CN1520457A - 利用l-阿拉伯糖的工程真菌 - Google Patents
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Abstract
可以通过遗传工程方法改造真菌微生物，以利用L－阿拉伯糖。鉴定了L－阿拉伯糖途径的未知基因，即L－阿拉伯糖醇4－脱氢酶和L－木酮糖还原酶。这些基因连同L－阿拉伯糖途径的已知基因，构成了功能性途径。可以在完全或部分缺少该途径的真菌中引入该途径。
Description
发明领域
本发明涉及遗传修饰的真菌及其在从含有戊糖L-阿拉伯糖的材料中生产有用的产品(例如乙醇、乳酸、木糖醇等)中的用途。
发明背景
L-阿拉伯糖是植物材料的主要成分。因此，L-阿拉伯糖发酵也具有潜在的生物技术利益。
能够利用L-阿拉伯糖和D-木糖的真菌不完全适于工业应用。例如，许多戊糖利用型酵母品种对乙醇的耐受低，使其不适于乙醇生产。一种方法可能是改进这些生物的工业特性。另一种方法是赋予合适的微生物以利用L-阿拉伯糖和D-木糖的能力。已知在细菌中存在有效的D-木糖和L-阿拉伯糖途径。对于D-木糖代谢，它是将D-木糖转变为D-木酮糖的木糖异构酶和将D-木酮糖转变为D-木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶。对于L-阿拉伯糖代谢，该途径由将L-阿拉伯糖醇(L-arabinitol)转变为L-核酮糖、L-核酮糖5-磷酸以及D-木酮糖5-磷酸的异构酶、激酶以及差向异构酶组成，其中D-木酮糖5-磷酸作为戊糖磷酸途径的中间体(Stryer，1988)。曾经在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中尝试过表达此细菌途径，但其没有功能。还表达了L-阿拉伯糖途径的三个酶，并显示有活性。但据报道，在以L-阿拉伯糖为唯一碳源时不生长(Sedlak和Ho，2001)。在真菌宿主中表达木糖异构酶也不成功(Sarthy等人1987，Chan等人1989，Kristo等人1989，Moes等人1996，Schründer等人1996)。此原因不明。可能存在物种屏障，阻止这些细菌异构酶在真菌中起作用。也可能在宿主中代谢不平衡，这在供者中则由未知机制解决。
也存在假设的真核即真菌途径，其中L-阿拉伯糖也转变为D-木酮糖5-磷酸，但通过不同的途径(参见图1)。据认为该途径使用所示的两种还原酶、两种脱氢酶和一种激酶(Chiang和Knight，1961，Witteveen等人，1989)。细菌途径的基因已经了解了数十年，而对假设的真菌途径却所知甚少。
Chiang和Knight(1961)描述了产黄青霉(penicilliumchrysogenum)、Witteveen等人(1989)描述了黑色曲霉(Aspergillusniger)利用L-阿拉伯糖的真菌途径。其由结合NADPH的形成L-阿拉伯糖醇的还原酶、结合NAD的形成L-木酮糖的脱氢酶、结合NADPH的形成木糖醇的还原酶、结合NAD的形成D-木酮糖的脱氢酶以及木酮糖激酶组成。终产物与细菌L-阿拉伯糖途径相同，为D-木酮糖5-磷酸(参见图1)。虽然只描述过丝状真菌中的该途径，但表明其也可能存在于酵母中。Shi等人(2000)描述了不能在L-阿拉伯糖中生长的具柄毕赤氏酵母(Pichia stipitis)突变株。过表达结合NAD的木糖醇脱氢酶，可以恢复在L-阿拉伯糖醇中的生长，表明木糖醇可能是L-阿拉伯糖途径的中间体。酵母菌株在以L-阿拉伯糖为唯一碳源时，也产生L-阿拉伯糖醇和少量的木糖醇(Dien等人，1996)，表明酵母可能利用这条途径。发酵L-阿拉伯糖的能力不是酵母的共同特性。许多酵母种类主要蓄积由L-阿拉伯糖形成的L-阿拉伯糖醇(McMillan和Boynton 1994)。只是在最近才鉴定了能够发酵L-阿拉伯糖的酵母品种(Dien等人，1996)。
假设的真菌L-阿拉伯糖途径与真菌D-木糖途径有相似之处。两条途径中的戊糖都经历还原和氧化反应，其中还原是NADPH结合的，氧化是NAD结合的。D-木糖经历一对还原和氧化反应，而L-阿拉伯糖经历两对还原和氧化反应。这是中性的还原氧化作用过程，但还原氧化的辅因子不同，也就是使用NADPH和NAD，其只能分别在其它代谢途径中分别再生。在D-木糖途径中，NADPH结合的还原酶将D-木糖转变为木糖醇，然后由NAD结合的脱氢酶将其转变为D-木酮糖，再由木酮糖激酶转变为D-木酮糖5-磷酸。D-木糖途径的酶全部都能够用于L-阿拉伯糖途径。两条途径的第一个酶是醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)。已经表征了在啤酒糖酵母(Kuhn等人1995)和具柄毕赤氏酵母(Verduyn，1985)中对应的酶。它们是非特异性的，能够以大致相同速率利用L-阿拉伯糖或D-木糖，分别产生L-阿拉伯糖醇或木糖醇。已经了解例如具柄毕赤氏酵母(Amore等人，1991)、啤酒糖酵母(Kuhn等人，1995，Richard等人，1999)、纤细假丝酵母(Candida tenius)(Hacker等人，1999)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)(Billard等人，1995)以及管囊酵母(Pachysolen tannophilus)(Bolen等人，1996)中编码该酶的基因。
木糖醇脱氢酶(也称为D-木酮糖还原酶EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶EC 2.7.1.17在真菌的D-木糖和L-阿拉伯糖途径中是相同的。具柄毕赤氏酵母(K_tter等人，1990)、啤酒糖酵母(Richard等人，1999)和Tricoderma reesei(Wang等人1998)的D-木酮糖还原酶基因已知。对于真菌木酮糖激酶基因，只了解啤酒糖酵母(Ho和Chang等人，1998)的木酮糖激酶基因。
编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.12)或L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)的基因未知。
