JP2002532096A - 酵素をコードする遺伝子の単離及び選択方法並びに適当な培養培地 - Google Patents
酵素をコードする遺伝子の単離及び選択方法並びに適当な培養培地Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は適切な基質をメチオニン及びその誘導体（例えばＨＭＴＢＳ）に変換する生物学的変換に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列の選択及び／又は単離方法に関し、前記方法は、１）適切な宿主微生物でその発現を可能にするベクターにＤＮＡ配列をクローニングする段階と、２）先に得られたベクターを適切なメチオニン栄養要求微生物に導入することにより前記適切な微生物を形質転換する段階と、３）十分な量の適切な基質を含む適切な培地で先に得られた形質転換微生物を培養する段階と、４）適切な培地で増殖することが可能な形質転換微生物を選択する段階と、５）適切な基質の生物学的変換に関与するＤＮＡ配列を単離し、場合により同定する段階を含む。
Description
【０００１】 本発明は、基質をメチオニンまたは２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタ
ン酸またはその塩のようなメチオニン誘導体に変換する生物的変換に関与する酵
素、特にアミド基をカルボン酸に加水分解する酵素、または、ニトリル基を対応
するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵素をコードする遺伝子を適当
な選択手段によって単離及び／または選択する新規な方法、並びに、該方法を実
施するための適当な培養培地に関する。
ン酸またはその塩のようなメチオニン誘導体に変換する生物的変換に関与する酵
素、特にアミド基をカルボン酸に加水分解する酵素、または、ニトリル基を対応
するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵素をコードする遺伝子を適当
な選択手段によって単離及び／または選択する新規な方法、並びに、該方法を実
施するための適当な培養培地に関する。
【０００２】 ニトリル基が対応するカルボン酸及びアンモニウムイオンに加水分解されると
き、これを触媒する酵素はニトリラーゼである（Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２，
ＩＳＢＮ３−５４０−５５７６２−８）。しかしながら、ニトリル基を対応する
カルボン酸に変換するこの生物的変換は、ニトリル基の加水分解を最終目的とし
て２段階で行うこともできる。第一段階でニトリルヒドラターゼによってニトリ
ルを対応するアミドに変換し、得られたアミドを第二段階でアミダーゼによって
対応するカルボン酸に加水分解する。
き、これを触媒する酵素はニトリラーゼである（Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２，
ＩＳＢＮ３−５４０−５５７６２−８）。しかしながら、ニトリル基を対応する
カルボン酸に変換するこの生物的変換は、ニトリル基の加水分解を最終目的とし
て２段階で行うこともできる。第一段階でニトリルヒドラターゼによってニトリ
ルを対応するアミドに変換し、得られたアミドを第二段階でアミダーゼによって
対応するカルボン酸に加水分解する。
【０００３】 ニトリラーゼは植物で初めて発見され（Ｔｈｉｍａｎｎ ａｎｄ Ｍａｈａｄ
ｅｖａｎ，１９６４，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０５：１
３３−１４１）、次いで、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｕｓ、Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓのような多くの代表的な土壌微生物相から単離された（Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉ ｅｔ Ｓｈｉｍｉｚｕ，１９９４，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２０：２１７−２２４）。より最近には好熱性細菌の
ニトリラーゼが特性決定された（Ｃｒａｍｐら，１９９７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１４３：２３１３−２３２０）。ニトリラーゼは多様な基質に特異性を
有しており、それらの特異性に基づいて３つのグループ、即ち、脂肪族ニトリル
特異的ニトリラーゼ、芳香族ニトリル特異的ニトリラーゼまたはアリールアセト
ニトリル特異的ニトリラーゼに分類できる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９３，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２４７−２５１；Ｋｏ
ｂａｙａｓｈｉ ｅｔ Ｓｈｉｍｉｚｕ，１９９４，前出；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉ
ｌら，１９９５，Ｇｅｎｅ，１６１：１５−２０）。多くの合成プロセスにニト
リル基の加水分解が関与するのでニトリラーゼは生体触媒として重要である（Ｌ
ｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌら）。特に、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓの
ニトリラーゼＡＴＣＣ９７５０及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏ
ｎｉのニトリラーゼは、メチオニンのヒドロキシ類似体を得るために使用し得る
（ＦＲ９４１１３０１、ＷＯ９６０９４０３、ＦＲ９６１３０７７）。
ｅｖａｎ，１９６４，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０５：１
３３−１４１）、次いで、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｕｓ、Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓのような多くの代表的な土壌微生物相から単離された（Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉ ｅｔ Ｓｈｉｍｉｚｕ，１９９４，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２０：２１７−２２４）。より最近には好熱性細菌の
ニトリラーゼが特性決定された（Ｃｒａｍｐら，１９９７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１４３：２３１３−２３２０）。ニトリラーゼは多様な基質に特異性を
有しており、それらの特異性に基づいて３つのグループ、即ち、脂肪族ニトリル
特異的ニトリラーゼ、芳香族ニトリル特異的ニトリラーゼまたはアリールアセト
ニトリル特異的ニトリラーゼに分類できる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９３，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２４７−２５１；Ｋｏ
ｂａｙａｓｈｉ ｅｔ Ｓｈｉｍｉｚｕ，１９９４，前出；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉ
ｌら，１９９５，Ｇｅｎｅ，１６１：１５−２０）。多くの合成プロセスにニト
リル基の加水分解が関与するのでニトリラーゼは生体触媒として重要である（Ｌ
ｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌら）。特に、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓの
ニトリラーゼＡＴＣＣ９７５０及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏ
ｎｉのニトリラーゼは、メチオニンのヒドロキシ類似体を得るために使用し得る
（ＦＲ９４１１３０１、ＷＯ９６０９４０３、ＦＲ９６１３０７７）。
【０００４】 一般に、新しい酵素を発見するためには複数の戦略が使用される（Ｄａｌｂｏ
ｇｅ ｅｔ Ｌａｎｇｅ，１９９８，ＴｉｂＴｅｃｈ １６：２６５−２７２）
：（ｉ）所望の酵素活性の存在に基づいた選択手段を使用して特異的ビオトープ
（生息場所）から微生物を微生物学的に単離する、（ｉｉ）微生物の酵素活性を
発見するために菌株を培養し、問題の活性を定量する、（ｉｉｉ）培養可能な微
生物中で問題の遺伝子に相同の沈黙遺伝子を発見し、この遺伝子をモデル微生物
でクローニングして発現させる、（ｉｖ）タンパク質工学を利用して、入手可能
な酵素の特性を改善する、最後に、（ｖ）微生物を予め単離しないで種々のビオ
トープから直接単離した遺伝子を発現によってクローニングする。（ｉ）、（ｉ
ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）に示した戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏ選択手段が入手可
能であるならば、顕著に推進することも簡便にすることもできる。ｉｎ ｖｉｖ
ｏ選択手段なる用語は、所望の酵素活性を提供する微生物だけが増殖し得る増殖
培地及び／または増殖条件を意味する。
ｇｅ ｅｔ Ｌａｎｇｅ，１９９８，ＴｉｂＴｅｃｈ １６：２６５−２７２）
：（ｉ）所望の酵素活性の存在に基づいた選択手段を使用して特異的ビオトープ
（生息場所）から微生物を微生物学的に単離する、（ｉｉ）微生物の酵素活性を
発見するために菌株を培養し、問題の活性を定量する、（ｉｉｉ）培養可能な微
生物中で問題の遺伝子に相同の沈黙遺伝子を発見し、この遺伝子をモデル微生物
でクローニングして発現させる、（ｉｖ）タンパク質工学を利用して、入手可能
な酵素の特性を改善する、最後に、（ｖ）微生物を予め単離しないで種々のビオ
トープから直接単離した遺伝子を発現によってクローニングする。（ｉ）、（ｉ
ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）に示した戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏ選択手段が入手可
能であるならば、顕著に推進することも簡便にすることもできる。ｉｎ ｖｉｖ
ｏ選択手段なる用語は、所望の酵素活性を提供する微生物だけが増殖し得る増殖
培地及び／または増殖条件を意味する。
【０００５】 更に、実験室で培養可能な微生物の割合が極めて少ないことを考慮するならば
（Ａｍａｎｎら，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．５９，１４３）、（
ｉｖ）及び（ｖ）に示した戦略は生態多様性をより十分に利用するために特に重
要であり、微生物単離によって得ることはできない入手可能な生態多様性（ｂｉ
ｏｄｉｖｅｒｓｉｔｅ）を標的とするか（戦略ｖ）、または、培養可能な菌株か
らより広い多様性を生み出す（戦略ｉｖ）。特にこれらの２つの戦略において、
入手容易なｉｎ ｖｉｖｏ選択手段を得ることができれば短期間で及び場合によ
っては少ない手段で大量のクローンを選択できるという確実な利点が得られる（
Ｍｉｎｓｈｕｌｌ，１９９８，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａ
ｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”，ＩＢＣ’ｓ ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｓｅｐｔ １４−１
５，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｇｒａｙｌｉｎｇ，１９９８，“Ｃｏｎｃｅｐｔｓ
ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃ
ｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｖａｒｉａｎｔｓ
”，ＩＢＣ’ｓ ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ ｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｓｅｐｔ １４−１５，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
（Ａｍａｎｎら，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．５９，１４３）、（
ｉｖ）及び（ｖ）に示した戦略は生態多様性をより十分に利用するために特に重
要であり、微生物単離によって得ることはできない入手可能な生態多様性（ｂｉ
ｏｄｉｖｅｒｓｉｔｅ）を標的とするか（戦略ｖ）、または、培養可能な菌株か
らより広い多様性を生み出す（戦略ｉｖ）。特にこれらの２つの戦略において、
入手容易なｉｎ ｖｉｖｏ選択手段を得ることができれば短期間で及び場合によ
っては少ない手段で大量のクローンを選択できるという確実な利点が得られる（
Ｍｉｎｓｈｕｌｌ，１９９８，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａ
ｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”，ＩＢＣ’ｓ ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｓｅｐｔ １４−１
５，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｇｒａｙｌｉｎｇ，１９９８，“Ｃｏｎｃｅｐｔｓ
ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃ
ｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｖａｒｉａｎｔｓ
”，ＩＢＣ’ｓ ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ ｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｓｅｐｔ １４−１５，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
【０００６】 本発明は、基質をメチオニン（ＡＭＴＢＳ）または２−ヒドロキシ−４−（メ
チルチオ）ブタン酸（ＨＭＴＢＳ）のようなその誘導体の塩、特にアンモニウム
塩に変換する生物的変換に関与する酵素、特に２−アミノ−４−（メチルチオ）
ブチロニトリル（ＡＭＴＢＮ）または２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブチ
