生產高產量2,3-丁二醇之方法
本發明係有關於一種生產高產量2,3-丁二醇之方法,尤指涉及一種以基因重組、基因剔除及同時轉殖多個基因表現質體方式建構能夠高產量生產2,3-丁二醇之大腸桿菌菌株,特別係指菌株具有能夠自行調節利用體內代謝路徑機制可應付外在環境氧氣濃度改變,而持續生產高產量之2,3-丁二醇者。
2,3-丁二醇(2,3-butanediol)係一種重要之化工原料及液態燃料,廣泛應用於化工、醫藥、食品及航空領域。另外亦可藉由後續簡單化學反應,產生許多高價值之衍生化學品。例如2,3-丁二醇常被用於製備樹脂與溶劑等;其燃燒值(27.2 KJ/g)與甲醇(22.1 KJ/g)、乙醇(29.0 KJ/g)相當,為極具潛力汽油添加劑;其具低冷凍點(-60°C)之特性,可當做抗凍劑。2,3-丁二醇經由脫水反應可以生成甲乙酮(methylethyl ketone, MEK),該MEK係一種高價液態燃料添加劑、低沸點化工溶劑,常應用於塗料、黏結劑、及油墨等,同時也是高品質航空燃料;2,3-丁二醇之前驅物乙偶姻(Acetoin)、2,3-丁二酮(Diacetyl),常當作天然食用香料、奶類製品香料來源,使食品有奶油口味;也可抑制細菌生長作為抑菌劑。2,3-丁二醇經縮醛(酮)化反應後可生產Acetone 2,3-butanediol ketal,應用於類似甲基第三丁基醚(methyl tert-butylether, MTBE)之汽油添加劑。2,3-丁二醇經酯化反應後可生產2,3-Butanedioldiester,常應用於醫藥、化粧品之中間體及載體;熱塑性聚酯纖維塑化劑。其中有一最重要之應用是2,3-丁二醇脫水反應可以生成特用化學品1,3-丁二烯(1,3-butandiene),其為一種重要之化工原料,用來製造合成橡膠(如順丁橡膠、氯丁橡膠、丁苯橡膠、丁腈橡膠)、塑膠、樹脂(如ABS、SBS、BS、MBS等)、彈性纖維等合成橡膠工業,在第二次世界大戰期間丁二烯更是被許多國家列為重要開發資源之一。目前工業界主要藉由石油裂解之過程取得丁二烯,初步估計每年有超過1200萬噸之1,3-丁二烯被化工產業用來製造合成橡膠 、塑膠、彈性纖維等物料。 以生物法之方式生產丁二烯,除了因菌種酵素之專一性特質可提升丁二烯產率外,相較於化學法,以生物法來生產1,3-丁二烯亦可具有低碳足跡之優點。目前全球以生物法生產丁二稀之發展上,尚未有商業化量產之進展,技術發展主要分為二種途徑,一是直接應用生物技術建構改造菌種,將原料轉化生成丁二稀之一步直接法,然而,現階段仰賴微生物菌種全程以生物法一步直接生產1,3-丁二烯仍存在著許多技術瓶頸;另一種途徑則是經由其他生物法製程之生質化學品(如乙醇、丁二醇等),接續進行化學法轉化成丁二稀之二步間接法。相較於乙醇,利用2,3-丁二醇化學法轉丁二稀之製程較簡易僅需進行一脫水步驟,產率亦相對較高。丁二烯全球市場龐大,而生物法製程兼具環保與減碳效益,目前二步間接生物法丁二稀製程已進入試量產階段。 以化學法生產2,3-丁二醇之製程方法主要係以石油裂解產生之四碳類碳氫化合物,在高溫高壓反應條件下經水解而得,但化學合成法程式繁複、成本昂貴,商業化目前侷限於生化途徑製法。生物法以微生物發酵生產2,3-丁二醇不但可以克服化學法之困境,同時亦能降低傳統以不可再生之石化資源為原料之依賴,轉為以可再生生物物質為原料之生物精煉製程,符合綠色工業製程低碳經濟之國際趨勢發展方向。 自然界中,很多微生物菌種都能夠以單糖為原料,代謝生產2,3-丁二醇,典型之代謝生成途徑主要經由3個關鍵酵素,乙醯乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)、乙醯乳酸去羧酶(acetolactate decarboxylase, ALDC)、及2,3-丁二醇去氫酶(2,3-butanediol dehydrogenase, 2,3-BDH)或稱為乙偶姻還原酶(acetoin reductase, AR)之作用下,最終轉化生成2,3-丁二醇。生成代謝過程中亦同時伴隨乙酸、乳酸、乙醇、丁二酸、甲酸等副產品之生成。。目前以原生菌種生產化學品2,3-丁二醇且其產量較具有量產規模潛力者,只有包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella
)、腸桿菌屬(Enterobacter)
、芽孢桿菌屬(Bacillus
)及類芽孢桿菌屬(Paenibacillus
)這少數幾屬。其中以Klebsiella
及Enterobacter
菌屬較具有工業化生產潛力,此2菌屬為2,3-丁二醇生產原生菌株中具有產量高及發酵基質利用範圍廣等較多優勢,而且能夠在便宜的基質快速生長,亦能夠利用非糧食纖維料源生產2,3-丁二醇,然而這些菌屬均屬於微生物安全等級2之菌屬,此乃是具有致病性感染風險之微生物菌屬,因此應用在工業生產放大規模量產時有嚴重的環境安全疑慮。 此外,由於2,3-丁二醇化學結構式具有2個掌性中心(chiral centers),因此自然界存在有三種形式之同分異構物(RR、meso及SS isomers),其中RR與SS異構物具有光學活性因此在醫藥原料有高應用價值。一般而言,不同之原生種菌株會生產不同形式2,3-丁二醇異構物,且大部分菌株自身都可以生產二種以上之2,3-丁二醇異構物混合產物,因此若要生產單一純度較高之2,3 -丁二醇光學異構物,則須仰賴基改菌種才能達成。 自然界中可用於發酵生產2,3-丁二醇之菌種多,雖然提供較大之菌種選擇空間,但因為2,3-丁二醇屬於菌株代謝之次級產物,其產量受到一定限制,而代謝生產過程中同時也會產生許多副產品因而降低目標產物及純度。近年利用基因工程編輯技術修改微生物體內基因,或是殖入表現外來基因,此不但可以強化宿主細胞之目標產物生成,並且還能建構擴展宿主菌株之料源利用性。隨著合成生物之技術發展得以生物合成特定產物之代謝途徑,並以大腸桿菌(Escherichia coli
)或酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae
)等這些培養容易、遺傳訊息清楚之非原生2,3-丁二醇生產菌株為宿主細胞,在菌株體內建構人工合成之2,3-丁二醇生產代謝途徑,剔除或強化其中之關鍵酵素,調節代謝途徑相關之輔因子(cofactor)等各種策略,進行高產量2,3-丁二醇生產。 化學品生產菌株之效能攸關生質化學品產業化進程,菌株之效能表現在產物之濃度(Titer, g/L)、生產速率(Rate, g/L/h)、產物生成產率(Yield, g/g)等各方面,產物濃度會影響製程設備及能耗需求,產物生產速率會影響發酵槽設置及商業廠規模,而產品產率則關係生質料源之成本,三個效能指標息息相關,大腸桿菌由於其生長快速、菌株代謝路徑及機制等資訊清楚,培養操作容易等優點,因此普遍被利用為生產生質化學品之宿主菌株,藉由代謝工程與合成生物技術,並依據產業需求得以達到高效能2,3-丁二醇生產菌株建構。 以細胞為主之生物轉換過程常需要經歷大量之複雜反應,並且需要特定輔因子參與,如菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)或菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleoside phosphate, NADPH),其中輔因子之供給不足容易造成代謝過程中氧化還原失衡,連帶影響生物轉化,因此調節氧化還原輔因子之代謝循環,是優化生物轉化代謝工程重要策略之一。過去的研究中曾有為了在反應中得到更多之輔因子NADH以提高2,3-丁二醇產量為目的,而在生產菌株-枯草桿菌(Bacillus subtilis
)中轉殖一基因編碼為udhA