本发明目的在于能够在真菌中表达利用L-阿拉伯糖的途径。在啤酒糖酵母中表达的假设的真菌途径可能产生能将林业和农业废弃物中几乎所有的糖发酵为乙醇的菌株。
发明概述
根据本发明，通过遗传修饰真菌，解决了真菌不能有效利用L-阿拉伯糖的问题，其特征在于，利用L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶基因或L-木酮糖还原酶基因或这两种基因转化真菌。
根据本发明，用全部或若干编码L-阿拉伯糖途径的酶的基因转化真菌，所述酶即醛糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶、D-木酮糖还原酶和木酮糖激酶。得到的真菌因而能够利用L-阿拉伯糖。我们公开了L-阿拉伯糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的基因。我们公开了当不能利用L-阿拉伯糖的真菌如啤酒糖酵母被醛糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶、D-木酮糖还原酶和木酮糖激酶基因转化后，变得能够利用L-阿拉伯糖。我们还公开了能够利用D-木糖而不能利用L-阿拉伯糖的真菌，例如遗传工程啤酒糖酵母，用L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶基因转化后，能够利用L-阿拉伯糖。
此处术语“利用”是指生物体能够利用L-阿拉伯糖为碳源或能源，或者指其能够将L-阿拉伯糖转变为另一可作为有用物质的化合物。
附图详述
图1.利用L-阿拉伯糖的假设的真菌和细菌途径。
图2.L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶基因序列(SEQ ID NO.1)：将基因组DNA序列与N端和C端区域的cDNA序列结合。核苷酸247-315是内含子序列。蛋白质由核苷酸47-1246编码。
图3.L-木酮糖还原酶cDNA克隆的序列以及蛋白质序列(SEQ ID NO.2)。蛋白质由核苷酸24-821编码。
图4.与对照菌株(H2652)相比，利用本发明的遗传修饰的真菌(菌株H2651)，由L-阿拉伯糖生产乙醇的产量。
发明详述
本发明主要证明如何遗传修饰真菌微生物以能利用L-阿拉伯糖。“利用”是指生物体能够利用L-阿拉伯糖作为碳源或能源，或者它能够将L-阿拉伯糖转变为另一可作为有用物质的化合物。有些真菌天生能利用L-阿拉伯糖，其它则不能。对于缺少L-阿拉伯糖利用能力但具有其它理想特性(例如耐受工业条件或产生特殊用途产品如乙醇或乳酸或木糖醇的能力)的生物体，希望赋予其利用L-阿拉伯糖的能力。为了通过遗传工程方法赋予该利用L-阿拉伯糖的能力，有必要了解能在宿主细胞中共同发挥作用而将L-阿拉伯糖转变为例如D-木酮糖5-磷酸的衍生物(能够为宿主细胞所分解代谢，并因而生产有用的产品)的一组酶的全部基因。用编码所缺失的一种或多种酶的一种或多种基因转化宿主，从而在特定宿主中完善这组酶。一个例子是遗传修饰啤酒糖酵母以利用L-阿拉伯糖。啤酒糖酵母是优良的乙醇生产生物，但缺少利用L-阿拉伯糖的能力。其它例子是具有有用特性、但缺少至少部分的功能性L-阿拉伯糖途径的生物体。
图1所示为据信在真菌中发挥作用的L-阿拉伯糖途径。编码醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)、D-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的基因已知。为构建能够通过此假设途径利用L-阿拉伯糖的菌株，可能需要另外两个基因，即L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.12)和L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)基因。
L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶：Chiang和Knight(1960)以及Witteveen等人(1989)分别描述了产黄青霉和黑色曲霉的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶。该酶将L-阿拉伯糖醇和NAD转变为L-木酮糖和NADH。也有报道其对NAD和阿东糖醇(核糖醇)以及NAD和木糖醇具有活性(Chiang和Knight，1960)。
L-木酮糖还原酶：L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)将木糖醇和NADP转变为L-木酮糖和NADPH。据报道，催化相同反应的另一种酶是D-艾杜糖醇2-脱氢酶(EC 1.1.1.15)(Shaw，1956)。
在噬夏孢欧文氏杆菌(Erwinia uredovora)(Doten等人，1985)、黑色曲霉(Witteveen等人1994)以及豚鼠(Hickman和Ashwell，1959)发现了L-木酮糖还原酶。来自鸽子肝脏的制剂已商品化(Sigma-Aldrich)。来自黑色曲霉的该酶的单个亚单位分子量为32kDa，天然酶估计分子量为250kDa(Witteveen等人1994)。
然而，任何L-阿拉伯糖醇脱氢酶或L-木酮糖还原酶的氨基酸序列和编码基因不为人知。现在我们公开这些基因。我们还公开了将这些基因转化不能利用L-阿拉伯糖但能利用木糖的真菌，赋予转化的真菌利用L-阿拉伯糖的能力。
为鉴定L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶或L-木酮糖还原酶的基因，使用的方法可能不同，本领域技术人员可以使用不同的方法。一种方法是，纯化具有相应活性的蛋白质，并利用有关该蛋白质的信息克隆相应的基因。这可包括纯化的蛋白质的蛋白水解消化、蛋白水解消化物的氨基酸测序、利用得自氨基酸序列的引物通过PCR克隆部分基因。然后可以利用各种方法获得其余的DNA序列。一种方法是利用来自文库载体和基因已知部分的引物，通过PCR从cDNA文库中获得序列。一旦已知其完整序列，即可以从cDNA文库中扩增该基因，克隆进表达载体，并在异源宿主中表这。如果筛选策略或基于序列间同源性的策略不合适，这是个有用的策略。