ロニトリル（ＨＭＴＢＮ）のようなその誘導体をメチオニンまたはＨＭＴＢＳの
ようなメチオニン誘導体に直接変換するかまたは２−アミノ−４−メチルチオブ
タンアミドまたは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンアミド（ＨＭＴＢＡｍ
ｉｄｅ）のようなその誘導体を経由して変換する生物的変換に関与する酵素をコ
ードするＤＮＡ配列を単離及び／または選択する簡単、迅速で廉価な方法に関す
る。
チルチオ）ブタン酸（ＨＭＴＢＳ）のようなその誘導体の塩、特にアンモニウム
塩に変換する生物的変換に関与する酵素、特に２−アミノ−４−（メチルチオ）
ブチロニトリル（ＡＭＴＢＮ）または２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブチ
ロニトリル（ＨＭＴＢＮ）のようなその誘導体をメチオニンまたはＨＭＴＢＳの
ようなメチオニン誘導体に直接変換するかまたは２−アミノ−４−メチルチオブ
タンアミドまたは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンアミド（ＨＭＴＢＡｍ
ｉｄｅ）のようなその誘導体を経由して変換する生物的変換に関与する酵素をコ
ードするＤＮＡ配列を単離及び／または選択する簡単、迅速で廉価な方法に関す
る。
【０００７】 本発明の好ましい実施態様によれば、酵素は、適当な基質をＨＭＴＢＳに変換
する生物的変換に関与し、適当な基質はＨＭＴＢＮまたはＨＭＴＢＡｍｉｄｅで
ある。
する生物的変換に関与し、適当な基質はＨＭＴＢＮまたはＨＭＴＢＡｍｉｄｅで
ある。
【０００８】 判り易いように配慮して、以後の記載はＨＭＴＢＳ、ＨＭＴＢＮまたはＨＭＴ
ＢＡｍｉｄｅに限定した。しかしながら、以後の記載中のＨＭＴＢＳ、ＨＭＴＢ
ＮまたはＨＭＴＢＡｍｉｄｅに関する情報は、メチオニンまたはその誘導体、対
応する基質、２−アミノ−４−（メチルチオ）ブチロニトリルまたはその誘導体
及び２−アミノ−４−メチルチオブタンアミドまたはその誘導体にも当てはまる
。
ＢＡｍｉｄｅに限定した。しかしながら、以後の記載中のＨＭＴＢＳ、ＨＭＴＢ
ＮまたはＨＭＴＢＡｍｉｄｅに関する情報は、メチオニンまたはその誘導体、対
応する基質、２−アミノ−４−（メチルチオ）ブチロニトリルまたはその誘導体
及び２−アミノ−４−メチルチオブタンアミドまたはその誘導体にも当てはまる
。
【０００９】 メチオニン要求性微生物の突然変異体中でニトリラーゼを発現させ得るプラス
ミドでこのような配列をクローニングすることによって、基質をＨＭＴＢＳに変
換する生物的変換に関与する活性酵素を組込んだ菌株だけを選択し得る。メチオ
ニン要求性微生物は、基質中にメチオニンが存在しなくても生物的変換によって
得られたＨＭＴＢＳの存在下で増殖できる。従ってこの戦略によって、活性酵素
を発現するクローンが富化された培養物が得られる。更に、調節突然変異誘発ま
たは無作為突然変異誘発によってその触媒特性が改善された酵素を発現するクロ
ーンに富む培養物が得られる。
ミドでこのような配列をクローニングすることによって、基質をＨＭＴＢＳに変
換する生物的変換に関与する活性酵素を組込んだ菌株だけを選択し得る。メチオ
ニン要求性微生物は、基質中にメチオニンが存在しなくても生物的変換によって
得られたＨＭＴＢＳの存在下で増殖できる。従ってこの戦略によって、活性酵素
を発現するクローンが富化された培養物が得られる。更に、調節突然変異誘発ま
たは無作為突然変異誘発によってその触媒特性が改善された酵素を発現するクロ
ーンに富む培養物が得られる。
【００１０】 従って本発明は、適当な基質をメチオニン及びＨＭＴＢＳのようなメチオニン
誘導体に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列の選択及び
／または単離方法に関する。該方法は以下の段階、即ち、 （１）適当な宿主微生物中でＤＮＡを発現させ得るベクターでＤＮＡ配列をクロ
ーニングする段階と、 （２）前段階で得られたベクターを適当なメチオニン要求性微生物に導入するこ
とによってその適当な微生物を形質転換する段階と、 （３）前段階で得られた形質転換微生物を十分な量の適当な基質を含む適当な培
養培地で培養する段階と、 （４）適当な培養培地で増殖し得る形質転換微生物を選択する段階と、 （５）適当な基質の生物的変換に関与するＤＮＡ配列を単離し必要な場合には同
定する段階、とから成る。
誘導体に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列の選択及び
／または単離方法に関する。該方法は以下の段階、即ち、 （１）適当な宿主微生物中でＤＮＡを発現させ得るベクターでＤＮＡ配列をクロ
ーニングする段階と、 （２）前段階で得られたベクターを適当なメチオニン要求性微生物に導入するこ
とによってその適当な微生物を形質転換する段階と、 （３）前段階で得られた形質転換微生物を十分な量の適当な基質を含む適当な培
養培地で培養する段階と、 （４）適当な培養培地で増殖し得る形質転換微生物を選択する段階と、 （５）適当な基質の生物的変換に関与するＤＮＡ配列を単離し必要な場合には同
定する段階、とから成る。
【００１１】 本発明の好ましい実施態様によれば、適当な基質が２−ヒドロキシ−４−（メ
チルチオ）ブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）であり、該基質は、ニトリラーゼによ
って直接に、または、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタンアミド（ＨＭ
ＴＢＡｍｉｄｅ）を経由して、ＨＭＴＢＳに変換される。この後者の経路では、
先ずＨＭＴＢＮがニトリルヒドラターゼによってＨＭＴＢＡｍｉｄｅに変換され
、次いでＨＭＴＢＡｍｉｄｅがアミダーゼによって変換される。第一の場合には
、本発明方法によって単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がニトリラーゼを
コードしている。第二の場合には、本発明方法によって単離及び／または選択さ
れたＤＮＡ配列がニトリルヒドラターゼまたはアミダーゼをコードしている。
チルチオ）ブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）であり、該基質は、ニトリラーゼによ
って直接に、または、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタンアミド（ＨＭ
ＴＢＡｍｉｄｅ）を経由して、ＨＭＴＢＳに変換される。この後者の経路では、
先ずＨＭＴＢＮがニトリルヒドラターゼによってＨＭＴＢＡｍｉｄｅに変換され
、次いでＨＭＴＢＡｍｉｄｅがアミダーゼによって変換される。第一の場合には
、本発明方法によって単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がニトリラーゼを
コードしている。第二の場合には、本発明方法によって単離及び／または選択さ
れたＤＮＡ配列がニトリルヒドラターゼまたはアミダーゼをコードしている。
【００１２】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、適当な基質はＨＭＴＢＡｍｉｄｅで
あり、この基質は、本発明方法で単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がコー
ドしているアミダーゼによってＨＭＴＢＳに変換される。
あり、この基質は、本発明方法で単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がコー
ドしているアミダーゼによってＨＭＴＢＳに変換される。
【００１３】 本文中の単離なる用語は本質的に、多様な配列の集合から１つの特定配列を分
離することを意味する。本文中の選択なる用語は本質的に、特定の性質を有して
いる最良の配列を選択することを意味する。
離することを意味する。本文中の選択なる用語は本質的に、特定の性質を有して
いる最良の配列を選択することを意味する。
【００１４】 微生物を選択及び／または単離した後、適当な基質の生物的変換に関与するＤ
ＮＡ配列を容易に単離及び同定できるように該微生物を常用の培養培地で培養し
て増殖させる。
ＮＡ配列を容易に単離及び同定できるように該微生物を常用の培養培地で培養し
て増殖させる。
【００１５】 本文中のメチオニン要求性の適当な微生物という表現は、メチオニン非含有で
ＨＭＴＢＳ含有の培地で増殖する能力を有している形質転換可能な任意のメチオ
ニン要求性微生物を意味する。適当な微生物は酵母、菌類または細菌である。本
発明の好ましい実施態様では、適当な微生物が細菌、好ましくは大腸菌である。
ＨＭＴＢＳ含有の培地で増殖する能力を有している形質転換可能な任意のメチオ
ニン要求性微生物を意味する。適当な微生物は酵母、菌類または細菌である。本
発明の好ましい実施態様では、適当な微生物が細菌、好ましくは大腸菌である。
【００１６】 本発明の適当な微生物は、天然にメチオニン要求性でもよく、または突然変異
誘発によってメチオニン要求性になるように修飾されてもよい。栄養要求性突然
変異体を得る種々の方法が当業界で公知であり、文献にも十分に記載されている
（特に、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＣＪ，Ｓｅｌｋｅｒ ＥＵ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ，１９９５ Ｄｅｃ １１ ２３：２３ ４８１８−２６；ＭｃＡ
ｄａｍ ＲＡら，Ｉｎｆｅｅｔ Ｉｍｍｕｎ，１９９５ Ｍａｒ ６３：３ １
００４−１２；Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍら，Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９
８４ Ｊａｎ ３０：１ ３１−５；Ｙａｍａｇａｔａ Ｓ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ，１９８７ Ａｕｇ １６９：８ ３４５８−６３；Ｗａｂｉｋｏ Ｈら
，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８８ Ｊｕｎ １７０：６ ２７０５−１０；
Ｆｒａｎｋ Ｐら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８５ Ｍａｙ １０ ２６０
：９ ５５１８−２５）。
誘発によってメチオニン要求性になるように修飾されてもよい。栄養要求性突然
変異体を得る種々の方法が当業界で公知であり、文献にも十分に記載されている
（特に、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＣＪ，Ｓｅｌｋｅｒ ＥＵ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ，１９９５ Ｄｅｃ １１ ２３：２３ ４８１８−２６；ＭｃＡ
ｄａｍ ＲＡら，Ｉｎｆｅｅｔ Ｉｍｍｕｎ，１９９５ Ｍａｒ ６３：３ １
００４−１２；Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍら，Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９
８４ Ｊａｎ ３０：１ ３１−５；Ｙａｍａｇａｔａ Ｓ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ，１９８７ Ａｕｇ １６９：８ ３４５８−６３；Ｗａｂｉｋｏ Ｈら
，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８８ Ｊｕｎ １７０：６ ２７０５−１０；
Ｆｒａｎｋ Ｐら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８５ Ｍａｙ １０ ２６０
：９ ５５１８−２５）。
【００１７】 ＨＭＴＢＮを対応するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵素をコー
ドするＤＮＡ配列を含むベクターによって形質転換された適当な微生物は、ＨＭ
ＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換し、メチオニン要求性微生物の増殖を可能にする。こ
の場合、微生物は菌株が増殖できるようにＨＭＴＢＳをメチオニンに生物的変換
させる。
ドするＤＮＡ配列を含むベクターによって形質転換された適当な微生物は、ＨＭ
ＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換し、メチオニン要求性微生物の増殖を可能にする。こ
の場合、微生物は菌株が増殖できるようにＨＭＴＢＳをメチオニンに生物的変換
させる。
【００１８】 ＨＭＴＢＡｍｉｄｅを対応するカルボン酸に変換する生物的変換に関与する酵
素をコードするＤＮＡ配列を含むベクターによって形質転換された適当な微生物
は、ＨＭＴＢＡｍｉｄｅをＨＭＴＢＳに変換し、メチオニン要求性微生物の増殖
を可能にする。
素をコードするＤＮＡ配列を含むベクターによって形質転換された適当な微生物
は、ＨＭＴＢＡｍｉｄｅをＨＭＴＢＳに変換し、メチオニン要求性微生物の増殖
を可能にする。
【００１９】 メチオニン要求性の適当な微生物が更にＨＭＴＢＡｍｉｄｅをＨＭＴＢＳに変
換する生物的変換に関与する酵素をコードする遺伝子を含むとき、及び、この微
生物がＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＡｍｉｄｅに変換する生物的変換に関与する酵素を
コードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換されているとき、該微生物はＨ
ＭＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換することによって増殖し得る。
換する生物的変換に関与する酵素をコードする遺伝子を含むとき、及び、この微
生物がＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＡｍｉｄｅに変換する生物的変換に関与する酵素を
コードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換されているとき、該微生物はＨ
ＭＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換することによって増殖し得る。
【００２０】 本発明の第一の好ましい実施態様によれば、ＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換す
る生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素はニトリラーゼであり
、ニトリラーゼはＨＭＴＢＮを、修飾された微生物の増殖に必要なＨＭＴＢＳに
変換し得る。
