CN116445385A - 一种生产胞二磷胆碱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产胞二磷胆碱的方法，属于基因工程和微生物工程领域。本发明通过基因编辑技术敲除宿主细胞基因组上的dCTP脱氨酶基因dcd、磷酸核苷激酶基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD和/或三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG，并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，并敲除宿主细胞基因组上的肽聚糖糖基转移酶基因mtgA，并将酿酒酵母来源的ScCCT酶进行定点突变提高酶活力，构建获得的重组大肠杆菌的胞二磷胆碱发酵水平可达28.3g/L以上。这种高效的重组菌株可用于实现胞二磷胆碱的工业化生产，利于降低其生产成本及环境污染，实现绿色生物制造。

Description

一种生产胞二磷胆碱的方法
技术领域
本发明涉及一种生产胞二磷胆碱的方法，属于基因工程和微生物工程领域。
背景技术
胞二磷胆碱，又名胞磷胆碱、尼古林、二磷酸胞嘧啶胆碱、胞嘧啶核苷二磷酸胆碱，为核苷衍生物。可改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用。促进卵磷脂生物合成和抗磷脂酶A作用。与蛋白分解酶抑制剂合用，可保护及修复胰腺组织。
目前，胞磷胆碱的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法主要为前期的工业生产路线。化学合成法存在诸多缺点，例如：有毒有机化学试剂的使用、低转化率等，不适于大规模的生产。目前工业生产上主要采用啤酒酿造后产生的酿酒酵母渣，催化胞嘧啶核苷酸CMP和磷酸胆碱，酶法转化生产胞二磷胆碱。CN1944661A披露了一种利用啤酒酵母合成胞二磷胆碱的方法，转化率达65％，产品浓度最高仅达4g/L。但是此种方法的底物价格较为昂贵，同时这种酿造啤酒产生的酿酒酵母没有经过特异性改造与优化，其催化底物胞嘧啶核苷酸CMP和磷酸胆碱生产胞二磷胆碱的效率较低。固定化酵母细胞也被应用于胞二磷胆碱的催化生产(余东生等，无锡轻工大学学报，2002,21(3)：277-280)。CN104774799A披露了一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的工程菌及其构建方法与应用，以乳清酸和磷酸胆碱为底物，添加葡萄糖，发酵生产胞二磷胆碱。但依然存在生产成本较高、转化率较低等问题。CN109207415B披露了一种生产胞二磷胆碱的重组微生物及生产胞二磷胆碱的方法，策略主要包括：敲除了胞二磷胆碱、胆碱、磷酸胆碱、CTP的降解基因，表达了胆碱激酶和胆碱磷酸胞苷酰转移酶，解除了嘧啶核苷途径合成反馈抑制，在5L发酵罐水平胞二磷胆碱达20g/L。但该方法依然存在生产成本较高、转化率较低等问题，主要体现在：发酵过程中使用昂贵的诱导剂IPTG会造成生产成本增加、重组菌中仍存在一些限速步骤会导致胞二磷胆碱偏低、细胞膜透性减低会导致补加的氯化胆碱很难高效进入细胞进而导致转化率偏低等。
胞二磷胆碱的市场需求量正在逐步扩大，存在极大的需求缺口。胞二磷胆碱的高效、高生产强度、低成本的工业化生产已经成为其急需解决的问题。更高效的胞二磷胆碱生产方法，对于提高生产强度、降低生产成本，具有重要意义。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有技术中缺少能够低成本、高转化率、高效生产胞二磷胆碱的重组菌株。
[技术方案]
本发明采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上dCTP脱氨酶基因dcd进行敲除，切断由CTP催化生产UTP的路径，使CTP获得积累；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上磷酸核苷激酶基因ndk进行敲除，切断由CTP催化生产CDP的路径，使CTP获得积累；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上核糖核苷三磷酸还原酶nrdD进行敲除；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG进行敲除，切断由CTP催化生产CMP的路径，使CTP获得积累；并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，促进CTP至胞二磷胆碱的转化，敲除大肠杆菌基因组上的肽聚糖糖基转移酶基因mtgA，并将酿酒酵母来源的ScCCT酶进行突变，将111位的Val氨基酸残基突变为Ala，提高酿酒酵母来源的ScCCT酶活力，可以高效生产胞二磷胆碱，促进其在医药等领域中的应用。
本发明提供一种生产胞二磷胆碱的重组菌，以大肠杆菌为宿主细胞，敲除基因组上的dCTP脱氨酶编码基因dcd、磷酸核苷激酶编码基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD和/或三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG，并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT和胆碱激酶编码基因CKI。
在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA。
在一种实施方式中，所述过量表达为将编码基因CCT和编码基因CKI整合至大肠杆菌基因组上。