克隆基因的另一方法是筛选DNA文库。当单个基因过表达会引起易于检测的表型时，此方法特别有利和快速。由于我们已经公开了用编码L-阿拉伯糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的基因转化木糖利用型真菌时能赋予其在L-阿拉伯糖中生长的能力，另外的发现L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶基因的策略如下：纯化两个酶之一并克隆相应基因。现在该途径的除一个基因以外的所有基因均为已知。这种情况下，筛选策略适于发现该途径中的最后一个基因。可以构建包含该途径除一个基因以外的所有基因的菌株，用DNA文库转化，筛选在L-阿拉伯糖中的生长。此策略中，可以先纯化L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶再筛选L-木酮糖还原酶，或者先纯化L-木酮糖还原酶再筛选L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶。
另有克隆这些基因的其它方法和可能性：
可以两个酶都纯化并找到相应基因。
可以筛选一个DNA文库或者两个DNA文库的组合，同时发现两个基因。
可以利用其它筛选方法找到各个基因。
例如，可以筛选在L-木酮糖中的生长，以找到L-木酮糖还原酶，然后筛选在L-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖醇中的生长，以筛选L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶。
其它可能的筛选方法可以利用辅因子需求，例如在因NADPH缺乏而致死的筛选条件下，可以在木糖醇存在下筛选L-木酮糖还原酶。
可以在现有数据库中筛选与相关蛋白质家族基因同源的基因，并测试其是否编码目的酶活性。由于我们已经公开了编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(SEQ ID NO 1)和L-木酮糖还原酶(SEQ ID NO 2)基因的序列，本领域技术人员很容易在数据库中筛选与SEQ ID NO 1和2同源的基因。利用基于SEQ ID NO 1和2的探针，通过DNA文库的物理筛选，也可以容易发现同源基因。合适的DNA文库包括从真菌和其它能够利用L-阿拉伯糖或L-木酮糖的微生物中分离的DNA。
对于本领域技术人员来说，有很多方法可用于鉴定编码具有目的酶活性的蛋白质的基因。此处所述方法目的在于阐明本发明，但可以使用本领域已知的其它任何方法。
一旦鉴定了L-阿拉伯糖途径的全部基因，便可将该途径引入缺少此途径的新宿主生物体。并非总是需要引入全部基因。可能宿主生物体已经具有部分途径。例如能够利用D-木糖的真菌，可能只需要将L-阿拉伯糖醇转变为木糖醇的酶。那么，表达L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶将足以完善L-阿拉伯糖途径。对真菌阿拉伯糖途径所有步骤中酶的测定已有描述(Witteveen等人1989)，需要时其可以用于帮助鉴定在特定宿主中缺失或不足的步骤。
可以将L-阿拉伯糖途径导入啤酒糖酵母，得到优良的乙醇生产、并能利用戊糖L-阿拉伯糖和D-木糖的菌株。在这样的菌株中，最丰富的己糖和戊糖可被发酵为乙醇。
在实施例3和5中，将基因克隆进遗传改造的啤酒糖酵母实验室菌株。同样方法可用于啤酒糖酵母工业菌株，例如啤酒酵母、酒精酵母或面包酵母。工业酵母具有加工优势，诸如耐受高乙醇、耐受其它工业压力以及发酵快速。它们通常是多倍体，其遗传改造比实验室菌株更困难，但其改造方法为本领域所公知(例如参见Blomqvist等人，1991；Henderson等人，1985)。其它不能或不能有效利用L-阿拉伯糖的酵母，也可以用作宿主，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromycespombe)或毕赤酵母属(Pichia spp.)、假丝酵母属(Candida spp.)、管囊酵母属(Pachysolen spp.)、许旺酵母属(Schwanniomyces spp.)、Arxula spp.、丝孢酵母属(Trichosporon spp.)、汉逊酵母属(Hansenula spp.)或Yarrowia spp.。潜在的宿主还包括丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)种、木霉属(Trichoderma)种、链孢霉属(Neurospora)种、镰孢属(Fusarium)种、青霉属(Penicillium)种、腐质霉属(Humicola)种、Tolypocladium geodes、Trichodermareesei(Hypocrea jecorina)、毛霉属(Mucor)种、Trichodermalongibrachiatum、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑色曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。但本发明不限于酵母和其它真菌。通过应用本领域合适的已知的对特定生物体的遗传手段，可以在不能或不能有效利用L-阿拉伯糖的任何生物体(例如细菌、植物或高等真核生物)中表达L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和/或L-木酮糖还原酶的编码基因。
在实施例3和5中，我们利用了啤酒糖酵母的TPI启动子表达L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶，利用了啤酒糖酵母的PGK启动子表达L-木酮糖还原酶。两个都是强的组成型启动子。可以使用其它更强或稍弱的启动子。也不一定使用组成型启动子。可以使用可诱导或可抑制型启动子，可能在例如希望顺序发酵不同的糖时有优势。
