FR2787121A1 - Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne donc un procédé de sélection et/ou d'isolement de séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat approprié en HMTBS, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de1) clonage de séquences d'ADN dans un vecteur permettant leur expression dans un micro-organisme hôte approprié, 2) transformation d'un micro-organismes approprié auxotrophe pour la méthionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit micro-organisme approprié, 3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, et 4) sélection des micro-organismes transformés capables de croître dans le milieu approprié, et 5) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
Description
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Nouvelle méthode d'isolement et de sélection de gènes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprié
La présente invention concerne un nouveau procédé d'isolement et/ou de sélection de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat en méthionine ou ses dérivés, comme l'acide 2-hydroxy 4-(methylthio) butanoïque ou ses sels, en particulier hydrolysant des groupements amides en acides carboxyliques, ou impliqués dans la bioconversion de groupements nitriles en acides carboxyliques correspondants, au moyen d'un crible de sélection approprié, et le milieu de culture approprié pour la mise en #uvre dudit procédé.
La présente invention concerne un nouveau procédé d'isolement et/ou de sélection de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat en méthionine ou ses dérivés, comme l'acide 2-hydroxy 4-(methylthio) butanoïque ou ses sels, en particulier hydrolysant des groupements amides en acides carboxyliques, ou impliqués dans la bioconversion de groupements nitriles en acides carboxyliques correspondants, au moyen d'un crible de sélection approprié, et le milieu de culture approprié pour la mise en #uvre dudit procédé.
Les enzymes catalysant l'hydrolyse de groupements nitriles en acides carboxyliques correspondants et ions ammoniums sont les nitrilases (Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Verlag, Berlin Heidelberg , 1992, ISBN3-540-55762-8). Toutefois, cette bioconversion des groupements nitriles en acides carboxyliques correspondants, dont le bilan final consiste en une hydrolyse des groupements nitriles peut aussi être réalisée en deux étapes, la première étape consistant en la conversion des nitriles en amides correspondants par une nitrile hydratase, la deuxième étape consistant à hydroliser les amides obtenus en acides carboxyliques correspondants par des amidases.
Les nitrilases furent découvertes d'abord chez les plantes (Thimann and Mahadevan, 1964, Arch. Biochem. Biophys. 105 : 133-141) puis isolées chez de nombreux représentants de la microflore du sol (Kobayashi et Shimizu, 1994, FEMS Microbiology Letters 120 : 217-224) : Pseudomonas, Nocardia, Arthrobacter, Fusarium, Rhodoccocus, Alcaligenes. Plus récemment, des nitrilases ont été caractérisées chez des bactéries thermophiles (Cramp et al., 1997, Microbiology, 143 : 2313-2320). Les nitrilases ont des spécificités de substrats variées mais peuvent être regroupées en trois groupes en fonction de leur spécificité: les nitrilases spécifiques des nitriles aliphatiques, celles spécifiques de nitriles aromatiques ou celles spécifiques d'arylacétonitriles (Kobayashi et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 247-251 ; Kobayashi et Shimizu, 1994, précité ; Lévy-Schil et al., 1995, Gene 161 : 15-20). Les nitrilases ont un intérêt en biocatalyse car de nombreux procédés de synthèse mettent en jeu des hydrolyses de groupements nitriles (Lévy-
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Schil et al.). En particulier, la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC9750 et celle de
Comamonas testosteroni peuvent être utilisées pour accéder à l'hydroxy-analogue de la méthionine (FR9411301, W09609403, FR9613077).
Comamonas testosteroni peuvent être utilisées pour accéder à l'hydroxy-analogue de la méthionine (FR9411301, W09609403, FR9613077).
Il est courant, lorsque l'on cherche de nouvelles enzymes, d'utiliser plusieurs stratégies (Dalboge et Lange, 1998, TibTech 16 : 265-272) : i) isolement microbiologique de micro-organismes à partir de biotopes spécifiques en utilisant un crible de sélection basé sur la présence de l'activité enzymatique recherchée, ii) recherche d'une activité enzymatique dans des micro-organismes par culture des souches et dosage de l'activité en question, iii) recherche, dans des micro-organismes cultivables, de gènes silencieux et homologues à un gène d'intérêt puis clonage et expression de ce gène dans un micro-organisme modèle, iv) ingénierie de protéines pour améliorer les caractéristiques d'une enzyme disponible et enfin v) clonage par expression de gènes directement isolés de biotopes variés sans isolement microbiologique préalable. Les stratégies i), iii), iv), et v) sont considérablement accélérées et simplifiées si un crible de sélection in vivo est disponible. Par crible de sélection in vivo, on entend un milieu et/ou des conditions de croissance qui ne permettent la croissance que des micro-organismes hébergeant l'activité enzymatique recherchée.
De plus, compte tenu de la très faible proportion de micro-organismes cultivables en laboratoire (Amann et al., 1995, Microbiol Rev., 59,143), les stratégies iv) et v) sont particulièrement intéressantes pour tirer un meilleur parti de la biodiversité en ciblant la biodiversité disponible mais non accessible par isolement microbiologique (stratégie v) ou en créant plus de diversité à partir de souches cultivables (stratégie iv). C'est particulièrement pour ces deux stratégies que la possibilité de disposer d'un crible de sélection in vivo simple à mettre en #uvre représente un avantage certain qui conduit à cribler un nombre de clones important en un court délai et le cas échéant avec des moyens limités (Minshull, 1998, Evolution of enzyme activities and substrate preferences by DNA shuffling , IBC's second International Symposium on Directed Evolution ofIndustrial Enzymes, Sept 14-15, San Diego ; Grayling, 1998, Concepts and Strategies in high throughput screening for improved enzyme variants , IBC's second International
Symposium on Directed Evolution ofindustrial Enzymes, Sept 14-15, San Diego).
Symposium on Directed Evolution ofindustrial Enzymes, Sept 14-15, San Diego).
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L'invention consiste en une méthode simple, rapide et peu coûteuse permettant d'isoler et/ou sélectionner des séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat en en sel de méthionine (AMTBS) ou ses dérivés comme l'acide 2-hydroxy 4-(methyl thio) butanoïque (ciaprès HMTBS), en particulier le sel d'ammonium, et notamment impliquées dans la bioconversion du 2-amino 4-(méthyl thio) butyronitrile (AMTBN) ou ses dérivés, comme le 2-hydroxy 4-(methyl thio) butyronitrile (ci-après HMTBN) en méthionine ou ses dérivés comme l'HMTBS, soit directement, soit par l'intermédiaire du 2amino 4-méthyl thio butanamide ou ses dérivés, comme le 2-hydroxy 4-méthyl thio butanamide (ci-après HMTBAmide).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les enzymes sont impliquées dans la bioconversion d'un substrat approprié en HMTBS, les substrats appropriés étant l'HMTBN ou l'HMTBAmide.
