RU2686614C2 - Способ получения ацетоина - Google Patents
Способ получения ацетоина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2686614C2 RU2686614C2 RU2017101673A RU2017101673A RU2686614C2 RU 2686614 C2 RU2686614 C2 RU 2686614C2 RU 2017101673 A RU2017101673 A RU 2017101673A RU 2017101673 A RU2017101673 A RU 2017101673A RU 2686614 C2 RU2686614 C2 RU 2686614C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- nucleic acid
- recombinant yeast
- sequence
- als
- Prior art date
Links
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 183
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 221
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 210
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108010084631 acetolactate decarboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 263
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 158
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 84
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims description 46
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 42
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 42
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 claims description 40
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 35
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 31
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 29
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 27
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 27
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 101150034686 PDC gene Proteins 0.000 claims description 13
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 172
- 102100024643 ATP-binding cassette sub-family D member 1 Human genes 0.000 description 76
- 101000760602 Homo sapiens ATP-binding cassette sub-family D member 1 Proteins 0.000 description 76
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 49
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 48
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 43
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- -1 AURI-C Proteins 0.000 description 32
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 32
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 26
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 101150051897 his5 gene Proteins 0.000 description 15
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 15
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- FUSUHKVFWTUUBE-UHFFFAOYSA-N buten-2-one Chemical compound CC(=O)C=C FUSUHKVFWTUUBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101150101337 Bdh2 gene Proteins 0.000 description 10
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 9
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000235060 Scheffersomyces stipitis Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 8
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 8
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 3-benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]oxolan-2-one Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OCC1OC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)C1 AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100001031 Acetobacter aceti adhA gene Proteins 0.000 description 5
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 101100054935 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) alcC gene Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 4
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 3
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 3
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 3
- 108010080643 L-xylulose reductase Proteins 0.000 description 3
- 102100029137 L-xylulose reductase Human genes 0.000 description 3
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100029089 Xylulose kinase Human genes 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 108091022915 xylulokinase Proteins 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- ZHBXLZQQVCDGPA-UHFFFAOYSA-N 5-[(1,3-dioxo-2-benzofuran-5-yl)sulfonyl]-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1=C2C(=O)OC(=O)C2=CC(S(=O)(=O)C=2C=C3C(=O)OC(C3=CC=2)=O)=C1 ZHBXLZQQVCDGPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100272861 Arabidopsis thaliana BXL3 gene Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000722885 Brettanomyces Species 0.000 description 2
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 2
- 101100480861 Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (strain DSM 15242 / JCM 11007 / NBRC 100824 / MB4) tdh gene Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 101100447466 Candida albicans (strain WO-1) TDH1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 108010058076 D-xylulose reductase Proteins 0.000 description 2
- 241000235035 Debaryomyces Species 0.000 description 2
- 101000904460 Encephalitozoon cuniculi (strain GB-M1) Probable glycerol-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101150095274 FBA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 102100036669 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Human genes 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 101150037790 JEN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 101150050255 PDC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100069420 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GRE3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100507956 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT7 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100386089 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MET17 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100305145 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPP1A gene Proteins 0.000 description 2
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150032817 TPI1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000235006 Torulaspora Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150100773 XKS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150032931 XYL3 gene Proteins 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150104041 eno2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 101150087371 gpd1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 2
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 101150088047 tdh3 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150034227 xyl1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 2
- 239000001661 (3R)-3-hydroxybutan-2-one Substances 0.000 description 1
- ROWKJAVDOGWPAT-GSVOUGTGSA-N (R)-Acetoin Chemical compound C[C@@H](O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylcyclopentane-1,2-dione Chemical compound CC1CC(C)C(=O)C1=O MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100272859 Arabidopsis thaliana BXL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100517196 Arabidopsis thaliana NRPE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100374156 Arabidopsis thaliana RKL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100264262 Aspergillus aculeatus xlnD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100434663 Bacillus subtilis (strain 168) fbaA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 101100190825 Bos taurus PMEL gene Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100351264 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) PDC11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001508811 Clavispora Species 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 229930195711 D-Serine Natural products 0.000 description 1
- RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N D-glyceric acid Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-VPENINKCSA-N D-xylose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N D-xylulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical group CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700036431 EC 1.6.3.1 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150037782 GAL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150081655 GPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023413 GRB2-related adapter protein Human genes 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100049998 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) XYLB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 101150044896 HXT4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000884385 Homo sapiens Arylamine N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101001034811 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000829735 Homo sapiens GRB2-related adapter protein Proteins 0.000 description 1
- 101001072574 Homo sapiens Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101001012669 Homo sapiens Melanoma inhibitory activity protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000601616 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001128581 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000639975 Homo sapiens Sodium-dependent noradrenaline transporter Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-IMJSIDKUSA-N L-arabinitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150044775 LYS1 gene Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101500023488 Lithobates catesbeianus GnRH-associated peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001508815 Lodderomyces Species 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100029778 Melanoma inhibitory activity protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100032199 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 101150113561 NUP57 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100073341 Oryza sativa subsp. japonica KAO gene Proteins 0.000 description 1
- 101150110652 PDC2 gene Proteins 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 101150093629 PYK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101150018379 Pfk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235379 Piromyces Species 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 108091006631 SLC13A4 Proteins 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235072 Saccharomyces bayanus Species 0.000 description 1
- 101100177143 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HAA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451954 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100507949 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100507954 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100453262 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) JEN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100519200 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PDC6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100045759 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TFC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204893 Saccharomyces douglasii Species 0.000 description 1
- 101100042410 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sfc1 gene Proteins 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100033769 Sodium-coupled neutral amino acid transporter 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035209 Solute carrier family 13 member 4 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000203644 Streptoalloteichus hindustanus Species 0.000 description 1
- 101100029430 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) pfkA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000666920 Streptomyces hygroscopicus subsp. limoneus Validoxylamine A 7'-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000187310 Streptomyces noursei Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150010219 TEF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150052008 TKL-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical group ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009499 Vanilla fragrans Nutrition 0.000 description 1
- 244000263375 Vanilla tahitensis Species 0.000 description 1
- 235000012036 Vanilla tahitensis Nutrition 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150095212 XYL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 1
- 241000191335 [Candida] intermedia Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical class C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 150000003792 acetoin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N ara-adenosine Natural products Nc1ncnc2n(cnc12)C1OC(CO)C(O)C1O OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150035354 araA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150097746 araB gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 101150038738 ble gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036467 butanediol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 230000025938 carbohydrate utilization Effects 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000008373 coffee flavor Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 235000014541 cooking fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003571 electronic cigarette Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010799 enzyme reaction rate Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 229940025237 fructose 1,6-diphosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 239000003264 margarine Substances 0.000 description 1
- 235000013310 margarine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150087123 nat gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019520 non-alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000005373 pervaporation Methods 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 101150000475 pntAB gene Proteins 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150005492 rpe1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013533 rum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002181 saccharomyces boulardii Drugs 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 101150033131 sthA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 101150003389 tdh2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150109723 tef3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 101150052264 xylA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- UZVNCLCLJHPHIF-NOJKMYKQSA-J zinc;(1e)-2-(ethylcarbamoylamino)-n-methoxy-2-oxoethanimidoyl cyanide;manganese(2+);n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[Zn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.CCNC(=O)NC(=O)C(\C#N)=N\OC UZVNCLCLJHPHIF-NOJKMYKQSA-J 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12Y106/03—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with oxygen as acceptor (1.6.3)
- C12Y106/03001—NAD(P)H oxidase (1.6.3.1), i.e. NOX1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/16—Butanols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
- C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
- C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01005—Acetolactate decarboxylase (4.1.1.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, имеющим пониженную активность пируватдекарбоксилазы, в геном которых вставлена:
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу или ALS,
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, и
- одна или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих NADH-оксидазу или NOXE.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, имеющему улучшенный метаболический путь ацетоина. Рекомбинантный микроорганизм модифицирован для улучшения получения ацетоина по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Изобретение также предоставляет способы применения такого микроорганизма для получения ацетоина.
Предшествующий уровень техники
Ацетоин, также известный как 3-гидроксибутанон или ацетил метил карбинол, образуется в бактериях из пирувата под действием двух ферментов, а именно α-ацетолактатсинтазы, которая катализирует конденсацию двух молекул пировиноградной кислоты с одним декарбоксилированием с получением α-ацетолактата и α-ацетолактатдекарбоксилазы, которая декарбоксилирует этот последний с образованием ацетоина (Juni, 1952).
Ацетоин представляет собой ароматизатор, обычно используемый в пищевой промышленности, где он заменяет диацетил, поскольку считается более безопасным (Huang, 2011). Ацетоин используют в качестве вкусового ингредиента в составах малина, клубника, ваниль, орех, ром, масло, баттерскотч, карамель, кокосовый орех, кофе и фруктовых отдушках. Ацетоин может быть добавлен в алкогольные и безалкогольные напитки, такие как крем-сода. Его маслянистый вкус хорошо подходит для мороженого, фруктового льда, конфет, хлебобулочных изделий, маргарина, желатиновых десертов, творога и кулинарного жира (шортенинга). Ацетоин также используется в косметической промышленности в парфюмерных изделиях, и духах, как носитель аромата. Наконец, ацетоин является одной из ведущих химических добавок в сигаретах и вкусоароматическим агентом в электронных сигаретах. Ацетоин является, кроме того, предшественником метилвинилкетона (MVK), который является полезным промежуточным соединением в химии.
Традиционный химический синтез ацетоина сталкивается с проблемой дефицита нефти и загрязнения окружающей среды, в то время как рынок ацетоина, как пищевой вкусоароматической добавки, в настоящее время по-прежнему растет от 5 до 5,5% в год и, как ожидается, достигнет $ 14 млрд. в 2018 году. Ожидается, что рынок ароматизаторов превысит $ 16 млрд. в 2018 году.
Многие химические вещества, которые в прошлом могли быть получены только с помощью традиционных химических процессов, теперь, потенциально, могут быть произведены биологически, с использованием возобновляемых ресурсов (Danner и Braun, 1999; Hatti-Kaul и др., 2007). Микробное получение ацетоина является одним из таких примеров. Интерес к этому биопроцессу заметно увеличился, потому что ацетоин имеет большое количество промышленных применений, как упомянутые выше, и микробное получение снизит зависимость от поставок нефти для получения базовых химикатов. Saccharomyces cerevisiae представляют собой особенно хорошо подходящую систему для таких биопроцессов (Nielsen 2013). Что касается микробного получения ацетоина, в большинстве исследований использовали такие микроорганизмы, как Candida glabrata, Bacillus subtilis для получения ацетоина (Shubo Li и др., Microbial Cell Factories 2014, 13:55; Silbersack J и др., Appl Microbiol Biotechnol, декабрь 2006; 73(4):895-903;
Таким образом, необходимо получение ацетоина с помощью микроорганизма GRAS (GRAS - Generally Recognized as Safe, т.е. в целом, признанного безопасным). В этом контексте, дрожжи, и более конкретно, Saccharomyces cerevisiae, являются подходящими микроорганизмами. S.cerevisiae, как известно, получают ацетоин естественным образом, но выход продукта и эффективность получения ацетоина невысоки. В действительности, наиболее очевидным препятствием для эффективного получения ацетоина в S.cerevisiae является получение этанола, потому что пируват, ключевой промежуточный продукт, преимущественно, используют для получения этанола, а не ацетоина.
Таким образом, по очевидным причинам, улучшение получения ацетоина посредством микробных процессов, и, более конкретно, превращение пирувата в ацетоин, остается постоянной целью. Более конкретно, по-прежнему существует потребность в стабильном рекомбинантном микроорганизме, имеющем повышенный выход ацетоина, особенно, совместимом с требованиями промышленного получения.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам с пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, в геном которых была вставлена:
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу или ALS,
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, и
- одна или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих NADH-оксидазу (NOXE).
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать одну или более ДНК-конструкций, выбранных из группы, включающей следующие формулы:
их комбинацию, где:
- "ген 1" означает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE;
- "ген 2" означает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от гена 1;
- "ген 3" означает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от генов 1 и 2;
- "ALS" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатсинтазу;
- "ALD" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатдекарбоксилазу;
- "NOXE" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу;
- каждое из "х1", "х2" и "х3", независимо друг от друга, представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, и,
при условии, что указанные рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую каждую из ALS, ALD и NOXE.
Предпочтительно каждое из "х1", "х2" и "х3", независимо друг от друга, представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 15, в том числе, от 0 до 12, более предпочтительно в диапазоне от 0 до 5, в частности, в диапазоне от 0 до 3, а еще лучше, представляет собой целое число, равное 1.
В соответствии с другим вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по изобретению могут содержать по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции указанной выше формулы (II), идентичные или разные, где "ген 3" означает нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу.
В соответствии с еще одним конкретным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIa), идентичные или разные, причем каждая формула (IIa), имеет следующую формулу:
где:
- ген 1, ген 2, ген 3, "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено выше;
- "х5" представляет собой целое число, равное 0 или 1;
- "у1", "у2", "z1" и "z2", каждое, независимо от других, представляет собой целое число, равное 0 или 1;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, две ДНК-конструкции формулы (IIa), то "х1", "х2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или разными;
- "пром1" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "пром 5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена 1, указанный пром5 идентичен или отличается от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию гена 1, указанный терм 5 идентичен или отличается от терм 1.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIb), идентичные или разные, причем каждая формула (IIb) имеет следующую формулу:
где:
- ALS, ALD, NOXE; "х1", "х2", "х3", "Х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено выше;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи содержат по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIb), то "х1", "х2", "х3", "Х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или разными;
- "пром1" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, указанный пром 5 идентичен или отличается от пром 1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу; а также
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, указанный терм 5 идентичен или отличается от терм1.
В соответствии с другим вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по изобретению могут содержать по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (II), (IIa) или (IIb), при условии, что все копии нуклеиновой кислоты NOXE расположены в одной из по меньшей мере двух ДНК-конструкций формулы (II), (IIa) или (IIb).
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, рекомбинантные дрожжи по изобретению могут содержать по меньшей мере две, предпочтительно строго две ДНК-конструкции следующих формул (IIc) и (IId):
где:
- ALS, ALD, NOXE; "пром1", "пром2", "пром3", "пром5", "терм1", "терм2", "терм3" и "терм5"; "х1”, "х2" и "х3"; и "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено выше;
- "х1" - "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" для каждой из формул (IIc) и (IId) являются идентичными или разными; а также
- "х6" и "х7" представляют собой целые числа от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 12, более конкретно от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4, а еще лучше, равные 3, при условии, что одно из "х6" и "х7" представляет собой 0.
Настоящее изобретение также относится к применению рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению для получения ацетоина и/или его производных, которые включают метилвинилкетон.
Настоящее изобретение также относится к способу получения ацетоина, причем указанный способ включает стадии:
(а) культивирования рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению, в соответствующей культуральной среде; а также
(с) выделения ацетоина.
Предпочтительно указанная культуральная среда содержит источник углерода, предпочтительно выбранный из группы, содержащей глюкозу и сахарозу.
Описание графических материалов
На Фиг. 1 показан метаболический путь в рекомбинантном штамме дрожжей, чтобы заменить получение этанола на получение ацетоина.
Подробное описание изобретения
Определения
Термин "микроорганизм", используемый в настоящем документе, относится к дрожжам, которые не изменены искусственно. Микроорганизм может быть "донором", если он предоставляет генетический элемент, который будет интегрирован в микроорганизм "акцептора", который будет экспрессировать этот чужеродный генетический элемент, или если он используется в качестве инструмента для генетических конструкций или экспрессии белков. Микроорганизм по настоящему изобретению выбирают из дрожжей, экспрессирующих гены для биосинтеза ацетоина.
