCAGTTAGAACGGGCATTG TTGGTGCTTATAATGCCTGTGGTCATGAATTGGAGGGCATTGGTGTCC AAGGTTCTAATGGTATATCGATTTATGGCCTTCATATGGTTAGTACCGG ATTGACTCTGGAGAAGGCCAAAGCTGCTGGATACAATGCGACAGAAAC AGGTTTCAACGATTTACAGAAGCCAGAGTTTATGAAACACGACAACCAT GAAGTAGCGATCAAAATCGTATTTGACAAGGATTCTCGTGAAATTCTAG GGGCACAAATGGTTTCACACGATATAGCGATAAGTATGGGCATCCATA TGTTCTCTCTAGCGATTCAAGAACATGTTACCATAGATAAATTAGCATTA ACCGATCTATTCTTCTTGCCTCATTTCAACAAACCTTACAATTACATCAC GATGGCAGCTTTGACCGCCGAAAAGTAA SEQ ID N° 24 (= aminoácido NOXE.Spn)

[000424] MSKIVVVGANHAGTACINTMLDNFGNENEIVVFDQNSNI SFLGCGMALWIGEQIDGAEGLFYSDKEKLEAKGAKVYMNSPVLSIDYDNK VVTAEVEGKEHKESYEKLIFATGSTPILPPIEGVEIVKGNREFKATLENVQF VKLYQNAEEVINKLSDKSQHLDRIAVVGGGYIGVELAEAFERLGKEVVLVDI VDTVLNGYYDKDFTQMMAKNLEDHNIRLALGQTVKAIEGDGKVERLITDKE SFDVDMVILAVGFRPNTALADGKIELFRNGAFLVDKKQETSIPDVYAVGDC ATVYDNARKDTSYIALASNAVRTGIVGAYNACGHELEGIGVQGSNGISIYGL HMVSTGLTLEKAKAAGYNATETGFNDLQKPEFMKHDNHEVAIKIVFDKDS REILGAQMVSHDIAISMGIHMFSLAIQEHVTIDKLALTDLFFLPHFNKPYNYIT MAALTAEK SEQ ID N° 25 (= ADN NOXE.Ef)

[000425] ATGTCTGTGGTTGTCGTAGGCTGTACACATGCTGGTA CTAGTGCAGTGAAATCTATCCTAGCTAATCATCCCGAAGCTGAAGTCAC TGTTTATGAACGTAATGACAACATATCCTTCTTGTCTTGTGGAATTGCAC TTTATGTTGGAGGTGTAGTTAAGAATGCTGCCGACTTATTTTACAGCAA TCCTGAGGAATTAGCCAGTTTAGGAGCCACTGTGAAAATGGAACACAA CGTAGAAGAGATCAATGTCGATGATAAGACAGTTACGGCAAAGAATCT ACAAACAGGTGCAACAGAAACCGTATCCTACGATAAGTTGGTCATGAC TACTGGAAGTTGGCCTATAATTCCACCAATACCCGGAATTGATGCTGAG AACATTCTACTTTGCAAGAATTATTCTCAAGCGAATGTCATTATCGAAAA GGCCAAAGATGCGAAAAGAGTCGTTGTCGTTGGTGGTGGCTATATTGG TATAGAGTTAGTTGAAGCTTTTGTTGAAAGCGGTAAACAGGTGACCCTA GTTGATGGTCTAGACAGGATTTTGAACAAGTATTTGGACAAACCGTTTA CTGATGTTTTAGAAAAGGAGTTAGTTGATAGAGGTGTGAACTTAGCCTT AGGTGAAAATGTCCAACAGTTTGTAGCTGATGAACAGGGAAAAGTTGC AAAAGTTATCACTCCATCTCAAGAATTCGAAGCAGACATGGTCATAATG TGTGTTGGCTTTAGACCAAATACCGAACTTTTGAAAGACAAAGTTGATA TGTTGCCTAACGGTGCAATTGAGGTTAACGAGTATATGCAAACGTCCAA TCCAGATATCTTTGCTGCTGGTGATTCAGCCGTAGTGCATTACAACCCA TCGCAAACGAAGAATTATATTCCCTTAGCGACTAATGCAGTAAGACAGG GTATGTTGGTGGGGAGAAACTTGACAGAACAGAAACTTGCCTATAGAG GCACCCAAGGTACGTCTGGCTTGTACTTGTTCGGTTGGAAAATTGGCT CAACAGGAGTAACCAAAGAATCGGCAAAATTGAATGGGTTAGATGTTG AAGCTACAGTCTTTGAGGATAACTATAGACCTGAATTCATGCCAACAAC CGAAAAGGTGCTGATGGAGCTGGTGTACGAAAAGGGGACTCAAAGGA TAGTAGGTGGGCAATTGATGTCCAAATACGATATCACTCAATCAGCGAA TACACTTTCATTGGCTGTACAGAACAAAATGACCGTTGAAGATCTGGCT ATTTCAGACTTCTTCTTTCAACCGCACTTTGACCGTCCTTGGAATTACTT AAATTTGCTAGCCCAAGCAGCTCTGGAGAACATGTAA SEQ ID N° 26 (= aminoácido NOXE.Ef)