Par souci de clarté, le reste de la description a été rédigée avec l'HMTBS, l'HMTBN ou l'HMTBAmide. Toutefois, dans la description qui suit, les indications relatives à l'HMTBS, l'HMTBN ou l'HMTBAmide s'applique également à la méthionine ou ses dérivés, et les substrats correspondants, le 2-amino 4-(méthyl thio) butyronitrile ou ses dérivés et le 2-amino 4-méthyl thio butanamide ou ses dérivés.
En clonant de telles séquences dans un plasmide permettant l'expression de ces nitrilases chez un mutant d'un micro-organisme auxotrophe pour la méthionine, on peut alors sélectionner les seules souches qui ont intégré une enzyme active impliquée dans la bioconversion du substrat en HMTBS, le micro-organisme auxotrophe pour la méthionine étant capable de croître en présence d'HMTBS, obtenu par bioconversion, en l'absence de méthionine dans le substrat. Cette stratégie conduit donc à des cultures enrichies en clones exprimant des enzymes actives, voire à des cultures enrichies en clones exprimant des enzymes dont les propriétés catalytiques ont été améliorées par mutagenèse dirigée ou aléatoire.
La présente invention concerne donc un procédé de sélection et/ou d'isolement de séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion d'un substrat approprié en méthionine et ses dérivés, comme l'HMTBS, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de
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1) clonage de séquences d'ADN dans un vecteur permettant leur expression dans un micro-organisme hôte approprié,
2) transformation d'un micro-organismes approprié auxotrophe pour la méthionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit micro-organisme approprié,
3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, et
4) sélection des micro-organismes transformés capables de croître dans le milieu approprié, et
5) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
2) transformation d'un micro-organismes approprié auxotrophe pour la méthionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit micro-organisme approprié,
3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, et
4) sélection des micro-organismes transformés capables de croître dans le milieu approprié, et
5) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le substrat approprié le 2-hydroxy 4- (methylthio) (ci-après HMTBN) qui est converti en HMTBS, soit directement par une nitrilase, soit par l'intermédiaire du 2-hydroxy 4- (methylthio) butanamide (ci-après HMTBAmide), cette deuxième voie impliquant une première conversion de l'HMTBN en HMTBAmide par une nitrile hydratase, suivie d'une conversion de l'HMTBAmide par une amidase. Dans le premier cas, la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée par le procédé selon l'invention code pour une nitrilase. Dans le deuxième cas, la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée par le procédé selon l'invention code pour une nitrile hydratase ou une amidase.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, le substrat approprié est l'HMTBAmide, qui est converti en HMTBS par une amidase, codée par la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée par le procédé selon l'invention.
Par isolement, on entend essentiellement selon l'invention la séparation d'une séquence particulière à partir d'un ensemble de séquences variées. Par sélection, on entend essentiellement selon l'invention le choix de la meilleure séquence présentant une propriété particulière.
Une fois les micro-organismes sélectionnés et/ou isolés, ils peuvent être cultivés sur un milieu de culture usuel pour en augmenter le nombre et faciliter l'isolement et l'identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
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Par micro-organisme approprié auxotrophe pour la méthionine, on entend selon l'invention tout micro-organisme auxotrophe pour la méthionine capable d'être transformé et susceptible de croître sur un milieu exempt de méthionine comprenant de l'HMTBS. Il peut s'agir d'une levure, d'un champignon ou d'une bactérie. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le micro-organisme approprié est une bactérie, de préférence E. coli.
Le micro-organisme approprié utile selon l'invention peut être naturellement auxotrophe pour la méthionine, ou encore modifié de manière à induire cette auxotrophie par mutagenèse. Les différentes méthodes d'obtention de mutants auxotrophes sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature (notamment Roberts CJ, Selker EU, Nucleic Acids Res, 1995 Dec 11
23 :23 4818-26; McAdam RA & al., Infect Immun, 1995 Mar 63:3 1004-12;
Manning M & al., Can J Microbiol 1984 Jan 30:1 31-5 ; Yamagata S, J Bacteriol,
1987 Aug 169:8 3458-63 ; Wabiko H & al., J Bacteriol, 1988 Jun 170 :6 2705-10 ; Frank P & al., J Biol Chem, 1985 May 10 260 :9 Le micro-organisme approprié transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en acide carboxylique correspondant, est capable de convertir l'HMTBN en HMTBS, permettant au micro-organisme auxotrophe pour la méthionine de se développer. Dans ce cas, le micro-organisme assure la bioconversion de l'HMTBS en méthionine pour permettre à la souche de croître.
23 :23 4818-26; McAdam RA & al., Infect Immun, 1995 Mar 63:3 1004-12;
Manning M & al., Can J Microbiol 1984 Jan 30:1 31-5 ; Yamagata S, J Bacteriol,
1987 Aug 169:8 3458-63 ; Wabiko H & al., J Bacteriol, 1988 Jun 170 :6 2705-10 ; Frank P & al., J Biol Chem, 1985 May 10 260 :9 Le micro-organisme approprié transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en acide carboxylique correspondant, est capable de convertir l'HMTBN en HMTBS, permettant au micro-organisme auxotrophe pour la méthionine de se développer. Dans ce cas, le micro-organisme assure la bioconversion de l'HMTBS en méthionine pour permettre à la souche de croître.
Le micro-organisme approprié transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion del'HMTBAmide en acide carboxylique correspondant, est capable de convertir l'HMTBAmide en HMTBS, permettant au micro-organisme auxotrophe pour la méthionine de se développer.
Lorsque le micro-organisme approprié auxotrophe pour la méthionine comprend également un gène codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBAmide en HMTBS, et lorsque ce micro-organisme est transformé avec un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBAmide, il est capable de convertir l'HMTBN en HMTBS, lui permettant de se développer.
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Selon un premier mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBS est une nitrilase permettant la conversion de l'HMTBN en HMTBS nécessaire à la croissance des micro-organismes modifiés.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBS est une nitrile hydratase permettant la conversion de l'HMTBN en HMTBAmide, le microorganisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une amidase complémentaire assurant la bioconversion de l'HMTBAmide en HMTBS nécessaire à la croissance des micro-organismes modifiés.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBN en HMTBS est une amidase, le micro-organisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une nitrile hydratase complémentaire.
Dans les deux cas ci-dessus, le gène de l'enzyme complémentaire, s'il est hétérologue est soit intégré dans le génome du micro-organisme approprié, soit porté par un plasmide.
Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'enzyme isolée et/ou sélectionnée impliquée dans la bioconversion de l'HMTBamide en HMTBS est une amidase, et le milieu de culture approprié contient de l'HMTBAmide.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée d'un ou de plusieurs génomes, par restriction totale ou partielle dudit ou desdits génomes. La séquence d'ADN peut également être une séquence d'ADN isolée d'une partie de génome par restriction totale ou partielle de ladite partie de génome. Par restriction, on entend tout moyen, enzymatique ou non, susceptible de fragmenter de l'ADN, de manière spécifique ou non. Le procédé selon l'invention est dans ce cas particulièrement approprié pour la sélection de nouvelles enzymes selon les stratégies i) et v) définies auparavant.
La séquence d'ADN peut également être une séquence d'ADN isolée à partir d'une construction par PCR (Polymerase Chain Reaction).
La séquence d'ADN peut aussi être obtenue par mutagenèse aléatoire ou ciblée d'une séquence codant pour une enzyme de référence définie précédemment.
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Dans ce cas, la procédé selon l'invention est particulièrement approprié pour la sélection de nouvelles enzyme selon la stratégie iv) définie auparavant.
La séquence d'ADN peut également être une séquence d'ADN isolée présentant une homologie déterminée avec une enzyme de référence définie précédemment. Ce degré d'homologie déterminé est avantageusement supérieur à 50 %, préférentiellement supérieur à 60 %, plus préférentiellement supérieur à 70 %.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention constitue un crible rapide à mettre en #uvre pour identifier dans quelle mesure une séquence d'acide nucléique présentant un certain niveau d'homologie avec une séquence de référence, a la même fonction et/ou la même activité que la séquence de référence.
Par enzyme de référence, on entend selon l'invention une enzyme connue impliquée dans la bioconversion du substrat approprié en HMTBS, en particulier de l'HMTBN en HMTBS ou dans la bioconversion de l'HMTBAmide en HMTBS, de préférence une nitrilase, une nitrile hydratase ou une amidase, définie auparavant, qui servira de référence pour évaluer la fonction et l'activité des nouvelles enzymes isolées et/ou sélectionnées par le procédé selon l'invention, notamment les enzymes pour lesquelles on cherche de nouveaux mutants et/ou celles présentant un certain degré d'homologie défini auparavant.
La culture des micro-organismes transformés pour le procédé d'isolement et/ou de sélection selon l'invention est effectuée par tout moyen approprié connu de l'homme du métier. Il s'agit notamment d'une culture en masse (batch), en particulier par des cultures successives, ou par des cultures en continu, en particulier des cultures en chemostat (Seegers JF & al., Plasmid, 1995 Jan 33 :1 71-7 ; Weikert C & al., Microbiology, 1997 May 143 ( Pt 5): 1567-74 ; Tsen SD & al., Biochem Biophys Res Commun, 1996 Jul 16 224 :2 351-7 ; Tsen SD, Biochem Biophys Res Commun, 1990 Feb 14 166:3 1245-50 ; Berg OG , J Theor Biol, 1995 Apr 7 173:3 307-20).
Par milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante de substrat approprié, on entend de préférence selon l'invention tout milieu de culture approprié pour la croissance du micro-organisme transformé auxotrophe pour la méthionine, ledit milieu étant substantiellement exempt de méthionine, et comprenant une
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quantité suffisante de substrat approprié pour permettre la croissance dudit micro- organisme transformé après bioconversion dudit substrat approprié en HMTBS.
Par milieu substantiellement exempt de méthionine, on entend un milieu exempt de méthionine ou comprenant éventuellement une quantité de méthionine insuffisante pour permettre la croissance du micro-organisme approprié auxotrophe pour la méthionine.
La quantité suffisante d'HMTBN est avantageusement comprise entre 0 et 60 g/1 (équivalent d'environ 400 mM), plus préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et
17 mg/1 (équivalent d'environ 20 M et environ 100 M), plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1 (équivalent d'environ 40 M et environ 60 M).
17 mg/1 (équivalent d'environ 20 M et environ 100 M), plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1 (équivalent d'environ 40 M et environ 60 M).
La quantité suffisante d'HMTBAmide est avantageusement comprise entre 0 et 60 g/1 (équivalent de environ 400 mM), plus préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et 17 mg/1 (équivalent d'environ 20 M et environ 100 M), plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1 (équivalent d'environ 40 M et environ 60 M).
Il est entendu que pour le procédé et le milieu selon l'invention, la source essentielle d'HMTBS nécessaire à la croissance des micro-organismes transformés est constituée par l'HMTBS produit de la conversion du substrat approprié, en particulier de l'HMTBN ou de l'HMTBAmide, par l'enzyme codée par la séquence d'ADN introduite dans le micro-organisme transformé. Toutefois, en fonction du micro-organisme considéré et du niveau de sélection recherché, le milieu selon l'invention peut également comprendre initialement (préalablement et au moment de l'inoculation avec les micro-organismes transformés) une quantité appropriée d'HMTBS, notamment pour permettre d'amorcer la croissance des microorganismes, cette quantité d'HMTBS étant remplacée au fur à mesure de la croissance des micro-organismes par l'HMTBS issu de la conversion du substrat approprié, en particulier HMTBN ou HMTBAmide. De manière avantageuse, l'HMTBS est présent dans le milieu à une concentration inférieure à la concentration suffisante pour permettre la croissance des micro-organismes transformés selon l'invention. Cette concentration pourra être déterminée en fonction du milieu de culture approprié, en particulier de sa forme (bacth, liquide en continu, solide, etc.), et sera de préférence inférieure à 350 g/l (équivalent de environ 2 M plus
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préférentiellement inférieure à 250 g/l (équivalent de environ 1,5 M), plus
préférentiellement comprise entre 130 ug/1 et 170 aug/1. (équivalent de environ 0,8 M et environ 1 M).
préférentiellement comprise entre 130 ug/1 et 170 aug/1. (équivalent de environ 0,8 M et environ 1 M).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le milieu approprié comprend une source d'azote organique ne comprenant pas de traces de méthionine.
De manière avantageuse, la source d'azote organique est un extrait de levure, en particulier du Yeats Nitrogen Broth w/o Amino Acids (YNB, Yeats Nitrogen Broth w/o Amino Acids, DIFCO, composition donnée dans DIFCO Manual, Tenth edition, ISBN 9-9613169-9-3,1984, page 1136) ou du Casamino acids (Casamino Acids, Difco, composition donnée dans DIFCO Manual, Tenth edition, ISBN 9- 9613169-9-3, 1984, page 208).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la teneur en source d'azote organique, plus préférentiellement en YNB, est comprise entre 0 et 15 g/1, plus préférentiellement comprise entre 2 et 10 g/1, encore plus préférentiellement entre 3 et 8 g/1.
Avantageusement, le milieu approprié selon l'invention comprend du M9fru décrit plus loin comme milieu minimum.