る生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素はニトリラーゼであり
、ニトリラーゼはＨＭＴＢＮを、修飾された微生物の増殖に必要なＨＭＴＢＳに
変換し得る。
【００２１】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、ＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換する
生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素がニトリルヒドラターゼ
であり、ニトリルヒドラターゼはＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＡｍｉｄｅに変換し得る
。適当な微生物はまた、ＨＭＴＢＡｍｉｄｅを修飾された微生物の増殖に必要な
ＨＭＴＢＳに変換する生物的変換を確保する相補的アミダーゼをコードする天然
遺伝子または異種遺伝子を含む。
生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素がニトリルヒドラターゼ
であり、ニトリルヒドラターゼはＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＡｍｉｄｅに変換し得る
。適当な微生物はまた、ＨＭＴＢＡｍｉｄｅを修飾された微生物の増殖に必要な
ＨＭＴＢＳに変換する生物的変換を確保する相補的アミダーゼをコードする天然
遺伝子または異種遺伝子を含む。
【００２２】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、ＨＭＴＢＮをＨＭＴＢＳに変換する
生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素がアミダーゼである。
生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素がアミダーゼである。
【００２３】 上記の２つの場合に、相補的酵素の遺伝子が異種遺伝子であるときは、該遺伝
子は、適当な微生物のゲノムに組込まれるかまたはプラスミドに担持される。
子は、適当な微生物のゲノムに組込まれるかまたはプラスミドに担持される。
【００２４】 本発明の別の好ましい実施態様によれば、ＨＭＴＢＡｍｉｄｅをＨＭＴＢＳに
変換する生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素がアミダーゼで
あり、適当な培養培地がＨＭＴＢＡｍｉｄｅを含有する。
変換する生物的変換に関与する単離及び／または選択された酵素がアミダーゼで
あり、適当な培養培地がＨＭＴＢＡｍｉｄｅを含有する。
【００２５】 本発明の特定実施態様によれば、ＤＮＡ配列は、１つまたは複数のゲノムから
該ゲノムの完全制限または部分制限によって単離されたＤＮＡ配列である。ＤＮ
Ａ配列はまた、ゲノムの一部から該ゲノムの一部の完全制限または部分制限によ
って単離されたＤＮＡ配列でもよい。制限という用語は、ＤＮＡを特異的または
非特異的に断片化し得る酵素的または非酵素的な任意の方法を意味する。この場
合に本発明方法は上記に定義した戦略（ｉ）及び（ｖ）に従って新規な酵素を選
択するために特に好適である。
該ゲノムの完全制限または部分制限によって単離されたＤＮＡ配列である。ＤＮ
Ａ配列はまた、ゲノムの一部から該ゲノムの一部の完全制限または部分制限によ
って単離されたＤＮＡ配列でもよい。制限という用語は、ＤＮＡを特異的または
非特異的に断片化し得る酵素的または非酵素的な任意の方法を意味する。この場
合に本発明方法は上記に定義した戦略（ｉ）及び（ｖ）に従って新規な酵素を選
択するために特に好適である。
【００２６】 ＤＮＡ配列はまた、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって構築物から単離
されたＤＮＡ配列でもよい。
されたＤＮＡ配列でもよい。
【００２７】 ＤＮＡ配列はまた、上記に定義の基準酵素をコードする配列の無作為突然変異
誘発または標的突然変異誘発によって得ることができる。
誘発または標的突然変異誘発によって得ることができる。
【００２８】 この場合には、本発明の方法は上記戦略（ｉｖ）による新規酵素の選択に特に
適している。
適している。
【００２９】 ＤＮＡ配列は上記基準酵素に対して所定相同度をもつ単離ＤＮＡ配列でもよい
。この所定相同度は＞５０％が有利であり、好ましくは＞６０％、より好ましく
は＞７０％である。この場合には、本発明の方法は基準配列に対して所定レベル
の相同度をもつ核酸配列が基準配列とどの程度まで同一機能及び／又は同一活性
をもつかを識別するために使用される迅速スクリーニング手段を構成する。
。この所定相同度は＞５０％が有利であり、好ましくは＞６０％、より好ましく
は＞７０％である。この場合には、本発明の方法は基準配列に対して所定レベル
の相同度をもつ核酸配列が基準配列とどの程度まで同一機能及び／又は同一活性
をもつかを識別するために使用される迅速スクリーニング手段を構成する。
【００３０】 基準酵素とは、本発明によると適切な基質からＨＭＴＢＳ（特にＨＭＴＢＮか
らＨＭＴＢＳ）への生物学的変換又はＨＭＴＢＡｍｉｄｅからＨＭＴＢＳへの生
物学的変換に関与する公知酵素を意味し、好ましくは本発明の方法により単離及
び／又は選択された新規酵素の機能及び活性を評価するための基準として利用さ
れる上記ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ又はアミダーゼを意味し、特に新
規突然変異体が所望される酵素及び／又は上記所定相同度をもつ酵素を意味する
。
らＨＭＴＢＳ）への生物学的変換又はＨＭＴＢＡｍｉｄｅからＨＭＴＢＳへの生
物学的変換に関与する公知酵素を意味し、好ましくは本発明の方法により単離及
び／又は選択された新規酵素の機能及び活性を評価するための基準として利用さ
れる上記ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ又はアミダーゼを意味し、特に新
規突然変異体が所望される酵素及び／又は上記所定相同度をもつ酵素を意味する
。
【００３１】 本発明の単離及び／又は選択方法では、形質転換微生物の培養は当業者に公知
の適切な任意手段により実施される。特に大量（バッチ）培養特に逐次培養が挙
げられ、又は連続培養、特にケモスタット培養により実施される（Ｓｅｅｇｅｒ
ｓ ＪＦら，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９９５ Ｊａｎ ３３：１ ７１−７； Ｗｅ
ｉｋｅｒｔ Ｃら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７ Ｍａｙ １４３（Ｐ
ｔ ５）：１５６７−７４； Ｔｓｅｎ ＳＤら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９６ Ｊｕｌ １６ ２２４：２ ３５１−
７； Ｔｓｅｎ ＳＤ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕ
ｎ，１９９０ Ｆｅｂ １４ １６６：３ １２４５−５０； Ｂｅｒｇ ＯＧ
，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ，１９９５ Ａｐｒ ７ １７３：３ ３０７−２
０）。
の適切な任意手段により実施される。特に大量（バッチ）培養特に逐次培養が挙
げられ、又は連続培養、特にケモスタット培養により実施される（Ｓｅｅｇｅｒ
ｓ ＪＦら，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９９５ Ｊａｎ ３３：１ ７１−７； Ｗｅ
ｉｋｅｒｔ Ｃら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７ Ｍａｙ １４３（Ｐ
ｔ ５）：１５６７−７４； Ｔｓｅｎ ＳＤら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９６ Ｊｕｌ １６ ２２４：２ ３５１−
７； Ｔｓｅｎ ＳＤ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕ
ｎ，１９９０ Ｆｅｂ １４ １６６：３ １２４５−５０； Ｂｅｒｇ ＯＧ
，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ，１９９５ Ａｐｒ ７ １７３：３ ３０７−２
０）。
【００３２】 十分な量の適切な基質を含む適切な培地とは、本発明によると好ましくはメチ
オニン栄養要求性形質転換微生物の増殖に適した任意の培地を意味し、前記培地
はメチオニンを実質的に含まず、適切な基質のＨＭＴＢＳ変換後に前記形質転換
微生物を増殖させるために十分な量の適切な基質を含む。
オニン栄養要求性形質転換微生物の増殖に適した任意の培地を意味し、前記培地
はメチオニンを実質的に含まず、適切な基質のＨＭＴＢＳ変換後に前記形質転換
微生物を増殖させるために十分な量の適切な基質を含む。
【００３３】 メチオニンを実質的に含まない培地とは、メチオニンを含まないか、又は場合
により、適切なメチオニン栄養要求微生物を増殖させるには不十分な量のメチオ
ニンを含む培地を意味する。
により、適切なメチオニン栄養要求微生物を増殖させるには不十分な量のメチオ
ニンを含む培地を意味する。
【００３４】 ＨＭＴＢＮの十分な量は０〜６０ｇ／ｌ（約４００ｍＭに等価）が有利であり
、より好ましくは３ｍｇ／ｌ〜１７ｍｇ／ｌ（約２０μＭ〜約１００μＭに等価
）、より好ましくは６ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ（約４０μＭ〜約６０μＭに等価
）である。
、より好ましくは３ｍｇ／ｌ〜１７ｍｇ／ｌ（約２０μＭ〜約１００μＭに等価
）、より好ましくは６ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ（約４０μＭ〜約６０μＭに等価
）である。
【００３５】 ＨＭＴＢＡｍｉｄｅの十分な量は０〜６０ｇ／ｌ（約４００ｍＭに等価）が有
利であり、より好ましくは３ｍｇ／ｌ〜１７ｍｇ／ｌ（約２０μＭ〜約１００μ
Ｍに等価）、より好ましくは６ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ（約４０μＭ〜約６０μ
Ｍに等価）である。
利であり、より好ましくは３ｍｇ／ｌ〜１７ｍｇ／ｌ（約２０μＭ〜約１００μ
Ｍに等価）、より好ましくは６ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ（約４０μＭ〜約６０μ
Ｍに等価）である。
【００３６】 当然のことながら、本発明の方法及び培地では、形質転換微生物の増殖に必要
な必須ＨＭＴＢＳ源は形質転換微生物に導入されるＤＮＡ配列によりコードされ
る酵素による適切な基質（特にＨＭＴＢＮ又はＨＭＴＢＡｍｉｄｅ）の変換産物
であるＨＭＴＢＳにより構成される。但し、該当微生物と所望選択レベルによっ
ては、本発明の培地は特に微生物の増殖を開始させるために十分な量のＨＭＴＢ
Ｓを最初から（形質転換微生物接種時に予め）含んでいてもよく、このＨＭＴＢ
Ｓ量は微生物の増殖に伴って適切な基質（特にＨＭＴＢＮ又はＨＭＴＢＡｍｉｄ
ｅ）の変換産物であるＨＭＴＢＳにより補充される。ＨＭＴＢＳは本発明により
形質転換微生物を増殖させるために十分な濃度よりも低い濃度で培地に存在して
いると有利である。この濃度は適切な培地、特にその形態（バッチ、連続液体、
固体等）に応じて決定することができ、好ましくは＜３５０μｇ／ｌ（約２μＭ
に等価）、より好ましくは＜２５０μｇ／ｌ（約１．５μＭに等価）、より好ま
しくは１３０μｇ／ｌ〜１７０μｇ／ｌ（約０．８μＭ〜約１μＭに等価）であ
る。
な必須ＨＭＴＢＳ源は形質転換微生物に導入されるＤＮＡ配列によりコードされ
る酵素による適切な基質（特にＨＭＴＢＮ又はＨＭＴＢＡｍｉｄｅ）の変換産物
であるＨＭＴＢＳにより構成される。但し、該当微生物と所望選択レベルによっ
ては、本発明の培地は特に微生物の増殖を開始させるために十分な量のＨＭＴＢ
Ｓを最初から（形質転換微生物接種時に予め）含んでいてもよく、このＨＭＴＢ
Ｓ量は微生物の増殖に伴って適切な基質（特にＨＭＴＢＮ又はＨＭＴＢＡｍｉｄ
ｅ）の変換産物であるＨＭＴＢＳにより補充される。ＨＭＴＢＳは本発明により
形質転換微生物を増殖させるために十分な濃度よりも低い濃度で培地に存在して
いると有利である。この濃度は適切な培地、特にその形態（バッチ、連続液体、
固体等）に応じて決定することができ、好ましくは＜３５０μｇ／ｌ（約２μＭ
に等価）、より好ましくは＜２５０μｇ／ｌ（約１．５μＭに等価）、より好ま
しくは１３０μｇ／ｌ〜１７０μｇ／ｌ（約０．８μＭ〜約１μＭに等価）であ
る。
【００３７】 本発明の好適実施態様によると、適切な培地はメチオニンを全く含まない有機
窒素源を含む。
窒素源を含む。
【００３８】 有機窒素源は酵母エキスが有利であり、特にＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
Ｂｒｏｔｈ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＹＮＢ，Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ Ｂｒｏｔｈ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，ＤＩＦＣＯ，組成は
ＤＩＦＣＯ Ｍａｎｕａｌ，第１０版，ＩＳＢＮ ９−９６１３１６９−９−３
，１９８４，１１３６頁に記載）又はカザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
ｓ，Ｄｉｆｃｏ，組成はＤＩＦＣＯ Ｍａｎｕａｌ，第１０版，ＩＳＢＮ ９−
９６１３１６９−９−３，１９８４，２０８頁に記載）である。
Ｂｒｏｔｈ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＹＮＢ，Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ Ｂｒｏｔｈ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，ＤＩＦＣＯ，組成は
ＤＩＦＣＯ Ｍａｎｕａｌ，第１０版，ＩＳＢＮ ９−９６１３１６９−９−３
，１９８４，１１３６頁に記載）又はカザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
ｓ，Ｄｉｆｃｏ，組成はＤＩＦＣＯ Ｍａｎｕａｌ，第１０版，ＩＳＢＮ ９−
９６１３１６９−９−３，１９８４，２０８頁に記載）である。
【００３９】 本発明の好適実施態様によると、有機窒素源、より好ましくはＹＮＢの含量は
０〜１５ｇ／ｌ、より好ましくは２〜１０ｇ／ｌ、更に好ましくは３〜８ｇ／ｌ
である。
０〜１５ｇ／ｌ、より好ましくは２〜１０ｇ／ｌ、更に好ましくは３〜８ｇ／ｌ
である。
【００４０】 本発明の適切な培地は最少培地として後述するＭ９ｆｒｕを含むと有利である
。
。
