JP5905834B2 - ファージ耐性に基づいて選択された食品に質感を加えるための乳酸菌 - Google Patents

ファージ耐性に基づいて選択された食品に質感を加えるための乳酸菌 Download PDF

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Description

本発明は、改善されたファージ耐性を有する菌体、本菌体を含むスターター培養物、および本スターター培養物で発酵された乳製品に関する。
食品会社は、食品の風味およびテクスチャーを改善するためだけでなくまたこれらの食品の貯蔵寿命を延長するために、多数の菌、特に乳酸菌を使用する。乳業の場合、乳酸菌は、乳の酸性化（発酵により）をもたらすためだけでなく、またそれらが組み込まれた製品に質感を加えるために、集中的に使用される。
食品会社で使用される乳酸菌の中で、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が挙げられる。ストレプトコッカスサーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の乳酸菌は、食品の製造、特に発酵製品のために単独または他の菌と組み合わせて集中的に使用される。それらは、特に、ヨーグルトなどの発酵乳の製造のために使用される発酵体の調合物について使用される。それらのいくつかは、発酵製品のテクスチャーの発達について最も有力な役割を果たす。この特性は、ポリサッカライドの生成と密接につながる。ストレプトコッカスサーモフィラスの株中で、質感を加える（ｔｅｘｔｕｒｚｉｎｇ）および質感を加えない（ｎｏｎ‐ｔｅｘｔｕｒｚｉｎｇ）株を区別することができる。
ＷＯ２００７０９５９５８Ａ１は、質感を加える特性を有するストレプトコッカスサーモフィラス株を開示する。図１では、もっとも質感を加える株ＣＨＣＣ８８３３（ＤＳＭ１７８７６）が、約５９Ｐａのせん断応力（ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）値を有することを見出し得る。
産業の要求を満たすために、乳酸菌の新規の質感を加える株、特に、食品に質感を加えるためのストレプトコッカスサーモフィラスを提供することが必要となっている。特に、ラストバチルス種の株と一緒に使用できるストレプトコッカスサーモフィラスの新規の質感を加える株の必要がある。産業の他の要求は、本株が、食品産業で通常見られるバクテリオファージに耐性であることである。
本発明は、ストレプトコッカスサーモフィラスおよびラクトバチルスブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の乳酸菌の新規の群を提供し、そしてそれは、驚くことに、それが得られた（母）株よりもファージ攻撃に対してより耐性である。さらに、驚くことに、本菌が乳を発酵するために使用されたとき、菌のこの群が、母株よりもより高いせん断応力および／またはゲル剛性を生じることが分かった。
ファージ耐性突然変異株が、（本株が、発酵乳に使用されたとき）母株よりもよりテクスチャー、例えば、より高いせん断応力および／またはゲル剛性を生じることは驚きであり、および（また）ｇａｌｋ遺伝子について突然変異を含む（野生株と比例して）株のファージ耐性突然変異株が、（本株が、発酵乳に使用されたとき）母株よりもよりテクスチャーを生じることは特に驚きである。
上の驚くべき知見に従って、本発明は、母株のファージ耐性突然変異体のためのスクリーニングにより質感を加える乳酸菌株を製造するための方法、例えば、質感を加える乳酸菌（例えば、そのうえ、例えばファージ耐性、実質的なファージ耐性であり、および／または母株と比較して増加したファージ耐性を持つ菌）を製造するための方法であって、以下のステップ：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；および
ｂ）突然変異株が、母株よりもよりファージに対して耐性（例えば、ファージのより多くの種類またはファージのより多くの株）である、母株の突然変異株を分離すること
を含む、方法に関する。
さらに、本発明は、Ｓ．サーモフィラス株またはラクトバチルスブルガリカス株などの質感を加える乳酸菌株に関し、そしてそれは、母株よりもよりファージに対して、特にＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２ファージの一つに対して耐性であるように改変される。
図１は、ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）レオメーターで測定したガラクトース陽性株ＣＨＣＣ１１３４２およびガラクトース陽性ファージ耐性突然変異体ＣＨＣＣ１１９７７のせん断応力を示す。せん断応力は、３７℃、乳中で終夜生育後、凝固した乳について測定した。 図２は、ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）レオメーターで測定したＣＨＣＣ１００１９のファージ耐性突然変異体のせん断応力を示す。 図３は、ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）レオメーターで測定したＣＨＣＣ１２３３９、ＣＨＣＣ９２０４のファージ耐性突然変異体のゲル剛性を示す。ゲル剛性は、３７℃、乳中で終夜生育後、凝固した乳について測定した。 図４は、ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）レオメーターで測定したＣＨＣＣ１３１４０、ＣＨＣＣ５０８６のファージ耐性突然変異体のせん断応力を示す。せん断応力は、３７℃、乳中で終夜生育後、凝固した乳について測定した。
第一態様では、本発明は、以下のステップ：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；および
ｂ）突然変異株が、母株よりもよりファージに対して耐性（例えば、ファージのより多い種類またはファージのより多い株）であり、および／またはその突然変異体が、母株が、耐性でない（同じ条件下）ファージに対して耐性である、母株の突然変異株を分離すること
を含む、乳酸菌（例えば、ファージ耐性、実質的なファージ耐性であり、および／または母株と比較して増加したファージ耐性を持ち、または本菌が乳を発酵するために使用されたとき、母株よりもより高いせん断応力および／またはゲル剛性を生じる）を製造するための方法に関する。
興味深い態様では、本発明は、以下のステップ：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；および
ａ１）乳酸菌をファージ、例えば、ＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２からなる群から選択されるファージなどの、母株を溶菌できるバクテリオファージに曝露すること、および；
ｂ）突然変異株が、ファージに対して耐性である（または株がファージによって溶菌されない）、母株の突然変異株を分離すること
を含む、乳酸菌（例えば、ファージ耐性、実質的なファージ耐性であり、および／または母株と比較して増加したファージ耐性を持ち、または本菌が乳を発酵するために使用されたとき、母株よりもより高いせん断応力および／またはゲル剛性を生じる）を製造するための方法に関する。
また、本発明は、以下のステップ：
ａ）乳酸菌株（母株）を提供すること；
ａ１）乳酸菌をファージ、例えば、ＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２からなる群から選択されるファージなどの、母株を溶菌できるバクテリオファージに曝露すること；
ａ２）生育培地中で曝露された菌体をインキュベートすること；および
ｂ）突然変異株が、バクテリオファージにより溶菌されない、母株の突然変異株を分離すること
を含む、方法に関する。
本発明の方法は、以下のステップ：
ｃ）母株を、例えばステップａ１）の前、間または後で、突然変異すること（例えば、化学薬品処理もしくは放射線処理により、または遺伝子工学的手法を用いて）
を含んでもよい。
また、本発明の任意の方法は、以下の方法：
ｄ）本株のｇａｌｋ遺伝子またはｇａｌｋ制御配列（例えば、プロモーター）中に、例えば、ステップｃ）の前、間もしくは後、またはステップａ）の前、間もしくは後で、突然変異を導入すること
を含んでもよい。
興味深い実施態様では、本発明は、以下のステップ：
‐ 乳酸菌株（母株）を提供すること；
‐ 母株を突然変異すること（例えば、化学薬品処理もしくは放射線処理、または遺伝子工学的手法を用いて）；
‐ 結果として得た乳酸菌をファージ、例えば、ＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２からなる群から選択されるファージなどの、母株を溶菌できるバクテリオファージなどに曝露すること；