在一种实施方式中，所述重组菌在yhdE位点整合编码基因CKI，在poxB位点整合编码编码基因CCT。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌选自MG1655、DH5α、BL21(DE3)、JM109或HB101在一种实施方式中，所述大肠杆菌为MG1655。
在一种实施方式中，所述dCTP脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷酸核苷激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述核糖核苷三磷酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述三磷酸核苷焦磷酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，所述dCTP脱氨酶编码基因dcd的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸核苷激酶编码基因ndk的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一种实施方式中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT的氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(c)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(d)在(a)的基础上将第111位的缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala。
在一种实施方式中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT的核苷酸序列如SEQID NO.9所示或SEQ ID NO.15所示。
在一种实施方式中，所述胆碱激酶编码基因CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，所述肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在一种实施方式中，所述yhdE位点的Gene ID:947753，所述poxB位点的Gene ID:946132。
本发明还提供一种生产胞二磷胆碱的方法，所述方法为将上述重组菌接种至含有碳源的反应体系中发酵。
在一种实施方式中，所述碳源为甘油或葡萄糖。
在一种实施方式中，所述发酵是将上述重组菌接种至含有LB培养基中培育得到种子液；将种子液转接至发酵培养基中，在20-45℃和50-350rpm条件下进行发酵培养，关联溶氧补料，当溶氧高于16-55％时进行补料，采用氨水控制pH维持在6.5-7.5；当发酵至菌浓OD600达30-70时，连续补加氯化胆碱。
在一种实施方式中，发酵培养基为葡萄糖20-90g/L、氯化铁2-10mg/L、MgSO40.5-10g/L、柠檬酸钠1-10mg/L、氯化钙50-150mg/L、磷酸氢二钠1-6g/L、磷酸二氢钠1-5g/L、氯化锌10-50mg/L、酵母粉1-20g/L、蛋白胨1-19g/L、微量元素溶液1-20mL。
在一种实施方式中，所述微量元素溶液含有氯化铜10-30g/L、硫酸锌10-37g/L、钼酸钠10-40g/L。
在一种实施方式中，所述补料采用的补料培养基为葡萄糖500-900g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母粉3-25g/L。
在一种实施方式中，所述氯化胆碱的浓度为0.5～1.5mol/L。
本发明还提供所述重组菌在发酵生产胞二磷胆碱方面的应用。
[有益效果]
本发明采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上dCTP脱氨酶基因dcd进行敲除，切断由CTP催化生产UTP的路径，使CTP获得积累；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上磷酸核苷激酶基因ndk进行敲除，切断由CTP催化生产CDP的路径，使CTP获得积累；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上核糖核苷三磷酸还原酶nrdD进行敲除；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG进行敲除，切断由CTP催化生产CMP的路径，使CTP获得积累；并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，促进CTP至胞二磷胆碱的转化，可以高效生产胞二磷胆碱；采用CRISPR技术敲除大肠杆菌MG1655基因组上肽聚糖糖基转移酶基因mtgA，促进底物氯化胆碱高效进入细胞内，进一步促进胞二磷胆碱的生产；进一步地，将酿酒酵母来源的ScCCT酶进行突变，将111位的Val氨基酸残基突变为Ala，提高酿酒酵母来源的ScCCT酶活力，进一步提高胞二磷胆碱的生产(图1)。
采用本发明提供的敲除大肠杆菌基因组上dCTP脱氨酶基因dcd、磷酸核苷激酶基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶nrdD、三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG；并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI；并敲除大肠杆菌MG1655基因组上肽聚糖糖基转移酶基因mtgA；并将酿酒酵母来源的ScCCT酶进行突变，将111位的Val氨基酸残基突变为Ala，提高酿酒酵母来源的ScCCT酶活力，可以高效生产胞二磷胆碱，产量达到28.3g/L。本发明提供的重组大肠杆菌，能够以葡萄糖为底物，一步发酵得到胞二磷胆碱，发酵上清液中胞二磷胆碱浓度高，便于分离纯化，工艺简单。