Термин "рекомбинантный микроорганизм" или "генетически модифицированный микроорганизм", или "рекомбинантные дрожжи", или "генетически модифицированные дрожжи", используемый в настоящем документе, относится к генетически модифицированным или генетически сконструированным дрожжам. Это означает, в соответствии с обычным значением этих терминов, что микроорганизм по изобретению не встречается в природе, и модифицирован или путем вставки, или путем удаления, или путем модификации генетических элементов из эквивалентного микроорганизма, встречающегося в природе. Он также может быть изменен усилением развития и эволюции новых метаболических путей с помощью комбинации направленного мутагенеза и эволюции под специфическим давлением отбора (например, WO 2004/076659).
Микроорганизм может быть изменен с целью экспрессии экзогенных генов, если эти гены вводят в микроорганизм со всеми элементами, обеспечивающими их экспрессию в микроорганизме-хозяине. Микроорганизм может быть изменен с целью модуляции уровня экспрессии эндогенного гена. Модификация или "трансформация" микроорганизма, такого как дрожжи, экзогенной ДНК является рутинной задачей для специалистов в данной области техники. В частности, генетическая модификация микроорганизма по изобретению, более конкретно, генетическая модификация(и) определенная в данном документе, может быть осуществлена с использованием системы CRISPR-Cas, как описано у DiCarlo и др., (Nucl. Acids Res., т. 41, No. 7, 2013: 4336-4343).
Термин "эндогенный ген" означает, что ген присутствовал в микроорганизме до любой генетической модификации, в штамме дикого типа. Эндогенные гены могут быть сверхэкспрессированы путем вставки гетерологичных последовательностей в дополнение к, или вместо эндогенных регуляторных элементов, или путем вставки одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду. Эндогенные гены также могут быть модифицированы с целью модуляции их экспрессии и/или активности. Например, мутации могут быть введены в кодирующую последовательность, чтобы модифицировать генный продукт, или гетерологичные последовательности могут быть введены в дополнение к, или вместо эндогенных регуляторных элементов. Модуляция эндогенного гена может привести к усилению экспресии и/или усилению активности генного продукта, или, в качестве альтернативы, к снижению экспресии и/или ослаблению активности продукта эндогенного гена. Другим способом усиления экспрессии эндогенных генов является введение одного или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду.
Термин "экзогенный ген" означает, что ген был вставлен в микроорганизм, с помощью средств, хорошо известных специалистам в данной области техники, в то время как этот ген от природы не присутствует в штамме микроорганизма дикого типа. Микроорганизм может экспрессировать экзогенные гены, если эти гены вводят в микроорганизм со всеми элементами, обеспечивающими их экспрессию в микроорганизме-хозяине. Трансформация микроорганизмов экзогенной ДНК является рутинной задачей для специалиста в данной области техники. Экзогенные гены могут быть интегрированы в хромосому хозяина, или могут быть экспрессированы экстра-хромосомно, из плазмид или векторов. Множество плазмид, различающихся точками начала (ориджинами) репликациии количеством их копий в клетке, известны в данной области техники. Последовательность экзогенных генов может быть адаптирована для их экспрессии в микроорганизме-хозяине. Действительно, специалисту в данной области техники известно понятие предпочтения кодонов и как адаптировать нуклеиновые последовательности для конкретного предпочтения кодонов без изменения получаемого белка.
Термин "гетерологичный ген" означает, что ген происходит из вида микроорганизма, отличного от экспрессирующего его микроорганизма-реципиента. Термин относится к гену, который от природы не присутствует в микроорганизме.
В настоящей заявке, все гены указаны с использованием их обычных названий и со ссылками на их нуклеотидные последовательности и, в случае возникновения вопросов, на их аминокислотные последовательности. Используя приведенные ссылки на номера доступа для известных генов, специалисты в данной области техники способны определить эквивалентные гены в других организмах, бактериальных штаммах, дрожжах, грибах, млекопитающих, растениях и т.д. Эту рутинную работу преимущественно осуществляют, используя консенсусные последовательности, которые могут быть определены путем проведения выравнивания последовательностей с генами, полученными из других микроорганизмов и конструирования вырожденных проб для клонирования соответствующего гена в другом организме.
Специалисту в данной области техники известны различные способы модулирования, и, в частности, усиления и ослабления экспресии эндогенных генов. Например, способом повышения экспрессии эндогенных генов является введение одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду.
Другой способ заключается в замене эндогенного промотора гена более сильным промотором. Эти промоторы могут быть гомологичными или гетерологичными. Гомологичными промоторами, известными, как обеспечивающие высокий уровень экспрессии в дрожжах, являются те, которые выбраны из следующей группы; ADH1, GPDH, TEF1, процессированный НХТ7, PFK1, FBA1, PGK1 и TDH3 и тому подобное. Промоторы, особенно интересные в настоящем изобретении, определены более подробно далее в настоящем документе.
В дрожжах, экспрессионная конструкция на основе нуклеиновой кислоты, предпочтительно содержит регуляторные последовательности, такие как последовательности промотора и терминатора, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей каждый из рассматриваемых генов, и, более конкретно, каждый из упомянутых выше ферментов ALS, ALD и NOXE по настоящему изобретению.
Экспрессионная конструкция на основе нуклеиновой кислоты может дополнительно включать в себя 5' и/или 3' распознающие последовательности и/или селективные маркеры.
Термин "сверхэкспрессия" означает, что экспрессия гена или фермента увеличивается по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Увеличение экспрессии фермента получают путем увеличения экспрессии гена, кодирующего указанный фермент. Увеличение экспрессии гена, может быть осуществлено с помощью всех методов, известных специалисту в данной области техники. В связи с этим, можно особенно назвать использование сильного промотора выше по цепи от нуклеиновой кислоты, предназначенной для сверхэкспресии, или вставку нескольких копий указанной нуклеиновой кислоты между промотором, особенно, сильным промотором и терминатором.
Термин "активность" фермента использован взаимозаменяемо с термином "функция" и обозначает, в контексте настоящего изобретения, способность фермента катализировать необходимую реакцию.
Термины "пониженная активность" или "ослабленная активность" фермента означают или уменьшенную удельную каталитическую активность белка, полученного в результате мутации в аминокислотной последовательности, и/или снижение концентрации белка в клетке, полученное в результате мутации нуклеотидной последовательности, или в результате делеции соответствующего когнатного гена.
Термин "повышенная активность" фермента обозначает или повышенную удельную каталитическую активность фермента, и/или повышенное количество/наличие данного фермента в клетке, полученное, например, путем сверхэкспрессии гена, кодирующего указанный фермент.
Термин "кодирование" относится к процессу, с помощью которого полинуклеотид, посредством механизмов транскрипции и трансляции, производит аминокислотную последовательность.
Ген(ы), кодирующий фермент(ы), рассмотренный в настоящем изобретении, может быть эндогенным или экзогенным.
"Ослабление" генов означает, что гены экспрессируются в меньшей степени, чем в немодифицированном микроорганизме. Ослабление может быть осуществлено с помощью средств и способов, известных специалистам в данной области техники, и включает делецию гена, осуществляемую путем гомологичной рекомбинации, ослабление гена путем вставки внешнего элемента в ген, или экспрессию гена под слабым промотором. Специалисту в данной области техники известны различные промоторы, которые демонстрируют различную силу, и какие промоторы можно использовать для слабой генной экспрессии.
Методы, использованные в настоящем изобретении, предпочтительно требуют использования одной или более хромосомных интеграционных конструкций для стабильного введения гетерологичной нуклеотидной последовательности в определенное место на хромосоме, или для функционального разрушения одного или более генов-мишеней в генетически-модифицированной микробной клетке. В некоторых вариантах осуществления, разрушение гена-мишени препятствует экспрессии соответствующего функционального белка. В некоторых вариантах осуществления, разрушение гена-мишени приводит к экспрессии нефункционального белка из разрушенного гена.
Параметры хромосомных интеграционных конструкций, которые могут быть изменены в практике настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, длины гомологичных последовательностей; нуклеотидную последовательность гомологичных последовательностей; длину интегрирующей последовательности; нуклеотидную последовательность интегрирующей последовательности; и нуклеотидную последовательность локуса-мишени. В некоторых вариантах осуществления, эффективный диапазон длины каждой гомологичной последовательности составляет от 20 до 5000 пар оснований, предпочтительно от 50 до 100 пар оснований. В конкретных вариантах осуществления, длина каждой гомологичной последовательности составляет, приблизительно, 50 пар оснований. Для получения дополнительной информации о длине гомологии, требуемой для направленного воздействия на ген, см. D. Burke и др. "Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual" (2000).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, разрушенный ген(ы) пируватдекарбоксилазы, в который должна быть вставлена вышеуказанная ДНК-конструкция(и), может преимущественно содержать один или более селективных маркеров, необходимых для отбора трансформированных микробных клеток. Предпочтительно указанный селективный маркер(ы) включен в ДНК-конструкцию(и) по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления, селективный маркер представляет собой маркер устойчивости к антибиотику. Иллюстративные примеры маркеров устойчивости к антибиотикам, включают, но не ограничиваются ими, продукты генов NAT1, AURI-C, НРН, DSDA, KAN<R>, и SH BLE. Продукт гена NAT 1 из S. noursei придает устойчивость к ноурсетрицину; продукт гена AURI-C из Saccharomyces cerevisiae придает устойчивость к Auerobasidin А (AbA); продукт гена НРН из Klebsiella pneumonia придает устойчивость к гигромицину В; продукт гена DSDA из Е. coli позволяет клеткам расти на пластинах с D-серином в качестве единственного источника азота; ген KAN<R> транспозона Tn903 придает устойчивость к G418; и продукт гена SH BLE из Streptoalloteichus hindustanus придает устойчивость к зеоцину (блеомицину).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, маркер устойчивости к антибиотику удаляют после того, как генетически модифицированную микробную клетку по изобретению изолируют. Специалист в данной области техники способен выбрать подходящий маркер в определенном генетическом контексте.
В некоторых вариантах осуществления, селективный маркер исправляет ауксотрофию (например, питательную ауксотрофию) в генетически модифицированной микробной клетке. В таких вариантах осуществления, родительская микробная клетка содержит нарушение функции в одном или более продуктах генов, которые функционируют в аминокислотном или нуклеотидном пути биосинтеза, таких, например, как продукты генов HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, МЕТ 15, TRP1, ADE2, и URA3 в дрожжах, которые делают родительские микробные клетки неспособными расти в среде без добавления одного или более питательных веществ (ауксотрофный фенотип). Ауксотрофный фенотип может затем быть исправлен путем трансформации родительской микробной клетки хромосомной интеграционной конструкцией, кодирующей функциональную копию продукта разрушенного гена (NB: функциональная копия гена может происходить из близких видов, таких как Kluveromyces, Candida и т.п.), и полученные генетически модифицированные микробные клетки могут быть отобраны на основании потери ауксотрофного фенотипа у родительской микробной клетки.
Для каждой из последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих последовательность промотора, кодирующую последовательность (например, последовательность, кодирующую фермент), или последовательность терминатора, эталонные последовательности описаны в настоящем документе. Настоящее описнаие также включает последовательности нуклеиновых кислот, имеющие конкретные проценты идентичности нуклеиновых кислот с последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты.
Для каждой из аминокислотных последовательностей, представляющих интерес, эталонные последовательности описаны в настоящем документе. Настоящее описание также охватывает аминокислотные последовательности (например, аминокислотные последовательности фермента), имеющие конкретные проценты идентичности аминокислот с эталонной аминокислотной последовательностью.
По очевидным причинам, во всем настоящем описании, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты или конкретная аминокислотная последовательность, которая удовлетворяет требованиям, соответственно, рассмотренной нуклеотидной или аминокислотной идентичности, должна дополнительно приводить к получению белка (или фермента), который демонстрирует необходимую биологическую активность. Используемый в настоящем описании термин "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или между двумя аминокислотными последовательностями определяют посредством сравнения обиех оптимально выровненных последовательностей через окно сравнения.
Часть нуклеотидной или аминокислотной последовательности в окне сравнения может, таким образом, включать в себя вставки или делеции (например, "пропуски") по сравнению с эталонной последовательностью (которая не включает в себя эти вставки или эти делеции), чтобы получить оптимальное выравнивание между обеими последовательностями.
Процент идентичности вычисляют путем определения числа положений, в которых идентичное нуклеиновое основание, или идентичный аминокислотный остаток можно отметить у обеих сравниваемых последовательностей, и затем путем деления числа положений, в которых можно наблюдать идентичность между обеими нуклеиновыми основаниями, или между обеими аминокислотными остатками, на общее число положений в окне сравнения, затем путем умножения результата на сто, чтобы получить процент нуклеотидной идентичности между двумя последовательностями, или процент идентичности аминокислот между двумя последовательностями.
Сравнение оптимального выравнивания последовательностей может быть выполнено на компьютере с использованием известных алгоритмов.
Наиболее предпочтительно процент идентичности последовательностей определяют с помощью программного обеспечения CLUSTAL W (версия 1.82), параметры установлены следующим образом:
(1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAP OPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAP EXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram" and (18) TREE GRAP DISTANCES="hide".
"Ферментацию" или "культивирование" обычно проводят в биореакторах с подходящей культуральной средой, адаптированной к культивируемым микроорганизмам, содержащей, по меньшей мере, один простой источник углерода, и, при необходимости косубстраты.
Микроорганизмы, описанные здесь, могут быть выращены в ферментационных средах для получения продукта из пирувата. Для максимального получения ацетоина, штаммы микроорганизмов, используемые в качестве организмов-хозяев, предпочтительно имеют высокую скорость утилизации углеводов. Эти характеристики могут быть получены с помощью мутагенеза и селекции, генной инженерии, или могут быть естественными. Ферментационная среда, или "культуральная среда" для настоящих клеток, может содержать, по меньшей мере, приблизительно 10 г/л глюкозы. Дополнительные углеродные субстраты могут включать, но не ограничиваются ими, моносахариды, такие как фруктоза, манноза, ксилоза и арабиноза; олигосахариды, такие как лактоза, мальтоза, галактоза, или сахароза; полисахариды, такие как крахмал или целлюлоза или их смеси и неочищенные смеси из возобновляемого сырья, такого как пермеат подсырной сыворотки, кукурузный настой, свекловичная патока (меласса из сахарной свеклы) и ячменный солод. Другие углеродные субстраты могут включать в себя глицерин.
Следовательно, предполагается, что источник углерода, используемый в настоящем изобретении, может включать в себя широкий спектр субстратов, содержащих углерод, и будет ограничен только выбором организма.
Несмотря на то, что предполагается, что все вышеуказанные субстраты углерода и их смеси пригодны в настоящем изобретении, предпочтительными углеродными субстратами являются глюкоза, фруктоза и сахароза, или их смеси с С5 сахарами, такими как ксилоза, и/или арабиноза для микроорганизмов, модифицированных для использования С5 сахаров, а более конкретно глюкозы.
Предпочтительным субстратом углерода является сахароза.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, углеродный субстрат по настоящему изобретению не содержит ксилозы.
В дополнение к подходящему источнику углерода, ферментационная среда может содержать подходящие минералы, соли, кофакторы, буферы и другие компоненты, известные специалистам в этой области техники, пригодные для выращивания культур и активации ферментативного пути, необходимого для получения требуемого продукта.
Кроме того, дополнительные генетические модификации, пригодные для роста рекомбинантных микроорганизмов по данному изобретению, могут быть рассмотрены.
Таким образом, чтобы предотвратить превращение ацетоина в 2,3-BDO, гены, которые участвуют в восстановлении ацетоина в 2,3-BDO, могут быть инактивированы. В связи с этим, можно упомянуть эндогенную бутандиолдегидрогеназу bdh1 и bdh2 (в частности, известную под номером ЕС 1.1.1.4.), а также эндогенную алкогольдегидрогеназу adh1, adh3 и adh4 (в частности, известную под номером ЕС 1.1.1.1). Инактивация указанных генов находится в области общих знаний специалиста в данной области техники.
Присутствие слабых кислот, как известно/является ограничением для роста и часто представлено в среде, полученной из целлюлозы или патоки.
