JP2000139486A - タンパク質の製造方法 - Google Patents

タンパク質の製造方法

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JP2000139486A
JP2000139486A JP2000000589A JP2000000589A JP2000139486A JP 2000139486 A JP2000139486 A JP 2000139486A JP 2000000589 A JP2000000589 A JP 2000000589A JP 2000000589 A JP2000000589 A JP 2000000589A JP 2000139486 A JP2000139486 A JP 2000139486A
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JP2000000589A
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Alexander W M Dr Strasser
ダブリュ．エム．ストラッサー アレクサンダー
Cornelis P Hollenberg
ピー．ホレンベルグ コルネリス
Michael Von Ciriacy-Wantrup
フォン シリアシィ − ヴァントラップ マイクル
Peter Koetter
コッター ペーター
Rene Amore
アモレ レネ
Michael Piontek
ピオンテック ミカエル
Jutta Hagedorn
ハゲドルン ユッタ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ピチア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓ
ｔｉｐｉｔｉｓ）において所望のタンパク質を製造する
こと。 【解決手段】 ピチア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ
ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のＸＹＬ１および（または）ＸＹ
Ｌ２遺伝子の５´調節領域、および（または）サッカロ
ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨＩプロモーター、お
よび（または）シュワニオミセス オクシデンタリス
（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａ
ｌｉｓ）からのグルコアミラーゼプロモーターの制御下
で、所望のタンパク質をコードしている構造遺伝子を発
現させることからなるピチア スティピティスにおいて
所望のタンパク質を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列の組合
せ、ベクター、微生物、キシロースレダクターゼ、そし
て・または、キシリトールデヒドロゲナーゼを製造する
方法、キシロースレダクターゼ、ならびにキシリトール
デヒドロゲナーゼに関する。本発明は、さらに、エタノ
ール製造工程、バイオマス製造工程、ＮＡＤＰＨからＮ
ＡＤＰ+を再生利用する工程、およびＰｉｃｈｉａｓｔ
ｉｐｉｔｉｓにおいて望ましいタンパク質を製造する方
法に関する。
【０００２】Ｄ−キシロースは、植物のバイオマスと木
材に存在する最も豊富な炭水化物の１つである。セルロ
ース生産工程においては、それはヘミセルロースの主化
合物であるキシランの加水分解物からの廃棄産物として
形成される。炭素資源の更新可能な使用を最適化するた
めに、キシロースをエタノールまたはバイオマスに変換
することが望ましい。Ｄ−キシロース、そしてＤ−リボ
ースを始めとするペントースを利用することができるＣ
ａｎｄｉｄａ（Ｇｏｎｇら、１９８１、Ｊｅｆｆｒｉｅ
ｓ，１９８３）、Ｄａｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｍｅｔｓｃ
ｈｎｉｋｏｗｉａ，Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ，Ｐａｅｃｉ
ｌｏｍｙｃｅｓ（Ｗｕら、１９８６）およびＰｉｃｈｉ
ａ（ＭａｌｅｓｚｋａとＳｃｈｎｅｉｄｅｒ １９８
２）のようないくつかの酵母の種があるが、しかし、好
気的においてのみである。
【０００３】一般的には、酵母類（例えば、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）によって利用されるペントース
がリン酸化されるためには、異性化されなければならな
い。この異性化は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと連結したペンティ
トール類への還元レダクターゼに続くペンティトール類
の相当するＤ−ペンテュロース類へのＮＡＤ+に連結し
た酸化（デヒドロゲナーゼ）を経て起る（Ｂａｒｎｅｔ
ｔ，１９７６）。バイオエタノール産生に主として使用
される酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、キシル
ロースを利用することができるが、この酵母は、ペント
ース類を醗酵することができない（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，
１９８８）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにもペントース
醗酵タンパク質類をコードする遺伝子が含まれている
が、それらは発現しないということは無視できない。
【０００４】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるペントー
スの醗酵は、キシロースを代謝する微生物からのキシロ
ース利用経路を提供することによって可能になるのでは
ないかと考えられる。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅにおいて、バクテリアのキシロースイソメラーゼ遺伝
子を発現するために、多くの試みが企てられたけれど
も、恐らく、外来遺伝子の発現が不十分であるために、
キシロースの醗酵は達成されていない（Ｓａｒｔｈｙ
ら、１９８７，Ａｍｏｒｅら、１９８９、Ｃｈａｎら、
１９８６および１９８９）。
【０００５】したがって、例えばこれらの配列を、適当
な調節配列と組合せるといった具合に、これらの遺伝子
を操作することができるようにするために、キシロース
分解に関与する酵素の遺伝子を提供することが、本発明
の主要な目的である。
【０００６】この目的は、キシロースレダクターゼ、そ
して・または、キシリトールデヒドロゲナーゼを含み、
該ポリペプチド（複数）を、微生物中で発現することが
できるＤＮＡ配列によって達成された。
【０００７】本発明のさらなる目的は、以下の発明の詳
述；例および図によって明らかとなる。
【０００８】この出願全体を通じて、種々の出版された
報告が、一番目の著者を括弧に入れて引用されている。
【０００９】これらの参考文献の完全な引用が、発明の
詳細な説明の末尾に添付してある。本明細に記述され請
求されている日付の時点で、その分野に通暁している人
々に知られている通りの最新の技術を、より完全に記述
するためにこれらの報告の詳細を、そのままの状態で、
この出願に引用によって組込んである。
【００１０】本発明によるＤＮＡ配列は、酵母菌から由
来するのがより好ましい。より好ましい酵母の菌株は、
Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｄｅｂａｒｙｏ
ｍｙｃｅｓ，Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｏｗｉａ，Ｐａｃｈ
ｙｓｏｌｅｎ および Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属か
ら選ばれる。これら酵母属のすべては、キシロースレダ
クターゼとキシリトールデヒドロゲナーゼを用いてキシ
ロースをエタノールに変換することができることが知ら
れている。
【００１１】本発明によるＤＮＡ配列のための源として
使用されるより好ましい属は、酵母Ｐｉｃｈｉａであ
る。この属は、いくつかの種からなっており、そのいず
れも本発明を遂行するのに使用できるかもしれない。し
かし、より好ましい種は、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔ
ｉｓである。本発明は、キシロースレダクターゼ、そし
て・または、キシリトールデヒドロゲナーゼをコードす