附图说明
图1为重组大肠杆菌的构建思路；
图2为dcd基因敲除菌落PCR验证图；
图3为ndK和nrdD基因敲除菌落PCR验证图；
图4为nrdD基因敲除菌落PCR验证图；
图5为为mazG基因敲除菌落PCR验证图；
图6ScCCT、ScCKI基因整合、mtgA基因敲除后PCR验证核酸胶图(a,ScCCT(1，整合前；2，整合后)；b，ScCKI(1，整合后；2，整合前)；c，mtgA(1，敲除后；2，敲除前)；M，标准分子量DNA)；
图7不同菌株的胞二磷胆碱产量(CK，对照菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG；A，E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI；B，E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKIΔmtgA。)；
图8酿酒酵母来源的ScCCT酶及其突变体纯化后SDS-PAGE图(M，标准分子量蛋白；WT，野生酶；1，G110A；2，G110V；3，V111A；4，V110L)；
图9重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::V111A::ScCKIΔmtgA在60L发酵罐中的生产胞二磷胆碱。
具体实施方式
表1下述实施例中涉及的引物
PCR扩增的条件：预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃(酶的延伸速度为1kb/min，具体时间根据扩增片段的长度来设置)；设置循环30次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。
PCR扩增的体系：5×PS buffer 20μL，dNTP 10μL，上游/下游引物(10μmol·L-1)2μL，模板1μL，酶1μL，水66μL。
LB固体培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基：葡萄糖50g/L、氯化铁6.5mg/L、MgSO41.5 g/L、柠檬酸钠6.9mg/L、氯化钙115mg/L、磷酸氢二钠3.6g/L、磷酸二氢钠2.5g/L、氯化锌23mg/L、酵母粉8g/L、蛋白胨6g/L、微量元素溶液8mL；其中，微量元素溶液含有氯化铜17g/L、硫酸锌21g/L、钼酸钠29g/L。
补料培养基：葡萄糖800g/L、蛋白胨8g/L、酵母粉9g/L。
60L发酵罐发酵培养方法：将重组菌株接种至含有LB培养基中培育得到种子液；将种子液按照体积比10％转接至装有25L发酵培养基的60L发酵罐中，在37℃和300rpm条件下进行发酵培养30～33h；关联溶氧补料，当溶氧高于30％时进行补料，采用氨水控制pH维持在7.2；当发酵至菌浓OD600达35时，以260mL/h的流加速度连续补加0.8mol/L氯化胆碱。
HPLC测定胞二磷胆碱的含量：
色谱柱：C185μm 250mm*4.6mm反相柱；流速：l.0mL/min；波长：276nm；进样量；20μL；运行时间：30min。流动相配制：甲醇：磷酸盐缓冲液＝5：95；缓冲液：0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和磷酸四丁基铵溶液(0.01mol/L的四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调pH值4.5)等量混合。
表2分子改造磷酰胆碱胞苷转移酶的相关引物
引物名称 引物序列(5’-3’)
ScCCT-T-FW ATGGCTAACCCGACCACCGGT
ScCCT-T-RS TTAGTTCGCAGACTGTTTTT
G110A-FW TTATGCAGACGCTGTATTCGACCTGT
G110A-RS ACAGGTCGAATACAGCGTCTGCATAA
G110V-FW TTATGCAGACGTTGTATTCGACCTGT
G110V-RS ACAGGTCGAATACAACGTCTGCATAA
V111A-FW TTATGCAGACGGCGCTTTCGACCTGT
V111A-RS ACAGGTCGAAAGCGCCGTCTGCATAA
V110L-FW TTATGCAGACGGCCTTTTCGACCTGT
V110L-RS ACAGGTCGAAAAGGCCGTCTGCATAA
ScCCT-28a-FW CATATGATGGCTAACCCGACCACCGGT
ScCCT-28a-RS GGATCCTTAGTTCGCAGACTGTTTTT
PCR反应体系(50μL)：5μL 10×Buffer、0.5μL模板、0.5μL Ex Taq、5μL dNTPs、下游引物各1μL、加去离子水至50μL。
PCR扩增条件为：95℃4min；94℃30s、55℃30s、72℃4min、29个循环；72℃10min。
实施例1：用于生产胞二磷胆碱的重组大肠杆菌构建
(1)构建重组大肠菌株E.coli MG1655Δdcd
采用基因敲除的手段，敲除大肠杆菌MG1655基因组上的dCTP脱氨酶编码基因dcd(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，dCTP脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，构建重组菌株。
1)采用引物Δdcd-up-FW和Δdcd-up-RS；Δdcd-down-FW和Δdcd-down-RS，以大肠杆菌基因组为模板，通过融合PCR技术获得敲除dCTP脱氨酶编码基因dcd的敲除框Δdcd。
2)以pTargetF为模板，采用引物Sg-dcd-FW和pTarget-RS构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-Δdcd。