‐ 生育培地中で曝露した菌体をインキュベートすること；および
‐ 突然変異株がバクテリオファージにより溶菌されない、母株の突然変異株を分離すること
を含む。
本発明の方法は、突然変異が、‐１０領域（プリブノーボックス）中、またはプリブノーボックスおよびリボソーム結合部位の間の領域中などのｇａｌｋ遺伝子のプロモーター領域に導入されることを惹起してもよい。
また、本発明の方法は、母株と比較して増加したガラクトース発酵活性を生じる突然変異体を惹起してもよい。
本突然変異は、Ａ、ＴおよびＧからなる群から選択されるヌクレオチドで、野生型プリブノーボックスから下流のＴＴＣＡＧＴ配列中のＣの置換など、プリブノーボックスおよびｇａｌｋ遺伝子のリボソーム結合部位の間の領域中で、一またはそれ以上のヌクレオチドの置換を生じてもよい。
他の実施態様では、本突然変異は以下の：
‐ Ａ、ＴおよびＧからなる群から選択されるヌクレオチドでの、野生型プリブノーボックスから下流のＴＴＣＡＧＴ（配列番号６）配列中のＣの置換など、プリブノーボックスおよびｇａｌｋ遺伝子のリボソーム結合部位の間の領域中での、一またはそれ以上のヌクレオチドの置換；および／または
‐ ＡおよびＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドでの、野生型‐１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号７）中での、一またはＣおよびＧの両方の置換；および／または
‐ ＡおよびＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドでの、野生型‐１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号７）中での、Ｃの置換；および／または
‐ Ｔで、野生型‐１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号７）中での、Ｃの置換；および／または
‐ ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＡＴ（配列番号８）、ＴＡＴＴＡＴ（配列番号９）またはＴＡＣＴＡＴ（配列番号１０）を有する‐１０領域
を生じてもよい。
本発明の方法で使用される母株は、ｇａｌ＋株であってもよく、好ましい株は、２％ガラクトースを伴うＭ１７（ガラクトースが唯一の糖類として添加された）中で、３７度で、１６時間インキュベート後、少なくとも１の値、ｐＨを低下でき、少なくとも培地１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量について植菌される。そのような株の例は、ここで以下：
‐ Ａ、ＴおよびＧからなる群から選択されるヌクレオチドでの、野生型プリブノーボックスから下流のＴＴＣＡＧＴ（配列番号６）配列中でのＣの置換など、プリブノーボックスおよびｇａｌｋ遺伝子リボソーム結合部位の間の一またはそれ以上のヌクレオチドが置換され；および／または
‐ 野生型‐１０領域（ＴＡＣＧＡＴ、配列番号７）中の一またはＣおよびＧの両方が、ＡおよびＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドで置換され；および／または
‐ 野生型‐１０領域（ＴＡＣＧＡＴ，配列番号７）中のＣが、ＡおよびＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドで置換され；および／または
‐ 野生型‐１０領域（ＴＡＣＧＡＴ，配列番号７）中のＣが、Ｔで置換され；および／または
‐ ‐１０領域が、ＴＡＴＧＡＴ（配列番号８）、ＴＡＴＴＡＴ（配列番号９）またはＴＡＣＴＡＴ（配列番号１０）配列を有する
株である。新規のｇａｌ＋株が、本発明の一部である。
本発明の方法は、以下：
ｃ１）母株と比較して増加したファージ耐性をなど、ファージ耐性を有する突然変異株をスクリーニングすること；および
ｃ２）母株と比較して増加したガラクトース分解活性など、Ｇａｌ＋表現型を有する突然変異株をスクリーニングすること
からなる群から選択される一またはそれ以上のさらなるステップ（複数）を含んでもよい。
本発明の方法のある実施態様は、以下のステップ：
‐ 乳酸菌株（母株）を提供すること；
‐ 場合により母株を突然変異すること；
‐ 突然変異した母株を、例えば、ＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２からなる群から選択されるファージなど、母株を溶菌することができるバクテリオファージに曝露すること；
‐ 場合により、生育培地で曝露された菌体をインキュベートすること；および
‐ 母株と比較して増加したファージ耐性など、ファージ耐性を有する突然変異株をスクリーニングすること；および／または母株と比較して増加したガラクトース分解活性など、Ｇａｌ＋表現型を有する突然変異株をスクリーニングすること
を含む、乳酸菌を製造するための方法に関する。
本発明の方法により得られた突然変異株は、自然発生突然変異体、例えば、化学薬品処理または放射線処理を用いて母株の突然変異誘発により得た突然変異体、または遺伝子工学的手法を用いて得た突然変異体でもよい。本発明の興味深い突然変異体は、ＣＨＣＣ６００８の突然変異体、特に、ｇａｌ＋およびＣＨＰＣ１１５２に対し耐性である突然変異体である。
本発明の方法のある実施態様では、突然変異株は、ファージ耐性、実質的なファージ耐性であり、および／または母株と比較して増加したファージ耐性を持ち、およびここで、ファージは、母株を溶菌することができるバクテリオファージ、ＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２からなる群から選択される。
菌は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種（例えば、ストレプトコッカスサーモフィラス）、ラクトバチルス種、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種、シュードリューコノストック（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、およびビフィドバクテリウム種からなる群から選択される種から選択されることが現在好ましい。
本発明の方法の興味深い実施態様では、菌（母株）は、乳に質感を加える能力、エキソポリサッカライドまたはきょう膜ポリサッカライドなどのポリサッカライドを生産する能力、乳中でインキュベートしたとき、粘性を引き起こす能力、乳中でインキュベートしたとき、せん断応力を増加する能力からなる群から選択される一またはそれ以上の特徴を有する株から選択される。
他の態様では、本発明は、本発明の方法により得られた乳酸菌または株に関する。
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法により得られる菌または株など、そしてそれは、例えば、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で１２時間生育後、せん断応力として測定され、発酵乳中で、約７０Ｐａ（パスカル）超（例えば、７３Ｐａ超、７７Ｐａ超、７９Ｐａ超または８０Ｐａ超）の粘度を生じる、乳酸菌または株に関する。発酵乳中で１００Ｐａまで、１２０Ｐａまで、１５０Ｐａまで、２００Ｐａまでさえ粘度を生じる株を得ることができると思われる。得られる粘度の範囲の例は、７０‐２００Ｐａ、７５‐１５０Ｐａ、７８‐１２０Ｐａ、７９‐１００Ｐａ、および８０‐９０Ｐａである。特に、本発明は、Ｓ．サーモフィラスの株に関し、そしてそれは、発酵乳中で、７９‐１００Ｐａの粘度を生じることができる。
本発明の株の例は、ＣＨＣＣ１１３４２（ＤＳＭ２２９３２）、ＣＨＣＣ１１９７７（ＤＳＭ２２９３５）、ＣＨＣＣ１２３３９（ＤＳＭ２４０９０）、およびＣＨＣＣ１３１４０（ＤＳＭ２４０２３）、並びにこれらの任意の突然変異体およびバリアントからなる群から選択されるストレプトコッカスサーモフィラス種に属する菌株である。さらに、本発明は、本明細書中で言及したすべての新規の株、同様にそれらの突然変異体およびバリアントに関する。特に、本発明は、ＣＨＣＣ１１９７７株、およびそれらの突然変異体に関する。
さらなる態様では、本発明は、例えば、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で１２時間の生育後、測定され、発酵乳中で約７０Ｐａ超（例えば、７３Ｐａ超、７７Ｐａ超または８０Ｐａ超）のせん断応力を生じる、乳酸菌または株に関する。本菌または株は、ストレプトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスデルブリュキーサブスピーシーズブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種に属してもよい。
