JP2002532096A - 酵素をコードする遺伝子の単離及び選択方法並びに適当な培養培地 - Google Patents

酵素をコードする遺伝子の単離及び選択方法並びに適当な培養培地

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JP2002532096A JP2000588369A JP2000588369A JP2002532096A JP 2002532096 A JP2002532096 A JP 2002532096A JP 2000588369 A JP2000588369 A JP 2000588369A JP 2000588369 A JP2000588369 A JP 2000588369A JP 2002532096 A JP2002532096 A JP 2002532096A
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hmtbs
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フアーブル−ビユル,オリビエ
ピエラール,ジエローム
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アベンテイス・アニマル・ニユートリシヨン・エス・エー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は適切な基質をメチオニン及びその誘導体(例えばHMTBS)に変換する生物学的変換に関与する酵素をコードするDNA配列の選択及び/又は単離方法に関し、前記方法は、1)適切な宿主微生物でその発現を可能にするベクターにDNA配列をクローニングする段階と、2)先に得られたベクターを適切なメチオニン栄養要求微生物に導入することにより前記適切な微生物を形質転換する段階と、3)十分な量の適切な基質を含む適切な培地で先に得られた形質転換微生物を培養する段階と、4)適切な培地で増殖することが可能な形質転換微生物を選択する段階と、5)適切な基質の生物学的変換に関与するDNA配列を単離し、場合により同定する段階を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、基質をメチオニンまたは2−ヒドロキシ−4−(メチルチオ)ブタ
ン酸またはその塩のようなメチオニン誘導体に変換する生物的変換に関与する酵
素、特にアミド基をカルボン酸に加水分解する酵素、または、ニトリル基を対応
するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵素をコードする遺伝子を適当
な選択手段によって単離及び/または選択する新規な方法、並びに、該方法を実
施するための適当な培養培地に関する。
【0002】 ニトリル基が対応するカルボン酸及びアンモニウムイオンに加水分解されると
き、これを触媒する酵素はニトリラーゼである(Faber,Biotrans
formations in Organic Chemistry,Spri
nger Verlag,Berlin Heidelberg,1992,
ISBN3−540−55762−8)。しかしながら、ニトリル基を対応する
カルボン酸に変換するこの生物的変換は、ニトリル基の加水分解を最終目的とし
て2段階で行うこともできる。第一段階でニトリルヒドラターゼによってニトリ
ルを対応するアミドに変換し、得られたアミドを第二段階でアミダーゼによって
対応するカルボン酸に加水分解する。
【0003】 ニトリラーゼは植物で初めて発見され(Thimann and Mahad
evan,1964,Arch.Biochem.Biophys.105:1
33−141)、次いで、Psuedomonas、Nocardia、Art
hrobacter、Fusarium、Rhodoccocus、Alcal
igenesのような多くの代表的な土壌微生物相から単離された(Kobay
ashi et Shimizu,1994,FEMS Microbiolo
gy Letters 120:217−224)。より最近には好熱性細菌の
ニトリラーゼが特性決定された(Crampら,1997,Microbiol
ogy,143:2313−2320)。ニトリラーゼは多様な基質に特異性を
有しており、それらの特異性に基づいて3つのグループ、即ち、脂肪族ニトリル
特異的ニトリラーゼ、芳香族ニトリル特異的ニトリラーゼまたはアリールアセト
ニトリル特異的ニトリラーゼに分類できる(Kobayashiら,1993,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:247−251;Ko
bayashi et Shimizu,1994,前出;Levy−Schi
lら,1995,Gene,161:15−20)。多くの合成プロセスにニト
リル基の加水分解が関与するのでニトリラーゼは生体触媒として重要である(L
evy−Schilら)。特に、Alcaligenes faecalisの
ニトリラーゼATCC9750及びComamonas testostero
niのニトリラーゼは、メチオニンのヒドロキシ類似体を得るために使用し得る
(FR9411301、WO9609403、FR9613077)。
【0004】 一般に、新しい酵素を発見するためには複数の戦略が使用される(Dalbo
ge et Lange,1998,TibTech 16:265−272)
:(i)所望の酵素活性の存在に基づいた選択手段を使用して特異的ビオトープ
(生息場所)から微生物を微生物学的に単離する、(ii)微生物の酵素活性を
発見するために菌株を培養し、問題の活性を定量する、(iii)培養可能な微
生物中で問題の遺伝子に相同の沈黙遺伝子を発見し、この遺伝子をモデル微生物
でクローニングして発現させる、(iv)タンパク質工学を利用して、入手可能
な酵素の特性を改善する、最後に、(v)微生物を予め単離しないで種々のビオ
トープから直接単離した遺伝子を発現によってクローニングする。(i)、(i
ii)、(iv)及び(v)に示した戦略は、in vivo選択手段が入手可
能であるならば、顕著に推進することも簡便にすることもできる。in viv
o選択手段なる用語は、所望の酵素活性を提供する微生物だけが増殖し得る増殖
培地及び/または増殖条件を意味する。
【0005】 更に、実験室で培養可能な微生物の割合が極めて少ないことを考慮するならば
(Amannら,1993,Microbiol Rev.59,143)、(
iv)及び(v)に示した戦略は生態多様性をより十分に利用するために特に重
要であり、微生物単離によって得ることはできない入手可能な生態多様性(bi
odiversite)を標的とするか(戦略v)、または、培養可能な菌株か
らより広い多様性を生み出す(戦略iv)。特にこれらの2つの戦略において、
入手容易なin vivo選択手段を得ることができれば短期間で及び場合によ
っては少ない手段で大量のクローンを選択できるという確実な利点が得られる(
Minshull,1998,“Evolution of enzyme a
ctivities and substrate preferences
by DNA shuffling”,IBC’s second Inter
national Symposium on Directed Evolu
tion of Industrial Enzymes,Sept 14−1
