WO2011099657A1 - 신규 자일리톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ-자일룰로즈의 생산방법 - Google Patents

신규 자일리톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ-자일룰로즈의 생산방법 Download PDF

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WO2011099657A1
WO2011099657A1 PCT/KR2010/000836 KR2010000836W WO2011099657A1 WO 2011099657 A1 WO2011099657 A1 WO 2011099657A1 KR 2010000836 W KR2010000836 W KR 2010000836W WO 2011099657 A1 WO2011099657 A1 WO 2011099657A1
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xylitol dehydrogenase
xylulose
xylitol
present
gene
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PCT/KR2010/000836
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Inventor
이정걸
마리무투제야
장예왕
티와리마니쉬
문희정
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a novel xylitol dehydrogenase and a method for preparing xylulose using the same, and more particularly xylitol dehydrogenase, a nucleic acid molecule encoding the same, a vector comprising the nucleic acid molecule, a trait comprising the vector
  • the present invention relates to a method for preparing L-xylulose using a converting agent and the xylitol dehydrogenase.
  • L-carbohydrates and nucleoside derivatives thereof in the medical field has been greatly increased, and in particular, nucleoside variants of L-saccharides have been used as virus inhibitors against hepatitis B and HIV.
  • L-sugars have been used effectively for cancer treatment, which has been reported to be highly effective in increasing the mortality rate of tumor cells as well as inhibiting the growth rate of malignant cells (Mathe C, Gosselin G. Antiviral Res, 2006, 71: 276-). 281; Bicher H, 1997, US Patent 5,624,908.
  • L-xylulose is a non-naturally occurring pentose sugar that is a very expensive substance and is an inhibitor of glucosidase I, which inhibits glycoprotein processes in many cellular systems. L-xylulose may also be used as a precursor for other rare sugars. A paper on the conversion of L-xylulose to the rare sugar L-Rixose has already been published (Muniruzzaman S, Pan Y. T, Zeng Y, Atkins B, Izumori K, Elbein AD, Glycobiology, 1996, 6: 795 -803; Heinz F, Hertel S, Vogel M, 1998, WO Patent 9,820,882).
  • L-xylose has been reported to be converted to L-xylulose by treatment with enzyme isomerization or alkaline (HeikkilH, Koivikko H, Ravanko V, AlR, Nurmi J, Ojamo H, Haimi P, Tylli M, 2002, WO Patent 02,088,154), which can be used as an initial material for the production of L-ribonucleosides used in the synthesis of therapeutic agents (Jokela J, Pastinen O, Leisola M, Enzyme Microb Technol, 2002, 31: 6776; Bhuiyan SH , Ahmed Z, Utamura M, Izumori K, J Ferment Bioeng, 1998, 86: 513-516).
  • D- and L-xylulose exist as intermediates in the metabolic processes of prokaryotic and eukaryotic organisms (Doten RC, Mortlock R. P, J Bacteriol, 1985, 162: 845-848). Some bacteria are known to metabolize xylitol first in the form of L- or D-xylulose. Bacterial breeding to produce L-xylulose has been attempted by the use of mutation methods and genetic engineering techniques. Mutation production resulted in the Pnatoea ananatis ATCC43072 strain, which still synthesizes xylitol-4-dehydrogenase, but lost the enzymatic activity of L-xylokinase. With P.
  • L-xylulose is converted from xylitol, but L-xylulose remains unmetabolized because phosphorylation no longer occurs.
  • 64% conversion yield was obtained from xylitol at 18 hours of fermentation.
  • the conversion rate is very slow, and the productivity is low and complex purification process and by-products are formed (Doten RC, Mortlock RP, Appl Environ Microbiol, 1985, 49: 158-162).
  • Several productions of L-xylose using Alcaligenes sp 701B and Bacillus pallidus have been reported several times, but they do not actually reach useful levels of accumulation.
  • L-xylulose may be prepared by presenting an optimal reaction condition capable of producing L-xylulose using xylitol dehydrogenase capable of producing L-xylulose from L-xylitol and such an enzyme. It is intended to provide a method for mass production at low cost with high yield.
  • the present invention solves the above problems, and the first object of the present invention to be devised by the necessity of the above is to provide a xylitol dehydrogenase.
  • a second object of the present invention is to provide a gene encoding the xylitol dehydrogenase.
  • a third object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising the gene of the xylitol dehydrogenase.
  • a fifth object of the present invention is to provide a method for producing recombinant xylitol dehydrogenase using a transformed strain.
  • a sixth object of the present invention is to provide a method for preparing L-xylulose from xylitol using the enzyme.
  • the present invention provides an xylitol dehydrogenase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a functional fragment thereof.
  • the xylitol dehydrogenase is preferably derived from a lyzobiium atelier, but is not limited thereto.
  • the xylitol dehydrogenase is characterized in that it is specific for L-xylulose.
  • the molecular weight of the enzyme of the present invention is characterized in that 34 kDa.
  • the enzyme of the present invention is characterized by an increase in activity in the presence of magnesium ions and NAD + , most preferably 3 mM Mg 2+ and 0.5 mM NAD + .
  • the present invention also provides a xylitol dehydrogenase gene encoding the enzyme of the present invention.
  • the gene of the present invention preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, at least 85%, preferably at least 90% or more, more preferably from the sequence of SEQ ID NO: 3 in consideration of degeneracy of the genetic code, etc. Is preferably a sequence having at least 95% homology, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for producing xylitol dehydrogenase by culturing a strain transformed with a recombinant expression vector comprising the xylitol dehydrogenase gene of the present invention.