Дополнительные генетические модификации, такие как разрушение гена JEN1 (или систематическое название: YKL217W, или номер доступа белка Р36035 (UniProtKB Swiss-Prot)) и/или сверхэкспрессия гена НАА-1 (систематическое название: YPR008W или номер доступа Q12753 (UniProtKB Swiss-Prot)) приводят к улучшению устойчивости штаммов к слабым кислотам в используемой культуральной среде.
Jen 1 представляет собой мембранный белок, ответственный за импорт лактата в клетку (Casal М., и др., (1999), J. Bacteriol, 181 (8): 2620-3).
НАА-1 представляет собой транскрипционный активатор, который контролирует экспрессию мембранных стрессовых белков, ответственных за устойчивость к слабым кислотам. Его сверхэкспрессия повышает устойчивость дрожжей к уксусным кислотам (Tanaka и др., (2012) Appl Environ Microbiol, 78(22): 8161-3).
Разрушение гена JEN1 и сверхэкспрессия гена НАА-1 относятся к общим знаниям специалиста в данной области техники и могут быть, в частности, осуществлены при помощи методов, продемонстрированных в настоящем документе.
Принимая во внимание далее в настоящем документе уравнение синтеза ацетоина в дрожжах, условия для рассмотрения в настоящем изобретении, являются обязательно аэробными условиями.
Термин "аэробные условия" относится к концентрациям кислорода в культуральной среде, достаточным для аэробного или факультативного анаэробного микроорганизма, чтобы использовать дикислород в качестве терминального акцептора электронов.
"Микроаэробное состояние" относится к культуральной среде, в которой концентрация кислорода меньше, чем в воздухе, то есть к концентрации кислорода до 6% O2.
Термин "соответствующая культуральная среда" обозначает среду (например, стерильную жидкую среду), содержащую питательные вещества, необходимые или полезные для поддержания и/или роста клеток, такие как источники углерода, или субстрат углерода, источники азота, например, пептон, дрожжевые экстракты, мясные экстракты, солодовые экстракты, мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, нитрат аммония и фосфат аммония; источники фосфора, например, монокалийфосфат или дикалийфосфат; микроэлементы (например, соли металлов), например, соли магния, соли кобальта и/или соли марганца, а также ростовые факторы, такие как аминокислоты, витамины, стимуляторы роста, и тому подобное. Термин "источник углерода" или "углеродный субстрат" или "источник углерода" в соответствии с настоящим изобретением, означает любой источник углерода, который может быть использован специалистами в этой области техники, чтобы поддерживать нормальный рост микроорганизма, включая гексозы (такие, как глюкоза, галактоза или лактоза), пентозы, моносахариды, олигосахариды, дисахариды (такие как сахароза, целлобиоза или мальтоза), мелассу, крахмал или его производные, целлюлозу, гемицеллюлозу и их комбинации.
Рекомбинантные дрожжи по изобретению
Как указано выше, настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам с пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, в геном которых была вставлена:
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу или ALS,
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, и
- одна или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих NADH-оксидазу (или NOXE).
Как показано в примерах, приведенных в настоящем документе, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что присутствие нуклеиновой кислоты, кодирующей NADH-оксидазу, преимущественно, присутствие множества ее копий в рекомбинантных дрожжах, в которых активность пируватдекарбоксилазы была снижена, и в которые были дополнительно интегрированы гены, обеспечивающие экспрессию ферментов ALS и ALD, необходимых для синтеза ацетоина, не только способствует стабилизации указанных рекомбинантных дрожжей, но также позволяет существенно увеличить рост этого штамма, а также выход продукции ацетоина.
Использование Крэбтри-положительных дрожжевых организмов, таких как Saccharomyces cerevisiae, и, в особенности рекомбинантных дрожжевых организмов, таких как Saccharomyces cerevisiae, для получения интересующих метаболитов является предпочтительным, так как, в отличие от бактерий, дрожжевые клетки обладают способностью осуществлять ферментацию в присутствии кислорода, при наличии достаточного количества сахара, такого как глюкоза или сахароза. В отличие от этого, бактерии осуществляют ферментацию только в анаэробных условиях. Кроме того, дрожжевые организмы не подвержены вирусной инфекции, в отличие от бактериофагов у бактерий. При этом далее, культура дрожжевых организмов редко подвергается заселению нежелательными микроорганизмами, такими как бактерии, так как дрожжевые клетки вызывают быстрое подкисление окружающей их среды до рН 4, например, культуральной среды, поддерживающей их рост. Более того, клетки дрожжей не выделяют ряд нежелательных метаболитов, таких как молочная кислота, присутствие которой в культуральной среде является реальным недостатком для последующей очистки требуемого метаболита(ов). При этом далее, дрожжи, в том числе рекомбинантные дрожжевые организмы имеют более высокую генетическую стабильность по сравнению с бактериями.
Уравнение для синтеза ацетоина в дрожжах представляет собой:
Указанное уравнение сохранения массы возможно в связи с тем, что S.cerevisiae может ферментировать даже в присутствии кислорода.
С учетом приведенного выше уравнения, максимальный теоретический выход ацетоина составит 97,78 г на ввод 200 г глюкозы.
Как показано в приведенных ниже примерах, эффективный выход ацетоина с рекомбинантными дрожжами по настоящему изобретению, является относительно близким к этому максимальному теоретическому выходу (до 83%). По сведениям изобретателя, никогда раньше до настоящего времени такого выхода в дрожжах еще не получали.
Таким образом, в рекомбинантных дрожжах по изобретению, успешно получают высокий выход ацетоина, что открывает путь для промышленного получения ацетоина в дрожжах.
Удивительно, но, как также показано в примерах, приведенных в настоящем документе, не наблюдается токсичность полученного ацетоина на клетках дрожжей, даже при высоких концентрациях синтезированного ацетоина. Более того, синтезированный ацетоин полностью экспортируется за пределы клетки, таким образом, существенно упрощая процесс очистки.
NADH-оксидаза (или NOXE), используемая в рекомбинантных дрожжах по изобретению, представляет собой очень специфический "NADH-зависимый" фермент, так как он не использует углеродный акцептор. По этой причине, выбранная NADH-оксидаза не мешает непосредственно углеродному метаболизму, но пополняет пул NAD+ в образующейся воде.
В связи с этим, NADH-оксидаза, используемая в рекомбинантных дрожжах по изобретению, в частности, отличается от "NADH-зависимого" фермента, описанного в указанных выше документах предшествующего уровня техники и, в особенности, в публикации США 2011/0124060 и WO 2013/076144.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, рекомбинантные дрожжи могут содержать одну или более ДНК-конструкций, выбранных из группы, включающей следующие формулы:
их комбинацию,
где:
- "ген 1" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE;
- "ген 2" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от гена 1;
- "ген 3" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от генов 1 и 2;
- "ALS" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатсинтазу;
- "ALD" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатдекарбоксилазу;
- "NOXE" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу;
- каждое из "х1", "х2" и "х3", независимо от других, представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, и
при условии, что указанные рекомбинантные дрожжи содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую каждый из ALS, ALD и NOXE.
Предпочтительно каждое из "х1", "х2" и "х3", независимо друг от друга, представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 10, а более конкретно, в диапазоне от 0 до 5, в частности, в диапазоне от 0 до 3, и еще лучше представляет собой целое число, равное 1.
Как и предполагалось в настоящем документе, каждое из х1, х2 и х3 может иметь значение, выбранное из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50.
В некоторых вариантах осуществления, где в ДНК-конструкциях формул (I) - (III) указанных выше, одно или более из целых чисел "х1", "х2" и/или "х3", независимо от других, имеет значение два или больше, каждая из двух или более копий соответствующего гена, среди родственных гена 1, гена 2 и/или гена 3, могут быть идентичными или разными. Разные отличающиеся последовательности ALS, ALD и NOXE приведены в Табл. 1 в настоящем документе.
В иллюстративных вариантах осуществления, ДНК-конструкция, выбранная среди конструкций с формулами (I) - (III), где "х1" представляет собой целое число, равное 2, и ген 1 представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатсинтазу (ALS), две ALS-кодирующих последовательности, содержащиеся в указанной ДНК-конструкции, могут быть одинаковыми или различными.
Например, в соответствии с этим конкретным вариантом осуществления, это означает, что первой копией нуклеиновой кислоты, кодирующей ацетолактатсинтазу, может быть нуклеиновая кислота, кодирующая ALS.Bs, а второй копией нуклеиновой кислоты, кодирующей ацетолактатсинтазу, может быть нуклеиновая кислота, кодирующая ALS.Pp.
В настоящих вариантах реализации рекомбинантных дрожжей по изобретению, где указанные рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, две ДНК-конструкции, выбранные из группы, включающей ДНК-конструкции формул (I) - (III), каждая из ДНК-конструкций, и, более конкретно, каждый из генов среди родственных гена 1, гена 2 и/или гена 3, содержащихся в ней, могут быть идентичными или разными.
Далее в настоящем документе представлены некоторые иллюстративные варианты осуществления ДНК-конструкции, выбранной из группы, содержащей ДНК-конструкции формул (I), (II) и (III).
Рекомбинантные дрожжи, содержащие ДНК-конструкцию формулы (I):
Рекомбинантные дрожжи, содержащие ДНК-конструкцию формулы (I) указанной выше, имеют пониженную активность пируватдекарбоксилазы, и имеют четыре следующих ДНК-суб-конструкции (i) - (iii), которые были введены в их геном:
(i) ДНК-суб-конструкция, содержащая две нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует ALS, указанную ДНК-суб-конструкцию вводят в первое местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей;
(ii) ДНК-суб-конструкция, содержащая две нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует ALD, указанную ДНК-суб-конструкцию вводят во второе местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, отличное от местоположения, куда была вставлена ДНК-суб-конструкция, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие ALS; и
(iii) ДНК-суб-конструкция, содержащая три нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует NOXE, указанную ДНК-суб-конструкцию вводят в третье местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, отличное от первого и второго местоположений, куда были вставлены ДНК-суб-конструкция, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие ALS, и ДНК-суб-конструкция, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие ALD, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, требуемое снижение активности пируватдекарбоксилазы указанных специфических рекомбинантных дрожжей, может быть достигнуто путем вставки по меньшей мере одного из дрожжевых генов pdc, по меньшей мере, одной ДНК-суб-конструкции (I) - (III), или, в качестве альтернативы, их комбинации.
Рекомбинантные дрожжи, содержащие одну ДНК-конструкцию формулы (II):
Рекомбинантные дрожжи, содержащие ДНК-конструкцию формулы (II), указанной выше, обладают пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, и имеют геном, в который были вставлены две следующие ДНК-суб-конструкции (А) и (В), а именно:
(А) первую ДНК-суб-конструкцию 5'-[ALS]2-[ALD]2-3', причем указанную первую ДНК-суб-конструкцию вводят в первое местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и указанная первая ДНК-суб-конструкция включает;
(i) две нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая из которых кодирует ALS; и
(ii) две нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая из которых кодирует ALD; и
(В) вторую ДНК-суб-конструкцию 5'-[NOXE]3-3', указанную ДНК-субконструкцию вводят во второе местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, отличное от первого местоположения, в которое была вставлена первая ДНК-суб-конструкция, и указанная вторая ДНК-суб-конструкция, содержит (iii) три нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует NOXE.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, необходимое уменьшение активности пируватдекарбоксилазы указанных выше конкретных рекомбинантных дрожжей, может быть получено путем вставки по меньшей мере в один из генов pdc дрожжей первой ДНК-конструкции и/или второй ДНК-конструкции.
Рекомбинантные дрожжи, содержащие одну ДНК-конструкцию формулы (III):
Рекомбинантные дрожжи, содержащие ДНК-конструкцию формулы (III) указанной выше, имеют пониженную активность пируватдекарбоксилазы и имеют геном, в который была вставлена одна ДНК-конструкция, расположенная в требуемом месте в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, причем указанная ДНК-конструкция, содержит;
(i) две нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует ALS;
(ii) две нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует ALD; а также
(iii) три нуклеиновые кислоты, идентичные или отличающиеся друг от друга, каждая нуклеиновая кислота кодирует NOXE.
В некоторых вариантах осуществления, необходимое уменьшение активности пируватдекарбоксилазы указанных конкретных рекомбинантных дрожжей, может быть получено путем вставки указанной ДНК-конструкции в, по меньшей мере, один из дрожжевых генов pdc.
Для каждого из этих трех указанных выше иллюстративных вариантов реализации рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению, и, как указано выше, когда "х1" - "х3", независимо друг от друга, представляет(ют) собой целое число, имеющее значение два и более:
- одна копия ALS в пределах одной ДНК-конструкции, может быть идентична другой копии ALS, содержащейся в указанной ДНК-конструкции, или может быть идентична всем остальным копиям ALS, содержащимся в указанной ДНК-конструкции или, альтернативно, указанная одна копия ALS может отличаться от других копий ALS, содержащихся в указанной ДНК-конструкции.
- одна копия ALD в пределах одной ДНК-конструкции, может быть идентична другой копии ALD, содержащейся в указанной ДНК-конструкции, или может быть идентичной всем остальным копиям ALD, содержащимся в указанной ДНК-конструкции или, альтернативно, указанная одна копия ALD может отличаться от других копий, содержащихся в указанной ДНК-конструкции.
- одна копия NOXE в пределах одной ДНК-конструкции, может быть идентична другой копии NOXE, содержащейся в указанной ДНК-конструкции или может быть идентична всем остальным копиям NOXE, содержащимся в указанной ДНК-конструкции или, альтернативно, указанная одна копия NOXE может отличаться от других копий, содержащихся в указанной ДНК-конструкции.
Рекомбинантные дрожжи, содержащие одну ДНК-конструкцию формулы (III) и одну ДНК-конструкцию формулы (I):
Полученные рекомбинантные дрожжи обладают пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, и имеют геном, в который были вставлены две следующих ДНК-суб-конструкции (А) и (В), а именно:
(A) первая ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', причем указанную первую ДНК-суб-конструкцию вводят в первое местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и указанная первая ДНК-субконструкция, содержит;
(i) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALS;
(ii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALD; и
(iii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую, NOXE;
а также
(B) вторая ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]0-3' и 5'-[ALD]0-3' и 5'-[NOXE]12-3', указанную вторую ДНК-суб-конструкцию вводят во второе местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и указанная вторая ДНК-субконструкция, содержит:
(i) двенадцать нуклеиновых кислот, кодирующих NOXE.
Рекомбинантные дрожжи, содержащие две ДНК-конструкции формулы (III) и одну ДНК-конструкцию формулы (I):
Полученные рекомбинантные дрожжи обладают пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, и имеют геном, в который были вставлены две следующие ДНК-суб-конструкции (А), (В) и (С), а именно:
(A) первая ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', причем указанную первую ДНК-суб-конструкцию вводят в первое местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и указанная первая ДНК-субконструкция содержит:
(i) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALS;
(ii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALD; и
(iii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую NOXE;
(B) вторая ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', причем указанную вторую ДНК-суб-конструкцию вводят во второе местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и вторая ДНК-суб-конструкция, содержит:
(i) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALS;
(ii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALD; и
(iii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую NOXE; и
(C) третья ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]0-3' и 5'-[ALD]0-3' и 5'-[NOXE]12-3', указанную третью ДНК-суб-конструкцию вводят в третье местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и третья ДНК-суб-конструкция, содержит:
(i) двенадцать нуклеиновых кислот, кодирующих NOXE.