5,San Diego;Grayling,1998,“Concepts
and Strategies in high throughput sc
reening for improved enzyme variants
”,IBC’s second International Symposi
um on Directed Evolution of Industri
al Enzymes,Sept 14−15,San Diego)。
【0006】 本発明は、基質をメチオニン(AMTBS)または2−ヒドロキシ−4−(メ
チルチオ)ブタン酸(HMTBS)のようなその誘導体の塩、特にアンモニウム
塩に変換する生物的変換に関与する酵素、特に2−アミノ−4−(メチルチオ)
ブチロニトリル(AMTBN)または2−ヒドロキシ−4−(メチルチオ)ブチ
ロニトリル(HMTBN)のようなその誘導体をメチオニンまたはHMTBSの
ようなメチオニン誘導体に直接変換するかまたは2−アミノ−4−メチルチオブ
タンアミドまたは2−ヒドロキシ−4−メチルチオブタンアミド(HMTBAm
ide)のようなその誘導体を経由して変換する生物的変換に関与する酵素をコ
ードするDNA配列を単離及び/または選択する簡単、迅速で廉価な方法に関す
る。
【0007】 本発明の好ましい実施態様によれば、酵素は、適当な基質をHMTBSに変換
する生物的変換に関与し、適当な基質はHMTBNまたはHMTBAmideで
ある。
【0008】 判り易いように配慮して、以後の記載はHMTBS、HMTBNまたはHMT
BAmideに限定した。しかしながら、以後の記載中のHMTBS、HMTB
NまたはHMTBAmideに関する情報は、メチオニンまたはその誘導体、対
応する基質、2−アミノ−4−(メチルチオ)ブチロニトリルまたはその誘導体
及び2−アミノ−4−メチルチオブタンアミドまたはその誘導体にも当てはまる
【0009】 メチオニン要求性微生物の突然変異体中でニトリラーゼを発現させ得るプラス
ミドでこのような配列をクローニングすることによって、基質をHMTBSに変
換する生物的変換に関与する活性酵素を組込んだ菌株だけを選択し得る。メチオ
ニン要求性微生物は、基質中にメチオニンが存在しなくても生物的変換によって
得られたHMTBSの存在下で増殖できる。従ってこの戦略によって、活性酵素
を発現するクローンが富化された培養物が得られる。更に、調節突然変異誘発ま
たは無作為突然変異誘発によってその触媒特性が改善された酵素を発現するクロ
ーンに富む培養物が得られる。
【0010】 従って本発明は、適当な基質をメチオニン及びHMTBSのようなメチオニン
誘導体に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするDNA配列の選択及び
/または単離方法に関する。該方法は以下の段階、即ち、 (1)適当な宿主微生物中でDNAを発現させ得るベクターでDNA配列をクロ
ーニングする段階と、 (2)前段階で得られたベクターを適当なメチオニン要求性微生物に導入するこ
とによってその適当な微生物を形質転換する段階と、 (3)前段階で得られた形質転換微生物を十分な量の適当な基質を含む適当な培
養培地で培養する段階と、 (4)適当な培養培地で増殖し得る形質転換微生物を選択する段階と、 (5)適当な基質の生物的変換に関与するDNA配列を単離し必要な場合には同
定する段階、とから成る。
【0011】 本発明の好ましい実施態様によれば、適当な基質が2−ヒドロキシ−4−(メ
チルチオ)ブチロニトリル(HMTBN)であり、該基質は、ニトリラーゼによ
って直接に、または、2−ヒドロキシ−4−(メチルチオ)ブタンアミド(HM
TBAmide)を経由して、HMTBSに変換される。この後者の経路では、
先ずHMTBNがニトリルヒドラターゼによってHMTBAmideに変換され
、次いでHMTBAmideがアミダーゼによって変換される。第一の場合には
、本発明方法によって単離及び/または選択されたDNA配列がニトリラーゼを
コードしている。第二の場合には、本発明方法によって単離及び/または選択さ
れたDNA配列がニトリルヒドラターゼまたはアミダーゼをコードしている。
【0012】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、適当な基質はHMTBAmideで
あり、この基質は、本発明方法で単離及び/または選択されたDNA配列がコー
ドしているアミダーゼによってHMTBSに変換される。
【0013】 本文中の単離なる用語は本質的に、多様な配列の集合から1つの特定配列を分
離することを意味する。本文中の選択なる用語は本質的に、特定の性質を有して
いる最良の配列を選択することを意味する。
【0014】 微生物を選択及び/または単離した後、適当な基質の生物的変換に関与するD
NA配列を容易に単離及び同定できるように該微生物を常用の培養培地で培養し
て増殖させる。
【0015】 本文中のメチオニン要求性の適当な微生物という表現は、メチオニン非含有で
HMTBS含有の培地で増殖する能力を有している形質転換可能な任意のメチオ
ニン要求性微生物を意味する。適当な微生物は酵母、菌類または細菌である。本
発明の好ましい実施態様では、適当な微生物が細菌、好ましくは大腸菌である。
【0016】 本発明の適当な微生物は、天然にメチオニン要求性でもよく、または突然変異
誘発によってメチオニン要求性になるように修飾されてもよい。栄養要求性突然
変異体を得る種々の方法が当業界で公知であり、文献にも十分に記載されている
(特に、Roberts CJ,Selker EU,Nucleic Aci
ds Res,1995 Dec 11 23:23 4818−26;McA
dam RAら,Infeet Immun,1995 Mar 63:3 1
004−12;Manning Mら,Can J Microbiol 19
84 Jan 30:1 31−5;Yamagata S,J Bacter
iol,1987 Aug 169:8 3458−63;Wabiko Hら
,J Bacteriol,1988 Jun 170:6 2705−10;
Frank Pら,J Biol Chem,1985 May 10 260
:9 5518−25)。
【0017】 HMTBNを対応するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵素をコー
ドするDNA配列を含むベクターによって形質転換された適当な微生物は、HM
TBNをHMTBSに変換し、メチオニン要求性微生物の増殖を可能にする。こ
の場合、微生物は菌株が増殖できるようにHMTBSをメチオニンに生物的変換
させる。
【0018】 HMTBAmideを対応するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵
素をコードするDNA配列を含むベクターによって形質転換された適当な微生物
は、HMTBAmideをHMTBSに変換し、メチオニン要求性微生物の増殖
を可能にする。
【0019】 メチオニン要求性の適当な微生物が更にHMTBAmideをHMTBSに変
換する生物的変換に関与する酵素をコードする遺伝子を含むとき、及び、この微
生物がHMTBNをHMTBAmideに変換する生物的変換に関与する酵素を
コードするDNA配列を含むベクターで形質転換されているとき、該微生物はH