Avantageusement, le milieu approprié selon l'invention comprend comme source de carbone un composé choisi parmi le glucose, le fructose, le galactose, le trehalose, le mannose, le melibiose, le sucrose, le raffinose, le maltotriose, le maltose, le lactose, le lactulose, l'arabinose, le xylose, le rhamnose, le fucose, le mannitol, le sorbitol, le malate, le saccharate, le mucate, le mesotartrate, le glucuronate, le galacturonate et leurs mélanges en toutes proportions. De manière préférentielle, la source de carbone est choisie parmi le glucose ou le fructose, et leurs mélanges en toutes proportions, plus préférentiellement le fructose.
Le milieu de culture selon l'invention peut être liquide ou solide, et dans ce cas peut contenir de l'agar ou de l'agarose.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat.
La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans
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"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans
Molecular cloning, T.Maniatis, E. F.Fritsch, J.Sambrook (1982).
Molecular cloning, T.Maniatis, E. F.Fritsch, J.Sambrook (1982).
Légende des figures
La figure 1 représente le plasmide RPA-BIOCAT41. Les sites entre parenthèse sont des sites qui ont été éliminés lors des clonages. Ptrp : tryptophane ; nitB : gène de la nitrilase ; TrrnB : terminateurs de transcription ; fin
ROP : fin du gène codant pour la protéine ROP (Chambers et al., 1988, Gene 68 :
139-149) ; ORI : origine de réplication ; RNAI/II : ARN impliqués dans la réplication ( Chambers et al., précité); Tc : gène de resistance à la tétracycline.
La figure 1 représente le plasmide RPA-BIOCAT41. Les sites entre parenthèse sont des sites qui ont été éliminés lors des clonages. Ptrp : tryptophane ; nitB : gène de la nitrilase ; TrrnB : terminateurs de transcription ; fin
ROP : fin du gène codant pour la protéine ROP (Chambers et al., 1988, Gene 68 :
139-149) ; ORI : origine de réplication ; RNAI/II : ARN impliqués dans la réplication ( Chambers et al., précité); Tc : gène de resistance à la tétracycline.
La figure 2 montre la croissance à 37 C, 200 tours/min et en tube de 50 ml hermétiquement clos, des deux souches RPA-BIOCAT 610 et 842 par lecture des densités optiques en micro-plaques à 630nm. En A) : croissance des souches RPABIOCAT 610 et 842 en milieu minimum M9YNBfru + HMTBN 50 M exempt d'HMTBS ; en B) : croissance des souches RPA-BIOCAT 610 et 842 en milieu minimum M9YNBfru + HMTBN 50 M complémenté en HMTBS 10 M.
La figure 3 montre la croissance des souches RPA-BIOCAT 841 et 842 en milieu sélectif: A. avec une concentration limitante en HMTBS de 0.8 M; B. avec une concentration limitante en HMTBS de 1 M. Les milieux sélectifs sont constitués par le milieu minimal M9YNBfru + IPTG 0. 5 mM supplémenté en : HMTBS 0.8 M (S0.8) ou en HMTBS 1 M (SI), ou en HMTBN 50 M + HMTBS 0. 8 M (NS0.8) ou encore en HMTBN 50 M + HMTBS 1 M (NS1).
La figure 4 montre la croissance des souches RPA-BIOCAT 841 et 960 en milieu sélectif: A. en présence d'HMTBS 0. 8 uM ; B. en présence d'HMTBS 1 M.
Les milieux sélectifs sont constitués par le milieu minimal M9YNBfru + IPTG 0.5 mM supplémenté en : HMTBS 0.8 M (S0.8) ou en HMTBS 1 M (SI), ou en HMTBN 50 M + HMTBS 0.8 M (NS0.8) ou encore en HMTBN 50 M +
HMTB S 1 p.M (NS 1 ). Méthodes :
HMTB S 1 p.M (NS 1 ). Méthodes :
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Les techniques mises en oeuvre sont des techniques classiques de biologie moléculaire et de microbiologie, connues de l'homme de l'art et décrites par exemple par Ausubel et al., 1987 (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York), Maniatis et al., 1982, (Molecular Cloning : a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, New York).
Le milieu minimal M9fru a la composition suivante : Na2HP04 7g/l, KHzP04 3g/l, NaCI 0. 6 g/1, NH4C1 1 g/1, fructose, 4 g/l, MgS04 1 mM, CaCl2 0. 1 mM, thiamine 10 g/ml. Le milieu minimal M9YNBfru correspond au milieu M9fru supplémenté en YNB (Yeast Nitrogen Base, Difco) à une concentration finale de 5 g/l. Ce milieu s'élabore à partir des solutions mères suivantes préalablement
stérilisées : M9 salts xl0 (Na2HP04 70g/1, KH2pO, 30g/l, NaCl 6 g/1, NH4C1 10 g/1, autoclavé), fructose 20% filtré, YNB 20% filtré, MgS04 100 mM autoclave, CaClz 10 mM autoclavé, thiamine 1% filtrée.
stérilisées : M9 salts xl0 (Na2HP04 70g/1, KH2pO, 30g/l, NaCl 6 g/1, NH4C1 10 g/1, autoclavé), fructose 20% filtré, YNB 20% filtré, MgS04 100 mM autoclave, CaClz 10 mM autoclavé, thiamine 1% filtrée.
Les solutions mères d'HMTBN (59 mM), d'HMTBS (1. 3 mM) et d'HTBAmide (100 mM) utilisées pour l'élaboration du milieu sélectif sont effectuées par dilutions en M9YNBfru de solutions stocks de ces produits à des concentrations respectives de 5. 9 M (référence Rhône-Poulenc du lot : PHM 439 J) et 1.3 M (référence Rhône-Poulenc du lot : BFR81). Ces solutions sont préparées selon un protocole décrit dans les brevets et demandes de brevet EP 330 521, EP 142 488, US 3 773 927 et US 4 353 924. L'HMTBamide est obtenu par hydrolyse à l'acide sulfurique de la cyanhydrine aminée (CH3SCH2CH2CHNH2CN) décrit dans les même brevets et demandes de brevet.
Les précultures sont effectuées dans 3 ml de milieu riche LB (tryptone 10 g/1, extrait levurien 5 g/1, NaCl 10 g/1, pH 7.0) en présence des antibiotiques appropriés, si nécessaire, par ensemencement à partir d'un stock glycérolé de la souche concernée. La préculture est incubée à 37 C, 200 tours/min pendant 6 à 7 heures.
Les cultures d'expression des souches RPA-BIOCAT 841 et 842 sont réalisée par dilution au 1/100ème d'une préculture dans 10 ml de LB + carbenicilline 100 g/ml + IPTG 0. 5 mM. Ces cultures sont incubées à 37 C, 200 tours/min en tube de 50 ml hermétiquement clos pendant 16h. Les biomasses sont estimées par mesure de la densité optique à 660 nm (D0660) en prenant comme relation biomasse en gramme de poids sec par litre de culture = D0660 x 0,35.
