CN116249766A - 具有改善的质构化特性的乳酸菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有改善的质构化特性的新型嗜热链球菌菌株、包含所述菌株的组合物以及使用所述菌株制造的发酵制品。

Description

具有改善的质构化特性的乳酸菌菌株
技术领域
本发明涉及嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的突变体，其被发现具有改善的质构化特性，同时基本上保持其亲本菌株的特性。此外，本发明涉及包含该突变体的组合物，例如发酵剂培养物，以及使用该突变体制备的发酵制品。
背景技术
食品工业使用大量细菌，特别是乳酸菌，以改善食品的味道和质构，同时也为了延长这些食品的保质期。在乳品工业中，大量使用乳酸菌以实现乳品的酸化(通过发酵)，同时也为了使掺入它们的制品质构化。
在食品工业中使用的乳酸菌(LAB)中，主要应用链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)。嗜热链球菌(S.thermophilus)菌种的乳酸菌广泛单独使用或与其他细菌(例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp bulgaricus，L.bulgaricus))组合用于生产食品，特别是发酵制品。它们尤其用于配制用于生产发酵乳(例如酸奶)的发酵物。它们中的某些在发酵制品质构的发展中起主导作用。该特性与由乳酸菌分泌至周围环境中的细胞外聚合物的产生密切相关。
酸奶的当前趋势是风味温和且质构优良。现今，这是通过使用产生温和风味的培养物并添加增稠剂或蛋白质来获得期望的稠度来实现。酸奶生产商希望能够在不添加增稠剂的情况下制作具有这些特性的酸奶。这将帮助他们降低成本并提供更简洁的标签。实现该目标的一种非常有吸引力的方法是拥有能产生高水平质构的起子培养物。
一些LAB菌株有助于显著改善质构，这与它们产生胞外(或细胞外)多糖(EPS)的能力相关，EPS可以是荚膜状的(以胶囊的形式保持附着在细胞上)或被分泌至培养基中。EPS由单一类型的糖(同胞外多糖)或由不同糖组成的重复单元(杂胞外多糖)组成。产生EPS的LAB受到关注，因为EPS可作为发酵食品的天然增粘剂和质构增强剂。此外，来自食品级LAB的EPS具有确定的流变特性，其具有作为食品添加剂开发和利用的潜力。已知EPS通过影响粘度、脱水收缩、硬度和感官特性来改善LAB发酵制品的流变特性。主要结构特征(单糖类型和构型、糖苷键、非糖修饰、电荷)、构象和分子量、多糖的量以及多糖与其他系统组分的相互作用均是有助于并影响所显示的技术功能特性的因素(Zeidan等人,2017FEMS微生物学综述(FEMS Microbiol Rev)41:168-200)。
尽管胞外多糖的存在未给嗜热链球菌在乳品中的生长或存活带来任何明显优势，但该菌种或其他乳品乳酸菌的原位生产通常赋予发酵乳制品期望的“粘稠”或粘性质构。研究还表明，产生胞外多糖的嗜热链球菌可以增强马苏里拉奶酪的功能特性。有关详细信息，参见Broadbent等人(乳品科学杂志(J.dairy Sci.)86:407-423)的综述文章。
为了满足工业的要求，提供新型乳酸菌(特别是嗜热链球菌)的质构化菌株用于食品质构化已经变得很有必要。尤其需要可以与德氏乳杆菌保加利亚亚种的质构化菌株一起使用的新型嗜热链球菌的质构化菌株。
发明内容
本发明涉及新型嗜热链球菌菌株，其具有改善的特性，特别涉及其改善发酵乳制品(例如酸奶)质构的能力，并且其可用于当今高度工业化的乳制品生产。
特别地，本发明公开了新型嗜热链球菌菌株DSM 33676。
因此，本发明的一方面涉及嗜热链球菌菌株DSM 33676及其突变体和变体。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含嗜热链球菌菌株DSM33676。
在还一方面，本发明涉及一种生产发酵制品的方法，其包括用嗜热链球菌菌株DSM33676或包含嗜热链球菌菌株DSM 33676的组合物发酵基质。
在又另一方面，本发明涉及一种发酵制品，其可通过本发明的方法获得。
在另一方面，本发明涉及一种发酵制品，其包含嗜热链球菌菌株DSM 33676。
此后，还一方面涉及嗜热链球菌菌株DSM 33676用于制造发酵制品的用途。
具体实施方式
定义
在更详细地概述本发明之前，首先定义一组术语和惯例：
术语“乳”应被理解为通过对任何哺乳动物(例如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)进行挤乳而获得的乳汁分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。术语乳还包括部分或完全由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液。
术语“乳基质”可以是可以根据本发明的方法进行发酵的任何生的和/或加工的乳材料。因此，有用的乳基质包括但不限于包含蛋白质的任何乳品或乳类制品的溶液/悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、乳粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、乳糖结晶母液、乳清蛋白浓缩物或奶油。显然，乳基质可以源自任何哺乳动物，例如是基本上纯的哺乳动物乳，或复原乳粉，或乳基质可以源自植物材料。