Рекомбинантные дрожжи, содержащие две ДНК-конструкции формулы (II) и одну ДНК-конструкцию формулы (I):
Полученные рекомбинантные дрожжи обладают пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, и имеют геном, в который были вставлены три следующие ДНК-суб-конструкции (А), (В) и (С), а именно:
(А) первая ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]1-[ALD]1-3' и 5'-[NOXE]0-3', причем указанную первую ДНК-суб-конструкцию вводят в первое местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и первая ДНК-суб-конструкция, содержит;
(i) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALS;
(ii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALD;
(B) вторая ДНК-суб-конструкция 5'-[ALS]1-[ALD]1-3' и 5'-[NOXE]0-3', причем указанную вторую ДНК-суб-конструкцию вводят во второе местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, и вторая ДНК-суб-конструкция содержит:
(i) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALS; и
(ii) одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ALD; и
(C) третья ДНК-суб-конструкция 5'-[NOXE]12-3', указанную третью ДНК-субконструкцию вводят в третье местоположение в геноме указанных рекомбинантных дрожжей, отличное от первого местоположения, куда первая ДНК-суб-конструкция была вставлена, и указанная вторая ДНК-суб-конструкция, содержит;
(iii) двенадцать нуклеиновых кислот, идентичных или отличающихся друг от друга, кодирующих NOXE.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, необходимое снижение активности пируватдекарбоксилазы указанных выше конкретных рекомбинантных дрожжей, может быть получено путем введения, по меньшей мере, в один из генов pdc дрожжей первой ДНК-суб-конструкции и/или второй ДНК-суб-конструкции.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать, по меньшей мере, одну, предпочтительно по меньшей мере, две ДНК-конструкции указанной выше формулы (II), в которой "ген 3" обозначает нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу (или NOXE).
В соответствии с этими конкретными вариантами осуществления, каждая нуклеиновая кислота из гена 1 и гена 2 обязательно означает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS и ALD. В этих вариантах осуществления, присутствует, по меньшей мере, одна копия вставленного ALS и ALD. В вариантах осуществления, в которых только одна конструкция формулы (II), вставлена в геном дрожжей, каждая нуклеиновая кислота из гена 1 и гена 2 обязательно означает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS и ALD, и присутствует одна копия каждой из ALS и ALD. В вариантах осуществления, где набор из двух или более конструкций формулы (II), вставлен в геном дрожжей, каждая нуклеиновая кислота из гена 1 и гена 2 обязательно означает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS и ALD и, по меньшей мере, одна копия каждого из ALS и ALD присутствует в указанном наборе из двух или более ДНК-конструкций формулы (II).
Кроме того, когда указанные рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению содержат, по меньшей мере, две ДНК-конструкции вышеуказанной формулы (II), указанные ДНК-конструкции упомянутой выше формулы (II), могут быть идентичными или разными.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать, по меньшей мере, одну, предпочтительно по меньшей мере, две ДНК-конструкции формулы (IIa), идентичные или разные, где каждая формула (IIa), имеет следующую формулу:
где:
- ген 1, ген 2 и ген 3, "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено выше;
- "х5" обозначает целое число, равное 0 или 1;
- "у1", "у2", "z1" и "z2", независимо друг от друга, представляют собой целое число, равное 0 или 1;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, две ДНК-конструкции формулы (IIa), то "х1", "х2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или разными;
- "пром1" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена 1, указанный пром5 может быть идентичным или отличаться от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 3; и
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию гена 1, указанный терм5 может быть идентичным или отличаться от терм1.
Для большей ясности в отношении характеристик "х5" и "у1", далее в настоящем документе представлены примеры, иллюстрирующие более подробно соответствующие конкретные варианты:
- когда "х5" представляет собой целое число, равное 1, и "у1" представляет собой целое число, равное 0, то это означает, что рассматриваемый ген 1 находится под контролем промотора гена рекомбинантных дрожжей, в который рассматриваемая ДНК-конструкция была вставлена; или
- когда "х5" представляет собой целое число, равное 1, и "у1" представляет собой целое число, равное 1, то это означает, что рассматриваемый ген 1 находится под контролем промотора "пром5". В связи с этим, последовательность промотора эндогенного гена, предпочтительно гена pdc, в который вставлена ДНК-конструкция, устранена, или, по меньшей мере, разрушена, так же как и последовательность его соответствующей кодирующей области.
Дополнительно, что касается, в частности, характеристик "у2" и "z2", далее в настоящем документе представлены примеры, иллюстрирующие более подробно, соответствующие конкретные варианты осуществления (конечно, в указанных далее в настоящем документе примерах, "х3" представляет собой целое число, равное 1 или больше):
- когда "у2" представляет собой целое число, равное 0, то это означает, что рассматриваемый ген 3 находится под контролем промотора гена рекомбинантных дрожжей, в который рассматриваемая ДНК-конструкция была вставлена; или
- когда "у2" представляет собой целое число, равное 1, то это означает, что рассматриваемый ген 3 находится под контролем промотора "пром3". В связи с этим, последовательность промотора эндогенного гена, в который вставлена ДНК-конструкция устранена, или, по меньшей мере, разрушена, также как и последовательность ее соответствующей кодирующей области.
- когда "z2" представляет собой целое число, равное 0, то это означает, что рассматриваемый ген 3 связан с терминатором транскрипции гена рекомбинантных дрожжей, в который рассматриваемая ДНК-конструкция была вставлена; или
- когда "z2" представляет собой целое число, равное 1, то это означает, что рассматриваемый ген 3 связан с терминатором транскрипции "терм3". В связи с этим, последовательность терминатора транскрипции эндогенного гена, в который вставлена ДНК-конструкция, устранена, или, по меньшей мере, разрушена, также как и последовательность ее соответствующей кодирующей области.
Что касается "z1", когда оно присутствует в формулах, описанных в настоящем описании, вышеупомянутое в отношении "z2" применяется mutatis mutandis.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции следующей формулы (IIb):
где:
- ALS, ALD, NOXE, "x1", "x2", "х3", "x5", "y1", "y2", "z1" и " z2" являются такими, как определено выше;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, две ДНК-конструкции формулы (IIb), то "х1", "х2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или разными;
- "пром1" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "пром 2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, причем указанный пром5 может быть идентичным или отличаться от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу; а также
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, указанный терм5 может быть идентичным или отличаться от терм1.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать, по меньшей мере, две ДНК-конструкции формул (II), (IIa) или (IIb), при условии, что все копии нуклеиновой кислоты NOXE расположены на одной из, по меньшей мере, двух ДНК-конструкций формул (II), (IIa) или (IIb).
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по изобретению могут содержать по меньшей мере две, предпочтительно строго две ДНК-конструкции следующих формул (IIc) и (IId):
где:
- ALS, ALD, NOXE, "пром1", "пром2", "пром3", "пром5", "терм1", "терм2", "терм3", "терм5", "х1", "х2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено выше; и
- "х1" к "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" для каждой из формул (IIc) и (IId) могут быть идентичными или разными; и
- "х6" и "х7" представляют собой целые числа от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 12, более конкретно от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4, а еще лучше, равны 3, при условии, что одно из "х6" и "х7" представляет собой 0.
Преимущественно, первый ген 1 в 5'-положении в ДНК-конструкции формулы (I) - (III), предпочтительно представляет собой ген, представленный нуклеиновой кислотой, кодирующей ALS, и, более конкретно, указанный первый ген 1 находится под контролем промотора гена рекомбинантных дрожжей, в которые была вставлена рассматриваемая ДНК-конструкция.
Более конкретно, это означает, что, для ДНК-конструкции формулы (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), "х5" преимущественно представляет собой целое число, равное 1, и "у1" представляет собой целое число, равное 0.
Ввиду сложности вышеуказанных ДНК-конструкций и ДНК-суб-конструкций по настоящему изобретению, следует подчеркнуть, что:
- относительно одной ДНК-конструкции по настоящему изобретению, когда "х1", "х2" и/или "х3" представляют целое число, большее или равное 2, то:
- каждая копия для соответствующей нуклеиновой кислоты из гена 1, гена 2 и/или гена 3 может быть идентичной или разной; и/или
- промоторы и/или терминаторы для каждой копии соответствующей нуклеиновой кислоты среди гена 1, гена 2 и/или гена 3 могут быть идентичными или разными;
- когда рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, две ДНК-конструкции, указанные, по меньшей мере, две ДНК-конструкции могут быть идентичными или разными в отношении:
(i) их общая формула в данной ДНК-конструкции, может быть охарактеризована формулой, выбранной из группы, состоящей из формул (I) - (III);
(ii) значения "х1" - "х3" и "х5" - "х7", "у1", "у2", "z1" и/или "z2";
(iii) характера промотора в отношении одного и того же гена;
(iv) характера терминатора в отношении одного и того же гена; и/или
(v) характера самого по себе гена в том, что ALS, ALD и NOXE могут происходить от организмов, принадлежащих к различным родам как, в частности, далее показано в Табл. 1.
Методы, использованные для реализации ДНК-конструкции, такие как определенные выше, относятся к общим знаниям специалиста в данной области техники.
В связи с этим, специалист в данной области техники может с успехом обратиться к методу, описанному у Shao и др., (Nucleic Acids Research, 2009, т. 37, No. 2: е16) и у Shao и др., (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., т. 517: 203), в конечном счете, лишь с незначительными изменениями, а более конкретно, разработанному далее в настоящем документе после примеров.
СНИЖЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ
Активность эндогенной пируватдекарбоксилазы в дрожжах превращает пируват в ацетальдегид, который затем превращается в этанол или ацетил-СоА через ацетат.
Как было упомянуто выше, настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам со сниженной активностью пируватдекарбоксилазы, в геном которых была вставлена определенная ДНК-конструкция.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи характеризуются тем, что один или более генов, кодирующих эндогенную пируватдекарбоксилазу, может быть выключен.
Активность эндогенной пируватдекарбоксилазы рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению, может быть снижена всеми способами, известными специалисту в данной области техники.
В связи с этим, активность пируватдекарбоксилазы рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению может, например, быть снижена путем (i) разрушения, по меньшей мере, одного гена, кодирующего пируватдекарбоксилазу, путем вставки в указанный, по меньшей мере, один ген, кодирующий пируват-декарбоксилазу, по меньшей мере, одной экзогенной ДНК-конструкции, способами, известными специалисту в данной области техники, (ii) мутациями в регуляторных областях, снижающими транскрипцию пируватдекарбоксилазы, (iii) мутациями в старт-кодоне, в частности, путем замены AUG на GUG, и (iv) мутациями в кодирующих последовательностях, изменяющими активность, (v) мутациями, вставками или делециями в кодирующую последовательность, изменяющими стабильность белка, (vi) мутациями, изменяющими время полужизни мРНК пируватдекарбоксилазы.
Что касается первого варианта (i), ДНК-конструкцией, используемой для разрушения рассматриваемого гена pdc, может быть экзогенная ДНК-конструкция, отличающаяся от ДНК-конструкций по изобретению, описанных выше, ДНК-конструкция по изобретению, или их комбинации.
Кроме того, и как упомянуто выше, каждая из ДНК-конструкций по настоящему изобретению формулы (I) и (II), состоит из двух или больше ДНК-субконструкций.
Таким образом, в соответствии с конкретным вариантом реализации, активность пируватдекарбоксилазы рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению, может быть снижена путем разрушения, по меньшей мере, одного гена, кодирующего пируватдекарбоксилазу, путем вставки в указанный ген только, по меньшей мере, одной ДНК-суб-конструкции, по меньшей мере, одной ДНК-конструкции по изобретению формулы (I) и (II).
Предпочтительно активность эндогенной пируватдекарбоксилазы может быть снижена путем разрушения по меньшей мере одного гена pdc.
В самом деле, дрожжи могут иметь один или более генов, кодирующих пируватдекарбоксилазу. Например, есть один ген, кодирующий пируватдекарбоксилазу у Kluyveromyces lactis, в то время как у Saccharomyces cerevisiae есть три изофермента пируватдекарбоксилазы, кодируемые генами PDC1, PCD5 и PDC6, а также регуляторный ген PDC2 пируватдекарбоксилазы.
Предпочтительно и, как определено далее в настоящем документе, рекомбинантными дрожжами по изобретению могут быть рекомбинантные дрожжи рода Saccharomyces и, предпочтительно рекомбинантные дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae.
В связи с этим, и согласно первому варианту, активность пируватдекарбоксилазы может быть снижена путем разрушения, по меньшей мере, одного гена pdc, предпочтительно по меньшей мере, двух генов pdc, и, более конкретно, только двух генов pdc.
Дополнительно, разрушенный ген(ы) pdc может быть выбран из группы, состоящей из pdc1, pdc5, pdc6 и их смеси, и, предпочтительно из pdc1 и pdc6.
Предпочтительно если рекомбинантные дрожжи принадлежат к роду Saccharomyces, то активность пируватдекарбоксилазы может быть снижена путем разрушения по меньшей мере двух генов pdc, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из pdc1, pdc5, pdc6, и их комбинации, и, более конкретно, из группы, состоящей из pdc1 и pdc6.
Действительно, разрушение трех генов pdc в роде Saccharomyces, предпочтительно виде Saccharomyces cerevisiae, резко снижает рост штамма, что делает его несовместимым с любым промышленным применением.
Согласно конкретному варианту, в роде Saccharomyces, предпочтительно виде Saccharomyces cerevisiae, только гены pdc1 и pdc6 разрушены и экспрессия pdc5 ослаблена.
Способ, используемый для ослабления экспрессии специфического гена, относится к общим знаниям специалиста данной области техники.
В связи с этим, специалист в данной области техники может с успехом обратиться к любому способу, который хорошо известен в данной области техники.
Преимущественно, для ослабления экспрессии pdc 5, его транскрипция, может быть помещена под контроль слабого промотора, особенно, такого как RPLA1, URA3, МЕТ25, HIS3, TRP1, GAP1, NUP57 или TFC1, предпочтительно RPLA1 (=последовательность SEQ ID NO 37).
Метод, используемый для измерения уровня активности пируватдекарбоксилазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области техники.
В связи с этим, специалист в данной области техники может с успехом обратиться к методу, описанному Wang и др., (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).
АЦЕТОЛАКТАТСИНТАЗА
Фермент ацетолактатсинтаза (ALS), (также известный как ацетогидроксикислотсинтаза (AHAS), α-ацетогидроксикислотсинтетаза, α-ацетогидроксикислотсинтаза, α-ацетолактатсинтаза, α-ацетолактатсинтетаза, ацетогидроксикислотсинтетаза, ацетогидроксикислотсинтаза, ацетолактатпируватлиаза (карбоксилирующая), ацетолактатсинтетаза представляет собой белок, который катализирует первую стадию в синтезе аминокислот с разветвленной цепью (валин, лейцин и изолейцин).
ALS является ферментом, специфически участвующим в химической реакции, включающей превращение двух молекул пирувата в молекулу ацетолактата и молекулу диоксида углерода. Реакция использует тиаминпирофосфат для того, чтобы связать две молекулы пирувата.
Метод, используемый для измерения уровня активности ацетолактатсинтазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области техники.
В этом отношении, специалист в данной области техники, может с успехом обратиться к методу, описанному у Poulsen и др., (Eur. J. Biochem. 185, 1989: 433-439).
Предпочтительная ацетолактатсинтаза в настоящем изобретении, известна под номером ЕС 2.2.1.6.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, нуклеиновая кислота(ы), кодирующая ацетолактатсинтазу или ALS, может быть нуклеиновой кислотой (ми), предпочтительно выбранной из группы, включающей Bacillus subtilis, Nicotiana tabacum, Paenibacillus polymyxa и их смесь, и, предпочтительно Nicotiana tabacum и Paenibacillus polymyxa.
Согласно еще предпочтительному варианту осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей ацетолактатсинтазу или ALS, может быть нуклеиновая кислота(ы), выбранная из группы, состоящей из последовательностей, имеющих, по меньшей мере, 65%, предпочтительно по меньшей мере, 80% идентичность нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая, по меньшей мере, 65% нуклеотидную идентичность с последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновых кислот, имеющих, по меньшей мере, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% нуклеотидную идентичность с указанной последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая, по меньшей мере, 80% идентичность с нуклеотидной последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновых кислот, имеющих, по меньшей мере, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% нуклеотидную идентичность с указанной последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей ацетолактатсинтазу, может быть нуклеиновой кислота(ы), кодирующая аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих, по меньшей мере, 65%, предпочтительно по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 2, 5 и 6.