MTBNをHMTBSに変換することによって増殖し得る。
【0020】 本発明の第一の好ましい実施態様によれば、HMTBNをHMTBSに変換す
る生物的変換に関与する単離及び/または選択された酵素はニトリラーゼであり
、ニトリラーゼはHMTBNを、修飾された微生物の増殖に必要なHMTBSに
変換し得る。
【0021】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、HMTBNをHMTBSに変換する
生物的変換に関与する単離及び/または選択された酵素がニトリルヒドラターゼ
であり、ニトリルヒドラターゼはHMTBNをHMTBAmideに変換し得る
。適当な微生物はまた、HMTBAmideを修飾された微生物の増殖に必要な
HMTBSに変換する生物的変換を確保する相補的アミダーゼをコードする天然
遺伝子または異種遺伝子を含む。
【0022】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、HMTBNをHMTBSに変換する
生物的変換に関与する単離及び/または選択された酵素がアミダーゼである。
【0023】 上記の2つの場合に、相補的酵素の遺伝子が異種遺伝子であるときは、該遺伝
子は、適当な微生物のゲノムに組込まれるかまたはプラスミドに担持される。
【0024】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、HMTBAmideをHMTBSに
変換する生物的変換に関与する単離及び/または選択された酵素がアミダーゼで
あり、適当な培養培地がHMTBAmideを含有する。
【0025】 本発明の特定実施態様によれば、DNA配列は、1つまたは複数のゲノムから
該ゲノムの完全制限または部分制限によって単離されたDNA配列である。DN
A配列はまた、ゲノムの一部から該ゲノムの一部の完全制限または部分制限によ
って単離されたDNA配列でもよい。制限という用語は、DNAを特異的または
非特異的に断片化し得る酵素的または非酵素的な任意の方法を意味する。この場
合に本発明方法は上記に定義した戦略(i)及び(v)に従って新規な酵素を選
択するために特に好適である。
【0026】 DNA配列はまた、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって構築物から単離
されたDNA配列でもよい。
【0027】 DNA配列はまた、上記に定義の基準酵素をコードする配列の無作為突然変異
誘発または標的突然変異誘発によって得ることができる。
【0028】 この場合には、本発明の方法は上記戦略(iv)による新規酵素の選択に特に
適している。
【0029】 DNA配列は上記基準酵素に対して所定相同度をもつ単離DNA配列でもよい
。この所定相同度は>50%が有利であり、好ましくは>60%、より好ましく
は>70%である。この場合には、本発明の方法は基準配列に対して所定レベル
の相同度をもつ核酸配列が基準配列とどの程度まで同一機能及び/又は同一活性
をもつかを識別するために使用される迅速スクリーニング手段を構成する。
【0030】 基準酵素とは、本発明によると適切な基質からHMTBS(特にHMTBNか
らHMTBS)への生物学的変換又はHMTBAmideからHMTBSへの生
物学的変換に関与する公知酵素を意味し、好ましくは本発明の方法により単離及
び/又は選択された新規酵素の機能及び活性を評価するための基準として利用さ
れる上記ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ又はアミダーゼを意味し、特に新
規突然変異体が所望される酵素及び/又は上記所定相同度をもつ酵素を意味する
【0031】 本発明の単離及び/又は選択方法では、形質転換微生物の培養は当業者に公知
の適切な任意手段により実施される。特に大量(バッチ)培養特に逐次培養が挙
げられ、又は連続培養、特にケモスタット培養により実施される(Seeger
s JFら,Plasmid,1995 Jan 33:1 71−7; We
ikert Cら,Microbiology,1997 May 143(P
t 5):1567−74; Tsen SDら,Biochem Bioph
ys Res Commun,1996 Jul 16 224:2 351−
7; Tsen SD Biochem Biophys Res Commu
n,1990 Feb 14 166:3 1245−50; Berg OG
,J Theor Biol,1995 Apr 7 173:3 307−2
0)。
【0032】 十分な量の適切な基質を含む適切な培地とは、本発明によると好ましくはメチ
オニン栄養要求性形質転換微生物の増殖に適した任意の培地を意味し、前記培地
はメチオニンを実質的に含まず、適切な基質のHMTBS変換後に前記形質転換
微生物を増殖させるために十分な量の適切な基質を含む。
【0033】 メチオニンを実質的に含まない培地とは、メチオニンを含まないか、又は場合
により、適切なメチオニン栄養要求微生物を増殖させるには不十分な量のメチオ
ニンを含む培地を意味する。
【0034】 HMTBNの十分な量は0〜60g/l(約400mMに等価)が有利であり
、より好ましくは3mg/l〜17mg/l(約20μM〜約100μMに等価
)、より好ましくは6mg/l〜10mg/l(約40μM〜約60μMに等価
)である。
【0035】 HMTBAmideの十分な量は0〜60g/l(約400mMに等価)が有
利であり、より好ましくは3mg/l〜17mg/l(約20μM〜約100μ
Mに等価)、より好ましくは6mg/l〜10mg/l(約40μM〜約60μ
Mに等価)である。
【0036】 当然のことながら、本発明の方法及び培地では、形質転換微生物の増殖に必要
な必須HMTBS源は形質転換微生物に導入されるDNA配列によりコードされ
る酵素による適切な基質(特にHMTBN又はHMTBAmide)の変換産物
であるHMTBSにより構成される。但し、該当微生物と所望選択レベルによっ
ては、本発明の培地は特に微生物の増殖を開始させるために十分な量のHMTB
Sを最初から(形質転換微生物接種時に予め)含んでいてもよく、このHMTB
S量は微生物の増殖に伴って適切な基質(特にHMTBN又はHMTBAmid
e)の変換産物であるHMTBSにより補充される。HMTBSは本発明により
形質転換微生物を増殖させるために十分な濃度よりも低い濃度で培地に存在して
いると有利である。この濃度は適切な培地、特にその形態(バッチ、連続液体、
固体等)に応じて決定することができ、好ましくは<350μg/l(約2μM
に等価)、より好ましくは<250μg/l(約1.5μMに等価)、より好ま
しくは130μg/l〜170μg/l(約0.8μM〜約1μMに等価)であ
る。
【0037】 本発明の好適実施態様によると、適切な培地はメチオニンを全く含まない有機
窒素源を含む。
【0038】 有機窒素源は酵母エキスが有利であり、特にYeast Nitrogen
Broth w/o Amino Acids(YNB,Yeast Nitr
ogen Broth w/o Amino Acids,DIFCO,組成は
DIFCO Manual,第10版,ISBN 9−9613169−9−3
,1984,1136頁に記載)又はカザミノ酸(Casamino Acid
s,Difco,組成はDIFCO Manual,第10版,ISBN 9−