优选地，乳基质中的至少部分蛋白质是(i)哺乳动物乳中天然存在的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白或(ii)植物乳中天然存在的蛋白质。然而，部分蛋白质可以不是乳中天然存在的蛋白质。
在发酵之前，可以根据本领域已知的方法对乳基质进行均质化和巴氏灭菌。
如本文所用，“均质化”意指充分混合以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在发酵之前进行均质化，则可以将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再与乳分离。这可以通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。
如本文所用，“巴氏灭菌”意指处理乳基质以减少或消除活生物体(例如微生物)的存在。优选地，通过将特定温度保持特定时间段来实现巴氏灭菌。通常通过加热达到规定温度。可以选择温度和持续时间以杀死或灭活某些细菌，例如有害细菌。随后可以进行快速冷却步骤。
本发明的方法中的“发酵”意指通过微生物的作用将碳水化合物转化成醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括将乳糖转化成乳酸。
用于生产发酵乳制品的发酵工艺是熟知的，并且本领域技术人员将知晓如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧气、微生物的量和特性以及工艺时间。显然，选择发酵条件以支持本发明的实现，即以获得发酵制品，例如固体或液体形式的乳制品或非乳制品(发酵乳制品)。
在本文中，术语“起子培养物”是培养物，其是在发酵制品(例如各种食品、饲料和饮料)的制备中有助于发酵过程开始的一种或多种细菌菌株(例如乳酸菌菌株)的制剂。
在本文中，“酸奶起子培养物”是包含至少一种德氏乳杆菌乳酸亚种(L.bulgaricus)菌株和至少一种嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株的细菌培养物。据此，“酸奶”是指可通过用包含德氏乳杆菌乳酸亚种菌株和嗜热链球菌菌株的组合物接种和发酵乳基质而获得的发酵乳制品。
术语“亚碲酸盐抗性”被理解为能够在37℃下孵育1至3天之后在含有0.1mMK2TeO3的M17琼脂平板上生长(形成菌落)的细菌菌株。
在本文中，术语“突变体”应被理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学处理的方式衍生的菌株，或通过该方式可从本发明的菌株(或母菌株)衍生的菌株。突变体还可以是自发发生的突变体。优选突变体是功能等同的突变体，例如具有与母菌株基本上相同或改善的特性(例如关于粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳健性)的突变体。此类突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”是指通过使本发明的菌株进行任何常规使用的诱变处理而获得的菌株，该诱变处理包括用化学诱变剂(例如乙烷甲磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG))处理、UV线或自发发生的突变体。突变体可能已经历数次诱变处理(单次处理应被理解为一个诱变步骤随后是筛选/选择步骤)，但目前优选不超过20次、或不超过10次、或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与母菌株相比，细菌基因组中少于1％、少于0.1、少于0.01、少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸已被另一种核苷酸替换或缺失。
在本文中，术语“变体”应被理解为功能等同于本发明菌株的菌株，例如具有基本上相同或改善的特性，例如关于粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳健性。可以使用适当的筛选技术鉴定的此类变体是本发明的一部分。
新型嗜热链球菌菌株及其应用
发明人已经出乎意料地鉴定出满足工业需求的嗜热链球菌菌株(即DSM 33676)。与其母菌株相比，新菌株在单独应用或作为乳品基质中混合培养物的一部分时显示出改善的流变特性，例如质构化。
嗜热链球菌菌株DSM 33676能够用于例如乳品培养物(例如酸奶培养物)以获得最终制品的改善的流变学参数(例如剪切应力和凝胶硬度)。
因此，本发明的一方面涉及嗜热链球菌菌株DSM 33676及其突变体和变体。
设想突变体和变体显示出与DSM 33676相同或相似的剪切应力和/或凝胶硬度特性。在本文中，术语“相似的剪切应力”应被理解为从低于DSM 33676的剪切应力特性10％至高于DSM 33676的剪切应力特性10％的范围，该范围还可以低于/高于DSM 33676的剪切应力特性9％，例如低于/高于DSM 33676的剪切应力特性8％，例如低于/高于DSM 33676的剪切应力特性7％，例如低于/高于DSM 33676的剪切应力特性6％，例如低于/高于DSM 33676的剪切应力特性5％，例如低于/高于DSM 33676的剪切应力特性4％，例如低于/高于DSM33676的剪切应力特性3％，例如低于/高于DSM 33676的剪切应力特性2％，或低于/高于DSM33676的剪切应力特性1％。