Как описано в настоящем документе, аминокислотная последовательность, имеющая, по меньшей мере, 65% идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью, включает в себя аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% аминокислотную идентичность с указанной эталонной аминокислотной последовательностью.
Как описано в настоящем документе, аминокислотная последовательность, имеющая, по меньшей мере, 80%-ную идентичность с последовательностью эталонной аминокислоты, включает в себя аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% аминокислотную идентичность с указанной последовательностью эталонной аминокислоты.
Как указано выше, уровень экспрессии ALS в настоящем изобретении, регулируется с помощью, по меньшей мере, одного промотора, и, по меньшей мере, одного терминатора, такого, как определено далее в деталях в настоящем документе, которые присутствуют соответственно в положениях 5' и 3' последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ALS.
АЦЕТОЛАКТАТДЕКАРБОКСИЛАЗА
Фермент ацетолактатдекарбоксилаза (также известный как α-ацетолактатдекарбоксилаза, (S)-2-гидрокси-2-метил-3-оксобутаноаткарбоксилиаза, (S)-2-гидрокси-2-метил-3-оксобутаноаткарбоксилиаза [(R)-2-ацетоин-образующая] или (S)-2-гидрокси-2-метил-3-оксобутаноаткарбоксилиаза [(3R)-3-гидроксибутан-2-он-образующая]) принадлежит к семейству лиаз, в частности карбоксилиаз, которые расщепляют связи углерод-углерод, а также участвуют в метаболизме бутаноата и метаболизме С5-разветвленной двухосновной кислоты.
ALD представляет собой фермент, специфически участвующий в химической реакции, связанной с превращением молекулы α-ацетолактата в молекулу ацетоина и углекислого газа.
Метод, используемый для измерения уровня активности ацетолактатдекарбоксилазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области техники.
В этом отношении, специалист в данной области техники может с успехом обратиться к методу, описанному у Dulieu и др., (Enzyme and Microbial Technology 25, 1999: 537-542).
Предпочтительная ацетолактатдекарбоксилаза в настоящем изобретении, известна под номером ЕС 4.1.1.5.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, может быть нуклеиновая кислота(ы), выбранная из группы, включающей Brevibacillus brevis, Enterobacter aerogenes, Lactococcus lactis, и их смесь, и, предпочтительно Brevibacillus brevis и Enterobacter aerogenes.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, может быть нуклеиновая кислота(ы), выбранная из группы, состоящей из последовательностей, имеющих, по меньшей мере, 36%, предпочтительно по меньшей мере, 80%, идентичность нуклеиновой кислоты с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 7, 9 и 11.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая, по меньшей мере, 36%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты включает последовательности нуклеиновых кислот, имеющих, по меньшей мере, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% нуклеотидную идентичность с указанной последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу может быть нуклеиновая кислота(ы), кодирующая аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 36%, предпочтительно по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 8, 10 и 12.
Как описано в настоящем документе, аминокислотная последовательность, имеющая, по меньшей мере, 36% аминокислотную идентичность с последовательностью эталонной аминокислоты, включает в себя аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% аминокислотную идентичность с указанной эталонной аминокислотной последовательностью.
Как указано выше, уровень экспрессии ALD в настоящем изобретении, регулируют по меньшей мере одним промотором, и по меньшей мере одним терминатором, таким, как определено далее в настоящем документе более подробно, которые присутствуют соответственно в положениях 5' и 3' последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ALD.
NADH-ОКСИДАЗА
Инактивация или снижение активности по меньшей мере одного гена pdc инактивирует или ослабляет путь ферментации этанола в дрожжах. В результате, это вызывает состояние нарушения окислительно-восстановительного равновесия, которое не устраняется путем экспрессии ALS и ALD. Действительно, путь от глюкозы до 2 пируватов генерирует 2 NADH-эквивалента, в то время как преобразование 2 пируватов в ацетоин не перерабатывает NADH в NAD+ (Фиг. 1).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что фермент бактериальная водообразующая NADH-оксидаза (также называемая в настоящем документе NOXE-оксидаза или NOXE), при определенном уровне экспрессии, может не только обеспечить уравновешивание окислительно-восстановительного состояния, которое обеспечивает усиление устойчивости этого штамма, но и обеспечивает усиление роста этого штамма и дальнейшее увеличение выхода ацетоина.
Бактериальная, водобразующая NADH-оксидаза представляет собой фермент, который катализирует следующую реакцию:
Предпочтительная водообразующая NADH-оксидаза в настоящем изобретении известна под номером ЕС 1.6.3.1 и 1.6.99.3 (также известна как NAD(P)H-оксидаза (Н(2)O(2) образующая), двойная оксидаза, NAD(P)H-оксидаза, ThOX, ТНОХ2, тиреоидная NADPH оксидаза, тиреоидная оксидаза, тиреоидная оксидаза 2 для ЕС 1.6.3.1 и NADH-дегидрогеназа, Бета-NADH-дегидрогеназа-динуклеотид, цитохром С редуктаза, диафораза, дигидрокодегидрогеназа I дегидрогеназа, дигидроникотинамидадениндинуклеотид дегидрогеназа, дифосфопириназа, DPNH-диафораза, NADH-диафораза, NADH-гидрогеназа, NADH-оксидоредуктаза, NADH-менадион-оксидоредуктаза, NADH:Цитохром С оксидоредуктаза, восстановленная дифосфопиридиннуклеотид диафораза, дегидрогеназа типа 1, дегидрогеназа типа I для ЕС 1.6.99.3).
Водообразующая NADH-оксидаза, которая может быть рассмотрена в настоящем изобретении, в частности, описана в публикации WO 2006/134277.
Метод, используемый для измерения уровня активности NADH-оксидазы в соответствии с настоящим изобретением, относится к общим знаниям специалиста в данной области техники.
В этом направлении, специалист в данной области техники может с успехом обратиться к методу, описанному у Lopez DE FELIPE и др., (International Daily Journal, 2001, т. 11: 37-44 (ISSN 0958-6946)).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей NADH-оксидазу или NOXE, может быть нуклеиновая кислота(ы), выбранная из группы, включающей Streptococcus pneumoniae, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus brevis и их смесь, и, предпочтительно Streptococcus pneumoniae.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей NADH-оксидазу или NOXE, может быть нуклеиновая кислота(ы), выбранная из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 78%, предпочтительно по меньшей мере 80%, идентичность нуклеиновой кислоты с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 21, 23, 25 и 27.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 78% нуклеотидную идентичность с последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновых кислот, имеющие по меньшей мере 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% нуклеотидную идентичность с указанной последовательностью эталонной нуклеиновой кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления, нуклеиновой кислотой(ми), кодирующей NADH-оксидазу может быть нуклеиновая кислота(ы), кодирующая аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 78%, предпочтительно по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 22, 24, 26 и 28.
Как описано в настоящем документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 78% аминокислотную идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью, включает в себя аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% аминокислотную идентичность с указанной эталонной аминокислотной последовательностью.
Как указано выше, уровень экспрессии NADH-оксидазы в настоящем изобретении, регулируется по меньшей мере одним промотором, и, по меньшей мере, одним терминатором, такими, как определено более подробно далее в настоящем документе, которые присутствуют соответственно в положениях 5'- и 3'- последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей NADH-оксидазу.
Кроме того, вышеуказанные предпочтительные технические эффекты связаны с уровнем экспрессии указанной NADH-оксидазы. В самом деле, и, как следует из приведенных ниже примеров, не только простое присутствие NADH-оксидазы является важным, но и уровень экспрессии NADH-оксидазы имеет также исключительную важность для получения ацетоина.
Как указано выше, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению обладают пониженной активностью пируватдекарбоксилазы, и в их геном была вставлена, в частности, одна или больше копий нуклеиновой кислоты, кодирующей NADH-оксидазу или NOXE.
В связи с этим, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут включать, в частности, от 1 до 20 копий нуклеиновой кислоты, кодирующей NADH-оксидазу.
Предпочтительно рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут содержать от 1 до 12, в частности, от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4, а еще лучше, 3 копии нуклеиновой кислоты, кодирующей NADH-оксидазу.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, ДНК-конструкция(и) формулы (I) - (III), содержащая, по меньшей мере, ген(ы) NOXE, может быть вставлена в эндогенный ген URA3 указанных рекомбинантный дрожжей.
С учетом вышеизложенного, каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу находится под контролем промотора и терминатора, с тем, чтобы избежать нежелательной регуляции, в частности, такой, как определено далее в настоящем документе.
ПРОМОТОР
По очевидным причинам, каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, находится под контролем промоторов, идентичных или разных.
Указанные промоторы, идентичные или разные, обеспечивающие конститутивную сверхэкспрессию данного гена, можно найти в литературе (Velculescu и др., (1997) Cell 88, 243-251).
Промоторы, наиболее интересные в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:
- pADH1 из гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу (ген ADH1 = последовательность SEQ ID NO 32),
- pTDH3 из гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (ген TDH3 = последовательность SEQ ID NO 39),
- pTEF2.KI из гена, кодирующего трансляционный фактор элонгации EF-1 альфа (ген TEF2=последовательность SEQ ID NO 30),
- pGPM1 из гена, кодирующего глицератфосфомутазу (ген GPM1 = последовательность SEQ ID NO 33),
- pPDC1 из гена, кодирующего пируватдекарбоксилазу (ген PDC1 = последовательность SEQ ID NO 35),
- pENO2 из гена, кодирующего энолазу II (ген ENO2 = последовательность SEQ ID NO 29),
- pTEF3 из гена, кодирующего гамма-субъединицу трансляционного фактора элонгации eEF1B (ген TEF3 = последовательность SEQ ID NO 31),
- pFBA1 из гена, кодирующего фруктозо-1,6-дифосфат альдолазу II (ген FBA1 = последовательность SEQ ID NO 34),
- pPGK1 из гена, кодирующего 3-фосфоглицераткиназу (ген PGK1 = последовательность SEQ ID NO 36),
- pPYK1 из гена, кодирующего пируват-киназу (ген PYK1=последовательность SEQ ID NO 49),
- pTPI1 из гена, кодирующего триозофосфатизомеразу (ген TPI1 = последовательность SEQ ID NO 50), или
- pTEF1 из гена, кодирующего трансляционный фактор элонгации EF-1 альфа (ген TEF1 = последовательность SEQ ID NO 38).
Кроме того, гомологичные промоторы из других близкородственных дрожжей могут быть также использованы в качестве промоторов дрожжей из рода Saccharomyces, или дрожжей из других родов, таких как Candida, Debaryomyces, Pichia или Kluveromyces.
Также могут быть использованы синтетические промоторы, как описано у Blazeck и Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58.
Более конкретно, указанные промоторы, идентичные или разные, могут быть, предпочтительно охарактеризованы последовательностью нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновой кислоты с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 29-39, 49 и 50.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, находится под контролем терминаторов транскрипции, идентичных или разных, указанные терминаторы транскрипции характеризуются последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновой кислоты с последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 40-48.
ТЕРМИНАТОР
По очевидным причинам, каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, связана с терминатором транскрипции (который также может быть назван "терминатор" в данном документе), идентичным или разным.
Указанные терминаторы транскрипции, идентичные или разные, можно найти в литературе Yamanishi и др., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.
Терминаторы, наиболее интересные в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:
- tTPI1 из гена, кодирующего триозофосфатизомеразу (ген ТРI1 = последовательность SEQ ID NO 44),
- tMET25 из гена, кодирующего О-ацетил гомосерин-О-ацетил-серин сульфидрилазу (ген МЕТ25 = последовательность SEQ ID NO 45),
- tADH1 из гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу (ген ADH1 = последовательность SEQ ID NO 43),
- tENO2 из гена, кодирующего энолазу II (ген ENO2 = последовательность SEQ ID NO 46),
- tTDH2 из гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, изофермент 2 (ген TDH2 = последовательность SEQ ID NO 40),
- tPGK1 из гена, кодирующего 3-фосфоглицераткиназу (PGK1 ген = последовательность SEQ ID NO 48),
- tCYC1 (= последовательность SEQ ID NO 41),
- tMET3 (= последовательность SEQ ID NO 47), и
- tTDH3 (= последовательность SEQ ID NO 42), и
- tDIT1 (= последовательность SEQ ID NO 43).
Более конкретно, указанный терминатор, идентичный или разный, может быть предпочтительно охарактеризван последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 32-40 и 43.
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ДРОЖЖИ
Как правило, дрожжи могут быстро расти, и могут быть выращены при более высокой плотности по сравнению с бактериями, и не требуют асептической среды в промышленных условиях. Кроме того, клетки дрожжей могут быть более легко отделены от культуральной среды по сравнению с бактериальными клетками, что значительно упрощает процесс экстракции и очистки продукта.
Предпочтительно дрожжи по изобретению, могут быть выбраны среди родов Saccharomyces, CandidaAshbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus или Malassezia.
Более предпочтительно дрожжи могут быть Крэбтри-положительными дрожжами рода Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces, или Brettanomycces.
Более предпочтительно дрожжи могут быть из видов Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus или Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa, Torulaspora glabrata.
Более предпочтительно рекомбинантные дрожжи могут принадлежать к роду Saccharomyces, и предпочтительно к виду Saccharomyces cerevisiae.
Как указано выше, рекомбинантные дрожжи по изобретению обладают активностью пируватдекарбоксилазы, которая снижена путем вставки, по меньшей мере, одной ДНК-конструкции(й), выбранной из группы, включающей формулы (I)-(III), и предпочтительно по меньшей мере, одной из указанных ДНК-конструкций, содержащих только, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую ALS и или ALD.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантными дрожжами могут быть рекомбинантные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, и активность пируватдекарбоксилазы снижена в результате разрушения только двух генов pdc. Более предпочтительно разрушенный ген(ы) pdc может быть выбран из группы, состоящей из pdc1, pdc5, pdc6 и их смеси, и предпочтительно из pdc1 и pdc6.
Способы, используемые для вставки специфической ДНК-конструкции в ген, и, более конкретно, ген пируватдекарбоксилазы, относятся к общим знаниям специалиста в данной области техники. Похожий способ описан более подробно далее в настоящем документе, после примеров.
НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Преимущественно, нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают из ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.LI, ALD.Ea, NOXE.spn, NOXE. LI и их смесей.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы тем, что они принадлежит к роду Saccharomyces, в частности виду Saccharomyces cerevisiae, в которых активность эндогенной пируватдекарбоксилазы снижена путем разрушения, по меньшей мере, двух генов pdc, в частности, путем разрушения генов pdc 1 и pdc 6, где:
- один из генов pdc, предпочтительно ген pdc 1, разрушен путем вставки ДНК-конструкции формулы (IIe), приведенной ниже:
- по меньшей мере, другой ген pdc, отличный от указанного выше разрушенного гена pdc, и, предпочтительно ген pdc 6, разрушен путем вставки ДНК-конструкции формулы (IIf') ниже:
и где ДНК-конструкция следующей формулы (IIf"):
вставлена в ген URA3,
где:
- пром1, пром2, пром3, пром5, терм1, терм2, терм3, терм5, "у1", "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено выше и ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.LI, ALD.Ea и NOXE.LI являются такими, как определено далее в Табл. 1,
- каждое из "х1", "х2" и "х3" независимо друг от друга представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10, более предпочтительно от 0 до 3, и, в частности, равное 1;
- "х3" представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 12, более конкретно от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4, а еще лучше, равное 3,
при условии, что указанные рекомбинантные дрожжи содержат, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую каждую ALS, ALD и NOXE, и, более конкретно, при условии, что каждая ДНК-конструкция формулы (IIe) and (IIf') включает в себя по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую каждую ALS и ALD.