【００４１】 本発明の適切な培地は炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース
、トレハロース、マンノース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、マル
トトリオース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、アラビノース、キシロ
ース、ラムノース、フコース、マンニトール、ソルビトール、リンゴ酸、サッカ
ラート、ムチン酸、メソ酒石酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸及び任意割合の
その混合物から選択される化合物を含むと有利である。炭素源はグルコース又は
フルクトース及び任意割合のその混合物から選択すると好ましく、フルクトース
がより好ましい。
、トレハロース、マンノース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、マル
トトリオース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、アラビノース、キシロ
ース、ラムノース、フコース、マンニトール、ソルビトール、リンゴ酸、サッカ
ラート、ムチン酸、メソ酒石酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸及び任意割合の
その混合物から選択される化合物を含むと有利である。炭素源はグルコース又は
フルクトース及び任意割合のその混合物から選択すると好ましく、フルクトース
がより好ましい。
【００４２】 本発明の培地は液体でも固体でもよく、後者の場合には寒天又はアガロースを
含むことができる。
含むことができる。
【００４３】 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これによって発明の範囲を
制限するものではない。これらの実施例に記載する全方法又は操作は例示に過ぎ
ず、同一結果を達成するために利用可能な種々の方法を選択できる。ＤＮＡフラ
グメントの工学的方法の大部分は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”第１及び２巻，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．
Ｍ．ら，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｅｔ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊（１９８９）又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ（１９８２）に記載されている。
制限するものではない。これらの実施例に記載する全方法又は操作は例示に過ぎ
ず、同一結果を達成するために利用可能な種々の方法を選択できる。ＤＮＡフラ
グメントの工学的方法の大部分は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”第１及び２巻，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．
Ｍ．ら，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｅｔ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊（１９８９）又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ（１９８２）に記載されている。
【００４４】 図面の説明 図１はプラスミドＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４１を示す。括弧内の部位はクローニ
ング時に除去された部位である。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター、ｎｉ
ｔＢ：ニトリラーゼ遺伝子、ＴｒｍＢ：転写ターミネーター、ｆｉｎＲＯＰ：Ｒ
ＯＰタンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８，Ｇ
ｅｎｅ ６８：１３９−１４９）、ＯＲＩ：複製起点、ＲＮＡＩ／ＩＩ：複製に
関与するＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）、Ｔｃ：テトラサイクリン耐性遺
伝子。
ング時に除去された部位である。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター、ｎｉ
ｔＢ：ニトリラーゼ遺伝子、ＴｒｍＢ：転写ターミネーター、ｆｉｎＲＯＰ：Ｒ
ＯＰタンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８，Ｇ
ｅｎｅ ６８：１３９−１４９）、ＯＲＩ：複製起点、ＲＮＡＩ／ＩＩ：複製に
関与するＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）、Ｔｃ：テトラサイクリン耐性遺
伝子。
【００４５】 図２は５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで培養した２種の株ＲＰＡ−Ｂ
ＩＯＣＡＴ６１０及び８４２の増殖度をマイクロプレートにおける６３０ｎｍ光
学密度の読取値により示す。Ａ）：ＨＭＴＢＳを加えない最少培地Ｍ９ＹＮＢｆ
ｒｕ＋５０μＭ ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株
の増殖度、Ｂ）：１０μＭ ＨＭＴＢＳを加えた最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５
０μＭ ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株の増殖度
。
ＩＯＣＡＴ６１０及び８４２の増殖度をマイクロプレートにおける６３０ｎｍ光
学密度の読取値により示す。Ａ）：ＨＭＴＢＳを加えない最少培地Ｍ９ＹＮＢｆ
ｒｕ＋５０μＭ ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株
の増殖度、Ｂ）：１０μＭ ＨＭＴＢＳを加えた最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５
０μＭ ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株の増殖度
。
【００４６】 図３はＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び８４２株の選択培地増殖度を示し、Ａ
は０．８μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを加え、Ｂは１μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを
加えた。選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８
μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０
μＭ ＨＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ Ｈ
ＭＴＢＮ＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
は０．８μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを加え、Ｂは１μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを
加えた。選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８
μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０
μＭ ＨＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ Ｈ
ＭＴＢＮ＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
【００４７】 図４は０．８μＭ ＨＭＴＢＳの存在下（Ａ）又は１μＭ ＨＭＴＢＳの存在
下（Ｂ）におけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び９６０株の選択培地増殖度を
示す。選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８μ
Ｍ ＨＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０μ
Ｍ ＨＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ ＨＭ
ＴＢＮ＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
下（Ｂ）におけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び９６０株の選択培地増殖度を
示す。選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８μ
Ｍ ＨＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０μ
Ｍ ＨＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ ＨＭ
ＴＢＮ＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
【００４８】 方法 使用した方法は例えばＡｕｓｕｂｅｌら，１９８７（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８
２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている当
業者に公知の慣用分子生物学及び微生物学法である。
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８
２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている当
業者に公知の慣用分子生物学及び微生物学法である。
【００４９】 最少培地Ｍ９ｆｒｕは以下の組成：７ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌ Ｋ
Ｈ２ＰＯ４、０．６ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ、４ｇ／ｌフルク
トース、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０μｇ／ｍｌチアミ
ンをもつ。最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕは最終濃度５ｇ／ｌのＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ，Ｄｉｆｃｏ）を加えたＭ９ｆｒｕ培地に対応す
る。この培地は予め滅菌しておいた下記母液：Ｍ９塩×１０（７０ｇ／ｌ Ｎａ ２ ＨＰＯ４、３０ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、６ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ Ｎ
Ｈ４Ｃｌ、高圧滅菌）、濾過２０％フルクトース、濾過２０％ＹＮＢ、高圧滅菌
１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、高圧滅菌１０ｍＭ ＣａＣｌ２、濾過１％チアミンか
ら生成される。
Ｈ２ＰＯ４、０．６ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ、４ｇ／ｌフルク
トース、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０μｇ／ｍｌチアミ
ンをもつ。最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕは最終濃度５ｇ／ｌのＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ，Ｄｉｆｃｏ）を加えたＭ９ｆｒｕ培地に対応す
る。この培地は予め滅菌しておいた下記母液：Ｍ９塩×１０（７０ｇ／ｌ Ｎａ ２ ＨＰＯ４、３０ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、６ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ Ｎ
Ｈ４Ｃｌ、高圧滅菌）、濾過２０％フルクトース、濾過２０％ＹＮＢ、高圧滅菌
１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、高圧滅菌１０ｍＭ ＣａＣｌ２、濾過１％チアミンか
ら生成される。
【００５０】 選択培地の生成に使用したＨＭＴＢＮ（５９ｍＭ）、ＨＭＴＢＳ（１．３ｍＭ
）及びＨＭＴＢアミド（１００ｍＭ）母液はこれらの物質の貯蔵液をＭ９ＹＮＢ
ｆｒｕで夫々濃度５．９Ｍ（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃロット番号：ＰＨＭ４
３９Ｊ）及び１．３Ｍ（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃロット番号：ＢＦＲ８１）
に希釈することにより調製される。これらの溶液はＥＰ３３０５２１、ＥＰ１４
２４８８、ＵＳ３７７３９２７及びＵＳ４３５３９２４の各特許及び特許出願に
記載されているプロトコールに従って調製する。ＨＭＴＢアミドは前記特許及び
特許出願に記載されているアミノシアノヒドリン（ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨＮ
Ｈ２ＣＮ）の硫酸加水分解により得られる。
）及びＨＭＴＢアミド（１００ｍＭ）母液はこれらの物質の貯蔵液をＭ９ＹＮＢ
ｆｒｕで夫々濃度５．９Ｍ（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃロット番号：ＰＨＭ４
３９Ｊ）及び１．３Ｍ（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃロット番号：ＢＦＲ８１）
に希釈することにより調製される。これらの溶液はＥＰ３３０５２１、ＥＰ１４
２４８８、ＵＳ３７７３９２７及びＵＳ４３５３９２４の各特許及び特許出願に
記載されているプロトコールに従って調製する。ＨＭＴＢアミドは前記特許及び