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Le dosage d'activité nitrilasique des cultures s'effectue comme suit : les cultures d'expression sont centrifugées et le culot cellulaire lavé dans du tampon phosphate 100 mM. Il est remis en suspension dans ce même tampon et 200 fil de suspension cellulaire sont incubés avec 200 l d'HMTBN 200mM (en solution dans du tampon phosphate 100 mM) pendant 2 h à 37 C. A intervalle de temps de 0,30, 60,90 et 120 min, un échantillon de 5 l du milieu réactionnel est prélevé et mélangé
à 50 III d'H3P04 200 mM. A ces 55 iii sont ajoutés 105 III d'une solution phénol 5.1%-NaOH 2. 54 N, puis, après mélange, 40 l d'une solution de Javel 47/50 C (Hypochloryte de sodium en solution à 12,5%, Dousselin & Geoffray Jacquet réunis, Couzon aux Monts d'Or, France), diluée au demi. Après agitation suivie d'une incubation de 10 min à température ambiante, les densités optiques sont lues à 630 nm. Le calcul de la quantité d'HMTBS libéré est réalisé par comparaison à une gamme étalon d'HMTBS préparée dans du tampon phosphate 100 mM en présence d'HMTBN selon le tableau ci dessous.
à 50 III d'H3P04 200 mM. A ces 55 iii sont ajoutés 105 III d'une solution phénol 5.1%-NaOH 2. 54 N, puis, après mélange, 40 l d'une solution de Javel 47/50 C (Hypochloryte de sodium en solution à 12,5%, Dousselin & Geoffray Jacquet réunis, Couzon aux Monts d'Or, France), diluée au demi. Après agitation suivie d'une incubation de 10 min à température ambiante, les densités optiques sont lues à 630 nm. Le calcul de la quantité d'HMTBS libéré est réalisé par comparaison à une gamme étalon d'HMTBS préparée dans du tampon phosphate 100 mM en présence d'HMTBN selon le tableau ci dessous.
<tb>
<tb>
<tb>
Echantillon <SEP> [HMTBS] <SEP> [HMTBN]
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> mM <SEP> 100 <SEP> mM
<tb> 2 <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 99 <SEP> mM
<tb> 3 <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 95 <SEP> mM
<tb> 4 <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 90 <SEP> mM
<tb> 5 <SEP> 20 <SEP> mM <SEP> 80 <SEP> mM
<tb> 6 <SEP> 50 <SEP> mM <SEP> 50 <SEP> mM
<tb> 7 <SEP> 80 <SEP> mM <SEP> 20 <SEP> mM
<tb> 8 <SEP> 100 <SEP> mM <SEP> 0 <SEP> mM
<tb>
Les activités sont exprimées en kg d'HMTBS produit/ heure/ kg de cellules sèches (CS).
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> mM <SEP> 100 <SEP> mM
<tb> 2 <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 99 <SEP> mM
<tb> 3 <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 95 <SEP> mM
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<tb> 6 <SEP> 50 <SEP> mM <SEP> 50 <SEP> mM
<tb> 7 <SEP> 80 <SEP> mM <SEP> 20 <SEP> mM
<tb> 8 <SEP> 100 <SEP> mM <SEP> 0 <SEP> mM
<tb>
Les activités sont exprimées en kg d'HMTBS produit/ heure/ kg de cellules sèches (CS).
Exemples Exemple 1 : Construction du plasmide pRPA-BCAT41.
Le fragment de 1. 27 kb contant le promoteur Ptrp, le site de fixation du ribosome du gène cII du phage X (RBScII) et le gène de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC8750 (nitB) a été extrait du plasmide pRPA-BCAT6 (Demande FR 96/13077) à l'aide des enzymes de restriction EcoRI et XbaI pour être cloné dans le vecteur pXL642 (décrit dans la demande CIP N 08/194,588) ouvert par les mêmes enzymes de restriction. Le plasmide résultant, pRPA-BCAT15 a été ouvert par les enzymes StuI et BsmI et le fragment de 4,3 kb a été ligaturé avec le fragment StuI-
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BsmI de 136 bp purifié de pRPA-BCAT4 (Demande FR 96/13077) pour conduire au plasmide pRPA-BCAT19. Le séquençage partiel de pRPA-BCAT19 a confirmé le remplacement du codon du résidu Asp279 de la nitrilase par le codon d'un résidu Asn279. Le fragment de 1,2 kb EcoRI-XbaI de pRPA-BCAT19 contenant la fusion Ptrp : :RBScII : :nitB a été ensuite cloné dans le vecteur pRPA-BCAT28 ouvert par les mêmes enzymes pour conduire au plasmide pRPA-BCAT29 de 6,2 kb. Le vecteur pRPA-BCAT28 a été obtenu en ligaturant le fragment de 3,9 kb SspI-ScaI de pXL642 (demande CIP N 08/194,588) avec le fragment de 2,1 kb SmaI de pHP45QTc (Fellay et al., 1987, Gene 52 : 147-154) afin de remplacer le marqueur de résistance à l'ampicilline par le marqueur de résistance à la tétracycline. En détruisant le site NdeI proche de l'origine de réplication du plasmide pRPA-BCAT29 par digestion partielle NdeI et action de la polymérase I d'E. coli (Fragment de Klenow), le plasmide pRPA-BCAT41 a été obtenu dont une carte est représentée sur la figure 1. La séquence de la cassette d'expression est représentée par l'identificateur de séquence n 1 (SEQ ID NO 1).
Exemple 2 : Construction du plasmide pRPA-BCAT77.
Une portion du gène nitB a été amplifié par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pRPA-BCAT41, les amorces PCRAFI décrite dans la demande FR96/13077 et NitB 160 décrite ci dessous et l'enzyme Pfu (Stratagene).