る構造遺伝子を含むＤＮＡ配列の単離のために、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ ５７７３を使用し
た。Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ ５７７
３は、１９９０年３月２１日のブタペスト条約のもとに
再寄託された（ＤＳＭ５８５５）。
【００１２】本発明者は、キシロースとキシリトールデ
ヒドロゲナーゼを、それぞれコードしている構造遺伝子
からなる配列を含むＤＮＡ分子を単離することに成功し
た。標準的方法にしたがって決定されたＤＮＡ配列によ
って、これらのタンパク質のアミノ酸配列がはじめて決
定されることができた。これら両タンパク質の完全なア
ミノ酸配列が、ヌクレオチド配列とともに、図２Ａと図
２Ｂに示されている。この分野の技術に熟達している人
々すべてにとって知られているように、図２Ａと図２Ｂ
において示されている通りのアミノ酸配列をもったタン
パク質は、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ５
７７３において見出されるＤＮＡによってのみならず、
遺伝的コードの縮重によって提供されたこれにかわるコ
ドンを用いることによってもコードされることができ
る。したがって、本発明は、図２において示されている
ＤＮＡ配列に限られないばかりでなく、同じアミノ酸配
列を産生する改変すべてを含む。
【００１３】本発明によるＤＮＡ配列は、以下に示され
る方法、すなわち、ゲノムライブラリーのスクリーニン
グを行うのに使用されるｃＮＡクローンを単離すること
によって得られるのみならず、自然のＤＮＡ、またはｃ
ＤＮＡまたは化学合成されたＤＮＡまたはこれらのＤＮ
Ａの２つ以上の組合せからの組換え体ＤＮＡ技術の他の
方法によっても得ることができる。例えば、化学的に合
成された５´領域を、３´領域をコードするｃＤＮＡと
組合せるか、上述の３種のＤＮＡ源の他の組合せすべて
を企てることができる。
【００１４】本発明によれば、上に論議したようなＤＮ
Ａ配列、すなわち、キシロースレダクターゼ、そして、
またはキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする構造
遺伝子を含む配列、そして、その上、推定上の宿主微生
物において、上述した構造遺伝子の発現を調節すること
ができる１つ以上のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の組合
せも提供される。構造遺伝子の発現を調節することがで
きるＤＮＡ配列は、この技術に熟達した人々にとっては
十分知られている。例えば、上に論議されたＤＮＡ配列
は、プロモーターと組合せることができ、プロモーター
は、効率的な発現を提供するために、構造遺伝子に結合
される。発現を調節することができるさらなるＤＮＡ配
列は、エンハンサー、終止配列、ポリアデニル化シグナ
ルからなることがある。調節配列の知られている最善の
例が、後述の例によって示される。
【００１５】本発明によって、ＤＮＡ配列、および（ま
たは）ＤＮＡ配列の組合せを効率的に発現するために
は、そのＤＮＡ配列が、所望のキシロースレダクター
ゼ、またはキシリトールデヒドロゲナーゼ活性をもって
いる機能酵素を発現する能力を維持している限り、ＤＮ
Ａ配列の部分的改変が行われることがある。これらの改
変には、上に論議されたような遺伝子コードの変化か、
または、さらなるそれぞれの酵素活性に対する好ましく
ない影響をもたない削除、そして・または、挿入ならび
にアミノ配列の小置換が含まれることがある。
【００１６】より好ましい態様において、構造遺伝子の
発現を調節することができるＤＮＡ配列は、その中でＤ
ＮＡ配列の発現が意図されている微生物の内因生遺伝子
から由来している。下記でさらに詳細に示されるように
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、
本発明に使用されるべきより好ましい微生物の１つであ
るので、知られている多数の可能な調節配列がある。こ
れらのよく知られた配列の若干が、下記の例において示
されるように、発現ベクターを構築するのに用いられ
た。最も好ましい態様においては、ＤＮＡ配列の組合せ
は、誘導可能なプロモーターを含んでいる。この場合に
おいては、キシロースレダクターゼとキシリトールデヒ
ドロゲナーゼの発現は、望ましい時間だけ止めることが
でき、発現は、適切なインデューサーを添加したとき、
開始することができる。
【００１７】本発明の最も好ましい態様においては、キ
シロースレダクターゼ、および（または）デヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子の発現を調節するために、以下
のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
のプロモーターが使用される。すなわち、ＡＤＨ１，Ａ
ＤＨ２，ＰＤＣ，ＧＡＬ１／１０。
【００１８】それぞれのプロモーターの選択次第では、
それらの元の宿主微生物における両タンパク質の自然の
発現のレベルを越える発現レベルを得ることが可能な場
合がある。
【００１９】本発明によるＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列の
組合せを、ベクター分子中に導入することができる。こ
れらの分子は、プラスミドであることがあり、それら
は、望ましい宿主微生物における複製に適切であり、し
たがって、複製の機能的開始点を含んでいるべきであ
る。代替として、本発明による該ＤＮＡ配列または、Ｄ
ＮＡ配列の組合せをもっている線状のＤＮＡ断片、また
は、複製の機能的開始点が欠けている円状ＤＮＡ分子を
使用することも可能である。この場合には、複製ができ
ないベクターは、宿主染色体に相同または非相同組換え
によって挿入される。
【００２０】本発明の対象は、さらに、発明のＤＮＡ配
列、または、ＤＮＡ組換え技術によるキシロースレダク
ターゼ、またはキシリトールデヒドロゲナーゼをコード
するＤＮＡ配列の組合せを受取った微生物である。
【００２１】より好ましい微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｃａ
ｎｄｉｄａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｅｔｓｃｈ
ｎｉｋｏｗｉａ，Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎまたは、Ｐａｅ
ｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属の酵母、またはＺｙｍｏｍｏｎａ
ｓ属のバクテリアからなる群から選ばれる。
【００２２】これらの微生物から最も好ましい微生物
は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅとＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂ
ｅとＺｙｍｏｍｏｎａｓである。
【００２３】上に記述した遺伝子に変更をうけた酵母菌
株の可能な応用の１つは、バイオマスの生産である。キ
シロースレダクターゼ、および（または）キシリトール
デヒドロゲナーゼを発現する能力を獲得した酵母菌株
は、良い醗酵能力を維持しているので、バイオマスはこ
れらの発明の酵母菌株の使用により最も効率的に生産す
ることができる。バイオマスを産生する方法は、通常の
ものであり、この分野の技術に熟達した人々のすべてに
とってよく知られている。この発明にしたがって提供さ
れる、遺伝子操作を受けた。酵母の菌株は、エタノール
の製造に適当である。醗酵によるエタノールの製造にお
いて使用される好ましい微生物は、酵母Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、および（また
は）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍ
ｂｅ、および（または）バクテリアＺｙｍｏｍｏｎａｓ
である。
【００２４】エタノール生産におけるより好ましい炭水
化物は、キシロースである。したがって、キシロースを
醗酵することができるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅそして・またはＳｃｈｉｚｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅそして・またはＺｙ
ｍｏｍｏｎａｓの菌株は、エタノールの製造に高度に有