本発明はまた、ＣＨＣＣ１２８１３（ＤＳＭ２４０７４）およびＣＨＣＣ１２８４１、およびそれらの突然変異体およびバリアントからなる群から選択される株など、Ｌｂデルブリュキーサブスピーシーズブルガリカス種に属する菌株に関する。興味深い株は、例えば、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で、１２時間生育後測定され、発酵乳中で、約６０Ｐａ超（例えば、６５Ｐａ超、６９Ｐａ超または７２Ｐａ超）のせん断応力を生じるものである。特に、興味深いのは、例えば、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で、１２時間生育後、測定され、発酵乳についてせん断応力が、６０‐１００Ｐａの範囲（例えば、６５‐９０Ｐａ、６９‐８５Ｐａまたは７２‐８０Ｐａ）で生じるものである。
本発明のさらなる態様では、例えば、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で１２時間生育後、測定され、発酵乳中のゲル剛性を約１１０Ｐａ超（例えば、１１５超、１２０超または１２５Ｐａ超）生じる、乳酸菌または株または本発明の突然変異体またはバリアントに関する。ゲル剛性は、１１０‐２００Ｐａの範囲内が現在好ましく、１２０‐１９０Ｐａまたは１２５‐１８０Ｐａの範囲内がより好ましい。菌または株は、ストレプトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスデルブリュッキーサブスピーシーズ種に属してもよい。特に、本発明は、発酵乳中で１２５‐１７５Ｐａのゲル剛性を生じることができる、Ｓ．サーモフィラスの株に関する。
興味深い実施態様では、本発明は、Ｌｂ．デルブリュッキーサブスピーシーズブルガリカス種に属する、乳酸菌または株に関する。この実施態様による興味深い例は、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で１２時間生育後、せん断応力として測定され、発酵乳中の粘度を約６０Ｐａ超（例えば、６５Ｐａ超、６９Ｐａ超または７２Ｐａ超）生じる、菌または株、および／または、例えば、少なくとも乳１ｍｌあたり１０Ｅ４菌量で植菌され、３７℃で１２時間生育後、せん断応力として測定され、発酵乳中の粘度を６０‐１００Ｐａの範囲で（例えば、６５‐９０Ｐａ、６９‐８５Ｐａまたは７２‐８０Ｐａ）生じる、菌または株である。
他の態様では、例えば、菌は、ＣＨＣＣ１１９７７株またはそれらの突然変異体に属し、乳酸菌または株を含む組成物に関する。そのような組成物は、前記菌の少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ（細胞形成単位）を含むことが好ましい。
ある実施態様では、組成物は、混合物としてまたはキットのパーツとして（ｋｉｔ‐ｏｆ‐ｐａｒｔｓ）以下：
‐ ラクトバチルスデルブリュッキーサブスピーシーズブルガリカス（同義語：ラクトバチルスブルガリカス）、Ｌ．ジョンソニー（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、またはＬ．ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株など、ラクトバチルス種に属する株；および
‐ 本発明の乳酸菌の株、ストレプトコッカスサーモフィラス種に属する株など、例えば、ＣＨＣＣ１１３４２（ＤＳＭ２２９３２）、ＣＨＣＣ１１９７７（ＤＳＭ２２９３５）、ＣＨＣＣ１２３３９、およびＣＨＣＣ１３１４０（ＤＳＭ２４０２３）、およびこれらの任意の突然変異体およびバリアントからなる群から選択される株、ここでラクトバチルス種に属する株が、ポリサッカライド（ヘテロポリサッカライド、ホモポリサッカライドなど）および／またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素産生ラクトバチルス種に属する株である組成物など
を含んでもよい。
本発明の組成物は、ラクトバチルス種の属する株の少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ（細胞形成単位）、および／または少なくともストレプトコッカスサーモフィラス種の属する株の１０ｅｘｐ１０ＣＦＵを含んでもよい。
興味深い実施態様では、本発明の組成物は、ポリサッカライド（ホモポリサッカライドなど）および／またはフルクトシルトランスフェラーゼ酵素産生ラクトバチルス種に属する株の少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ（細胞形成単位）、およびストレプトコッカスサーモフィラス種に属する株の少なくとも１０ｅｘｐ１０ＣＦＵを含む。
組成物は、スターター培養物として使用可能でもよく、および凍結、凍結乾燥または液体形態でもよい。
さらなる態様では、本発明は、本発明の乳酸菌、本発明の株、または本発明の組成物で乳基質（牛乳など）を発酵することを含む、発酵乳製品を製造するための方法に関する。
本方法は、さらに、ラクトバチルス種に属する株で、Ｌ．ブルガリカスまたはＬ．ファーメンタムの株など、例えば、ＣＨＣＣ１００１９、ＣＨＣＣ１０９３５、またはＣＨＣＣ３９８４、並びにこれらの株の任意の突然変異体およびバリアントからなる群から選択される株で、乳基質を発酵することを含んでもよい。例えば、乳基質は、本発明の組成物、株または菌、例えば、ラクトバチルス種に属する株で発酵前、間、後、ストレプトコッカスサーモフィラスに属する株で発酵され、または乳基質は、ポリサッカライド産生ラクトバチルス種に属する株で発酵の間、ストレプトコッカスサーモフィラス種に属する株または菌で発酵される。
発酵乳製品を製造するための本発明の方法は、発酵の前、間および／または後、乳基質に、タンパク質を架橋できる酵素、トランスグルタミナーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、キモシン、およびレンネットからなる群から選択される酵素などの酵素を添加することを含んでもよい。
さらに他の態様では、本発明は、本発明の上の方法により得られる、発酵乳製品（例えば、ヨーグルトまたはバターミルク）またはチーズ（例えば、フレッシュチーズまたはパスタフィラータ）などの乳製品に関する。発酵乳製品は、例えば、攪拌タイプ製品、飲用製品、またはセットタイプ製品であってもよい。本発明の乳製品は、場合により、フルーツ濃縮物、シロップ、プロバイオティック菌培養物、着色剤、増粘剤、調味料、および保存料からなる群から選択される原料を含んでもよい。
従って、本発明は、場合によりフルーツ濃縮物、シロップ、プロバイオティック菌培養物、着色剤、増粘剤、調味料、および保存料からなる群から選択される原料を含み、および／または場合により、攪拌タイプ製品、セットタイプ製品、または飲用製品の形態である、本発明の方法により得られる発酵乳製品に関する。
また本発明は、本発明の乳酸菌（例えば、ＤＳＭ２２８８４などのストレプトコッカスサーモフィラス種に属する株）およびラクトバチルスブルガリカスおよびラクトバチルスファーメンタム（ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）、ＣＨＣＣ３９８４（ＤＳＭ１９２５１）およびＣＨＣＣ２００８（ＤＳＭ２２５８４））から選択される乳酸菌株で、乳基質（牛乳など）を発酵することで作られた、乳製品に関する。
興味深い実施態様では、本発明の乳製品は、例えば乳中で３７℃、１２時間生育後、せん断応力として測定され、１００Ｐａ超（１０２超または１０４Ｐａ超など）の粘度／テクスチャーを有する。現在好ましい実施態様では、１００Ｐａ超の粘度は、菌体単独の生育により得られるが、より高い粘度値が、スターチ、ゼラチン、カラギナンなどの化合物の添加により得ることができる。
他の実施態様では、本発明の乳製品は、せん断応力として測定され、１００‐１５０Ｐａの範囲、または１０５‐１２５Ｐａの範囲など、１００‐２００Ｐａの範囲で粘度／テクスチャーを有する。
さらなる実施態様では、本発明の乳製品は、例えば、飲料ヨーグルトなどの、飲用製品である。
本発明はまた、ＣＨＰＣ６５８（ＤＳＭ２３９６１）、ＣＨＰＣ１０５７、ＣＨＰＣ１０８９およびＣＨＰＣ１１５２（ＤＳＭ２３９９４）、並びにそれらの突然変異体およびバリアントからなる群から選択されたバクテリオファージなど、本明細書中で言及された株、例えば、ＣＨＣＣ６００８株を溶菌することができる突然変異体およびバリアントなど、本発明の方法で使用可能な新規のバクテリオファージに関する。