  • the present invention also provides a method for preparing L-xylulose from xylitol using the xylitol dehydrogenase of the present invention.
  • Xylitol dehydrogenase of the present invention is characterized by having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • deletion, substitution and addition of at least one amino acid of at least one amino acid are introduced within a range in which the xylitol dehydrogenase activity indicated by the protein having these amino acid sequences is not impaired.
  • Mutated xylitol dehydrogenase is also included in the xylitol dehydrogenase according to the present invention.
  • the present invention includes a xylitol dehydrogenase gene encoding a xylitol dehydrogenase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the gene sequence thereof is represented by SEQ ID NO: 3.
  • the mutant xylitol dehydrogenase gene encoding the above-described mutant xylitol dehydrogenase gene obtained by mutating the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 is also included in the xylitol dehydrogenase gene of the present invention.
  • the present invention also includes a recombinant vector containing the xylitol dehydrogenase gene and a transformant transformed by the recombinant vector.
  • the present invention also includes a method for producing xylitol dehydrogenase, wherein the transformant is cultured to separate xylitol dehydrogenase from the obtained culture.
  • the xylitol dehydrogenase gene of the present invention is isolated from the cells of Lysiumium atelier.
  • chromosomal DNA is obtained from a strain having a xylitol dehydrogenase gene.
  • the designed oligonucleotide is used as a primer, and the polymerase chain reaction (PCR) is performed by using the chromosomal DNA of the Ryzobium ateli strain as a template to partially amplify the xylitol dehydrogenase gene.
  • the PCR amplification fragments thus obtained were 100% homologous to the xylitol dehydrogenase gene of the Ryzobium atelier strain, and a high S / N ratio could be expected as a probe for colony hybridization. At the same time, it facilitates the stringency control of hybridization.
  • the PCR amplification fragments are labeled with appropriate reagents, and colony hybridization is performed on the chromosomal DNA libraries to select xylitol dehydrogenase genes (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, p. 603, 1994). ).
  • DNA fragments containing the xylitol dehydrogenase gene can be obtained by recovering the plasmid from the E. coli selected by the above method using alkaline method (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, p. 161, 1994). After determining the nucleotide sequence by the above method, it is possible to obtain the entire gene of the present invention by hybridizing the DNA fragment prepared by digestion by restriction enzymes of the DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the xylitol dehydrogenase gene of the present invention
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence encoded by the gene.
  • the transformed microorganism of the present invention is obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector.
  • a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector for example, when a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector according to the present invention can autonomously replicate in the host and, at the same time, include a promoter, a DNA containing a xylitol dehydrogenase gene, a transcription termination sequence, or the like. It is preferable to have a structure necessary for the expression of. PGEX-KG was used as the expression vector used in the present invention, but any expression vector satisfying the above requirements can be used.
  • a transformant obtained by transforming a host with a recombinant vector having a gene encoding the same is cultured, and dehydration of xylitol as a gene product in a culture (cultured cell or culture supernatant)
  • the digestion enzyme is produced and accumulated, and the enzyme is obtained from the culture.
  • Acquisition and purification of xylitol dehydrogenase can be carried out by centrifuging the cells or supernatant from the obtained culture, followed by cell disruption, affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography or the like alone or in combination.
  • the present inventors cloned the genes of xylitol dehydrogenase from Ryzobiium atelier to develop enzymes capable of producing L-xylulose in high yields. It was confirmed that the recombinant strain incorporating the above-described gene can not only prepare L-xylulose from xylitol in high yield, but also greatly reduce the production of by-products, and completed the present invention.
  • the present invention clones a gene encoding xylitol dehydrogenase from the gene of lyzobium atelier to produce industrially useful xylitol dehydrogenase, and analyzes the base sequence of the gene and the amino acid sequence inferred therefrom.
  • the xylitol dehydrogenase of the present invention is an enzyme that forms L-xylulose by catalyzing the dehydrogenation reaction using xylitol as a substrate, and more preferably has specificity for dehydrogenation and converts xylitol to L-xylulose. Xylitol dehydrogenase with the ability to do so.
  • the xylitol dehydrogenase of the present invention has the following characteristics: (iii) a molecular weight of about 34 kDa; (Ii) Enzyme activity appears in the presence of NAD + and Mg 2+ .
  • xylitol dehydrogenases show low L-xylulose conversion.
  • the xylitol dehydrogenase of the present invention uses xylitol to produce L-xylulose in high yield. Therefore, the enzyme of the present invention which produces L-xylulose in high yield in xylitol will be very specific and will be usefully applied in the production of L-xylulose from sugar mixtures.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a search through Southern hybridization of a fragment having xylitol dehydrogenase in a lysium vitreous genomic DNA, where lanes 1, 2, 3, and 4 are each restricted. Enzymes BamHI, EcoRI, HindIII, PstI and the like.
  • Figure 2 is a vector map of the vector pUC-LAD to find a fragment carrying the xylitol dehydrogenase gene on the chromosome of the R. zombies and cloned into a vector used in E. coli.
  • Figure 3 is a view showing a method for producing an expression vector comprising a xylitol dehydrogenase gene derived from Ryzodium atelier strain.
  • FIG. 4 is a SDS-PAGE gel photograph of xylitol dehydrogenase derived from Ryzobium ateli strain.