利である。本発明による遺伝的に操作された酵母菌株の
使用による飲料用エタノールまたは工業用エタノールの
製造は、それ自体は既知の方法で実施することができ
る。本発明の酵母菌株は、濃厚炭水化物溶液を醗酵する
能力があり、高度のエタノール耐性をもち、高められた
濃度のエタノールを製造する能力がある。それらは、繰
返し再利用のための高い細胞生存性をもち、ｐＨと温度
耐性を示す。キシロースの製造の工程において、キシロ
ースは、キシランの加水分解からの廃棄物質として形成
される。キシランは、ヘミセルロースの主要化合物であ
る。したがって、エタノール、そして・またはバイオマ
スの製造にキシロースを使用することは、大いに有利で
ある。さらに、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ連結キシロー
スレダクターゼの製造と単離に適切である。その還元反
応のために、この酵素は、例えばアミノ酸の製造のため
のバイオリアクターにおいて、特に相当する補酵素を配
達するか、再生利用する（ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ
+へ）のに適している。
【００２５】本発明のさらなる対象は、本発明にしたが
って、適した条件下で、微生物を培養し、該酵素、また
はそれらの両方を、それ自体既知の方法で回収すること
により、キシロースレダクターゼ、そして・またはキシ
リトールデヒドロゲナーゼを製造する方法である。した
がって、この方法には、本発明による適切な微生物にお
けるＤＮＡ配列とＤＮＡ配列の組合せの発現、該微生物
を適切な条件下で培養し、酵素を単離することが含まれ
る。
【００２６】微生物が、キシルロースの効率的な醗酵の
ために選ばれたならば、発明の微生物における望ましい
タンパク質の発現のレベルが高まるということを示すこ
とができた。したがって、それに応じて選ばれた微生物
を使用して、タンパク質の１つ、または両方を再現する
方法を遂行することが、より望ましい。
【００２７】本発明は、クローニングされた遺伝子と相
当する配列を提供するので、遺伝子産物は、他の微生
物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍ
ｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉ
ａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｄｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ，Ｐａｃ
ｈｙｓｏｌｅｎ，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属の酵母、
またはＺｙｍｏｍｏｎａｓ属のバクテリア中で過剰生産
することができる。ＸＹＬ１（キシロースレダクター
ゼ）そして・または、ＸＹＬ２（キシリトールデヒドロ
ゲナーゼ）遺伝子の発現と活性遺伝子産物を得るために
用いられる技術は、この分野の技術に熟達した人々に知
られているプロモーター融合、形質転換、組込みと選抜
およびタンパク質の単離の方法である。
【００２８】一般的には、該微生物は、ＤＮＡ配列また
はＤＮＡ配列の組合せを形質転換操作を経て受取った。
可能な微生物、すなわち異なる酵母属およびＺｙｍｏｎ
ａｓ属のバクテリアについて、既知の形質転換法が存在
している。形質変換は、好ましくはベクターを使用して
実行され、ベクターは、直線または円形のＤＮＡ分子で
あり、その上、形質転換の方法は、自律的に増殖する、
あるいは組込まれる分子を使用しても遂行することがで
きる。分子が、それぞれの宿主のゲノムに組込まれると
考えられる場合には、意図された宿主微生物のＤＮＡに
相同性であるＤＮＡを含むベクターを使用することがよ
り望ましい。この手段により、相同性組換えが容易にな
る。
【００２９】本発明のさらなる対象は、上述の方法によ
って製造された酵素である。
【００３０】本発明による微生物は、エタノール製造工
程において使用することができる。キシロースは、通常
廃棄物と考えられている、容易に手に入る資源なので、
本発明によるエタノール製造工程は、経済的ならびに生
態学的に高度に興味深いエタノールの製造の可能性を提
供する。
【００３１】このエタノール製造工程は、キシランから
好ましくはキシラナーゼ、そして・または、キシロシダ
ーゼ活性によって遊離される遊離キシロースを含む基質
からのアルコール性飲料または単細胞タンパク質の製造
に適用することができる。
【００３２】本発明によれば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｉｔｉｓにおいて所望のタンパク質の産生に対して、さ
らに１つの方法が提供されている。この方法によれば、
所望のタンパク質をコードしている構造的遺伝子は、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓからのＸＹＬ１および(
または) ＸＹＬ２遺伝子の５´調節領域、そして・，ま
たは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１プロモータ
ー、および（または）Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ からのグルコアミラーゼの
制御下で発現される。前に述べたプロモーターのうち
で、ＸＹＬ１またはＸＹＬ２遺伝子の５´調節領域の使
用がより好ましい。これらのプロモーターは、キシロー
スを加えることによって誘導することができるからであ
る。宿主微生物として使用されたとき、Ｐｉｃｈｉａ
ｓｔｉｐｉｔｉｓ は、効率的な分泌系をもっていると
いう大きな利点を示す。これによって、細胞内に留るタ
ンパク質の効率発現のみならず、連続的に培地に分泌さ
れるタンパク質の発現も容易になる。Ｐｉｃｈｉａ ｓ
ｔｉｐｉｔｉｓ発現系のさらなる利点は、キシロースを
基質として使用する可能性である。キシロースは、廉価
で容易に手に入る炭素源である。
【００３３】本発明を、図（図１−図７参照）と以下の
例によって詳細に論ずる。
【００３４】例材料と方法 Ｉ．微生物と培養 酵母菌株： １．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ： ａ）ＸＪＢ３−１Ｂ（ＭＡＴα、ｍｅｔ６，ｇａ１２）
は、イースト・ジュネティック・ストック・センター
（イースト・ジュネティック・ストック・センターのカ
タログ、６版、１９８７参照）から得た。 ｂ）ＧＲＦ１８（ＭＡＴα、ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−
１１２，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５）は、Ｇ．
Ｒ．Ｆｉｎｋ（ＤＳＭ３７９６）から得た。 ｃ）ＡＨ２２（ＭＡＴａ、ｃａｎ１，ｈｉｓ４−５１
９，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２）はＡ．Ｈｉｎｎ
ｅｎ（ＤＳＭ３８２０）から得た。 ２．Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍ
ｂｅ（ｌｅｕ１−３２，ｈｉｓ５−３０３）（ＤＳＭ３
７９６） ３．Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ５７７３（ＤＳＭ５
８５５） Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍ
ｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（カビ培養のための中央事務
局）、Ｙｅａｓｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（酵母部門）、Ｄ
ｅｌｆｔ、オランダ、から得られた。酵母の菌株は、Ｙ
Ｐ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン）中、ま
たは、アミノ酸無添加、随意に適当なアミノ酸を補強し
た０．６７％のＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース（ＹＮＢ）中
で３０℃で生育させた。培地には、２％キシロースか２
％グルコースを加えた。酵母は、Ｄｏｈｍｅｎら（１９
８９）にしたがって形質転換された。
【００３５】Ｅ．ｃｏｌｉ菌株 １．ＤＨ５αＦ´（ドイツ連邦共和国、Ｅｇｇｅｎｓｔ
ｅｉｎ, ＢＲＬ会社によって供給された。） ２．ＨＢ１０１（ＤＭＳ３７８８）（Ｂｏｌｉｖａｒ