在本文中，术语“相似的凝胶硬度”应被理解为从低于DSM 33676的凝胶硬度特性10％至高于DSM 33676的凝胶硬度特性10％的范围，该范围还可以低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性9％，例如低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性8％，例如低于/高于DSM33676的凝胶硬度特性7％，例如低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性6％，例如低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性5％，例如低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性4％，例如低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性3％，例如低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性2％，或低于/高于DSM 33676的凝胶硬度特性1％。
在以上“特性”中，应在定义部分的上下文中进行理解，其中说明了如何适当地测量剪切应力或凝胶硬度。
用于确定发酵制品(例如乳制品)的质构的方法包括测量发酵制品的剪切应力(粘度)或凝胶刚度(复数模量)并且是容易获得的且是本领域已知的，并且在本文中举例说明。
在本发明的一个实施方案中，当以每ml的乳品至少107个细胞的量接种时，嗜热链球菌菌株DSM 33676在43℃下在脱脂乳(0.5％脂肪)中生长16小时之后产生大于20Pa的剪切应力(以300 1/s(Pa)的剪切应力测量)。
当对通过添加DSM 33676制成的发酵制品进行测量时，在300s-1下的剪切应力大于20Pa、22Pa、24Pa、26Pa、28Pa、30、31Pa、32Pa、33Pa、34Pa或35Pa可能是期望的。如上所述测量剪切应力。在实施例2中测量单一培养物的剪切应力。
当对通过添加DSM 33676的组合物和至少一种另外的乳酸菌菌株(混合培养物)制成的发酵制品进行测量时，在300s-1下的剪切应力大于35Pa、40Pa、45Pa、50Pa、60Pa、70Pa、80Pa、90Pa或100Pa可能是期望的，因为这类似于感官小组(sensory panel)优选的感官粘度/口腔稠度。如上所述测量剪切应力。如实施例3中所述测量剪切应力。
在本发明的一个实施方案中，当以每ml的乳品至少107个细胞的量接种时，嗜热链球菌菌株DSM 33676在43℃下脱脂乳(0.5％脂肪)中生长16小时之后产生大于89Pa的复数模量(以1.52Hz振荡测量时)。
当对通过添加DSM 33676制成的发酵制品以1.52Hz振荡进行测量时，复数模量大于90Pa、91Pa、92Pa、93Pa、94Pa、95、96Pa、97Pa、98Pa、99Pa或100Pa可能是期望的。如上所述测量复数模量。在实施例2中测量单一培养物的复数模量。
当对通过添加DSM 33676的组合物和至少一种另外的乳酸菌菌株(混合培养物)制成的发酵制品以1.52Hz振荡进行测量时，复数模量大于140Pa、141Pa、142Pa、143Pa、144Pa、145Pa、146Pa、147Pa或147Pa可能是期望的，因为这类似于感官小组优选的感官粘度/口腔稠度。如上所述测量复数模量。如实施例3中所述测量剪切应力。
在优选的实施方案中，当以每ml的乳品至少107个细胞的量接种时，嗜热链球菌菌株DSM 33676在43℃下在脱脂乳(0.5％脂肪)中生长16小时之后产生的剪切应力(在300 1/s(Pa)下测量时)与其母菌株相比提高了至少1％，例如2％，例如3％，例如4％，例如5％，例如6％，例如7％，例如8％，例如9％，例如10％。
在优选的实施方案中，当以每ml的乳品至少107个细胞的量接种时，嗜热链球菌菌株DSM 33676在43℃下在脱脂乳(0.5％脂肪)中生长16小时之后产生的复数模量(通过1.52Hz振荡测量时)与其母菌株相比提高了至少1％，例如2％，例如3％，例如4％，例如5％，例如6％，例如7％，例如8％，例如9％，例如10％。
“质构”或“口感”意指制品在口腔中的物理和化学相互作用。
已出乎意料地发现，嗜热链球菌菌株的突变体对亚碲酸盐(如K2TeO3)具有抗性，显示出增加的流变学特性。因此，在一个实施方案中，嗜热链球菌菌株DSM 33676对亚碲酸盐和/或其盐或衍生物具有抗性。
组合物
本发明的还一方面涉及一种组合物，其包含嗜热链球菌菌株DSM 33676或由其组成。
本发明的组合物可以以多种形式提供。它可以是冷冻形式、干燥形式、冻干形式或液体形式。因此，在一个实施方案中，该组合物是冷冻、干燥、冻干或液体形式。
本发明的组合物可以另外包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、营养素、填充剂、调味剂或其混合物。该组合物优选包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养素中的一种或多种，更优选地冷冻保护剂、冻干保护剂和/或抗氧化剂，并且最优选地冷冻保护剂或冻干保护剂，或两者。保护剂(例如冷冻保护剂和冻干保护剂)的使用是本领域技术人员已知的。合适的冷冻保护剂或冻干保护剂包括单糖、二糖、三糖和多糖(例如葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精、淀粉和阿拉伯树胶(金合欢树胶)等)、多元醇(例如赤藓糖醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、苏糖醇、木糖醇等)、氨基酸(例如脯氨酸、谷氨酸)、复合物(例如脱脂乳、蛋白胨、明胶、酵母提取物)和无机化合物(例如三聚磷酸钠)。