[000426] MSVVVVGCTHAGTSAVKSILANHPEAEVTVYERNDNIS FLSCGIALYVGGVVKNAADLFYSNPEELASLGATVKMEHNVEEINVDDKTV TAKNLQTGATETVSYDKLVMTTGSWPIIPPIPGIDAENILLCKNYSQANVIIE KAKDAKRVVVVGGGYIGIELVEAFVESGKQVTLVDGLDRILNKYLDKPFTD VLEKELVDRGVNLALGENVQQFVADEQGKVAKVITPSQEFEADMVIMCVG FRPNTELLKDKVDMLPNGAIEVNEYMQTSNPDIFAAGDSAVVHYNPSQTK NYIPLATNAVRQGMLVGRNLTEQKLAYRGTQGTSGLYLFGWKIGSTGVTK ESAKLNGLDVEATVFEDNYRPEFMPTTEKVLMELVYEKGTQRIVGGQLMS KYDITQSANTLSLAVQNKMTVEDLAISDFFFQPHFDRPWNYLNLLAQAALE NM SEQ ID N° 27 (= ADN NOXE.Lb)

[000427] ATGTCTAAGGTTACCGTGGTAGGTTGTACACATGCC GGTACTTTTGCAATCAAACAGATTTTGGCAGAACATCCTGATGCAGAAG TAACAGTCTATGAGAGAAATGACGTGATTAGCTTCTTGTCGTGTGGCAT AGCGTTGTACTTGGGTGGGAAAGTTGCTGACCCTCAAGGGCTTTTCTA CTCATCACCAGAAGAGTTACAAAAGCTTGGGGCGAATGTCCAAATGAA CCACAACGTTTTAGCGATAGATCCAGATCAAAAGACTGTTACTGTTGAA GATCTAACGAGTCATGCTCAGACAACAGAATCCTATGACAAGTTAGTCA TGACTTCAGGTTCTTGGCCGATAGTTCCCAAAATACCAGGTATTGACTC CGATAGAGTCAAGCTGTGCAAGAATTGGGCTCATGCACAAGCTTTGAT TGAAGATGCTAAAGAAGCGAAAAGAATTACTGTCATTGGCGCTGGTTAT ATCGGTGCCGAATTGGCCGAAGCGTATTCTACTACAGGTCACGACGTA ACGTTGATAGACGCAATGGATAGAGTAATGCCCAAATACTTTGATGCAG ATTTTACCGATGTCATTGAGCAAGATTATCGTGATCATGGAGTGCAATT AGCCTTGAGTGAAACTGTTGAATCGTTTACAGACAGTGCTACAGGATTG ACCATAAAGACTGACAAGAATAGTTACGAAACAGATCTTGCCATCTTAT GCATTGGCTTTAGACCAAATACGGATCTGCTGAAAGGAAAAGTTGATAT GGCACCAAATGGTGCTATTATTACCGATGACTATATGCGTTCCTCTAAT CCGGACATATTTGCTGCAGGAGACTCTGCTGCAGTTCACTATAACCCT ACACACCAGAATGCATATATCCCACTAGCCACAAATGCTGTGAGACAA GGTATATTAGTAGGCAAGAATTTGGTCAAACCGACCGTTAAATACATGG GTACGCAAAGCTCTTCAGGTCTTGCCCTGTACGATAGGACTATTGTTTC GACCGGCTTAACGCTAGCAGCAGCTAAACAACAGGGTGTTAATGCTGA ACAGGTGATCGTTGAGGACAATTATAGACCTGAGTTTATGCCTTCAACT GAACCCGTGCTAATGAGCTTAGTCTTTGATCCAGATACTCATAGGATCT TAGGAGGAGCTTTGATGTCCAAATACGATGTATCCCAGTCTGCAAACA CCTTGTCTGTGTGTATCCAAAACGAGAATACTATTGATGACTTAGCCAT GGTTGATATGCTTTTCCAACCTAACTTCGATAGACCATTCAACTATCTAA ACATTTTGGCTCAAGCTGCTCAAGCCAAAGTAGCTCAATCAGTAAACGC CTAG SEQ ID N° 28 (= aminoácido NOXE. Lb)

[000428] MSKVTVVGCTHAGTFAIKQILAEHPDAEVTVYERNDVIS FLSCGIALYLGGKVADPQGLFYSSPEELQKLGANVQMNHNVLAIDPDQKT VTVEDLTSHAQTTESYDKLVMTSGSWPIVPKIPGIDSDRVKLCKNWAHAQ ALIEDAKEAKRITVIGAGYIGAELAEAYSTTGHDVTLIDAMDRVMPKYFDAD FTDVIEQDYRDHGVQLALSETVESFTDSATGLTIKTDKNSYETDLAILCIGF RPNTDLLKGKVDMAPNGAIITDDYMRSSNPDIFAAGDSAAVHYNPTHQNA YIPLATNAVRQGILVGKNLVKPTVKYMGTQSSSGLALYDRTIVSTGLTLAAA KQQGVNAEQVIVEDNYRPEFMPSTEPVLMSLVFDPDTHRILGGALMSKYD VSQSANTLSVCIQNENTIDDLAMVDMLFQPNFDRPFNYLNILAQAAQAKVA QSVNA SEQ ID N° 29 (= pENO2)