NitB 160 : 5'-GGGGAGAGGT GCTCCCAGCA GCACAGGCCA CCGACGGG-3' Le programme utilisé comprenait un cycle de 5 min à 95 C, 5 cycles de 1 min à 95 C ; 1 min à 60 C ; 1 min à 72 C, 30 cycles de 30 sec à 95 C ; 30 sec à 60 C ; 30 sec à 72 C et une séquence de 5 min à 72 C. Le fragment d'environ 0,495 bp ainsi amplifié a été digéré par les enzymes NdeI et BsiHKAI (New England Biolabs). Il a ensuite été ligaturé au fragment de 0,261 kb BsiHKAI-StuI purifié d'une digestion du plasmide pRPA-BCAT41 et au fragment NdeI-StuI de 5,43 kb purifié d'une digestion de pRPA-BCAT72. Le vecteur pRPA-BCAT72 a été obtenu en éliminant du vecteur pRPA-BCAT41, par digestion Xcml et religature, le fragment Xcml d'environ 0,55 kb. Le plasmide résultant de ce clonage a été appelé pRPA-BCAT77. Il correspond au plasmide pRPA-BCAT41 mais permet d'exprimer une nitrilase NitB portant une substitution du résidu Alanine en position 160 par un résidu glycine
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Exempte 3 : Construction d'une souche d'E. coli auxotrophe exprimant la
nitrilase d'Afcaligellesfaecalis à partir du promoteur Ploc'
Le gène de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC8750 a été amplifié par
PCR en utilisant, comme matrice, le plasmide pRPA-BCAT77, les amorces nitBMNl et nitBMN2 décrites ci-dessous et la polymerase Pfu (Stratagene). nitBMNI 5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3' nitBMN2: 5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3'
Le programme utilisé comprenait un cycle de 5 min à 95 C, 5 cycles de 1 min à
95 C ; 1 min à 50 C ; 1 min à 72 C, 30 cycles de 30 sec à 95 C ; 30 sec à 50 C ; 30 sec à 72 C et une séquence de 5 min à 72 C. Le fragment d'environ 1,2 kb obtenu a ensuite été digéré par l'enzyme XbaI pour être cloné dans le vecteur pbsII ks- (Stratagene) ouvert par les enzymes EcoRV et XbaI. Le plasmide obtenu, pRPA-
BCAT105, a ensuite été introduit dans la souche E. coli RPA-BIOCAT610. Cette souche contient une délétion dans le gène metA et correspond à la souche ss180 décrite dans Richaud et al. (J Biol. Chem. (1993) 268 : 26827-26835).Un clone a été sélectionné et cultivé en 3 exemplaires en LB dans les conditions d'expression décrites ci-dessus. L'activité nitrilase a été mesurée sur les culots cellulaires obtenus comme décrit ci-dessus et trouvé après moyenne à 2.5 kg/h.kg CS contre 0 kg/h.kg
CS pour la souche RPA-BIOCAT 842 décrite dans l'exemple 4 et cultivée dans les mêmes conditions. Cette nouvelle souche exprimant une nitrilase active a été nommée RPA-BIOCAT 841.
nitrilase d'Afcaligellesfaecalis à partir du promoteur Ploc'
Le gène de la nitrilase d'Alcaligenes faecalis ATCC8750 a été amplifié par
PCR en utilisant, comme matrice, le plasmide pRPA-BCAT77, les amorces nitBMNl et nitBMN2 décrites ci-dessous et la polymerase Pfu (Stratagene). nitBMNI 5'-TTGTTATCTA AGGAAATACT TA-3' nitBMN2: 5'-CGACTCTAGA ACTAGTGGAT CC-3'
Le programme utilisé comprenait un cycle de 5 min à 95 C, 5 cycles de 1 min à
95 C ; 1 min à 50 C ; 1 min à 72 C, 30 cycles de 30 sec à 95 C ; 30 sec à 50 C ; 30 sec à 72 C et une séquence de 5 min à 72 C. Le fragment d'environ 1,2 kb obtenu a ensuite été digéré par l'enzyme XbaI pour être cloné dans le vecteur pbsII ks- (Stratagene) ouvert par les enzymes EcoRV et XbaI. Le plasmide obtenu, pRPA-
BCAT105, a ensuite été introduit dans la souche E. coli RPA-BIOCAT610. Cette souche contient une délétion dans le gène metA et correspond à la souche ss180 décrite dans Richaud et al. (J Biol. Chem. (1993) 268 : 26827-26835).Un clone a été sélectionné et cultivé en 3 exemplaires en LB dans les conditions d'expression décrites ci-dessus. L'activité nitrilase a été mesurée sur les culots cellulaires obtenus comme décrit ci-dessus et trouvé après moyenne à 2.5 kg/h.kg CS contre 0 kg/h.kg
CS pour la souche RPA-BIOCAT 842 décrite dans l'exemple 4 et cultivée dans les mêmes conditions. Cette nouvelle souche exprimant une nitrilase active a été nommée RPA-BIOCAT 841.
Exemple 4: Construction d'une souche d'E. coli auxotrophe exprimant la nitrilase d'Alcaligenes faecalis inactive à partir du promoteur Ploc' Le gène d'un variant de la nitrilase NitB a été amplifié comme décrit dans l'exemple 3 en utilisant comme matrice le plasmide pRPA-BCAT69. Le plasmide pRPABCAT69 correspond au vecteur pRPA-BCAT41 mais contient une mutation dans le gène nitB qui conduit au remplacement du résidu Cystéine 163 de la nitrilase NitB par un résidu Alanine. Le plasmide pRPA-BCAT69 a été obtenu comme suit. Après amplification par PCR sur la matrice pRPA-BCAT41 avec les amorces PCRAFI décrite dans la demande FR96/13077 et NitB 1 décrit ci-dessous, le produit amplifié a été digéré par NdeI et BanI pour obtenir un insert d'environ 0,476 kb.
NitBl : 5'-GCAGCACAGG GCACCGACGC-3'
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De même, après amplification par PCR sur la matrice pRPA-BCAT41 avec les amorces NitB2 et SR décrites ci-dessous, le produit amplifié a été digéré par BanI et Stul pour obtenir un insert d'environ 0,34 kb.
NitB2 : 5'-CGCGTCGGTG CCCTGTGCGC CTGGGAGC-3' SR : 5'-CGGCAATGAT CAGGCCTTCG GC-3' Après digestion du vecteur pRPA-BCAT72 par NdeI et StuI, le fragment de 5,43 kb a été ligaturé aux inserts de 0,476 kb NdeI-BanI et de 0,34 kb BanI-StuI décrits cidessus pour former le vecteur pRPA-BCAT69. Le produit d'amplification obtenu avec les amorces amorces nitBMNI et nitBMN2 et la matrice pRPA-BCAT69 a ensuité été cloné dans le vecteur pbsII ks- (Stratagene) comme décrit dans l'exemple 3. Le plasmide résultant, nommé pRPA-BCAT107, a été introduit dans la souche RPA-BIOCAT610 pour obtenir la nouvelle souche RPA-BIOCAT 842.
Exemple 5 : Construction d'une souche d'E. coli auxotrophe pour la méthionine exprimant la nitrilase active de Comamonas testosteroni à partir du promoteur Plac..
L'amplification par PCR d'un fragment de 1. 35 kb contenant le gène nitA de Comamonas testosteroni a été réalisée à l'aide du plasmide matrice pXL2158 (FR9613077), des amorces NitAl et NitA2 décrites ci-dessous et l'ADN polymérase Pfu.
