CN111575209A - 一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法，包括以下步骤：(1)获取含有植物乳杆菌的样品进行发酵培养，然后破碎植物乳杆菌释放并富集噬菌体；(2)噬菌体的富集；(3)噬菌体的分离；(4)抗噬菌体菌株的分离。本专利的有益效果是相对于目前通过化学诱变和物理诱变获得抗噬菌体的植物乳杆菌菌株，此方法更加快捷准确、操作简单、高安全性，并且极大程度提高了抗噬菌体植物乳杆菌菌株的分离成功率，因此具有相当高的实际应用前景。

Description

一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法。
背景技术
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于乳杆菌属，厌氧或兼性厌氧,菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，广泛存在于自然界中，尤其是分布在诸多发酵食品中，如发酵乳、发酵肉类和发酵蔬菜等。植物乳杆菌是人类胃肠道中的益生菌群，自然分布在人体的胃肠道中，对促进人体健康具有非常重要的生理功能，如调节肠道健康、降低胆固醇、增强免疫力、改善焦虑抑郁等。同时，植物乳杆菌对改善发酵乳的风味特征也起着决定性作用。
噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，结构简单，但却是生物圈中种类和数量最多的生物体。根据噬菌体对宿主细胞的影响可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体。
植物乳杆菌噬菌体是一类以植物乳杆菌为宿主的噬菌体，该噬菌体能特异、高效地裂解植物乳杆菌。
在乳制品发酵过程中，植物乳杆菌易受到噬菌体感染，从而降低乳品酸化率和风味特征等感官品质甚至导致发酵失败，被认为是乳品生产加工环境的主要威胁因子。此外，发酵乳的生理功能也大幅降低。
因此，筛选出具有抗噬菌体特性的植物乳杆菌菌株对提高产品的发酵效率、改良发酵乳的风味质地具有重要经济价值。
目前常用的方法为通过化学诱变和物理诱变获得抗噬菌体的植物乳杆菌菌株。但这两种方法相对来说操作比较复杂，需要涉及遗传操作。
而自发突变获得抗噬菌体菌株操作简单，且不涉及遗传操作，被认为是一种简单有效且天然的筛选抗性菌株的方法。
发明内容
本发明提供了一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法，该方法能够保证高效地筛选出抗噬菌体的植物乳杆菌菌株，将为解决因植物乳杆菌噬菌体引起的乳制品发酵失败提供新的解决方案。
一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法，包括以下步骤：
(1)获取含有植物乳杆菌的样品进行发酵培养，然后破碎植物乳杆菌释放并富集噬菌体；
(2)使用双层平板法分离步骤(1)中富集的噬菌体；
(3)将植物乳杆菌接种到液体培养基中培养至对数生长期，添加步骤(2)分离的噬菌体，培养使噬菌体感染并裂解植物乳杆菌获得裂解液；
(4)将步骤(3)获得的裂解液涂布固体培养基上，培养后挑取单菌落接种至中培养，取培养液连续多次划线培养获得纯菌株，将所得菌株培养在液体培养基中，加入噬菌体培养，若在噬菌体存在下，连续传代至少三次均能正常生长，则该液体培养基菌株被确定为抗噬菌体的植物乳杆菌菌株。
优选的，步骤(1)含有植物乳杆菌的样品为发酵乳样品。
优选的，步骤(1)先将样品接种到MRS-Ca液体培养基培养，培养液采用超速离心方法破裂植物乳杆菌释放噬菌体，上清液过滤去除杂质；然后取滤液加入TSB液体培养基中，再加入植物乳杆菌共培养，培养液采用超速离心方法破裂植物乳杆菌释放噬菌体，上清液过滤去除杂质获得富集后的噬菌体。
更优选的，第一次上清液过滤使用0.45um的无菌微孔滤膜过滤；第二次上清液过滤使用0.22um的无菌微孔滤膜过滤。
更优选的，超速离心方法为12000g离心30min。
优选的，步骤(2)双层平板法分离噬菌体时，上层培养基为0.8％的TSB半固体培养基，下层培养基为2％的TSB固体培养基，将2％的TSB固体培养基均匀倒入平板中，冷却凝固，制备底层平板，取步骤(1)中富集的噬菌体、对数期的植物乳杆菌菌液与0.8％半固体培养基混合均匀后，倒入已制备好的底层平板中，静置20min待水分蒸发后，于37℃下培养24h。