[000429] CGCTCAGCATCTGCTTCTTCCCAAAGATGAACGCGG CGTTATGTCACTAACGACGTGCACCAACTTGCGGAAAGTGGAATCCCG TTCCAAAACTGGCATCCACTAATTGATACATCTACACACCGCACGCCTT TTTTCTGAAGCCCACTTTCGTGGACTTTGCCATATGCAAAATTCATGAA GTGTGATACCAAGTCAGCATACACCTCACTAGGGTAGTTTCTTTGGTTG TATTGATCATTTGGTTCATCGTGGTTCATTAATTTTTTTTCTCCATTGCTT TCTGGCTTTGATCTTACTATCATTTGGATTTTTGTCGAAGGTTGTAGAAT TGTATGTGACAAGTGGCACCAAGCATATATAAAAAAAAAAAGCATTATC TTCCTACCAGAGTTGATTGTTAAAAACGTATTTATAGCAAACGCAATTGT AATTAATTCTTATTTTGTATCTTTTCTTCCCTTGTCTCAATCTTTTATTTTT ATTTTATTTTTCTTTTCTTAGTTTCTTTCATAACACCAAGCAACTAATACT ATAACATACAATAATA SEQ ID N° 30 (= pTEF2.Kl)

[000430] CTCTCTCGCAATAACAATGAACACTGGGTCAATCATA GCCTACACAGGTGAACAGAGTAGCGTTTATACAGGGTTTATACGGTGA TTCCTACGGCAAAAATTTTTCATTTCTAAAAAAAAAAAGAAAAATTTTTCT TTCCAACGCTAGAAGGAAAAGAAAAATCTAATTAAATTGATTTGGTGATT TTCTGAGAGTTCCCTTTTTCATATATCGAATTTTGAATATAAAAGGAGAT CGAAAAAATTTTTCTATTCAATCTGTTTTCTGGTTTTATTTGATAGTTTTT TTGTGTATTATTATTATGGATTAGTACTGGTTTATATGGGTTTTTCTGTAT AACTTCTTTTTATTTTAGTTTGTTTAATCTTATTTTGAGTTACATTATAGTT CCCTAACTGCAAGAGAAGTAACATTAAAA SEQ ID N° 31 (= pTEF3)

[000431] GGCTGATAATAGCGTATAAACAATGCATACTTTGTAC GTTCAAAATACAATGCAGTAGATATATTTATGCATATTACATATAATACA TATCACATAGGAAGCAACAGGCGCGTTGGACTTTTAATTTTCGAGGAC CGCGAATCCTTACATCACACCCAATCCCCCACAAGTGATCCCCCACAC ACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCT CGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCAT ACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACT AAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTC GAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTTT TTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATA AACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACA ACTTTTTTTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTA AGTTTTAATTACAAA SEQ ID N° 32 (= pADH1)

[000432] GGGTGTACAATATGGACTTCCTCTTTTCTGGCAACCA AACCCATACATCGGGATTCCTATAATACCTTCGTTGGTCTCCCTAACAT GTAGGTGGCGGAGGGGAGATATACAATAGAACAGATACCAGACAAGA CATAATGGGCTAAACAAGACTACACCAATTACACTGCCTCATTGATGGT GGTACATAACGAACTAATACTGTAGCCCTAGACTTGATAGCCATCATCA TATCGAAGTTTCACTACCCTTTTTCCATTTGCCATCTATTGAAGTAATAA TAGGCGCATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCTCTCTCCCCCGTT GTTGTCTCACCATATCCGCAATGACAAAAAAATGATGGAAGACACTAAA GGAAAAAATTAACGACAAAGACAGCACCAACAGATGTCGTTGTTCCAG AGCTGATGAGGGGTATCTCGAAGCACACGAAACTTTTTCCTTCCTTCAT TCACGCACACTACTCTCTAATGAGCAACGGTATACGGCCTTCCTTCCA GTTACTTGAATTTGAAATAAAAAAAAGTTTGCTGTCTTGCTATCAAGTAT AAATAGACCTGCAATTATTAATCTTTTGTTTCCTCGTCATTGTTCTCGTT CCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAG CATACAATCAACTATCTCATATACA SEQ ID N° 33 (= pGPM1)

[000433] GCCAAACTTTTCGGTTAACACATGCAGTGATGCACGC GCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATATATATATATATATATA TAGCCATAGTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGA AAGATACTAGCGCGCGCACCCACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAG AAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTTCCGTTCCCTGCCAG CTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATCC ACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAAC AATGGTAACGAGTTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTCTCAACTTT TAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGGGTTTGTTATATAACAAAGAAGAA ATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAATTCTGTTGT AATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAA ACAAACACACATATTACAATA SEQ ID N° 34 (= pFBA1)