在一个实施方案中，根据本发明的组合物可以包含选自由以下组成的组的一种或多种冷冻保护剂：肌苷5'-单磷酸(IMP)、腺苷-5'-单磷酸(AMP)、5'-单磷酸鸟苷(GMP)、5'-单磷酸铀苷(UMP)、5'-单磷酸胞苷(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳清苷、胸苷、肌苷和任何此类化合物的衍生物。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸及其盐、没食子酸盐、半胱氨酸、山梨醇、甘露醇、麦芽糖。合适的营养素包括糖类、氨基酸、脂肪酸、矿物质、微量元素、维生素(例如维生素B族、维生素C)。该组合物可以任选地包含其他物质，包括填充剂(例如乳糖、麦芽糖糊精)和/或调味剂。
在本发明的一个实施方案中，冷冻保护剂是试剂或试剂的混合物，除了其冷冻保护性外，其还具有促进作用。
表述“促进作用”用于描述这样的情况，其中将冷冻保护剂接种到待发酵或转化的培养基中时，冷冻保护剂赋予解冻的或复溶的培养物增加的代谢活性(促进作用)。活力和代谢活性不是同义词。市售冷冻或冷冻干燥的培养物可能保留其活力，尽管它们可能已经失去很大部分代谢活性，例如即使保存时间较短，培养物也可能失去其产酸(酸化)活性。因此，必须通过不同的测定来评价活力和促进作用。通过活力测定(例如测定菌落形成单位)评估)，而通过定量解冻的或复溶的培养物相对于培养物的活力的相关代谢活性评估促进作用。术语“代谢活性”是指培养物的除氧活性，其产酸活性，即产生例如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸，或其代谢物产生活性，例如产生芳香化合物，例如乙醛(α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁二醇(丁二醇))。
在一个实施方案中，本发明的组合物含有或包含0.2％至20％的冷冻保护剂或试剂的混合物，以材料的％w/w测量。然而，优选以0.2％至15％、0.2％至10％、0.5％至7％和1％至6％(按重量计)范围的量添加冷冻保护剂或试剂的混合物，包括2％至5％范围内的冷冻保护剂或试剂的混合物，以冷冻材料的％w/w(按重量计)测量。在优选的实施方案中，培养物包含约3％的冷冻保护剂或试剂的混合物，以材料的％w/w(按重量计)测量。约3％的冷冻保护剂的量对应于100mM范围内的浓度。应当认识到，对于本发明的实施方案的每个方面，范围可以是所述范围的增量。
在还一方面，本发明的组合物含有或包含铵盐(例如有机酸的铵盐(例如甲酸铵和柠檬酸铵)或无机酸的铵盐)作为细菌细胞的促进剂(例如生长促进剂或酸化促进剂)，例如属于嗜热链球菌菌种的细胞，例如(大量)脲酶阴性细菌细胞。术语“铵盐”、“甲酸铵”等应被理解为盐源或离子组合。例如，术语“甲酸铵”或“铵盐”的“源”是指添加至细胞培养物中时提供甲酸铵或铵盐的化合物或化合物的混合物。在一些实施方案中，铵源释放铵至生长培养基中，而在其他实施方案中，铵源经代谢产生铵。在一些优选的实施方案中，铵源是外源的。在一些特别优选的实施方案中，铵不是由乳制品基质提供的。当然应该理解可以添加氨代替铵盐。因此，术语铵盐包含括氨(NH3)、NH4OH、NH4+等。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶。
在一个实施方案中，其中微生物产生多糖(例如EPS)，该多糖导致酸化乳制品中的高/粘稠质构酸化乳制品基本上不含或完全不含任何增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶。基本上不含应被理解为制品包含0％至20％(w/w)(例如0％至10％、0％至5％或0％至2％、或0％至1％)增稠剂和/或稳定剂。
该组合物可以是混合物或作为部件试剂盒(kit-of-parts)，其包含：
i)嗜热链球菌菌株DSM 33676，和
ii)属于德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株。
为了获得制品(如酸奶)的酸度、味道、质构的最佳组合，通常应用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的组合。
在一个实施方案中，该混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 33571的组合。
在另一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 24074的组合。
实施例3显示了包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合培养物。
益生菌菌株
术语“益生菌”是指为了在消费者中实现健康促进效果而以足量施用至消费者的活细菌。益生菌在摄入之后能够在胃肠道条件下存活并在消费者的肠道内定植。
应当理解，乳杆菌属分类法已于2020年更新。Zheng等人2020公开了新分类法，如无其他注意事项，将与此保持一致。为了本发明的目的，表1提供了与本发明相关的一些乳杆菌属菌种的新旧名称。
Figure BDA0004149343270000111
表1.与本发明相关的一些乳杆菌属菌种的新旧名称