  • FIG. 5 is a diagram showing an initial titer concentration of substrate xylitol in a method for producing L-xylulose using E. coli, which comprises xylitol dehydrogenase derived from a strain of Ryzobium.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a reaction time in a method of producing L-xylulose using Escherichia coli including xylitol dehydrogenase derived from a strain of Ryzobium.
  • Figure 7-8 is a diagram showing the appropriate temperature and pH in the method for producing L-xylulose using Escherichia coli containing xylitol dehydrogenase derived from the strain of Lyzobium.
  • Figure 9 is a graph showing the production of L-xylulose using E. coli containing xylitol dehydrogenase derived from the Ryzobiium atelier strain.
  • the ITS-5.8S rDNA sequence was analyzed at the Korea Microorganism Conservation Center. As a result of analyzing the soft relationship with the similar species of the ITS-5.8S rDNA sequence of the S3 strain, it was identified as Rhizobium etli.
  • the S3 strain was named Rhizobium etli, and was deposited internationally under the Budapest Treaty under the deposit number KCCM11059P on January 28, 2010, at the Korea Microorganism Conservation Center in Hongje-dong, Seodaemun-gu, Korea.
  • Rizobiium atelier was used to obtain the nucleotide sequence of L-arabinitol dehydrogenase gene, an L-arabitol degrading enzyme.
  • genes with similar functions are known to be somewhat similar in size to each nucleotide sequence. Therefore, it is assumed that the gene of xylitol dehydrogenase of Lyzobium atelier has a size of about 1.0 kb, and the entire gene of xylitol dehydrogenase of Lyzobium atelier is based on the other known xylitol dehydrogenase sequence. Cloned.
  • E. coli XL1-Blue (NEB, UK) and pUC18 vector (NEB, UK) were used for cloning.
  • LB medium Difco, USA
  • peptone agar medium Malt extract peptone agar
  • E. coli plate media include LB agar (Difco, USA), 35% sugar (Difco, USA), 0.30.5% beef extract (Difco, USA), 0.91.1% Bakto peptone (Difco, USA). , USA), agar plates of 1.31.7% agar composition were used. 50 ⁇ g / ml ampicillin (Sigma, USA) was added as needed.
  • the culture method was inoculated in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of culture medium for 1 day at 37 ° C. and 200 rpm, and 16 hours at 37 ° C. and 200 rpm for E. coli. It was.
  • RNA extraction of Ryzobium atelier was performed using a Qiagen plant total RNA kit (QIAGEN), and a reverse transcriptase for cDNA synthesis was used with Oligo-dT RT-mix (intron).
  • the Ryzobium messe chromosome was isolated to clone the xylitol dehydrogenase gene.
  • a portion of the xylitol dehydrogenase gene corresponding to the size of 650 bp was amplified on the chromosome of the lysodium atelier by a chain polymerization reaction.
  • genomic DNA of the lyzobiium atelier was completely cleaved using restriction enzymes BamHI, EcoRI, HindIII, and PstI which do not have a cleavage site in the amplified partial sequences.
  • a radiolabeled probe was made using a DNA fragment obtained through the polymerase chain reaction. Using this, the DNA fragment containing the gene to be searched by Southern hybridization was searched (FIG. 1).
  • Colony hybridization was performed using the 650 bp probe made in the pUC-LAD library to determine clones with the desired xylitol dehydrogenase gene.
  • the nucleotide sequence was analyzed using the determined clone, and the total gene nucleotide sequence of xylitol dehydrogenase was identified as 1,044 bp (SEQ ID NO: 3). As expected, it was similar in size to the xylitol dehydrogenase gene found in several other bacteria. In addition, it was confirmed that the lyzobium atelier xylitol dehydrogenase has a nucleotide sequence common to other xylitol dehydrogenases.
  • the recombinant strain prepared in Example 4 was inoculated in LB medium and incubated at 37 ° C. for 24 hours, and then the protein expressed in the SDS-PAGE gel was confirmed (FIG. 4).
  • the recombinant strain culture solution was centrifuged (8000 ⁇ g, 10 minutes) to collect only the cells, and then subjected to sonication to disrupt the cell wall of Escherichia coli, The precipitate was removed by centrifugation at 20,000 ⁇ g for 20 minutes to obtain a supernatant. Subsequently, the supernatant was heat-treated at 70 ° C. for 15 minutes, centrifuged at 20,000 ⁇ g for 20 minutes to remove precipitates, and then the supernatant was obtained. Finally, column chromatography was performed using GSTrap (GE Healthcare, Sweden). The recombinant xylitol dehydrogenase was purified purely.
  • Example 5 The physical and chemical properties of the xylitol dehydrogenase isolated in Example 5 were investigated, and xylitol was used as a substrate.
  • the enzyme reaction experiment was performed under the following conditions. NAD + and NADP + were added as coenzymes using xylitol as a substrate and enzyme activity was measured. Bacterial culture and enzyme purification were performed in the same manner as in Example 3, and the enzyme and the substrate were reacted at 25 ° C. in the presence of 400 mM xylitol substrate solution, 0.5 mM NAD +, 0.5 mM NADP +.
  • Example 7-1 Optimal Initial Substrate Concentration for L-Riboulose Production
  • LB As microbial production medium, LB was used. As enzyme production medium, glycerol 10g L -1 , peptone 1g L -1 , yeast extract 30g L -1 , potassium diphosphate 0.14g L -1 , sodium monophosphate 1g L -1 Added medium was used. When the absorbance at 600 nm was 0.6, 0.1 mM ITPG was added to induce enzyme production. Stirring speed during the process was 200 rpm, the culture temperature was maintained at 37 °C. The conversion rate of L-xylulose from xylitol was confirmed by setting the concentration of xylitol as a substrate to 15-120 g L -1 . The results are shown in FIG.