我们在实施例中使用L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶两个基因的两种质粒。每种质粒包含不同的选择标志。这些基因还可在有或没有选择标志的单个质粒中表达，或者其可整合到染色体中。选择标志用于更容易地找到成功的转化子，并用于稳定遗传构建体。用不同基因连续转化酵母菌株，利用乙酸锂方法进行啤酒糖酵母的转化(Gietz等人1992)。这只是完成所需遗传构建体的一种方法。可以同时或连续转化全部的必要基因。本领域已知其它转化方法，某些对特定宿主是优选的，其可以用来实现本发明。
在实施例2和4中公开了编码L-阿拉伯糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的Treesei的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 1和2)。这些是实践实施例5和6公开的本发明的合适的基因。众所周知，来自不同生物体的编码具有相同催化活性的酶的基因具有序列同源性，本领域技术人员可以通过许多方法利用这些同源性，从其它具有相同催化活性的生物体中克隆其它基因。这些基因也适于实践本发明。同样众所周知的是，基因核苷酸序列中的许多小的变异并不能显著改变所编码蛋白质的催化特性。例如，核苷酸序列中的许多变化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列，而氨基酸序列中的许多变化并不改变蛋白质的功能特性，尤其不能阻止酶实现其催化功能。由于并不显著改变基因编码特定功能蛋白质的功能(例如催化特定反应)，我们将DNA分子核苷酸序列中的这种变异称作“功能等价变异”。SEQ ID NO 1和2所确定的分子的功能等价变异的DNA分子可用于实践本发明。
有时生物体包含的基因，不在适用于生物技术应用的条件下表达。例如，尽管一般曾相信啤酒糖酵母不能利用木糖，并因此认为啤酒糖酵母不包含编码能使其利用木糖的酶的基因，然而已经证明啤酒糖酵母的确包含这些基因(Richard等人1999)。但这些基因通常不充分表达。因此，本发明另一方面在于，鉴定宿主生物体自身的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶或L-木酮糖还原酶或这两种基因，并在便于生物技术加工(例如含L-阿拉伯糖生物质的乙醇发酵)的条件下，于同一生物体中使这些基因表达。我们公开了鉴定这些通常不表达的候选基因的方法，包括搜索与SEQ ID NO 1和2的相似性。然后如实施例1和6所述，将候选基因克隆进表达载体，于合适的宿主中表达，并测定宿主的无细胞提取物中适当的催化活性情况。证实了通常不表达或不充分表达的基因编码目的酶以后，可将基因克隆回原始生物体，其中具有使该基因在适当的生物技术条件下表达的新的启动子。也可通过在完整生物体中遗传改造该基因的启动子来实现。
在本发明的又一方面，现在可以根据与SEQ ID NO 1和2的相似性，轻易鉴定编码具有L-阿拉伯糖利用能力的真菌包括丝状真菌的L-阿拉伯糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的基因。然后修饰这些基因，例如通过将其启动子改为更强的或者具有不同特性的启动子，以增强生物体利用L-阿拉伯糖的能力。
这方面的一个实施方案是，修饰这些基因(可能还有熟知的编码D-木酮糖还原酶的基因)以创造具有增强的生产珍贵糖醇(L-阿拉伯糖醇和木糖醇，后者是有用的甜味剂)的能力的真菌。例如，包含醛糖还原酶但缺少L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的真菌，会将L-阿拉伯糖转变为L-阿拉伯糖醇，现在可以通过下列步骤来创造：(1)如果该真菌缺少醛糖还原酶，则用该酶的基因转化所述真菌，以及(2)利用我们公开的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶基因序列(SEQ ID NO 1)，通过众所周知的方法删除或破坏该基因。类似地，包含将L-阿拉伯糖转变为木糖醇的真菌途径的全部酶、但缺少D-木酮糖还原酶的真菌，会将L-阿拉伯糖转变为木糖醇，现在可以利用我们在SEQ ID NO 1和2中公开的信息，连同已知的关于D-木酮糖还原酶基因的信息来创造该真菌。
真菌可能天生没有生成乳酸所需的酶，或者其生成乳酸的效率差。这些情况下，可以提高或改进真菌中编码乳酸脱氢酶(LDH)的基因的表达，因而真菌能更有效地生成乳酸(例如WO 99/14335)。类似地，按本发明所述修饰的利用阿拉伯糖更为有效的真菌，可以利用本领域已知的方法，进一步修饰以生成乳酸。从本发明的L-阿拉伯糖利用型真菌中可以获得乙醇、乳酸和糖醇，例如阿拉伯糖醇和木糖醇，以及其它有用产品。这些真菌通过阿拉伯糖途径，将L-阿拉伯糖转变为木酮糖5-磷酸，后者为戊糖磷酸途径的中间体。因此，也可以生产戊糖磷酸途径的衍生物，例如芳香族氨基酸，以及源于乳酸和乙醇的共同前体丙酮酸的其它物质。
本发明的转化真菌可用于从L-阿拉伯糖生产乙醇。用L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶或两者共同转化宿主真菌。该宿主可以是任何没有或者只有有限的利用L-阿拉伯糖的能力、但能发酵D-木糖的真菌。例如，它可以是啤酒糖酵母菌株，其已经转化了能使其发酵D-木糖的基因。如实施例2和4所述，可以从T.reesei中获得L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和L-木酮糖还原酶的基因，但也可使用其它编码具有这些催化活性的酶的基因。如今这些基因容易发现，例如可以从能够利用L-阿拉伯糖的微生物中获得，因为可以利用SEQ ID NO 1和2公开的序列，通过本领域广为人知的各种方法，克隆相似基因。用来转化宿主真菌以及筛选转化子的方法可以与实施例3和5中所用方法相同，但也可使用本领域已知的其它方法成功地提供本发明转化的真菌。