3)将质粒pCas转化大肠杆菌MG1655，获得重组大肠杆菌MG1655/pCas。
4)将pTarget-Δdcd和敲除框Δdcd电转化入重组大肠杆菌MG1655/pCas，在含有博来霉素和卡那霉素的抗性LB平板上筛选。
5)将获得的单菌落，采用引物Δdcd-PCR-FW和Δdcd-PCR-RS进行菌落PCR验证，筛选获得的大肠杆菌E.coli MG1655Δdcd。通过PCR获得的条带均比对照菌株小，说明dCTP脱氨酶基因dcd已经敲除，同时将该序列送至测序公司测序验证正确(图2)，并消除质粒pTarget-Δdcd和质粒pCas，构建获得重组菌株E.coli MG1655Δdcd。
(2)构建重组大肠菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndk
在步骤(1)构建的重组菌株E.coli MG1655Δdcd的基础上，采用基因敲除的手段，继续敲除大肠杆菌基因组上的二磷酸核苷激酶编码基因ndk(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，二磷酸核苷激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，构建重组菌株。
1)采用引物Δndk-up-FW和Δndk-up-RS；Δndk-down-FW和Δndk-down-RS，以大肠杆菌基因组为模板，通过融合PCR技术获得敲除二磷酸核苷激酶编码基因ndk的敲除框Δndk。
2)以pTargetF为模板，采用引物Sg-ndk-FW和pTarget-RS，构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-Δndk。
3)将质粒pCas转化E.coli MG1655Δdcd，获得重组大肠杆菌MG1655Δdcd/pCas。
4)将pTarget-Δndk和敲除框Δndk电转化入重组大肠杆菌MG1655Δdcd/pCas，在含有博来霉素和卡那霉素的抗性LB平板上筛选。
5)将获得的单菌落，采用引物Δndk-PCR-FW和Δndk-PCR-RS进行菌落PCR验证，筛选获得的大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndk，通过PCR获得的条带均比对照菌株小，说明二磷酸核苷激酶基因ndk已经敲除，同时将该序列送至测序公司测序验证正确(图3)，并消除质粒，构建获得重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndk。
(3)构建重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdD
在步骤(2)构建的重组菌E.coli MG1655ΔdcdΔndk的基础上，采用基因敲除的手段，继续敲除大肠杆菌基因组上的核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD(核苷酸序列如SEQID NO:5所示，核糖核苷三磷酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)，构建重组菌株。
1)采用引物ΔnrdD-up-FW和ΔnrdD-up-RS；ΔnrdD-down-FW和ΔnrdD-down-RS，以大肠杆菌基因组为模板，通过融合PCR技术获得敲除核糖核苷三磷酸还原酶nrdD的敲除框ΔnrdD。
2)以pTargetF为模板，采用引物Sg-nrdD-FW和pTarget-RS，构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-ΔnrdD。
3)将质粒pCas转化E.coli MG1655ΔdcdΔndk，获得重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndk/pCas。
4)将pTarget-ΔnrdD和敲除框ΔnrdD电转化入重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndk/pCas，在含有博来霉素和卡那霉素的抗性LB平板上筛选。
5)将获得的单菌落，采用引物ΔnrdD-PCR-FW和ΔnrdD-PCR-RS进行菌落PCR验证，筛选获得的大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdD，通过PCR获得的条带均比对照菌株小，说明二磷酸核苷激酶基因nrdD已经敲除，同时将该序列送至测序公司测序验证正确(图4)，并消除质粒，构建获得重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdD。
(4)构建重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG
在步骤(3)构建的重组菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdD的基础上，采用基因敲除的手段，继续敲除大肠杆菌基因组上的三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，三磷酸核苷焦磷酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)，构建重组菌株。
1)采用引物ΔmazG-up-FW和ΔmazG-up-RS；ΔmazG-down-FW和ΔmazG-down-RS，以大肠杆菌基因组为模板，通过融合PCR技术获得敲除三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG的敲除框ΔmazG。