[000434] ACGCAAGCCCTAAGAAATGAATAACAATACTGACAGT ACTAAATAATTGCCTACTTGGCTTCACATACGTTGCATACGTCGATATA GATAATAATGATAATGACAGCAGGATTATCGTAATACGTAATAGTTGAA AATCTCAAAAATGTGTGGGTCATTACGTAAATAATGATAGGAATGGGAT TCTTCTATTTTTCCTTTTTCCATTCTAGCAGCCGTCGGGAAAACGTGGC ATCCTCTCTTTCGGGCTCAATTGGAGTCACGCTGCCGTGAGCATCCTC TCTTTCCATATCTAACAACTGAGCACGTAACCAATGGAAAAGCATGAGC TTAGCGTTGCTCCAAAAAAGTATTGGATGGTTAATACCATTTGTCTGTT CTCTTCTGACTTTGACTCCTCAAAAAAAAAAAATCTACAATCAACAGATC GCTTCAATTACGCCCTCACAAAAACTTTTTTCCTTCTTCTTCGCCCACGT TAAATTTTATCCCTCATGTTGTCTAACGGATTTCTGCACTTGATTTATTA TAAAAAGACAAAGACATAATACTTCTCTATCAATTTCAGTTATTGTTCTT CCTTGCGTTATTCTTCTGTTCTTCTTTTTCTTTTGTCATATATAACCATAA CCAAGTAATACATATTCAAA SEQ ID N° 35 (= pPDC1)

[000435] TTATTTACCTATCTCTAAACTTCAACACCTTATATCAT AACTAATATTTCTTGAGATAAGCACACTGCACCCATACCTTCCTTAAAAA CGTAGCTTCCAGTTTTTGGTGGTTCCGGCTTCCTTCCCGATTCCGCCC GCTAAACGCATATTTTTGTTGCCTGGTGGCATTTGCAAAATGCATAACC TATGCATTTAAAAGATTATGTATGCTCTTCTGACTTTTCGTGTGATGAGG CTCGTGGAAAAAATGAATAATTTATGAATTTGAGAACAATTTTGTGTTGT TACGGTATTTTACTATGGAATAATCAATCAATTGAGGATTTTATGCAAAT ATCGTTTGAATATTTTTCCGACCCTTTGAGTACTTTTCTTCATAATTGCA TAATATTGTCCGCTGCCCCTTTTTCTGTTAGACGGTGTCTTGATCTACTT GCTATCGTTCAACACCACCTTATTTTCTAACTATTTTTTTTTTAGCTCATT TGAATCAGCTTATGGTGATGGCACATTTTTGCATAAACCTAGCTGTCCT CGTTGAACATAGGAAAAAAAAATATATAAACAAGGCTCTTTCACTCTCC TTGCAATCAGATTTGGGTTTGTTCCCTTTATTTTCATATTTCTTGTCATAT TCCTTTCTCAATTATTATTTTCTACTCATAACCTCACGCAAAATAACACA GTCAAATCAATCAAA SEQ ID N° 36 (= pPGK1)

[000436] GTGAGTAAGGAAAGAGTGAGGAACTATCGCATACCT GCATTTAAAGATGCCGATTTGGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTCACC CTCATACTATTATCAGGGCCAGAAAAAGGAAGTGTTTCCCTCCTTCTTG AATTGATGTTACCCTCATAAAGCACGTGGCCTCTTATCGAGAAAGAAAT TACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCC AGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCG TCACACAACAAGGTCCTAGCGACGGCTCACAGGTTTTGTAACAAGCAA TCGAAGGTTCTGGAATGGCGGGAAAGGGTTTAGTACCACATGCTATGA TGCCCACTGTGATCTCCAGAGCAAAGTTCGTTCGATCGTACTGTTACTC TCTCTCTTTCAAACAGAATTGTCCGAATCGTGTGACAACAACAGCCTGT TCTCACACACTCTTTTCTTCTAACCAAGGGGGTGGTTTAGTTTAGTAGA ACCTCGTGAAACTTACATTTACATATATATAAACTTGCATAAATTGGTCA ATGCAAGAAATACATATTTGGTCTTTTCTAATTCGTAGTTTTTCAAGTTC TTAGATGCTTTCTTTTTCTCTTTTTTACAGATCATCAAGGAAGTAATTATC TACTTTTTACAACAAATATAAAACA SEQ ID N° 37 (= pRPLA1)

[000437] TCAAGTTGGATACTGATCTGATCTCTCCGCCCTACTA CCAGGGACCCTCATGATTACCGCTCGAATGCGACGTTTCCTGCCTCAT AAAACTGGCTTGAAAATATTTATTCGCTGAACAGTAGCCTAGCTTATAA AAATTTCATTTAATTAATGTAATATGAAAACTCACATGCCTTCTGTTTCTA AAATTGTCACAGCAAGAAATAACATTACCATACGTGATCTTATTAAACTC TAGTATCTTGTCTAATACTTCATTTAAAAGAAGCCTTAACCCTGTAGCCT CATCTATGTCTGCTACATATCGTGAGGTACGAATATCGTAAGATGATAC CACGCAACTTTGTAATGATTTTTTTTTTTTCATTTTTTAAAGAATGCCTTT ACATGGTATTTGAAAAAAATATCTTTATAAAGTTTGCGATCTCTTCTGTT CTGAATAATTTTTAGTAAAAGAAATCAAAAGAATAAAGAAATAGTCCGCT TTGTCCAATACAACAGCTTAAACCGATTATCTCTAAAATAACAAGAAGAA SEQ ID N° 38 (= pTEF1)