特許出願に記載されているアミノシアノヒドリン（ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨＮ
Ｈ２ＣＮ）の硫酸加水分解により得られる。
【００５１】 予備培養は該当株のグリセロール貯蔵液から播種することにより、必要に応じ
て適切な抗生物質の存在下に濃ＬＢ培地（１０ｇｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エ
キス、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）３ｍｌ中で実施される。予備培養液
を３７℃、２００ｒｐｍで６〜７時間インキュベートする。
て適切な抗生物質の存在下に濃ＬＢ培地（１０ｇｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エ
キス、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）３ｍｌ中で実施される。予備培養液
を３７℃、２００ｒｐｍで６〜７時間インキュベートする。
【００５２】 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び８４２株の発現培養液はＬＢ１０ｍｌ＋１０
０μｇ／ｍｌカルベニシリン＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧで予備培養液を１００倍に
希釈することにより得られる。これらの培養液を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２０
０ｒｐｍで１６時間インキュベートする。バイオマスは６６０ｎｍ光学密度（Ｏ
Ｄ６６０）を測定し、バイオマス関係式（培養液１リットル当たりの乾燥重量グ
ラム）＝ＯＤ６６０×０．３５で表す。
０μｇ／ｍｌカルベニシリン＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧで予備培養液を１００倍に
希釈することにより得られる。これらの培養液を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２０
０ｒｐｍで１６時間インキュベートする。バイオマスは６６０ｎｍ光学密度（Ｏ
Ｄ６６０）を測定し、バイオマス関係式（培養液１リットル当たりの乾燥重量グ
ラム）＝ＯＤ６６０×０．３５で表す。
【００５３】 培養液のニトリラーゼ活性定量は次のように実施する。発現培養液を遠心分離
し、細胞ペレットを１００ｍＭリン酸緩衝液で洗浄する。細胞ペレットをこの同
一緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液２００μｌを２００ｍＭ ＨＭＴＢＮ（１００
ｍＭリン酸緩衝液溶液）２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートする。
０、３０、６０、９０及び１２０分間隔で反応媒体５μｌサンプルを分取し、２
００ｍＭ Ｈ２ＰＯ４ ５０μｌと混合する。このサンプル５５μｌに５．１％
フェノール−２．５４Ｎ ＮａＯＨ溶液１０５μｌを加え、混合後に２倍希釈４
７／５０℃Ｊａｂｅｌ溶液（１２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液、Ｄｏｕｓｓ
ｅｌｉｎ ＆ Ｇｅｏｆｆｒａｙ Ｊａｃｑｕｅｔ ｒｅｕｎｉｓ，Ｃｏｕｚｏ
ｎ ａｕｘ Ｍｏｎｔｓｄ’Ｏｒ，フランス）４０μｌを加える。撹拌後に周囲
温度で１０分間インキュベートした後、６３０ｎｍ光学密度を読取る。遊離ＨＭ
ＴＢＳ量の計算は下表に従ってＨＭＴＢＮの存在下に１００ｍＭリン酸緩衝液で
調製したＨＭＴＢＳ校正溶液に比較することにより実施する。
し、細胞ペレットを１００ｍＭリン酸緩衝液で洗浄する。細胞ペレットをこの同
一緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液２００μｌを２００ｍＭ ＨＭＴＢＮ（１００
ｍＭリン酸緩衝液溶液）２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートする。
０、３０、６０、９０及び１２０分間隔で反応媒体５μｌサンプルを分取し、２
００ｍＭ Ｈ２ＰＯ４ ５０μｌと混合する。このサンプル５５μｌに５．１％
フェノール−２．５４Ｎ ＮａＯＨ溶液１０５μｌを加え、混合後に２倍希釈４
７／５０℃Ｊａｂｅｌ溶液（１２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液、Ｄｏｕｓｓ
ｅｌｉｎ ＆ Ｇｅｏｆｆｒａｙ Ｊａｃｑｕｅｔ ｒｅｕｎｉｓ，Ｃｏｕｚｏ
ｎ ａｕｘ Ｍｏｎｔｓｄ’Ｏｒ，フランス）４０μｌを加える。撹拌後に周囲
温度で１０分間インキュベートした後、６３０ｎｍ光学密度を読取る。遊離ＨＭ
ＴＢＳ量の計算は下表に従ってＨＭＴＢＮの存在下に１００ｍＭリン酸緩衝液で
調製したＨＭＴＢＳ校正溶液に比較することにより実施する。
【００５４】
【表１】 活性は生成ＨＭＴＢＳｋｇ／時／ｋｇ乾燥細胞（ＣＳ）で表す。
【００５５】 実施例 実施例１：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１の構築。
【００５６】 Ｐｔｒｐプロモーター、λファージのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳｃＩＩ）及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓのニトリラーゼ遺
伝子ＡＴＣＣ８７５０（ｎｉｔＢ）を含む１．２７ｋｂフラグメントを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩによりプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６（仏国出願第９
６／１３０７７号）から抽出し、同一制限酵素で切断したベクターｐＸＬ６４２
（ＣＩＰ出願第０８／１９４，５８８号に記載）にクローニングした。得られた
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を酵素ＳｔｕＩ及びＢｓｍＩで切断し、４．
３ｋｂフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（仏国出願第９６／１３０７７号）
から精製した１３６ｂｐ ＳｔｕＩ−ＢｓｍＩフラグメントと連結し、プラスミ
ドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を得た。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の部分配列決定によ
ると、ニトリラーゼのＡｓｐ２７９残基のコドンがＡｓｎ２７９残基のコドンで
置換されていることが確認された。次に、融合体Ｐｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：
ｎｉｔＢを含むｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の１．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフ
ラグメントを同一酵素で切断したベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８にクローニン
グし、６．２ｋｂプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９を得た。ベクターｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ２８はｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願第０８／１９４，５８８号に記載）
の３．９ｋｂ ＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラグメントをｐＨＰ４５ΩＴｃ（Ｆｅｌｌ
ａｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５２：１４７−１５４）の２．１ｋｂ ＳｍａＩ
フラグメントと連結してアンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マー
カーで置換することにより得た。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点
の近傍のＮｄｅＩ部位をＮｄｅＩ部分消化と大腸菌ポリメラーゼＩ（クレノウフ
ラグメント）の作用により破壊することにより、図１に制限地図を示すプラスミ
ドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を得た。発現カセットの配列を配列番号１で表す。
ＢＳｃＩＩ）及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓのニトリラーゼ遺
伝子ＡＴＣＣ８７５０（ｎｉｔＢ）を含む１．２７ｋｂフラグメントを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩによりプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６（仏国出願第９
６／１３０７７号）から抽出し、同一制限酵素で切断したベクターｐＸＬ６４２
（ＣＩＰ出願第０８／１９４，５８８号に記載）にクローニングした。得られた
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を酵素ＳｔｕＩ及びＢｓｍＩで切断し、４．
３ｋｂフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（仏国出願第９６／１３０７７号）
から精製した１３６ｂｐ ＳｔｕＩ−ＢｓｍＩフラグメントと連結し、プラスミ
ドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を得た。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の部分配列決定によ
ると、ニトリラーゼのＡｓｐ２７９残基のコドンがＡｓｎ２７９残基のコドンで
置換されていることが確認された。次に、融合体Ｐｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：
ｎｉｔＢを含むｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の１．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフ
ラグメントを同一酵素で切断したベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８にクローニン
グし、６．２ｋｂプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９を得た。ベクターｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ２８はｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願第０８／１９４，５８８号に記載）
の３．９ｋｂ ＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラグメントをｐＨＰ４５ΩＴｃ（Ｆｅｌｌ
ａｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５２：１４７−１５４）の２．１ｋｂ ＳｍａＩ
フラグメントと連結してアンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マー
カーで置換することにより得た。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点
の近傍のＮｄｅＩ部位をＮｄｅＩ部分消化と大腸菌ポリメラーゼＩ（クレノウフ
ラグメント）の作用により破壊することにより、図１に制限地図を示すプラスミ
ドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を得た。発現カセットの配列を配列番号１で表す。
【００５７】 実施例２：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７７の構築。
【００５８】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を鋳型として使用し、プライマーとして仏
国出願第９６／１３０７７号に記載のＰＣＲＡＦ１及び下記ＮｉｔＢ１６０： NitB160:5'-GGGGAGAGGT GCTCCCAGCA GCACAGGCCA CCGACGGG-3' とＰｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することにより、ｎｉｔＢ遺伝子
の一部をＰＣＲ増幅した。使用したプログラムは、５分間９５℃１サイクル、１
分間９５℃、１分間６０℃、１分間７２℃５サイクル、３０秒間９５℃、３０秒
間６０℃、３０秒間７２℃３０サイクル及び５分間７２℃１シーケンスとした。
こうして増幅した約０．４９５ｂｐフラグメントを酵素ＮｄｅＩ及びＢｓｉＨＫ
ＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。次に、プラ
スミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１の消化産物から精製した０．２６１ｋｂ Ｂｓｉ
ＨＫＡＩ−ＳｔｕＩフラグメントと、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２の消化産物から精
製した５．４３ｋｂ ＮｄｅＩ−ＳｔｕＩフラグメントに前記増幅フラグメント
を連結した。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２はＸｃｍＩ消化と再連結によりベ
クターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１から約０．５５ｋｂのＸｃｍＩフラグメントを除
去することにより得た。このクローニングにより得られたプラスミドをｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ７７と命名した。これはプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１に対応す
るが、１６０位アラニン残基をグリシン残基で置換したニトリラーゼＮｉｔＢを
発現させることができる。
国出願第９６／１３０７７号に記載のＰＣＲＡＦ１及び下記ＮｉｔＢ１６０： NitB160:5'-GGGGAGAGGT GCTCCCAGCA GCACAGGCCA CCGACGGG-3' とＰｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することにより、ｎｉｔＢ遺伝子