С учетом вышеизложенного, и, несмотря на то, что это неявно раскрыто, это указывает, что между каждой формулой (IIe) и (IIf'):
- "х1" - "х3", "х5","у1", "у2", "z1" и "z2"; и/или
- промотор и/или терминатор для каждой копии нуклеиновой кислоты для рассматриваемого гена, могут быть идентичными или разными.
В соответствии с конкретным предпочтительным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по настоящему изобретеню могут быть охарактеризованы тем, что они принадлежат к роду Saccharomyces, в частности виду Saccharomyces cerevisiae, где активность эндогенной пируватдекарбоксилазы снижена путем разрушения, по меньшей мере двух из генов pdc, в частности, путем разрушения генов pdc 1 и pdc 6, где:
- один из генов pdc, предпочтительно ген pdc 1, разрушен путем вставки ДНК-конструкции формулы (IIg), приведенной ниже:
- по меньшей мере, другой ген pdc, отличный от упомянутого выше разрушенного гена pdc, и, предпочтительно ген pdc 6, разрушен путем вставки ДНК-конструкции формулы (IIh') ниже:
и где ДНК-конструкция следующей формулы (IIh"):
вставлена в ген URA3,
где:
- ген "ALS.Bs" ДНК-конструкции формулы (IIg) находится под контролем промотора гена pdc, где указанная ДНК-конструкция формулы (IIg) вставлена,
- pENO2, pADH1, pTDH3, tTDH2, tCYC1, tDPI1, tMET25 и tPGK1 являются такими, как определено в настоящем описании, и, более конкретно, в нижеприведенном списке последовательностей,
- ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.LI, ALD.Ea и NOXE. LI являются такими, как определено в Табл. 1 и, более конкретно, в приведенном ниже списке последовательностей.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, рекомбинантные дрожжи по изобретению, могут быть дополнительно модифицированы с целью оптимизации получения ацетоина.
Использование альтернативных источников сахара:
Прямое использование альтернативного источника сахара, такого как крахмал, в дальнейшем требует сверхэкспрессии в дрожжах экзогенной α-амилазы и глюкоамилазы (Buscke и др., Biosource technology, 2013).
Импорт сахара - улучшение импорта С5-сахаров
Импорт пентоз с помощью рекомбинантного микроорганизма является серьезной проблемой для промышленного процесса, поскольку С5-сахара являются основными составляющими гидролизованной лигноцеллюлозной биомассы. Природные штаммы S. cerevisiae, как и многие другие виды дрожжей, не могут использовать ксилозу или арабинозу в качестве ферментативных субстратов (Hahn-Hagerdal и др., 2007; Jin и др., 2004). Интересно, что они способны поглощать ксилозу, даже если сахар не является природным субстратом (Hamacher и др., 2002).
S.cerevisiae, GAL2, НХТ1, НХТ2, НХТ4, НХТ5 и НХТ7 катализируют поглощение ксилозы, потому что они имеют широкую субстратную специфичность (Hamacher и др., 2002; Saloheimo и др., 2007; Sedlak и Но 2004). Тем не менее, их сродство к ксилозе значительно ниже, чем сродство к глюкозе и поглощение ксилозы переносчиками сильно ингибировано глюкозой (Saloheimo и др., 2007).
Необходимы несколько изменений для получения штамма, способного расти и потреблять ксилозу и/или арабинозу. Эти различные модификации являются частью настоящего изобретения.
Сверхэкспрессия гетерологичных переносчиков ксилозы
Для улучшения поглощения ксилозы и арабинозы, рекомбинантный штамм-производитель ацетоина должен быть изменен, чтобы экспрессировать гетерологичные гены, кодирующие переносчики ксилозы или арабинозы. Например, гены GXF1, SUT1 и AT5g59250 из Candida intermedia, Pichia stipitis и Arabidopsis thaliana, соответственно, сверхэкспрессированы для улучшения использования ксилозы дрожжами (Runquist и др., 2010).
Сверхэкспрессия путей, участвующих в метаболизме ксилозы и арабинозы
Штаммы дрожжей способны поглощать ксилозу, даже если сахар не является естественным субстратом. Даже если гены для ассимиляции ксилозы присутствуют в S.cerevisiae, они не экспрессируются на достаточном уровне, чтобы обеспечить существенное усвоение сахара. Таким образом, необходимы генетические модификации для улучшения усвоения пентозных сахаров. Все ферменты, которые обеспечивают превращение ксилозы или арабинозы в ксилитол, должны быть улучшены, также как и ферменты, которые перерабатывают ксилит в ксилулозу, и ксилозу в ксилозу-5-фосфат. Либо, гомологичные гены из метаболических путей ксилозы и арабинозы должны быть сверхэкспрессированы, или гетерологичные гены из бактерий должны быть сверхэкспрессированы.
В одном из вариантов осуществления изобретения, поглощение ксилозы и ее усвоение штаммом улучшают путем сверхэкспрессии, например:
1) генов XYL1 или GRE3, кодирующих альдолаза-редуктазу P. stipitis и S. Cerevisiae, соответственно, связаных со сверхэкспрессией XYL2, кодирующего ксилитолдегидрогеназу из P. stipitis, в сочетании со сверхэкспрессией генов XKS 1 или XYL3, кодирующиих ксилулокиназу из S. cerevisiae и P. stipitis, соответственно,
2) гена xylA, кодирующего ксилозоизомеразу из бактерий или Piromyces, связанного со сверхэкспрессией генов XKS1 или XYL3, кодирующих ксилулокиназу из S.cerevisiae и P. Stipitis, соответственно.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, поглощение арабинозы и ее усвоение штаммом, улучшают путем сверхэкспрессии, например:
1) гомологичных генов XYL1 или GRE3, кодирующих альдолаза-редуктазу P. stipitis и S.cerevisiae, соответственно, связаных с ladl, кодирующим L-арабинитол 4-гидрогеназу и Ixrl, кодирующим L-ксилулозредуктазу из Trichoderma reesei, в комбинации со сверхэкспрессией XYL2, кодирующего ксилитолдегидрогеназу из P. stipitis, а кроме того, сверхэкспрессией генов XKS1 или XYL 3, кодирующих ксилулокиназу из S.cerevisiae и P. stipitis, соответственно,
2) гетерологичных генов araA и araB, кодирующих бактериальную арабинозоизомеразу и рибулозокиназу.
Оптимизация пентозофосфатного пути
Она может быть осуществлена путем сверхэкспресии по меньшей мере одного гена, принадлежащего к неокислительному пентозофосфатному пути; TALI, TKL1, RKL1 и RPE1 из штамма дрожжей.
Оптимизация доступности NAPDH-кофакторов, требуемых ферментами, участвующими в метаболизме С5-сахаров.
Она может быть осуществлена путем экспрессии трансгидрогеназ Е. coli в штамме дрожжей. Гены udhA или pntAB из E.coli будут сверхэкспрессированы в штамме-производителе.
Предотвращение потребления глюкозы для синтеза глицерина:
Это может быть осуществлено путем разрушения гена GPD1, кодирующего глицерол-3-фосфат-дегидрогеназу ЕС 1.1.1.8. (GPDH).
Настоящее изобретение в соответствии с этим вариантом осуществления интересно, особенно, с учетом выхода ацетоина, несмотря на то, что разрушение гена GPD1 приводит к прекращению активности фермента, который потребляет NADH в пользу NAD. Для уравновешивания редокс-дисбаланса, сформированного таким образом, штамм с разрушенным GPD1, может потребовать дополнительной экспрессии NOXE.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, рекомбинантный штамм по настоящему изобретению является таким, что он не включает в себя какой-либо генетической модификации(ий), которая имеет эффект снижения репрессии глюкозы, как это раскрыто в публикации WO 2011/041426 или Kim и др., (Bioresource Technology, т. 146, 2013: 274).
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, рекомбинантный штамм по настоящему изобретению является таким, что он не включает в себя какой-либо генетической модификации(ий) для обеспечения экспрессии любых путей ассимиляции ксилозы, как описано у Kim и др., (Journal of Biotechnology, 2014).
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Настоящее изобретение также относится к применению рекомбинантных дрожжей, таких, как определено выше, для получения ацетоина и/или его производных, в частности, метилвинилкетона (MVK).
Настоящее изобретение, дополнительно, относится к способу получения ацетоина, включающему следующие стадии:
- предоставление рекомбинантного микроорганизма, описанного выше, культивирование рекомбинантного микроорганизма в культуральной среде, содержащей источник углерода, и
- выделение ацетоина.
Как правило, микроорганизмы по данному изобретению выращивают при температуре в диапазоне от, приблизительно, 20°С до, приблизительно, 37°С, предпочтительно при температуре в диапазоне от 27°С до 34°С, в соответствующей культуральной среде.
Когда рекомбинантные дрожжи по изобретению относятся к виду S.cerevisiae, температура может, предпочтительно составлять от 27°С до 34°С в соответствующей культуральной среде.
Подходящими культуральными средами для дрожжей являются обычные, коммерчески доступные среды, такие как жидкая питательная среда, которая включает основу азотного агара для дрожжей, сульфат аммония и декстрозу в качестве источника энергии/углерода или среда YPD, смесь пептона, дрожжевого экстракта, и декстрозы в оптимальных пропорциях для наибольшего роста дрожжей.
Другие определенные или синтетические культуральные среды также могут быть использованы, и подходящая культуральная среда для роста конкретного микроорганизма будет известна специалисту в области микробиологии или ферментации.
Термин "соответствующая культуральная среда" определен выше.
Примеры известных культуральных сред для рекомбинантных дрожжей по настоящему изобретению, известны специалистам в данной области техники, и представлены в следующей публикации D. Burke и др., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
Подходящие диапазоны pH для ферментации могут быть от рН 3,0 до рН 7,5, где диапазон от рН 4,5 до рН 6,5 предпочтителен в качестве начального условия.
Ферментации могут быть проведены в аэробных условиях или микроаэробных условиях.
Количество продукта в ферментационной среде, может быть определено с использованием ряда способов, известных в данной области техники, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или газовой хроматографии (ГХ).
Данный способ может использовать периодический способ ферментации. Классическая периодическая ферментация представляет собой закрытую систему, где состав среды установлен в начале ферментации, и не подлежит искусственным изменениям в процессе ферментации. То есть, в начале ферментации, среду засевают желаемым организмом или организмами, и ферментации позволяют происходить без добавления чего-либо в систему. Тем не менее, как правило, "периодическая" ферментация является периодической в отношении добавления источника углерода, и часто делают попытки контролировать такие факторы, как температура, рН и концентрация кислорода. В системах периодической ферментации, композиции метаболита и биомассы системы постоянно меняются до того момента, когда ферментация остановлена. В периодических культурах клетки проходят через статическую лаг-фазу до логарифмической фазы ускорения роста, и, наконец, до стационарной фазы, где скорость роста снижается или останавливается. При отсутствии вмешательства, клетки в стационарной фазе, в конечном счете, умрут. Клетки в логарифмической фазе, как правило, отвечают за основную часть получения конечного продукта или промежуточного продукта.
Система периодической ферментации с подпитыванием, также может быть использована в настоящем изобретении. Система периодической ферментации с подпитыванием, аналогична системе обычной периодической ферментации, за исключением того, что субстрат источника углерода добавляют поэтапно, по мере прохождения ферментации. Системы периодической ферментации с подпитыванием полезны, когда катаболитная репрессия (например, глюкозный эффект) склонен подавлять метаболизм клеток, и, когда желательно иметь ограниченные количества субстрата в среде. Измерение фактической концентрации субстрата в системах с подпитыванием затруднено и, таким образом, оценивается на основе изменений измеримых факторов, таких как рН, растворенный кислород и парциальное давление отработанных газов, таких как CO2.
Ферментации распространены и хорошо известны в данной области техники, и примеры могут быть найдены у Sunderland и др., (1992), включенного сюда в качестве ссылки. Хотя настоящее изобретение выполняется в периодическом режиме, предполагается, что этот способ адаптируем к непрерывной ферментации.
Непрерывная ферментация представляет собой открытую систему, где определенную ферментационную среду непрерывно добавляют в биореактор, и равное количество кондиционированных сред удаляют одновременно для обработки. Непрерывная ферментация, в целом, поддерживает культуры при постоянной высокой плотности, где клетки изначально находятся логарифмической фазе роста.
Непрерывная ферментация обеспечивает модуляцию одного фактора или любого количества факторов, которые влияют на клеточный рост или концентрацию конечного продукта. Например, один способ будет поддерживать лимитирующее питательное вещество, такое как источник углерода или уровень азота на фиксированном уровне, и позволять варьировать все другие параметры. В других системах, ряд факторов, влияющих на рост, может изменяться непрерывно, в то время как концентрация клеток, измеренная с помощью мутности среды, поддерживается на постоянном уровне. Непрерывные системы стремятся поддерживать условия устойчивого роста и, таким образом, потеря клеток, вследствие отвода среды, должна быть сбалансирована по отношению к скорости роста клеток в процессе ферментации. Способы модуляции питательных веществ и факторов роста для непрерывных процессов ферментации, а также методы для максимизации скорости образования продукта, хорошо известны в области промышленной микробиологии.
Предполагается, что настоящее изобретение может быть реализовано на практике с использованием или периодического, периодического с добавлением субстрата, или непрерывного процесса, и что любой известный способ ферментации будет подходящим. Кроме того, предполагается, что клетки для получения могут быть иммобилизованы на субстрате как на цельноклеточном катализаторе, и подвержены условиям ферментации.
С целью дальнейшего улучшения получения ацетоина, конкретный вариант осуществления изобретения может включать культивирование клеток рекомбинантных дрожжей в соответствующей культуральной среде, такой как указанная выше, где указанная культуральная среда содержит оптимальное количество источника углерода, особенно глюкозы.
Предпочтительно клетки культивируют в такой оптимальной культуральной среде в течение только части полной продолжительности культивирования. В некоторых вариантах осуществления, дрожжевые клетки инкубируют в указанной оптимальной культуральной среде 10 часов или больше после начала культивирования, что включает 11, 12, 13, 14, 15 или 16 часов или более после начала культивирования.
Предпочтительно клетки культивируют в такой оптимальной культуральной среде в течение периода времени от 5 часов до 15 часов, в том числе, от 6 часов до 10 часов, например, 8 часов после начала культивирования.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, источник углерода, включенный в указанную оптимальную культуральную среду, состоит из глюкозы. В предпочтительных вариантах осуществления, указанная оптимальная культуральная среда содержит 12% масс./масс. или больше глюкозы, в том числе 15% масс./масс. или больше глюкозы. В предпочтительных вариантах осуществления, указанная оптимальная культуральная среда содержит не более 40% масс./масс глюкозы, в том числе не более 35% масс./масс. глюкозы.
Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, описанных выше, способ получения ацетоина по настоящему изобретению может дополнительно включать, между стадиями (а) и (с), промежуточную стадию ((b), состоящую из культивирования дрожжевых клеток в указанной оптимальной культуральной среде.
ОЧИСТКА АЦЕТОИНА
В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения, ферментативное получение ацетоина включает стадию выделения ацетоина из культуральной среды. Выделение ацетоина из культуральной среды является обычной задачей для специалиста в данной области техники. Оно может быть осуществлено с помощью ряда методов, хорошо известных в данной области техники, включая, но, не ограничиваясь ими, перегонку, отдувку газом, первапорацию или жидкостную экстракцию. Специалист в данной области техники знает, как адаптировать параметры каждого метода в зависимости от характеристик материала, который надо отделить.
Дрожжи как модель микроорганизма в настоящем изобретении, были сохранены, поскольку у них, синтезированный ацетоин полностью экспортируется за пределы клетки, таким образом, упрощая процесс очистки.