さらに、本発明は、ＣＨＣＣ１１３４２（ＤＳＭ２２９３２）、ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）、ＣＨＣＣ１１３７９（ＤＳＭ２２８８４）、ＣＨＣＣ１１９７６（ＤＳＭ２２９３４）からなる群から選択される株など、本発明の方法で母株として使用可能な新規の菌株に関する。
本明細書で使用されるように、用語「乳酸菌」は、グラム陽性、微好気性または嫌気性細菌を示し、そしてそれは、主要な産生酸として乳酸、酢酸およびプロピオン酸を含む酸の産生を伴い、糖を発酵する。産業的にもっとも有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバチルス種、リューコノストック種、シュードリューコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、エンテロコッカス種、およびプロピオニバクテリウム種を含む「ラクトバチルス目」内に見出される。そのうえ、絶対嫌気性細菌、ビフィドバクテリア、すなわちビフィドバクテリウム種の群に属する乳酸産生菌は、一般的に乳酸菌の群に含まれる。これらは、しばしば食品培養物単独としてまたは他の乳酸菌と組み合わせて使用される。ラクトバチルススピーシーズ種およびストレプトコッカスサーモフィラスの菌を含む乳酸菌は、通常、バルクスターター増殖のための凍結または凍結乾燥培養物として、または発酵乳製品など、乳製品の製造のための発酵容器またはバット内に直接植菌するために意図された、いわゆるダイレクトバットセット（ＤＶＳ）培養物としてのいずれかで乳業に供給される。そのような培養物は、一般的に「スターター培養物」または「スターター」として称される。
用語「乳」は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウまたはラクダなどの任意の哺乳類を搾乳することにより得られる乳び管の分泌物として理解されるべきである。好ましい実施態様では、乳は、牛乳である。用語「乳」は、また、豆乳などの植物材料で作られたタンパク質／脂肪溶液を含む。
用語「乳基質」は、本発明の方法に従って発酵を受けることができる任意の生および／または加工乳原料であってもよい。従って、有用な乳基質は、全または低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、還元乳パウダー、コンデンスミルク、ドライミルク、ホエイ、ホエイパーミエイト、ラクトース、ラクトースの結晶由来の母液、ホエイプロテインコンセントレイト、またはクリームなどの、任意の乳またはタンパク質を含む乳様製品の溶液／懸濁液を含むが、限定されない。明らかに、乳基質は、例えば、実質的に純粋な哺乳類の乳、または還元乳パウダーである、任意の哺乳類に由来してもよい。
好ましくは、少なくとも乳基質中のタンパク質の一部は、カゼインまたはホエイタンパク質など、乳中で天然起源のタンパク質である。しかしながら、タンパク質の一部は、乳中で天然起源でないタンパク質であってもよい。
用語「乳」は、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウまたはラクダなど、任意の哺乳類を搾乳することにより得られた乳び管の分泌物として理解されるべきである。好ましい実施態様では、乳は牛乳である。
発酵前に、乳基質は、当該技術分野で知られた方法によりホモジナイズされおよび殺菌されてもよい。
本明細書中で使用されるように「ホモジナイズ」は、可溶性懸濁液またはエマルジョンを得るために激しく混合することを意味する。仮に均質化が、発酵前に行われれば、もはや乳から分離しないように、乳脂肪をより小さいサイズに分解するために行われてもよい。これは、小さなオリフィスを介して高圧で乳を押し出すことにより果たされてもよい。
本明細書中で使用されるように「殺菌」は、微生物などの生きている生物の存在を低減または除去するための乳基質の処理を意味する。好ましくは、殺菌は、特定の期間の間特定の温度を維持することにより達成される。特定の温度は、加熱により通常達成される。温度および期間は、有害な細菌など、ある細菌を死滅しまたは不活化するために選択されてもよい。急速冷却ステップが、続いてもよい。
本発明の方法における「発酵」は、微生物の作用を介して糖類のアルコールまたは酸への変換を意味する。好ましくは、本発明の方法における発酵は、ラクトースの乳酸への変換を含む。
発酵乳製品の製造で使用される発酵プロセスは、周知および当業者が、温度、酸素、微生物（複数）の量および特徴並びに処理時間などの好適な処理条件の選択方法を知るであろう。明らかに、発酵条件は、本発明の達成を支持するために、すなわち、固体または液体形態で乳製品（発酵乳製品）を得るために、選択される。
用語「攪拌タイプ製品」は、発酵後機械的な処理を受け、その結果、発酵ステージにおいて形成された凝固物の破壊および液状化をもたらす発酵乳製品を指す。機械的処理は、典型的に、ゲルの攪拌、ポンピング、ろ過またはホモジナイズにより、あるいは他の成分とゲルとを混合することによって得られるが、これに限定されない。攪拌タイプ製品は、典型的に９〜１５％の無脂乳固形分を有するが、これに限定されない。
用語「セットタイプ製品」は、例えばスターター培養物で植菌され、そして植菌工程の次にパッケージ化され、その次にパッケージ内で発酵された乳に基づく製品を含む。
用語「飲用製品」は、例えば「飲用（ｄｒｉｎｋｉｎｇ）ヨーグルト」および類似物のような飲料を含む。用語「飲用ヨーグルト」は、典型的に、ラクトバチルス種およびストレプトコッカスサーモフィラスの組み合わせによる発酵により生産される乳製品をカバーする。飲用ヨーグルトは、典型的に、８％またはそれ以上の無脂乳固形分を有する。さらに、飲用ヨーグルトドリンク用の生培養計数（ｌｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔ）は、典型的に１ｍｌあたり、少なくとも１０Ｅ６細胞形成単位（ＣＦＵ）である。
本発明によれば「飲用製品」は、酸性化乳基質に基づいた任意の飲用製品を含み、従って発酵乳飲料および液体ヨーグルト飲料を含む。本発明の方法において、酸性化は、微生物での発酵として行われ、場合により、有機酸など（例えば、乳酸、ラクトビオン酸またはＧＤＬ）の酸が添加される。
本発明による飲用製品は、それらは液体形態でありおよび飲料として消費されるという意味で飲用であり、すなわち、それらはスプーンで食する代わりに飲用のために適している。「液体形態の」は、製品が、物質の流体状態であり、従って流動するために特徴的な待機を示すことを意味する。従って、液体の形状は、そしてそれは、例えば、ヨーグルトまたはプディングなどの柔らかいが、自由に流動しない、例えば、ゲル様物質と反して、通常、それを充填したコンテナにより決定される。本発明による飲用製品は、所望するなら、消費者が、ストローを使用して製品を飲むことを許容する粘度を有してもよい。
本発明による飲用製品は、ｐＨ４．６未満、好ましくは４．４未満、より好ましくは４．２未満およびさらにより好ましくは約４または未満を有してもよい。一つの態様では、飲用製品は、３．６未満など、ｐＨ３．８未満を有する。
本発明による飲用製品は、０‐２％の脂肪含量、好ましくは１．５％未満、１％未満または０．５％未満、より好ましくは０．１％または未満の量を有してもよい。飲用製品は、２０％未満の無脂乳固形物、好ましくは８．５％未満、８％未満、７．５％未満、７％未満、６．５％未満または６％未満、およびより好ましくは約５％を有してもよい。
本発明による飲用製品は、０．５％‐４％の間のタンパク質含量を有してもよい。一つの好ましい態様では、飲用製品は、１％未満のタンパク質含量を有する。他の好ましい態様では、飲用製品は、２％‐３％の間のタンパク質含量を有する。
本発明による飲用製品は、７日超、好ましくは１４日超、より好ましくは２８日超、３月超などの貯蔵寿命を有してもよい。
本発明による飲用製品は、改善された沈降安定性を有してもよい。安定性は、離水のため表面上に集合したホエイの高さを測定することにより、適当な日数の間、飲用製品を保存した後、決定されてもよい。また、遠心分離などにより、加速させた離水後、決定されてもよい。
飲用製品、例えば、飲用ヨーグルトのための、発酵後の高せん断処理（例えば、均質化）は、通常、なめらかな、均質なおよび飲用に適した製品を得るために、タンパク質ネットワークを分解することが必要である。ネットワークの分解は、飲用ヨーグルトが、減少された沈降安定性を有し、貯蔵寿命の間、底面にタンパク質の沈降を生じることを伴う。高脂肪レベルおよび高タンパク質含量は、沈降安定性を増加し、一方で、低タンパク質レベル（１‐２．５％）を伴う低脂肪製品（０‐０．５％脂肪）は、通常、タンパク質沈降を避けるために安定剤の添加を必要とする。