然后用转化的真菌发酵碳源，例如包含含有L-阿拉伯糖以及也可能含有其它戊糖或其它可发酵糖类的农业或林业产品和废弃物的生物质。发酵所用碳源的制备以及发酵条件，可与利用宿主真菌发酵相同碳源时的相同。但是，本发明的转化真菌，比宿主真菌消耗更多的L-阿拉伯糖，并从总的碳水化合物中产生更多的乙醇。如实施例7所示。众所周知，可以根据发酵原料以及发酵微生物的性质，优化发酵条件，包括碳源制备、辅助底物和其它养分的添加，以及发酵温度、搅拌、供气、供氮、pH控制、发酵生物体加入量。因此，根据设置好的加工工程工艺优化发酵条件，转化真菌较之宿主真菌改进的特性可以进一步得到改善。
利用本发明的转化真菌，从包含L-阿拉伯糖和其它可发酵糖的碳源生产乙醇，有几方面的工业优势。包括每吨碳源的乙醇产量高以及发酵物中乙醇的浓度高，这均有助于降低诸如用作燃料的蒸馏乙醇的生产成本。此外，由于L-阿拉伯糖的含量降低，发酵废物中污染减少，因而创造了更清洁的加工方法。
自然界中木质纤维素原料非常丰富，提供了可供微生物加工的、可再生和廉价的碳水化合物来源。含有L-阿拉伯糖的原料为例如各种果胶、半纤维素(例如木聚糖)，其含有己糖和戊糖(木糖、阿拉伯糖)的混合物。有用的原料包括造纸和纸浆工业副产品，例如废液和木材水解物，以及农业副产品，例如糖蔗渣、玉米穗、玉米纤维、燕麦、小麦、大麦以及稻壳和麦秆及其水解物。还可以利用包含阿拉伯聚糖(arabanane)或半乳糖醛酸的聚合物材料。
实施例：
实施例1
L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的纯化及氨基酸序列测定：
Tricoderma reesei(Rut C-30)在含有40g/l L-阿拉伯糖、2g/l朊蛋白胨、15g/l KH2PO4、5g/l(NH4)2SO4、0.6g/l Mg2SO4×7H2O、0.8g/l CaCl2×2H2O以及微量元素的培养基中(Mandels和Weber，1969)，28℃、pH4.0和30％溶解氧下于发酵罐中生长(ChepmapCF2000)。当L-阿拉伯糖大约10g/l时停止发酵。用塑料网筛收集细胞，并用10mM磷酸钠(pH7)洗涤。500g生物质按每份100g冷冻于液氮中。融化并用尖头超声波处理器进行超声波处理后，加入DTT，终浓度为5mM，将悬浮液离心(Sorvall SS34，40分钟，20000转/分)。上清液用10倍体积的缓冲液A(10mM磷酸钠pH7、5mM DTT)透析过夜。然后离心保留物(Sorvall SS34，40分钟，20000转/分)。所有步骤均在4℃下进行。粗提物蛋白质含量为7g/l，每mg提取蛋白质中L-阿拉伯糖醇脱氢酶活性为0.7nkat。500ml该粗提物上样至200ml DEAE柱上，利用缓冲液A到添加了100mM NaCl的缓冲液A的线性梯度洗脱。在约80mM NaCl处洗脱的活性最高(16nkat/mg，5mg/ml蛋白质)。
将酶制剂加入到含有100mM Tris HCl pH9.0、0.5mM MgCl2、2mMNAD的缓冲液中，测定L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶活性。然后加入L-阿拉伯糖醇(或指定的其它糖)至终浓度10mM起始反应。根据NADH在340nm处吸光值的变化计算活性。所有酶的测定在37℃、Cobas Mira自动分析仪(Roche)上进行。在逆向反应中，将酶制剂加入至含有200mM NaPO4pH7.0、0.5mM MgCl2、200μM NADH和2mM L-木酮糖的缓冲液中测定活性。根据NADH在340nm处吸光值的变化计算活性。
测定部分纯化的酶对其它糖的活性。发现其对D-阿拉伯糖醇没有活性。对L-阿拉伯糖醇和阿东糖醇(核糖醇)有活性。对核糖醇的活性是L-阿拉伯糖醇的大约80％。NADP用作辅助底物时，对任何糖都没有活性。
在对L-木酮糖和NADH的可逆反应中，发现在pH7.0时对2mM L-木酮糖的活性为0.8nkat/mg，而对10mM L-阿拉伯糖醇的活性为6.4nkat/mg，对10mM阿东糖醇(核糖醇)的活性为5nkat/mg。
将具有最高活性的DEAE柱后组分600μl，进行天然PAGE(12％丙烯酰胺，BioRad)。然后在含有200mM Tris HCl pH9.0、100mM L-阿拉伯糖醇、0.25mM氮蓝四唑、0.06mM吩嗪硫酸甲酯(phenazinemetosulfate)、1.5mM NAD的Zymogram染色液中染色凝胶。
切下染色时呈现的唯一条带，在2ml 100mM Tris Cl pH9.0、0.1％SDS；中温育过夜而洗脱。然后用Centricon(Amicon)浓缩至约80μl。
这样得到几乎纯的酶制剂，SDS PAGE主带约38kDa。随后此蛋白质用于蛋白酶解消化物的氨基酸序列分析。测序结果如下：
纯化的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的内部肽序列：
1：A T G A A I S V K P N I G V F T N P K
2：Y S N T W P R
3：A F E T S A D P K
4：H D L W I S E A E P
实施例2
L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的克隆：
利用内部氨基酸序列克隆基因片段：
利用内部肽序列设计PCR简并引物。第一步中的模板是Tricoderma reesei的基因组DNA。使用对应于氨基酸片段A T G A AI S V K P N I G V F T N P K的正义DNA序列(引物5384：ARCCIAAYATHGGIGTITTYACIAAYCC)和对应于氨基酸片段A F E T S A DP K的反义DNA序列(引物5285：GGRTCIGCIGAIGTYTCRAAIGC)。PCR条件是：96℃变性30秒，退火30秒，(前两次37℃、然后27次42℃)72℃延伸2分钟，最后72℃延伸5分钟。此过程产生约1kb的PCR产物。然后将得到的约1kb片段克隆到TOPO载体(Invitrogen)。
然后将此构建体用于测序。
PCR产物序列也编码其余的两个肽序列(参见图2)。
从cDNA文库克隆N和C端：