  • the concentration of the initial substrate in the L-ribulose production method of the present invention was 60g L -1 .
  • the bacterial culture and enzyme purification were performed in the same manner as in Example 7-1, and the conversion ratio to L-xylulose was confirmed in 0 g of 0-25 hours in a 60 g L- 1 substrate solution. As shown in Figure 6, the conversion rate was maintained at 70% or more until the production time 10-25 hours. In particular, after 6 hours of production, production was no longer increased. Therefore, it was found that the optimal bacterial culture time in the L-xylulose production method of the present invention is between 6-10 hours.
  • Bacterial culture and enzyme purification were performed in the same manner as in Example 7-1, and the bacteria were incubated at a temperature of 25, 30, 35, 37, 40 ° C. in a substrate solution of 60 g L ⁇ 1 , and transferred to L-xylulose. The conversion ratio was confirmed. As shown in Figure 7, when the bacteria culture temperature was maintained at 25-40 °C showed only a difference of about 8%. Among them, the conversion ratio to L-xylulose was the highest at 35 ° C. Therefore, it was found that the optimum bacterial culture temperature in the L-xylulose production method of the present invention is 35 °C.
  • Example 7-5 Production of L-Xylulose at Optimal Conditions Using Novel Xylitol Dehydrogenase Derived from Lysodium Ethyl
  • the productivity of L-xylulose was 8.6 g L ⁇ 1 h ⁇ 1
  • the conversion of L-xylulose from xylitol was 86%
  • the production concentration was 51.6 g L ⁇ 1 .
  • L-xylulose produced by the xylitol dehydrogenase of the present invention is a non-naturally occurring pentose sugar, a very expensive substance, and it is an inhibitor of glucosidase I, which acts as an inhibitor of glycoprotein processes in various cellular systems.
  • L-xylulose may also be used as precursor of other rare sugars.
  • L-xylulose is converted to L-xylose by isomerization, which can be used as an initial material in the production of L-ribonucleosides used in the synthesis of therapeutic agents.
  • the nucleosides derived here have shown considerable potential as useful antiviral agents.

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Abstract

본 발명은 신규 자일리톨 탈수소화효소의 유전자로부터 발현되는 자일리톨 탈수소화효소, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질 전환된 균주로부터 자일리톨 탈수소화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용한 L-자일룰로즈의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 자일리톨 탈수소화효소는 특이적으로 자일리톨만을 전환시키며, 안정적으로 효소반응을 촉매 할 수 있다. 라이조비움 에틸리 유래 자일리톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 L-자일룰로즈의 생산방법은 L-자일룰로즈의 대량 생산에 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

신규 자일리톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 Ｌ-자일룰로즈의 생산방법
본 발명은 신규 자일리톨 탈수소화효소 및 그를 이용한 자일룰로즈의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자일리톨 탈수소화효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 자일리톨 탈수소화효소를 이용한 L-자일룰로즈의 제조방법에 관한 것이다.
최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 특히, L-당의 뉴클레오사이드 변형체는 B형간염과 HIV에 대한 바이러스 억제제로 사용되고 있고 있다. L-당은 암치료에도 효과적으로 쓰이고 있는데 이는 종양 세포의 치사율을 높일 뿐만 아니라 malignant cell의 성장률을 저해하는 것에도 상당히 효과적인 것으로 보고되고 있다 (Mathe C, Gosselin G. Antiviral Res, 2006, 71:276-281; Bicher H, 1997, US Patent 5,624,908).
L-자일룰로즈는 천연에 존재하지 않은 오탄당으로 매우 고가의 물질이며, 이는 glucosidase Ⅰ의 저해제로 여러 세포 시스템에 있어서 glycoprotein 과정에 억제제로 작용한다. 또한 L-자일룰로즈는 다른 희소당의 전구체서도 이용될 수 있다 다. L-자일룰로즈가 희소당인 L-릭소오스로 전환되는 논문은 이미 발표된 바 있다 (Muniruzzaman S, Pan Y. T, Zeng Y, Atkins B, Izumori K, Elbein AD, Glycobiology, 1996, 6:795-803; Heinz F, Hertel S, Vogel M, 1998, WO Patent 9,820,882). 효소 이성화반응이나 알칼리 상태로 처리하면 L-자일로즈가 L-자일룰로즈로 전환되는 보고가 있으며 (HeikkilH, Koivikko H, Ravanko V, AlR, Nurmi J, Ojamo H,Haimi P, Tylli M, 2002, WO Patent 02,088,154), 이는 치료용 제재 합성에 이용되는 L-리보뉴클레오사이드의 생산에 초기 물질로 사용될 수 있다 (Jokela J, Pastinen O, Leisola M, Enzyme Microb Technol, 2002, 31:6776; Bhuiyan SH, Ahmed Z, Utamura M, Izumori K, J Ferment Bioeng, 1998, 86:513-516).