9613169−9−3,1984,208頁に記載)である。
【0039】 本発明の好適実施態様によると、有機窒素源、より好ましくはYNBの含量は
0〜15g/l、より好ましくは2〜10g/l、更に好ましくは3〜8g/l
である。
【0040】 本発明の適切な培地は最少培地として後述するM9fruを含むと有利である
【0041】 本発明の適切な培地は炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース
、トレハロース、マンノース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、マル
トトリオース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、アラビノース、キシロ
ース、ラムノース、フコース、マンニトール、ソルビトール、リンゴ酸、サッカ
ラート、ムチン酸、メソ酒石酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸及び任意割合の
その混合物から選択される化合物を含むと有利である。炭素源はグルコース又は
フルクトース及び任意割合のその混合物から選択すると好ましく、フルクトース
がより好ましい。
【0042】 本発明の培地は液体でも固体でもよく、後者の場合には寒天又はアガロースを
含むことができる。
【0043】 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これによって発明の範囲を
制限するものではない。これらの実施例に記載する全方法又は操作は例示に過ぎ
ず、同一結果を達成するために利用可能な種々の方法を選択できる。DNAフラ
グメントの工学的方法の大部分は“Current Protocols in
Molecular Biology”第1及び2巻,Ausubel F.
M.ら,Greene Publishing Associates et
Wiley−Interscience刊(1989)又はMolecular
cloning,T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sa
mbrook(1982)に記載されている。
【0044】 図面の説明 図1はプラスミドRPA−BIOCAT41を示す。括弧内の部位はクローニ
ング時に除去された部位である。Ptrp:トリプトファンプロモーター、ni
tB:ニトリラーゼ遺伝子、TrmB:転写ターミネーター、finROP:R
OPタンパク質をコードする遺伝子の終点(Chambersら,1988,G
ene 68:139−149)、ORI:複製起点、RNAI/II:複製に
関与するRNA(Chambersら,前出)、Tc:テトラサイクリン耐性遺
伝子。
【0045】 図2は50ml密閉管で37℃、200rpmで培養した2種の株RPA−B
IOCAT610及び842の増殖度をマイクロプレートにおける630nm光
学密度の読取値により示す。A):HMTBSを加えない最少培地M9YNBf
ru+50μM HMTBNにおけるRPA−BIOCAT610及び842株
の増殖度、B):10μM HMTBSを加えた最少培地M9YNBfru+5
0μM HMTBNにおけるRPA−BIOCAT610及び842株の増殖度
【0046】 図3はRPA−BIOCAT841及び842株の選択培地増殖度を示し、A
は0.8μMの制限濃度HMTBSを加え、Bは1μMの制限濃度HMTBSを
加えた。選択培地は最少培地M9YNBfru+0.5mM IPTG+0.8
μM HMTBS(S0.8)もしくは1μM HMTBS(S1)、又は50
μM HMTBN+0.8μM HMTBS(NS0.8)、又は50μM H
MTBN+1μM HMTBS(NS1)から構成した。
【0047】 図4は0.8μM HMTBSの存在下(A)又は1μM HMTBSの存在
下(B)におけるRPA−BIOCAT841及び960株の選択培地増殖度を
示す。選択培地は最少培地M9YNBfru+0.5mM IPTG+0.8μ
M HMTBS(S0.8)もしくは1μM HMTBS(S1)、又は50μ
M HMTBN+0.8μM HMTBS(NS0.8)、又は50μM HM
TBN+1μM HMTBS(NS1)から構成した。
【0048】 方法 使用した方法は例えばAusubelら,1987(Current Pro
tocols in Molecular Biology,John Wil
ley and Sons,New York)、Maniatisら,198
2(Molecular cloning: a laboratory ma
nual,Cold Spring Harbor Laboratory,C
old Spring Harbor,New York)に記載されている当
業者に公知の慣用分子生物学及び微生物学法である。
【0049】 最少培地M9fruは以下の組成:7g/l NaHPO、3g/l K
PO、0.6g/l NaCl、1g/l NHCl、4g/lフルク
トース、1mM MgSO、0.1mM CaCl、10μg/mlチアミ
ンをもつ。最少培地M9YNBfruは最終濃度5g/lのYNB(Yeast
Nitrogen Base,Difco)を加えたM9fru培地に対応す
る。この培地は予め滅菌しておいた下記母液:M9塩×10(70g/l Na HPO、30g/l KHPO、6g/l NaCl、10g/l N
Cl、高圧滅菌)、濾過20%フルクトース、濾過20%YNB、高圧滅菌
100mM MgSO、高圧滅菌10mM CaCl、濾過1%チアミンか
ら生成される。
【0050】 選択培地の生成に使用したHMTBN(59mM)、HMTBS(1.3mM
)及びHMTBアミド(100mM)母液はこれらの物質の貯蔵液をM9YNB
fruで夫々濃度5.9M(Rhone−Poulencロット番号:PHM4
39J)及び1.3M(Rhone−Poulencロット番号:BFR81)
に希釈することにより調製される。これらの溶液はEP330521、EP14
2488、US3773927及びUS4353924の各特許及び特許出願に
記載されているプロトコールに従って調製する。HMTBアミドは前記特許及び
特許出願に記載されているアミノシアノヒドリン(CHSCHCHCHN
CN)の硫酸加水分解により得られる。
【0051】 予備培養は該当株のグリセロール貯蔵液から播種することにより、必要に応じ
て適切な抗生物質の存在下に濃LB培地(10glトリプトン、5g/l酵母エ
キス、10g/l NaCl,pH7.0)3ml中で実施される。予備培養液
を37℃、200rpmで6〜7時間インキュベートする。
【0052】 RPA−BIOCAT841及び842株の発現培養液はLB10ml+10
0μg/mlカルベニシリン+0.5mM IPTGで予備培養液を100倍に
希釈することにより得られる。これらの培養液を50ml密閉管で37℃、20
0rpmで16時間インキュベートする。バイオマスは660nm光学密度(O
D660)を測定し、バイオマス関係式(培養液1リットル当たりの乾燥重量グ
ラム)=OD660×0.35で表す。
【0053】 培養液のニトリラーゼ活性定量は次のように実施する。発現培養液を遠心分離
し、細胞ペレットを100mMリン酸緩衝液で洗浄する。細胞ペレットをこの同
一緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液200μlを200mM HMTBN(100
mMリン酸緩衝液溶液)200μlと共に37℃で2時間インキュベートする。
0、30、60、90及び120分間隔で反応媒体5μlサンプルを分取し、2
00mM HPO 50μlと混合する。このサンプル55μlに5.1%
フェノール−2.54N NaOH溶液105μlを加え、混合後に2倍希釈4
7/50℃Jabel溶液(12.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液、Douss
elin & Geoffray Jacquet reunis,Couzo
n aux Montsd’Or,フランス)40μlを加える。撹拌後に周囲
温度で10分間インキュベートした後、630nm光学密度を読取る。遊離HM
TBS量の計算は下表に従ってHMTBNの存在下に100mMリン酸緩衝液で
調製したHMTBS校正溶液に比較することにより実施する。
【0054】
【表1】 活性は生成HMTBSkg/時/kg乾燥細胞(CS)で表す。
【0055】 実施例 実施例1:プラスミドpRPA−BCAT41の構築。
【0056】 Ptrpプロモーター、λファージのcII遺伝子のリボソーム結合部位(R
BScII)及びAlcaligenes faecalisのニトリラーゼ遺
伝子ATCC8750(nitB)を含む1.27kbフラグメントを制限酵素
EcoRI及びXbaIによりプラスミドpRPA−BCAT6(仏国出願第9
6/13077号)から抽出し、同一制限酵素で切断したベクターpXL642
(CIP出願第08/194,588号に記載)にクローニングした。得られた
プラスミドpRPA−BCAT15を酵素StuI及びBsmIで切断し、4.
3kbフラグメントをpRPA−BCAT4(仏国出願第96/13077号)
から精製した136bp StuI−BsmIフラグメントと連結し、プラスミ
ドpRPA−BCAT19を得た。pRPA−BCAT19の部分配列決定によ
ると、ニトリラーゼのAsp279残基のコドンがAsn279残基のコドンで
置換されていることが確認された。次に、融合体Ptrp::RBScII::
nitBを含むpRPA−BCAT19の1.2kb EcoRI−XbaIフ
ラグメントを同一酵素で切断したベクターpRPA−BCAT28にクローニン
グし、6.2kbプラスミドpRPA−BCAT29を得た。ベクターpRPA
−BCAT28はpXL642(CIP出願第08/194,588号に記載)
の3.9kb SspI−ScaIフラグメントをpHP45ΩTc(Fell
ayら,1987,Gene 52:147−154)の2.1kb SmaI
フラグメントと連結してアンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マー
カーで置換することにより得た。プラスミドpRPA−BCAT29の複製起点
の近傍のNdeI部位をNdeI部分消化と大腸菌ポリメラーゼI(クレノウフ
ラグメント)の作用により破壊することにより、図1に制限地図を示すプラスミ
ドpRPA−BCAT41を得た。発現カセットの配列を配列番号1で表す。
【0057】 実施例2:プラスミドpRPA−BCAT77の構築。
【0058】 プラスミドpRPA−BCAT41を鋳型として使用し、プライマーとして仏
国出願第96/13077号に記載のPCRAF1及び下記NitB160: NitB160:5'-GGGGAGAGGT GCTCCCAGCA GCACAGGCCA CCGACGGG-3' とPfu酵素(Stratagene)を使用することにより、nitB遺伝子
の一部をPCR増幅した。使用したプログラムは、5分間95℃1サイクル、1
分間95℃、1分間60℃、1分間72℃5サイクル、30秒間95℃、30秒
間60℃、30秒間72℃30サイクル及び5分間72℃1シーケンスとした。
こうして増幅した約0.495bpフラグメントを酵素NdeI及びBsiHK
AI(New England Biolabs)により消化した。次に、プラ
スミドpRPA−BCAT41の消化産物から精製した0.261kb Bsi
HKAI−StuIフラグメントと、pRPA−BCAT72の消化産物から精
製した5.43kb NdeI−StuIフラグメントに前記増幅フラグメント
を連結した。ベクターpRPA−BCAT72はXcmI消化と再連結によりベ
クターpRPA−BCAT41から約0.55kbのXcmIフラグメントを除
去することにより得た。このクローニングにより得られたプラスミドをpRPA
−BCAT77と命名した。これはプラスミドpRPA−BCAT41に対応す
るが、160位アラニン残基をグリシン残基で置換したニトリラーゼNitBを
発現させることができる。
【0059】 実施例3:PlacプロモーターからAlcaligenes faecal
isのニトリラーゼを発現する栄養要求大腸菌株の構築。
【0060】 プラスミドpRPA−BCAT77を鋳型として使用し、下記プライマーni
tBMN1及びnitBMN2: nitBMN1:5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3' nitBMN2:5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3' とPfuポリメラーゼ(Stratagene)を使用することにより、Alc
aligenes faecalisのニトリラーゼ遺伝子ATCC8750を
PCR増幅した。使用したプログラムは、5分間95℃1サイクル、1分間95
℃、1分間50℃、1分間72℃5サイクル、30秒間95℃、30秒間50℃
、30秒間72℃30サイクル及び5分間72℃1シーケンスとした。次に、得
られた約1.2kbフラグメントを酵素XbaIにより消化し、酵素EcoRV
及びXbaIで切断しておいたベクターpbsII ks−(Stratage
ne)にクローニングした。次に、得られたプラスミドpRPA−BCAT10
5を大腸菌株RPA−BIOCAT610に導入した。この株はmetA遺伝子
に欠失を含み、Richaudら(J.Biol.Chem.(1993)26
8:26827−26835)に記載されているβ180株に対応する。クロー
ンを1個選択し、上記発現条件下に3種のLBサンプルで培養した。上記のよう
にして得られた細胞ペレットでニトリラーゼ活性を測定した処、実施例4に記載
するRPA−BIOCAT842株の0kg/h.kgCSに対して平均後に2
.5kg/h.kgCSであることが判明したので、同一条件で培養した。活性
ニトリラーゼを発現するこの新規株をRPA−BIOCAT841と命名した。
【0061】 実施例4:PlacプロモーターからAlcaligenes faecal
isの不活性ニトリラーゼを発現する栄養要求大腸菌株の構築。
【0062】 プラスミドpRPA−BCAT69を鋳型として使用することにより、ニトリ
ラーゼ変異体遺伝子NitBを実施例3に記載したように増幅した。プラスミド
pRPA−BCAT69はベクターpRPA−BCAT41に対応するが、ニト
リラーゼNitBの163位システイン残基をアラニン残基で置換する突然変異
をnitB遺伝子に含む。プラスミドpRPA−BCAT69は次のように得た
。プライマーとして仏国出願第96/13077号に記載のPCRAF1及び下