利用在酵母表达载体中的cDNA文库(Margolles-Clark等人1996)克隆该基因的其余部分。在此表达载体中，cDNA位于PGK启动子和终止子之间。为克隆对应蛋白质N端的部分基因，以cDNA文库为模板进行PCR反应，其中一个引物位于PGR启动子区，反义引物来自L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的基因片段。
PGK启动子区的引物：(引物4196：TCAAGTTCTTAGATGCTT)
基因片段的反义引物：(引物5431：CCTTTCCTCCAAACTTGCTGG)
以同样方法克隆对应蛋白质C端的部分基因，其中引物来自基因片段，反义引物来自PGK终止子。
PGK终止子区反义引物：(引物3900：TAGCGTAAAGGATGGGG)
基因片段的引物：(引物5430：CTGCATTGGGCCCATGAT)
PCR条件如上所述，只是50℃退火30次。
N端反应得到的PCR产物大约0.8kb；C端反应得到的PCR产物大约0.9kb。将PCR产物克隆到TOPO载体，得到的载体用于序列分析。
利用C端和N端的信息，利用PCR从cDNA文库克隆开放阅读框架。N端引物包含附加的EcoRI限制性位点(引物5526：AGAATTCACCATGTCGCCTTCCGCAGTC)。C端引物包含附加的BamHI限制性位点(引物5468：ACGGATCCTCTACCTGGTAGCACCTCA)。PCR反应的退火是60.5℃ 30次，其它条件如上所述。得到1.1kb片段，然后克隆到TOPO载体，用于序列分析。
比较得自基因组DNA和cDNA的序列，揭示存在69个碱基对的内含子(参见图2)。
开放阅读框架编码377个氨基酸的蛋白质，计算分子量为39806g/mol。
实施例3
在啤酒糖酵母中表达L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶：
将TOPO载体中的1.1kb的EcoRI、BamHI片段连接到pYX242载体(R & D Systems)的相应位点。pYX242是多拷贝酵母表达载体，带有酵母TPI启动子和LEU2供筛选。然后将该质粒转化啤酒糖酵母菌株CEN.PK2(VW1b)。重组酵母细胞在选择培养基中生长。然后利用玻璃珠涡旋提取酵母细胞的胞内蛋白质。然后分析提取物的L-阿拉伯糖醇脱氢酶活性。我们发现每mg提取的蛋白质中L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶活性为0.2-0.3nkat。
实施例4
筛选L-木酮糖还原酶：
利用包含木糖还原酶(醛糖还原酶EC 1.1.1.21)、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.12)、D-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)基因的啤酒糖酵母菌株，以筛选L-木酮糖还原酶。醛糖还原酶、D-木酮糖还原酶和木酮糖激酶是整合的。构建此菌株，使其仍能利用尿嘧啶和亮氨酸进行筛选。用实施例3中的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶多拷贝质粒，转化整合有醛糖还原酶、D-木酮糖还原酶和木酮糖激酶的菌株。此菌株中尿嘧啶营养缺陷型仍留作筛选。然后将在带有尿嘧啶标志的酵母表达载体中的T.reesei cDNA文库(Margolles-Clark等人1996)转化此菌株，在L-阿拉伯糖中生长进行筛选。为了筛选，转化子首先在带有选择的葡萄糖平板上生长。然后将大约750000个转化子复制铺板到以5％L-阿拉伯糖为唯一碳源的选择平板上。将2-3周后出现的克隆，再次在L-阿拉伯糖上划线接种。然后将得到的克隆于葡萄糖中生长，提取质粒。将质粒转化E.coli细胞。由于带有L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的质粒以及来自cDNA文库的质粒都只含有氨苄青霉素抗性，我们利用菌落PCR鉴定带有cDNA文库质粒的E.coli。为进行菌落PCR，我们使用PGK启动子和终止子区的引物。从L-阿拉伯糖筛选出的4个独立克隆中，获得0.9kb的PCR产物。相应质粒随之测序。cDNA序列如图3所示。开放阅读框架编码具有266个氨基酸、计算的分子量为28,428Da的蛋白质。
实施例5
L-木酮糖还原酶的表达：
使用实施例4中得到的含有L-木酮糖还原酶的表达载体。将其再转化在实施例4中也用到的包含木糖还原酶(醛糖还原酶EC1.1.1.21)、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.12)、D-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9)和木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的基因的菌株。作为对照，使用空的克隆载体pAJ401代替具有L-木酮糖还原酶基因的载体进行转化。转化子首先在D-葡萄糖平板上生长，然后划线到以5％L-阿拉伯糖为唯一碳源的平板上。此平板包含碳源和不包含尿嘧啶和亮氨酸的选择性培养基(为选择所需要)(Sherman等人1983)。2-4周后，在L-阿拉伯糖平板上出现含有L-木酮糖还原酶的菌株的克隆，对照中没有出现克隆。
实施例6
TPI启动子控制下L-木酮糖还原酶的表达：
以实施例5的载体为模板，利用PCR克隆L-木酮糖还原酶。引物是(LXR起始EcoRI：GCCGAATTCATCATGCCTCAGCCTGTCCCCACCGCC)和(LXR终止HindIII：CGCCAAGCTTTTATCGTGTAACCTCCGTCAATCAC)。条件与实施例2相同，只是退火温度为63℃。PCR产物用EcoRI和HindIII消化。用EcoRI和HindIII消化含有TPI启动子以及供筛选的URA3基因的酵母表达载体pXY212(R & D Systems)。然后将PCR产物连接到表达载体。然后将得到的载体转化酵母菌株CEN.PK2。重组酵母细胞在选择培养基中生长。然后利用玻璃珠涡旋提取酵母细胞的胞内蛋白质。分析提取物的L-木酮糖还原酶活性。在含有100mM TrisClpH9.0、1.6M木糖醇和2mM MgCl2的介质中测定活性。加入2mM NADP(终浓度)作为起始试剂。根据NADPH在340nm处吸光值的变化计算活性。在37℃、Cobas Mira自动分析仪(Roche)上进行测定。每mg提取蛋白质中活性介于2-5nkat。