在本发明的具体实施方案中，根据本发明的益生菌菌株选自由以下的细菌组成的组：乳杆菌属，例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，双歧杆菌属，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)和婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)等。
在本发明的具体实施方案中，益生菌乳杆菌菌株选自由以下组成的组：嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌。
在本发明的具体实施方案中，益生菌乳杆菌菌株选自由鼠李糖乳杆菌菌株和副干酪乳杆菌菌株组成的组。
在本发明的具体实施方案中，益生菌菌株是保藏为ATCC53103的鼠李糖乳杆菌菌株
Figure BDA0004149343270000121
在本发明的具体实施方案中，益生菌菌株是保藏为ATCC 55544的副干酪乳杆菌菌株CRL 431。
在本发明的具体实施方案中，益生菌双歧杆菌菌株选自由以下组成的组：长双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌乳酸亚种、齿双歧杆菌、链状双歧杆菌、角双歧杆菌、大双歧杆菌、假小链双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。
在本发明的具体实施方案中，益生菌双歧杆菌益生菌菌株是保藏为DSM15954的动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12。
以上混合物或部件试剂盒可以进一步与其他乳酸菌(例如但不限于益生菌)组合。在一个实施方案中，至少一种乳酸菌选自由以下组成的组：双歧杆菌属例如动物双歧杆菌乳酸亚种(例如
Figure BDA0004149343270000122
)、嗜酸乳杆菌/>
Figure BDA0004149343270000123
鼠李糖乳杆菌(例如/>
Figure BDA0004149343270000124
)及其组合。根据它们的应用和待生产的食品来应用何种双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。
在一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 33571和动物双歧杆菌乳酸亚种菌株DSM 33443的组合。
在一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 24074和动物双歧杆菌乳酸亚种菌株DSM 33443的组合。
在一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 33571、动物双歧杆菌乳酸亚种菌株DSM 33443和动物双歧杆菌乳酸亚种菌株DSM 13241的组合。
在一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 24074、动物双歧杆菌乳酸亚种菌株DSM 33443和嗜酸乳杆菌菌株DSM 13241的组合。
在一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 33571和鼠李糖乳杆菌菌株DSM 33156的组合。
在一个实施方案中，混合物或部件试剂盒可以包含嗜热链球菌菌株DSM 33676与嗜热链球菌菌株DSM 24011、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 24074和鼠李糖乳杆菌菌株DSM 33156的组合。
以上混合物或部件试剂盒可以进一步与其他嗜热链球菌菌株组合。这些菌株例如可以是DSM 32823和/或DSM 32587。
表述“混合物”意指将(一种或多种)嗜热链球菌菌株和(一种或多种)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株物理混合在一起。在实施方案中，(一种或多种)嗜热链球菌菌株和(一种或多种)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在同一盒子或同一袋中。
相反，包含(一种或多种)嗜热链球菌菌株和(一种或多种)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的“试剂盒”的表述意指(一种或多种)嗜热链球菌菌株的培养物和(一种或多种)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株培养物是物理分离的，但计划一起使用。因此，(一种或多种)嗜热链球菌菌株的培养物和(一种或多种)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株培养物在不同的盒子或小袋中。在实施方案中，(一种或多种)嗜热链球菌菌株的培养物和(一种或多种)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株培养物是相同的形式，即冷冻的形式，颗粒或冷冻颗粒的形式，粉末形式，例如干燥或冷冻干燥的粉末。
在本发明的具体实施方案中，组合物包含104至1012CFU(菌落形成单位)/g的嗜热链球菌菌株，例如105至1011CFU/g，例如106至1010CFU/g，或107至109CFU/g的嗜热链球菌菌株。