2)以pTargetF为模板，采用引物Sg-mazG-FW和pTarget-RS，构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-ΔmazG。
3)将质粒pCas转化E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdD，获得重组大肠杆菌E.coliMG1655ΔdcdΔndkΔnrdD/pCas。
4)将pTarget-ΔmazG和敲除框ΔmazG电转化入重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdD/pCas，在含有博来霉素和卡那霉素的抗性LB平板上筛选。
5)将获得的单菌落，采用引物ΔmazG-PCR-FW和ΔmazG-PCR-RS进行菌落PCR验证，筛选获得的大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG，通过PCR获得的条带均比对照菌株小，说明三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG已经敲除，同时将该序列送至测序公司测序验证正确(图5)，并消除质粒，构建获得重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG。
(5)构建重组大肠杆菌菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI
在步骤(4)构建的重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG的基础上，采用基因整合手段，将酿酒酵母来源的磷酸胆碱胞苷基转移酶编码基因ScCCT(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，磷酸胆碱胞苷基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)和胆碱激酶编码基因ScCKI(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，胆碱激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示)整合到重组菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG的基因组上，构建重组菌株。其中，基因CKI的表达框整合位点是基因yhdE，基因CCT的表达框整合位点是基因poxB。
1)采用引物pEtac-CCT-FW和pEtac-CCT-RS；pEtac-CKI-FW和pEtac-CKI-RS，以全基因合成的基因CCT或CKI为模板，PCR扩增获得目的片段CCT或CKI，分别插入至经EcoRⅠ和HindⅢ酶切的质粒pEtac，构建重组质粒pEtac-CCT和pEtac-CKI。
2)以pTargetF为模板，采用引物Sg-CCT-FW和pTarget-RS，构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-CCT。
3)以质粒pEtac-CCT为模板，利用下述引物进行PCR：CCT-up-FW和CCT-up-RS；CCT-mid-FW和CCT-mid-RS；CCT-down-FW和CCT-down-RS，构建获得CCT基因的表达整合框::ScCCT。
4)以pTargetF为模板，采用引物Sg-CKI-FW和pTarget-RS，构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-CKI。
5)以质粒pEtac-CCT为模板，利用下述引物进行PCR：CKI-up-FW和CKI-up-RS；CKI-mid-FW和CKI-mid-RS；CKI-down-FW和CKI-down-RS，构建获得CKI基因的表达整合框::ScCKI。
6)将质粒pCas转化E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG，获得重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG/pCas。
7)将pTarget-ScCCT和整合框::ScCCT电转化入重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG/pCas，在含有博来霉素和卡那霉素的抗性LB平板上筛选。
8)将获得的单菌落，采用引物CCT-PCR-FW和CCT-PCR-RS进行菌落PCR验证，筛选获得的大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT，通过PCR获得的条带均比对照菌株大，说基因ScCCT已经整合到基因组(图6a)，同时将该序列送至测序公司测序验证正确。
9)采用同样的方法，将基因ScCKI整合到重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT基因组上，构建获得重组菌大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI(图6b)。其中，其菌落PCR验证引物为：ScCKI-PCR-FW和ScCKI-PCR-RS。
将构建获得的菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI采用LB培养基活化后，接种至含有发酵培养基的60L发酵罐中进行发酵培养，发酵结束后，离心除菌体，取上清液，采用HPLC测定其中的胞二磷胆碱的含量。通过测定发现，对照菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG，几乎检测不到胞二磷胆碱的含量；构建获得的菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI，可以检测到15.8g/L的胞二磷胆碱的含量(图7)。