ら、１９７７）Ｅ．ｃｏｌｉの菌株は、栄養に富んだ培
地（ＬＢ−培地、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）中
で、３７℃で生育させた。培地は、形質転換体を選抜す
るときは、ペニシリンＧ（１００μｇ／ml）を補添し
た。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換は、Ｍａｎｉａｔｉｓ（１
９８２）によって記述されたように実施された。
【００３６】II. Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓからのＸＲおよ
びＸＤＨタンパク質の精製 細胞は、誘導条件下で指数凾数増殖相まで生育させた。
無細胞抽出物を調製するために細胞を、遠心分離で収穫
し、０．１Ｍトリスー塩酸緩衡液（ｐＨ７．０）を使用
してＢｒａｕｎホモジナイザー中で、ガラスビーズとと
もに破砕した。粗抽出物を1 時間遠心分離した （１５０，０００×ｇ）後得られた上清を５ｍＭＮａＰ
Ｏ4緩衡液（ｐＨ６．８）であらかじめ平衡させたアフ
ィニティークロマトグラフィーカラム（Ａｆｆｉ−Ｇｅ
ｌ Ｂｌｕｅ，６０×５０mm）上にのせ、そして、１．
５ｍＭ ＮＡＤで溶出した。ＸＲとＸＤＨ活性を含む分
画を集めておき、２０ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ７．５）
に対して透析した。透析物を続いて２０ｍＭトリスー塩
酸（ｐＨ７．５）であらかじめ平衡させたＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌアニオン交換カラムに適用した。タンパ
ク質を、線形グレージェント（２０−２５０ｍＭトリス
ー塩酸、ｐＨ７．５）で溶出した。最高の活性を含んで
いる分画を集め、濃縮し、ＳＤＡ−ＰＡＡ−ゲールにの
せた。ゲルを展開した後、ゲルを０．１ＭＫｃｌで染色
し、ＸＲ−ＸＰＨ−タンパクバンドを切出し、両タンパ
ク質は、別々にＮａＰＯ4（ｐＨ８．０）、０．１％Ｓ
ＤＳを使用して、透析によってポリアクリルアミドゲル
から溶出した。続いて、透析物を濃縮した。バッファー
は、すべて０．２ｍＭ ＤＤＴ（ジチオトレイトール）
と、０．４ｍＭＰＭＳＦ（フェニルメタン−スルホニル
フルオライド）を含んでいた。
【００３７】III ．抗血清の調製 マウスは、フロイント完全アジュバント中のタンパク質
を、２−５μｇ腹腔内に注射した。２週間後に、フロイ
ント完全アジュバント中の同じ量のタンパク質を注射し
た。３番目の注射は、２週間後にフロイントのアジュバ
ントを使用しないで行った。抗血清は、最初の注射から
６週間後に収穫した。
【００３８】IV．イムノスクリーニング それぞれ精製したＰ．ｓｔｉｐｉｔｉｓのキシロースレ
ダクターゼ（ＸＲ）とキシリトールデヒドロゲナーゼ
（ＸＤＨ）タンパク質に対してマウスに免疫を成立させ
た抗血清をＨｕｙｎｈら（１９８５）の方法にしたがっ
て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使
用した。抗血清は、１０，０００倍に希釈した。結合抗
体は、アルカリ性ホスファターゼ結合ヒツジ抗−マウス
イムノグロブリンを用い、続いてホスファターゼの基質
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（ＢＣＩＰ）と、ニトロ ブルー テトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）の混合物との呈色反応で可視化した。
【００３９】Ｖ．ＲＮＡの単離 特に、それ以外の指示がない限り、操作はすべて０から
４℃で行われた。溶液と材料は可能ならば、すべて滅菌
した。Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ細胞は、キシロースの存在
下で指数凾数相の中頃まで生育させた。酵母菌は、遠心
分離によって収穫し、緩衡液１（２０ｍＭ ＮａＣｌ，
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００ｍＭトリスー塩酸、ｐＨ
７．６）で２回洗い、同じ緩衡液（１．２５ml／ｇ細
胞）に懸濁させた。１／１０容のフェノール、２００μ
ｇ／mlのヘパリン、１００μｇ／mlのシクロヘキシミド
と０．４％ＳＤＳを加えた。細胞の破砕はブラウン・ホ
モジナイザー（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）中
で、懸濁液対ガラス・ビーズ１：１（Ｖ／Ｖ）の割合で
ガラス・ビーズ（０．４５−０．５mm）とともにしんと
うすることによって実施した。２容量の緩衡液２（１０
０μｇ／mlのヘパリン、５０μｇ／mlのシクロヘキシミ
ド２％ＳＤＳを含む緩衡液１）を、ホモジネートに加
え、細胞の破片を遠心分離によって除去した（１０，０
００×ｇ，１０分）溶液を、フェノール／クロロホルム
（１：１）で３回から５回、クロロホルム／イソアミル
アルコール（２４：１）で１回抽出した。核酸は、水相
を０．２ＭのＮａＣｌの存在下で、２．５容のエタノー
ルと共に、一夜−２０℃でインキュベートすることによ
って沈澱させた。沈澱を緩衡液３（０．１Ｍ ＮａＣｌ
１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭトリスー塩酸、ｐＨ７．
５）中に溶解させ、ＳＤＳとＬｉＣｌを最終濃度が、そ
れぞれ０．１％と４Ｍになるまで加えた。ＲＡＮを、＋
４℃で一夜沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで
２回洗い、無菌水中に懸濁させてから使用した。ＲＮＡ
は、エタノール沈澱物として、−７０℃で貯蔵した。
【００４０】VI. 酵素アッセイ キシロースレダクターゼ（ＥＣ．１．１．１．２１）と
キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．
９）を、Ｂｒｕｉｎｅｎｂｅｒｇら（１９８３）によっ
て記載されているように測定した。タンパク質は、ウシ
血清アルブミンを標準として使用し、Ｚａｍｅｎｈｏｆ
ｆ（１９５７）にしたがって、ミクロビウレット法で測
定した。
【００４１】VII. ゲル電気泳動 ＳＤＳゲル電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に
したがって、１０％のＰＡＡ中で実施した。
【００４２】VIII. イムノブロッティング 抗原性タンパク質の検出は、マウスから得られた抗血清
を使用してＴｏｗｂｉｎら（１９７９）によって記載さ
れたように行われた。タンパク質を、ポリビニリデンジ
フルオライド細孔膜（ミリポーア、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ
ＰＶＤＦ）に移し、ホスファターゼ結合、呈色反応に
よって可視化した（Ｂｌａｋｅら、１９８４）。ヒツジ
抗−マウスＩｇＧに結合させたアルカリ性ホスファター
ゼをＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂ．（Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＵＳＡ）から得た。
【００４３】IX. ＤＮＡ配列解析ＸＹＬ１ とＸＹＬ２のゲノムＤＮＡならびに、それぞれ
のｃＤＮＡｓをｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア）中
にサブクローニングした。エキソヌクレアーゼIII （Ｈ
ｅｉｎｋｏｆｆ，１９８４）を使用した部分的加水分解
によって得られた断片を分析し、配列決定は、Ｔ７−Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇTMＫｉｔ（ファルマシア）を使用し
て、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）のジデオキシ法によっ
て実施した。両鎖は、各接合部における重複した配列を
得ることによって、完全に決定した。
【００４４】X. Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ５７７
３（ＤＳＭ５８５５）ｃＤＮＡライブラリーの構築 全ＲＮＡは、上に述べた方法にしたがって抽出された。
ポリ（Ａ）+−ＲＮＡは、ほぼＭａｎｉａｔｉｓら（１
９８２）によって記載された方法を使用して、オリゴ
（ｄＴ）−セルロースカラム上のクロマトグラフィーに
よって調整された。λｇｔ１１におけるｃＤＮＡライブ