D-, L-자일룰로즈는 원핵 그리고 진핵 생물의 대사 과정에 있어서 중간체로 존재한다 (Doten R.C, Mortlock R. P, J Bacteriol, 1985, 162:845-848). 몇몇의 박테리아에서는 자일리톨 먼저 L- 또는 D-자일룰로즈의 형태로 산화시켜 대사하는 것으로 알려져 있다. L-자일룰로즈를 생산하기 위한 세균의 육종은 돌연변이 방법과 유전자 조작 기술의 이용에 의해 시도되어 왔다. 돌연변이 생성을 통해 Pnatoea ananatis ATCC43072 균주를 만들었는데, 이 균주는 여전히 자일리톨-4-탈수소효소를 합성하지만, L-자일룰로카이네이즈의 효소 활성은 잃었다. P. ananatis을 이용하면, 자일리톨로부터 L-자일룰로즈는 전환 되지만 인산화 반응이 더 이상 일어나지 않기 때문에 L-자일룰로즈가 대사되지 않고 남아있게 된다. 이 균주를 이용하여 자일리톨로부터 발효 18시간에 64% 전환 수율을 얻었지만 전환속도가 매우 느리며, 생산성이 낮고 복잡한 정제과정 및 부산물을 형성하는 등 단점이 있다 (Doten R.C, Mortlock R.P, Appl Environ Microbiol, 1985, 49:158-162). Alcaligenes sp 701B와 Bacillus pallidus를 이용한 L-자일룰로즈 생산이 수차례 보고된 바는 있으나, 실제로 유용한 축적 수준에 이르지 못한다. 따라서, 미생물 및 그의 효소를 사용하여 L-자일리톨부터 L-자일룰로즈를 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있으며 (Anne U, Kristiina K, Matti L, Antti N, J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36:1323-1330), 이와 같이 생촉매를 사용하여 L-자일룰로즈를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
본 발명에서는 L-자일리톨로부터 L-자일룰로즈를 생산할 수 있는 자일리톨 탈수소화효소 및 그와 같은 효소를 이용하여 L-자일룰로즈를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시함으로써, L-자일룰로즈를 높은 수율로 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 자일리톨 탈수소화효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 자일리톨 탈수소화효소를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 자일리톨 탈수소화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 균주를 이용한 재조합 자일리톨 탈수소화효소 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 자일리톨로부터 L-자일룰로즈를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 자일리톨 탈수소화효소를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 자일리톨 탈수소화효소는 라이조비움 에틀리에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명의 바람직한 일 구체 예에 있어서 상기 자일리톨 탈수소화효소는 L-자일룰로즈에 특이적인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체 예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 34 kDa인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 상기 효소는 마그네슘 이온과 NAD+, 가장 바람직하게는 3 mM Mg2+ 그리고 0.5 mM NAD+ 존재 시 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 제공한다.
본 발명의 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 3에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 자일리톨 탈수소화효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 자일리톨 탈수소화효소를 이용하여 자일리톨로부터 L-자일룰로즈를 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명의 자일리톨 탈수소화효소는 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 4의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 자일리톨 탈수소화효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 자일리톨 탈수소화효소도 본 발명에 관한 자일리톨 탈수소화효소에 포함된다.
또, 본 발명에는 서열번호 4의 아미노산서열을 가진 자일리톨 탈수소화효소를 코딩하는 자일리톨 탈수소화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 3으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 3의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 자일리톨 탈수소화효소를 코딩하는 변이 자일리톨 탈수소화효소 유전자도 본 발명에 관한 자일리톨 탈수소화효소 유전자에 포함된다.
또, 본 발명에는, 상기 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게되는 배양물로부터 자일리톨 탈수소화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 자일리톨 탈수소화효소의 제조방법이 포함된다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 자일리톨 탈수소화효소 유전자는 라이조비움 에틀리의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 라이조비움 에틀리 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 라이조비움 에틀리 균주의 자일리톨 탈수소화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).
상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 3에는 본 발명의 자일리톨 탈수소화효소 유전자의 염기서열을 서열번호 4에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다.
본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pGEX-KG를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.
본 발명에 관한 자일리톨 탈수소화효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 자일리톨 탈수소화효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.
자일리톨 탈수소화효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.
본 발명자는 높은 수율로 L-자일룰로즈를 제조할 수 있는 효소를 개발하고자 라이조비움 에틀리부터 자일리톨 탈수소화효소의 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 자일리톨로부터 높은 수율로 L-자일룰로즈를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 부산물의 생성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 산업적으로 유용한 자일리톨 탈수소화효소를 제조하기 위하여 라이조비움 에틀리의 유전자로부터 자일리톨 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다.
본 발명의 자일리톨 탈수소화효소는 자일리톨을 기질로 하여 탈수소화반응을 촉매하여 L-자일룰로즈를 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 탈수소화에 대한 특이성을 갖고 자일리톨을 L-자일룰로즈로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 자일리톨 탈수소화효소를 의미한다.
본 발명의 자일리톨 탈수소화효소는 다음의 특징을 갖는다: (ⅰ) 분자량이 약 34 kDa; (ⅱ) NAD+와 Mg2+ 존재 시 효소 활성이 나타난다.
기존에 알려진 자일리톨 탈수소화효소는 낮은 L-자일룰로즈 전환율을 보이고 있다. 그러나 본 발명의 자일리톨 탈수소화효소는 자일리톨을 이용하여 높은 수율로 L-자일룰로즈를 생산한다. 따라서 자일리톨에서 L-자일룰로즈를 높은 수율로 생산하는 본 발명의 효소는 매우 특이하다 할 것이며, 당 혼합물로부터 L-자이룰로즈의 생산에 유용하게 적용될 것이다.