实施例7
利用重组酵母菌株的L-阿拉伯糖发酵：
构建带有L-阿拉伯糖途径所有基因的酵母菌株。为此目的，构建染色体中整合有醛糖还原酶和木糖醇脱氢酶(Toivari等人2001)以及木酮糖激酶(Richard等人2000)、从质粒中表达L-阿拉伯糖醇脱氢酶和L-木酮糖还原酶的菌株。质粒如实施例3和6所述。得到的带有L-阿拉伯糖途径的所有基因的菌株，称作H2651。构建对照菌株(H2652)，其与菌株H2651相似，只是携带空质粒pYX212，而非包含lxrl的质粒。
在分开的两个发酵罐中分批培养，进行发酵，一个发酵罐中含有菌株H2651，另一个含有菌株H2652。首先在摇瓶中利用以葡萄糖为碳源的选择性培养基(SCD-leu-ura)，使细胞生长到OD600约为8，然后收集并接种到发酵罐中，在D-葡萄糖中培养2天。2天后，细胞代谢了由葡萄糖产生的所有乙醇。然后加入L-阿拉伯糖，发酵转为无氧发酵。接种L-阿拉伯糖后，菌株H2651和H2652的OD600分别为16.6和8.9。图4表明，在L-阿拉伯糖培养的前50个小时期间，菌株H2651从L-阿拉伯糖生产超过0.12g/l的乙醇。相同时间内，几乎检测不到对照菌株生产的乙醇。
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序列表
<110>Valtion teknillinen tutkimuskeskus
<120>利用L-阿拉伯糖的工程真菌
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<141>2001-02-16
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1361
<212>DNA
<213>L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶
<400>1
ctcaaacgcc ttgttcgccg gagaccgcgc gcattcacag ctcgccatgt cgccttccgc 60
agtcgatgac gctcccaagg ccacaggggc agccatctca gtcaagccca acattggcgt 120
cttcacaaat ccaaaacatg acctctggat tagcgaagct gaacccagcg ccgatgccgt 180
caaatctggc gctgatctga agcccggcga ggtgaccatt gctgtccgca gcactggtat 240
ctgtgggtat gtataacgct tctgtccaca gagcgcaagc gcagaggagc agcatgctga 300
acgaaatacg aatagttcag atgtccattt ctggcacgcc ggctgcattg ggcccatgat 360
cgtcgagggc gaccacatcc tcggccacga gtctgccggc gaggtcatcg ccgtccaccc 420
gactgtcagt agcctccaaa tcggcgatcg ggttgccatc gagcccaaca tcatctgcaa 480
cgcgtgcgag ccctgcctga caggtcgata caacggctgc gaaaaggtcg agttcctatc 540
cacgccgcca gtgcccggac cgctgcgacg ctacgtcaac cacccagccg tttggtgcca 600
caagattggc aacatgtcgt gggagaacgg cgcgctgctg gagcccctga gcgtggctct 660
ggccggcatg cagagggcca aggttcagct cggtgacccc gtgctggtct gcggcgctgg 720
tccgattgga ttggtgtcaa tgctgtgcgc tgctgccgcc ggtgcttgcc cgcttgtcat 780
cacagacatt tcagagagcc gtctggcgtt tgcaaaggag atctgccccc gcgtcaccac 840
gcaccgcatc gagattggca agtcggctga ggaaacggcc aaaagcatcg tcagctcttt 900
tgggggcgtc gagccagccg tgaccctgga gtgcaccggt gtggagagca gcattgcagc 960
ggccatctgg gccagcaagt ttggaggaaa ggtctttgtg atcggcgtcg gcaagaatga 1020
aatcagcatt ccctttatga gggccagtgt acgcgaggtc gatatccagc tgcagtatcg 1080
ctacagcaac acctggcctc gtgccatccg gctcatcgag agcggtgtca tcgatctatc 1140
caaatttgtg acgcatcgct tcccgctgga ggatgccgtc aaggcatttg agacgtcagc 1200
agatcccaag agcggcgcca ttaaggtcat gattcagagc ctggattgag agtgaggtgc 1260
taccaggtag aggtagataa tagatagatg atgaagatgg aaagactgcg ggcgcaagaa 1320
tcgggcggat agggagttgg ctgtaatggt ttgcaaagca t 1361
<210>2
<211>923
<212>DNA
<213>L-木酮糖还原酶