ラリーを、ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア）を使用
してＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）の方法
と組換え体λｇｔ１１−ＤＮＡをＢｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツ連邦共和国）によって供
給されたｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキットを使用
して、ＨｏｈｎとＭｕｒｒａｙ（１９７４）にしたがっ
て、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングすることによって
調製した。
【００４５】XI. 粗抽出物の調製 細胞を、指数函数相の後期まで生育させ、バッファー中
で２回洗った（１０ｍＭ リン酸カリ、ｐＨ．７．０，
１ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭβ−メルカプトエタノール）。
細胞を、等量のガラスビーズとともに、Ｂｒａｕｎ ホ
モジナイザー中で破砕した。１０，０００ｇにおける５
分間の遠心分離から生ずる上清を、酸素アッセイに使用
した。ウェスターンブロット分析のための抽出物を、１
％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、１０ｍＭリ
ン酸カリｐＨ７．０と１０％中で沸とうさせた。
【００４６】例１： キシロースレダクターゼ（ＸＹＬ１）とキシリトールデ
ヒドロゲナーゼ（ＸＹＬ２）遺伝子の単離Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ のポリ（Ａ）+−ＲＮＡから構築
されたλｇｔ１１のｃＤＮＡライブラリーを精製キシロ
ースレダクターゼ（ＸＲ）とキシリナールデヒドロゲナ
ーゼ（ＸＤＨ）タンパク質のそれぞれに対して形成させ
たマウスのポリクローナル抗体でスクリーニングを行っ
た。約５５，０００の一次クローンを含む増幅させたｃ
ＤＮＡライブラリーの１１０，０００組換え体クローン
中、７つの同一ＸＹＬ１クローンと３つの同一ＸＹＬ２
クローンが同定され、精製された。挿入の大きさの解析
からＸＹＬ１クローンは、２つのＥｃｏＲ１断片（０．
６ｋｂと０．４ｋｂ）を含むが、それに反してＸＹＬ２
クローン１つの０．５５ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ１断片を含ん
でいることが明らかとなった。λｇｔ１１クローンのそ
れぞれのＥｃｏＲ１断片を、プラスミドｐＴ７Ｔ３（フ
ァルマシア）の１つあるＥｃｏＲ１部位に再クローニン
グし、その結果、プラスミドｐＸＲａ（ＸＹＬ１の０．
４ｋｂＥｃｏＲ１断片を含む）、ｐＸＲｂ（ＸＹＬ１ク
ローンの０．６ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ１断片を含む）、およ
びｐＸＤＨ（ＸＹＬ２クローンの０．５５ｋｂのＥｃｏ
Ｒ１断片を含む）が得られる。
【００４７】これらのプラスミドは、Ｐ．ｓｔｉｐｉｔ
ｉｓゲノムライブラリーをスクリーニングするための放
射性プローブとして使用された。このライブラリーは、
Ｓａｕ３Ａによって部分的に消化されたＰ．ｓｔｉｐｉ
ｔｉｓのＤＮＡをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ− Ｅ．ｃｏ
ｌｉシャトルベクターＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、１
９７９）に連結し、その結果、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１
の形質転換の後、約６０，０００の独立したクローンを
得ることによって構築した。
【００４８】２つのプラスミド、すなわち、ｐＲ１とｐ
Ｄ１を単離することができ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＧＲＦ１８の形質転換に使用した。ＸＲの活性は、ｐＲ
１を含む形質転換体の粗抽出物中に検出され、それに対
し、ｐＤ１をもっている形質転換体は、ＸＤＨ活性を示
した。有絲分裂安定性試験（Ｂｅｇｇｓ １９７８）に
おいて、ＬＥＵ２マーカーとＸＲまたはＸＤＨ遺伝子は
共分離し、ｐＲ１とｐＤ１が、機能性ＸＹＬ１（キシロ
ースレダクターゼ）とＸＹＬ２（キシリトールデヒドロ
ゲナーゼ）遺伝子を、それぞれ宿していることを示し
た。
【００４９】プラスミドｐＲ１とｐＤ１を制限酵素分析
にかけ、ＸＹＬ１（図１Ａ）とＸＹＬ２（図１Ｂ）の遺
伝子の制限部位の地図をそれぞれ得た。
【００５０】さらなるサブクローニング実験により、Ｘ
ＹＬ１遺伝子は、２．０４ｋｂＢａｍＨＩゲノム断片内
にコードされていることが明らかになった。ＢａｍＨＩ
部位の１つは、元のプラスミドｐＲ１中に存在しない。
それは、サブクローニング中に発生したに違いない。Ｘ
ＹＬ２遺伝子は、１．９５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
断片内にコードされている。２．０４ＢａｍＨＩ断片と
１．９５ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片は、ｐＴ７Ｔ３
−１８Ｕの複数のクローニング部位にサブクローニング
され、その結果、それぞれｐＲ２とｐＤ２を生じ、ＤＮ
Ａ配列分析にかけた。ＸＹＬ１とＸＹＬ２の構造遺伝子
と５´および３´の非コード領域のＤＮＡ配列が、図２
Ａと図２Ｂに、それぞれ表示されている。
【００５１】ＸＹＬ１遺伝子のＤＮＡ配列は、９５４ｂ
ｐ（３１８このアミノ酸）の読取り枠（ＯＲＦ）を含ん
でいるが、それに対し、ＸＹＬ２の遺伝子は、１０８９
ｂｐ（３６３このアミノ酸）のＯＲＦを含んでいる。
【００５２】読取り枠から導出されたアミノ酸は、図２
Ａと図２Ｂに示される。これらの配列は、それぞれ３５
９２２と３８５２６Ｄの計算による分子量をもったＸＲ
ポリペプチドとＸＤＨポリペプチドに相当する。
【００５３】例２Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ におけるキシロースレダクタ
ーゼとキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両方の発
現Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
は、ｐＲ１とｐＤ１とで、同時形質転換された。このよ
うにして形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけ
るＸＲとＸＤＨの最高の測定し得る活性は、Ｐ．ｓｔｉ
ｐｉｔｉｓの抽出物において測定し得る両酵素の活性の
５０％に相当する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて
は、遺伝子は、２％グルコースを単独炭素源として含む
ＹＮＳ培地において発現された。それに反して、Ｐ．ｓ
ｔｉｐｉｔｉｓにおいては、両者の遺伝子の発現は、グ
ルコースによって抑制され、キシロースによって誘導さ
れた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＹＥｐ１３の
コピー数１０を勘定に入れ、遺伝子の用量依存性発現を
仮定すると、Ｐｉｃｈｉａのプロモーターは、Ｐ．ｓｔ
ｉｐｉｔｉｓにおけるよりもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
において、２０倍効率が悪いと結論することができる。
【００５４】さらに、それらの元のＰｉｃｈｉａプロモ
ーターを含むＸＹＬ１とＸＹＬ２のの両方の遺伝子を宿
しているプラスミドが構築された（図３）。このプラス
ミドｐＲＤ１がロイシン上での選択により、菌株ＧＲＦ
１８を転換するのに使用され、その結果、形質転換体Ｐ
Ｋ１を生じた。しかし、別々のプラスミドでの同時転換
したときに比べて、発現は改善されなかった。
【００５５】例３ 異なるプロモーターの制御下におけるＸＹＬ２遺伝子を
含む組込み性ベクターの構築Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ における組込みと発現のため
の異なるプロモーターを使用する異なる発現ベクターが
構築された。例えば、ＸＹＬ２遺伝子をＡＤＨ１プロモ
ーターに融合し、続いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ＨＩＳ３の位置に相同性組込みを行った。用いた戦略