[000438] GTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACcCGgcca GCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCA GCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATC CCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCG AAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACG CTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGA GAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTT CCTTTTAAAATCTTGCTACGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAA ACAACC SEQ ID N° 39 (= pTDH3)

[000439] CTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGG GTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTC CTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAG AAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCA GTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAA ACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTG GAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCAT TTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTG AAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTA ATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTT CTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAA ACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAA SEQ ID N° 40 (= tTHD2)

[000440] CTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGG GTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTC CTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAG AAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCA GTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAA ACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTG GAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCAT TTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTG AAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTA ATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTT CTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAA ACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAA SEQ ID N° 41 (= tCYC1)

[000441] ACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAG TTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGA AAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTT TAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTT TTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTT GCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTTCG CAGTTTACACTCTCATC SEQ ID N° 42 (= tTDH3)

[000442] GTGAATTTACTTTAAATCTTGCATTTAAATAAATTTTCT TTTTATAGCTTTATGACTTAGTTTCAATTTATATACTATTTTAATGACATT TTCGATTCATTGATTGAAAGCTTTGTGTTTTTTCTTGATGCGCTATTGCA TTGTTCTTGTCTTTTTCGCCACATGTAATATCTGTAGTAGATACCTGATA CATTGTGGATGCTGAGTGAAATTTTAGTTAATAATGGAGGCGCTCTTAA TAATTTTGGGGATATTGGCTTTTTTTTTTAAAGTTTACAAATGAATTTTTT CCGCCAGGAT SEQ ID N° 43 (= tADH1)

[000443] ACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGA ATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAA GTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTA TTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGC ATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGCATGCCGAGCAAAT GCCTGCAAATCGCTCCCCATTTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCA GCAATGAGTTGAtGAATCTCGGTGTGTATTTTATGTCCTCAGAgGACAAC ACCTGTTGTAATCGTTCTTCCA SEQ ID N° 44 (= tTPI1)

[000444] GATTAATATAATTATATAAAAATATTATCTTCTTTTCTT TATATCTAGTGTTATGTAAAATAAATTGATGACTACGGAAAGCTTTTTTA TATTGTTTCTTTTTCATTCTGAGCCACTTAAATTTCGTGAATGTTCTTGTA AGGGACGGTAGATTTACAAGTGATACAACAAAAAGCAAGGCGCTTTTT CTAATAAAAAGAAGAAAAGCATTTAACAATTGAACACCTCTATATCAACG AAGAATATTACTTTGTCTCTAAATCCTTGTAAAATGTGTACGATCTCTAT ATGGGTTACTC SEQ ID N° 45 (= tMET25)

[000445] GTGTGCGTAATGAGTTGTAAAATTATGTATAAACCTA CTTTCTCTCACAAGTACTATACTTTTATAAAACGAACTTTATTGAAATGA ATATCCTTTTTTTCCCTTGTTACATGTCGTGACTCGTACTTTGAACCTAA ATTGTTCTAACATCAAAGAACAGTGTTAATTCGCAGTCGAGAAGAAAAA TATGGTGAACAAGACTCATCTACTTCATGAGACTACTTTACGCCTCCTA TAAAGCTGTCACACTGGATAAATTTATTGTAGGACCAAGTTACAAAAGA GGATGATGGAGGTTT SEQ ID N° 46 (= tENO2)

[000446] GGATCCTAAAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTT TTCTGCTTATTTTTTCATCATAGTTTAGAACACTTTATATTAACGAATAGT TTATGAATCTATTTAGGTTTAAAAATTGATACAGTTTTATAAGTTACTTTT TCAAAGACTCGTGCTGTCTATTGCATAATGCACTGGAAGGGGAAAAAA AAGGTGCACACGCGTGGCTTTTTCTTGAATTTGCAGTTTGAAAAATAAC TACATGGATGATAAGAAAACATGGAGTACAGTCACTTTGAGAACCTTCA ATCAGCTGGTAACGTCTTC SEQ ID N° 47 (= tMET3)

[000447] TCGTCATAAAATGCTCCCATCTCAAAAGTAGGGCAAA ATTCATGATCGACCGCGCAAAATAAATAGATTTGCAAATAAGTTTTGTAT GTACATTTATTAATATATATAATATATCAAAAGAAAAAAATCAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAATTGCACTCTTATTCAGTCATCAATTACAAAACCTAGAG ATAGCGATGGTGCATATTCAATAAAAAACTCCTTATACTGTCGAGAAAG CTTATTATTGGTACTTCTCGAAGATACTAAAAAAGGTTAATTTTTGGAGA CGGAGGCAATAGC SEQ ID N° 48 (= tPGK1)

[000448] ATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCT TTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTG AATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGA TTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTAT GCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTT TAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGG ATATTATTTA SEQ ID N° 49 (= pPYK1)