本明細書で使用されるように、用語「バクテリオファージ」は、当該技術分野で理解されるようにその通常の意味を有し、すなわち一またはそれ以上の細菌に選択的に感染するウィルスである。多くのバクテリオファージは、細菌の特定の属または種または株に固有である。用語「バクテリオファージ」は、用語「ファージ」と同義である。バクテリオファージは、任意の次のウィルスファミリー：コルチコウィルス科、シストウィルス科、イノウィルス科、レビウィルス科、ミクロウィルス科、ミオウィルス科、ポドウィルス科、シホウィルス科、またはテクティウィルス科に属するバクテリオファージを含むが、限定されない。バクテリオファージは、溶菌性のバクテリオファージまたは溶原性のバクテリオファージであってもよい。溶菌性のバクテリオファージは、溶原性の経路に入るよりもむしろ溶菌性のサイクルの完了を通じて溶菌性の経路に続くものである。溶菌性のバクテリオファージは、細胞膜の溶解、細胞の破壊、および他の細胞に感染できる子孫バクテリオファージ粒子の放出に導くためのウィルス複製を起こす。溶原性のバクテリオファージは、本バクテリオファージが休止状態になり、その溶菌性のサイクルの完了前を通じて細胞のゲノムの受動的な部分になる溶原性の経路に入ることができるものである。
一つの実施態様では、本発明による乳酸菌は、一もしくはそれ以上のバクテリオファージまたは一もしくはそれ以上のバクテリオファージのセットに耐性であり、他の実施態様では、本発明による乳酸菌は、本発明による寄託された株が耐性である同様のバクテリオファージに耐性である。本文脈では、用語「ファージに強い（Ｐｈａｇｅ ｒｏｂｕｓｔ）」は、用語「ファージ耐性」と互換性があるように使用される。
本文脈では、用語「突然変異体」は、例えば、遺伝子工学、放射線および／または化学薬品処理により本発明の株（または母株）由来の株、または由来することができる株として理解されるべきである。突然変異体は、母株と、機能的に同等の突然変異体、例えば、実質的に同じ、または改善された特徴（例えば、テクスチャー、せん断応力、粘度、ゲル剛性、口内での広がり（ｍｏｕｔｈ ｃｏａｔｉｎｇ）、フレーバー、後酸性化、酸性化速度、および／またはファージ頑強性に関して）を有する突然変異体であることが好ましい。そのような突然変異体は、本発明の一部である。特に、用語「突然変異体」は、例えばエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）またはＮ‐メチル‐Ｎ’‐ニトロ‐Ｎ‐ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ＵＶライトのような化学的変異原との処理を含む、任意の従来使用される突然変異誘発処理に本発明の株をかけることによって得られる株、または自然発生突然変異体を指す。突然変異体は、いくつかの突然変異誘発処理（単一の処理は、スクリーニング／選択ステップに続いて一の突然変異誘発ステップを理解されるべきである）を受けてもよいが、たった２０、たった１０、またはたった５処理（またはスクリーニング／選択ステップ）が、行われることが現在好ましい。現在好ましい突然変異体は、母株と比較して、細菌ゲノム中のヌクレオチドの５％未満、または１％未満、またはさらに０．１％未満が、他のヌクレオチドと変化または欠失している。本文脈では、用語「バリアント」は、本発明の株と機能的に同等、例えば、実質的に同じ、または改善された特徴（例えば、テクスチャー、せん断応力、粘度、ゲル剛性、口内での広がり、フレーバー、後酸性化、酸性化速度、および／またはファージ頑強性に関して）を有する株として理解されるべきである。そのようなバリアントは、そしてそれは、適当なスクリーニングを使用することで同定でき、そのようなバリアントは、本発明の一部である。
本文脈では、「テクスチャー」は、３７℃で１２時間生育後、せん断応力として測定される。せん断応力およびゲル剛性のためのＳＩ単位は、パスカル（Ｐａ）である。
テクスチャーの解析に使用されるアッセイ：
インキュベーションの翌日、発酵乳は、１３℃にされおよびサンプルの均質性まで、穴が開いたディスクを装着したスティックを用いて穏やかに攪拌した。サンプルの流体力学的特性は、Ｃ２５同軸測定システムを備えたレオメーター（ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）、レオロジカ インスツルメンツ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、スウェーデン）で評価した。粘度測定試験は、２１ステップで、０．２７‐３００ １／Ｓまで変化するせん断速度で行った。せん断速度は、増加しおよびその後、減少し、並びにせん断応力および見かけの粘度の上昇および下降曲線が記録された。遅延および積分時間は、それぞれ、５Ｓおよび１０Ｓであった。
用語「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」の使用並びに本発明に記載する本文脈における（特に、以下の請求項の構成において）同様の指示語は、本明細書において他に示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形または複数形の両方をカバーすると解釈される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注意がない限り、非制限用語（すなわち、「含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味）として解釈される。本明細書中の数値範囲の記載は、本明細書において他に示されない限り、その範囲内にある各々別個の値を個々に示す簡略化した方法として有用であることを単に意図し、各々別個の値は、それが個々に本明細書に記載されたように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書において他に示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適当な順序で行われ得る。本明細書において提供される任意の、および全ての例、または例示のための用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）は、本発明をよりよく示すことを単に意図されたものであって、他に記載されない限り、本発明の範囲において限定を課すものではない。本明細書における如何なる用語も、本発明の実施において不可欠である、請求項に記載されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
実施例１：改善されたテクスチャー特性を伴うファージ耐性ストレプトコッカスサーモフィラス株の開発
ＣＨＣＣ１１９７７の開発
母株ＣＨＣＣ１１３４２を、実施例５で記載したように得た。本株は、ＣＨＣＣ６００８の突然変異体であり、およびガラクトース発酵Ｓ．サーモフィラス株と見なされる。
ＣＨＣＣ１１９７７株を、１ｍｌあたり、１０Ｅ０９（１０ｅｘｐ９）ファージ粒子を含む０．１ｍｌのＣＨＰＣ１１５２ファージと一緒にＣＨＣＣ１１３４２のＭ１７終夜培養物０．１ｍｌをプレートに蒔き、および３７℃で２日間インキュベーション後、Ｍ１７アガープレートから単離した。ＣＨＣＣ１１９７７と呼ばれる一つの突然変異体を、３回コロニー精製し、およびファージ耐性を確認するファージＣＨＰＣ１１５２を使用して、３７℃、Ｍ１７アガープレート上でプラーク試験について再試験した（単一プラークを認めなかった）。
突然変異株を、その後、ファージＣＨＰＣ１１５２の存在中、３７℃で、Ｍ１７培地でまた試験した。ＣＨＣＣ１１９７７は、液体培養物中でまた、そのファージ耐性を維持し、ここでＣＨＣＣ１１３４２は、予想通り、ＣＨＰＣ１１５２により攻撃された。
ＣＨＣＣ１１９７７を、母株ＣＨＣＣ１１３４２と比較できる酸性化活性を示すように異なる温度（感染ファージの添加なしで）において乳中でまた試験した。
発酵乳中のＣＨＣＣ１１３４２のテクスチャーの分析
インキュベーションの翌日、発酵乳を１３℃にし、およびサンプルの均質性まで穴の開いたディスクを装着したスティックを用いて穏やかに攪拌した。サンプルの流体力学的特性を、Ｃ２５同軸測定システムを備えたレオメーター（ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）、レオロジカ インスツルメンツ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、スウェーデン）で評価した。
粘度測定試験を、２１ステップで、０．２７‐３００ １／Ｓまで変化するせん断速度で行った。せん断速度は、増加し、およびその後減少し、並びにせん断速度および見かけの粘度の上昇および下降曲線を記録した。遅延および積分時間は、それぞれ５Ｓおよび１０Ｓであった。さらなる分析では、３００ｓ‐１のせん断応力を選択した。レオメーターの結果は、ＣＨＣＣ１１３４２が、６８．０Ｐａのせん断応力値を伴うＣＨＣＣ６００８と比べて７３．０Ｐａのせん断応力を有することを示した、図１参照。