は、以下の通りであった。すなわち、キシリトールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子ＸＹＬ２を含む１．５ｋｂのＸｂａ
Ｉ／ＥｃｏＲ１断片をｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシ
ア）の複数のクローニング部位へ挿入し、その結果プラ
スミドｐＸＤＨを得た。ＸＹＬ２遺伝子のプロモーター
領域を取除くために、ＸｂａＩ（制限酵素部位のイニシ
ェーターＡＴＧコドンの３１８ｂｐ上流）で、プラスミ
ドＤＮＡの３´末端を保護するために、ＰｓｔＩでこの
プラスミドを直線化した。その直線化プラスミドをエキ
ソヌクレアーゼIII で処理し、続いて、Ｓ１ヌクレアー
ゼで処理して、ＸｂａＩ部位とＸＹＬ２構造遺伝子の間
のＤＮＡを除去した。この削除を行ったＤＮＡ分子を再
び円形とし、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングし、削除の程
度を、ディデオキシ配列決定法によって決定した。改変
したｐＸＤＨプラスミドのうちの１つにおいては、５´
の非翻訳領域と４つのＮ末端アミノ酸の削除されてい
た。しかし、複数のクローニング部位からのＳｐｈＩ部
位のために、１つの新しい枠内ＡＴＧ開始コドンが創り
出された。ＢａｍＨＩリンカーを、複数のクローニング
部位のうちのＨｉｎｄIII 部位へ挿入した。続いて、Ｘ
ＹＬ２の遺伝子を担っている、１．５ｋｂＢａｍＨＩ断
片は、ベクターｐＴ７Ｔ３−１８Ｕにサブクローニング
することができ、その結果、ＡＴＧ開始コドンの前に、
さらなる制限部位を生じた。新たに創製された５´−領
域は、以下の如くである。：ＡＴＧ ＣＴＴ ＴＧＧ
ＴＧＴ・・・（元のアミノ酸、２，３と４の削除）。
【００５６】ＸＹＬ２遺伝子の３´の非翻訳領域を完成
するために、４４０ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片をｐＴ７Ｔ３
−１８Ｕにサブクローニングした。１．５ｋｂ断片の単
独のＥｃｏＲＩ部位へ挿入した。この４４０ｂｐ断片
は、４４０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（図１Ｂ
を参照）を、別のｐＴ７Ｔ３−１８Ｕにサブクローニン
グし、ＢａｍＨＩで切断することによってＢａｍＨＩ部
位を除去して、続いて、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで充
填することによって得られた。このようにして、３´非
翻訳領域は、４４０ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片として単離す
ることができた。ポリリンカー領域によって提供される
ＸＹＬ２遺伝子の５´−末端の近くに整えられた単独の
ＢａｍＨＩ部位において、プラスミドＹＥＰ６（Ｓｔｒ
ｕｈｌら、１９７９）から由来し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ Ｈｉｓ３遺伝子を宿している１．８ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩ断片を挿入した。その結果得られたプラスミド
を、２つのＢａｍＨＩ部位の１つを除去するために、Ｓ
ａｌＩとＸｈｏＩで切断し、ひき続いて、再び円形とし
た。その結果生ずるプラスミドｐＸＤＨ−ＨＩＳ３は
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１−プロモーター
（Ａｍｅｒｅｒ，１９８３）を含む１．５ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ断片を、その中に挿入することができるＡＴＧ開始
コドンの前にＢａｍＨＩ部位を含んでいる。
【００５７】このプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのためになんら自律複製する配列を含まないので、
このプラスミドを使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
菌株のいずれについてもＨＩＳ３部位へ相同性組込み
（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、１９８１）を行うことがで
きる。
【００５８】我々の組込み実験において、我々は、Ｐｏ
ｒｅｐ（１９８７）とＣｉｒｉａｃｙ（１９８６）のプ
ロトコールにしたがって単離されたＰＵＡ６−１と呼ば
れる突然変異を起させたＸＪＢ３−１Ｂを使用した。そ
の結果生じた組込み体ＰＫ２は、活性遺伝子産物に導か
れるＡＤＨ１プロモーターの制御下で、ＸＹＬ２遺伝子
を発現している。
【００５９】例４ＸＹＬ １とＸＬＹ２の遺伝子の両方を発現するＳ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅとＳ．ｐｏｍｂｅの組込み体の構築ＸＹＬ １のプロモーター遺伝子を除くために、２．０４
ｋｂのＢａｍＨＩ断片上にＸＹＬ１遺伝子を含むプラス
ミドＰＲ２をＸｂａＩで（翻訳開始ＡＩＧコドンの３６
２ｂｐ上流の制限酵素部位）直線化し、そしてプラスミ
ドＤＮＡの３´の端を保護するためにＳｐｈＩで開裂し
た。直線状のプラスミドを、エキソヌクレーアゼIII で
処理し、続いてＳ１ヌクレアーゼで処理して、ＸｂａＩ
部位とＸＹＬ１構造遺伝子の間のＤＮＡを除去した。削
除したＤＮＡ分子を再び円形とし、Ｅ．ｃｏｌｉにクロ
ーニングし、削除の程度をディデオキシ配列決定法によ
って決定した。修飾したｐＲ２プラスミドの１つにおい
て、５´の非翻訳領域が正確に削除されていた。
【００６０】構造遺伝子を、ＹＩｐ３６６（Ｍｙｅｒｓ
ら、１９８６）の相当する部位に、ＨｉｎｄIII −Ｂａ
ｍＨＩ断片としてサブクローニングした。その上、ＡＤ
Ｈ１プロモーターを、ブラント末端連結により、Ｈｉｎ
ｄIII 部位にサブクローニングし、その結果、プラスミ
ドｐＸＲ−ＬＥＵ２を得た。このプラスミドは、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのために、自律的に複製する配列を
持っていないので、このプラスミドを使用して、例え
ば、ＰＫ２株のようなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株の
ＬＥＵ２部位へ相同性組込み（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ
ら、１９８８）を行うことができる。結果としてえられ
る組込み体ＰＫ３は、ＡＤＨ１プロモーターの制御下
で、活性遺伝子産物へと導かれるＸＹＬ１とＸＹＬ２遺
伝子の両者を発現している。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒ
ｏｍｙｃｅｓにおける発現試験のために、Ｓ．Ｐｏｍｂ
ｅを、ヒスチジンとロイシンで選抜を行うため、プラス
ミドｐＸＤＨ−ＨＩＳ３とｐＸＲ−ＬＥＵ２の両者で形
質変換を行った。キシロース上で生長する形質転換体の
広汎なスクリーニングを行った後、ＡＤＨ１プロモータ
ーの制御下でＸＹＬ１とＸＹＬ２遺伝子の両者を発現す
るＡＳ１と呼ばれる形質変換体を単離することができ
た。
【００６１】同様にして、他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅプロモーター、例えば、ピルビン酸デカルボキシラー
ゼ（ＰＤＣ）プロモーター（ＫｅｌｌｅｒｍａｎｎとＨ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ
ら、１９８３）、または、ＢａｍＨＩ部位にすぐ続い
て、ＨｉｎｄIII 部位を導入することによってプラスミ
ドｐＢＭ１５０（ＪｏｈｎｓｔｏｎとＤａｖｉｓ，１９
８４）から誘導されるプラスミドｐＢＭ２７２からのガ
ラクトキナーゼ（ＧＡＬ１／１０）プロモーターは、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける活性ＸＹＬ１とＸＹ
Ｌ２の遺伝子産物発現へと導いた。
【００６２】別の組の実験においては、ＸＹＬ１とＸＹ
Ｌ２の遺伝子の丁度前に２つの適当な制限酵素部位Ｂａ
ｍＨＩ（位置−９）とＳａｌＩ（位置−１５）を導入し
た。 XYL1:5´ attcttttctaGTCGACGGATCCAAGATGCCTTCTATT...
TAA terminator3´ XYL2:5´ cccctaatactGTCGACGGATCCAAGATGACTGCTAAC...