实施例2：构建高效生产胞二磷胆碱的重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKIΔmtgA
在实施例1构建的菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI的基础上，采用基因敲除的手段，继续敲除大肠杆菌基因组上的肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，肽聚糖糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，构建重组菌株。
1)采用引物ΔmtgA-1-FW和ΔmtgA-1-RS；ΔmtgA-2-FW和ΔmtgA-2-RS，以大肠杆菌基因组为模板，通过融合PCR技术获得敲除肽聚糖糖基转移酶基因mtgA的敲除框ΔmtgA。
2)以pTargetF为模板，采用引物Sg-mtgA-FW和pTarget-RS，构建含有导向RNA的重组质粒pTarget-ΔmtgA。
3)将质粒pCas转化E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI，在抗性平板筛选获得重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI/pCas。
4)将pTarget-ΔmtgA和敲除框ΔmtgA电转化入重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKI/pCas，在含有博来霉素和卡那霉素的抗性LB平板上筛选。
5)将获得的单菌落，采用引物mtgA-1-FW和mtgA-2-RS进行菌落PCR验证，筛选获得重组大肠杆菌E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKIΔmtgA。
如图6c所示，通过PCR获得的条带均比对照菌株小，说明肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA已经敲除，同时将该序列送至测序公司测序验证正确。将构建获得的重组大肠杆菌菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::ScCCT::ScCKIΔmtgA，同样进行60L发酵罐发酵。发酵结束后，离心菌体，取上清液，测定其中的胞二磷胆碱的含量。结果显示，发酵30h的发酵液中胞二磷胆碱到达最高，含量为25.9g/L(图7)。
实施例3：基于酶分子改造磷酰胆碱胞苷转移酶提高重组大肠杆菌的胞二磷胆碱生产水平
为了提高磷酰胆碱胞苷转移酶CCT的催化活力，将酿酒酵母来源的ScCCT的进行定点突变，获得4个突变体G110A、G110V、V111A、V110L。构建突变体酶的方法具体步骤如下：
(1)以化学合成的基因ScCCT(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)为模板，利用引物ScCCT-T-FW和ScCCT-T-RS，采用Extaq酶PCR扩增得基因片段，将基因片段与T载体连接，转化大肠杆菌JM109，筛选获得重组菌，提取获得含有基因ScCCT的T载体。
(2)利用突变位点相对应的引物，以含有基因ScCCT的T载体为模板PCR，针对酿酒酵母来源的ScCCT进行定点突变。所涉及的引物序列见表2。将PCR获得的基因片段，采用DpnI对模板进行消化后，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，测序验证是否突变成功。
(3)分别提取突变成功的含有编码ScCCT突变体基因G110A、G110V、V111A、V110L的T载体，分别以其为模板，采用引物ScCCT-28a-FW和ScCCT-28a-RS进行PCR扩增。采用限制性内切酶NdeI和BamHI对PCR片段和质粒pET28a分别进行双酶切，并将酶切后的PCR片段和质粒pET28a连接，获得重组质粒pET28a-G110A、pET28a-G110V、pET28a-V111A、pET28a-V110L；
(4)分别将重组质粒pET28a-G110A、pET28a-G110V、pET28a-V111A、pET28a-V110L转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得含有突变体的重组菌BL21(DE3)/pET28a-G110A、BL21(DE3)/pET28a-G110V、BL21(DE3)/pET28a-V111A、BL21(DE3)/pET28a-V110L。
分别挑取重组菌BL21(DE3)/pET28a-G110A、BL21(DE3)/pET28a-G110V、BL21(DE3)/pET28a-V111A和BL21(DE3)/pET28a-V110L的单菌落接种到含50μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200r·min-1培养12h，制备得到种子液。将种子液以1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基，在37℃，200r·min-1继续培养至OD600为0.8时，加入1.0mmol·L- 1IPTG于28℃培养8h诱导重组蛋白表达，分别得到突变体G110A、G110V、V111A、V110L的粗酶液和ScCCT野生型酶的粗酶液(WT)。
酶催化反应体现(终浓度)：10mM CTP，10mMATP，10mM氯化胆碱，30mM MgCl2，10mMScCCT，10mM ScCKI。反应体系1mL，反应pH＝7.5，反应温度37℃，200rpm，反应30min。煮沸灭活，采用HPLC检测胞二磷胆碱产量，计算酶活力。