优选的，步骤(3)中添加噬菌体的量按感染复数0.1添加。
优选的，步骤(3)中使用的液体培养基为MRS-Ca液体培养基。
优选的，步骤(4)中使用的固体培养基为MRS固体培养基，液体培养基为MRS-Ca液体培养基。
本专利的有益效果是相对于目前通过化学诱变和物理诱变获得抗噬菌体的植物乳杆菌菌株，此方法更加快捷准确、操作简单、高安全性，并且极大程度提高了抗噬菌体植物乳杆菌菌株的分离成功率，因此具有相当高的实际应用前景。
附图说明
图1为植物乳杆菌噬菌体双层平板噬菌斑形态图。
图2为筛选到的7株自发突变的抗噬菌体植物乳杆菌菌株图。
具体实施方式
实施例1：植物乳杆菌噬菌体的分离
(1)为得到植物乳杆菌噬菌体，从杭州娃哈哈公司取得不同批次的发酵乳样品。将获取的发酵乳样品充分混匀后，取10mL发酵乳于100mL的MRS-Ca液体培养基中，在37℃下培养24h。取培养液于无菌离心管中经12000g离心10min，上清液用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤后，将滤液放入4℃冰箱备用。
(2)噬菌体的富集：取步骤(1)滤液15mL，加入2×的TSB液体培养基以及1mL培养至对数生长期的植物乳杆菌菌液，混匀后置于无菌锥形瓶中，于37℃下培养过夜，取出培养物于50mL无菌离心管中，在4℃下12000g离心30min，上清液用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤后，将滤液放入4℃冰箱备用。
(3)噬菌体的分离：采用传统的双层平板法进行植物乳杆菌噬菌体的分离鉴定：上层培养基为0.8％的TSB半固体培养基，下层培养基为2％的TSB固体培养基。将2％的TSB固体培养基均匀倒入平板中，冷却凝固，制备底层平板。取10μL步骤(2)中的滤液、0.1mL对数期的植物乳杆菌菌液与4mL的0.8％半固体培养基混合均匀后，倒入已制备好的底层平板中，静置20min带水分蒸发后，于37℃下培养24h。
观察现象，发现双层平板上出现大块透明斑点(如图1所示)，说明成功分离得到植物乳杆菌噬菌体。
实施例2：抗噬菌体植物乳杆菌菌株的筛选
采用次级感染的方法筛选植物乳杆菌自发突变抗噬菌体菌株。将植物乳杆菌接种到MRS-Ca液体培养基中，37℃下培养至对数生长期。按照感染复数0.1添加加入噬菌体后，37℃下培养至培养液完全裂解。继续置于37℃下培养至48h。将裂解液涂布于MRS固体平板，37℃下培养24h。挑取获得的单菌落培养于MRS液体培养基中。将培养液连续三次划线培养获得纯菌株后，将所得菌株培养于MRS-Ca液体培养基中，加入噬菌体并观察裂解情况。若在噬菌体存在下，连续传代三次均能正常生长，则该菌株被确定为抗噬菌体菌株。
实验结果显示，从MRS平板上挑取所有菌落，经三次划线后可正常生长的有7株，然后加入感染复数为0.1的噬菌体三代培养，正常生长的菌株分别为7株，这些均初步确定为抗噬菌体菌株，证明成功筛选到抗噬菌体植物乳杆菌菌株(如图2所示)。
实施例3：抗噬菌体植物乳杆菌菌株的分子鉴定
(1)基因组DNA提取：将植物乳杆菌自发突变抗噬菌体菌株挑单菌落在5mL MRS液体培养基中培养至对数生长期，用细菌基因组DNA提取试剂提取噬菌体抗性菌株基因组。
(2)PCR反应体系(25μL)：Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，10×Ex PCR buffer2.5μL，dNTPs 2.0μL，模板2μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，灭菌去离子水15.25μL。细菌扩增引物为通用引物27F和1492R。
(3)PCR扩增程序设为：先94℃预变性5min后进入PCR循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃终延伸10min。
(4)登录NCBI数据库将所得序列与已知序列进行比对，确保抗噬菌体菌株与敏感菌株为同一菌种。
实施例4：抗噬菌体菌株的抗性特征测定
抗性菌株的抗噬菌体能力用EOP(efficiency of plaguing)来表示，EOP是等量噬菌体分别以抗性菌株或原始菌株为指示菌时形成的噬菌斑数之比。抗性菌株抗噬菌体的稳定性测定是将抗噬菌体的突变株培养于含噬菌体的MRS-Ca培养基中，并连续转接25代，每次加入新的噬菌体，观测抗性菌株的生长情况。与对照即同样条件下培养在未添加噬菌体的MRS-Ca培养基中的抗性菌株相比，在噬菌体存在时培养液的裂解说明该菌株对噬菌体抗性的丧失。在5，10，15，20，25代时分别以双层平板法检测噬菌体，测定EOP。