の一部をＰＣＲ増幅した。使用したプログラムは、５分間９５℃１サイクル、１
分間９５℃、１分間６０℃、１分間７２℃５サイクル、３０秒間９５℃、３０秒
間６０℃、３０秒間７２℃３０サイクル及び５分間７２℃１シーケンスとした。
こうして増幅した約０．４９５ｂｐフラグメントを酵素ＮｄｅＩ及びＢｓｉＨＫ
ＡＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。次に、プラ
スミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１の消化産物から精製した０．２６１ｋｂ Ｂｓｉ
ＨＫＡＩ−ＳｔｕＩフラグメントと、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２の消化産物から精
製した５．４３ｋｂ ＮｄｅＩ−ＳｔｕＩフラグメントに前記増幅フラグメント
を連結した。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２はＸｃｍＩ消化と再連結によりベ
クターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１から約０．５５ｋｂのＸｃｍＩフラグメントを除
去することにより得た。このクローニングにより得られたプラスミドをｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ７７と命名した。これはプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１に対応す
るが、１６０位アラニン残基をグリシン残基で置換したニトリラーゼＮｉｔＢを
発現させることができる。
【００５９】 実施例３：ＰｌａｃプロモーターからＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌ
ｉｓのニトリラーゼを発現する栄養要求大腸菌株の構築。
ｉｓのニトリラーゼを発現する栄養要求大腸菌株の構築。
【００６０】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７７を鋳型として使用し、下記プライマーｎｉ
ｔＢＭＮ１及びｎｉｔＢＭＮ２： nitBMN1:5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3' nitBMN2:5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3' とＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することにより、Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓのニトリラーゼ遺伝子ＡＴＣＣ８７５０を
ＰＣＲ増幅した。使用したプログラムは、５分間９５℃１サイクル、１分間９５
℃、１分間５０℃、１分間７２℃５サイクル、３０秒間９５℃、３０秒間５０℃
、３０秒間７２℃３０サイクル及び５分間７２℃１シーケンスとした。次に、得
られた約１．２ｋｂフラグメントを酵素ＸｂａＩにより消化し、酵素ＥｃｏＲＶ
及びＸｂａＩで切断しておいたベクターｐｂｓＩＩ ｋｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）にクローニングした。次に、得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０
５を大腸菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０に導入した。この株はｍｅｔＡ遺伝子
に欠失を含み、Ｒｉｃｈａｕｄら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６
８：２６８２７−２６８３５）に記載されているβ１８０株に対応する。クロー
ンを１個選択し、上記発現条件下に３種のＬＢサンプルで培養した。上記のよう
にして得られた細胞ペレットでニトリラーゼ活性を測定した処、実施例４に記載
するＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４２株の０ｋｇ／ｈ．ｋｇＣＳに対して平均後に２
．５ｋｇ／ｈ．ｋｇＣＳであることが判明したので、同一条件で培養した。活性
ニトリラーゼを発現するこの新規株をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１と命名した。
ｔＢＭＮ１及びｎｉｔＢＭＮ２： nitBMN1:5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3' nitBMN2:5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3' とＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することにより、Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓのニトリラーゼ遺伝子ＡＴＣＣ８７５０を
ＰＣＲ増幅した。使用したプログラムは、５分間９５℃１サイクル、１分間９５
℃、１分間５０℃、１分間７２℃５サイクル、３０秒間９５℃、３０秒間５０℃
、３０秒間７２℃３０サイクル及び５分間７２℃１シーケンスとした。次に、得
られた約１．２ｋｂフラグメントを酵素ＸｂａＩにより消化し、酵素ＥｃｏＲＶ
及びＸｂａＩで切断しておいたベクターｐｂｓＩＩ ｋｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）にクローニングした。次に、得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０
５を大腸菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０に導入した。この株はｍｅｔＡ遺伝子
に欠失を含み、Ｒｉｃｈａｕｄら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６
８：２６８２７−２６８３５）に記載されているβ１８０株に対応する。クロー
ンを１個選択し、上記発現条件下に３種のＬＢサンプルで培養した。上記のよう
にして得られた細胞ペレットでニトリラーゼ活性を測定した処、実施例４に記載
するＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４２株の０ｋｇ／ｈ．ｋｇＣＳに対して平均後に２
．５ｋｇ／ｈ．ｋｇＣＳであることが判明したので、同一条件で培養した。活性
ニトリラーゼを発現するこの新規株をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１と命名した。
【００６１】 実施例４：ＰｌａｃプロモーターからＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌ
ｉｓの不活性ニトリラーゼを発現する栄養要求大腸菌株の構築。
ｉｓの不活性ニトリラーゼを発現する栄養要求大腸菌株の構築。
【００６２】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９を鋳型として使用することにより、ニトリ
ラーゼ変異体遺伝子ＮｉｔＢを実施例３に記載したように増幅した。プラスミド
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９はベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１に対応するが、ニト
リラーゼＮｉｔＢの１６３位システイン残基をアラニン残基で置換する突然変異
をｎｉｔＢ遺伝子に含む。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９は次のように得た
。プライマーとして仏国出願第９６／１３０７７号に記載のＰＣＲＡＦ１及び下
記ＮｉｔＢ１： NitB1:5'-GCAGCACAGG GCACCGACGC-3' を使用して鋳型ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１でＰＣＲ増幅後に、増幅産物をＮＤｅＩ
とＢａｎＩで消化し、約０．４７６ｋｂインサートを得た。同様に、下記プライ
マーＮｉｔＢ２及びＳＲ： NitB2:5'-CGCGTCGGTG CCCTGTGCGC CTGGGAGC-3' SR:5'-CGGCAATGAT CAGGCCTTCG GC-3' を使用して鋳型ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１でＰＣＲ増幅後に、増幅産物をＢａｎＩ
とＳｔｕＩで消化し、約０．３４ｋｂインサートを得た。ベクターｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ７２をＮｄｅＩとＳｔｕＩで消化後、５．４３ｋｂフラグメントを上記０
．４７６ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｎＩインサートと０．３４ｋｂ ＢａｎＩ−Ｓｔ
ｕＩインサートに連結し、ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９を形成した。プライ
マーｎｉｔＢＭＮ１及びｎｉｔＢＭＮ２と鋳型ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９を使用し
て得られた増幅産物を次に実施例３に記載したようにベクターｐｂｓＩＩ ｋｓ
−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ１０７と命名し、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０株に導入し、新規株
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４２を得た。
ラーゼ変異体遺伝子ＮｉｔＢを実施例３に記載したように増幅した。プラスミド
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９はベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１に対応するが、ニト
リラーゼＮｉｔＢの１６３位システイン残基をアラニン残基で置換する突然変異
をｎｉｔＢ遺伝子に含む。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９は次のように得た
。プライマーとして仏国出願第９６／１３０７７号に記載のＰＣＲＡＦ１及び下
記ＮｉｔＢ１： NitB1:5'-GCAGCACAGG GCACCGACGC-3' を使用して鋳型ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１でＰＣＲ増幅後に、増幅産物をＮＤｅＩ
とＢａｎＩで消化し、約０．４７６ｋｂインサートを得た。同様に、下記プライ
マーＮｉｔＢ２及びＳＲ： NitB2:5'-CGCGTCGGTG CCCTGTGCGC CTGGGAGC-3' SR:5'-CGGCAATGAT CAGGCCTTCG GC-3' を使用して鋳型ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１でＰＣＲ増幅後に、増幅産物をＢａｎＩ
とＳｔｕＩで消化し、約０．３４ｋｂインサートを得た。ベクターｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ７２をＮｄｅＩとＳｔｕＩで消化後、５．４３ｋｂフラグメントを上記０
．４７６ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｎＩインサートと０．３４ｋｂ ＢａｎＩ−Ｓｔ
ｕＩインサートに連結し、ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９を形成した。プライ
マーｎｉｔＢＭＮ１及びｎｉｔＢＭＮ２と鋳型ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６９を使用し
て得られた増幅産物を次に実施例３に記載したようにベクターｐｂｓＩＩ ｋｓ
−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ１０７と命名し、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０株に導入し、新規株
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４２を得た。
【００６３】 実施例５：ＰｌａｃプロモーターからＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅ
ｒｏｎｉの活性ニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の構築。
ｒｏｎｉの活性ニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の構築。
【００６４】 鋳型プラスミドｐＸＬ２１５８（ＦＲ９６１３０７７）と、下記プライマーＮ
ｉｔＡ１及びＮｉｔＡ２： NitA1:5'-GGGCATACAT TCAATCAATT G-3' NitA2:5'-AGGTGGGACC CAAGCTTGCA-3' とＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを使用してＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅ
ｒｏｎｉのｎｉｔＡ遺伝子を含む１．３５ｋｂフラグメントのＰＣＲ増幅を行っ
た。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）精製
、ＱＩＡＥＸ ＩＩキット（ＱＩＡＧＥＮ）による脱塩及び酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
による消化後に、酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｉｎｃＩＩで予め消化しておいたプ
ラスミドｐｂｓＩＩ ｋｓ−にＰＣＲフラグメントを連結し、プラスミドｐＢＣ
ＡＴ１４５を得た。このプラスミドをＣｈｕｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８６：２１７２−２１７５）の方法に従って
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０株に導入した。得られた新規株をＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ９６０と命名した。