[000449] AAAAGGAAAGATTATTGAAAGAGAAAGAAAGAAAAAA AAAAAATGTACACCCAGACATCGGGCTTCCACAATTTCGGCTCTATTGT TTTCCATCTCTCGCAACGGCGGGATTCCTCTATGGCGTGTGATGTCTG TATCTGTTACTTAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCACGT GGGTCGTTTTGCCATCGACAGATTGGGAGATTTTCATAGTAGAATTCAG CATGATAGCTACGTAAATGTGTTCCGCACCGTCACAAAGTGTTTTCTAC TGTTCTTTCTTCTTTCGTTCATTCAGTTGAGTTGAGTGAGTGCTTTGTTC AATGGATCTTAGCTAAAATGCATATTTTTTCTCTTGGTAAATGAATGCTT GTGATGTCTTCCAAGTGATTTCCTTTCCTTCCCATATGATGCTAGGTAC CTTTAGTGTCTTCCTAAAAAAAAAAAAAGGCTCGCCATCAAAACGATAT TCGTTGGCTTTTTTTTCTGAATTATAAATACTCTTTGGTAACTTTTCATTT CCAAGAACCTCTTTTTTCCAGTTATATCATGGTCCCCTTTCAAAGTTATT CTCTACTCTTTTTCATATTCATTCTTTTTCATCCTTTGGTTTTTTATTCTTA ACTTGTTTATTATTCTCTCTTGTTTCTATTTACAAGACACCAATCAAAACA AATAAAACATCATCACA SEQ ID N° 50 (= pTPI1)

[000450] ATTTAAACTGTGAGGACCTTAATACATTCAGACACTT CTGCGGTATCACCCTACTTATTCCCTTCGAGATTATATCTAGGAACCCA TCAGGTTGGTGGAAGATTACCCGTTCTAAGACTTTTCAGCTTCCTCTAT TGATGTTACACCTGGACACCCCTTTTCTGGCATCCAGTTTTTAATCTTC AGTGGCATGTGAGATTCTCCGAAATTAATTAAAGCAATCACACAATTCT CTCGGATACCACCTCGGTTGAAACTGACAGGTGGTTTGTTACGCATGC TAATGCAAAGGAGCCTATATACCTTTGGCTCGGCTGCTGTAACAGGGA ATATAAAGGGCAGCATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAACATTTAC TATTTTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTTTTAATTCTAAATCAATCTTT TTCAATTTTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAA ACACATACATAAACTAAAA SEQ ID N° 51 (= tDIT1)

[000451] TAAAGTAAGAGCGCTACATTGGTCTACCTTTTTGTTC TTTTACTTAAACATTAGTTAGTTCGTTTTCTTTTTCTCATTTTTTTATGTTT CCCCCCCAAAGTTCTGATTTTATAATATTTTATTTCACACAATTCCATTTA ACAGAGGGGGAATAGATTCTTTAGCTTAGAAAATTAGTGATCAATATAT ATTTGCCTTTCTTTTCATCTTTTCAGTGATATTAATGGTTTCGAGACACT GCAATGGCCCTAGTTGTCTAAGAGGATAGATGTTACTGTCAAAGATGAT ATTTTGAATTTC SEQ ID N° 52 (= loxP)

[000452] ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA SEQ ID N° 53 (= ácido nucleico HAA-1)