TAA terminator3´
【００６３】これらの修飾は、Ａｍｅｒｓｈａｍから供
給された特定部位の突然変異キットを用い、製造業者の
指針にしたがって、５´領域の特定部位の突然変異によ
って導入された。これらの制限部位は、ＡＴＧ開始コド
ンの丁度前に、どのようなプロモーターをも融合させる
可能性を提供している。その上、望ましいプロモーター
の制御下にある遺伝子は相同性組込みに適した配列への
挿入のための、明確に定められた断片として単離するこ
とができる。
【００６４】工業的または商業的目的のために、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅそして、または、Ｓ．ｐｏｍｂｅの
安定生産株を構築することが望ましい。したがって、構
造的ＡＤＨ１プロモーターの制御下の両方の遺伝子が、
バクテリアの配列なしに相同性組込み（Ｏｒｒ−Ｗｅａ
ｖｅｒら、１９８１）を経由して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ株ＰＵＡ６−１の染色体中に組込まれた。ＤＪＷ
６（ＦｏｇｅｌとＷｅｌｃｈ，１９８２）での同時形質
変換（Ｒｕｓｓｅｌら、１９８６）によるＨＯホモタリ
ズム遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌら、１９８６）、ＡＲＳ−配
列（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、１９７８）、またはＡＤ
Ｈ４遺伝子（Ｐａｑｕｉｎら、１９８６）への組込みが
より望ましく、その結果ｐＫ３（ＨＯ），ｐＫ３（ＨＲ
Ｓ）およびｐＫ３（ＡＤＨ４）を生ずる。Ｓ．ｐｏｍｂ
ｅの場合には、組込みは主として非正統的組換えを経て
起る。したがって、Ｓ．ｐｏｍｂｅの組込み体のうち小
数だけが、野性型と同じ醗酵と生育の特性をもってい
る。
【００６５】Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組込み体、
ＰＫ３、ＰＫ３（ＨＯ），ＰＫ３（ＡＲＳ）とＰＫ３
（ＡＤＨ４）は、キシルロースの効率的蓄積のため、改
良されることができる。
【００６６】例５ 効率的にキシルロースを同化するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ変異株の単離Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の菌株ＸＪＢ3−１Ｂは、キ
シルロースを唯一の炭素源として（世代時間１０時間）
含む培地上で、ゆっくりと成長する。Ｐｏｒｅｐによっ
て記されたプロトコール（Ｐｏｒｅｐ，１９８７）にし
たがって、変異株ＰＵＡ３が単離された。この変異株
は、野性型のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅよりももっと効
率的に、キシルロースを利用し、その結果、唯一の炭素
源としてのキシルロース上に４時間の世代時間で成育し
た。
【００６７】変異株ＰＵＡ３は、呼吸の存在しない状態
（Ｐｏｒｅｐ，１９８７）でも、キシルロースをエタノ
ールに変換する。酵母の形質転換に役立つ補助的マーカ
ー（ＬＥＵ２）と組合せてＰＵＡ遺伝子型を得るため
に、ＰＡＵ３株をＡＨ２２（ｌｅｕ２，ｈｉｓ４）とか
け合せた。ＡＨ２２ＸＰＵＡ３の胞子形成培養からｌｅ
ｕ２であり、元の変異株ＰＵＡ３において観察されたよ
うに、効率的なキシルロース利用能を有していた２倍体
の減数分裂胞子の後代が単離された。類似した実験にお
いて、ＰＵＡ遺伝型は、ＧＲＦ１８株とＰＵＡ株をかけ
合せ、引続いて減数分裂胞子を単離することによって、
ｌｅｕ２とｈｉｓ３の補助マーカーと組合せた。その結
果、これは、ＰＵＡ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３であったＰＵ
Ａ６−１を生じた。
【００６８】例６ 効率的にキシロースをエタノールに変換するＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅの変異株の単離 染色体に組込まれた（例３，４を参照）ＸＹＬ１とＸＹ
Ｌ２遺伝子を含むＰＵＡ６−１菌株は、キシロースを唯
一の炭素源として、キシロース上で生育することができ
たが、それに反し、非形質転換ＰＵＡ６−１菌株は、Ｙ
ＮＢキシロース培地上で全く生育しなかった。形質転換
体株ＰＫ３の継代時間は、ＹＮＢ１％キシロース（比較
のため、ＹＮＢ１％グリコースにおける継代時間：２時
間）上で４時間であった。この菌株では、キシロース上
に生育させたとき、エタノール生産は非効率的であり、
呼吸が行われないとキシロースでの生育が観察されなか
ったので、キシロースを、エタノールに変換する能力が
改善された変異株は、以下のようにして選択された。１
０8のＰＫ３細胞を、２０％から４０％の細胞生存がで
きるようになる条件を使用して、紫外線（２５４ｎｍ）
で突然変異を誘発した。生存している細胞は、ＹＮＢ２
％キシロース液体培地中で約３０代生育させた。キシロ
ース固型培地上で平板培養した後、親株のＰＫ３よりも
有意に早く生育する単離株が得られた。１つの単離株は
さらに増殖させ、呼吸代謝を遮断するために、２mg／ml
アンチマイシンＡを補添したＹＮＢ２％キシロースプレ
ート上で生育することができる変異株の選択に使用され
た。この手順によってキシロースを、元の形質転換体Ｐ
Ｋ３よりももっと効率的にエクノールに変換することが
できた変異株（ＰＫ４）を生じた。典型的なキシロース
醗酵のプロトコルは、図４において表示されている。エ
タノール収率は、最初のキシロースの約４０％に相当し
た。この収率は、キシロース変換からのエタノールの最
大収量の約８０％に相当する。
【００６９】例７Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ における異種遺伝子の
発現Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ 菌株ＣＢＳ５７７３
（ＤＳＭ５８５５）のＵＶ突然変異を行った後、ｔｒｐ
５突然変異体が単離された。ｔｒｐ５ 突然変異は、Ｈ
ａｇｅｄｏｒｎとＣｉｒｉａｃｙ（Ｈａｇｅｄｏｒｎと
Ｃｉｒｉａｃｙ，１９８９）にしたがって、インドール
の蓄積を検べることによって同定された。
【００７０】Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ中の発現
のために、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄ
ｅｎｔａｌｉｓ（ＳＷＡＲＳ１）からのレプリコン、選
択的マーカーとしてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｄｏ
ｈｍｅｎら、１９８９）からのＴＲＰ５−遺伝子、さら
に、グルコアミラーゼプロモーターの制御下のグルコア
ミラーゼ（ＧＡＭ）−セルラーゼ（ｃｅｌＤ）遺伝子融
合体を含むプラスミドが構築された。第１の段階におい
ては、プラスミドｐＢＲＳＷＡＲＳＧＡＭ（図５、欧州
特許８９ １０７ ７８０に記述されている）からの
３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ−断片を単離し、
アンピシリン抵抗遺伝子とバクタリアの複製の起点を担
っているｐＢＲ３２２からの２２９６ｂｐのＥｃｏＲＩ
−ＰｖｕＩＩ断片に挿入した結果、プラスミドｐＢＲＧ
ＡＭ（図５）を生じた。ｐＢＲ３２２に由来する配列に
加えて、このプラスミドはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ
ｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼ
遺伝子の５´非コード領域から由来した３．６ｋｂ、な
らびにグルコアミラーゼのシグナル配列を含むＮ−末端
部分をコードしている１から２０８番目のヌクレオチド
をもっている。続いて、コーディング領域の５´末端で
始まる１２０ｂｐ（４０このアミノ酸に相当する）を例
外として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅ
ｌｌｕｍからのｃｅｌＤ−遺伝子のコーディング領域を
含むｐＣＴ６０３（Ｊｏｌｉｆｆら、１９８６）由来の
３．４ｋｂのＰｖｕII−断片をｐＢＲＧＡＭのＰｖｕII
部位に挿入した結果、ｐＢＲＧＣ１（図６）を生じた。
Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ発現ベクターを構築するために、
プラスミドｐＣＪＤ５−１（欧州特許８７ １１０ ３
７０．１）をＢａｍＨ１／ＰｓｔＩで開裂させ、ｐＢＲ
ＧＣ１からの６．５ｋｂのＢａｍＨ１／ＰｓｔＩ−断片
と連結した（図７）。その結果生じたプラスミドを、ｐ
ＭＰＧＣ１−２と名付けた。上記のＰ．ｓｔｉｐｉｔｉ
ｓ変異株Ｔｒｐ５をｐＭＰＧＣ１−２で形質転換し、形
質転換体を、トリプトファン不含培地上で生育できる能
力によって同定した（トリプトファン原栄養性）。形質
転換体は、コンゴーレッドアッセイ（Ｔｅａｔｈｅｒと
Ｗｏｏｄ，１９８２）を用いてセルラーゼ活性について
試験した。本形質転換体は構成的にＣｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの活性セルラーゼ（ｅ
ｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｄ）を産生し、それは、培
地中に排泄され、グルコアミラーゼ遺伝子によってコー
ドされているプロモーターとシグナル配列は、異質遺伝
子の発現と遺伝子産物の培地中への分泌を制御すること
ができることを示している。
【００７１】続いて、グルコアミラーゼプロモーターを
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＤＨ１−プロモーター
か、発明のＸＹＬ１またはＸＹＬ２遺伝子のそれぞれか
によって置換するために、プラスミドｐＭＰＧＣ１−２
の改変を行った。ＸＹＬ１またはＸＹＬ２プロモーター
領域の制御下で、発現は、キシルロースで誘導される
が、一方、グルコースによって抑制されることを示すこ
とができた。参考文献 Ammerer, G. Expression of genes in yeast using the
ADCI promoter.Methds in Enzymology 101:192-201(198
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leic acids from animal tissue. Methodsin Enzymolog
y 3:696-704(1957)
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、キシロースレダクターゼ遺伝子（Ｘ
ＹＬ１）をコードしているＤＮＡ断片の制限地図であ
り、略号の意味は以下の通りである。Ｅ：ＥｃｏＲ１，
Ｈ：ＨｉｎｄIII, Ｂ：ＢａｍＨＩ，Ｎ：ＮｃｏＩ，
Ｐ：ＰｖｕII, Ｐｓ：Ｐｓｔ１．図１Ｂは、キシリトー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＸＹＬ２）をコードしてい
るＤＮＡ断片の制限地図であり、略号の意味は以下の通
りである。Ｂａ：ＢａｍＨＩ，Ｂ：ＢｇｌII，Ｅ：Ｅｃ
ｏＲ１，Ｘ：ｘｂａＩ，Ｓ：ＳａｌＩ
【図２】図２は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ１のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図３】図３は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ１のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図４】図４は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ１のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図５】図５は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ１のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図６】図６は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ１のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図７】図７は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ１のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図８】図８は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ２のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図９】図９は、その５´−および３´−隣接配列を含
む構造遺伝子、ＸＹＬ２のヌクレオチド配列と、それに
相当するアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、その５´−および３´−隣接配列
を含む構造遺伝子、ＸＹＬ２のヌクレオチド配列と、そ
れに相当するアミノ酸配列である。
【図１１】図１１は、その５´−および３´−隣接配列
を含む構造遺伝子、ＸＹＬ２のヌクレオチド配列と、そ
れに相当するアミノ酸配列である。
【図１２】図１２は、その５´−および３´−隣接配列
を含む構造遺伝子、ＸＹＬ２のヌクレオチド配列と、そ
れに相当するアミノ酸配列である。
【図１３】図１３は、その５´−および３´−隣接配列
を含む構造遺伝子、ＸＹＬ２のヌクレオチド配列と、そ
れに相当するアミノ酸配列である。
【図１４】図１４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ．
ｐｏｍｂｅの発現ベクターである。プラスミドｐＲＤ１
は、それらの元のプロモーターの制御下にあるキシロー
スレダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子の両方を含んでいる。
【図１５】図１５は、ＹＮＢ、２％キシロース媒地にお
いて生育させたＰＫ４の醗酵曲線である。培養は、キシ
ロースで生育させた前培養から１０8細胞／mlを接種し
た。図は、キシロースの消費と理論的最大収量に対する
百分率で表したエタノールへの変換を示している。
【図１６】図１６（１，２）は、ベクターｐＢＲＰＧＡ
Ｍ構築の略図である。このベクターを構築するために
は、機能性ＧＡＭプロモーターとＧＡＭのコーディング
配列の１から２０８番目までの塩基対を含むｐＢＲＳＷ
ＡＲＳＧＡＭからの３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII
−断片を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII小断片
に連結させた。
【図１７】図１７（１，２）は、ベクターｐＢＲＧＣ１
の構築の略図である。このベクターを構築するために
は、ヌクレオチド＋１２２で始まるキシロースのための
構造遺伝子を含むｐＣＴ６０３の３．４ｋｂのＰｖｕII
断片を、ｐＢＲＰＧＡＭのＰｖｕII部位に挿入した。
【図１８】図１８（１，２）は、ベクターｐＭＰＧＣ１
−２構築の略図である。ＧＡＭプロモーターの制御下の
セルラーゼ遺伝子を含むｐＢＲＧ１−１の６．５ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ−断片をｐＣＪＤ５−１の大きな
ＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ−断片に連結した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 コルネリス ピー．ホレンベルグ ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ，チェ ピンシュトラーセ ７ (72)発明者 マイクル フォン シリアシィ − ヴァ ントラップ ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ 13, オット − ハーン − シュトラーセ 161 (72)発明者 ペーター コッター ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ，オベ ルビルケル アレ 24 (72)発明者 レネ アモレ ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ，ヒメ ルガイステル シュトラーセ 110 (72)発明者 ミカエル ピオンテック ドイツ連邦共和国エッセン 15， ハイシ ンゲルシュトラーセ 336 (72)発明者 ユッタ ハゲドルン ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ，ブリ ックマンシュトラーセ 13エイ

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ピチア スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ
    ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のＸＹＬ１および（または）ＸＹ
    Ｌ２遺伝子の５´調節領域、および（または）サッカロ
    ミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
    ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨＩプロモーター、お
    よび（または）シュワニオミセス オクシデンタリス
    （Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａ
    ｌｉｓ）からのグルコアミラーゼプロモーターの制御下
    で、所望のタンパク質をコードしている構造遺伝子を発
    現させることからなるピチア スティピティスにおいて
    所望のタンパク質を製造する方法。
JP2000000589A 1990-03-26 2000-01-06 タンパク質の製造方法 Pending JP2000139486A (ja)

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