在具体实施方案中，组合物进一步包含104至1012CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，例如105至1011CFU/g，例如106至1010CFU/g，或例如107至109CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌和其他乳酸菌通常用作起子培养物，在生产各种食品(例如在乳制品行业，例如用于发酵乳制品)中具有技术目的。因此，在另一个优选的实施方案中，该组合物适合作为起子培养物。
该组合物可以是起子培养物，例如酸奶起子培养物。
组合物和/或起子培养物可以是冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、盘式干燥或以液体形式。通常，可以通过配制具有低水活性的制品来扩展组合物和/或起子培养物的储存稳定性。通过控制水活性(AW)，可能预测和调节水分迁移对制品的影响。因此，可以优选本文中干燥组合物的水活性(AW)在0.01-0.8范围内，优选在0.05-0.4范围内。
本发明的还一方面涉及一种生产发酵制品的方法，其包括用嗜热链球菌菌株DSM33676或根据本发明的组合物发酵基质。
根据待生产的制品，基质可以是乳基质。当发酵乳制品(例如酸奶、酪乳或开菲尔(kefir))是最终制品时，乳基质是特别优选的。
乳基质可以是动物或植物衍生制品。因此，在实施方案中，发酵制品是乳制品。乳制品可以选自由发酵乳制品(例如但不限于酸奶、酪乳和开菲尔)和奶酪(例如但不限于新鲜奶酪或帕斯特干酪(pasta filata))组成的组。
即使发酵制品和/或乳制品本身包含发酵过程中产生的酸和风味，但期望发酵制品和/或乳制品包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂及其混合物。
同样，例如在发酵之前、期间和/或之后将酶添加至基质(例如乳基质)中，该酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶、凝乳酵素(rennet)及其混合物。
在一个实施方案中，发酵制品可以是搅拌型制品、固定型制品或可饮用制品的形式。
显然，本发明的另一方面涉及可通过本发明的方法获得的发酵制品。因此，本发明的一方面还是一种发酵制品，其包含嗜热链球菌菌株DSM 33676。该发酵制品可以是乳制品。
本发明的最后一方面涉及嗜热链球菌菌株DSM 33676用于制造发酵制品的用途。再次，该发酵制品可以是乳制品。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“a”和“an”和“the”以及类似的指示物将被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即意思是“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的列举仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独值的陈述，并且每个单独的值均被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言均不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
本说明书中显然先前已发表的文件的列表或讨论不一定被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
除非上下文另有说明，否则本发明的给定方面、特征或参数的优选、选项和实施方案应被视为已经本发明的所有其他方面、特征和参数的任何和所有优选、选项和实施方案结合公开。对于描述微囊化的微生物培养物及其所有特征(其很容易作为通过如本文所述的方法获得的最终组合物的一部分)，尤其如此。以下项目中还概述了本发明的实施方案和特征，并且还通过以下非限制实例进行说明。
保藏和专家解决方案
嗜热链球菌菌株由Chr.Hansen A/S,Hoersholm,丹麦于2020年10月29日保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)，保藏号为DSM 33676。
申请人要求以下所述的保藏微生物样品仅向专家提供，直至授予专利的日期。
菌株 登录号 保藏日期
嗜热链球菌 DSM 33676 2020.10.29
表2：根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约在获得国际保藏机构地位的保藏机构进行了以下保藏：Leibniz研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig，德国。
项目
X1.嗜热链球菌菌株DSM 33676及其突变体及其变体。
X2.根据X1项的嗜热链球菌菌株DSM 33676，其中突变体和变体显示出与DSM33676相同或相似的剪切应力和/或凝胶硬度特性。
X3.根据X1-X2项中任一项的嗜热链球菌菌株DSM 33676，其中所述菌株对亚碲酸盐和/或其盐或衍生物具有抗性。
Y1.一种组合物，其包含X1-X3项中任一项的嗜热链球菌菌株DSM 33676。
Y2.根据Y1项的组合物，其包含，作为混合物或作为部件试剂盒包含：
i)根据X1-X3项中任一项的嗜热链球菌菌株DSM 33676；和
ii)属于德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株。