[000453] ATGGTCTTGATAAATGGCATAAAGTATGCCTGTGAGA GGTGCATAAGAGGCCATAGAGTAACAACATGCAATCATACAGATCAAC CGCTTATGATGATCAAACCCAAAGGTAGACCTTCCACTACATGCGACTA TTGTAAACAACTTCGAAAAAACAAGAATGCAAATCCTGAAGGTGTTTGC ACGTGTGGCCGGCTAGAGAAGAAAAAACTGGCACAGAAAGCCAAAGA AGAAGCAAGAGCTAAAGCCAAAGAAAAACAAAGAAAACAGTGTACCTG CGGGACTGATGAGGTTTGCAAATATCATGCTCAAAAGAGACATCTAAG AAAGTCCCCTTCAAGTTCTCAAAAGAAAGGAAGATCCATTTCTCGTTCT CAACCAATGTTTGAAAGGGTATTGTCTTCTACTTCACTTGACAGCAATA TGTTATCCGGCCACGGAGCACTATCAGATACCTCTAGCATACTGACGA GCACATTTTTAGACAGTGAGCCGGGTGTTGGTAAAATTTCAAAAGATTA CCATCATGTCCCTTCATTGGCCTCCATTTCATCCTTACAATCCTCGCAA TCGTTAGATCAAAATTTCAGTATACCACAAAGCCCGCCGTTATCTTCAA TGTCATTTAATTTTCTCACGGGAAATATCAATGAAACCAACCAAAATCAC AGTAATCATCAGCATTCAAAATCAGGCAATAACTGGCAAGATAGTTCGG TAAGCTTGCCAGCGAAAGCTGATTCACGTCTTAACATGATGGATAAAAA CAACTCTGTGGGTCTTGACCTATTAGGCCATTCAAAACGAATATCGCCG ATATCAAACTCTCGTGTGGGCGAAGTTAGCGTTCCGCTAGAAGAATATA TTCCTTCTGACATTGATGGGGTTGGAAGAGTTACTGATAAAAGCTCTTT GGTCTACGATTGGCCATTTGATGAAAGTATTGAGAGAAATTTCAGTACA ACCGCAACCGCTGCAACTGGTGAAAGTAAGTTCGACATTAACGACAAC TGTAATAGAATTAATAGCAAAAGTTATAGTAAGACTAATAGTATGAATGG AAACGGTATGAACAATAGCAATAATAATAATATCAACAGTAATGGCAAC GACAAGAACAATAACAACTCTTCTAGACAAGAACATCAAGGAAATGGAC TATTTGACATGTTTACAGATTCATCGTCGATTTCAACGCTTTCCCGTGC AAACTTATTATTGCAAGAAAAAATTGGTTCGCAAGAAAACTCTGTCAAA CAAGAAAACTATTCGAAAAATCCTCAACTTCGTCATCAATTAACTTCCAG AAGTAGATCATTTATTCATCATCCGGCAAACGAGTATTTGAAGAATACTT TTGGAAATTCACATAGTAATGACATCGGAAAGGGAGTTGAAGTGCTATC TTTGACACCGAGTTTTATGGATATTCCCGAAAAAGAAAGAGAAACGGAA AGATCGCCATCATCCAATTACATTACTGACAGACCTTTCACTCGAAAAC CTAGATCTTCTAGCATTGACGTAAACCATAGGTATCCACCTATGGCACC AACAACCGTAGCGACATCTCCCGGTGCATTGAACAATGCCGTAGCAAG CAATCTCGACGATCAACTGAGTTTAACATCACTAAACTCTCAGCCATCA TCGATAGCAAATATGATGATGGACCCTTCAAACCTAGCTGAGCAAAGTT CTATTCATTCAGTTCCTCAGTCAATAAACTCTCCGAGAATGCCTAAAAC TGGAAGTCGCCAAGACAAGAACATTCACACTAAGAAGGAAGAAAGAAA TCCGCTAAATAACATACACGATCTGTCACAATTGGAAAATGTACCAGAC GAGATGAACCAAATGTTCTCCCCACCATTAAAAAGTATGAATAGACCGG ATGCCATAAGGGAAAATTCATCTAGTAGTAATTTCATAATCCAAGGAAA TAGCATGATCTCTACGCCTTCCGGAAGGAATGACCTTCCAGATACCTCT CCAATGAGTAGTATTCAAACAGCGTCACCACCAAGTCAATTACTGACCG ATCAAGGATTTGCGGATTTGGATAATTTCATGTCTTCGTTATGA SEQ ID N° 54 (= aminoácido HAA-1)

[000454] MVLINGIKYACERCIRGHRVTTCNHTDQPLMMIKPKGR PSTTCDYCKQLRKNKNANPEGVCTCGRLEKKKLAQKAKEEARAKAKEKQ RKQCTCGTDEVCKYHAQKRHLRKSPSSSQKKGRSISRSQPMFERVLSST SLDSNMLSGHGALSDTSSILTSTFLDSEPGVGKISKDYHHVPSLASISSLQS SQSLDQNFSIPQSPPLSSMSFNFLTGNINETNQNHSNHQHSKSGNNWQD SSVSLPAKADSRLNMMDKNNSVGLDLLGHSKRISPISNSRVGEVSVPLEE YIPSDIDGVGRVTDKSSLVYDWPFDESIERNFSTTATAATGESKFDINDNC NRINSKSYSKTNSMNGNGMNNSNNNNINSNGNDKNNNNSSRQEHQGNG LFDMFTDSSSISTLSRANLLLQEKIGSQENSVKQENYSKNPQLRHQLTSRS RSFIHHPANEYLKNTFGNSHSNDIGKGVEVLSLTPSFMDIPEKERETERSP SSNYITDRPFTRKPRSSSIDVNHRYPPMAPTTVATSPGALNNAVASNLDD QLSLTSLNSQPSSIANMMMDPSNLAEQSSIHSVPQSINSPRMPKTGSRQD KNIHTKKEERNPLNNIHDLSQLENVPDEMNQMFSPPLKSMNRPDAIRENS SSSNFIIQGNSMISTPSGRNDLPDTSPMSSIQTASPPSQLLTDQGFADLDN FMSSL SEQ ID N° 55 (= ácidos nucleicos LEU2. KL)