之轉氫酶(transhydrogenase),一方面限制發酵於低溶氧狀態條件以及額外添加還原物質等策略達到菌株最終生產(R,R)-2,3-丁二醇達49 g/L。 常見之非天然2,3-丁二醇生產菌株(如大腸桿菌或酵母菌)之建構策略,係將完整異源性2,3-丁二醇之代謝途徑轉殖於宿主中表現,除了必須表現路徑中之關鍵生成酵素ALS與ALDC以產生2,3-丁二醇之前驅物乙偶姻之外,同時也需表現AR/2,3-BDH,亦有稱之為仲醇脫氫酶(secondary alcohol dehydrogenase, sADH),2,3-BDH此一酵素目的為藉由輔因子(常見使用NADH)協助進行氧化作用將乙偶姻還原生成目標產物2,3-丁二醇。再者,2,3-丁二醇生產係屬發酵代謝途徑,為提高產量,一方面要避免生成發酵代謝其他副產物生成(如乙醇(ethanol)、乳酸(lactate)、琥珀酸(succinate)等),使碳通量(carbon flux)集中往2,3-丁二醇之生成路徑,另一方面要控制生產環境之氧濃度於微好氧狀態(microaerobic)以利菌株生長,同時又能兼顧2,3-丁二醇生產。另外,大腸桿菌在不同氧氣培養條件下,糖解作用與五碳糖代謝路徑之碳通量會產生變化,造成NAD+
/NADH與NADP+
/NADPH濃度比例會因應環境氧氣濃度改變而變化,影響對輔因子具專一選擇性酵素之催化能力,而影響目標產物產量。而在低溶氧狀態下以2,3-丁二醇為唯一發酵產物生產,其中輔因子濃度與反應之氧化還原平衡,將是影響2,3-丁二醇產量之重要限制因子。 目前研究文獻顯示,以代謝工程改質2,3-丁二醇生產菌株皆只有表現偏好單一特定輔因子(NADH或NADPH)酵素之2,3-BDH將乙偶姻還原生成2,3-丁二醇,因此在產量上仍然有進步空間。為了因應菌株在培養生產過程中,能適應環境各種不同氧氣濃度變化,避免輔因子濃度與比例分布發生改變,而影響原本利用代謝途徑之目標物產量。實有必要另外尋求能改善輔因子影響調節代謝之策略方法。故,ㄧ般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。
本發明之主要目的係在於,克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種能在不同氧濃度環境下保有彈性應用菌株自身輔因子以維持良好2,3-丁二醇產量之生產高產量2,3-丁二醇之方法。 本發明之次要目的係在於,提供一種可以避免2,3-丁二醇之前驅物acetoin累積,因此可間接提高2,3-丁二醇產量,且產生純度高之(R,R)-2,3-丁二醇之生產高產量2,3-丁二醇之方法。 本發明之另一目的係在於,提供一種以發酵槽製程批次饋料模式進行生產2,3-丁二醇,發酵製程56小時後,可達92 g/L之2,3-丁二醇高產量生成,此菌株生產2,3-丁二醇之表現優於目前文獻發表中之非天然原生種基改菌株之2,3-丁二醇產量,無論是在2,3-丁二醇之產量或生產速率(productivity)上都是最高產量之生產高產量2,3-丁二醇之方法。 為達以上之目的,本發明係一種生產高產量2,3-丁二醇之方法,係以基因重組、基因剔除及同時轉殖多個基因共同表現能夠利用不同輔因子之最佳化2,3-丁二醇去氫酶代謝基因表現量方式,建構能夠高產量生產2,3-丁二醇之菌株。 於本發明上述實施例中,該菌株為大腸桿菌屬,能以葡萄糖為主要碳源生長,並能發酵葡萄糖轉化生成2,3-丁二醇。 於本發明上述實施例中,該建構之菌株體內能表現生產2,3-丁二醇所需之酵素acetolactate synthase(基因alsS
)、acetolactate decarboxylase(基因alsD
)以及兩個以上2,3-丁二醇去氫酶。 於本發明上述實施例中,該acetolactate synthase基因alsS
係來自於Bacillus subtilis
。 於本發明上述實施例中,該acetolactate decarboxylase基因alsD
係來自於Bacillus subtilis
。 於本發明上述實施例中,該些2,3-丁二醇去氫酶其中之一係為NADH-dependentbudC
,來自於Klebsiella pneumoniae
。 於本發明上述實施例中,該些2,3-丁二醇去氫酶其中之一係為NADPH-dependentadh
,來自於拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii
)。 於本發明上述實施例中,該菌株表現該些2,3-丁二醇去氫酶之方法係同時將兩個以上之2,3-丁二醇去氫酶基因轉殖入菌株。 於本發明上述實施例中,該轉殖入菌株體內之外源基因係先表現於質體後殖入菌株。 於本發明上述實施例中,該葡萄糖來源係選自木質纖維素原料及木質纖維素原料經處理後衍生之糖液。
本發明係一種生產高產量2,3-丁二醇之方法,主要特色係以基因重組、基因剔除及同時轉殖多個基因表現質體方式建構能夠高產量生產2,3-丁二醇之大腸桿菌(Escherichia coli
,E. coli
)菌株。大腸桿菌基改菌株YCW3體內,除了表現生產2,3-丁二醇所需之基因alsS
(乙醯乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS),來源為枯草桿菌(Bacillus subtilis, BS
))及alsD
(乙醯乳酸去羧酶(acetolactate decarboxylase, ALDC),來源為Bacillus subtilis
)外,最重要之技術特徵為共同表現能夠利用不同輔因子(cofactor)NADP及NADPH之2,3-丁二醇去氫酶(acetoin reductase, AR或稱2,3-butanediol dehydrogenase, 2,3-BDH),宿主菌株體內共同轉殖表現NADH-dependentbudC
(來源為克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae
)),以及NADPH-dependentadh
(來源為拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii
))2種酵素,因此使得菌株在生產2,3-丁二醇之過程中,不會因為培養發酵環境之變動而影響產量,菌株能夠彈性化利用體內NADH及NADPH自行調節比例,進而生產高產量2,3-丁二醇。 本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣,將描述於以下內容中,以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。 [實施例一] 建構大腸桿菌E.Coli
-YCW3之2,3-丁二醇生產菌株 表一所示為實驗所使用之菌株及建構之質體,大腸桿菌BW25113品係由野生型設計而來,此品係之基因特徵為(rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78
)。XL-1 Blue品系購買自Stratagene公司,用於保存所有製備實驗所需之質體。菌株JCL16係BW25113經過接合生殖方式(conjugation),傳送帶有lacIq之F’質體。JCL166之製備係經過剔除adhE
、ldhA
以及frdBC
三個基因之菌株,基因剔除方法則是以Keio collection購得之菌株作為捐贈者菌株(donor),藉由λ P1 噬菌體轉殖方法(P1 transduction)經過基因同源互換,則可將宿主之目標基因替換成康黴素(kanamycin)抗生素基因,接著將帶有FLP重組酶(Flp recombinase)之溫度敏感質體(pCP20),以電穿孔方式送入宿主並表現,使之能辨識FRT位置而將kanamycin抗生素基因踢出宿主體外,爾後再將pCP20失活,並以菌落PCR(colony PCR)確認,即完成宿主目標基因基因剔除。 構築質體之方法,主要依據Gibson isothermal DNA assembly方法,將欲進行組裝各基因片段,先經PCR製備、純化、測濃度,再依各片段大小與濃度,計算組裝時各片段所需之體積量,再加入內含外切酶(exonuclease)、聚合酶(polymerase)、及連接酶(ligase)之AMM反應試劑進行反應,組裝好之質體以熱休克方法(heart shock transformation)轉殖於XL-1 strain保存,並進行質體定序確認。 表2所示為實驗所需構築之質體及製備目標基因所需引子(primer),個別質體建構如下說明: pKM5:骨架片段以pPC150(p15A ori, Specr)與引子K3,K4進行PCR獲得;Bs-alsS-alsD基因片段以pZE12-alsS-alsD-BudC為模版與引子K9,K10進行PCR所得。 