Y3.根据Y1-Y2项中任一项的组合物，其中该组合物是起子培养物。
Y4.根据Y1-Y3项中任一项的组合物，其中该组合物和/或起子培养物是冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、盘式干燥或液体形式。
Z1.一种生产发酵制品的方法，其包括用根据X1-X3项中任一项的嗜热链球菌菌株DSM 33676或Y1-Y4项中任一项的组合物发酵基质。
Z2.根据Z1项的方法，其中该基质是乳基质。
Z3.根据Z1-Z2项中任一项的方法，其中该乳基质是动物或植物衍生的制品。
Z4.根据Z1-Z3项中任一项的方法，其中该发酵制品为乳制品。
Z5.根据Z4项的方法，其中该乳制品选自由发酵乳制品(例如但不限于酸奶、酪乳和开菲尔)和奶酪(例如但不限于新鲜奶酪或帕斯特干酪)组成的组。
Z6.根据Z4-Z5项中任一项的方法，其中该发酵制品进一步包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂及其混合物。
Z7.根据Z6项的方法，其中在发酵之前、期间和/或之后将酶添加至基质中，该酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶、凝乳酵素及其混合物。
Z8.根据Z1-Z7项中任一项的方法，其中该发酵制品是搅拌型制品、固定型制品或可饮用制品的形式。
Q1.一种发酵制品，其可通过Z1项的方法获得。
Q2.根据Q1项的发酵制品，其中该发酵制品是乳制品。
P1.一种发酵制品，其包含根据X1-X3项中任一项的嗜热链球菌菌株DSM 33676。
P2.根据P1项的发酵制品，其中该发酵制品是乳制品。
W1.根据X1-X3中任一项的嗜热链球菌菌株DSM 33676用于制造发酵制品的用途。
W2.根据W1项的用途，其中该发酵制品是乳制品。
实施例
实施例1：从具有质构特性增加的嗜热链球菌DSM 18111分离亚碲酸盐抗性突变体
从DSM 18111(也称为“母菌株”)分离亚碲酸盐抗性突变体，如下所示。
通过在含有0.1mM K2TeO3的M17琼脂平板上铺板DSM 18111的过夜培养物，然后在37℃下孵育1至3天，在这些板上直接筛选突变体。在含有0.1mM K2TeO3的M17琼脂平板上纯化十五种突变体，显示出稳定的亚碲酸盐抗性表型。显示出亚碲酸盐抗性表型的亚碲酸盐突变体中的一种被命名为DSM 33676。
从含有0.1mM K2TeO3的M17过夜培养物，将DSM 18111突变体以1％接种于乳品中，并在37℃下孵育24小时。然后通过测量从25ml移液器的排出时间来确定发酵乳的粘度。排出时间越长，测试培养基的粘度越高。排出时间被确定为三次测量的平均值。
亚碲酸盐抗性突变体的排出时间(即粘度)增加。对于突变体DSM 33767，与母菌株DSM 18111相比，测量的粘度增加为20％。
通过该实验，证明可以通过分离亚碲酸盐抗性突变体进一步提高eps阳性嗜热链球菌菌株的质构特性。
实施例2：母菌株DSM 18111与DSM 33676之间关于剪切应力和复数模量的比较
将DSM 18111接种在9.5％复原脱脂乳中，并在43℃下孵育以产生过夜培养物。然后从乳品过夜培养物，将DSM 18111以1％两份重复接种于脱脂乳(0.5％脂肪)中，并在41℃下孵育16小时。同样，从乳品过夜培养物，将DSM 33676以1％接种于脱脂乳(0.5％)中，并在43℃下孵育16小时。
孵育后第二天，将发酵乳转至13℃，并通过装有钻孔圆盘的棍状物轻轻搅拌直至样品均匀。在配备有C25同轴测量系统的流变仪(StressTech,Reologica Instruments,瑞典)上评估样品的流变特性。
通过在21个步骤中以0.27至300 1/s的剪切速率进行粘度测试。剪切速率增加，然后降低，并记录剪切应力的向上和向下曲线，并记录表观粘度。
延迟和整合时间分别为5s和10s。为了进一步分析，选择300s-1下的剪切应力。
结果
单一菌株结果：
样品名称 剪切应力 复数模量 比率
DSM 18111 32.9 79.2 0.502
DSM 18111 33.7 88.8 0.509
DSM 33676 30.8 90.9 0.511
DSM 33676 30.8 90.9 0.51
表3：母菌株(DSM 18111)和突变菌株(DSM 33676)的剪切应力、复数模量和比率性能
与DSM 18111相比，DSM 33676显示出凝胶硬度(复数模量)增加了8％(两次测量的平均值)。
混合培养物结果：
使用蛋白质减少的(3％)脱脂乳进行用于扩大规模的突变体DSM 33676的选择，在95℃下热处理5min，并在使用前冷却至发酵温度。接种材料是过夜培养在添加酵母提取物的无菌乳中的候选物。将突变体DSM 33676与同科的已经工业化改善的菌株(DSM 22935)进行比较。
在背景培养物中测试所有突变体，背景培养物由以下组成：50％的待测试菌株、10％的酸化嗜热链球菌、30％的质构化嗜热链球菌和10％的德氏乳杆菌保加利亚亚种，每种突变体产生12种不同变化。测量通过Hamilton机器人(TADM)在抽吸过程中的阻力以检查粘度的增加。将每种突变体的平均结果与参考菌株的平均进行比较。抽吸过程中压力(mPa)的负数越高，样品的粘度越高。
结果可见于下表：
Figure BDA0004149343270000201
表4：分别包含DSM 33676和DSM 22935的混合物在抽吸过程中的压降。实施例3：具有包含DSM 33676的共混物的原味搅拌酸奶的生产