酶活力单位定义：在上述反应条件下，催化底物每分钟生成0.1mM的产物胞二磷胆碱为一个酶活力单位U。
其中，突变体G110A、G110V、V111A、V110L、野生型酶WT粗酶液的酶活分别为：1.8U/mL、1.3U/mL、3.2U/mL、1.1U/mL、2.6U/mL。
(5)采用镍柱分别对含有突变体G110A、G110V、V111A、V110L、野生型酶WT的粗酶液进行纯化，纯化方法如下：收集诱导后的细胞，加入pH 7.4，500mmol·L-1NaCl，50mmol·L-1磷酸缓冲液，低温下超声波破碎12min后，5000r·min-1，离心8min，收集上清作为粗酶液。用pH 7.4，500mmol·L-1NaCl，50mmol·L-1磷酸缓冲平衡Ni柱(HisTrap HP)，液粗酶液用0.22μm滤膜过滤后上样，然后用pH 7.4，500mmol·L-1咪唑，500mmol·L-1NaCl，50mmol·L-1磷酸缓冲液洗脱，流速1.0mL·min-1，收集样品。
分别制备得到突变体G110A、G110V、V111A、V110L、野生型酶WT的纯酶液，将制备得到的纯酶液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图8所示，结果显示制备得到的纯酶液均为单一目的条带，为电泳纯样品；并且在49.4kDa处有蛋白条带，证明酿酒酵母来源的ScCCT成功表达。
(6)以突变体基因V111A为模板，构建基因整合表达框::V111A。采用实施例1步骤(5)中的方法，将编码ScCCT突变体的基因V111A整合到E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG，构建获得重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::V111A。
同样的，采用实施例1步骤(5)中的方法，进一步将酿酒酵母来源的ScCKI基因整合到重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::V111A，构建获得E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::V111A::ScCKI。
采用实施例2中的方法，敲除E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::V111A::ScCKI基因组上的基因mtgA，构建获得重组菌株E.coli MG1655ΔdcdΔndkΔnrdDΔmazG::V111A::ScCKIΔmtgA。
同样进行60L发酵罐进行发酵。发酵结束后，离心菌体，取上清液，测定其中的胞二磷胆碱的含量。结果显示，发酵30h的发酵液中胞二磷胆碱产量达到最大，其含量为28.3g/L(图9)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种生产胞二磷胆碱的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞，敲除基因组上的dCTP脱氨酶编码基因dcd、磷酸核苷激酶编码基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD和/或三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG，并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT和胆碱激酶编码基因CKI。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述过量表达为将编码基因CCT和编码基因CKI整合至大肠杆菌基因组上。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌在yhdE位点整合编码基因CKI，在poxB位点整合编码编码基因CCT。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组菌，其特征在于，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT的氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(b)在(a)的基础上将第111位的缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组菌，其特征在于，还敲除了肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA。
6.根据权利要求1～5任一所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌选自MG1655、DH5α、BL21(DE3)、JM109或HB101。
7.一种生产胞二磷胆碱的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1～6任一所述重组菌接种至含有碳源的反应体系中发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是将权利要求1～6任一所述重组菌的种子液接种至发酵培养基中，在20-45℃和50-350rpm条件下进行发酵培养，关联溶氧补料，当溶氧高于16-55％时进行补料；当发酵至菌浓OD600达30-70时，连续补加氯化胆碱。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氯化胆碱的浓度为0.5～1.5mol/L。
10.权利要求1～6任一所述重组菌在发酵生产胞二磷胆碱方面的应用。
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