实验结果如表1所示，以植物乳杆菌为指示菌时，噬菌体的成斑数为4.0×108PFU/mL，而以抗噬菌体菌株为指示菌时，B4、B7在传代25代之后均未检测到噬菌斑的出现，说明这两株突变菌株几乎能完全抵抗噬菌体的侵染。所获得的7株抗性菌株(B1-B7)在噬菌体存在的情况下连续传代25次后，均能正常生长。
表1
Figure BDA0002507166540000041
Figure BDA0002507166540000051
实施例5：抗噬菌体菌株生长状况和产酸特性
将植物乳杆菌及突变的抗噬菌体菌株分别接种于MRS液体培养基，在对数初期按最佳感染复数接入噬菌体增值液，每2h测定其OD600值和pH值，以不加噬菌体增值液的植物乳杆菌和抗噬菌体菌株作为对照。
结果，抗噬菌体菌株B4和B7在噬菌体存在与不存在时均正常生长，且长势跟敏感菌株几乎一致；而敏感菌株在噬菌体存在的情况下，生长明显减缓，可能是一部分菌株被噬菌体侵染裂解，一部分菌株产生了抗性。
无论噬菌体存在与否，抗性菌株B4、B7产酸情况跟敏感菌株几乎一致，培养12h后pH达到3.9左右，这表明抗性菌株在拥有抗性之后，产酸能力并没有降低；敏感菌在培养4h后加入噬菌体，2h后，pH趋于平稳，变化不大。

Claims (9)

1.一种用于筛选抗噬菌体的植物乳杆菌菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取含有植物乳杆菌的样品进行发酵培养，然后破碎植物乳杆菌释放并富集噬菌体；
(2)使用双层平板法分离步骤(1)中富集的噬菌体；
(3)将植物乳杆菌接种到液体培养基中培养至对数生长期，添加步骤(2)分离的噬菌体，培养使噬菌体感染并裂解植物乳杆菌获得裂解液；
(4)将步骤(3)获得的裂解液涂布固体培养基上，培养后挑取单菌落接种至中培养，取培养液连续多次划线培养获得纯菌株，将所得菌株培养在液体培养基中，加入噬菌体培养，若在噬菌体存在下，连续传代至少三次均能正常生长，则该液体培养基菌株被确定为抗噬菌体的植物乳杆菌菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)含有植物乳杆菌的样品为发酵乳样品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)先将样品接种到MRS-Ca液体培养基培养，培养液采用超速离心方法破裂植物乳杆菌释放噬菌体，上清液过滤去除杂质；然后取滤液加入TSB液体培养基中，再加入植物乳杆菌共培养，培养液采用超速离心方法破裂植物乳杆菌释放噬菌体，上清液过滤去除杂质获得富集后的噬菌体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第一次上清液过滤使用0.45um的无菌微孔滤膜过滤；第二次上清液过滤使用0.22um的无菌微孔滤膜过滤。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，超速离心方法为12000g离心30min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)双层平板法分离噬菌体时，上层培养基为0.8％的TSB半固体培养基，下层培养基为2％的TSB固体培养基，将2％的TSB固体培养基均匀倒入平板中，冷却凝固，制备底层平板，取步骤(1)中富集的噬菌体、对数期的植物乳杆菌菌液与0.8％半固体培养基混合均匀后，倒入已制备好的底层平板中，静置20min待水分蒸发后，于37℃下培养24h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中添加噬菌体的量按感染复数0.1添加。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中使用的液体培养基为MRS-Ca液体培养基。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中使用的固体培养基为MRS固体培养基，液体培养基为MRS-Ca液体培养基。
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