記NitB1: NitB1:5'-GCAGCACAGG GCACCGACGC-3' を使用して鋳型pRPA−BCAT41でPCR増幅後に、増幅産物をNDeI
とBanIで消化し、約0.476kbインサートを得た。同様に、下記プライ
マーNitB2及びSR: NitB2:5'-CGCGTCGGTG CCCTGTGCGC CTGGGAGC-3' SR:5'-CGGCAATGAT CAGGCCTTCG GC-3' を使用して鋳型pRPA−BCAT41でPCR増幅後に、増幅産物をBanI
とStuIで消化し、約0.34kbインサートを得た。ベクターpRPA−B
CAT72をNdeIとStuIで消化後、5.43kbフラグメントを上記0
.476kb NdeI−BanIインサートと0.34kb BanI−St
uIインサートに連結し、ベクターpRPA−BCAT69を形成した。プライ
マーnitBMN1及びnitBMN2と鋳型pRPA−BCAT69を使用し
て得られた増幅産物を次に実施例3に記載したようにベクターpbsII ks
−(Stratagene)にクローニングした。得られたプラスミドをpRP
A−BCAT107と命名し、RPA−BIOCAT610株に導入し、新規株
RPA−BIOCAT842を得た。
【0063】 実施例5:PlacプロモーターからComamonas testoste
roniの活性ニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の構築。
【0064】 鋳型プラスミドpXL2158(FR9613077)と、下記プライマーN
itA1及びNitA2: NitA1:5'-GGGCATACAT TCAATCAATT G-3' NitA2:5'-AGGTGGGACC CAAGCTTGCA-3' とDNAポリメラーゼPfuを使用してComamonas testoste
roniのnitA遺伝子を含む1.35kbフラグメントのPCR増幅を行っ
た。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)精製
、QIAEX IIキット(QIAGEN)による脱塩及び酵素HindIII
による消化後に、酵素HindIII及びHincIIで予め消化しておいたプ
ラスミドpbsII ks−にPCRフラグメントを連結し、プラスミドpBC
AT145を得た。このプラスミドをChungら(Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA(1988)86:2172−2175)の方法に従って
RPA−BIOCAT610株に導入した。得られた新規株をRPA−BIOC
AT960と命名した。
【0065】 実施例6:HMTBSを加えた最少培地におけるメチオニン栄養要求大腸菌突
然変異体の増殖。
【0066】 RPA−BIOCAT610及び842株を842株のみに0.5mM IP
TGと100μg/mlカルベニシリンを加えたLB培地で予備培養し、M9Y
NBfru培地で洗浄し、等容量のこの同一培地にとった。次に2種の培養液を
RPA−BIOCAT842株のみに100μg/mlカルベニシリンと0.5
mM IPTGを加えた培地i)M9YNBfru+50μM HMTBN、i
i)M9YNBfru+50μM HMTBN+10μM HMTBSで100
倍に希釈した。これらの培養液を50ml密閉管で37℃、200rpmで撹拌
下に培養し、マイクロプレートで読取った培養液の630nm光学密度により株
の増殖度を測定し、図2に報告する。
【0067】 その結果、HMTBSはメチオニン栄養要求大腸菌株によりメチオニン源とし
て使用可能であることが判明した。
【0068】 実施例7:Alcaligenes faecalisの活性ニトリラーゼを
発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の最少培地増殖に及ぼすYNB、HMTB
N及びHMTBSの影響 RPA−BIOCAT841及び842株を100μg/mlカルベニシリン
と0.5mM IPTGの存在下に予備培養し、実施例6に記載したように洗浄
し、いずれも100μg/mlカルベニシリンと0.5mM IPTGを加えた
表1に示す培地5mlで1000倍に希釈した。50ml密閉管で37℃、20
0rpmで5日間インキュベーション後に培養液の濁度の目視により増殖を評価
した。これらの結果を表1にまとめる。
【0069】
【表2】
【0070】 これらの結果から明らかなように、YNBは例示条件下でメチオニン栄養要求
大腸菌株の増殖に必須の添加成分を構成する。
【0071】 また、試験した選択培地は活性ニトリラーゼを発現するΔmetA大腸菌株を
不活性形態のこの酵素を発現する株から区別できないこともこれらの結果から明
らかである。50μMのHMTBN濃度は大腸菌の増殖に十分なメチオニン源を
提供するには低過ぎる。
【0072】 実施例8:栄養要求株の増殖を可能にするHMTBS最少濃度の決定。
【0073】 RPA−BIOCAT841株を100μg/mlカルベニシリンと0.5m
M IPTGの存在下に予備培養し、実施例6に記載したように洗浄し、いずれ
も100μg/mlカルベニシリンと0.5mM IPTGを加えた表2に示す
培地5mlで1000倍に希釈した。50ml密閉管で37℃、200rpmで
5日間インキュベーション後に培養液の濁度の目視により増殖を評価した。これ
らの結果を表2にまとめる。
【0074】
【表3】
【0075】 これらの結果から明らかなように、RPA−BIOCAT841株の増殖に必
要な最少HMTBS濃度は2μM以上である。
【0076】 実施例9:Alcaligenes faecalisの活性ニトリラーゼを
発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の増殖を可能にする選択培地の調製。
【0077】 RPA−BIOCAT841及び842株を100μg/mlカルベニシリン
と0.5mM IPTGの存在下に予備培養し、実施例6に記載した条件下で洗
浄後、0.8又は1μM HMTBSと50μM HMTBNを加えた選択培地
M9YNBfru 10ml+0.5mM IPTGで100倍に希釈した。図
3はこれらの2種の株を50ml密閉管で37℃、200rpmで培養し、マイ
クロプレートで630nm光学密度の読取りにより測定した増殖度を示す。
【0078】 その結果、選択培地M9YNBfru+0.5mM IPTG+50μM H
MTBN+0.8又は1μM HMTBSは活性ニトリラーゼを発現する大腸菌
株を不活性ニトリラーゼを発現する大腸菌株から区別できることが判明した。
【0079】 実施例10:活性ニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求大腸菌株のヒド
ロキシメチルチオブチロニトリル上の増殖。
【0080】 RPA−BIOCAT841及び960株を100μg/mlカルベニシリン
と0.5mM IPTGの存在下に予備培養し、実施例6に記載した条件下に洗
浄後、実施例9に記載した選択増殖培地で100倍に希釈した。図4はこれらの
2種の株を50ml密閉管で37℃、200rpmで培養し、マイクロプレート
で630nm光学密度の読取りにより測定した増殖度を示す。
【0081】 その結果、実施例9に記載の培地はPlacプロモーターを使用する発現系で