도 1은 라이조비움 에틀리 염색체(genomic DNA) 내에서 자일리톨 탈수소화효소를 지닌 단편의 서어던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 통한 탐색을 나타낸 도면으로, lane 1, 2, 3, 4는 각각 제한 효소 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI 등을 처리한 것이다.
도 2는 벡터 pUC-LAD의 벡터맵으로 라이조비움 에틀리의 염색체에서 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝한 것이다.
도 3은 라이조비움 에틀리 균주로부터 유래된 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 4는 라이조비움 에틀리 균주로부터 유래된 자일리톨 탈수소화효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 5는 라이조비움 에틀리 균주로부터 유래된 자일리톨 탈수소화효소를 포함하는 대장균을 이용하여 L-자일룰로즈를 생산하는 방법에서, 기질 자일리톨의 초기 적정 농도를 나타낸 도면이다.
도 6은 라이조비움 에틀리 균주로부터 유래된 자일리톨 탈수소화효소를 포함하는 대장균을 이용하여 L-자일룰로즈를 생산하는 방법에서, 반응시간을 나타낸 도면이다.
도 7-8은 라이조비움 에틀리 균주로부터 유래된 자일리톨 탈수소화효소를 포함하는 대장균을 이용하여 L-자일룰로즈를 생산하는 방법에서, 적정 온도와 pH를 나타낸 도면이다.
도 9는 라이조비움 에틀리 균주로부터 유래된 자일리톨 탈수소화효소를 포함하는 대장균을 이용한 L-자일룰로즈의 생산량을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 의도로 기재된 것으로서, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 자일리톨 탈수소화효소 생산균의 선별
자일리톨 탈수소화효소를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 각종 균의 배양액 10ul를 생리식염수 10ml에 현탁하고, 현탁액의 10ul(1×104 cfu ml-1)취하여 3% malt extract가 첨가된 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)(Difco, 미국) 에 도말한 후, 37℃에서 2일간 배양 하였다. 고체 펩톤배지에서 콜로니가 형성된 후 콜로니를 취하여 자일리톨을 기질로 하여 효소 활성을 가지는 자일리톨 탈수소화효소 활성을 갖는 균들을 선별하는 방법으로 다양한 균으로부터 자일리톨 탈수소화효소를 생산하는 균을 탐색하였다.
위의 탐색과정을 통해 1차 선별된 균주(S1부터 S7까지)를 대조군(C)으로 종래 자일리톨 탈수소화효소 생산균주로 이용되는 글루코노박터를 이용하여, 상기와 같이 자일리톨을 기질로 하여 자일리톨 탈수소화효소 활성이 있는 것을 확인한 후, 효소 활성이 가장 뛰어난 S3 균주를 선별하였다.
실시예 2: 균주의 동정
실시예 1에서 분리한 S3 균주의 동정을 위하여 한국미생물 보존센터에서 ITS-5.8S rDNA 서열을 분석하였다. 상기 S3 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과 라이조비움 에틀리(Rhizobium etli)로 동정되었다.
상기 S3 균주는 라이조비움 에틀리(Rhizobium etli)로 명명하였고, 대한민국 서대문구 홍제동 소재 한국미생물보존센터에 2010년 1월 28일 기탁번호 KCCM11059P호로 부다페스트조약에 의거하여 국제 기탁하였다.
실시예 3: 라이조비움 에틀리로부터 신규 자일리톨 탈수소화효소 유전자의 클로닝
L-아라비톨 분해 효소인 L-아라비니톨 탈수소화효소 유전자의 염기서열을 얻기 위해 라이조비움 에틀리를 사용하였다. 일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열과 크기가 어느 정도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 라이조비움 에틀리의 자일리톨 탈수소화효소의 유전자도 약 1.0kb정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 다른 균의 이미 알려진 자일리톨 탈수소화효소 염기서열을 바탕으로 라이조비움 에틀리의 자일리톨 탈수소화효소 전체 유전자를 클로닝하였다.
클로닝에는 대장균 XL1-Blue(NEB, 영국)와 pUC18 벡터(NEB, 영국)를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지(Difco, 미국)를 사용하였고, 라이조비움 에틀리의 배양에는 상기 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)를 사용하였다. 대장균의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar) (Difco, 미국)와 35% 설탕 (Difco, 미국), 0.30.5% 쇠고기 추출물 (Difco, 미국), 0.91.1% 박토 펩톤 (Difco, 미국), 1.31.7% 아가 조성의 아가 플레이트를 사용하였다. 필요에 따라 50 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin) (Sigma, 미국)을 첨가하였다.
배양 방법은 라이조비움 에틀리의 경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 37℃, 200 rpm 조건에서 1일간 배양하였고, 대장균의 경우에는 37℃, 200 rpm 조건에서 16 시간 배양하였다.
대부분의 DNA는 아가로스겔(TAE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QiaXII 겔 추출장지(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(NEB)를 이용하였다. 또한 라이조비움 에틀리의 RNA 추출은 Qiagen plant total RNA kit(QIAGEN)을 이용하였으며, cDNA 합성을 위한 역전사 효소는 Oligo-dT RT-mix(intron)를 이용하였다.