[000455] ATGTCTAAGAATATCGTTGTCCTACCGGGTGATCACG TCGGTAAAGAAGTTACTGACGAAGCTATTAAGGTCTTGAATGCCATTGC TGAAGTCCGTCCAGAAATTAAGTTCAATTTCCAACATCACTTGATCGGG GGTGCTGCCATCGATGCCACTGGCACTCCTTTACCAGATGAAGCTCTA GAAGCCTCTAAGAAAGCCGATGCTGTCTTACTAGGTGCTGTTGGTGGT CCAAAATGGGGTACGGGCGCAGTTAGACCAGAACAAGGTCTATTGAAG ATCAGAAAGGAATTGGGTCTATACGCCAACTTGAGACCATGTAACTTTG CTTCTGATTCTTTACTAGATCTTTCTCCTTTGAAGCCTGAATATGCAAAG GGTACCGATTTCGTCGTCGTTAGAGAATTGGTTGGTGGTATCTACTTTG GTGAAAGAAAAGAAGATGAAGGTGACGGAGTTGCTTGGGACTCTGAGA AATACAGTGTTCCTGAAGTTCAAAGAATTACAAGAATGGCTGCTTTCTT GGCATTGCAACAAAACCCACCATTACCAATCTGGTCTCTTGACAAGGCT AACGTGCTTGCCTCTTCCAGATTGTGGAGAAAGACTGTTGAAGAAACC ATCAAGACTGAGTTCCCACAATTAACTGTTCAGCACCAATTGATCGACT CTGCTGCTATGATTTTGGTTAAATCACCAACTAAGCTAAACGGTGTTGT TATTACCAACAACATGTTTGGTGATATTATCTCCGATGAAGCCTCTGTTA TTCCAGGTTCTTTGGGTTTATTACCTTCTGCATCTCTAGCTTCCCTACCT GACACTAACAAGGCATTCGGTTTGTACGAACCATGTCATGGTTCTGCC CCAGATTTACCAGCAAACAAGGTTAACCCAATTGCTACCATCTTATCTG CAGCTATGATGTTGAAGTTATCCTTGGATTTGGTTGAAGAAGGTAGGG CTCTTGAAGAAGCTGTTAGAAATGTCTTGGATGCAGGTGTCAGAACCG GTGACCTTGGTGGTTCTAACTCTACCACTGAGGTTGGCGATGCTATCG CCAAGGCTGTCAAGGAAATCTTGGCTTAA SEQ ID N° 56 (= aminoácido LEU2. KL)

[000456] MSKNIVVLPGDHVGKEVTDEAIKVLNAIAEVRPEIKFNFQ HHLIGGAAIDATGTPLPDEALEASKKADAVLLGAVGGPKWGTGAVRPEQG LLKIRKELGLYANLRPCNFASDSLLDLSPLKPEYAKGTDFVVVRELVGGIYF GERKEDEGDGVAWDSEKYSVPEVQRITRMAAFLALQQNPPLPIWSLDKA NVLASSRLWRKTVEETIKTEFPQLTVQHQLIDSAAMILVKSPTKLNGVVITN NMFGDIISDEASVIPGSLGLLPSASLASLPDTNKAFGLYEPCHGSAPDLPAN KVNPIATILSAAMMLKLSLDLVEEGRALEEAVRNVLDAGVRTGDLGGSNST TEVGDAIAKAVKEILA.

Claims (8)

1. Levedura recombinante produtora de 2,3-butanodiol possuindo uma atividade de piruvato descarboxilase reduzida em comparação com a levedura tipo selvagem caracterizada pelo fato de que em seu genoma foi inserido: - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato sintase (ALS) tendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consisitindo nas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3 e 5, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 e 6, - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma acetolactato descarboxilase (ALD) tendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 7, 9 e 11, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 10 e 12, - um ou mais ácidos nucleicos codificando uma butanodiol desidrogenase (BDH), tendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 13, 15, 17 e 19, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16, 18 e 20, e - duas a cinco cópias de ácidos nucleicos codificando uma NADH oxidase (NOXE) tendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo nas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 21, 23, 25 e 27, e sequências degeneradas das mesmas, que codificam uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 24, 26 e 28, dita atividade de piruvato descarboxilase é reduzida por (i) interrupção de pelo menos um gene que codifica uma piruvato descarboxilase pela inserção no referido pelo menos um gene que codifica uma piruvato descarboxilase pelo menos um construto de DNA exógeno, (ii) mutações em regiões reguladoras, (iii) mutações em um códon inicial, notavelmente por substituição de AUG por GUG, (iv) mutações nas sequências codificadoras que alteram a atividade enzimática; (v) mutações, inserções ou deleções na sequência codificadora que alteram a estabilidade da proteína ou (vi) mutações que alteram a meia-vida do mRNA da piruvato descarboxilase.

2. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada um dos ácidos nucleicos codificando acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, butanodiol desidrogenase e NADH oxidase está sob controle de um terminador de transcrição, idêntico ou diferente, ditos terminadores de transcrição sendo representados por uma sequência de ácido nucleico selecionado a partir do grupo consistindo em sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40 a 48.

3. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a levedura recombinante pertence ao gênero Saccharomyces, e preferencialmente à espécie Saccharomyces cerevisiae.

4. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção de pelo menos dois genes pdc, preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo de pdc1, pdc5, pdc6 e uma combinação destes, e, mais particularmente, a partir do grupo consistindo em pdc1 e pdc6.

5. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que quando a levedura recombinante pertence à espécie Saccharomyces cerevisiae, então a atividade de piruvato descarboxilase é reduzida pela interrupção dos genes pdc1 e pdc6, e adicionalmente pela atenuação do gene pdc5.

6. Uso de uma levedura recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para a produção de 2,3-butanodiol (BDO) e/ou derivados diretos destes, particularmente, ditos derivados diretos de 2,3-butanodiol (BDO) sendo selecionados a partir do grupo consistindo em butano-dieno (BDE), Metil- Etil-Cetona (MEK) ou uma mistura destes.

7. Método para produzir 2,3-butanodiol (BDO), dito método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar uma levedura recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em um meio de cultura apropriado; e (b) recuperar o 2,3-butanodiol (BDO).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito meio de cultura compreende uma fonte de carbono, preferencialmente selecionado em um grupo compreendendo glicose e sacarose.