ｉｔＡ１及びＮｉｔＡ２： NitA1:5'-GGGCATACAT TCAATCAATT G-3' NitA2:5'-AGGTGGGACC CAAGCTTGCA-3' とＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを使用してＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅ
ｒｏｎｉのｎｉｔＡ遺伝子を含む１．３５ｋｂフラグメントのＰＣＲ増幅を行っ
た。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）精製
、ＱＩＡＥＸ ＩＩキット（ＱＩＡＧＥＮ）による脱塩及び酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
による消化後に、酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｉｎｃＩＩで予め消化しておいたプ
ラスミドｐｂｓＩＩ ｋｓ−にＰＣＲフラグメントを連結し、プラスミドｐＢＣ
ＡＴ１４５を得た。このプラスミドをＣｈｕｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８６：２１７２−２１７５）の方法に従って
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０株に導入した。得られた新規株をＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ９６０と命名した。
【００６５】 実施例６：ＨＭＴＢＳを加えた最少培地におけるメチオニン栄養要求大腸菌突
然変異体の増殖。
然変異体の増殖。
【００６６】 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株を８４２株のみに０．５ｍＭ ＩＰ
ＴＧと１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを加えたＬＢ培地で予備培養し、Ｍ９Ｙ
ＮＢｆｒｕ培地で洗浄し、等容量のこの同一培地にとった。次に２種の培養液を
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４２株のみに１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５
ｍＭ ＩＰＴＧを加えた培地ｉ）Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５０μＭ ＨＭＴＢＮ、ｉ
ｉ）Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５０μＭ ＨＭＴＢＮ＋１０μＭ ＨＭＴＢＳで１００
倍に希釈した。これらの培養液を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで撹拌
下に培養し、マイクロプレートで読取った培養液の６３０ｎｍ光学密度により株
の増殖度を測定し、図２に報告する。
ＴＧと１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを加えたＬＢ培地で予備培養し、Ｍ９Ｙ
ＮＢｆｒｕ培地で洗浄し、等容量のこの同一培地にとった。次に２種の培養液を
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４２株のみに１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５
ｍＭ ＩＰＴＧを加えた培地ｉ）Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５０μＭ ＨＭＴＢＮ、ｉ
ｉ）Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５０μＭ ＨＭＴＢＮ＋１０μＭ ＨＭＴＢＳで１００
倍に希釈した。これらの培養液を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで撹拌
下に培養し、マイクロプレートで読取った培養液の６３０ｎｍ光学密度により株
の増殖度を測定し、図２に報告する。
【００６７】 その結果、ＨＭＴＢＳはメチオニン栄養要求大腸菌株によりメチオニン源とし
て使用可能であることが判明した。
て使用可能であることが判明した。
【００６８】 実施例７：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓの活性ニトリラーゼを
発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の最少培地増殖に及ぼすＹＮＢ、ＨＭＴＢ
Ｎ及びＨＭＴＢＳの影響 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び８４２株を１００μｇ／ｍｌカルベニシリン
と０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載したように洗浄
し、いずれも１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えた
表１に示す培地５ｍｌで１０００倍に希釈した。５０ｍｌ密閉管で３７℃、２０
０ｒｐｍで５日間インキュベーション後に培養液の濁度の目視により増殖を評価
した。これらの結果を表１にまとめる。
発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の最少培地増殖に及ぼすＹＮＢ、ＨＭＴＢ
Ｎ及びＨＭＴＢＳの影響 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び８４２株を１００μｇ／ｍｌカルベニシリン
と０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載したように洗浄
し、いずれも１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えた
表１に示す培地５ｍｌで１０００倍に希釈した。５０ｍｌ密閉管で３７℃、２０
０ｒｐｍで５日間インキュベーション後に培養液の濁度の目視により増殖を評価
した。これらの結果を表１にまとめる。
【００６９】
【表２】
【００７０】 これらの結果から明らかなように、ＹＮＢは例示条件下でメチオニン栄養要求
大腸菌株の増殖に必須の添加成分を構成する。
大腸菌株の増殖に必須の添加成分を構成する。
【００７１】 また、試験した選択培地は活性ニトリラーゼを発現するΔｍｅｔＡ大腸菌株を
不活性形態のこの酵素を発現する株から区別できないこともこれらの結果から明
らかである。５０μＭのＨＭＴＢＮ濃度は大腸菌の増殖に十分なメチオニン源を
提供するには低過ぎる。
不活性形態のこの酵素を発現する株から区別できないこともこれらの結果から明
らかである。５０μＭのＨＭＴＢＮ濃度は大腸菌の増殖に十分なメチオニン源を
提供するには低過ぎる。
【００７２】 実施例８：栄養要求株の増殖を可能にするＨＭＴＢＳ最少濃度の決定。
【００７３】 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１株を１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５ｍ
Ｍ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載したように洗浄し、いずれ
も１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えた表２に示す
培地５ｍｌで１０００倍に希釈した。５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで
５日間インキュベーション後に培養液の濁度の目視により増殖を評価した。これ
らの結果を表２にまとめる。
Ｍ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載したように洗浄し、いずれ
も１００μｇ／ｍｌカルベニシリンと０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えた表２に示す
培地５ｍｌで１０００倍に希釈した。５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで
５日間インキュベーション後に培養液の濁度の目視により増殖を評価した。これ
らの結果を表２にまとめる。
【００７４】
【表３】
【００７５】 これらの結果から明らかなように、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１株の増殖に必
要な最少ＨＭＴＢＳ濃度は２μＭ以上である。
要な最少ＨＭＴＢＳ濃度は２μＭ以上である。
【００７６】 実施例９：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓの活性ニトリラーゼを
発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の増殖を可能にする選択培地の調製。
発現するメチオニン栄養要求大腸菌株の増殖を可能にする選択培地の調製。
【００７７】 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び８４２株を１００μｇ／ｍｌカルベニシリン
と０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載した条件下で洗
浄後、０．８又は１μＭ ＨＭＴＢＳと５０μＭ ＨＭＴＢＮを加えた選択培地
Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ １０ｍｌ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧで１００倍に希釈した。図
３はこれらの２種の株を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで培養し、マイ
クロプレートで６３０ｎｍ光学密度の読取りにより測定した増殖度を示す。
と０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載した条件下で洗
浄後、０．８又は１μＭ ＨＭＴＢＳと５０μＭ ＨＭＴＢＮを加えた選択培地
Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ １０ｍｌ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧで１００倍に希釈した。図
３はこれらの２種の株を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで培養し、マイ
クロプレートで６３０ｎｍ光学密度の読取りにより測定した増殖度を示す。
【００７８】 その結果、選択培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋５０μＭ Ｈ
ＭＴＢＮ＋０．８又は１μＭ ＨＭＴＢＳは活性ニトリラーゼを発現する大腸菌
株を不活性ニトリラーゼを発現する大腸菌株から区別できることが判明した。
ＭＴＢＮ＋０．８又は１μＭ ＨＭＴＢＳは活性ニトリラーゼを発現する大腸菌
株を不活性ニトリラーゼを発現する大腸菌株から区別できることが判明した。
【００７９】 実施例１０：活性ニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求大腸菌株のヒド
ロキシメチルチオブチロニトリル上の増殖。
ロキシメチルチオブチロニトリル上の増殖。
【００８０】 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び９６０株を１００μｇ／ｍｌカルベニシリン
と０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載した条件下に洗
浄後、実施例９に記載した選択増殖培地で１００倍に希釈した。図４はこれらの
２種の株を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで培養し、マイクロプレート
で６３０ｎｍ光学密度の読取りにより測定した増殖度を示す。
と０．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下に予備培養し、実施例６に記載した条件下に洗
浄後、実施例９に記載した選択増殖培地で１００倍に希釈した。図４はこれらの
２種の株を５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで培養し、マイクロプレート
で６３０ｎｍ光学密度の読取りにより測定した増殖度を示す。
【００８１】 その結果、実施例９に記載の培地はＰｌａｃプロモーターを使用する発現系で
異なる２種の起源のニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求株に選択的であ
ることが判明した。
異なる２種の起源のニトリラーゼを発現するメチオニン栄養要求株に選択的であ
ることが判明した。
【配列表】
【図１】 プラスミドＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４１を示す。括弧内の部位はクローニング時
に除去された部位である。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター、ｎｉｔＢ：
ニトリラーゼ遺伝子、ＴｒｍＢ：転写ターミネーター、ｆｉｎＲＯＰ：ＲＯＰタ
ンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ
６８：１３９−１４９）、ＯＲＩ：複製起点、ＲＮＡＩ／ＩＩ：複製に関与す
るＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）、Ｔｃ：テトラサイクリン耐性遺伝子。
に除去された部位である。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター、ｎｉｔＢ：
ニトリラーゼ遺伝子、ＴｒｍＢ：転写ターミネーター、ｆｉｎＲＯＰ：ＲＯＰタ
ンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ
６８：１３９−１４９）、ＯＲＩ：複製起点、ＲＮＡＩ／ＩＩ：複製に関与す
るＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）、Ｔｃ：テトラサイクリン耐性遺伝子。
【図２】 ５０ｍｌ密閉管で３７℃、２００ｒｐｍで培養した２種の株ＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ６１０及び８４２の増殖度をマイクロプレートにおける６３０ｎｍ光学密度
の読取値により示す。Ａ）：ＨＭＴＢＳを加えない最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋
５０μＭ ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株の増殖