자일리톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하기 위하여 라이조비움 에틀리 염색체를 분리하였다. 라이조비움 에틀리 자일리톨 탈수소화효소 유전자의 일부분을 증폭하기위해 다른 균에서 이미 알려진 자일리톨 탈수소화효소 염기서열을 바탕으로 비특이적 프라이머(degenerated primer), ReXDH F-5'-TCK SBC ATD ARK CGG SBV RDD CSB YRN TCG-3' (서열번호 1)와 ReXDH R-5'-TGH BRD TSN CCG KYR AGA CGT CBV AAC CWM CAG KST T-3' (서열번호 2)를 제작하였다. 이를 이용하여 연쇄중합반응에 의해 650bp 크기에 해당하는 자일리톨 탈수소화효소 유전자 일부를 라이조비움 에틀리의 염색체에서 증폭하였다.
그리고 증폭된 상기의 부분 염기서열 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI을 이용하여 라이조비움 에틀리의 genomic DNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 만들었다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다(도 1).
BamHI, EcoRI으로 염색체를 자른 경우에 있어서는 서어던 하이브리다이제이션의 결과 나타난 자일리톨 탈수소화효소의 유전자를 지닌 DNA의 크기가 큰 관계로 이용하지 않았고, 2.0kb 정도의 PstI으로 잘린 조각과 약 2.5 kb정도의 HindIII으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 라이조비움 에틀리 염색체를 PstI으로 절단한 후 분리한 2.0kb 정도 크기의 DNA 조각과 HindIII으로 절단한 2.5kb 정도의 DNA 단편들을 pUC18에 클로닝하고 이를 pUC-XDH라고 명명하였다 (도 2).
pUC-LAD 라이브러리에서 앞서 만든 650bp 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 자일리톨 탈수소화효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석하여 자일리톨 탈수소화효소의 전체 유전자 염기서열 1,044bp를 밝혔다 (서열번호 3). 이는 앞서 예상한 바와 같이 다른 여러 균에서 밝혀진 자일리톨 탈수소화효소 유전자와 크기가 비슷하였다. 또한 라이조비움 에틀리 자일리톨 탈수소화효소는 다른 자일리톨 탈수소화효소에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 지니고 있음을 확인하였다.
실시예 4: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 3에 따른 자일리톨 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 자일리톨 탈수소화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pGEX-KG(ATCC, 미국) BamHⅠ과 SalⅠ부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 3).
실시예 5: 재조합 자일리톨 탈수소화효소의 발현 및 순수 분리
상기 실시예 4에서 제조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 4).
상기 실시예 5의 방법으로 발현시킨 재조합 자일리톨 탈수소화효소효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리 하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 이어, 상기 상등액을 70℃에서 15분간 열처리하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 상등액을 수득한 후, 최종적으로 GSTrap (GE Healthcare, 스웨덴)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 재조합 자일리톨 탈수소화효소를 순수 분리하였다.
실시예 6: 재조합 자일리톨 탈수소화효소의 특성 실험
상기 실시예 5에서 분리된 자일리톨 탈수소화효소의 물리 화학적 특성을 조사하였으며, 기질로서 자일리톨을 사용하였다.
실시예 6-1: 조효소
상기 실시예 5의 방법으로 정제한 제조한 자일리톨 탈수소화효소의 조효소를 알아보기 위하여, 효소 반응실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 자일리톨을 기질로 하여 NAD+, NADP+ 를 조효소로 첨가한 뒤 효소 활성을 측정하였다. 균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 400mM의 자일리톨 기질 용액, 0.5mM NAD+, 0.5mM NADP+의 존재 하에서 25℃의 온도 하에서 효소와 기질을 반응시켰다. 표1에 나타난 바와 같이, 0.5mM NAD+ 존재 시 재조합 자일리톨 탈수소화효소의 활성이 나타났으며, NADP+ 존재 시에는 그 활성이 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 자일리톨 탈수소화효소의 조효소로는 0.5mM NAD+가 필요함을 알 수 있었다.
표 1
Figure PCTKR2010000836-appb-T000001
실시예 6-2: 금속이온의 효과
순수 정제된 자일리톨 탈수소화효소의 금속 이온이 효소 활성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 본 실험을 수행하였다. 최종농도 20mM의 MgCl2, MnCl2, CoCl2, ZnCl2, 또는 CaCl2를 효소 반응액에 첨가한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 20mM 농도에서 다양한 금속의 자일리톨 탈수소화효소 활성에 대한 영향은 표 2에 나타내었다. 자일리톨 탈수소화효소는 Mg2+ 존재 시 효소 활성이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 자일리톨 탈수소화효소의 효소 활성은 Mg2+ 존재 시 효소 반응이 일어남을 알 수 있었다.
표 2
Figure PCTKR2010000836-appb-T000002
실시예 7: 신규 자일리톨 탈수소화효소를 이용한 L-자일룰로즈 생산방법
실시예 7-1: L-리불로스 생산을 위한 최적 초기 기질 농도
상기 실시예 4에서 제조한 자일리톨 탈수소화효소를 삽입한 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 자일리톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 초기 기질의 농도를 변화시키면서 자일리톨과 L-자일룰로스의 비율을 확인하였다.
미생물 생산배지로는 LB를 사용하였고 효소 생산배지로는 글리세롤 10g L-1, 펩톤 1g L-1, 효모 추출물 30g L-1, 이인산칼륨 0.14g L-1, 일인산나트륨 1g L-1가 첨가된 배지를 사용하였다. 600nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM ITPG를 첨가하여 효소 생산을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 유지하였다. 기질인 자일리톨의 농도를 15-120g L-1로 하여 자일리톨로부터 L-자일룰로스의 전환율 확인하였으며. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, L-자일룰로즈 생산에서 기질인 자일리톨을 15-60 g L-1로 하였을 때, 자일리톨에서 L-자일룰로즈의 변환 비율은 70% 이상이었고, 기질인 자일리톨을 15g L-1로 하였을 때, 자일리톨에서 L-자일룰로즈의 변환 비율은 88%였다. 따라서, 최종 농도를 고려하여 본 발명의 L-리불로스 생산 방법에서 초기 기질의 농도는 60g L-1로 하였다.