pKM9:骨架片段以pPC150(p15A ori, Specr)與引子K3,K4進行PCR獲得;Bs-alsS基因片段以pZE12-alsS-alsD-BudC為模版與引子K9,K11進行PCR所得。 pKM11:骨架段以pCS180(pUC ori, Kanr)與引子K5,K6進行PCR獲得;Kp-budC基因片段以pZE12-alsS-alsD-BudC(密碼子優化(codon optimized))為模版與引子K12,K13進行PCR所得。 pKM12:骨架片段以pCS180(pUC ori, Kanr)與引子K5,K6進行PCR獲得;Cb-adh基因片段以pZE12-alsS-alsD-CBADH(codon optimized)為模版與引子K14,K15進行PCR所得。 為了能生產更高2,3-丁二醇產量,於是將表現宿主(JCL166)為原始母株,陸續剔除其他可能的競爭代謝途徑基因,包括了pflB
(pyruvate formate-lyase)與ilvC
(acetohydroxy acid isomeroreductase)而產生新的突變菌株YCW3(ΔadhEΔldhAΔfrdBCΔpflBΔilvC
)。 表一表中縮寫代表基因來源:BS,Bacillus subtilis
;KP,Klebsiella pneumoniae
MGH78578;CB,Clostridium beijerinckii
NRRL B593。 表二[實施例二] 菌株轉殖同時具有NADH及NADPH輔因子依賴性功能之酵素可適應不同氧氣濃度環境下生成2,3-丁二醇 請參閱『第1圖』所示,係本發明在不同氧氣條件對大腸桿菌JCL166表現不同輔因子依賴性之BDH生產2,3-丁二醇之影響示意圖。如圖所示:為了使菌株能適應環境各種不同氧氣濃度,避免輔因子濃度與比例分布發生變化,影響原本利用這些輔因子代謝途徑之目標物產量。為解決上述問題,本發明在大腸桿菌JCL166(ΔadhEΔldhAΔfrdBC
)母株中轉殖內含Bacillus subtilis
來源之酵素acetolactate synthase(ALS)與acetolactate decarboxylase(ALDC)之質體pKM5作為生產2,3-丁二醇前驅物-乙偶姻(Acetoin)所需之酵素,同時亦分別共同轉殖質體pKM11(帶有Klebsiella pneumonias
NADH-dependent BDH, KpBudC),pKM12(帶有Clostridium beijerinkiis
NADPH-dependent BDH, CbAdh)以及pKM9(帶有KpBudC及CbAdh兩者,Combo)共3株菌株,分別於有氧及無氧條件環境下,測試氧氣濃度對於2,3-丁二醇產量之影響。 結果如第1圖所示,圖中(A)係以不同轉殖菌株,在有氧環境條件下,於250 mL搖瓶以20 mL培養液(M9、30 g/L葡萄糖、5 g/L酵母萃出物),培養48小時生產2,3-丁二醇之結果。結果顯示僅表現KpBudC之菌株,主要生產5.6 g/L meso-2,3-丁二醇,同時累積大量之acetoin(3.8 g/L),另一僅表現CbAdh之菌株,其丁二醇產量可達10.5 g/L,其中75%為(R,R)-2,3-丁二醇,25%為meso-2,3-丁二醇,沒有任何acetoin累積,而同時表現NADH-dependent KpBudC及NADPH-dependent CbAdh之菌株(Combo),則有2,3-丁二醇最高產量12 g/L,而且丁二醇幾乎都為(R,R)異構物型式。 圖中(B)係菌株在20 mL培養液(M9、15g/L葡萄糖、5 g/L酵母萃出物)並外加5 g/L acetoin,於無氧環境條件下培養24小時生產2,3-丁二醇之結果。結果顯示僅帶有KpBudC菌株可產6.43 g/L meso-2,3-丁二醇,而僅表現CbAdh菌株,由於無氧環境下,此基改菌株累積大量NADH,無法利用糖解作用所產生NADH,加上所表現CbAdh係專一性之NADPH-dependent,同樣不能以NADH為輔因子,將外加之acetoin進行還原反應消耗累積過多NADH。因此,菌株最後無法再循環NAD+