<400>2
ccccatcctt tgcatcgccc atcatgcctc agcctgtccc caccgccaac agactccttg 60
atctcttcag cttgaagggc aaggtcgtcg tcgtcaccgg cgcttccggc cctcgaggca 120
tgggaatcga agctgcccgt ggctgcgccg agatgggcgc tgacctcgcc atcacctact 180
cgtctcgcaa ggagggcgcg gagaagaacg ccgaggaatt gaccaaggaa tacggcgtca 240
aagtcaaggt gtacaaggtc aaccagagcg actacaacga tgttgagcgc tttgtgaacc 300
aggtcgtgtc tgactttggc aagatcgatg cctttattgc caacgccgga gccacagcta 360
atagcggagt tgttgacggc agcgccagcg attgggacca tgtcatccag gtcgacctga 420
gcggcaccgc atactgcgca aaggctgttg gcgcgcactt caagaagcag ggccacggct 480
cccttgtcat cacagcttca atgtccggcc acgtcgcaaa ctatccccag gaacagacct 540
catacaacgt cgccaaggcc ggttgcatcc atctggcgcg gtctctggcc aacgagtggc 600
gtgattttgc ccgcgtcaac agcatttcgc ccggttatat cgataccggc ctgtccgact 660
tcatcgacga gaagacgcaa gagctgtgga ggagcatgat ccccatggga cgaaacggcg 720
atgccaagga gctcaagggc gcgtatgtat atctggtcag cgacgctagc tcgtacacga 780
cgggagccga tattgtgatt gacggaggtt acactacacg ataaagaaat aatgtattgt 840
tagactataa tcaatgtgac gaacaagatt tgtgattaag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaactcgag taattccgat aga 923
Claims (14)
1.遗传修饰的利用L-阿拉伯糖的能力提高的真菌，其特征在于它转化有编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的DNA序列，或者编码L-木酮糖还原酶的DNA序列，或者所述的两个DNA序列。
2.权利要求1的遗传修饰的真菌，其特征在于编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的DNA序列是SEQ ID NO.1或其功能相当的变体，以及编码L-木酮糖还原酶的DNA序列是SEQ ID NO.2或其功能相当的变体。
3.权利要求1或2的遗传修饰的真菌，其特征在于它生产有用的产品。
4.权利要求1-3中任一项的遗传修饰的真菌，其特征在于它生产戊糖磷酸途径或真菌L-阿拉伯糖途径的衍生物，或者乙醇、乳酸、木糖醇或阿拉伯糖醇。
5.权利要求1-4中任一项的遗传修饰的真菌，其特征在于该真菌是酵母。
6.权利要求5的遗传修饰的真菌，其特征在于该酵母是糖酵母属(Saccharomyces)种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)种、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)种、毕赤氏酵母属(Pichia)种、假丝酵母属(Candida)种、或管囊酵母属(Pachysolen)种。
7.权利要求6的遗传修饰的真菌，其特征在于该菌株是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的遗传工程菌株。
8.权利要求1-4中任一项的遗传修饰的真菌，其特征在于该真菌是丝状真菌。
9.权利要求8的遗传修饰的真菌，其特征在于该菌株是曲霉属(Aspergillus)种、木霉属(Trichoderma)种、链孢霉属(Neurospora)种、镰孢属(Fusarium)种、青霉属(Penicillium)种、腐质霉属(Humicola)种、Tolypocladium geodes、Trichoderma reesei(Hypocrea jecorina)、毛霉属(Mucor)种、Trichodermalongibrachiatum、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑色曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的遗传工程菌株。
10.权利要求1-9中任一项的遗传修饰的真菌，其特征在于在修饰之前所述的真菌能够利用D-木糖。
11.从包含L-阿拉伯糖的生物质中生产有用产品的方法，其特征在于该产品是利用权利要求1-10中任一项的遗传修饰的真菌，从所述生物质中生产的。
12.权利要求11的方法，其特征在于所述的有用的产品是乙醇、乳酸或木糖醇。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述的有用的产品是乙醇。
14.分离的DNA分子，其特征在于它包含编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、具有序列SEQ ID NO.1的基因或其功能相当的变体。
15.分离的DNA分子，其特征在于它包含编码L-木酮糖还原酶、具有序列SEQ ID NO.2的基因或其功能相当的变体。
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