실시예 7-2: L-자일룰로즈 생산을 위한 최적 온도
상기 실시예 4에서 제조한 자일리톨 탈수소화효소를 삽입한 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 자일리톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 균 배양 시간을 변화시키면서 자일리톨과 L-자일룰로즈의 비율을 확인하였다.
균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 7-1과 같이 수행하였으며, 60g L-1의 기질 용액에서 0-25 시간까지 L-자일룰로즈로의 변환비율을 확인하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 생산 시간 10-25 시간까지는 전환율이 70% 이상 유지가 되었다. 특히 생산 6시간이 지난 후에는 더 이상 생산량이 증가되지 않음을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 최적 균 배양 시간은 6-10 시간 사이임을 알 수 있었다.
실시예 7-3: L-자일룰로즈 생산을 위한 최적 온도
상기 실시예 4에서 제조한 자일리톨 탈수소화효소를 삽입한 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 자일리톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 균 배양 온도를 변화시키면서 자일리톨과 L-자일룰로즈의 비율을 확인하였다.
균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 7-1과 같이 수행하였으며, 60g L-1의 기질 용액에서 25, 30, 35, 37, 40℃의 온도 하에서 균을 배양시키며, L-자일룰로즈로의 변환비율을 확인하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 균 배양 온도를 25-40℃로 유지하였을 때 8% 정도만의 차이를 보였다. 그 중 35℃에서 L-자일룰로즈로의 변환 비율이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 최적 균 배양 온도는 35℃임을 알 수 있었다.
실시예 7-4: L-자일룰로즈 생산을 위한 최적 pH
상기 실시예 4에서 제조한 자일리톨 탈수소화효소를 삽입한 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 자일리톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 균 배양시 pH를 변화시키면서 자일리톨과 L-자일룰로즈의 비율을 확인하였다.
균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 7-1과 같이 수행하였으며, 60g L-1의 기질 용액에서 35℃의 온도 하에서 균을 배양시키며, pH 4.0-8.0까지 변화 시키면서 L-자일룰로즈로의 변환비율을 확인하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 초기 pH를 5.0으로 유지하였을 때, L-자일룰로즈로의 변환 비율이 가장 높았다. L-자일룰로즈의 생산은 염기성 조건에 불안정하였다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 최적 초기 pH는 5.0임을 알 수 있었다.
실시예 7-5: 라이조비움 에틸리 유래 신규 자일리톨 탈수소화효소를 이용한 최적 조건에서의 L-자일룰로즈 생산
신규 자일리톨 탈수소화효소를 이용한 최대 L-자일룰로즈 생산을 하기 위하여 상기의 최적 조건에서 생산 실험을 수행하였다. 60 g L-1의 기질 용액, 35℃, 초기 pH 5.0에서 L-자일룰로즈의 생산실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, L-자일룰로즈의 생산성은 8.6 g L-1 h-1, 자일리톨로부터 L-자일룰로즈의 전환율은 86%, 생산농도는 51.6 g L-1 이었다. 이러한 수율 및 최종 농도는 자일리톨부터 L-자일룰로즈 생산에서 매우 우수한 수치이다. 따라서 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법은 기존의 방법에 비해 우수한 수율 및 고농도로 L-자일룰로즈의 생산이 가능하도록 한다.
본 발명의 자일리톨 탈수소화효소에 의해 생산된 L-자일룰로즈는 천연에 존재하지 않은 오탄당으로 매우 고가의 물질이며, 이는 glucosidase Ⅰ의 저해제로 여러 세포 시스템에 있어서 glycoprotein 과정에 억제제로 작용한다. 또한 L-자일룰로즈는 다른 희소당의 전구체서도 이용될 수 있다. L-자일룰로즈는 이성화 작용에 의해 L-자일로즈로 전환되며, 이는 치료용 제재 합성에 이용되는 L-리보뉴클레오사이드의 생산에 초기 물질로 사용될 수 있다. 여기서 유도된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다.
[규칙 제91조에 의한 정정 28.04.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-11
[규칙 제91조에 의한 정정 28.04.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-12

Claims (10)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 자일리톨 탈수소화효소.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 자일리톨 탈수소화효소는 라이조비움에서 유래한 것을 특징으로 하는 자일리톨 탈수소화효소.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 라이조비움 균주는 라이조비움 에틸리 (Rhizobium etli) (기탁번호 KCCM11059P)
  4. 제 1항 또는 제2항에 있어서 상기 자일리톨 탈수소화효소는 자일리톨에 특이적인 것을 특징으로 하는 자일리톨 탈수소화효소.
  5. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소는 Mg2+, 또는 NAD 존재 시 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 자일리톨 탈수소화효소.
  6. 제1항의 효소를 코딩하는 자일리톨 탈수소화효소 유전자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 자일리톨 탈수소화효소 유전자.
  8. 제 7항의 자일리톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 자일리톨 탈수소화효소를 제조하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 자일리톨 탈수소화효소 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 자일리톨 탈수소화효소를 제조하는 방법.
  10. 제 1항의 자일리톨 탈수소화효소를 이용하여 자일리톨로부터 L-자일룰로즈를 제조하는 방법.
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