異なる2種の起源のニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求株に選択的であ
ることが判明した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 プラスミドRPA−BIOCAT41を示す。括弧内の部位はクローニング時
に除去された部位である。Ptrp:トリプトファンプロモーター、nitB:
ニトリラーゼ遺伝子、TrmB:転写ターミネーター、finROP:ROPタ
ンパク質をコードする遺伝子の終点(Chambersら,1988,Gene
68:139−149)、ORI:複製起点、RNAI/II:複製に関与す
るRNA(Chambersら,前出)、Tc:テトラサイクリン耐性遺伝子。
【図2】 50ml密閉管で37℃、200rpmで培養した2種の株RPA−BIOC
AT610及び842の増殖度をマイクロプレートにおける630nm光学密度
の読取値により示す。A):HMTBSを加えない最少培地M9YNBfru+
50μM HMTBNにおけるRPA−BIOCAT610及び842株の増殖
度、B):10μM HMTBSを加えた最少培地M9YNBfru+50μM
HMTBNにおけるRPA−BIOCAT610及び842株の増殖度。
【図3】 RPA−BIOCAT841及び842株の選択培地増殖度を示し、Aは0.
8μMの制限濃度HMTBSを加え、Bは1μMの制限濃度HMTBSを加えた
。選択培地は最少培地M9YNBfru+0.5mM IPTG+0.8μM
HMTBS(S0.8)もしくは1μM HMTBS(S1)、又は50μM
HMTBN+0.8μM HMTBS(NS0.8)、又は50μM HMTB
N+1μM HMTBS(NS1)から構成した。
【図4】 0.8μM HMTBSの存在下(A)又は1μM HMTBSの存在下(B
)におけるRPA−BIOCAT841及び960株の選択培地増殖度を示す。
選択培地は最少培地M9YNBfru+0.5mM IPTG+0.8μM H
MTBS(S0.8)もしくは1μM HMTBS(S1)、又は50μM H
MTBN+0.8μM HMTBS(NS0.8)、又は50μM HMTBN
+1μM HMTBS(NS1)から構成した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 バテイース・ドウビテ,ナデイヌ フランス国、エフ−69009・リヨン、リ ユ・ドウ・サン−シル、224、アパルトマ ン・76 Fターム(参考) 4B024 AA03 AA05 BA07 BA11 BA71 CA01 DA06 GA11 GA19 4B050 CC03 EE02 EE03 EE10 LL05 4B065 AA26X AB01 AC14 BA01 BB11 BC13 BC20 CA17 CA41 CA44

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 適当な基質をメチオニン及びHMTBSのようなメチオニン
    誘導体に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするDNA配列の選択及び
    /または単離方法であって、 (1)適当な微生物宿主中でDNAを発現させ得るベクターでDNA配列をクロ
    ーニングする段階と、 (2)前段階で得られたベクターを適当なメチオニン要求性微生物に導入するこ
    とによって前記適当な微生物を形質転換する段階と、 (3)前段階で得られた形質転換微生物を十分な量の適当な基質を含む適当な培
    養培地で培養する段階と、 (4)前記適当な培地で増殖し得る形質転換微生物を選択及び/または単離する
    段階と、 (5)適当な基質の生物的変換に関与するDNA配列を単離し必要な場合には同
    定する段階、とから成ることを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】 適当な基質が2−アミノ−4−(メチルチオ)ブチロニトリ
    ルであるか、または、2−ヒドロキシ−4−(メチルチオ)ブチロニトリル(H
    MTBN)のようなその誘導体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 適当な基質がニトリラーゼによって直接にメチオニンまたは
    HMTBSのようなメチオニン誘導体に変換されることを特徴とする請求項2に
    記載の方法。
  4. 【請求項4】 単離及び/または選択されたDNA配列がニトリラーゼをコ
    ードしていることを特徴とする請求項3に記載の方法。
  5. 【請求項5】 2−アミノ−4−(メチルチオ)ブチロニトリルまたはHM
    TBNのようなその誘導体を、2−アミノ−4−(メチルチオ)ブタンアミドま
    たは2−ヒドロキシ−4−(メチルチオ)ブタンアミド(HMTBAmide)
    のようなその誘導体を経由して、メチオニンまたはHMTBSのようなメチオニ
    ン誘導体に変換する請求項2に記載の方法であって、先ず、2−アミノ−4−(
    メチルチオ)ブチロニトリルまたはHMTBNのようなその誘導体をニトリルヒ
    ドラターゼによって2−アミノ−4−(メチルチオ)ブタンアミドまたはHMT
    BAmideのようなその誘導体に変換し、次いで、2−アミノ−4−(メチル
    チオ)ブタンアミドまたはHMTBAmideのようなその誘導体をアミダーゼ
    によってメチオニンまたはHMTBSのようなメチオニン誘導体に変換すること
    を特徴とする方法。
  6. 【請求項6】 単離及び/または選択されたDNA配列がニトリルヒドラタ
    ーゼまたはアミダーゼをコードしていることを特徴とする請求項5に記載の方法
  7. 【請求項7】 単離及び/または選択されたDNA配列がニトリルヒドラタ
    ーゼをコードしており、適当な微生物が更に、相補的アミダーゼをコードする天
    然遺伝子または異種遺伝子を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項8】 単離及び/または選択されたDNA配列がアミダーゼをコー
    ドしており、適当な微生物が更に、相補的ニトリルヒドラターゼをコードする天
    然遺伝子または異種遺伝子を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
  9. 【請求項9】 適当な基質が2−アミノ−4−(メチルチオ)ブタンアミド
    であるかまたはHMTBAmideのようなその誘導体であり、アミダーゼによ
    ってメチオニンまたはHMTBSのようなメチオニン誘導体に変換されることを
    特徴とする請求項1に記載の方法。
  10. 【請求項10】 単離及び/または選択されたDNA配列がアミダーゼであ
    ることを特徴とする請求項9に記載の方法。
  11. 【請求項11】 メチオニン要求性の適当な微生物が、メチオニン非含有で
    HMTBS含有の培地で増殖し得る形質転換可能なメチオニン要求性微生物であ
    ることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 【請求項12】 適当な微生物が、酵母、菌類及び細菌から選択されること