/NADH,糖解作用無法進行,因此菌株在無氧環境幾乎沒有生長,也沒有2,3-丁二醇生成。相反的YCW 3株菌株同時表現KpBudC與CbAdh,具有對 NADH、NADPH輔因子之彈性調控,因此菌株生成meso-2,3-丁二醇及少量之(R,R)-2,3-丁二醇。 由上述結果可知,菌株僅表現NADH-dependent或NADPH-dependent單一種BDH酵素時,因為受到特定輔因子供應狀態限制停滯於特定代謝狀態下,2,3-丁二醇產量受到限制;當菌株同時表現KpBudC與CbAdH兩者酵素時,不管在何種環境下,菌株因為具有NADH與NADPH輔因子適應性可以因應菌體內NADH與NADPH動態濃度變化,暨不同氧氣濃度條件下,菌株可以自行調整使用體內NADH及NADPH輔因子,協同作用轉化促使能有2,3-丁二醇高產量生成。 [實施例三] 發酵槽批次饋料方式生產2,3-丁二醇 請參閱『第2圖』所示,係本發明以發酵槽批次饋料策略生產2,3-丁二醇之相關變化示意圖。如圖所示:YCW3菌株以1.5公升發酵槽、批次饋料模式(fed-batch)策略進行92小時發酵生產2,3-丁二醇,結果如第2圖所示,圖中(A)係2,3-丁二醇與acetoin產量變化情形之結果。結果顯示,菌株在此發酵條件下,能夠充分將acetoin還原生成2,3-丁二醇,避免2,3-丁二醇之前驅物acetoin累積,因此有2,3-丁二醇高產量,且產生純度高之(R,R)-2,3-丁二醇。 圖中(B)係發酵培養液之糖濃度變化與菌株生長情形之結果。結果顯示,發酵以穩定快速之狀態進行至44小時生成80 g/L之2,3-丁二醇,平均產率為1.8 g/L/h;發酵至56小時時,2,3-丁二醇產物為92 g/L約達其發酵總程之高原期,至92小時發酵實驗停止,2,3-丁二醇總產量為107.92 g/L,生產率為1.17 g/L/h,其中超過90%之2,3-丁二醇產物為(R,R)-form之異構物型式(98.56 g/L),純度為91.32%。在發酵期間,以攪拌速率來控制槽內培養液溶氧值維持在10%,期望讓菌株維持基本生長與生理代謝活性以持續生產2,3-丁二醇,但菌株生長代謝旺盛情況下,消耗氧氣速率非常快速,以致於有段長時間槽內培養液溶氧值呈現0 %,到最後菌株依然約有100 g/L產量,相較於在相同發酵槽生產條件,使用僅單獨表現KpBudC或CbAdh酵素之菌株,產量顯著不如同時表現KpBudC與CbAdh酵素之菌株。結果顯示雖然槽內環境之溶氧度,在發酵過程有很大差異之變動,但是同時表現NADH/NADPH-dependent BDH之菌株卻能因應環境氧氣濃度變化,自行調節使用不同輔因子,而依然有高產量表現。 綜上所述,本發明係一種生產高產量2,3-丁二醇之方法,可有效改善習用之種種缺點,所建構之大腸桿菌2,3-丁二醇生產菌株YCW3除了具有自行調節體內2,3-丁二醇生成代謝路徑輔因子NADP/NADPH濃度比例彈性運用外,並在最適發酵製程條件中生成高產量、高產率之2,3-丁二醇,此外本發明建構之菌株亦無2,3-丁二醇原生種菌株須顧慮其生物安全等級之致病性,因此極具有2,3-丁二醇工業化量產應用潛力,進而使本發明之産生能更進步、更實用、更符合使用者之所須,確已符合發明專利申請之要件,爰依法提出專利申請。 惟以上所述者,僅為本發明之較佳實施例而已,當不能以此限定本發明實施之範圍;故,凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾,皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
第1圖 係本發明 在不同氧氣條件對大腸桿菌JCL166表現不同輔 因子依賴性之BDH生產2,3-丁二醇之影響示意圖。 第2圖,係本發明以發酵槽批次饋料策略生產2,3-丁二醇之相關變化示意圖。