NitAl :5'-GGGCATACAT TCAATCAATT G-3' NitA2 : 5'-AGGTGGGACC CAAGCTTGCA-3' Après purification au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25 :24 :1), dessalage à l'aide du kit QIAEX II (QIAGEN) et digestion par l'enzyme Hindlll, le fragment PCR a été ligué au plasmide pbsII ks- préalablement digéré par les enzymes HindIII et Hindi pour conduire au plasmide pBCAT145. Ce dernier a été introduit selon la méthode de Chung et al. (Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1988) 86 : 2172-2175) dans la souche RP-BIOCAT 610. La nouvelle souche ainsi obtenue a été nommée RPABIOCAT 960.
Exemple 6 : Croissance de mutants d'E. coli auxotrophes pour la méthionine en milieu minimum supplémenté en HMTBS.
Les souches RPA-BIOCAT 610 et 842 ont été précultivées en milieu LB additionné, uniquement pour la souche 842, d'IPTG 0.5 mM et de carbenicilline 100
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g/ml, lavées en milieu M9YNBfru et reprises dans un égal volume de ce même milieu. Les deux cultures ont ensuite été diluées au 1/100"" dans 10 ml des milieux suivants supplémentés en carbenicilline 100 g/ml et IPTG 0. 5 mM uniquement pour la souche RPA-BIOCAT 842 : i) M9YNBfru + HMTBN 50uM ii) M9YNBfru + HMTBN 50 M + HMTBS 10 M.. Ces cultures ont été réalisées en tube de 50 ml hermétiquement clos, à 37 C sous agitation de 200 tours/min et la croissance des souches, mesurée par densité optique de la culture à 630 nm lue en micro-plaque, est reportée sur la figure 2.
Les résultats montrent que l'HMTBS est utilisable comme source de méthionine par des souches d'E. coli auxotrophes pour la méthionine.
Exemple 7 : Influence du YNB, de l'HMTBN et de l'HMTBS sur la croissance, en milieu minimum, d'une souche d'E. coli auxotrophe pour la méthionine exprimant la nitrilase active d'Alcaligenes faecalis
Les souches RPA-BIOCAT 841 et 842 ont été précultivées en présence de carbenicilline 100 g/ml et d'IPTG 0. 5 mM, lavées comme il l'a été décrit à l'exemple 6 et diluées au 1/1000ème dans 5 ml des milieux cités dans le tableau 1, tous supplémentés en carbenicilline 100 g/ml et IPTG 0. 5 mM. Leur croissance a été estimée après 5 jours d'incubation à 37 C, 200 tours/min, en tube de 50 ml hermétiquement clos, par observation visuelle de la turbidité des cultures. Ces résultats sont regroupés dans le tableau 1.
Les souches RPA-BIOCAT 841 et 842 ont été précultivées en présence de carbenicilline 100 g/ml et d'IPTG 0. 5 mM, lavées comme il l'a été décrit à l'exemple 6 et diluées au 1/1000ème dans 5 ml des milieux cités dans le tableau 1, tous supplémentés en carbenicilline 100 g/ml et IPTG 0. 5 mM. Leur croissance a été estimée après 5 jours d'incubation à 37 C, 200 tours/min, en tube de 50 ml hermétiquement clos, par observation visuelle de la turbidité des cultures. Ces résultats sont regroupés dans le tableau 1.
Tableau 1 : des souches RPA-BIOCAT 841 et 842 en présence et absence de YNB
<tb>
<tb> Milieux <SEP> RPA-BIOCAT <SEP> 841 <SEP> RPA-BIOCAT <SEP> 842
<tb> M9fru
<tb> M9fru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> M9fru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M
<tb> M9fru <SEP> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M <SEP> - <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
<tb> Milieux <SEP> RPA-BIOCAT <SEP> 841 <SEP> RPA-BIOCAT <SEP> 842
<tb> M9fru
<tb> M9fru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> M9fru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M
<tb> M9fru <SEP> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M <SEP> - <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
<tb>
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> +
<tb> - <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M <SEP> - <SEP> -
<tb>
- : absence de croissance ; +: croissance.
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 50 <SEP> M <SEP> +
<tb> - <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M <SEP> - <SEP> -
<tb>
- : absence de croissance ; +: croissance.
Ces résultats montrent que le YNB constitue un supplément essentiel à la croissance de la souche d'E. coli auxotrophe pour la méthionine dans les conditions décrites en exemple.
Ces résultats montrent également que les milieux sélectifs testés ne permettent pas de différencier une souche d'E. coli AmetA exprimant une nitrilase active d'une souche exprimant cette enzyme sous forme inactive. La concentration en HMTBN de 50 M est trop faible pour fournir une source de méthionine suffisante pour la croissance d'E. coli.
Exemple 8: Détermination de la concentration minimum en HMTBS permettant la croissance des souches auxotrophes
La souche RPA-BIOCAT 841 a été précultivée en présence de carbenicilline 100 ug/ml et d'IPTG 0.5mM, lavée comme il l'a été décrit à l'exemple 6 et diluée au 1/1000ème dans 5 ml des milieux cités dans le tableau 2, tous supplémentés en carbenicilline 100 g/ml et IPTG 0. 5 mM. Leur croissance a été estimée après 5 jours d'incubation à 37 C, 200 tours/min, en tube de 50 ml hermétiquement clos, par observation visuelle de la turbidité des cultures. Ces résultats sont regroupés dans le tableau 2.
La souche RPA-BIOCAT 841 a été précultivée en présence de carbenicilline 100 ug/ml et d'IPTG 0.5mM, lavée comme il l'a été décrit à l'exemple 6 et diluée au 1/1000ème dans 5 ml des milieux cités dans le tableau 2, tous supplémentés en carbenicilline 100 g/ml et IPTG 0. 5 mM. Leur croissance a été estimée après 5 jours d'incubation à 37 C, 200 tours/min, en tube de 50 ml hermétiquement clos, par observation visuelle de la turbidité des cultures. Ces résultats sont regroupés dans le tableau 2.
Tableau 2 : Croissance de la souche RPA-BIOCAT 841 en présence d'HMTBS à faible concentration.
<tb>
<tb>
<tb>
Milieux <SEP> RPA-BIOCAT <SEP> 841 <SEP>
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 0 <SEP> M <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 0,8 <SEP> M <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 1 <SEP> M <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 2 <SEP> M <SEP> +
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 4 <SEP> M <SEP> +
<tb>
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 0 <SEP> M <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 0,8 <SEP> M <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 1 <SEP> M <SEP> - <SEP> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 2 <SEP> M <SEP> +
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 4 <SEP> M <SEP> +
<tb>
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<tb>
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 6 <SEP> M
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 10 <SEP> M <SEP> +
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M <SEP> +
<tb>
- : absence de croissance ; + : croissance.
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 6 <SEP> M
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBS <SEP> 10 <SEP> M <SEP> +
<tb> M9YNBfru <SEP> + <SEP> HMTBN <SEP> 50 <SEP> M <SEP> +
<tb>
- : absence de croissance ; + : croissance.