    を特徴とする請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項13】 細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項12に記載の
    方法。
  14. 【請求項14】 DNA配列が、1つまたは複数のゲノムから該ゲノムの完
    全制限または部分制限によって単離されたDNA配列であることを特徴とする請
    求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 【請求項15】 DNA配列が、ゲノムの一部から該ゲノムの一部の完全制
    限または部分制限によって単離されたDNA配列であることを特徴とする請求項
    1から13のいずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項16】 DNA配列が、PCRによって構築物から単離されたDN
    A配列であることを特徴とする請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  17. 【請求項17】 DNA配列が、無作為突然変異誘発によって得られること
    を特徴とする請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  18. 【請求項18】 形質転換された微生物の培養が、特に逐次培養による(バ
    ッチ式)大量培養であるか、または、特にケモスタット培養のような連続培養で
    あることを特徴とする請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 【請求項19】 適当な培養培地が、微生物の増殖を確保するためには不十
    分な量のメチオニンを含むが、生物的変換によってメチオニンまたはHMTBS
    のようなメチオニン誘導体に変換されると形質転換微生物を増殖させ得る十分な
    量の適当な基質を含むことを特徴とする請求項1から18に記載の方法。
  20. 【請求項20】 2−アミノ−4−(メチルチオ)ブチロニトリルまたはH
    MTBNのようなその誘導体の十分量が、0−60g/リットル、好ましくは3
    mg/リットル−17mg/リットル、より好ましくは6mg/リットル−10
    mg/リットルの範囲であることを特徴とする請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項21】 2−アミノ−4−(メチルチオ)ブタンアミドまたはHM
    TBAmideのようなその誘導体の十分量が、0−60g/リットル、好まし
    くは3mg/リットル−17mg/リットル、より好ましくは6mg/リットル
    −10mg/リットルの範囲であることを特徴とする請求項19に記載の方法。
  22. 【請求項22】 適当な培養培地が適正量のメチオニンまたはHMTBSの
    ようなメチオニン誘導体を含有することを特徴とする請求項1から21のいずれ
    か一項に記載の方法。
  23. 【請求項23】 メチオニンまたはHMTBSのようなメチオニン誘導体の
    適正量が、形質転換微生物を増殖させ得る十分な量を下回る濃度であることを特
    徴とする請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項24】 HMTBSの量が、350μg/リットル未満、好ましく
    は250μg/リットル未満、より好ましくは130−170μg/リットルの
    範囲であることを特徴とする請求項22または23に記載の方法。
  25. 【請求項25】 適当な培養培地が有機窒素源を含むことを特徴とする請求
    項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 【請求項26】 有機窒素源の濃度が、0−15g/リットル、好ましくは
    2−10g/リットル、より好ましくは3−8g/リットルの範囲であることを
    特徴とする請求項25に記載の方法。
  27. 【請求項27】 適当な培養培地が最少培地としてM9fruを含むことを
    特徴とする請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 【請求項28】 適当な培養培地が液体培地または固体培地であることを特
    徴とする請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 【請求項29】 請求項19から28のいずれか一項に定義された培養培地
  30. 【請求項30】 本発明方法によって選択及び/または単離されることを特
    徴とする、適当な基質をメチオニンまたはHMTBSのようなメチオニン誘導体
    に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするDNA配列。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FR2822460B1 (fr) * 2001-03-26 2005-04-29 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation enantioselectif d'acides carboxyliques optiquement actifs par hydrolyse enzymatique de nitriles
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CN111944794B (zh) * 2020-08-20 2022-05-31 中国石油大学(华东) 酰胺酶xam及其编码基因和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56144092A (en) * 1980-04-14 1981-11-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-methionine by fermentation
JP2840253B2 (ja) * 1988-07-06 1998-12-24 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子dna、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法
JP3078312B2 (ja) * 1990-11-22 2000-08-21 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
DE69506430T2 (de) * 1994-09-22 1999-05-20 Rhone Poulenc Nutrition Animal Enzymatische hydrolyse von den 4-methylthiobutyronitrilen
FR2755143B1 (fr) * 1996-10-25 1998-11-27 Rhone Poulenc Nutrition Animal Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.

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