度、Ｂ）：１０μＭ ＨＭＴＢＳを加えた最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５０μＭ
ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株の増殖度。
ＡＴ６１０及び８４２の増殖度をマイクロプレートにおける６３０ｎｍ光学密度
の読取値により示す。Ａ）：ＨＭＴＢＳを加えない最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋
５０μＭ ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株の増殖
度、Ｂ）：１０μＭ ＨＭＴＢＳを加えた最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋５０μＭ
ＨＭＴＢＮにおけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ６１０及び８４２株の増殖度。
【図３】 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び８４２株の選択培地増殖度を示し、Ａは０．
８μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを加え、Ｂは１μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを加えた
。選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８μＭ
ＨＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０μＭ
ＨＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ ＨＭＴＢ
Ｎ＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
８μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを加え、Ｂは１μＭの制限濃度ＨＭＴＢＳを加えた
。選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８μＭ
ＨＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０μＭ
ＨＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ ＨＭＴＢ
Ｎ＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
【図４】 ０．８μＭ ＨＭＴＢＳの存在下（Ａ）又は１μＭ ＨＭＴＢＳの存在下（Ｂ
）におけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び９６０株の選択培地増殖度を示す。
選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８μＭ Ｈ
ＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０μＭ Ｈ
ＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ ＨＭＴＢＮ
＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
）におけるＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ８４１及び９６０株の選択培地増殖度を示す。
選択培地は最少培地Ｍ９ＹＮＢｆｒｕ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．８μＭ Ｈ
ＭＴＢＳ（Ｓ０．８）もしくは１μＭ ＨＭＴＢＳ（Ｓ１）、又は５０μＭ Ｈ
ＭＴＢＮ＋０．８μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ０．８）、又は５０μＭ ＨＭＴＢＮ
＋１μＭ ＨＭＴＢＳ（ＮＳ１）から構成した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バテイース・ドウビテ，ナデイヌ フランス国、エフ−69009・リヨン、リ ユ・ドウ・サン−シル、224、アパルトマ ン・76 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA07 BA11 BA71 CA01 DA06 GA11 GA19 4B050 CC03 EE02 EE03 EE10 LL05 4B065 AA26X AB01 AC14 BA01 BB11 BC13 BC20 CA17 CA41 CA44
Claims (30)
- 【請求項１】 適当な基質をメチオニン及びＨＭＴＢＳのようなメチオニン
誘導体に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列の選択及び
／または単離方法であって、 （１）適当な微生物宿主中でＤＮＡを発現させ得るベクターでＤＮＡ配列をクロ
ーニングする段階と、 （２）前段階で得られたベクターを適当なメチオニン要求性微生物に導入するこ
とによって前記適当な微生物を形質転換する段階と、 （３）前段階で得られた形質転換微生物を十分な量の適当な基質を含む適当な培
養培地で培養する段階と、 （４）前記適当な培地で増殖し得る形質転換微生物を選択及び／または単離する
段階と、 （５）適当な基質の生物的変換に関与するＤＮＡ配列を単離し必要な場合には同
定する段階、とから成ることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 適当な基質が２−アミノ−４−（メチルチオ）ブチロニトリ
ルであるか、または、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブチロニトリル（Ｈ
ＭＴＢＮ）のようなその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 適当な基質がニトリラーゼによって直接にメチオニンまたは
ＨＭＴＢＳのようなメチオニン誘導体に変換されることを特徴とする請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】 単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がニトリラーゼをコ
ードしていることを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ２−アミノ−４−（メチルチオ）ブチロニトリルまたはＨＭ
ＴＢＮのようなその誘導体を、２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタンアミドま
たは２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタンアミド（ＨＭＴＢＡｍｉｄｅ）
のようなその誘導体を経由して、メチオニンまたはＨＭＴＢＳのようなメチオニ
ン誘導体に変換する請求項２に記載の方法であって、先ず、２−アミノ−４−（
メチルチオ）ブチロニトリルまたはＨＭＴＢＮのようなその誘導体をニトリルヒ
ドラターゼによって２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタンアミドまたはＨＭＴ
ＢＡｍｉｄｅのようなその誘導体に変換し、次いで、２−アミノ−４−（メチル
チオ）ブタンアミドまたはＨＭＴＢＡｍｉｄｅのようなその誘導体をアミダーゼ
によってメチオニンまたはＨＭＴＢＳのようなメチオニン誘導体に変換すること
を特徴とする方法。 - 【請求項６】 単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がニトリルヒドラタ
ーゼまたはアミダーゼをコードしていることを特徴とする請求項５に記載の方法
。 - 【請求項７】 単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がニトリルヒドラタ
ーゼをコードしており、適当な微生物が更に、相補的アミダーゼをコードする天
然遺伝子または異種遺伝子を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がアミダーゼをコー
ドしており、適当な微生物が更に、相補的ニトリルヒドラターゼをコードする天
然遺伝子または異種遺伝子を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】 適当な基質が２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタンアミド
であるかまたはＨＭＴＢＡｍｉｄｅのようなその誘導体であり、アミダーゼによ
ってメチオニンまたはＨＭＴＢＳのようなメチオニン誘導体に変換されることを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 単離及び／または選択されたＤＮＡ配列がアミダーゼであ
ることを特徴とする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 メチオニン要求性の適当な微生物が、メチオニン非含有で
ＨＭＴＢＳ含有の培地で増殖し得る形質転換可能なメチオニン要求性微生物であ
ることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 適当な微生物が、酵母、菌類及び細菌から選択されること
を特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項１２に記載の
方法。 - 【請求項１４】 ＤＮＡ配列が、１つまたは複数のゲノムから該ゲノムの完
全制限または部分制限によって単離されたＤＮＡ配列であることを特徴とする請
求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＤＮＡ配列が、ゲノムの一部から該ゲノムの一部の完全制
限または部分制限によって単離されたＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項
１から１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】 ＤＮＡ配列が、ＰＣＲによって構築物から単離されたＤＮ
Ａ配列であることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１７】 ＤＮＡ配列が、無作為突然変異誘発によって得られること
を特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１８】 形質転換された微生物の培養が、特に逐次培養による（バ
ッチ式）大量培養であるか、または、特にケモスタット培養のような連続培養で
あることを特徴とする請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】 適当な培養培地が、微生物の増殖を確保するためには不十
分な量のメチオニンを含むが、生物的変換によってメチオニンまたはＨＭＴＢＳ
のようなメチオニン誘導体に変換されると形質転換微生物を増殖させ得る十分な
量の適当な基質を含むことを特徴とする請求項１から１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 ２−アミノ−４−（メチルチオ）ブチロニトリルまたはＨ
ＭＴＢＮのようなその誘導体の十分量が、０−６０ｇ／リットル、好ましくは３
ｍｇ／リットル−１７ｍｇ／リットル、より好ましくは６ｍｇ／リットル−１０
ｍｇ／リットルの範囲であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 ２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタンアミドまたはＨＭ
ＴＢＡｍｉｄｅのようなその誘導体の十分量が、０−６０ｇ／リットル、好まし
くは３ｍｇ／リットル−１７ｍｇ／リットル、より好ましくは６ｍｇ／リットル
−１０ｍｇ／リットルの範囲であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２２】 適当な培養培地が適正量のメチオニンまたはＨＭＴＢＳの
ようなメチオニン誘導体を含有することを特徴とする請求項１から２１のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項２３】 メチオニンまたはＨＭＴＢＳのようなメチオニン誘導体の
適正量が、形質転換微生物を増殖させ得る十分な量を下回る濃度であることを特
徴とする請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 ＨＭＴＢＳの量が、３５０μｇ／リットル未満、好ましく
は２５０μｇ／リットル未満、より好ましくは１３０−１７０μｇ／リットルの
範囲であることを特徴とする請求項２２または２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 適当な培養培地が有機窒素源を含むことを特徴とする請求
項１から２４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２６】 有機窒素源の濃度が、０−１５ｇ／リットル、好ましくは
２−１０ｇ／リットル、より好ましくは３−８ｇ／リットルの範囲であることを
特徴とする請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 適当な培養培地が最少培地としてＭ９ｆｒｕを含むことを
特徴とする請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２８】 適当な培養培地が液体培地または固体培地であることを特
徴とする請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２９】 請求項１９から２８のいずれか一項に定義された培養培地
。 - 【請求項３０】 本発明方法によって選択及び／または単離されることを特
徴とする、適当な基質をメチオニンまたはＨＭＴＢＳのようなメチオニン誘導体
に変換する生物的変換に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9815849A FR2787120A1 (fr) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
| FR98/15849 | 1999-07-19 | ||
| FR99/09489 | 1999-07-19 | ||
| FR9909489A FR2787121B1 (fr) | 1998-12-11 | 1999-07-19 | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
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