Ces résultats montrent que la concentration en HMTBS minimale nécessaire pour la croissance de la souche RPA-BIOCAT 841 est supérieure ou égale à 2 M.
Exemple 9 : Mise au point d'un milieu sélectif permettant la croissance d'une souche d'E. coli auxotrophe pour la méthionine exprimant la nitrilase active
d 'Alcaligelles faecalis.
d 'Alcaligelles faecalis.
Les souches RPA-BIOCAT 841 et 842 ont été précultivées en présence de carbenicilline 100 ug/ml et d'IPTG 0. 5 mM, lavées dans les conditions décrites à l'exemple 6 puis diluées au 1/100ème dans 10 ml de milieu sélectif M9YNBfru + IPTG 0. 5 mM contenant 0,8 ou 1 M HMTBS et 50 M HMTBN. La figure 3 montre la croissance de ces deux souches à 37 C, 200 tours/min en tubes de 50 ml hermétiquement clos, croissance mesurée par lecture des densités optiques en microplaques à 630 nm.
Les résultats montrent que le milieu sélectif M9YNBfru + IPTG 0. 5 mM + HMTBN 50 M + HMTBS 0. 8 ou 1 M permet de différencier une souche d'E. coli exprimant une nitrilase active d'une souche d'E. coli exprimant une nitrilase inactive.
Exemple 10 : Croissance de souches d'E. coli auxotrophes pour la méthionine exprimant des nitrilases actives sur hydroxy-methyl-thio-butyronitrile .
Les souches RPA-BIOCAT 841 et 960 ont été précultivées en présence de carbenicilline 100 g/ml et d'IPTG 0. 5 mM, lavées dans les conditions décrites à l'exemple 6 puis diluées au 1/100ème dans les milieux sélectifs de croissance décrits dans l'exemple 9. La figure 4 décrit la croissance de ces deux souches à 37 C, 200 tours/min en tubes de 50 ml hermétiquement clos, croissance mesurée par lecture des densités optiques en microplaques à 630 nm.
Les résultats montrent que le milieu décrit à l'exemple 9 est sélectif pour des souches auxotrophes pour la méthionine exprimant des nitrilases de deux origines différentes dans le système d'expression utilisant le promoteur Plac.
Claims (30)
1. Procédé de sélection et/ou d'isolement de séquences d'ADN codant pour des enzymes impliquées dans la bioconversion substrat approprié en méthionine et ses dérivés, comme l'HMTBS, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de
1) clonage de séquences d'ADN dans un vecteur permettant leur expression dans un micro-organisme hôte approprié,
2) transformation d'un micro-organismes approprié auxotrophe pour la méthionine par introduction des vecteurs obtenus précédemment dans ledit micro-organisme approprié,
3) culture des micro-organismes transformés obtenus précédemment dans un milieu de culture approprié comprenant une quantité suffisante
4) de substrat approprié,
5) sélection et/ou isolement des micro-organismes transformés capables de croître dans le milieu approprié, et
6) isolement et le cas échéant identification des séquences d'ADN impliquées dans la bioconversion du substrat approprié.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat approprié est le 2-amino 4- (méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme le 2hydroxy 4-(methylthio) butyronitrile (HMTBN).
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat approprié est converti directement en méthionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS, par une nitrilase.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une nitrilase.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le 2-amino 4- (méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme l'HMTBN, est converti en méthionine ou ses dérivés, comlme l'HMTBS par l'intermédiaire du 2-amino 4- (méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme le 2-hydroxy 4-(methylthio) butanamide (HMTBAmide), par une première conversion du 2-amino 4- (méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme l'HMTBN en 2-amino 4-(méthyl thio)
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butanamide ou ses dérivés, comme l'HMTBAmide par une nitrile hydratase, suivie d'une conversion du 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme l'HMTBAmide en méthionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS, par une amidase.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une nitrile hydratase ou une amidase.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une nitrile hydratase, le micro-organisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une amidase complémentaire.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée code pour une amidase, le micro-organisme approprié comprenant également un gène, naturel ou hétérologue codant pour une nitrile hydratase complémentaire.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat approprié est le 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme le l'HMTBAmide, qui est converti en méthionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS par une amidase.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence d'ADN isolée et/ou sélectionnée est une amidase.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le micro-organisme approprié auxotrophe pour la méthionine, est un micro-organisme auxotrophe pour la méthionine capable d'être transformé et susceptible de croître dans un milieu exempt de méthionine comprenant de l'HMTBS.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le microorganisme approprié est choisi parmi les levures, les champignons et les bactéries.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la bactérie est E. coli.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée d'un ou de plusieurs génomes, par restriction totale ou partielle dudit ou desdits génomes.
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15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée d'une partie de génome par restriction totale ou partielle de ladite partie de génome.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADN isolée à partir d'une construction par PCR.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est obtenue par mutagenèse aléatoire.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la culture des micro-organismes transformés est une culture en masse (batch), en particulier par des cultures successives, ou une culture en continu, en particulier une cultures en chemostat.
19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend une quantité de méthionine insuffisante pour assurer la croissance du micro-organisme et comprend une quantité suffisante de substrat approprié pour permettre la croissance du micro-organisme transformé après bioconversion en méthionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la quantité suffisante de 2-amino 4- (méthylthio) butyronitrile ou ses dérivés, comme l'HMTBN, est comprise entre 0 et 60 g/1, préférentiellement comprise entre 3 mg/l et 17 mg/1, plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la quantité suffisante de 2-amino 4-(méthyl thio) butanamide ou ses dérivés, comme l'HMTBAmide est avantageusement comprise entre 0 et 60 g/1, préférentiellement comprise entre 3 mg/1 et 17 mg/1, plus préférentiellement comprise entre 6 mg/1 et 10 mg/1.
22. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend une quantité appropriée en méthionione ou ses dérivés, comme l'HMTBS.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la quantité appropriée en méthionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS est inférieure à la
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concentration suffisante pour permettre la croissance des micro-organismes transformés.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la quantité d'HMTBS est inférieure à 350 g/l, préférentiellement inférieure à 250 g/l, plus préférentiellement comprise entre 130 et 170 g/l.
25. Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend une source d'azote organique.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la teneur en source d'azote organique est comprise entre 0 et 15 g/1, préférentiellement comprise entre 2 et 10 g/1, plus préférentiellement entre 3 et 8 g/1.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 26, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié comprend du M9fru comme milieu minimum.
28. Procédé selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que le milieu de culture approprié est un milieu liquide ou solide.
29. Milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 19 à 28.
30. Séquence d'ADN codant pour une enzyme impliquée dans la bioconversion d'un substrat approprié en méthionine ou ses dérivés, comme l'HMTBS, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée et/ou isolée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 28.
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