Синтезированный ацетоин может быть собран с помощью перегонки. Перегонка может включать дополнительный компонент, отличный от культуральной среды, с тем, чтобы облегчить выделение ацетоина путем формирования азеотропной смеси и, в частности с водой. Этот дополнительный компонент представляет собой органический растворитель, такой как циклогексан, пентан, бутанол, бензол, толуол, трихлорэтилен, октан, диэтиловый эфир или их смесь.
Отдувку газом осуществляют с помощью отдувочного газа, выбранного из гелия, аргона, диоксида углерода, водорода, азота, или их смеси.
Жидкостную экстракцию осуществляют с органическим растворителем, в качестве гидрофобной фазы, таким как пентан, гексан, гептан, додекан.
Начиная с ацетоина, который продуцируется клетками рекомбинантных дрожжей, описанных в настоящем описании, производные ацетоина, в том числе метилвинилкетон, могут быть получены с помощью различных методов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники.
На протяжении всего описания, включая формулу изобретения, термин "включающий" следует понимать как синоним "включающий, по меньшей мере, один", если не указано иное.
Кроме того, выражение "формулы (I) - (III)", в соответствии с рассматриваемым контекстом и, в отсутствие противоположных указаний, означает ДНК-конструкции формул (I), (II) и (III), а также (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf'), (IIf"), (IIg), (IIh') и/или (IIh").
Термины "между … и …" и "в диапазоне от … до …" следует понимать, как включая пределы, если не указано иное.
Примеры и фигуры, которые следуют ниже, представлены в качестве иллюстрации и не ограничивают объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
а) Протокол получения рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae по изобретению
Все использованные далее в этом документе рекомбинантные штаммы Saccharomyces cerevisiae были получены из стандартного штамма W303 (Thomas и Rothstein (1989), Cell. 56, 619-630) с использованием стандартных методов молекулярной генетики дрожжей (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000), D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).
В этих штаммах, активность пируватдекарбоксилазы снижена путем разрушения, по меньшей мере, одного из генов pdc (pdc1, pdc5, pdc6) или путем замены их когнатного промотора транскрипции слабым промотором.
В наиболее эффективных штаммах, только pdc1 и pdc6 были удалены.
Ряд экзогенных ферментов был экспрессирован в рассматриваемых рекомбинантных штаммах Saccharomyces cerevisiae. Они были выбраны в соответствии с их ферментативными параметрами Михаэлиса-Ментен, при их наличии (см. в настоящем документе после Табл. 1). Высокая kcat (константа скорости ферментативной реакции) для высокой эффективности и разнообразие Km (константа Михаэлиса), чтобы покрыть разные концентрации в субстрате. Ферменты Paenibacillus Polymyxa были выбраны потому, что этот организм является естественным производителем 2,3-бутандиола, продукта непосредственно получаемого из ацетоина. Поэтому он имеет ферменты, которые эффективно катализируют синтез ацетоина.
Номенклатура генов, относящихся к используемым экзогенным ферментам ацетолактатсинтазе, ацетолактатдекарбоксилазе и водо-образующей NADH-оксидазе, показана далее в настоящем документе в Табл. 1.
Эти гены обозначены аббревиатурой фермента с последующей аббревиатурой организма происхождения следующим образом:
Кроме того, для лучшего понимания следующих генотипов:
- ade2, his3, leu2, trp1 и ura3 являются маркерными генами ауксотрофии.
- строчные буквы означают, что рассматриваемый ген неактивен, заглавные буквы обозначают активный ген.
- "::" следующее за названием гена означает, что ген прерван тем, что следует (если более чем один ген, вставлен, они указаны в квадратных скобках []). Прерывание гена сопровождается полной делецией кодирующей последовательности, но сохраняет промотор. Вследствие этого, ген с последующим "::" является неактивным и обозначается строчными буквами. Если не указано конкретно, транскрипция вставленного гена контролируется промотором разрушенного гена.
- "ген.KI" означает, что ген происходит из Kluyveromyces lactis.
- Промоторы транскрипции, обеспечивающие конститутивную сверхэкспрессию данного гена, найдены в литературе (Velculescu и др., (1997) Cell 88, 243-251). Промоторы, используемые в настоящем документе, обозначены "р", а затем названием их когнатного гена. Их соответствующий порядковый номер также упомянут далее.
- Терминаторы транскрипции также помещены после каждого гена. Чтобы избежать нежелательной регуляции, промоторы и терминаторы, обрамляющие один встроенный ген, не были взяты из одного и того же оригинального гена. Терминаторы, используемые в настоящем документе, обозначены "t" с последующим названием их когнатного гена. Далее упоминается их соответствующий порядковый номер.
Кластеры вышеуказанных генов были интегрированы в рекомбинантные дрожжи одновременно, используя способность дрожжей эффективно рекомбинировать свободные концы ДНК, имеющие гомологию последовательности.
Рекомбинантные дрожжи получали в соответствии с опубликованными способами, доступными специалисту в данной области техники. В частности, они могут повторять способ, описанный у Shao и др., (Nucleic Acids Research, 2009, т. 37, No. 2: е16) и Shao и др., (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., т. 517: 203), в конечном счете, только с незначительными изменениями.
Более конкретно, кодирующие последовательности, предназначенные для клонирования, были искусственно синтезированы. Для получения гетерологичных последовательностей (недрожжевых), нуклеиновые последовательности были модифицированы с целью получения синонимичных кодирующих последовательностей, использующих частоту использования кодонов дрожжей.
С использованием рестрикционных ферментов и классического метода клонирования, каждую синтетическую последовательность клонировали между промотором транскрипции и терминатором транскрипции. Каждой последовательности промотора предшествует 50-200 нуклеотидная последовательность, гомологичная последовательности терминатора гена выше по последовательности. Точно так же, за терминатором каждого гена (гена, содержащего промотор - кодирующую последовательность - терминатор) сразу следуют последовательности, гомологичные гену. Так что каждый из блоков, предназначенных для интеграции, имеет 50-200 нуклеотидное перекрывание с блоком выше по последовательностии блоком ниже по последовательности. Для первого блока, промотору предшествуют 50-200 нуклеотидов, гомологичных нуклеотидам дрожжевой хромосомы из локуса, в который он будет интегрирован. Точно так же, для последнего блока, за терминатором следуют 50-200 нуклеотидов, гомологичных нуклеотидам дрожжевой хромосомы из локуса, в который он будет интегрирован.
Каждый блок затем амплифицируют с помощью ПЦР из плазмидных конструкций, с получением X блоков линейной ДНК, имеющей перекрывающиеся последовательности. Один из генов является ауксотрофным маркером, предназначенным для селекции рекомбинантов. Дрожжи трансформируют все линейные фрагменты одновременно, и рекомбинантные дрожжи выбирают по ауксотрофному фенотипу, связанному с использованным маркером. Целостность последовательности затем проверяют с помощью ПЦР и секвенирования.
b) Что касается ALS и ALD ферментов
Ферменты ALS и ALD были оценены не по отдельности, а в парах (ALS+ALD) через выход ацетоина. Три экзогенных ALD и ALS были выбраны в соответствии с их кинетическими параметрами: ALS.Nt, ALS.Pp, ALS.Bs и ALD.Bb, ALD.LI, ALD.Ea (см. выше).
Восемь из девяти возможных комбинаций ALS и ALD были совместно вставлены в хромосому штамма дрожжей ura3 между промоторами и одним терминатором.
Вставка этих двух генов разрушает ген pdc1. Маркерный ген URA3 одновременно вставляют для селекции трансформантов. ALS/ALD комбинацию вставляли в штамм YA747, а именно, производное W303, имеющее следующий генотип:
YA747: МАТ-а, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp, pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3.
Были сконструированы следующие штаммы:
YA768. МАТ-а, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Bs-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
NB: в этом случае ген "ALS.Bs" находится под контролем природного промотора pdc1, а именно промотора pPDC1.
YA769: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA770: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA771: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA772: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.LI-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA773: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.LI-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA810: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA811: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
Все эти штаммы выращивали в течение 24 ч в среде YPA с 8% глюкозы (дрожжевой экстракт 1%, Бактопептон 2%, аденин 0,1 мМ, глюкоза 8%). Они были собраны и содержание ацетоина и этанола определяли в соответствии со стандартными способами, с особенностями адаптированными из Gonzales и др., (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.
Для некоторых штаммов, анализировали несколько клонов, последнее число после "-" это номер клона. Следует отметить, что, так как эндогенный фермент bdh разрушен, 2,3-BDO не продуцируется.
Получение этанола и ацетоина отслеживают в соответствии со стандартными способами и Gonzales и др., (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.
Результаты
В Табл. 2 далее в настоящем документе показано получение ацетоина из вышеуказанных протестированных штаммов.
Из этих результатов можно сделать вывод о том, что, взятые по отдельности, лучшие ферменты для повышения получения ацетоина, представляют собой ALS Рр, ALS Nt, ALD Еа и ALD Bb, который, на самом деле, кажется наиболее эффективным ферментом.
с) Преимущественное техническое действие фермента NOXE на выход ацетоина
Рекомбинантные дрожжи, соответствующие YA1609 были получены.
YA1609: МАТ-а, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2- pENO2-ALD.LI- tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, LEU2.KI], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1, URA3]×12
YA1609-1, YA1609-2 и YA1609-4 представляют собой различные клоны из этого штамма YA1609.
Замечено, что эти рекомбинантные дрожжи всегда имеют природную эндогенную активность ВНН.
Эти штаммы затем анализировали на предмет получения ацетоина в среде YPA с 16% глюкозой (дрожжевой экстракт 1%, Бактопептон 2%, аденин 0,1 мМ, глюкоза 8%) при тех же условиях, которые описаны выше.
Получение этанола и ацетоина отслеживали в соответствии со стандартными способами и Gonzales и др., (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.
Результаты
Результаты представлены в Табл. 3 ниже.
Эти результаты показывают, что присутствие NOXE приводит к очень существенному накоплению ацетоина.
YA1609-4 в настоящее время используют в той же культуральной среде, которая указана выше. Однако, настоящий анализ отличается следующими параметрами:
Среда: 0,5 л YPA, 16% глюкозы.
16 часов после начала культивирования клеток, клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей конечную концентрацию 16% масс/масс, глюкозы в течение периода времени 8 часов.
Перемешивание: 800 оборотов в минуту (2 лопасти), 1,9 мс-1
Температура: 30°С
Воздух: 0,15 л/мин (0,3 об/об/мин)
Затем клетки анализировали на получение ацетоина. Получение этанола и ацетоина отслеживали в соответствии со стандартными способами и Gonzales и др., (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.
Результаты
Результаты представлены в Табл. 4 ниже.
Эти результаты показывают, что рассматриваемые параметры культуры, могут также влиять на получение ацетоина.
d) Другие примеры рекомбинантных дрожжей, производящих ацетоин
Были получены другие рекомбинантные дрожжи, которые описаны ниже.
YA1573-4: МАТ-а, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1-BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1, URA3]×12
YA1609-4: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, LEU2.KI], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1, URA3]×12
YA1661-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1, URA3]×12.
Отмечено, что эти рекомбинантные дрожжи всегда имеют естественную эндогенную активность ВНН.
Эти штаммы затем анализировали на получение ацетоина в среде YPA с 16% глюкозы (дрожжевой экстракт 1%, Бактопептон 2%, аденин 0,1 мМ, глюкоза 8%) при тех же условиях, которые описаны выше.
Получение этанола и ацетоина отслеживали в соответствии со стандартными способами и Gonzales и др. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679.
Результаты
Результаты представлены в Таблице 5 ниже.
Эти результаты Табл. 5 показывают, что присутствие множества нуклеиновых кислот, кодирующих NOXE в рекомбинантных дрожжах, приводит к увеличению накопления ацетоина, по сравнению с рекомбинантными дрожжами, трансформированными одной нуклеиновой кислотой, кодирующей NOXE.
e) Предотвращение превращения ацетоина в 2,3-BDO
По меньшей мере, один ген(ы) из следующих эндогенных генов bdh1, bdh2, adh1, adh3 и/или adh4 может быть инактивирован. В некоторых штаммах маркеры ауксотрофии были вновь введены, чтобы сделать их прототрофами. Все они имеют одинаковые промоторы и терминаторы, как YA1660:
YA1660-2. YA1660-3, YA1660-4, and YA1711-16C: МАТ-а, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, LEU2.KI], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1, URA3]×12.
YA1711-45C: Mat-α, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, LEU2.KI], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1, URA3]×12
YA1711-13A. YA1711-16B: Mat-a, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA1711-19A and YA1711-46A: Mat-α, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA1822-1 and YA1822-2: Mat-α, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1::TRP1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA 1870-10A: Mat-a, adh3::TRP1.KI, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA 1870-11B: Mat-α, adh3::TRP1.KI, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA1870-10B: Mat-α, adh1::TRP1.KI, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA1870-11A: Mat-α, adh1::TRP1.KI, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
YA1870-2A and YA1870-3D: Mat-a, adh1::TRP1.KI, adh3::TRP1.KI, bdh1::LEU2.KI, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-HIS5.Sp-loxP], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.KI-loxP], trp1, ura3::[NOXE.LI-URA3]×12
Все описанные выше штаммы, а также YA1609-4 и YA1661-2 и двойную комбинацию этих штаммов, следует рассматривать в качестве штаммов, обладающих улучшенным выходом ацетоина.
f) Дальнейшие примеры, показывающие предотвращение превращения ацетоина в 2,3-BDO
Штамм YA1711-19A был выращен в ферментере 3l в дрожжевом экстракте 2%, сахарозе, 10%, от 0 до 24 часов, а затем 600 г глюкозы медленно добавляли (30 г/л в течение 20 часов)
Следующие штаммы, все из которых являются штаммами, в которые были введены экзогенные ALS, ALD и NOXE, инкубировали в 500 мл колбах Эрленмейера и встряхивали в течение 24 ч и 48 ч при 30°С в дрожжевом экстракте 2% и сахарозе 30%:
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO 1 (=ADN ALS.Bs)
SEQ ID NO 2 (=Аминокислота ALS.Bs)
SEQ ID NO 3 (=ADN ALS.Nt)
SEQ ID NO 4 (=Аминокислота ALS.Nt)
SEQ ID NO 5 (=ADN ALS.Pp)
SEQ ID NO 6 (=Аминокислота ALS.Pp)
SEQ ID NO 7 (=ADN ALD.Bb)
SEQ ID NO 8 (=Аминокислота ALD.Bb)
SEQ ID NO 9 (=ADN ALD.Ea)
SEQ ID NO 10 (=Аминокислота ALD.Ea)
SEQ ID NO 11 (=ADN ALD.LI)
SEQ ID NO 12 (=Аминокислота ALD.LI)
SEQ ID NO 13 (=ADN NOXE.LI)
SEQ ID NO 14 (=Аминокислота NOXE.LI)
SEQ ID NO 15 (=ADN NOXE.spn)
SEQ ID NO 16 (=Аминокислота NOXE.spn)
SEQ ID NO 17 (=ADN NOXE.Ef)
SEQ ID NO 18 (=Аминокислота NOXE.Ef)
SEQ ID NO 19 (=ADN NOXE.Lb)
SEQ ID NO 20 (=Аминокислота NOXE.Lb)
SEQ ID NO 21 (=pENO2)
SEQ ID NO 22 (=pTEF2.KI)
SEQ ID NO 23 (=pTEF3)
SEQ ID NO 24 (=pADH1)
SEQ ID NO 25 (=pGPM1)
SEQ ID NO 26 (=pFBA1)
SEQ ID NO 27 (=pPDC1)
SEQ ID NO 28 (=pPGK1)
SEQ ID NO 29 (=pRPLA1)
SEQ ID NO 30 (=pTEF1)
SEQ ID NO 31 (=pTDH3)
SEQ ID NO 32 (=tTHD2)
SEQ ID NO 33 (=tCYC1)
SEQ ID NO 34 (=tTDH3)
SEQ ID NO 35 (=tADH1)
SEQ ID NO 36 (=tTPI1)
SEQ ID NO 37 (=tMET25)
SEQ ID NO 38 (=tENO2)
SEQ ID NO 39 (=tMET3)
SEQ ID NO40 (=tPGK1)
SEQ ID NO 41 (=pPYK1)
SEQ ID NO 42 (=pTPI1)
SEQ ID NO 43 (=tDIT1)
SEQ ID NO 44 (=loxP)
SEQ ID NO 45 (=нуклеиновая кислота НАА-1)
SEQ ID NO 46 (=аминокислота HAA-1)
SEQ ID NO 47 (=нуклеиновые кислоты LEU2.KI)
SEQ ID NO 48 (=аминокислота LEU2.KI)
SEQ ID NO 49 (=нуклеиновая кислота His 5)
SEQ ID NO 50 (=аминокислота His 5)
SEQ ID NO 51 (=нуклеиновая кислота Trp1 kI)
SEQ ID NO 52 (=аминокислота Trp1 KI)
Claims (69)
1. Рекомбинантные дрожжи для получения ацетоина, имеющие пониженную активность пируватдекарбоксилазы, в геном которых вставлена:
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу
или ALS,
- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, и
- одна или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих NADH-оксидазу или NOXE,
причем рекомбинантные дрожжи принадлежат к роду Saccharomyces.
2. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают одну или более ДНК-конструкций, выбранных из группы, включающей следующие формулы:
(I) 5'-[ген 1]х1-3' и 5'-[ген 2]х2-3' и 5'-[ген 3]х3-3',
(II) 5'-[ген 1]x1-[ген 2]х2-3' и 5'-[ген 3]х3-3',
(III) 5'-[ген 1]х1-[ген 2]х2-[ген 3]х3-3', и
их комбинацию, где:
- "ген 1" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE;
- "ген 2" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от гена 1;
- "ген 3" обозначает нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, включающей ALS, ALD или NOXE, но отличающуюся от генов 1 и 2;
- "ALS" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатсинтазу;
- "ALD" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетолактатдекарбоксилазу;
- "NOXE" представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу;
- каждое из "х1, "х2" и "х3" независимо друг от друга представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, и,
при условии, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую каждую из ALS, ALD и NOXE.
3. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну ДНК-конструкцию формулы (II), где "ген 3" обозначает нуклеиновую кислоту, кодирующую NADH-оксидазу.
4. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIa), идентичные или отличающиеся, причем каждая формула (IIa) имеет следующую формулу:
(IIa) 5'-[(пром5)y1-ген 1-терм5]x5-[пром1-ген 1-терм1]x1-[пром2-ген 2-(терм2)z1]x2-3' и 5'-[(пром3)y2-ген 3-(терм3)z2]х3-3', где:
- ген 1, ген 2 и ген 3 являются такими, как определено по п. 2 или 3, и "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено по п. 2;
- "х5" представляет собой целое число, равное 0 или 1;
- "у1", "у2", "z1" и "z2", каждое независимо от других представляет собой целое число, равное 0 или 1;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIa), то "х1", "x2", "х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или отличающимися;
- "пром1'' представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена 1, причем указанный пром5 является идентичным или отличающимся от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 1;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 2;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ген 3;
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию гена 1, причем указанный терм5 является идентичным или отличающимся от терм1.
5. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIb), идентичные или отличающиеся, причем каждая формула (IIb) имеет следующую формулу:
(IIb) 5'-[(пром5)y1-ALS-терм5]x5-[пром1-ALS-терм1]x1-[пром2-ALD-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)у2-NOXE-(терм3)z2]x3-3',
где:
- ALS, ALD и NOXE являются такими, как определено по любому из пп. 1-4; "х1'', "х2" и "х3" являются такими, как определено по п. 2; и "х5" и "у1, "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено по п. 4;
- когда указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (IIb), то "х1", "х2", "х3", "х5", "у1, "у2", "z1" и "z2" могут быть идентичными или отличающимися;
- "пром1'' представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "пром2" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "пром3" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу;
- "пром5" представляет собой регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, причем указанный пром5 является идентичным или отличающимся от пром1;
- "терм1" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу;
- "терм2" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатдекарбоксилазу;
- "терм3" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей NADH-оксидазу; и
- "терм5" представляет собой последовательность терминатора транскрипции, который прекращает экспрессию последовательности, кодирующей ацетолактатсинтазу, причем указанный терм5 является идентичным или отличающимся от терм1.
6. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две ДНК-конструкции формулы (II), (IIa) или (IIb), при условии, что все копии нуклеиновой кислоты NOXE расположены в одной из по меньшей мере двух ДНК-конструкций формулы (II), (IIa) или (IIb).
7. Рекомбинантные дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что указанные рекомбинантные дрожжи включают по меньшей мере две, предпочтительно строго две ДНК-конструкции следующих формул (IIc) и (IId):
(IIc) 5'-[(пром5)y1-ALS-терм5]x5-[пром1-ALS-терм1]x1-[пром2-ALD-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)y2-NOXE-(терм3)z2]x6-3'; и
(IId) 5'-[(пром5)y1-ALS-терм5]x5-[пром1-ALS-терм1]x1-[пром2-ALD-(терм2)z1]х2-3' и 5'-[(пром3)y2-NOXE-(терм3)z2]x7-3',
где:
- ALS, ALD и NOXE являются такими как определено по любому из пп. 1-6, "пром1'', "пром2", "пром3", "пром5", "терм1”, "терм2", "терм3" и "терм5" являются такими, как определено по п. 4 или 5; "х1", "х2" и "х3" являются такими, как определено по п. 2; и "х5", "у1, "у2", "z1" и "z2" являются такими, как определено по п. 4;
- "х1''-“х3", "х5", "у1", "у2", "z1" и ''z2" для каждой из формул (IIc) и (IId) являются идентичными или отличающимися; и
- "х6" и "х7" представляют собой целые числа от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 12, более конкретно от 2 до 5, предпочтительно от 3 до 4, а еще лучше равные 3, при условии, что одно из "х6" и "х7" представляет собой 0.
8. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) ацетолактатсинтазу или ALS, представляет/представляют собой нуклеиновую(ые) кислоту(ы), выбранную(ые) из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1, 3 и 5.
9. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, представляет/представляют собой нуклеиновую(ые) кислоту(ы), выбранную(ые) из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 36%, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 7, 9 и 11.
10. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что нуклеиновая кислота(ы), кодирующая(ие) NADH-оксидазу или NOXE, представляет/представляют собой нуклеиновую(ые) кислоту(ы), выбранную(ые) из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 78%, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 21, 23, 25 и 27.
11. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, находится под контролем промотора, идентичного или отличающегося, причем указанные промоторы характеризуются последовательностью нуклеиновых кислот, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 29-39, 49 и 50.
12. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, ацетолактатдекарбоксилазу и NADH-оксидазу, находится под контролем терминатора транскрипции, идентичного или отличающегося, причем указанные терминаторы транскрипции характеризуются последовательностью нуклеиновых кислот, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80% идентичность нуклеиновых кислот с последовательностью нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 40-48.
13. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что активность пируватдекарбоксилазы снижают при помощи разрушения по меньшей мере одного гена pdc.
14. Рекомбинантные дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что активность пируватдекарбоксилазы снижают при помощи разрушения по меньшей мере двух генов pdc, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из pdc1, pdc5, pdc6 и их комбинации, и более конкретно, из группы, состоящей из pdc1 и pdc6.
15. Рекомбинантные дрожжи по п. 13 или 14, отличающиеся тем, что активность пируватдекарбоксилазы снижают при введении по меньшей мере одной ДНК-конструкции(ий), выбранной из группы, включающей формулы (I)-(III), и, предпочтительно по меньшей мере одной из указанных ДНК-конструкции(ий), включающих только по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую ALS и/или ALD.
16. Рекомбинантные дрожжи по любому из пп. 2-14, отличающиеся тем, что ДНК-конструкция(ии), выбранная(ые) из группы, включающей формулы (I)-(III), включающие по меньшей мере ген(ы) NOXE, вставлена/вставлены в эндогенный ген URA3 указанных рекомбинантных дрожжей.
17. Применение рекомбинантных дрожжей, таких как определено по любому из пп. 1-16, для получения ацетоина.
18. Способ получения ацетоина, причем указанный способ включает стадии:
(а) культивирования рекомбинантных дрожжей, таких как определено по любому из пп. 1-16, в подходящей культуральной среде; и
(с) выделения ацетоина.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная культуральная среда включает источник углерода, предпочтительно выбранный из группы, включающей глюкозу и сахарозу.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14306205 | 2014-07-25 | ||
EP14306205.7 | 2014-07-25 | ||
PCT/EP2015/066927 WO2016012561A1 (en) | 2014-07-25 | 2015-07-23 | Method for producing acetoin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017101673A RU2017101673A (ru) | 2018-08-30 |
RU2017101673A3 RU2017101673A3 (ru) | 2018-12-06 |
RU2686614C2 true RU2686614C2 (ru) | 2019-04-29 |
Family
ID=51263347
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017101673A RU2686614C2 (ru) | 2014-07-25 | 2015-07-23 | Способ получения ацетоина |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10301655B2 (ru) |
EP (1) | EP3172313A1 (ru) |
JP (2) | JP6847036B2 (ru) |
KR (1) | KR102281701B1 (ru) |
CN (1) | CN106715679B (ru) |
AU (1) | AU2015293864B2 (ru) |
CA (1) | CA2956184C (ru) |
IL (1) | IL250099B (ru) |
NZ (1) | NZ728287A (ru) |
RU (1) | RU2686614C2 (ru) |
WO (1) | WO2016012561A1 (ru) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106967741B (zh) * | 2017-04-03 | 2020-02-21 | 天津大学 | 一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 |
CN107177620B (zh) * | 2017-06-28 | 2020-12-18 | 南宁中诺生物工程有限责任公司 | 一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法 |
EP3428282A1 (en) * | 2017-07-11 | 2019-01-16 | Alderys | Ectoine-producing yeast |
CN110914434A (zh) * | 2017-07-11 | 2020-03-24 | 安迪苏法国联合股份有限公司 | 苏氨酸生产酵母 |
CN107955805B (zh) * | 2017-12-13 | 2020-03-06 | 江南大学 | 一种稳定性提高的nadh氧化酶及其在乙偶姻生产中的应用 |
WO2019124782A2 (ko) * | 2017-12-20 | 2019-06-27 | 건국대학교 산학협력단 | 에탄올에서 아세토인, 부탄디올 또는 부탄올의 생산방법 |
US11441142B2 (en) | 2017-12-20 | 2022-09-13 | Konkuk University Industrial Cooperation Corporation | FLS variant having increased activity |
CN109370958A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-02-22 | 佛山市海天(高明)调味食品有限公司 | 一株增加酱油中3-羟基-2-丁酮含量的植物乳杆菌及其应用 |
CN110257442A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-09-20 | 苏州凯祥生物科技有限公司 | 一种含混合糖浆香料的特异糖原培养基、制备方法及应用 |
CN116287028A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-06-23 | 天津大学 | 一种生物酶法利用甲醛合成乙偶姻的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU777059A1 (ru) * | 1978-12-06 | 1980-11-07 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Способ выделени ацетоина |
WO2013076144A2 (en) * | 2011-11-21 | 2013-05-30 | Metabolic Explorer | Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2887258B1 (fr) * | 2005-06-17 | 2007-09-21 | Agronomique Inst Nat Rech | Souches de levures saccharomyces transformees presentant une production d'ethanol reduite par fermentation |
WO2007005646A2 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-11 | The University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant host cells and media for ethanol production |
FR2916000B1 (fr) * | 2007-05-07 | 2013-07-05 | Lallemand Sas | Moyens pour reduire l'accumulation d'acetoine dans des milieux de fermentation alcoolique |
AU2010300653B2 (en) * | 2009-09-29 | 2016-01-28 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Improved yeast production host cells |
-
2015
- 2015-07-23 KR KR1020177005199A patent/KR102281701B1/ko active IP Right Grant
- 2015-07-23 WO PCT/EP2015/066927 patent/WO2016012561A1/en active Application Filing
- 2015-07-23 AU AU2015293864A patent/AU2015293864B2/en active Active
- 2015-07-23 US US15/327,207 patent/US10301655B2/en active Active
- 2015-07-23 NZ NZ728287A patent/NZ728287A/en unknown
- 2015-07-23 CA CA2956184A patent/CA2956184C/en active Active
- 2015-07-23 RU RU2017101673A patent/RU2686614C2/ru active
- 2015-07-23 JP JP2017524104A patent/JP6847036B2/ja active Active
- 2015-07-23 CN CN201580052256.XA patent/CN106715679B/zh active Active
- 2015-07-23 EP EP15749744.7A patent/EP3172313A1/en active Pending
-
2017
- 2017-01-15 IL IL250099A patent/IL250099B/en unknown
-
2020
- 2020-08-13 JP JP2020136738A patent/JP2020195384A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU777059A1 (ru) * | 1978-12-06 | 1980-11-07 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Способ выделени ацетоина |
WO2013076144A2 (en) * | 2011-11-21 | 2013-05-30 | Metabolic Explorer | Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LIAN J et.al. Metabolic engineering of a Saccharomyces cerevisiae strain capable of simultaneously utilizing glucose and galactose to produce enantiopure (2R,3R)-butanediol, Metab Eng. 2014 May;23:92-9. doi: 10.1016/j.ymben.2014.02.003. Epub 2014 Feb 10.. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20170041768A (ko) | 2017-04-17 |
RU2017101673A (ru) | 2018-08-30 |
IL250099B (en) | 2021-12-01 |
CA2956184C (en) | 2021-10-19 |
AU2015293864A1 (en) | 2017-02-02 |
JP2017525388A (ja) | 2017-09-07 |
NZ728287A (en) | 2019-01-25 |
AU2015293864B2 (en) | 2019-07-11 |
CN106715679A (zh) | 2017-05-24 |
JP6847036B2 (ja) | 2021-03-24 |
US10301655B2 (en) | 2019-05-28 |
KR102281701B1 (ko) | 2021-07-23 |
WO2016012561A1 (en) | 2016-01-28 |
CN106715679B (zh) | 2021-07-02 |
BR112017001542A2 (pt) | 2018-01-30 |
JP2020195384A (ja) | 2020-12-10 |
RU2017101673A3 (ru) | 2018-12-06 |
EP3172313A1 (en) | 2017-05-31 |
CA2956184A1 (en) | 2016-01-28 |
US20170159081A1 (en) | 2017-06-08 |
IL250099A0 (en) | 2017-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2686614C2 (ru) | Способ получения ацетоина | |
EP2783007B9 (en) | Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol | |
EP3652323B1 (en) | Ectoine-producing yeast | |
CN105492599A (zh) | 乙酸转化提高的甘油和乙酸转化酵母细胞 | |
US12012604B2 (en) | Acetate consuming yeast cell | |
JP5608999B2 (ja) | キシロースを利用して有用物質を生産する方法 | |
KR101616171B1 (ko) | 유기산 제조에서의 모나스쿠스의 용도 | |
CA2920617C (en) | Clostridium acetobutylicum capable of fermenting lignocellulosic hydrolysate to produce butanol | |
US10619174B2 (en) | Microorganism strains for the production of 2.3-butanediol | |
Basso et al. | The future of bioethanol | |
WO2015141705A1 (ja) | 耐酸耐塩性付与方法と耐酸耐塩性酵母を用いた有用物質生産 | |
JP6249391B2 (ja) | キシロースを高温で発酵する方法 | |
BR112017001542B1 (pt) | Levedura recombinante produtora de acetoína, uso desta e método para produzir acetoína | |
BR112017001539B1 (pt) | Levedura recombinante produtora de 2,3-butanodiol, uso desta e método para produzir 2,3-butanodiol | |
WO2022019949A1 (en) | Enzymes and methods for production of malonic acid and derivatives thereof | |
EP3652322A1 (en) | Threonine-producing yeast |