発酵乳中のＣＨＣＣ１１９７７のテクスチャーの分析
ｇａｌ陽性ファージ耐性突然変異体について上記のように、発酵乳を取得し、および特性に関するテクスチャーを分析した。
レオメーターの結果は、ＣＨＣＣ１１９７７が、ＣＨＣＣ１１３４２と比較して１０％さらに改善されたせん断応力を有することを示した（母株ＣＨＣＣ１１３４２における７３．０Ｐａと比較してＣＨＣＣ１１９７７におけるせん断応力値８０．０Ｐａ、図１参照）。さらに、ゲル剛性（Ｇ*）は、ＣＨＣＣ１１３４２（ゲル剛性１０４．０Ｐａ）と比較して１２６．０Ｐａの値を示したファージ耐性突然変異体ＣＨＣＣ１１９７７について、２０％増加した。これで、重要なレオロジーパラメーターであるせん断応力およびゲル剛性を、ガラクトース陽性母株からファージ耐性突然変異体を分離することにより、著しく改善することが可能となった。
ＣＨＣＣ１１３４２由来のｇａｌｋプロモーター領域の配列決定
ＣＨＣＣ１１３４２ガラクトース陽性突然変異体における突然変異の種類を明らかにするために、ｇａｌｋ遺伝子の最初（Ｓ．サーモフィラス由来のガラクトキナーゼについてコード）をシークエンスした。
ＣＨＣＣ１１３４２について、ｇａｌｋプロモーターの領域中の突然変異を同定した（以下の配列を参照）。突然変異は、ｇａｌｋ遺伝子の‐１０‐プロモーターボックスの３ヌクレオチド下流で、ＣをＡに導くヌクレオチド置換が起こった。
Figure 0005905834
ＣＨＣＣ１１３４２由来のｇａｌｋ遺伝子のプロモーター領域
ＣＨＣＣ１１３４２のｇａｌｋプロモーター領域内の点突然変異を、灰色コードで示した。Ｓ．サーモフィラス ＳＴＩＩＩ由来の公開されたｇａｌｋ配列（ジェンバンク アクセッション番号 ＡＹ７０４３６８）を、比較のために示した。‐３５は‐３５‐プロモーターボックス、‐１０は‐１０‐プロモーターボックス、ＲＢＳはリボソーム結合部位である。
さらなるファージ耐性突然変異体
ファージ耐性およびガラクトース陽性表現型の間の考えられる関係を明らかにするために、５の追加のファージ耐性突然変異体を、Ｍ１７ガラクトースアガープレート上、ＣＨＣＣ１１３４２の母株（ｇａｌ＋）であるＣＨＣＣ６００８株（ｇａｌ−）から分離した。５のファージ耐性突然変異体すべて、ＣＨＣＣ１１３９６、ＣＨＣＣ１１３９７、ＣＨＣＣ１１３９８、ＣＨＣＣ１１３９９、およびＣＨＣＣ１１３４０（ファージＣＨＰＣ１１５２に耐性）は、ガラクトースを発酵することができず、ｇａｌ＋表現型は、直接的にファージ耐性と関係しないことを意味する。他方で、プラークアッセイにより、ＣＨＣＣ１１３４２（ｇａｌ＋）は、ファージＣＨＰＣ１１５２にさらに感受性があることを示した。
実施例２：改善されたテクスチャー特性を伴うファージ耐性ラクトバチルスデルブリュキーサブスピーシーズブルガリカス株の開発
母株ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）から、ファージ耐性突然変異体を以下のように分離した。
突然変異体を、１ｍｌあたり１０Ｅ０６ファージ粒子を含んでいるＣＨＰＣ６５８ファージライセート（溶菌液）０．１ｍｌと一緒にＣＨＣＣ１００１９のＭＲＳ終夜培養物０．１ｍｌをプレートに蒔き、および３７℃で２日間、嫌気性インキュベーション後、１０ｍＭ ＣａＣｌ2／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＭＲＳアガープレートから選択した。３０の突然変異体を単離しおよびファージＣＨＰＣ６５８に対してクロスストリーキングで試験した。２９の突然変異体が、クロスストリーキング試験で耐性を示し、およびその後、３７℃、ＭＲＳアガープレート上で、３回コロニー精製をした。
２９突然変異体を、酸性化プロファイルおよびファージ耐性についてマイクロタイタープレートで試験した。２のマイクロタイタープレートを乳で調製し、およびそれぞれのプレートを、それぞれの突然変異体２％で植菌した。一のプレートについて、２％ペプトン塩希釈液（コントロール）を、それぞれのウェルに添加し、および他のマイクロタイタープレートに、１ｍｌあたり１０Ｅ０６ファージ粒子を含む２％ＣＨＰＣ６５８を添加した。２のプレートを、２日間、３７℃でインキュベートし、およびそれぞれのウェルのｐＨを、１２分毎に記録した。すべての突然変異体は、母株ＣＨＣＣ１００１９と比較してファージ耐性であり、そしてそれは、ファージＣＨＰＣ６５８により攻撃された。１２の突然変異体を、ＭＲＳおよび乳中での酸性化プロファイル（母株と同様）並びに株の粘度に基づいて選択した。
発酵乳中のテクスチャー特性についてＣＨＣＣ１００１９ファージ耐性突然変異体の分析
乳中で、３７℃、終夜で、１２の突然変異体および母株ＣＨＣＣ１００１９をインキュベートしたのち、発酵乳を１３℃に調整し、およびそれぞれのサンプルの均質性まで、穴の開いたディスクを装着したスティックを用いて穏やかに攪拌した。サンプルの流体力学的特性を、Ｃ２５同軸測定システムを備えたレオメーター（ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）、レオロジカ インスツルメンツ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、スウェーデン）で評価した。
粘度測定試験を、２１ステップで、０．２７‐３００ １／Ｓまで変化するせん断速度で行った。せん断速度は、増加し、およびその後減少し、並びにせん断速度および見かけの粘度の上昇および下降曲線を記録した。遅延および積分時間は、それぞれ５Ｓおよび１０Ｓであった。さらなる分析では、３００ｓ‐１のせん断応力を選択した。
レオロジー測定の結果は、１２突然変異体すべて（ＣＨＣＣ１２８１３およびＣＨＣＣ１２８４１など）が、ＣＨＣＣ１００１９と比較して、せん断応力として測定した改善された粘度を有することを示した。もっとも高いせん断応力を、ＣＨＣＣ１２８４１（７４Ｐａ）について得、ここでＣＨＣＣ１００１９は、５８．０Ｐａのせん断応力値を有した、図２参照。図では、１２のファージ耐性突然変異体についてレオロジーデータを示す。すべての突然変異体は、ＣＨＣＣ１００１９と比較して、１０％‐２８％までの範囲でせん断応力について増加を有した。
突然変異体を他の株ＣＨＣＣ１２８１３と共培養で生育したときの酸性化活性およびレオロジーデータに基づいて、さらなる適用試験のために単離した突然変異体の最も有望な候補として選択した。
本実験は、重要な流体力学的パラメーター菌株のせん断応力が、ファージ耐性突然変異株を単離することにより著しく改善することを示した。
実施例３．ストレプトコッカスサーモフィラス株ＣＨＣＣ９２０４のファージ耐性突然変異体の単離
クリスチャン ハンセン カルチャー コレクション（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で登録されている、母株ＣＨＣＣ９２０４から、ファージ耐性変異体を単離した。突然変異体を、０．１ｍｌの１ｍｌあたり１×１０ｅｘｐ０９のファージ粒子を含むファージＣＨＰＣ１０５７と一緒にＣＨＣＣ９２０４のＭ１７ラクトース終夜培養物０．１ｍｌをプレートに蒔き、および３７℃で終夜インキュベーション後、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2／ＣａＣｌ2を伴うＭ１７‐２％ラクトースアガープレート上で単離した。
いくつかの突然変異体の間で、ＣＨＣＣ１２３３９と呼ばれる一の株を、３回コロニー精製し、およびファージ攻撃のためにファージＣＨＰＣ１０５７を使用して、３７℃で、Ｍ１７ラクトースアガープレート上でプラーク試験について再試験し、およびファージ耐性を確認した（プラーク試験で単一プラークを観察しなかった）。ＣＨＣＣ１２３３９を、母株と比較できる酸性化活性を示すために、乳中でまた試験した。
発酵乳についてファージ耐性突然変異体ＣＨＣＣ１２３３９のテクスチャー特性の分析
突然変異体ＣＨＣＣ１２３３９および母株ＣＨＣＣ９２０４を３７℃、乳中で終夜インキュベートしたのち、発酵乳を、１３℃にし、およびそれぞれのサンプルの均質性まで、穴の開いたディスクを装着したスティックを用いて穏やかに攪拌した。それぞれのサンプルの流体力学的特性を、Ｃ２５同軸測定システムを備えたレオメーター（ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）、レオロジカ インスツルメンツ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、スウェーデン）で評価した。