材料和方法乳基：4.0％蛋白质，1.5％脂肪。新鲜乳与Arla中火脱脂奶粉(SMP)。培养物：培养物1(德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 33571，嗜热链球菌菌株DSM 24011和DSM33676)，和F-DVS
Figure BDA0004149343270000202
Premium 1.0，其是专有的现有技术培养物，包含一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株与2种不同的嗜热链球菌菌株的组合。/>
Figure BDA0004149343270000211
结果
复数模量G*-与凝胶硬度相关
通过使用Anton Paar的ASC流变仪型号DSR502，通过振荡测量来评价复数模量G*。该方法基于振荡步骤，其中样品在两个表面之间振荡，上部几何(bob)移动并且下杯保持静止。振荡在恒定应变下在0.5-8Hz进行。对于这些评价，从1.52Hz的测量结果中提取结果。在测量之前将样品在13℃下放置1小时。每个样品用勺子从底部到顶部轻轻搅拌5次，以确保样品均匀。装填流变杯至线并放入样品盒中。使用两个独立的酸奶杯重复两份测量样品。在第+7天进行测量，并且测量温度设置为13℃。样品在5℃下储存直至测量当天。由于这些结果包括三个产品，总共有6个数据点。
Figure BDA0004149343270000212
Figure BDA0004149343270000221
表5.通过振荡在1.52Hz下通过复数模量G*测量的凝胶硬度结果。结果显示为平均结果，包括ATC中3项重复两份试验的标准偏差。在第+7天进行测量，将温度调整为13℃。
剪切应力-与口腔稠度相关
通过使用Anton Paar的ASC流变仪型号DSR502测量剪切应力。该方法使用基于样品上的旋转变形，从10-3s-1至300s-1，然后返回10-3s-1。测量相应的剪切应力。对于这些结果，从流曲线中提取四个剪切速率(0.3；30；135；300s-1)(见表4)。在测量之前将样品在13℃下放置1小时。每个样品用勺子从底部到顶部轻轻搅拌5次，以确保样品均匀。装填流变杯至线并放入样品盒中。使用两个独立的酸奶杯重复两份测量样品。在第+7天进行测量，并且测量温度设置为13℃。样品在5℃下储存直至测量当天。
平均值
Figure BDA0004149343270000222
STD
Figure BDA0004149343270000223
表6.通过Anton Paar流变仪测量剪切应力结果。结果显示为平均结果，包括ATC中3项重复试验的标准偏差。在第+7天进行测量，将温度调整为13℃。

Claims (15)

1.嗜热链球菌菌株DSM 33676及其突变体和变体。
2.根据权利要求1所述的嗜热链球菌菌株DSM 33676，其中所述突变体和变体显示出与DSM 33676相同或相似的剪切应力和/或凝胶硬度特性。
3.根据前述权利要求中任一项所述的嗜热链球菌菌株DSM 33676，其中所述菌株对亚碲酸盐和/或其盐或衍生物具有抗性。
4.一种组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的嗜热链球菌菌株DSM 33676。
5.根据权利要求4所述的组合物，其以混合物或部件试剂盒的形式包含：
i)根据权利要求1-3中任一项所述的嗜热链球菌菌株DSM 33676；和
ii)属于德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的组合物，其中所述组合物是起子培养物。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述组合物和/或起子培养物是冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、盘式干燥或液体的形式。
8.一种生产发酵制品的方法，其包括用根据权利要求1-3中任一项所述的嗜热链球菌菌株DSM 33676或根据权利要求4-7中任一项的组合物发酵基质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述基质是乳基质。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述发酵制品为乳制品。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述发酵制品进一步包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂及其混合物。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中在所述发酵之前、期间和/或之后将酶添加至所述基质中，所述酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶、凝乳酵素及其混合物。
13.一种发酵制品，其能够通过根据权利要求8-12中任一项所述的方法获得。
14.一种发酵制品，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的嗜热链球菌菌株DSM33676。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的嗜热链球菌菌株DSM 33676用于制造发酵制品的用途。
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