粘度測定試験を、２１ステップで、０．２７‐３００ １／Ｓまで変化するせん断速度で行った。せん断速度は、増加し、およびその後減少し、並びにせん断速度および見かけの粘度の上昇および下降曲線を記録した。遅延および積分時間は、それぞれ５Ｓおよび１０Ｓであった。さらなる分析では、３００ｓ‐１のせん断応力を選択した。
レオロジー測定の結果は、突然変異体ＣＨＣＣ１２３３９が、ＣＨＣＣ９２０４と比較して２２％ゲル剛性（Ｇ*）の増加を惹起することを示した、図３参照。図では、ファージ耐性突然変異体ＣＨＣＣ１２３３９（７８．０Ｐａ）および母株ＣＨＣＣ９２０４（６４．０Ｐａ）のゲル剛性値（Ｇ*）を比較する。
実施例４．ストレプトコッカスサーモフィラス株ＣＨＣＣ５０８６のファージ耐性突然変異体の単離
クリスチャン ハンセン カルチャー コレクション（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で登録されている、母株ＣＨＣＣ５０８６から、ファージ耐性突然変異体を単離した。突然変異体を、０．１ｍｌの１ｍｌあたり１×１０ｅｘｐ０８のファージ粒子を含むファージＣＨＰＣ１０８９と一緒にＣＨＣＣ５０８６のＭ１７‐２％ラクトース終夜培養物０．１ｍｌをプレートに蒔きおよび３７℃で終夜インキュベーション後、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2／ＣａＣｌ2を伴うＭ１７‐２％ラクトースアガープレート上で単離した。
いくつかの突然変異体の間で、ＣＨＣＣ１３１４０と呼ばれる一の株を、３回コロニー精製し、およびファージ攻撃のためにファージＣＨＰＣ１０８９を使用して、３７℃で、Ｍ１７ラクトースアガープレート上でプラーク試験について再試験し、およびファージ耐性を確認した（プラーク試験で単一プラークを観察しなかった）。ＣＨＣＣ１３１４０を、母株と比較できる酸性化活性を示すために、乳中でまた試験した。
発酵乳についてファージ耐性突然変異体ＣＨＣＣ１３１４０のテクスチャー特性の分析
突然変異体ＣＨＣＣ１３１４０および母株ＣＨＣＣ５０８６を、３７℃、乳中で終夜インキュベートしたのち、発酵乳を、１３℃にし、およびそれぞれのサンプルの均質性まで、穴の開いたディスクを装着したスティックを用いて穏やかに攪拌した。それぞれのサンプルの流体力学的特性を、Ｃ２５同軸測定システムを備えたレオメーター（ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）、レオロジカ インスツルメンツ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、スウェーデン）で評価した。
粘度測定試験を、２１ステップで、０．２７‐３００ １／Ｓまで変化するせん断速度で行った。せん断速度は、増加し、およびその後減少し、並びにせん断速度および見かけの粘度の上昇および下降曲線を記録した。遅延および積分時間は、それぞれ５Ｓおよび１０Ｓであった。さらなる分析では、３００ｓ‐１のせん断応力を選択した。
レオロジー測定の結果は、突然変異体ＣＨＣＣ１３１４０が、ＣＨＣＣ５０８６と比較して１４％せん断応力の増加を惹起することを示した、図４参照。図では、ファージ耐性突然変異体ＣＨＣＣ１３１４０（せん断応力３３．０Ｐａ）および母株ＣＨＣＣ５０８６（２８．０Ｐａ）についてのせん断応力データを比較した。
実施例５．ストレプトコッカス株のガラクトース陽性突然変異体の調製
ｇａｌ＋株を得るための一般的な方法
突然変異体単離の前に、母株（例えば、ＣＨＣＣ６００８）を、２％ガラクトースを伴うＭ１７アガープレート（Ｍ１７‐ｇａｌプレート）上にストリークした。ＣＨＣＣ６００８は、唯一の糖類としてガラクトースで生育せず、および従って母株を、ｇａｌ−であるとみなした。母株の終夜培養物を、その後、Ｍ１７‐ｇａｌプレート上に蒔き、およびいくつかのコロニーを、３７℃で２日間生育後、単離できた。いくつかの突然変異体を、Ｍ１７‐ｇａｌプレート上で精製し、および唯一の糖類として２％ガラクトースを含むＭ１７培地で再試験した。突然変異体を、例えば遺伝子工学、放射線および／または化学薬品処理により得てもよく、または突然変異体は、自然発生突然変異体でもよい。
培地１ｍｌあたり少なくとも１０Ｅ４菌量で植菌し、２％ガラクトースを伴うＭ１７（唯一の糖類としてガラクトースを添加）において３７℃で１６時間インキュベーション後、少なくとも１．０の値で、ｐＨが低下したとき、突然変異体を、ガラクトース陽性とみなした。
ＣＨＣＣ６００８は、Ｍ１７‐ｇａｌ培地で有意により低いｐＨとならなかったが、精製した突然変異体の一つ、ＣＨＣＣ１１３４２は、３７℃で１６時間後、ｐＨ５．４に達し、および従って、ＣＨＣＣ６００８のガラクトース発酵（ｇａｌ＋）突然変異体とみなした。
ガラクトース発酵株の単離
突然変異体を、Ｓ．サーモフィラス株ＣＨＣＣ６００８のガラクトース発酵突然変異体として単離した（＝ＳＴ６００８、ＤＳＭ１８１１１）。ＣＨＣＣ６００８細胞を、突然変異体単離ステップの前に、任意の変異原性の化合物およびＵＶ光のいずれでも突然変異誘発していない。単離した株は、従ってＣＨＣＣ６００８の自然発生ガラクトース陽性突然変異体と似ている。
突然変異体単離の前に、ＣＨＣＣ６００８を、２％ガラクトースを伴うＭ１７アガープレート（Ｍ１７‐ｇａｌプレート）上でストリークした。ＣＨＣＣ６００８は、唯一の糖類源としてガラクトースで生育しなかった。
ＣＨＣＣ６００８の終夜培養物を、その後、Ｍ１７‐ｇａｌプレートに蒔き、およびいくつかのコロニーを、３７℃で２日間生育後、単離できた。いくつかの突然変異体は、Ｍ１７‐ｇａｌプレート上で精製し、および唯一の糖類として２％ガラクトースを含むＭ１７培地上で再試験した。
ＣＨＣＣ６００８は、Ｍ１７‐ｇａｌ培地で有意により低いｐＨとならなかったが、精製した突然変異体の一つ、ＣＨＣＣ１１３７９は、３７℃で１０時間後、ｐＨ５．３に達し、および従って、ＣＨＣＣ６００８由来のガラクトース発酵突然変異体とみなした。ＣＨＣＣ１１３４２株およびＣＨＣＣ１１９７６株を、同様に単離した。
遺伝子工学による突然変異体の単離
ガラクトース陽性突然変異を、部位特異的突然変異誘発により、また産生できる。ｇａｌｋ‐１０プロモーターボックス内の突然変異したヌクレオチドを担っているオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにより、特定のＤＮＡフラグメントを増幅するために使用した。所望する突然変異を担っているＰＣＲフラグメントを、ベクタープラスミドにクローン化し、およびＳ．サーモフィラス標的株内に形質転換し、および突然変異を、染色体内に統合し、および組み換えにより、野生型ｇａｌｋプロモーター領域を交換した。上のように、株の単離を行った。
発酵乳についてテクスチャーの分析
インキュベーションの翌日、発酵乳を１３℃にし、およびそれぞれのサンプルの均質性まで、穴の開いたディスクを装着したスティックを用いて穏やかに攪拌した。サンプルの流体力学的特性を、Ｃ２５同軸測定システムを備えたレオメーター（ストレステック（ＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈ）、レオロジカ インスツルメンツ（Ｒｅｏｌｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、スウェーデン）で評価した。
粘度測定試験を、２１ステップで、０．２７‐３００ １／Ｓまで変化するせん断速度で行った。せん断速度は、増加し、およびその後減少し、並びにせん断速度および見かけの粘度の上昇および下降曲線を記録した。遅延および積分時間は、それぞれ５Ｓおよび１０Ｓであった。さらなる分析では、３００ｓ‐１のせん断応力を選択した。レオメーターの結果は、ＣＨＣＣ１１３７９が、ＣＨＣＣ６００８と比較して１０％改善したせん断応力（母株ＣＨＣＣ６００８について６７．５Ｐａと比較して、ＣＨＣＣ１１３７９についてせん断応力値７４．０Ｐａ（パスカル））を有することを示した。
乳におけるテクスチャーの分析
他の実施態様では、ＣＨＣＣ１１３７９を、Ｓ．サーモフィラス由来の株を、ラクトバチルスデルブリュッキーサブスピーシーズブルガリカス由来の株と一緒に４３℃、脱脂粉乳中で共培養したヨーグルト培養物の一部として使用した。ヨーグルトの製造で唯一の相違が、野生型ＣＨＣＣ６００８の代わりにＣＨＣＣ１１３７９の使用であるとき、せん断応力は、また１０％増加した（ＣＨＣＣ６００８を含むヨーグルト培養物において９４．７Ｐａと比較してＣＨＣＣ１１３７９を含むヨーグルト培養物において１０５．０Ｐａ）。
ＣＨＣＣ１１３７９由来のｇａｌｋプロモーター領域の配列決定
ＣＨＣＣ１１３７９ｇａｌ陽性突然変異体における突然変異の種類を明らかにするために、ｇａｌｋ遺伝子の最初（Ｓ．サーモフィラス由来のガラクトキナーゼについてコード）をシークエンスした。ｇａｌｋプロモーターの領域における突然変異であるＣＨＣＣ１１３７９について、同定した（以下を参照）。それぞれの突然変異は、母株６００８と比較してより強いプロモーター活性をおそらくもたらすであろう、このことは観察されたｇａｌ‐陽性表現型を説明する。これは、‐１０‐プロモーターボックスのためのコンセンサス配列が、「ＴＡＴＡＡＴ」であり、およびＣＨＣＣ６００８（「ＴＡＣＧＡＴ」）における‐１０ボックス（領域）のヌクレオチド３の突然変異が、ＣＨＣＣ１１３７９（「ＴＡＴＧＡＴ」）で、コンセンサス配列とより高い相同性をもたらす事実に基づく。
Figure 0005905834
ＣＨＣＣ１１３７９由来のｇａｌｋ遺伝子のプロモーター領域
ＣＨＣＣ１１３７９のｇａｌｋプロモーター内の点突然変異を、灰色コードで示す。公開されたＳ．サーモフィラスＳＴ１１１由来のｇａｌｋ配列（ジェンバンク アクセッション番号 ＡＹ７０４３６８）を、比較のために示す。‐３５は‐３５‐プロモーターボックス、‐１０は‐１０‐プロモーターボックス、ＲＢＳはリボソーム結合部位である。
本発明の好ましい実施態様は、本明細書において記載され、本発明を実施するための本発明者の知る最良の形態（ｂｅｓｔ ｍｏｄｅ）を含む。それらの好ましい実施態様のバリエーションは、先の記載を読んだ場合において、当業者にとって明らかとなり得る。本発明者は、適当にそのようなバリエーションを使用することができることを当業者に期待し、そして本発明者は、当該発明が本明細書において具体的に記載されたものとは別の方法で行われることを意図している。したがって、本発明は、ここに添付された特許請求の範囲中に記載された対象の全ての改良および均等物を、適用法によって許される限り含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける、上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書において他に示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り含まれる。
寄託およびエキスパートソリューション
ストレプトコッカスサーモフィラスＣＨＣＣ１１９７７およびＣＨＣＣ１１３４２株は、ドイツ国際寄託機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、所在地（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に、それぞれアクセッション番号ＤＳＭ２２９３５およびＤＳＭ２２９３２の下、２００９年９月８日に寄託された。ＣＨＣＣ６００８は、ＤＳＭＺにアクセッション番号ＤＳＭ１８１１１の下、２００６年３月２９日に寄託された。
バクテリオファージＣＨＰＣ６５８、ＣＨＰＣ１０５７およびＣＨＰＣ１１５２は、ＤＳＭＺに２０１０年８月２７日に寄託され、および寄託番号ＤＳＭ２３９６１、ＤＳＭ２３９６２、およびＤＳＭ２３９９４をそれぞれ与えられた。
ＤＳＭＺへのさらなる寄託：
ＣＨＣＣ１００１９（ＤＳＭ１９２５２）およびＣＨＣＣ３９８４（ＤＳＭ１９２５１）：寄託日２００７年４月３日、
ＣＨＣＣ２００８（ＤＳＭ２２５８４）およびＣＨＣＣ５０８６（ＤＳＭ２２５８７）：寄託日２００９年３月１９日、
ＣＨＣＣ１１３７９（ＤＳＭ２２８８４）：寄託日２００９年８月２６日、
ＣＨＣＣ１１９７６（ＤＳＭ２２９３４）：寄託日２００９年９月８日；
ＣＨＣＣ１３１４０（ＤＳＭ２４０２３）、ＣＨＣＣ１２８１３（ＤＳＭ２４０７４）、およびＣＨＰＣ１０８９（ＤＳＭ２４０２２）：寄託日２０１０年９月２９日；
ＣＨＣＣ１２３３９（ＤＳＭ２４０９０）：寄託日２０１０年１０月１４日。
ストレプトコッカスサーモフィラスＣＨＣＣ５０８６（ＤＳＭ２２５８７）：寄託日２００９年５月１９日。
ＣＨＣＣ９２０４（ＤＳＭ１９２４３）：寄託日２００７年５月２９日。
寄託は、特許手続の目的のため微生物の寄託の国際的な承認によるブタベスト条約に従ってなされた。出願人は、寄託された微生物のサンプルが、出願人により承認された専門家にのみ利用可能にされるべきであることを要求する。
参考文献
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１，７，ｐ．３６５９‐６７（２００５）；
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１３（２００７）１９５‐２００；
Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００２，ｐ．７８４‐７９０；
Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ ９２：４７７‐４８２（２００９）
ＷＯ２００８／０４０７３４Ａ１、ＷＯ２００７／０２５０９７Ａ２、ＵＳ７２４１６１０Ｂ２、ＷＯ２００７／１４４７７０Ａ２、ＷＯ２００４／０８５６０７Ａ、ＷＯ２００８／１４８５６１Ａ、ＷＯ１１０００８７９Ａ、ＷＯ１１０００８８３Ａ、ＷＯ１００２３１７８Ａ
本特許書類にあるすべての参照は、それらのすべてについて参照により、これによって本明細書中に取り込まれる。

Claims (8)

  1. 乳酸菌が、乳を発酵するために使用されたとき、前記乳酸菌の母株よりも、より高いせん断応力および／またはゲル剛性を生じる乳酸菌の製造方法であって、以下のステップ：
    ａ）母株として乳酸菌株を提供し；
    ａ１）前記母株を溶菌することができるバクテリオファージに前記乳酸菌株を暴露し；および
    ｂ）前記母株よりもよりファージに対して耐性である、前記母株の突然変異株を分離し；
    ｃ）前記母株又は突然変異株のｇａｌｋ遺伝子またはｇａｌｋ制御配列中に突然変異を導入する
    ことを含み、ここで前記突然変異が、プリブノーボックスとしても知られるｇａｌｋ遺伝子の−１０領域中に、または前記ｇａｌｋ遺伝子のプリブノーボックスおよびリボソーム結合部位の間の領域中に導入され、そしてここで、前記突然変異が遺伝子工学的手法により導入され、そして以下：
    ‐ Ａ，ＴおよびＧからなる群から選択されるヌクレオチドでの、野生型プリブノーボックスから下流のＴＴＣＡＧＴ配列（配列番号６）中のＣの置換など、前記ｇａｌｋ遺伝子の前記プリブノーボックスおよび前記リボソーム結合部位の間の前記領域中の一またはそれ以上のヌクレオチドの置換；および／または
    ‐ ＡおよびＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドでの、ＴＡＣＧＡＴ配列（配列番号７）を有する野生型−１０領域中のＣおよびＧの一または両方の置換；および／または
    ‐ ＡおよびＴからなる群から独立して選択されるヌクレオチドでの、ＴＡＣＧＡＴ配列（配列番号７）を有する野生型−１０領域中のＣの置換；および／または
    ‐ Ｔでの、ＴＡＣＧＡＴ配列（配列番号７）を有する野生型‐１０領域中のＣの置換；および／または
    ‐ ヌクレオチド配列ＴＡＴＧＡＴ（配列番号８）、ＴＡＴＴＡＴ（配列番号９）またはＴＡＣＴＡＴ（配列番号１０）を有する−１０領域
    を生じる、方法。
  2. 前記バクテリオファージが、ＣＨＰＣ６５８（ＤＳＭ２３９６１）、ＣＨＰＣ１０５７（ＤＳＭ２３９６２）、ＣＨＰＣ１０８９（ＤＳＭ２４０２２）およびＣＨＰＣ１１５２（ＤＳＭ２３９９４）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 以下のさらなるステップ：
    ｃ１）前記母株と比較して増加したガラクトース分解活性を有する突然変異株をスクリーニングする
    ことを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＣＨＣＣ１１９７７（ＤＳＭ２２９３５）、ＣＨＣＣ１２３３９（ＤＳＭ２４０９０）、およびＣＨＣＣ１３１４０（ＤＳＭ２４０２３）、並びに、それらの突然変異株、ここで前記変異株が、せん断応力および／またはゲル剛性に関して、前記株と同じかまたは同程度の特性を、前記変異株によって製造される発酵乳製品に対して付与する、からなる群から選択される、ストレプトコッカスサーモフィラス種に属する菌株。
  5. ＣＨＣＣ１２８１３（ＤＳＭ２４０７４）、並びに、その突然変異株、ここで前記変異株が、せん断応力および／またはゲル剛性に関して、前記株と同じかまたは同程度の特性を、前記変異株によって製造される発酵乳製品に対して付与する、からなる群から選択される、ラクトバチルスデルブリュキーサブスピーシーズブルガリカス種に属する菌株。
  6. 請求項４または５に記載の菌株を含む組成物。
  7. 請求項４もしくは５に記載の菌株、または請求項６に記載の組成物で乳基質を発酵することを含む、発酵乳製品の製造方法。
  8. 請求項４または５に記載の菌株を含む、発酵乳製品。
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